CN101487043B - Hla-c基因分型dna微阵列芯片试剂盒 - Google Patents
Hla-c基因分型dna微阵列芯片试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种临床检测用途的基因检测试剂盒，尤其是涉及DNA微阵列芯片试剂盒，该试剂盒能够高通量、高效率、高特异性对人类白细胞抗原C(HLA-C)基因进行分型检测。
Description
所属技术领域
本发明涉及一种临床检测用途的基因检测试剂盒，尤其是涉及DNA微阵列芯片试剂盒，该试剂盒能够高通量、高效率、高特异性对HLA-C基因进行分型检测。
背景技术
HLA(Human leukocyte antigen，人类白细胞抗原)是人类主要组织相容性系统。组织相容性是指不同个体间进行组织或器官移植时，供者和受者双方接受的程度。供受者组织不相容引起的反应，被证实是一种免疫反应，它是由细胞表面同种异型抗原诱导的，这个代表个体特异性的抗原称移植抗原或组织相容性抗原，其中起主要作用的抗原称主要组织相容性系统(MHS)，HLA(人类白细胞抗原)就是人类的主要组织相容性系统。HLA基因复合体位于人类第6号染色体6p21.3区域，具有高度单核苷酸多态性(SNPs)。HLA存在多个基因座位，其中HLA-C座位是影响移植排斥反应的座位之一。SNPs是决定组织相容性的本质因素，个体之间的SNPs差异程度决定着相容性程度。HLA-C基因座位的SNPs主要集中在第二、三外显子上。根据SNPs的差异特点，可以进行基因分型，将HLA-C基因座位分成不同的型别和亚型，型别和亚型相同者，SNPs差异较小，相容性好，反之亦然。HLA基因分型技术广泛应用于造血干细胞移植、器官移植、疾病关联研究。
HLA-C基因分型方法是从90年代开始发展起来的，目前主要包括PCR-SSP(PCR-序列特异性引物法)、PCR-SSOP(PCR-序列特异性寡核苷酸探针法)、SBT(测序法)、FCM(流式法)方法。这些方法目前被西方国家的少数企业垄断，我国处于空白状态，完全依赖进口。同时，这些方法也存在一些技术问题，比如引物过多造成检测错误、检测通量过小等等。
DNA微阵列法是近几年发展起来的新型基因分型法，相比其它分型方法，具有高通量、集约化、低成本、高准确性等特点，是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。由于该技术可以将极其大量的探针同时固定于支持物上，所以一次可以对大量的生物分子进行检测分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量等不足。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序(Sequencing by hybridization，SBH)等，为“后基因组计划”时期基因功能研究及现代医学科学、医学诊断学的发展提供了强有力的工具。
发明内容
本发明的目的是将DNA微阵列技术应用于HLA-C基因分型检测，开发了一种新型的基因分型检测试剂盒。
本发明所采用的技术方案是：针对HLA-C基因座位的第二、三外显子，设计一套特异性寡核苷酸探针(表1)，采用自动点样机器人，将探针印制在玻片的特定区域，制成高密度DNA微阵列(芯片分为10个检测区，可以检测同时检测10个样本)，再配以其它必要的组份，包括PCR引物(表2)组成完整的试剂盒。实际检测时，取10份人基因组DNA溶液，采用CY3标记引物和不对称PCR方法，扩增出人基因组HLA-C基因的第二、三外显子单链CY3标记片段。取DNA微阵列芯片一张，分别加入10种PCR产物2ul和杂交液8ul。将芯片放在自动杂交洗涤仪内，设定杂交温度52℃，杂交时间30分钟，自动洗涤吹干。取出芯片，放入GenePix 4100A扫描仪进行扫描，使用分析软件对扫描图像信号进行图像数据转换处理，并分析产生样本基因型别结果。
本试剂盒采用高密度DNA微阵列技术，可以大大提高检测通量，每张芯片可以制备用于检测10个样本的DNA微阵列，是现有一般检测技术的10倍以上；同时，由于采用了国产原材料，与同类进口产品相比成本得到显著降低。
本发明的试剂盒用于用于临床移植配型和造血干细胞库建立HLA-C基因分型检测。
表1 HLA-C基因分型寡核苷酸探针
| 名称 | 序列(5’-3’) | 碱基数 |
| C1C2C3C4C5C6C7C8C9C10C11C12 | GCGAGTCCAAGAGGGGACGTGCAGTTCGACAGCGGCCGCGGGAGCCGTGGGGGGGAGCCCCGGGCGCCACACAGAACTACAAGCGCCGAGTGAACCTGCGGACTGCGGAAACTGCGCGGAGGCACAGGCTGACCGAAACCAGAGCGAGGACGCCTCCAGAGGATGTTTGTCTCACATCATCCAGAGCCTCCAGAGGATGTACG | 171717171717171716171717 |
| C13C14C15C16C17C18C19C20C21C22CNCP | GCTGCGACGTGGGGCCCCTGGGGCCGGACGGGCGTGACCAGTCCGCCTACGTGACCAGTTAGCCTACGAACGAGGATCTGCGCTCGCGGACACGGCGGCTCAGCGGACAAGGCGGCTCAGGCCCGTGCGGCGGAGCGCGCAAGTTGGAGGCGGGCCCTGAATGAGGACCTGAGTATTC GGATCGGGAGAGTATTGGGACCGGGA | 171717171717171717171717 |
CN，CP分别为阴性和阳性控制探针
表2引物序列
| 名称 | 序列(5’-3’) | 碱基数 | 特异性 |
| P1P2P3P4 | AGTGGGCTACGTGGACGACACCGCTTGTACTTCTGTGTCTCCGACGGGCGCCTCCTCCGCGGGCTGCGGAGCCACTCCACGCAC | 21212121 | 特异性扩增HLA-C第2外显子特异性扩增HLA-C第3外显子 |
本发明用下列实施例进行解释，目的只是为了解释而不是以任何方式限制本发明。以下结合附图说明本发明的具体实施。
附图说明
图1 HLA-C基因分型DNA微阵列杂交区和探针微阵列示意图
1、2芯片外观
3杂交区及探针矩阵
具体实施方式
实施例一：
方法1：HLA-C基因分型DNA微阵列PCR引物和寡核苷酸探针的设计和合成为了采用特异性PCR扩增HLA-C基因座位的第2、3外显子，分别在第2外显子的始端和末端设计特异性引物P1、P2，以及在第3外显子开始和末端设计引物P3、P4。合成、CY3标记、纯化。引物序列见表2。
针对HLA-C基因第2、3外显子基因序列的多态性，设计22种分型探针，序列见表1，合成、修饰、纯化。
方法2：HLA-C基因分型DNA微阵列的制备
采用基因芯片自动点样仪，将22种分型探针和两种对照探针点制到玻片的特定区域，制成DNA微阵列。
(1)点样探针溶液：将探针稀释到5×SSC、0.05％SDS溶液中，终浓度为30uM；
(2)点样矩阵：(如图1)将探针点制在玻片上，每个探针横向重复3点点制在杂交区内；杂交区分成10个。
实施例二：采用HLA-C基因分型用DNA微阵列检测临床样本HLA-C基因型别
取10份已知基因型别的DNA样本，采用CY3标记的PCR引物，上下游引物1∶30(分子数比)不对称PCR方法，PCR循环参数为：94℃5’；94℃30”，58℃30”，72℃30”，40个循环；72℃5’。
取一张微阵列玻片，分别取10种PCR产物各2ul加到芯片的10孔，再在各孔加入杂交液(5×SSC)8ul，芯片放到自动杂交洗涤仪的槽内，设定杂交温度52℃，杂交时间40分钟。杂交后自动洗涤和风干。
采用GnenPix4100A扫描仪，扫描杂交信号，得到杂交结果扫描图，并将图像转换成数据。
采用分析软件，将以上数据自动分析转换成为各个样本的基因型别，检测结果与样本原基因型别完全相符。见表3。
表3本次检测结果与样本原有基因型别的比较
| 样本编号 | 原基因型别(HLA-C*) | 本次试验结果(HLA-C*) | 是否相符 |
| 010203040506 | 0303，04010202，15020304，05010602，070602，0812，1403 | 0303，04010202，15020304，05010602，070602，0812，1403 | 是是是是是是 |
| 07080910 | 0401，160501，170102，180302，0602 | 0401，160501，170102，180302，0602 | 是是是是 |
实施例说明了本发明产品在检测通量方面的优势(一次检测10个样本)和检测准确性方面的可靠性(检测结果与原样本结果完全相符)。
序列表
<110>中山大学达安基因股份有限公司
<120>HLA-C基因分型DNA微阵列芯片试剂盒
<140>
<141>
<160>28
<210>1
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>1
GCGAGTCCAAGAGGGGA
<210>2
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>2
CGTGCAGTTCGACAGCG
<210>3
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>3
GCCGCGGGAGCCGTGGG
<210>4
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>4
GGGGAGCCCCGGGCGCC
<210>5
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>5
ACACAGAACTACAAGCG
<210>6
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>6
CCGAGTGAACCTGCGGA
<210>7
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>7
CTGCGGAAACTGCGCGG
<210>8
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>8
AGGCACAGGCTGACCGA
<210>9
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>9
AACCAGAGCGAGGACG
<210>10
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>10
CCTCCAGAGGATGTTTG
<210>11
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>11
TCTCACATCATCCAGAG
<210>12
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>12
CCTCCAGAGGATGTACG
<210>13
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>13
GCTGCGACGTGGGGCCC
<210>14
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>14
CTGGGGCCGGACGGGCG
<210>15
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>15
TGACCAGTCCGCCTACG
<210>16
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>16
TGACCAGTTAGCCTACG
<210>17
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>17
AACGAGGATCTGCGCTC
<210>18
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>18
GCGGACACGGCGGCTCA
<210>19
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>19
GCGGACAAGGCGGCTCA
<210>20
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>20
GGCCCGTGCGGCGGAGC
<210>21
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>21
GCGCAAGTTGGAGGCGG
<210>22
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>22
GCCCTGAATGAGGACCT
<210>23
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>23
GAGTATTCGGATCGGGA
<210>24
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>24
GAGTATTGGGACCGGGA
<210>25
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR引物。
<400>25
AGTGGGCTACGTGGACGACAC
<210>26
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR引物。
<400>26
CGCTTGTACTTCTGTGTCTCC
<210>27
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR引物。
<400>27
GACGGGCGCCTCCTCCGCGGG
<210>28
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR引物。
<400>28
CTGCGGAGCCACTCCACGCAC
Claims (1)
1.一种DNA微阵列芯片检测试剂盒，用于对HLA-C基因进行分型检测，该试剂盒由通过将22种寡核苷酸探针点制在玻片上而制成的DNA微阵列芯片、4种引物以及其它组分组成，其特征在于22种寡核苷酸探针的序列分别为：
C1：5’-GCGAGTCCAAGAGGGGA-3’
C2：5’-CGTGCAGTTCGACAGCG-3’
C3：5’-GCCGCGGGAGCCGTGGG-3’
C4：5’-GGGGAGCCCCGGGCGCC-3’
C5：5’-ACACAGAACTACAAGCG-3’
C6：5’-CCGAGTGAACCTGCGGA-3’
C7：5’-CTGCGGAAACTGCGCGG-3’
C8：5’-AGGCACAGGCTGACCGA-3’
C9：5’-AACCAGAGCGAGGACG-3’
C10：5’-CCTCCAGAGGATGTTTG-3’
C11：5’-TCTCACATCATCCAGAG-3’
C12：5’-CCTCCAGAGGATGTACG-3’
C13：5’-GCTGCGACGTGGGGCCC-3’
C14：5’-CTGGGGCCGGACGGGCG-3’
C15：5’-TGACCAGTCCGCCTACG-3’
C16：5’-TGACCAGTTAGCCTACG-3’
C17：5’-AACGAGGATCTGCGCTC-3’
C18：5’-GCGGACACGGCGGCTCA-3’
C19：5’-GCGGACAAGGCGGCTCA-3’
C20：5’-GGCCCGTGCGGCGGAGC-3’
C21：5’-GCGCAAGTTGGAGGCGG-3’
C22：5’-GCCCTGAATGAGGACCT-3’，
4种引物序列分别为：
P1：AGTGGGCTACGTGGACGACAC
P2：5’-CGCTTGTACTTCTGTGTCTCC-3’
P3：5’-GACGGGCGCCTCCTCCGCGGG-3’
P4：5’-CTGCGGAGCCACTCCACGCAC-3’。
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Citations (1)
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| CN1451760A (zh) * | 2002-04-16 | 2003-10-29 | 中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所 | Hla分型用寡核苷酸芯片的制备及用法 |
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2008
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Non-Patent Citations (2)
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| 张伯伟等.DNA基因芯片在中华骨髓库HLA组织配型检测中的应用价值.《中国卫生工程学》.2006,第5卷(第4期), * |
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