JP4381457B2 - 標的核酸配列の検出方法 - Google Patents
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Description
近年培養法は、検出感度の向上や培養日数の短縮のために更なる改良工夫がなされている。特に、抗原抗体反応を用いたイムノクロマトグラフィーは簡便な識別法として急速に普及してきている(例えば、特許文献1及び2参照。)。しかしながら、依然として、菌の発育に数週間かかることから、医療現場のニーズに対応できているとは言い難い。患者は、判定結果がでるまでの間、誤った治療を受けているケースが少なくない。
その他、LAMP増幅産物を検出する手法として、インターカレーターを用いるものや光学的特性を利用する方法がある(例えば、特許文献6参照。)。さらに別の方法として、LAMP産物中に存在する1本鎖ループ部分にハイブリダイズするプローブを蛍光標識し、反応液の蛍光偏光度を測定するものや(例えば、特許文献7参照。)、1本鎖ループ部分にハイブリするプライマーの5’末端側に不溶性担体を固定化し、増幅反応に伴う凝集反応を観察するものがある(例えば、特許文献8参照)。
一端が固相基体表面に結合され且つ、前記ターゲット配列に対して相補的な配列を有するプローブ核酸を準備する工程と、
前記測定用核酸と前記プローブ核酸とを反応させることにより、前記測定用核酸のターゲット配列部分を前記プローブ核酸に特異的にハイブリダイズさせる工程と、
前記プローブ核酸にハイブリダイズした前記測定用核酸の有無を検出する工程と、
を具備し、
前記プローブ核酸にハイブリダイズした前記測定用核酸を検出を二本鎖特異的なインターカレーターを添加して行うことを特徴とするターゲット核酸の検出方法が提供される。
また、本発明の他の態様において、前記プローブ核酸はDNAチップを構成している。
本発明の方法における第一の特徴は、両端の相補的配列部分および該相補的配列部分の間に存在するターゲット配列部分を含み、且つ前記両端の相補的配列部分のハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖部分およびそれ以外のループ状一本鎖部分を含んでなるステム・アンド・ループ構造の測定用核酸を対象として、ターゲット核酸配列の検出が行なわれることである。このようなステム・アンド・ループ構造の核酸は、例えば一本鎖DNAまたはRNAが自己ハイブリダイゼーションしたときにも形成されるが、最も典型的な例は、LAMP法による増幅産物として形成される。
本発明においては、図4で説明したように、ステム・アンド・ループ構造を有する測定用核酸の一本鎖のループ構造内に含まれるターゲット配列を、これと相補的な配列を有するプローブ核酸を用いて検出する。このプローブ核酸は固相基体表面に固定化されたものであり、典型的にはDNAチップとして構成されたものを用いるが、他のマイクロアレイを構成するプローブを用いてもよい。
前記測定用核酸は、その中に含まれる一本鎖のターゲット配列と前記プローブ核酸との特異的ハイブリダイゼーション反応により、前記固体表面に結合される。本発明においては、プローブ核酸およびターゲット配列部分がハイブリダイズしたときに、測定用核酸の二本鎖部分が固相表面から離間する方向に伸びるように、プローブ核酸および前記ターゲット配列部分の双方における5′→3′の配列の向きを設定することも好ましい(図5(A)参照)。すなわち、これは、プローブ核酸およびターゲット配列部分の双方における5′→3′の配列の向きが図5(C)に例示したような向きを有する場合、LAMP産物に特徴的な複雑な高次構造が、プローブが結合した基体と立体障害を起こし(図6(B)参照)、これが要因となってハイブリダイゼーション効率が低下するとの知見に基づき見出されたものであり、プローブ核酸およびターゲット配列部分がハイブリダイズしたときに、測定用核酸の二本鎖部分が固相表面から離間する方向に伸びるようにプローブ核酸およびターゲット配列部分双方における5′→3′の配列の向きを図5(B)に例示したように設定することにより、LAMP産物とプローブ核酸が結合した固相基体との立体障害が回避され(図6(A)参照)、これによりハイブリダイゼーション効率をより向上させることが可能である。
本発明において、プローブ核酸にハイブリダイズした測定用核酸の有無を検出する手段は特に限定されるものではなく、例えば、蛍光ラベルに基づいて検出してもよいし、あるいは二本鎖特異的で且つ電位差を生ずるインターカレータを用いて電気的に検出してもよい。
本実施例では、サンプル用核酸としてLAMP増幅産物を製造し、ハイブリダイゼーション反応後、該LAMP増幅産物中に存在する標的核酸を電流検出方式を用いて検出した。LAMP反応は以下に示す2組のプライマーを使用し、N-Acetyltransferase 2 (NAT2) 遺伝子の一部分を増幅させた。
プライマー1
標的核酸配列がLAMP増幅産物の2本鎖領域(ステム領域)に存在するように設計する。図7に周辺ゲノム配列を示す。
NAT FIP Primer: 5’ TGTTTCTTCTTTGGCAGGAGATGAGAA-GGACCAAATCAGGAGAGAGCA 3’
NAT B3 Primer : 5’ GATGAAGCCCACCAAACAGTA 3’
NAT BIP Primer: 5’ ATGAATACATACAGACGTCTCC-CTGGGGTCTGCAAGGAAC 3’。
標的核酸配列がLAMP増幅産物の1本鎖領域(ループ領域)に存在するように設計する。図8に周辺ゲノム配列を示す。
NAT FIP Primer: 5’ CGTCTGCAGGTATGTATTCATAGACTCAAAAAATATACTTATTTACGCTTGAACC 3’
NAT B3 Primer : 5’ CGACCAGATCTGTATTGTCTT 3’
NAT BIP Primer: 5’ ATAACCACATCATTTTGTTCCTTGCATGAATTTTCTATAGGTGAGGATGA 3’。
LAMP反応溶液は以下の組成とした。
滅菌超純水 1.5μL
Bst DNA ポリメラーゼ 1 μL
バッファー 12.5μL
Tris HCl(pH8.0) 40 mM
KCl 20 mM
MgSO4 16 mM
(NH4)2SO4 20 mM
Tween20 0. 2%
Betaine 1.6 M
DNTP 2.8 mM
F3−プライマー(10μM) 0.5 μL
B3−プライマー(10μM) 0.5 μL
FIP−プライマ(10μM) 4 μL
BIP−プライマ(10μM) 4 μL
テンプレート(purified human genome) 1 μL
合計 25 μL。
温度は58℃、時間は1時間として核酸増幅を行った。この時、テンプレートの代わりに滅菌水を添加したものをnegative controlとした。
上記の方法で増幅したLAMP産物を図9に示すようにアガロースゲル電気泳動で確認した。また、目的産物の有無は制限酵素切断により確認した。図9において、レーン1〜7はそれぞれ以下に示すサンプル1〜7に対応する。
1.100bP ladder (TAKARA)
2.Negative control: 二本鎖領域に標的核酸が存在
3.Positive control: 二本鎖領域に標的核酸が存在
4.Negative control: 一本鎖領域に標的核酸が存在
5.Positive control: 一本鎖領域に標的核酸が存在
6.PstI 制限酵素処理:二本鎖領域に標的核酸が存在
7.PstI 制限酵素処理:一本鎖領域に標的核酸が存在。
核酸プローブの塩基配列を以下に示す。
Positive-probe FP: AACCTCGAACAATTG
3’ SH, 5’ SH プローブ 計二本
Positive-probe FPc: CAATTGTTCGAGGTT
3’ SH, 5’ SH プローブ 計二本
N-probe NP: CTGGACGAAGACTGA。
試料核酸は、上記(3)で増幅したLAMP産物を用いた。(4)で作製した核酸プローブ固定化表面を2×SSCの塩を添加したLAMP産物に浸漬し、35℃で60分間静置することによってハイブリダイゼーション反応を行った。その後、超純水で軽く洗浄した。この電極を挿入剤であるヘキスト33258溶液を50μM含むリン酸緩衝液中に15分間浸漬した後、ヘキスト33258分子の酸化電流応答を測定した。
電流測定の結果を、各プローブを固定した電極における電流値増加量として図11に示す。二本鎖部分(ステム部分)に標的配列が存在するLAMP産物では、NP、3´SH FP、3´SH FPc、5´SH FP、および5´SH FPcのすべてにおいてハイブリダイズに由来する電流値増加は見られなかった(図11(A))。これに対し、一本鎖ループ部分に標的核酸が存在するLAMP産物では、NP、3´SH FP、5´SH FPcではハイブリダイズに由来する電流値増加は見られなかったが、3´SH FPcと5´SH FPでは、ハイブリダイズに由来すると推測される大きな電流値増加が見られた(図11(B))。
LAMP産物については、実施例1、(1)合成オリゴヌクレオチド プライマー2を用い増幅させたものと同一のものを使用した。
核酸プローブの塩基配列を以下に示す。
Positive-probe FPc SNP: CAATTGTTGGAGGTT 3’ SH
Positive-probe FPc 25mer: ATCTTCAATTGTTCGAGGTTCAAGC 3’ SH
Positive-probe FPc 25mer SNP: ATCTTCAATTGTTGGAGGTTCAAGC 3’ SH
N-probe NP: CTGGACGAAGACTGA 3’ SH
FPcとNPは実施例1で使用したものと同一のものである。FPc SNPはFPc配列の中央付近の配列をG→Cに変換したものである。FPc 25merはFPcの上流側、下流側にそれぞれ5塩基ずつ標的核酸配列をのばしたものである。FPc 25mer SNPは、FPc 25mer配列の中央付近の配列をG→Cに変換したものである。上記5本のプローブはすべて3´SH修飾とした。
試料核酸は、上記(1)で増幅したLAMP産物を用いた。(2)で作成した核酸プローブ固定化表面を2×SSCの塩を添加したLAMP産物に浸漬し、35℃で60分間静置することによってハイブリダイゼーション反応を行った。その後、35、40、45℃の0.2×SSCバッファーにそれぞれ40分間浸漬し、その後、超純水で軽く洗浄したものとハイブリダイゼーション後に超純水で軽く洗浄しただけのもの、計4種類の洗浄条件の基板を作成した。この電極を挿入剤であるヘキスト33258溶液を50μM含むリン酸緩衝液中に15分間浸漬した後、ヘキスト33258分子の酸化電流応答を測定した。
電流測定の結果を、各プローブを固定化した電極における電流値増加量として図13に示す。FPcとPFcSNPについては、(A)ハイブリ後、超純水で軽く洗浄しただけの基板で、PFcSNPでは電流値増加がみられないが、FPcでは優位な電流値増加が見られている。さらに、(B)ハイブリ後、0.2×SSC溶液で洗浄を35℃、40分行った基板では、FPcとPFcSNP共に電流値増加が見られなくなった。このことから、FPcとPFcSNPは(A)の洗浄条件の場合に一塩基変異を判定できることが明らかになった。
Claims (3)
- 両端の相補的配列部分および当該相補的配列部分の間に存在するターゲット配列部分を含み、且つ前記両端の相補的配列部分のハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖部分およびそれ以外のループ状一本鎖部分を含んでなるステム・アンド・ループ構造の測定用核酸を準備する工程と、
一端が固相基体表面に結合され且つ、前記ターゲット配列に対して相補的な配列を有するプローブ核酸を準備する工程と、
前記測定用核酸と前記プローブ核酸とを反応させることにより、前記測定用核酸のターゲット配列部分を前記プローブ核酸に特異的にハイブリダイズさせる工程と、
前記プローブ核酸にハイブリダイズした前記測定用核酸の有無を検出する工程と、
を具備し、
前記プローブ核酸にハイブリダイズした前記測定用核酸の検出を二本鎖特異的なインターカレーターを添加して行うことを特徴とするターゲット核酸の検出方法。 - 請求項1に記載のインターカレーターが電気化学的に活性のあるインターカレーターであるターゲット核酸の検出方法。
- 前記測定用核酸がLAMP法により増幅されたLAMP産物であることを特徴とする、請求項1乃至2のいずれか1項に記載の方法。
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