CN103710432A - 用于cyp2c9和vkorc1基因芯片检测的特异性引物对和探针 - Google Patents

用于cyp2c9和vkorc1基因芯片检测的特异性引物对和探针 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，公开了用于检测CYP2C9和VKORC1的SNP位点的特异性寡核苷酸探针，这种探针可以与CYP2C9第430位、1075位和VKORC1第-1639位不同基因型杂交。本发明还公开了检测上述SNP位点时，用于扩增CYP2C9和VKORC1基因的特异性引物对，引物对可特异性扩增CYP2C9和VKORC1基因中的含有检测目标位点的目标区域。本发明的产品可以一步完成检测CYP2C9和VKORC1的3个SNP位点基因型，为人们正确使用华法林提供信息。

Description

用于CYP2C9和VKORC1基因芯片检测的特异性引物对和探针
技术领域
本发明涉及分子生物学领域和核酸检测领域，具体设计用于扩增CYP2C9和VKORC1基因的特异性引物对和用于CYP2C9和VKORC1基因芯片检测的特异性探针。 
背景技术
华法林，一种双香豆素衍生物，是常用口服抗凝药物。其稳定剂量在不同种族间及个体间存在着较大差异，不同个体间稳定剂量的差异可达20倍以上。研究表明，维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位1基因(VKORC1)的基因多态性和细胞色素P4502C9基因(CYP2C9)是影响华法林用量个体差异最主要的两个遗传因素。其中，VKORC1最常见的SNP位点-1639G/A被发现与华法林用量个体差异显著相关。CYP2C9是华法林最主要的代谢酶。到目前为止，已发现的CYP2C9的等位基因有30种，其中以*1(野生型)、*2(Arg144Cys)、*3(Ile359Leu)最为常见。使用华法林前，检测使用者基因型是非常必要的。目前测定CYP2C9和VKORC1基因型的方法主要采用聚合酶链式反应-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)、手工或自动测序、序列特异性引物PCR等方法，操作繁琐，检测周期长，检测结果不易准确，难以满足临床检验的要求。 
近几年在高科技领域内出现的最具时代特征的重大科技进展之一便是基因芯片。用基因芯片检测CYP2C9和VKORC1基因亚型，发挥基因芯片检测操作简单、快捷、结果准确的特点，只需一次实验，就可高通量获得所有待检基因的信息。 
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测CYP2C9和VKORC1基因SNP位点的特异性扩增引物对和特异性寡核苷酸杂交探针。 
这组特异性寡核氨酸探针中包括（430C/T，rs1799853和1075A/C，rs1057910）位点和VKORC1（-1639G/A，rs9923231）位点，可以与CYP2C9第430位、1075位和VKORC1第-1639位不同基因型杂交，用于检测CYP2C9430C/T和1075A/C以及VKORC1-1639G/A rs9923231SNP位点。 
所述的检测位点为CYP2C9基因rs1799853的430C时，特异性寡核苷酸探针序列含有以下核苷酸序列之一（下划线部分为SNP位点）： 
（1）SEQ ID No.1：5'-CATTGAGGACCGTGTTCAAG-3'； 
（2）SEQ ID No.2：5'-TTGAGGACCGTGTTCAAGAG-3'； 
（3）SEQ ID No.3：5'-CATTGAGGACCGTGTTCAAGAG-3'； 
所述的检测位点为CYP2C9基因rs1799853的430T时，特异性寡核苷酸探针序列含有以下核苷酸序列之一（下划线部分为SNP位点）： 
（4）SEQ ID No.4：5'-CATTGAGGACTGTGTTCAAGAG-3' 
（5）SEQ ID No.5：5'-ATTGAGGACTGTGTTCAAGAGG-3' 
（6）SEQ ID No.6：5'-AGCATTGAGGACTGTGTTCAAGAG-3'； 
所述的检测位点为CYP2C9基因rs1057910的1075A时，特异性寡核苷酸探针序列含有以下核苷酸序列之一（下划线部分为SNP位点）： 
（7）SEQ ID No.7：5'-AGGTCCAGAGATACATTGACCTT-3' 
（8）SEQ ID No.8：5'-TCCAGAGATACATTGACCTTCTC-3' 
（9）SEQ ID No.9：5'-GTCCAGAGATACATTGACCTTCTCC-3'； 
所述的检测位点为CYP2C9基因rs1057910的1075C SNP位点时，特异性寡核苷酸探针序列含有以下核苷酸序列之一（下划线部分为SNP位点）： 
（10）SEQ ID No.10：5'-TCCAGAGATACCTTGACCTTCT-3' 
（11）SEQ ID No.11：5'-CAGAGATACCTTGACCTTCTCC-3' 
（12）SEQ ID No.12：5'-GTCCAGAGATACCTTGACCTTCTCC-3'； 
所述的检测位点为VKORC1基因rs9923231的-1639G时，特异性寡核苷酸探针序列含有以下核苷酸序列之一（下划线部分为SNP位点）： 
（13）SEQ ID No.10：5'-ACCGCACCGGGCCAAT-3' 
（14）SEQ ID No.11：5'-CGCACCGGGCCAATGGT-3' 
（15）SEQ ID No.12：5'-CACCGCACCGGGCCAAT-3'； 
所述的检测位点为VKORC1基因rs9923231的-1639A时，特异性寡核苷酸探针序列含有以下核苷酸序列之一（下划线部分为SNP位点）： 
（16）SEQ ID No.10：5'-CACCGCACCAGGCCAATG-3' 
（17）SEQ ID No.11：5'-ACCGCACCAGGCCAATGGT-3' 
（18）SEQ ID No.12：5'-CCACCGCACCAGGCCAAT-3'。 
或者，优选的，上述特异性寡核苷酸探针序列的5'端还包含5'氨基修饰的聚脱氧胸苷酸，聚脱氧胸苷酸长度为5～25。 
优选的，所述的检测位点为CYP2C9基因rs1799853的430C时，特异性寡核苷酸探针为SEQ ID No.1-3中的一个；所述的检测位点为CYP2C9基因rs1799853的430T时，特异性寡核苷酸探针为SEQ ID No.4-6中的一个。所述的检测位点为CYP2C9基因rs1057910的1075A时，特异性寡核苷酸探针为SEQID No.7-9中的一个；所述的检测位点为CYP2C9基因rs1057910的1075C时，特异性寡核苷酸探针为SEQ ID No.10-12中的一个。所述的检测位点为VKORC1基因rs9923231的-1639G时，特异性寡核苷酸探针为SEQ ID No.13-15中的一个；所述的检测位点为VKORC1基因rs9923231的-1639A时，特异性寡核苷酸探针为SEQ ID No.16-18中的一个。 
更优选的，上述特异性寡核苷酸探针序列的5'端还包含5'氨基修饰的聚脱氧胸苷酸，聚脱氧胸苷酸长度为5～25。 
检测上述CYP2C9和VKORC1基因SNP位点时，用于扩增CYP2C9基因rs1799853的430C/T SNP位点所使用的特异性引物对含有以下核苷酸序列之一： 
（1）上游SEQ ID No.19：5'-CAGCAATGGAAAGAAATGGA-3' 
     下游SEQ ID No.20：5'-TGAAACGAAAAAACGAAAGT-3'，或， 
（2）上游SEQ ID No.21：5'-GGGAGGATGGAAAACAGAGA-3' 
     下游SEQ ID No.22：，或，5’-CCCCACCGGTATAGAAAGTA-3’ 
（3）上游SEQ ID No.23：5'-CTTACAGAGCTCCTCGGGCA-3' 
     下游SEQ ID No.24：5'-TTGTAAAGTCCCCACCGGTA-3'； 
用于扩增CYP2C9基因rs1057910的1075A/C SNP位点所使用的特异性引物对含有以下核苷酸序列之一： 
（4）上游SEQ ID No.25：5'-TTGCTACAACAAATGTGCCA-3' 
     下游SEQ ID No.26：5'-ATTTGGAGATGGTAGTGGCC-3'，或， 
（5）上游SEQ ID No.27：5'-AGATTGAACGTGTGATTGGC-3' 
     下游SEQ ID No.28：5'-AGAGAACAAAGGTCAAACCC-3'，或， 
（6）上游SEQ ID No.29：5'-TTTTCCATCAGTTTTTACTTGTG-3' 
     下游SEQ ID No.30：5'-GAGGTACAAAAGCTTCAGGG-3'； 
用于扩增VKORC1基因rs9923231的-1639G/A SNP位点所使用的特异性引物对含有以下核苷酸序列之一： 
（7）上游SEQ ID No.31：5'-AGGGTTCAAGTGGTTCTCGT-3' 
     下游SEQ ID No.32：5'-TACTTAGGGACCTTGAACAC-3'，或， 
（8）上游SEQ ID No.33：5'-TCCAGGGTTCAAGTGGTTCT-3' 
     下游SEQ ID No.34：5'-GAGGGAGAGGTCTACGACAA-3'，或， 
（9）上游SEQ ID No.35：5'-GTTCAAGTGGTTCTCGTGCC-3' 
     下游SEQ ID No.36：5'-CAGTGGTTTCTACAGGGACG-3'。 
即所述的检测位点为CYP2C9基因rs1799853的430C/T时，特异性引物对序列含有SEQ ID No.19和No.20的核苷酸序列，或者含有SEQ ID No.21和No.22的核苷酸序列，或者含有SEQ ID No.23和No.24的核苷酸序列；检测位点为CYP2C9基因rs1057910的1075A/C时，特异性引物对序列含有SEQ ID No.25和No.26的核苷酸序列，或者含有SEQ ID No.27和No.28的核苷酸序列，或者含有SEQ ID No.29和No.30的核苷酸序列。更优选的，上述的特异性引物对的5’端用生物素、地高辛、荧光素、荧光素衍生物、荧光分子、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶进行了修饰。 
优选的，所述的检测位点为CYP2C9基因rs1799853的430C/T时，引物对序列为SEQ ID No.19和No.20的核苷酸序列，或者为SEQ ID No.21和No.22的核苷酸序列，或者为SEQ ID No.23和No.24的核苷酸序列；检测位点为CYP2C9基因rs1057910的1075A/C时，特异性引物对序列为SEQ ID No.25和No.26的核苷酸序列，或者为SEQ ID No.27和No.28的核苷酸序列，或者为SEQ ID No.29和No.30的核苷酸序列；检测位点为VKORC1基因rs9923231的-1639G/A时，特异性引物对为SEQ ID No.31和No.32的核苷酸序列，或者为SEQ ID No.33和No.34的核苷酸序列，或者为SEQ ID No.35和No.36的核苷酸序列。更优选的，上述特异性引物对核苷酸序列的5’端用生物素、地高辛、荧光素、荧光素 衍生物、荧光分子、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶进行了修饰。 
利用上述引物对及特异性寡核苷酸探针检测CYP2C9430C/T，rs1799853和1075A/C，rs1057910SNP位点以及VKORC1-1639G/A rs9923231SNP位点的方法，步骤包括： 
（1）制备待测样品的基因组DNA； 
（2）采用聚合酶链反应方法扩增CYP2C9基因中包含430C/T和1075A/C SNP位点的基因片段，以及VKORC1基因中包含-1639G/A SNP位点的基因片段；用上述的引物对进行扩增； 
（3）将所得扩增产物与杂交缓冲液混合； 
（4）将上述混合液与CYP2C9基因和VKORC1基因SNP检测芯片杂交；所述的CYP2C9基因和VKORC1基因SNP检测芯片包括固相支持物和固定在所述固相支持物上的特异性寡核苷酸探针； 
（5）检测芯片的杂交信号。 
步骤（5）中检测杂交信号的方法选自碱性磷酸酶催化的四氮唑蓝显色反应，辣根过氧化物酶催化的5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺显色反应，或者荧光检测。 
上述的特异性寡核苷酸探针用于制备同时检测CYP2C9基因和VKORC1基因SNP位点的检测芯片或试剂盒。 
上述的引物对用于制备同时检测CYP2C9基因和VKORC1基因SNP位点的检测芯片或试剂盒。 
本发明还提供一种用于同时检测CYP2C9基因和VKORC1基因SNP位点的试剂盒，该试剂盒包含上述检测芯片和使用说明书。 
上述检测芯片可用于同时检测CYP2C9430C/T、CYP2C91075A/C和VKORC1-1639G/A SNP位点的基因型。 
上述基因芯片的制备可按照生物芯片的常规制造方法进行。例如，如果固相支持物采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后用点样仪将其点在修饰玻片或硅片，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到基因芯片。如果寡核苷酸探针不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射 性操作手册》；Derisi，JL等于1997年在《科学》278（5338）：680-686发表的“探讨基因组内基因表达的代谢和遗传控制”（Dersi,JL,Iyer VR,Brown PO.Exploring the metablic and genetic control of gene expression on a genomic scale.Science.1997;278(5338):680-686）及马立人等主编的生物芯片，化学工业出版社。 
制备用于PCR扩增的染色体DNA的方法很多，可以从全血中制备，也可以从组织中制备。具体方法可参阅文献（丁振诺主编《临床PCR基因诊断技术》，世界图书出版公司）。 
用PCR方法扩增基因组DNA的特定片段的关键在于引物设计。 
取适量扩增产物加入杂交缓冲液中与基因芯片杂交。与基因芯片杂交时，可以先将基因芯片与预杂交缓冲液进行预杂交。 
本发明扩增产物与基因芯片之间的固相杂交按照本领域的经典方法进行，本领域一般人员依据经验容易较易确定有关缓冲液、探针和样品浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。或者也可参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.萨姆布鲁克等主编的《分子克隆实验指南》，科学出版社。 
然后根据标记信号在基因芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。本发明所述检测基因芯片杂交信号的方法是基于与抗生物素抗体或亲和素或链亲和素或抗地高辛抗体或抗荧光素抗体复合在一起的碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶催化的四氮唑蓝（NBT）和5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺盐（BCIP）或四甲基联苯胺（TMB）的显色反应。具体方法可参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》。若扩增产物用荧光基团标记，也可参照用荧光检测设备（如激光共聚焦扫描仪Scanarray3000等）获取待测信息。 
本发明所制备的CYP2C9和VKORC1基因SNP检测芯片具有良好的信噪比，所设计的探针有良好的特异性，能准确区分各类型的突变位点，并且所述检测方法步骤简单，3个SNP位点可以一步检测完成。全自动化杂交过程更加方便快捷并且避免了人为操作过程中存在的诸多不确定因素。本发明提供的探针、特异性引物对及其试剂盒，可用于检测CYP2C9和VKORC1基因型，为人们正确使用华法林提供信息。 
附图说明
图1为实施例1本发明基因芯片上的一种点样列阵。其中，0为质控探针，1为CYP2C9基因430C探针，2为CYP2C9基因430T探针，3为CYP2C9基因1075A探针，4为CYP2C9基因1075C探针，5为VKORC1基因-1639G探针，6为VKORC1基因-1639A探针，7为CYP2C9基因430阴性对照探针，8为CYP2C9基因1075阴性对照探针，9为VKORC1基因-1639阴性对照探针，10为空白对照。 
图2为实施例5中，用实施例1的芯片和探针检测CYP2C9和VKORC1基因时所得结果的照片。 
具体实施方式
以下实施例是对本发明的更详细说明，而不是对本发明范围的限定。 
所用基因序列的来源为NCBI(美国国立生物技术信息中心)： 
CYP2C9基因的430C/T，rs1799853 
CYP2C9基因的1075A/C，rs1057910 
VKORC1基因的-1639G/A，rs9923231 
实施例1  基因芯片的制备 
人工合成（上海生工生物工程技术服务有限公司）以下特异性探针，用水溶解为100pmol/ul浓度的溶液，然后用2×点样buffer（产品编号：BST02010，上海百傲科技有限公司）等比混合。接着，用Affymetrix公司的GSM417点样仪按说明书所述方法，在醛基修饰的载玻片（产品编号：BSM03011，上海百傲科技有限公司）上点制如图1的阵列。室温放置过夜。 
各特异性探针序列如下： 
检测CYP2C9基因rs1799853的430C位点特异性寡核苷酸探针序列为： 
NH2-TTTTTTTTTTTTTTTT-CATTGAGGACCGTGTTCAAG；检测CYP2C9基因rs1799853的430T位点的特异性寡核苷酸探针序列为：NH2-TTTTTTTTTTTTTTTT-CATTGAGGACTGTGTTCAAGAG。 
检测CYP2C9基因rs1057910的1075A位点特异性寡核苷酸探针序列为：NH2-TTTTTTTTTTTTTTTT-AGGTCCAGAGATACATTGACCTT；检测CYP2C9基因rs1057910的1075C位点特异性寡核苷酸探针序列为：NH2-TTTTTTTTTTTTTTTT-TCCAGAGATACCTTGACCTTCT。 
检测VKORC1基因rs9923231的-1639G位点特异性寡核苷酸探针序列为：NH2-TTTTTTTTTTTTTTTT–ACCGCACCGGGCCAAT；检测VKORC1基因rs9923231的-1639A位点特异性寡核苷酸探针序列为：NH2-TTTTTTTTTTTTTTTT-CACCGCACCAGGCCAATG。 
即上述各探针分别为序列表中SEQ ID No.1、4、7、10、13、16，且5'端还包含一段5'氨基（-NH2）修饰的16聚Polyd T（多聚脱氧胸苷酸）。 
如图1所示，在载玻片上点上质控点、特异性寡核苷酸探针、阴性对照探针和空白对照。其中0为质控探针，1为CYP2C9基因430C探针，2为CYP2C9基因430T探针，3为CYP2C9基因1075A探针，4为CYP2C9基因1075C探针，5为VKORC1基因-1639G探针，6为VKORC1基因-1639A探针，7为CYP2C9基因430阴性对照探针，8为CYP2C9基因1075阴性对照探针，9为VKORC1基因-1639阴性对照探针，10为空白对照。 
实施例2  染色体DNA的制备 
使用上海百傲科技有限公司血液DNA提取试剂盒按说明书操作如下： 
吸附柱活化：将吸附柱置于收集管中，加入500μL缓冲液BH1，静置2-3min，12,000rpm（9,500×g）离心30s；弃去收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，在吸附柱中加入500μL缓冲液BH2，12,000rpm（9，500×g）离心30s，弃去收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中待用。 
操作程序： 
（1）将20μL的蛋白酶K用移液器加入到1.5mL离心管底部。 
（2）将200μL的血液样品加入到离心管中。 
（3）加入200μL缓冲液BL到离心管中，振荡混匀15s。 
（4）离心管56℃保温10min。 
（5）短暂离心将离心管盖的液滴离下。 
（6）加入200μL无水乙醇，振荡混匀15s。短暂离心将离心管盖的液滴离下。 
（7）取已活化的吸附柱套在2mL收集管中，将上述混合液小心加入吸附柱中，不要弄湿管口。盖上管盖，12,000rpm（9,500×g）离心1min，弃取装废液的收集管，将吸附柱插入新的收集管中。 
（8）小心打开吸附柱的管盖，加入500μL缓冲液BW1，不要弄湿管口。盖上管盖，12,000rpm（9,500×g）离心1min，倒掉废液，将吸附柱插入收集管中。 
（9）小心打开吸附柱的管盖，加入500μL缓冲液BW2，不要弄湿管口。盖上管盖，12,000rpm（9,500×g）离心1min，倒掉废液，将吸附柱插入收集管中。 
（10）将吸附柱插入收集管中。12,000rpm（9,500×g）离心1min。 
（11）将吸附柱插入干净的1.5mL无菌离心管，弃去装废液的收集管。小心打开吸附柱的管盖，加入60μL的洗脱液BE或去离子水。室温（15～25℃）放置5min，然后12,000rpm（9,500）离心1min。 
（12）抽提好的DNA放置-20℃冰箱保存备用。 
实施例3  用本发明提供的引物通过PCR方法扩增ALDH2基因片段 
委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物，引物信息如下。 
用于检测CYP2C9基因430C/T的引物对： 
SEQ ID No.19：上游5'-CAGCAATGGAAAGAAATGGA-3'， 
SEQ ID No.20：下游5'-TGAAACGAAAAAACGAAAGT-3’。 
用于检测CYP2C9基因1075A/C的引物对： 
SEQ ID No.25：上游5'-TTGCTACAACAAATGTGCCA-3'， 
SEQ ID No.26：下游5'-ATTTGGAGATGGTAGTGGCC-3’。 
用于检测VKORC1基因-1639G/A的引物对： 
SEQ ID No.31：上游5'-AGGGTTCAAGTGGTTCTCGT-3'， 
SEQ ID No.32：下游5'-TACTTAGGGACCTTGAACAC-3’。 
并且，上述引物的5’端用生物素进行修饰。 
然后用水溶解引物对并稀释至10pmol/μl。将购置的Taq酶(TaKaRa)、10×缓冲液(TaKaRa)、dNTP(上海生工生物工程技术服务有限公司)、纯水以及实施例2获得的PCR扩增模板按以下配方配制PCR扩增体系： 
表1 
Figure DEST_PATH_GDA0000462321800000101
用PCR仪（TC-96/G/H（b）PCR扩增仪，杭州博日）按如下程序扩增： 
50℃5min，94℃5min，然后按94℃25sec、59℃30sec、72℃30sec做35个循环，最后72℃延伸5min。 
实施例4 
用实施例1制成的基因芯片与实施例3的PCR产物杂交。 
采用上海百傲科技有限公司出品的杂交显色试剂盒（BST03021），在 全自动杂交仪（上海百傲科技有限公司：BSE03011）中，按以下方法进行杂交：杂交显色试剂盒为碱性磷酸酶显色反应。 
1）杂交反应液配制：吸取150ul杂交液，加入实施例3中扩增产物各10μL，混匀。 
2）按表2设置反应程序，按表要求用量分装各试剂。并将各试剂放入指定位置内，运行程序，杂交显色反应自动进行。 
表2.杂交体系和反应程序 
步骤 位置 试剂名 体积（ul） 时间（min） 取样次数 温度（℃）
1 A 预杂交液 1200 5 1 41
[0130] 
2 B 杂交反应液 200 30 1 41
3 C 洗液1 800 6 2 41
4 D 洗液2 1600 5 2 28
5 E 抗体液 200 20 1 28
6 D 洗液2 / 5 2 28
7 F 洗液3 400 3 1 28
8 G 显色液 200 20 1 41
9 A 预杂交液 / 2 2 28
实施例5 
基因芯片杂交信号的检测：将杂交并洗涤完毕的基因芯片置于Baio BE3.0生物芯片识读仪(上海百傲科技有限公司)上扫描后得到如图2所示的检测结果。检测结果经测序结果验证完全符合。这一检测结果表明受检者的CYP2C9基因型属于*1/*3型VKORC1AA型，需要减少华法林起始用量。 
效果检测：采用上述引物和探针对60例样本进行检测，并采用测序方法进行验证。结果显示，60例测序结果与检测结果全部一致。 
也可以用SEQ ID No.2或3的序列作为检测CYP2C9基因rs1799853的430C位点的特异性探针；用SEQ ID No.5或6的序列作为检测CYP2C9基因rs1799853的430T位点的特异性探针；用SEQ ID No.8或9的序列作为检测CYP2C9基因rs1057910的1075A位点的特异性探针；用SEQ ID No.11或12的序列作为检测CYP2C9基因rs1057910的1075C位点的特异性探针；用SEQ ID No.14或15的序列作为检测VKORC1基因rs9923231的-1639G位点的特异性探针，用SEQ ID No.17或18的序列作为检测VKORC1基因rs9923231的-1639A位点的特异性探针，并且上述序列的5'端还连接一段5'氨基（-NH2）修饰的16聚Polyd T（多聚脱氧胸苷酸）。检测效果同实施例5。 
并且可以使用以下引物进行扩增。用于检测CYP2C9基因430C/T的引物对的上游和下游分别选用SEQ ID No.21和22，或者SEQ ID No.23和24；用于检测CYP2C9基因1075A/C的引物对的上游和下游分别选用SEQ ID No.27和28，或者SEQ ID No.29和30；用于检测VKORC1基因-1639G/A的引物对的上游 和下游分别选用SEQ ID No.33和34，或者SEQ ID No.35和36，并且在上述引物的5'端用生物素修饰，检测效果同实施例5。 
Figure IDA0000405578630000031
Figure IDA0000405578630000041
Figure IDA0000405578630000061
Figure IDA0000405578630000071

Claims (9)

1.一组用于检测CYP2C9和VKORC1基因SNP位点的特异性寡核苷酸探针，其特征在于，所述特异性寡核苷酸探针用于检测CYP2C9基因rs1799853的430C/T SNP位点和rs1057910的1075A/C SNP位点以及VKORC1基因rs9923231的-1639G/ASNP位点；
所述的检测位点为CYP2C9基因rs1799853的430C时，特异性寡核苷酸探针序列含有以下核苷酸序列之一：
（1）SEQ ID No.1：5'-CATTGAGGACCGTGTTCAAG-3'；
（2）SEQ ID No.2：5'-TTGAGGACCGTGTTCAAGAG-3'；
（3）SEQ ID No.3：5'-CATTGAGGACCGTGTTCAAGAG-3'；
所述的检测位点为CYP2C9基因rs1799853的430T时，特异性寡核苷酸探针序列含有以下核苷酸序列之一：
（4）SEQ ID No.4：5'-CATTGAGGACTGTGTTCAAGAG-3'
（5）SEQ ID No.5：5'-ATTGAGGACTGTGTTCAAGAGG-3'
（6）SEQ ID No.6：5'-AGCATTGAGGACTGTGTTCAAGAG-3'；
所述的检测位点为CYP2C9基因rs1057910的1075A时，特异性寡核苷酸探针序列含有以下核苷酸序列之一：
（7）SEQ ID No.7：5'-AGGTCCAGAGATACATTGACCTT-3'
（8）SEQ ID No.8：5'-TCCAGAGATACATTGACCTTCTC-3'
（9）SEQ ID No.9：5'-GTCCAGAGATACATTGACCTTCTCC-3'；
所述的检测位点为CYP2C9基因rs1057910的1075C时，特异性寡核苷酸探针序列含有以下核苷酸序列之一：
（10）SEQ ID No.10：5'-TCCAGAGATACCTTGACCTTCT-3'
（11）SEQ ID No.11：5'-CAGAGATACCTTGACCTTCTCC-3'
（12）SEQ ID No.12：5'-GTCCAGAGATACCTTGACCTTCTCC-3'；
所述的检测位点为VKORC1基因rs9923231的-1639G时，特异性寡核苷酸探针序列含有以下核苷酸序列之一：
（13）SEQ ID No.10：5'-ACCGCACCGGGCCAAT-3'
（14）SEQ ID No.11：5'-CGCACCGGGCCAATGGT-3'
（15）SEQ ID No.12：5'-CACCGCACCGGGCCAAT-3'；
所述的检测位点为VKORC1基因rs9923231的-1639A时，特异性寡核苷酸探针序列含有以下核苷酸序列之一：
（16）SEQ ID No.10：5'-CACCGCACCAGGCCAATG-3'
（17）SEQ ID No.11：5'-ACCGCACCAGGCCAATGGT-3'
（18）SEQ ID No.12：5'-CCACCGCACCAGGCCAAT-3'。
2.权利要求1所述用于检测CYP2C9和VKORC1基因SNP位点的特异性寡核苷酸探针，其特征在于，
所述的检测位点为CYP2C9基因rs1799853的430C时，特异性寡核苷酸探针序列为以下核苷酸序列之一：
（1）SEQ ID No.1：5'-CATTGAGGACCGTGTTCAAG-3'；
（2）SEQ ID No.2：5'-TTGAGGACCGTGTTCAAGAG-3'；
（3）SEQ ID No.3：5'-CATTGAGGACCGTGTTCAAGAG-3'；
所述的检测位点为CYP2C9基因rs1799853的430T时，特异性寡核苷酸探针序列为以下核苷酸序列之一：
（4）SEQ ID No.4：5'-CATTGAGGACTGTGTTCAAGAG-3'
（5）SEQ ID No.5：5'-ATTGAGGACTGTGTTCAAGAGG-3'
（6）SEQ ID No.6：5'-AGCATTGAGGACTGTGTTCAAGAG-3'；
所述的检测位点为CYP2C9基因rs1057910的1075A时，特异性寡核苷酸探针序列为以下核苷酸序列之一：
（7）SEQ ID No.7：5'-AGGTCCAGAGATACATTGACCTT-3'
（8）SEQ ID No.8：5'-TCCAGAGATACATTGACCTTCTC-3'
（9）SEQ ID No.9：5'-GTCCAGAGATACATTGACCTTCTCC-3'；
所述的检测位点为CYP2C9基因rs1057910的1075C时，特异性寡核苷酸探针序列为以下核苷酸序列之一：
（10）SEQ ID No.10：5'-TCCAGAGATACCTTGACCTTCT-3'
（11）SEQ ID No.11：5'-CAGAGATACCTTGACCTTCTCC-3'
（12）SEQ ID No.12：5'-GTCCAGAGATACCTTGACCTTCTCC-3'；
所述的检测位点为VKORC1基因rs9923231的-1639G时，特异性寡核苷酸探针序列为以下核苷酸序列之一：
（13）SEQ ID No.10：5'-ACCGCACCGGGCCAAT-3'
（14）SEQ ID No.11：5'-CGCACCGGGCCAATGGT-3'
（15）SEQ ID No.12：5'-CACCGCACCGGGCCAAT-3'；
所述的检测位点为VKORC1基因rs9923231的-1639A时，特异性寡核苷酸探针序列为以下核苷酸序列之一：
（16）SEQ ID No.10：5'-CACCGCACCAGGCCAATG-3'
（17）SEQ ID No.11：5'-ACCGCACCAGGCCAATGGT-3'
（18）SEQ ID No.12：5'-CCACCGCACCAGGCCAAT-3'。
3.权利要求1所述用于检测CYP2C9和VKORC1基因SNP位点的特异性寡核苷酸探针，其特征在于，其5'端还包含5'氨基修饰的聚脱氧胸苷酸，聚脱氧胸苷酸长度为5～25。
4.权利要求1所述用于检测CYP2C9和VKORC1基因SNP位点的特异性寡核苷酸探针，其特征在于，
所述的检测位点为CYP2C9基因rs1799853的430C时，特异性寡核苷酸探针序列为以下核苷酸序列之一，并且其5'端还包含5'氨基修饰的聚脱氧胸苷酸，聚脱氧胸苷酸长度为5～25：
（1）SEQ ID No.1：5'-CATTGAGGACCGTGTTCAAG-3'；
（2）SEQ ID No.2：5'-TTGAGGACCGTGTTCAAGAG-3'；
（3）SEQ ID No.3：5'-CATTGAGGACCGTGTTCAAGAG-3'；
所述的检测位点为CYP2C9基因rs1799853的430T时，特异性寡核苷酸探针序列为以下核苷酸序列之一，并且其5'端还包含一段5'氨基修饰的聚脱氧胸苷酸，聚脱氧胸苷酸长度为5～25：
（4）SEQ ID No.4：5'-CATTGAGGACTGTGTTCAAGAG-3'
（5）SEQ ID No.5：5'-ATTGAGGACTGTGTTCAAGAGG-3'
（6）SEQ ID No.6：5'-AGCATTGAGGACTGTGTTCAAGAG-3'；
所述的检测位点为CYP2C9基因rs1057910的1075A时，特异性寡核苷酸探针序列为以下核苷酸序列之一，并且其5'端还包含一段5'氨基修饰的聚脱氧胸苷酸，聚脱氧胸苷酸长度为5～25：
（7）SEQ ID No.7：5'-AGGTCCAGAGATACATTGACCTT-3'
（8）SEQ ID No.8：5'-TCCAGAGATACATTGACCTTCTC-3'
（9）SEQ ID No.9：5'-GTCCAGAGATACATTGACCTTCTCC-3'；
所述的检测位点为CYP2C9基因rs1057910的1075C时，特异性寡核苷酸探针序列为以下核苷酸序列之一，并且其5'端还包含一段5'氨基修饰的聚脱氧胸苷酸，聚脱氧胸苷酸长度为5～25：
（10）SEQ ID No.10：5'-TCCAGAGATACCTTGACCTTCT-3'
（11）SEQ ID No.11：5'-CAGAGATACCTTGACCTTCTCC-3'
（12）SEQ ID No.12：5'-GTCCAGAGATACCTTGACCTTCTCC-3'；
所述的检测位点为VKORC1基因rs9923231的-1639G时，特异性寡核苷酸探针序列为以下核苷酸序列之一，并且其5'端还包含一段5'氨基修饰的聚脱氧胸苷酸，聚脱氧胸苷酸长度为5～25：
（13）SEQ ID No.13：5'-ACCGCACCGGGCCAAT-3'
（14）SEQ ID No.14：5'-CGCACCGGGCCAATGGT-3'
（15）SEQ ID No.15：5'-CACCGCACCGGGCCAAT-3'；
所述的检测位点为VKORC1基因rs9923231的-1639A位点时，特异性寡核苷酸探针序列为以下核苷酸序列之一，并且其5'端还包含一段5'氨基修饰的聚脱氧胸苷酸，聚脱氧胸苷酸长度为5～25：
（16）SEQ ID No.16：5'-CACCGCACCAGGCCAATG-3'
（17）SEQ ID No.17：5'-ACCGCACCAGGCCAATGGT-3'
（18）SEQ ID No.18：5'-CCACCGCACCAGGCCAAT-3'。
5.一组用于检测CYP2C9和VKORC1基因SNP位点的引物对，其特征在于，所述引物对是用于扩增CYP2C9基因rs1799853的430C/T、CYP2C9基因rs1057910的1075A/C和VKORC1基因rs9923231的-1639G/A的特异性引物对；
所述的检测位点为CYP2C9基因rs1799853的430C/T时，特异性引物对含有以下核苷酸序列之一：
（1）上游SEQ ID No.19：5'-CAGCAATGGAAAGAAATGGA-3'
     下游SEQ ID No.20：5'-TGAAACGAAAAAACGAAAGT-3’，或，
（2）上游SEQ ID No.21：5'-GGGAGGATGGAAAACAGAGA-3'
     下游SEQ ID No.22：，或，5’-CCCCACCGGTATAGAAAGTA-3’
（3）上游SEQ ID No.23：5'-CTTACAGAGCTCCTCGGGCA-3'
     下游SEQ ID No.24：5'-TTGTAAAGTCCCCACCGGTA-3’；
所述的检测位点为CYP2C9基因rs1057910的1075A/C时，特异性引物对含有以下核苷酸序列之一：
（4）上游SEQ ID No.25：5'-TTGCTACAACAAATGTGCCA-3'
     下游SEQ ID No.26：5'-ATTTGGAGATGGTAGTGGCC-3’，或，
（5）上游SEQ ID No.27：5'-AGATTGAACGTGTGATTGGC-3'
     下游SEQ ID No.28：5'-AGAGAACAAAGGTCAAACCC-3’，或，
（6）上游SEQ ID No.29：5'-TTTTCCATCAGTTTTTACTTGTG-3'
     下游SEQ ID No.30：5'-GAGGTACAAAAGCTTCAGGG-3’；
所述的检测位点为VKORC1基因rs9923231的-1639G/A时，特异性引物对含有以下核苷酸序列之一：
（7）上游SEQ ID No.31：5'-AGGGTTCAAGTGGTTCTCGT-3'
     下游SEQ ID No.32：5'-TACTTAGGGACCTTGAACAC-3'，或，
（8）上游SEQ ID No.33：5'-TCCAGGGTTCAAGTGGTTCT-3'
     下游SEQ ID No.34：5'-GAGGGAGAGGTCTACGACAA-3'，或，
（9）上游SEQ ID No.35：5'-GTTCAAGTGGTTCTCGTGCC-3'
     下游SEQ ID No.36：5'-CAGTGGTTTCTACAGGGACG-3'。
6.权利要求5所述用于检测CYP2C9和VKORC1基因SNP位点的引物对，其特征在于，所述引物对序列选自以下核苷酸序列之一：
所述的检测位点为CYP2C9基因rs1799853的430C/T时，特异性引物对为以下核苷酸序列之一：
（1）上游SEQ ID No.19：5'-CAGCAATGGAAAGAAATGGA-3'
     下游SEQ ID No.20：5'-TGAAACGAAAAAACGAAAGT-3'，或，
（2）上游SEQ ID No.21：5'-GGGAGGATGGAAAACAGAGA-3'
     下游SEQ ID No.22：5’-CCCCACCGGTATAGAAAGTA-3'，或，
（3）上游SEQ ID No.23：5'-CTTACAGAGCTCCTCGGGCA-3'
     下游SEQ ID No.24：5'-TTGTAAAGTCCCCACCGGTA-3'；
所述的检测位点为CYP2C9基因rs1057910的1075A/C时，特异性引物对为以下核苷酸序列之一：
（4）上游SEQ ID No.25：5'-TTGCTACAACAAATGTGCCA-3'
     下游SEQ ID No.26：5'-ATTTGGAGATGGTAGTGGCC-3'，或，
（5）上游SEQ ID No.27：5'-AGATTGAACGTGTGATTGGC-3'
     下游SEQ ID No.28：5'-AGAGAACAAAGGTCAAACCC-3'，或，
（6）上游SEQ ID No.29：5'-TTTTCCATCAGTTTTTACTTGTG-3'
     下游SEQ ID No.30：5'-GAGGTACAAAAGCTTCAGGG-3'；
所述的检测位点为VKORC1基因rs9923231的-1639G/A时，特异性引物对为以下核苷酸序列之一：
（7）上游SEQ ID No.31：5'-AGGGTTCAAGTGGTTCTCGT-3'
     下游SEQ ID No.32：5'-TACTTAGGGACCTTGAACAC-3'，或，
（8）上游SEQ ID No.33：5'-TCCAGGGTTCAAGTGGTTCT-3'
     下游SEQ ID No.34：5’GAGGGAGAGGTCTACGACAA-3'，或，
（9）上游SEQ ID No.35：5'-GTTCAAGTGGTTCTCGTGCC-3'
     下游SEQ ID No.36：5’CAGTGGTTTCTACAGGGACG-3'。
7.权利要求5或6所述用于检测CYP2C9和VKORC1基因SNP位点的引物对，其特征在于，所述的引物对的5’端用生物素、地高辛、荧光素、荧光素衍生物、荧光分子、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶进行了修饰。
8.权利要求1～4任一项所述的特异性寡核苷酸探针用于制备CYP2C9和VKORC1基因SNP检测芯片或试剂盒。
9.权利要求5～7任一项所述的引物对用于制备CYP2C9和VKORC1基因SNP检测芯片或试剂盒。
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