CN104561359A - 检测vkorc1基因突变的引物以及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了检测VKORC1基因突变的引物以及应用。本发明首先公开了用于检测VKORC1基因突变的引物对，其核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。本发明还公开了应用所述引物对检测VKORC1基因突变的方法，包括：(1)提取待检测血液标本DNA；(2)进行PCR扩增；(3)采用Sanger法测定PCR扩增片段序列；(4)用VKORC1基因标准序列与样本测序序列比对，判断标准序列中界定的检测位点碱基与测序序列对应位点碱基，分析基因突变位点型别。本发明通过Sanger法测序对扩增片段进行测序，将测序结果与标准序列比对，可直观读出检测碱基的突变，具有较高的准确率。

Description

检测VKORC1基因突变的引物以及应用

技术领域

本发明涉及检测基因突变的引物以及检测方法，尤其涉及检测VKORC1基因突变的引物以及应用该引物检测VKORC1基因突变的方法，属于VKORC1基因突变的检测领域。

背景技术

VKORC1基因位点单核苷酸多态性的参考序列编号为rs9923231，此序列(aagacctgaaaaacaaccattggccgggtgcggtggctcacgcctataatc)中的第26个碱基为g是需要检测碱基，该位置碱基通常可能突变直接影响VKORC1基因(序列号为AY587020.1)编码的维生素K环氧化物还原酶的功能。该酶参与抗凝药华法林代谢。研究确定个人华法林弱代谢者与该基因多态性相关。

检测基因突变的方法有多种，如限制性内切酶法、实时荧光定量法和新一代测序法等，它们最大的缺点是假阴性和假阳性的出现，很难分辨。目前主要常用的方法为限制性内切酶法。

限制性内切酶检测VKORC1基因突变位点的主要方法如下：

1、提取血液标本基因组DNA备用。

2、设计限制性内切酶法检测VKORC1基因突变位点的特异性引物，PCR扩增需要检测的基因片段。

3、常规纯化沉淀PCR扩增片段并用合适量的蒸馏水溶解。

4、用相应的限制性内切酶在酶切体系中酶切PCR扩增VKORC1基因片段。

5、电泳分析PCR扩增VKORC1基因片段酶切后DNA条带的大小与数量，进而判断VKORC1基因突变位点基因型。

采用限制性内切酶法检测VKORC1基因所存在的主要缺点如下：

1、设计的限制性内切酶法酶切受酶本身的纯度、DNA的质量(主要是纯度)、酶切体系的缓冲液的pH值和离子强度、酶切的温度和时间等的影响，通常可能会出现的问题：DNA完全没有或不完全被内切酶切割；切割的片段数目多于理论值；酶切后没观察DNA片段的存在和电泳后DNA片段带型弥散，不均一等。

2、PCR扩增片段酶切后DNA凝胶电泳受琼脂糖的质量、凝胶制备、电泳缓冲液的PH值和离子强度、DNA样品加入量和DNA样品中盐浓度可改变DNA电泳的迁移率等的影响，通常可能会出现的问题：DNA带模糊；不规则DNA带迁移；带弱或无DNA电泳条带和DNA缺失等。

新一代测序方法虽然有简单、快速和高通量的特点，但致命的弱点是误读率高，对临床诊断要求的关键点---高准确不相符。因此，提供一种准确性高的检测样品中VKORC1基因的突变位点的方法具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一提供一对特异性的用于检测样品中VKORC1基因突变的引物对。

本发明的目的之二是应用所述的引物对检测样品中的VKORC1基因突变的方法。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先公开了一种用于检测VKORC1基因突变的引物对，其核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

本发明进一步提供了一种应用所述的引物对检测VKORC1基因是否突变的方法，包括以下步骤：

(1)提取待检测的血液标本中的基因组DNA；

(2)以步骤(1)所提取的基因组DNA为模板，以SEQ ID No.1和SEQID No.2为上下游引物建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；

(3)回收并纯化所扩增的PCR扩增片段；采用Sanger法测定所纯化的PCR扩增片段序列，得到样本测序序列；

(4)用VKORC1基因标准序列与样本测序序列比对，判断标准序列中界定的检测位点碱基与测序序列对应位点碱基，分析VKORC1基因突变位点型别。

其中，步骤(2)中所述的PCR扩增体系如下：

2×Ex Taq Buffer 10μl，dNTP(2mM)4μl；10μM的上游引物(SEQ IDNo.1)0.4μl，10μM的下游引物(SEQ ID No.2)0.4μl，Ex Taq0.4μl，DNA模板1.5μl，双蒸水3.3μl。

步骤(2)中所述的PCR扩增程序优选为：95℃ 5分钟；94℃、10秒，59℃、20秒，72℃、60秒，扩增45个循环；72℃，5分钟。

步骤(3)中优选用Exo I和CIP酶混合体系纯化PCR扩增片段。

步骤(4)中所述VKORC1基因标准序列为SEQ ID No.3所示，标准序列中界定的检测位点碱基为SEQ ID No.3所示的第26个碱基g。

本发明通过Sanger法测序对扩增出目的DNA片段进行测序，通过经典而又规范的操作程序，完全避免了现有的限制性内切酶法的缺点，并且直接获得PCR扩增序列的结果，将测序结果与VKORC1基因的标准序列比对，直观的读出检测碱基的突变，具有非常高的准确率。

附图说明

图1、PCR扩增VKORC1基因片段电泳图。

图2、PCR扩增VKORC1基因片段测序图。

图3、标准序列与PCR扩增VKORC1基因序列比对分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

1、样本要求EDTA或ACD抗凝全血；最佳量5.0ml，最少量2ml无菌和无RNase的真空采血管或试管；0-10℃冷藏运输小于2天，拒收重度溶血样本及肝素抗凝的全血。

2、全血DNA提取采用DNA提取试剂盒；3ml DNA当天不用，-20℃保存。

3、PCR反应液体系

表1PCR反应液体系

试剂名称	用量
		2x Ex Taq Buffer	10μl
dNTP(2mM)	4μl
		VKORC1-F(10μM)	0.4μl
VKORC1-R(10μM)	0.4μl
		Ex Taq	0.4μl
DNA	1.5μl
		dH2O	3.3μl
Total	20μl

VKORC1-F:5’-GTTCCCAGAAGGGTAGGTGC-3’

VKORC1-R:5’-CACCAAGACGCTAGACCCAA-3’

反应体系为：2x Ex Taq Buffer 10μl，dNTP(2mM)4μl；10μM的上游引物(SEQ ID No.1)0.4μl，10μM的下游引物(SEQ ID No.2)0.4μl，Ex Taq0.4μl，DNA模板1.5μl，双蒸水3.3μl。

扩增产物为409bp。

扩增序列：

gttcccag

agggtaggtg caacagtaag ggatccctct gggaagtcaa gcaagagaag acctgaaaaa

caaccattgg ccgggtgcgg tggctcacgc ctataatcct agcattttgg gaggccgagg

tgggtggatc acttgaggtc aggagtttaa gacaagcctg gccaacatgg tgaaaccctg

tctctactaa aaatacaaaa attagccaga catggtggca ggcacctgta gtccaaacta

cttgggaggc tgaggcacga gaaccacttg aaccctggag gcggaagttg cagtgagccg

agatggcacc gctgcactcc agcctgggcg acagagtgag actccgtctc aaaataagta

aataaataaa taaataacca ttgggtctag cgtcttggtg

(SEQ ID No.4)

标准序列：aagacctgaaaaacaaccattggccGggtgcggtggctcacgcctataatc

(SEQ ID No.3)

测序系列与标准序列比对，判断标准序列中大写的G对应的测序序列中位置的碱基，正反测序判断基因型。

4、PCR扩增：

95℃→94℃→59℃→72℃→72℃→4℃

5' 10″ 20″ 60″ 5' +∞

|→→45circles←←|

扩增程序：95℃5分钟；94℃、10秒，59℃、20秒，72℃、60秒，扩增45个循环；72℃，5分钟。

5、电泳：5ul扩增产物，2％琼脂糖凝胶电泳；150V恒压电泳15min；条带大小约为409bp(电泳图图1)。

6、上述两次电泳有条带标本的PCR产物做测序程序

PCR产物纯化反应：

13000rpm离心PCR产物(CIP与Exo I两种酶，不管缓冲液，直接配)。

表2PCR产物纯化

纯化好的样品用于下一步测序反应，如当日不用放冷冻保存。

测序反应：每个样品做正反两个反应，在相应的薄壁管上写好标记。

Terminator v3.1混合液配制。

表3

(每人份体积为1ul，－20℃保存一个月)

反应体系(3.2umol/L＝3.2pmol/ul)

测序反应产物的纯化：

将扩增完的PCR产物进行短暂离心。在每管中加入2ul的125mMEDTA，盖上盖子，涡旋旋混匀，短暂离心，静置5min，然后加入15ul无水乙醇，涡旋混匀。板式离心机4000rpm离心30min，300rpm倒置除掉上清。加入50ul冰冻的75％乙醇，涡旋混匀，4000rpm 4℃离心15min。300rpm倒置除掉上清。放置室温15min，完全挥发酒精。每管加入10ul的Hi-Di^TMFormamide，涡旋振荡30sec，短暂离心后静置15min使测序产物完全溶解。将加有Hi-Di^TM Formamide的各管按引物正反向对应排列，把各管上的样本编号按所排列顺序对应录入sample表格中。将96孔板放至PCR扩增仪上，95℃预变性5min，迅速转移至冰盒上4℃冷却5min。编完sample的各管按sample中位置将Hi-Di^TM Formamide溶解产物转移至96孔板的相应位置中。

上机测序，测序结果用软件分析(DNASTAR分析)，测序结果见图2；用VKORC1基因标准序列与样本测序序列比对，判断标准序列中界定的检测位点碱基与测序序列对应位点碱基，分析待检测的样本中VKORC1基因突变是否突变。

根据比对结果可见(图3)：图3中有三条碱基序列，从上开始计算，第二条是检测样本碱基序列，第三条是标准序列，即VKORC1基因位点单核苷酸多态性参考序列(rs9923231)，DNASTAR软件严格比对分析两序列的同源性(95％以上)；准确定位标准序列在检测样本序列中的位置，进而检测出样本序列中需要检测的碱基。图3是检测样本中一个检测结果，检测碱基为A，说明此标本检测结果为野生纯合子，对于VKORC1编码酶的活性没有影响。

Claims (8)

1.用于检测VKORC1基因突变的引物对，其特征在于：其核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

2.权利要求1所述的引物对在制备检测VKORC1基因突变的诊断试剂或药物中的用途。

3.应用权利要求1所述的引物对检测VKORC1基因是否突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待检测的血液标本中的基因组DNA；

(2)以步骤(1)所提取的基因组DNA为模板，以SEQ ID No.1和SEQID No.2为上下游引物建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；

(3)回收并纯化所扩增的PCR扩增片段；采用Sanger法测定所纯化的PCR扩增片段序列，得到样本测序序列；

(4)用VKORC1基因标准序列与样本测序序列比对，判断标准序列中界定的检测位点碱基与测序序列对应位点碱基，分析VKORC1基因突变位点型别。

4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的PCR扩增体系如下：

2×Ex Taq Buffer 10μl，dNTP(2mM)4μl；10μM的上游引物(SEQ IDNo.1)0.4μl，10μM的下游引物(SEQ ID No.2)0.4μl，Ex Taq0.4μl，DNA模板1.5μl，双蒸水3.3μl。

5.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的PCR扩增程序为：95℃5分钟；94℃、10秒，59℃、20秒，72℃、60秒，扩增45个循环；72℃，5分钟。

6.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(3)中用Exo I和CIP酶混合体系纯化PCR扩增片段。

7.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：VKORC1基因标准序列为SEQ ID No.3所示。

8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：标准序列中界定的检测位点碱基为SEQ ID No.3所示的第26个碱基g。