CN103710431A - 一种检测基因突变引物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测基因突变引物及应用,该引物包括锚定序列、嘌呤环和检测序列，锚定序列位于引物5’-端与靶序列有大于14个碱基互补，嘌呤环为引物3’-端第5～8个碱基位置由3～4个黄嘌呤核苷、次黄嘌呤核苷或脱氧次黄嘌呤核苷形成泡状环，检测序列位于引物3’-末端由5～8个碱基组成。本发明的技术方案中由于引物3’-末端起第5～8个碱基位置插入的泡状环且与靶序列对应位置有“0”或“1”个碱基对位形成泡状环赋予了引物高度特异基因突变检测能力，因此本发明的引物可抑制非特异性扩增，提高了检测能力，可应用于检测低拷贝基因突变检测、多重PCR、基因芯片等领域。
Description
技术领域
本发明涉及检测低拷贝突变的技术领域，特别是一种检测基因突变的引物及应用。
背景技术
随着个性化医疗事业的发展，SNP基因分型分子诊断技术在药物基因组学的研究中发挥着越来越重要的作用，分子诊断技术或基因诊断技术己经逐步应用于临床的辅助诊断和用药。目前，我国在SNP、突变分子等诊断技术上的检测技术相对比较落后，随着国家十二五中长期发展纲要的逐步实施，特别是临床诊断技术发展规划的提出，将逐步促进我国临床诊断水平的快速发展。开发一种快速、准确的SNP检测方法，并将其应用于肿瘤的早期筛查、肿瘤靶向用药和预后、细菌和病毒的耐药性研究具有非常重要现实意义。
自20世纪80年代PCR技术问世，PCR技术被逐渐广泛地应用于分子诊断中，基于PCR技术的SNP检测技术也得到了迅速的发展，并不断衍生出诸如：PCR-RFLP，allele-sepecific PCR，TaqMan probe，ARMS，PNA-LNA clamp荧光PCR、Cycleave probe PCR，Nanofluidic Digital PCR Arrays，MassArray和DNA芯片等新的检测手段和技术。PCR-RFLP是早期实验开发检测SNP分型技术，它依赖于巧妙地选择限制性内切酶切出用于识别突变位点的短片段长度多态，但是这种方法需要电泳分离酶消化之后的产物，这将严重限制反应的通量和操作的自动化。ARMS技术与allele-sepecific PCR大致相同，利用Taq酶缺失3’～5’的外切活性，3’端错配的引物低于正常引物的延伸速度，当错配数目达到一定的严谨程度时，3’-端则无法延伸，如果PCR有条带，说明有相应的突变。ARMS技术敏感性和特异较高，已经成功应用于临床检测SNP，但是ARMS技术最低只可以检测到10个拷贝，很大程度上，限制了其广泛用于临床检测细菌和病毒的耐药、分型检测。TaqMan探针是一种寡核酸探针，在探针的3’末端连接有荧光报告基团，而5’末端连接有荧光淬灭基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，当PCR扩增时，Taq酶的5’外切酶活性能将结合到靶DNA链上的探针的淬灭基团切除掉，使探针的荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。通过使用不同的荧光报告基团，在同一个PCR中可以同时检测不同的酶切消化等位基因特异性探针。这种5’外切酶实验己经成功用来区分只有一个碱基差异的等位基因。尽管如此，Taqman探针技术同样遇到ARMS技术相同的开发瓶颈。
Cycleave probe PCR，技术原理类似Taqman探针，只是探针含有一个rNTP碱基于SNP互补，当存在突变时，rNTP与突变配对，RNaseＨ识别并切割rNTP，使探针的荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，荧光产生，此项技术缺点是背景较高，探针容易降解，引物探针设计受限制。PNA-LNA-clamp技术，采用NestPCR技术和PNA-LNA-clamp探针，PNA-LNA-clamp探针特异性的封闭野生性SNP，阻止野性性模板扩增从而达到扩增突变的目的。虽然这项技术很灵敏，但经历两次PCR容易污染，探针设计也受到限制。上述检测技术采用普通的引物对靶序列进行扩增检测，尤其是多重PCR难以避免非特异性扩增。Jong-Yoon Chun等发明的DPO（Dual priming oligonucleotide system，美国专利号US2013/0090464A1）提出在引物中插入5个黄嘌呤或次黄嘌呤且与靶序列有5个碱基对位，可以增加引物的特异性，抑制非特异性扩增，且具有SNP的检测能力。DPO主要为多重PCR设计，由于引物3’-端起第10个碱基位置插入5个次黄嘌呤的且与靶序列有5个碱基对位，虽然一定程度上抑制了非特异性扩增，DPO的敏感性和基因突变的检测能力并不明显。基于以上，开发出一种经济实用型、特异性高、敏感性强的基因突变检测方法是当前要研究的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：针对现有的检测目的基因突变技术存在敏感性弱、检测能力弱、特异性弱等问题，提供一种可检测出低拷贝的基因突变，并提供一个新的检测体系的检测基因突变的引物及其应用，从而可以高效、特异的扩增需要检测的目的基因突变。
本发明采用的技术方案是：一种检测基因突变的引物，该引物包括如下三部分：
1）锚定序列：该序列位于引物5’-端，与模板有大于14个碱基配对；
2）嘌呤环：引物3’-端起第5～8个碱基位置插入有3～4个黄嘌呤核苷、次黄嘌呤核苷或脱氧次黄嘌呤核苷，与靶序列的同等位置上有“1”个碱基或“0”个碱基对位，形成“3:0”、“4:1”、“3:1”或“4：0”的泡状嘌呤环结构；
3）检测序列：引物3’-末端由5～8个碱基组成的基因突变检测序列，特异性检测单核苷酸多态性和基因突变。
上述引物的结构如附图1所示，引物由16～30个碱基组成（含插入的嘌呤环），引物与靶序列结合的Tm值为40～65℃，检测序列与靶序列结合的碱基个数为5～8个，优选“6”或“7”碱基组成的序列；特异性检测基因突变的碱基可放置在检测序列3’-末端起第“1”、“2”、“3”或“4”个碱基位置，优选3’-末端起第3个碱基位置；检测探针与靶序列结合的Tm值为10～20℃。下面以引物3’-末端起插入第6个碱基位置插入3～4个脱氧次黄嘌呤核苷（方便描述用字母“I”表示脱氧次黄嘌呤核苷），检测基因突变的碱基位于检测序列3’-末端起第3个碱基位置为例，具体如下a、b、c、d所示：
a.插入的3个脱氧次黄嘌呤核苷与靶序列有“0”碱基对位:
5’…GCC-TTG-GGT-GGC-III-TTT-AGG
5’……GCC-TTG-GGT-GGC——TTT-AGG-ACA-TGG-ACA-TTG-A……3’；
b.插入的4个脱氧次黄嘌呤核苷与靶序列有“0”对位：
5’…GCC-TTG-GGT-GGC-IIII-TTT-AGG
5’……GCC-TTG-GGT-GGC——TTT-AGG-ACA-TGG-ACA-TTG-A……3’；
c.插入的3个脱氧次黄嘌呤核苷与靶序列有“1”碱基对位:
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5’…GCC-TTG-GGT-GG-C-TTT-AGG-ACA-TGG-ACA-TTG-A…3’；
d.插入的4个脱氧次黄嘌呤核苷与靶序列有“1”碱基对位:
5’…GCC-TTG-GGT-GG-IIII-TTT-AGG
5’…GCC-TTG-GGT-GG-C—TTT-AGG-ACA-TGG-ACA-TTG-A…3’。
上述引物检测基因突变的原理如附图2所示，当野生型模板（A/T）存在，本发明设计的引物特异性检测基因突变（G/C）与野生型模板结合不稳定，DNA聚合酶无法延伸，扩增受阻；当突变模板（G/C）存在下，引物识别突变，DNA聚合酶结合并延伸。
“基因突变”包括碱基缺失、插入和定点突变等。引物的设计原则尽可能遵守普通引物的设计和探针的设计原则，上述引物可搭载不同的荧光探针信号系统或与其他的信号系统、引物组合形成新的基因突变检测引物和探针，如：Taqman探针、分子信标、楔形探针、双环探针等。该技术可以应用于核酸检测技术检测基因突变、单核苷酸多态性、多重PCR和基因芯片。这些核酸扩增技术包括恒温扩增（NASBA、TMA、SDA、RCA等）和变温扩增（PCR），此外本发明还可以用于转录介导的恒温扩增（TMA、NASBA）、链置换（SDA）等恒温扩增的其他核酸检测方法。
上述PCR扩增方法，具有以下步骤：
1）初始变性2～10分钟；
2）富集突变：需要2～10个循环来富集单核苷酸多态性和基因突变，包括变性、退火、延伸；
3）突变检测：30～35个循环的检测过程，包括变性、退火、延伸等过程。上述PCR扩增的方法特征在于，第（2）和第（3）部分的退火温度Tm均为50～65℃。
本发明应用的PCR体系的特点在于：变性-退火-延伸等过程，做了优化。首先SNP或者突变富集阶段，采用2～10循环富集突变，这个阶段的退火温度为50～65℃；其次，突变检测阶段，30～35个循环，富集和突变检测阶段的退火温度和延伸的时间视扩增片段大小而定。
本发明的核心是在3’-端第5～8个碱基位置，插入3～4个黄嘌呤核苷、次黄嘌呤核苷或脱氧次黄嘌呤核苷，其目的有三，一方面提高引物的特异性，抑制非特异性扩增，提高诊断的准确性；另一方面，由于黄嘌呤核苷与碱基（A、G、C、T）结合力弱，且与模板只有1个或者0个位置的碱基对位，形成由3～4个黄嘌呤核苷组成的泡状环，降低了引物与模板结合的Tm值；第三，正是因为这个泡状环的存在，使得引物3’-末端5～8个碱基序列具有了特异性识别和检测基因突变的能力。
本发明的有益效果在于：
1）由于引物3’-末端起第5～8个碱基位置，优选6～7个碱基位置插入3～4个黄嘌呤核苷且与靶序列对应位置有“0”或“1”个碱基对位形成泡状环将引物分成三部分，赋予了引物高度特异基因突变检测能力。因此本申请的技术方案可最大程度上抑制非特异性扩增，提检测能力。
2）本发明的引物具备高度特异性的SNP和基因突变的检测能力，能够从高强度背景中发现低拷贝的突变，使得该方法可广泛应用于细菌病毒耐药突变、分型检测，肿瘤个性化用药、超低浓度的细菌病毒检测、多重PCR、基因芯片等领域。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明；
图1是本发明的引物的结构示意图；
图2是图示解释本发明检测DNA突变反应示意图；
图3是应用本发明设计的特异性检测HBV C基因型的引物和探针检测1E+7IU/ml B基因质粒和1E+6IU/ml-1E+2IU/ml C基因质粒；
图4是应用本发明设计的特异性检测拉米夫定rtL180M耐药；
图中，1.锚定序列,2.嘌呤环,3.检测探针，4.应用C基因引物检测1E+6IU/ml C基因质粒，5.应用C基因引物检测1E+5IU/ml C基因质粒，6.应用C基因引物检测1E+4IU/ml C基因质粒，7.应用C基因引物检测1E+3IU/mlC基因质粒，8.应用C基因引物检测1E+2IU/ml C基因质粒，9.应用C基因引物检测1E+7IU/ml B基因质粒，10.为PCR阴性对照，11.设计检测rtL180M突变引物检测1E+6IU/ml突变模板，12.设计检测rtL180M突变引物检测1E+5IU/ml突变模板，13.设计检测rtL180M突变引物检测1E+4IU/ml突变模板，14.设计检测rtL180M突变引物检测1E+3IU/ml突变模板，15.设计检测rtL180M突变引物检测1E+2IU/ml突变模板，16.设计检测rtL180M突变引物检测1E+8IU/ml野生型模板。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例一
乙肝病毒C基因检测，本实例以本发明的方法设计检测180耐药位点。
材料：
| 材料名称 | 公司 |
| Hotstart Taq polymerase | 上海生工 |
| Mg2+ | 上海生工 |
| PCR buffer | 上海生工 |
| dNTP mix（dA、dG、dC、dT） | Promega |
1.样本和标准品准备：
接受来自临床的样本，200ul血清，加入蛋白酶K和buffer AL，混匀15s，56℃消化10分钟，重复混匀，加入200ul无水乙醇，混匀15s，将液体小心移入2ml的离心柱中，6000g（8000rpm）离心一分钟。加入500ul buffer AW1，6000g（8000rpm）离心1分钟，小心打开盖子加入500ul AW2，6000g（8000rpm）离心1分钟，空管20000g离心3分钟，加入50ul ATE buffer与膜中央，室温10分钟，20000g离心1min。
2.HBV B基因和C基因标准品制备：
60ul体系包含：500nM上游引物（5’-CCGGAAAGCTTGAGCTCTTCTTTTTCACCTCTGCCTAATCA-3）、500nM下游引物（5’-CCGGAAAGCTTGAGCTCTTCAAAAAGTTGCATGGTGCTGG-3’），5ul HBV DNA模板，250nM dNTP，5ul10X LAMP buffer，0.5ul Lamp Taq polymerase（康为世纪生物）。
采用Touch-down PCR方法：
1）收集：95℃2min，95℃30s，60℃60s，72℃3min，共10循环，每次循环后，退火温度降低0.3～0.5℃；
2）扩增：95℃30s，60℃60s，72℃3min，30循环。PCR产物采用Axygen公司胶回收试剂盒纯化后，连接致pGEM-5Zf(+)载体，转化DH5a宿主菌。挑取白色菌落，并用PCR法鉴定，对阳性克隆做大量培养。质粒全长测序鉴定后，采用NanoDrop200稀释成备用。
3.检测HBV C基因型
引物、探针设计和合成，通过比对HBV A～H基因全基因组序列，找到可以准确分C基因型的单个碱基，设计引物和探针如下：
特异性区分C基因型引物：
上游引物：TGTCTGCGGCGTTTTATCAT
下游引物：GTAGTTGATGTTCCTGIIIGAAGTA
探针：Fam-agaagatgaggcatagcagcagga-BHQ1
将上述引物和探针送往上海生工生物股份有限公司合成，合成后用去离子水稀释。
检测C基因PCR体系：
实时PCR反应条件是：94℃预变性10min；富集阶段：10个循环，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸25s；突变检测阶段：30个循环，94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸20s。应用ABI7500荧光PCR在突变检测阶段退火步骤检测荧光，软件采用Auto自动分析。
4.基因判定：Ct<30则为相应的基因型。
5.检测能力分析：
应用C基因型引物和探针检测1E+7IU/mlB型质粒、1E+7-1E+2IU/ml C基因质粒，结果显示应用本发明设计的引物可以非常好的区分C基因型。由图3可知：设计特异性检测C基因探针扩增1E+7IU/ml B基因质粒，不出峰（图3中，数据“9”标记的曲线）；本发明设计的引物和探针体系可以特异性检测出1E+2IU/ml C基因质粒（图3中，“8”标记的曲线）；图3中“4-8”分别表示应用本专利技术设计的引物和探针检测1E+6-1E+2IU/ml HBV C基因质粒，图3中“9”表示检测1E+7IU/ml B基因质粒，曲线“10”位于曲线“9”的下方，曲线“10”为PCR阴性对照。
6.临床样本检测
随机收集三院50例临床样本，应用本发明设计的引物和探针体系检测HBVB和C基因型，其结果与测序比较。应用本技术的检测结果与测序完全一致。
实施例二
检测拉米夫定HBV rtL180M耐药位点。
我国是乙肝病毒感染的重灾区，目前临床上治疗慢性乙肝的手段是抑制病毒的复制，转氨酶复常和肝组织改善等。长期有效的方法是抗病毒药物的治疗，这些药物如拉米夫定、阿德福韦等可以有效抑制乙肝病毒的复制。但是由于乙肝病毒转录复制缺乏严谨的矫正体系，在抗病毒药物治疗的过程中很容易产生耐药突变，治疗两年耐药率可以达到22%，长期抗病毒药物治疗过程中，缺乏高度敏感和准确的检测手段，使得耐药株得以存活而大量复制，造成治疗失败，对患者身体和经济造成不小的损失。本实例以检测拉米夫定耐药位点rtL180M为例。
1.标准品制备：筛选临床上测序验证的rtL180M样本，应用Qiagen DNAmini kit纯化HBV DNA。全长扩增、构建含rtL180M的HBV全基因组质粒，测序验证，稀释备用。
2.引物探针如下表，于上海生工合成。
| 名称 | 5'～3' | 修饰 |
| 180R | GCACTAGTAAACTGAGIIIICCATGA | dI |
| 180F | TGTTTCCCTCTTGTTGCTGT | N/A |
| 180P | CACCTGTATTCCCATCCCATCATCTT | 5FAM,3TAMRA |
3.25ulPCR体系包含：
4.扩增条件：实时PCR反应条件是：94℃预变性10min；富集阶段：10个循环，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸25s；突变检测阶段：30个循环，94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸20s。应用ABI7500荧光PCR在突变检测阶段退火步骤检测荧光，软件采用Auto自动分析。
5.结果分析：应用本发明设计的引物和探针体系具有高度特异性，可以检测1E+2IU/ml突变模板（图4中，“15”指示的曲线）；而扩增1E+8IU/ml的野生型模板不出峰（图4中“16”指示的曲线）；图4中，数据“11”～“15”分别表示检测1E+6IU/ml～1E+2IU/ml rtL180M突变质粒，“16”为1E+8IU/ml野生型质粒。
从上述实施例中可以看出，本发明的引物具有高度特异的检测能力，具有从高背景中检测低拷贝的能力。
Claims (9)
1.一种检测基因突变引物，其特征在于：该引物包括如下三部分：
1）锚定序列：该序列位于引物5’-端，与靶序列有大于14个碱基配对；
2）嘌呤环：引物3’-端起第5～8个碱基位置插入有3～4个黄嘌呤核苷、次黄嘌呤核苷或脱氧次黄嘌呤核苷，与靶序列的同等位置上有“1”个碱基或“0”个碱基对位，形成“3:0”、“4:1”、“3:1”或“4：0”的泡状嘌呤环；
3）检测序列：位于引物3’-末端由5～8个碱基组成的基因突变检测序列。
2.根据权利要求1所述的检测基因突变引物，其特征在于：所述引物具有16～30个碱基，引物与靶序列结合的Tm值为40～65℃。
3.根据权利要求1所述的检测基因突变引物，其特征在于：所述检测序列与靶序列结合的碱基个数为5～8。
4.根据权利要求1所述的检测基因突变引物，其特征在于：所述检测序列与靶序列结合的Tm值为10～20℃。
5.根据权利要求1所述的检测基因突变引物，其特征在于：所述检测基因突变的碱基放置在所述检测序列3’-末端起第“1”、“2”、“3”或“4”个碱基位置。
6.根据权利要求5所述的检测基因突变引物，其特征在于：所述检测基因突变的碱基放置在所述检测序列3’-末端起第“3”个碱基位置。
7.根据权利要求3所述的检测基因突变引物，其特征在于：所述检测序列与靶序列结合的碱基个数为6～7。
8.根据权利要求1所述的检测基因突变引物的应用，其特征在于：将引物与其他的信号系统组合形成新的基因突变检测体系，应用于核酸检测技术检测基因突变、单核苷酸多态性、多重PCR和基因芯片的扩增，对这些核酸的扩增包括恒温扩增和变温扩增两种。
9.根据权利要求8所述的检测基因突变的引物的应用，其特征在于：所述变温扩增方法，具有以下步骤：
1）初始变性2～10分钟；
2）富集突变：需要2～10个循环来富集单核苷酸多态性和基因突变，包括变性、退火、延伸；
3）突变检测：30～35个循环的检测过程，包括变性、退火、延伸过程；
所述退火温度Tm均为50～65℃。
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