CN101250581B - 一种检测乙型肝炎病毒p基因ymdd变异的置换扩增法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及“一种检测乙型肝炎病毒P基因YMDD变异的置换扩增法”，其特征在于待测HBV P基因YMDD motif及变异YIDD，YVDD序列通过杂交-连接酶反应置换成指示DNA，再反向扩增指示系统。所述YMDD杂交序列分成左右两半分别加在一段指示DNA首尾两端，加了首尾指示DNA与P基因YMDD区序列杂交，使其首尾靠近契合，杂交链缺口连接酶连接。所述反向扩增指示DNA，采用指示DNA正中间序列作为引物，反向扩增首尾共价相连指示DNA。其缺口两侧碱基匹配依赖性连接使其适合单碱基变异基因分析。一个检测可置换成许多指示PCR，避免仅一套系统扩增产物的再污染。待测RNA也可以杂交一连接反应置换成指示DNA而直接检测。或与SYBR Green染料或荧光分子探针联用还适用于待测基因的实时定量分析。

Description

一种检测乙型肝炎病毒P基因YMDD变异的置换扩增法 

技术领域：

本发明涉及乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus HBV)基因及其变异的分子检测方法。尤其是HBV基因组包括DNA和RNA以及YMDD基因变异的多聚酶链反应(Polymerase ChainReaction)PCR扩增检测法和检测试剂盒。 

背景技术：

乙型肝炎是一种严重威胁人类健康的传染病，据世界卫生组织报导，全球约20亿人曾感染过HBV，其中超过了3.5亿人为慢性乙肝病毒HBV感染者，我国是乙肝感染高流行区。乙型肝炎病毒属嗜肝DNA病毒科，也是慢性肝炎、肝硬化、肝衰竭及原发性肝细胞癌的主要原因。乙肝感染的诊断目前主要依据血清学酶免方法检测，随着PCR技术出现而发展了许多HBV基因扩增PCR检测法，然而PCR太过灵敏容易带来假阳性问题。乙肝感染的控制主要采用乙型肝炎疫苗接种预防，乙肝的治疗采用α-干扰素和核苷酸类抗病毒药拉米夫定(Lamivudine)。然而拉米夫定治疗中受药物选择而容易产生耐药变异株。据临床统计，血清e抗原阳性病人经一年拉米夫定治疗，会有14-32％耐药，长期治疗，第二、三、四年的耐药率增加至38％、49％和66％(Karayianmis P.，Journal of Antimicrobial Chemotherapy2003，51：p761-785)。耐药株基因变异主要在HBV多聚酶活性区PoL/RT片段(349-692 aa，即rt1-rt344)，常见的是酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸YMDD变异，即由YMDD变异为YIDD(rtM204I/aaM552I)或YVDD(rtM204V/aaM552V)，YVDD常伴有rtL180M变异(Lai CL.，et.al.，Clin.Infect.Dis，2003，36：p687-696)。而且血清HBV RNA的YMDD变异更早于HBV DNA变异检测(Hatakeyama.，et.al.，Hepatology；2007，45-5：p1179-86)。因此，检测HBV YMDD基因变异尤其RNA的YMDD变异对调整治疗用药、及时用阿德福韦(adefovir)代替拉米夫定的耐药无效治疗具有重要的指导意义。 

目前对HBV YMDD变异株的检测方法多采用PCR或RT-PCR扩增HBV多聚酶P基因产物测序法(Chayamak，et.al.，Hepatology 1998，27：p1711-1716)；PCR-RFLP限制性片段长度多态性分析法(Allen MI.，et al.，Journal of Clinical Microbiology 1999，37-10：p3338-3347和中国专利200710036511.9)；各种荧光PCR分析法(Whallyey SA，et al.，J Clinical Microbiol，2001，39：p1456-1459；Wang PZ，et al.，World Clin J Digestol 2004，12-3：p600-603和中国专利200510065445.9)；以及线性探针反向杂交法INNO-LipA(Osinwg C.，et al.，Journal of ClinicalMicroliology 2003，41-72：p5473-5477)。这些基于传统PCR技术的应用方法不仅存在着繁琐、费时，不便于临床快速监测，最重要的是PCR技术太过于灵敏，极易产生假阳性扩增。

基因芯片技术是近十年来发展起来的高效大规模并行分析技术，广泛应用于生物学许多领域。并且在HBV拉米夫定抗药性检测中得到应用(Jang H.，et.a1.，Journal of ClinicalMicrobiology，2004，42-9：p4181-4188；中国专利：03111452.0和02221161.6等)。然而这种固相生物芯片加工繁琐昂贵，分子在固相表面较液相中反应不均一，不充分，芯片之间的加工差异而导致重复性不好。需要专用复杂仪器，不便于推广等。我国HBV慢性感染者众多，在拉米夫定治疗中亟待发展更有效，简便，快捷的耐药YMDD变异检测方法，以建立完善的耐药监测体系以指导临床合理用药。 

发明内容：

针对上述领域中的缺陷，提供一种检测乙型肝炎病毒P基因YMDD变异的置换扩增法，通过置换法降低扩增灵敏度来规避PCR产物再污染导致的假阳性问题，同时给合荧光显色，可检测各变异株的含量。 

一种检测乙型肝炎病毒P基因YMDD motif(模体)及变异的置换扩增法，其特征在于：将待测P基因RT区(…sYMDDv…)DNA/RNA作为保留杂交序列与包括一套以上的指示DNA首尾互补序列杂交，连接酶反应，指示加首尾DNA的首尾共价连接，形成置换指示DNA环，再反向PCR扩增；所述待测P基因RT区包括YMDD、及变异YIDD和YVDD基因的DNA和RNA样本，所述指示DNA的序列是与HBV基因包括P基因RT区序列无关的基因序列，无关定义为6-8base碱基以上连续相同为相关，反之无关。所述保留杂交序列为待测基因中P基因RT区含变异(或突变)序列，长度为20-100bp；从变异基因开始断开，形成左、右半部分序列，链长10-50base；所述保留杂交序列优选为P基因RT区一段长30-60base序列片段。所述首尾互补杂交序列是指保留杂交序列的右半部分序列加在指示DNA上游首端，左半部分序列反接在指示DNA的下游尾端，形成指示加首尾DNA，所述指示DNA序列长度为80-1000bp；所述指示DNA序列优选长度为150-500bp。所述连接酶反应的连接酶指DNA ligase包括T4ligase，Taq ligase；所述连接反应包括0℃-20℃连接反应和热循环连接反应。所述反向PCR扩增是采用指示DNA的无关序列设计反向引物，一般采用其正中间序列的右半部分作为反向引物Rev F，左半部分以互补反义序列作为反向引物Rev R，反向扩增置换指示DNA环。 

所述置换扩增体系中还包括有荧光分子信标或荧光染料。所述荧光分子信标为Molecular Beacon，Taqmen或LightCycler，荧光分子信标序列与待测模板保留序列杂交或与指示模板序列杂交。所述荧光染料为DNA荧光染料包括SYBR Green。 

检测乙型肝炎病毒P基因YMDD变异的试剂盒，包括DNA/RNA纯化试剂，Taq连接酶及缓冲液、抑制Oligo、dNTP、Taq Polymerase及缓冲液，DNA荧光染料或分子信标， 凝胶电泳试剂，其特征在于还包括指示加首尾DNA和反向引物Rev F和Rev R。 

本发明置换指示PCR(见图1)工作原理及流程如下： 

基本原理是将待测PCR就是工作PCR的常规概念转变成为用指示PCR系统置换待测PCR来工作。具体置换方法就是选取待测基因一段作为特异保留杂交序列，将这段序列分成左右两半分别加在指示DNA首尾两端，加了首尾的指示DNA就能与待测目的基因杂交，从而指示DNA首尾靠近，缺口连接，使指示DNA成环。再反向PCR扩增首尾连接了的指示DNA。这种置换效率较直接扩增基因效率低，降低了直接PCR的太过的灵敏度。减少指示DNA的量或比例，可以极大地降低非特异性扩增。杂交链缺口两侧碱基配对要完全正确才能连接，因此，可以分析待测基因的单碱基变异。 

1.准各指示DNA： 

以待测乙型肝炎病毒HBV多聚酶催化区POL/RT片段蛋白序列 ，其核酸序列 5’-c tgt t/c tg gct ttc agt tat 

gat gat gtg gt w(a/t)ttg-3’作为待测HBV非耐药株基因的保留杂交序列。变异 核酸序列5’-c tgt t/c tg gct ttc agt tat 

gat gat gtg gtw(a/t)ttgg-3’和变异 

核酸序列5’-c tgt t/c tg gct ttc agt tat 

gat gat gtg gtw(a/t)ttg g-3’作为拉米夫定耐药株基因的保留杂交序列。 

选取一段与HBV无关的日本血吸虫谷胱苷肽-S-转移酶GST基因(13-341nt/aa5-114)约300bp的序列作为YMDD的指示DNA 1，同样的序列首尾各除去约50bp的GST 83-270nt近200bp的序列作为YIDD的指示DNA 2，同样的序列首尾再各除去约25bp的GST105-250nt近约150bp的序列作为YVDD的指示DNA 3；指示DNA 1，2，3构成独立一套指示系统。以此类推，选取另一无关的基因序列作为第二套指示系统，……等等。 

每个保留杂交序列从变异碱基开始断开分成左半部分L和右半部分R。右半部分序列以有意义链序列3’末端加在指示DNA上游5’端20bp序列前面合成指示DNA 5，端制备引物，左半部以互补反义序列3’端接在指示DNA下游尾端20bp的反意义链序列5’端之前合成指示DNA 3’端制备引物。以此对磷酸化的引物和用pfu酶扩增生成平末端的指示加首尾DNA，其首尾两端包含部分待测模板保留序列，制备的指示PCR产物用琼脂糖凝胶电泳纯化及柱纯化。 

2.待测模板一指示DNA杂交连接酶反应： 

指示加首尾DNA与纯化的待测标本杂交，如有阳性模板则通过其保留杂交序列与指示加首尾DNA两头末端序列杂交，使指示DNA两侧5’末端和3’末端因结合待测模板杂交序列而促使同一指示DNA首尾靠近契合(juxtaposed)，其首尾末端磷酸基与羟基间缺口经耐热连接酶Taq Ligase连接修复而生成环状指示DNA。并且杂交链缺口两侧碱基要完全匹配才能修复成环，因此，YMDD指示DNA只能与YMDD motif杂交成环；YIDD指示DNA只能与YIDD motif杂交成环；YVDD指示DNA只能与YVDD motif杂交成环；单碱基错误匹配 不能修复成环而不会相互之间错配。而未杂交的双链同一指示模板链的首尾平末端不能连接，双链指示DNA分子之间平末端的连接效率较双链中单链的缺口修复效率低太多，并因加入过量的平端8-20bp无关序列的Oligo寡聚物双链DNA而几乎全被抑制。结果只有阳性标本模板有杂交序列帮助的指示DNA才能形成环状指示DNA，而阴性标本则只存在线性指示DNA。 

调节指示DNA含量或与待测标本模板比例，可以控制杂交成环效率从而控制最终反向PCR的非特异性背景及检测分析灵敏度。采用连接酶链反应Ligase Chain Reaction(BaranyF.，PNAS 1991，88：p189-193)热循环连接催化，第一循环产生的指示DNA环可以作为第二轮循环的杂交模板，从而进一步提高最终PCR检测的灵敏度。 

3.环状指示DNA反向PCR： 

环状YMDD指示DNA分子1，YIDD指示DNA分子2，YVDD指示DNA分子3均采用同一套DNA序列，只是从两端逐渐缩短，用指示DNA正中间共同的序列作为工作指示PCR引物，向首尾外侧延伸反向扩增环状DNA，间接指示待测模板的存在与多少。而非环状各种指示DNA则反向PCR因中间断开而无法指数扩增。PCR产物用Agarose凝胶检测分析，YMDD指示DNA分子1将产生约300bp的片段，YIDD指示DNA分子2将产生约200bp的片段，YVDD指示DNA分子3将产生约150bp的片段。 

反向实时荧光PCR将反向PCR系统中加入DNA结合染料SYBR Green，或与MolecularBeacon，Taqmen，LightCycler等荧光分子探针联用可实时定量检验待测标本模板含量。一种新型UT-PCR采用将PCR一侧引物5’末端接上一段通用序列，再与该通用序列互补的Taqmen荧光分子探针联用实时定量检测(Zhang Y.，Nucleic Acids Research，2003，31-20：e123)，通用Taqmen不仅减少了荧光分子探针对模板扩增的干扰，而且本底更低。 

4.指示DNA的变通： 

线性指示DNA正中间可以断开，换句话说，可以合成左、右分开独立的两条指示DNA，一条首端加右半部分保留杂交区序列，另一条尾端加左半部分保留杂交序列。中间断开端的序列仍作为反向PCR引物序列。除了不便于指示加首尾DNA的制做，纯化。其余与成环指示DNA方法全部相同。 

本发明优点： 

(1)待测PCR可以置换成许多指示PCR，避免仅一套工作系统扩增产物的再污染。 

(2)拓展了常规PCR灵敏范围，即可降低灵敏度减少非特异性扩增，又可进一步增加灵敏度检测极微量基因。 

(3)待测DNA与RNA均可杂交直接置换成指示DNA，无需RNA逆转录成cDNA，特别适合大量RNA病毒的直接检测。 

(4)尤其适合待测基因的单碱基及多碱基变异分析。 

(5)实时荧光置换PCR，易设置指示对照，定量更准确；与高通量荧光PCR仪联用，适合高通量大规模并行分析。 

附图说明

图1：本发明置换PCR示意图 

其中：(1)待测模板：示意图左侧长直线代表含YMDD motif模板，粗线为有意义链或RNA，细线为反意义链。 

(2)指示模板：右图上断开的双环代表一套指示加首尾模板DNA，包括环线代表的一段与待测基因无关的序列和两端的与待测模板互补的保留杂交序列(短直线部分)。 

(3)左侧代表阳性反应：待测模板与指示加首尾DNA序列杂交后经Taq连接酶修复缺口，形成环状指示DNA，并被反向PCR扩增。 

(4)右侧代表阴性反应：缺口指示加首尾DNA被过量平端双链Oligo竞争抑制，不能被Taq连接酶环化，没有扩增。 

图2A：为慢性乙肝耐药变异检测电泳结果. 

其中：M lane(列)为DNA Marker，1为正常血清标本，2-4为3例YMDD阳性，5为一例YMDD和YIDD混合感染，6为一例YIDD阳性，7为一例YVDD阳性感染，8为阴性pUC19对照，9为混合质粒pYMDD，pYIDD和pYVDD阳性对照 

图2B：为乙型肝炎YIDD和YVDD阳性标本基因商业测序结果。 

具体实施方法 

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。所用试剂均为市售。 

实施例步骤： 

慢性乙型肝炎感染者长期拉米夫定治疗的6例血清和1例正常人血清标本。分别用等量酚/氯仿及单独氯仿抽提，天根Tiangen公司DNA纯化柱纯化。每份标本分别加入混合的指示DNA分子1，分子2，分子3以及双链寡聚DNA抑制物，标本指示DNA杂交连接酶反应，以该连接酶反应液1-2ul作为模板，加入反向PCR引物Reverse F和Reverse R，反向PCR扩增。同时以pUC YMDD(531-582aa)，pUC YIDD和pUC YVDD质粒混合作为阳性对照，单独的pUC19质粒作为阴性对照。 

(一)指示加首尾DNA及引物的准备： 

(1).合成指示PCR引物：(采用固相亚磷酰胺三酯法或商业定购5’末端磷酸化的引物)YMDD 5’端引物MF：首先待测HBV P基因YMDD保留杂交序列右半部分有意义链 18base，再加指示DNA1的首(5’)端最开始的22base有意义链序列。 

5’-tg gat gat gtg gt W ttg gta ggt tat tgg aaa att aag g-3’ 

YMDD 3’端引物MR：首先待测HBV P基因YMDD保留杂交序列左半部分反意义链 20base，再加指示DNA1的尾端最开始的20base反意义链序列。 

5’-t ata act gaa agc caR aca gtc ttt act ata tgc aat tc-3’ 

YIDD 5’端引物IF：首先待测HBV P基因YIDD保留杂交序列右半部分有意义链 17base，再加指示DNA2的首(5’)端最开始的19base有意义链序列。 

5’-t gat gat gtg gt W ttg gaa gag cat ttg tat gag c-3’ 

YIDD 3’端引物IR：首先待测HBV P基因YIDD保留杂交序列左半部分反意义链 21base，再加指示DNA2的尾端最开始的18base反意义链序列。 

5’-at ata act gaa agc caR aca gtc tgc acg ctc ttt tgg-3’ 

YVDD 5’端引物VF：首先待测HBV P基因YVDD保留杂交序列右半部分有意义链 17base，再加指示DNA3的首(5’)端最开始的19base有意义链序列。 

5’-g gat gat gtg gtW ttg gat gaa ggt gat aaa tgg-3’ 

YVDD 3’端引物VR：首先待测HBV P基因YVDD保留杂交序列左半部分反意义链 21base，再加指示DNA3的尾端最开始的17base反意义链序列。 

5’ac ata act gaa agc caR aca gcc acc caa cat gtt gtg-3’ 

分别PCR扩增指示加首尾DNA并用商业PCR产物纯化柱纯化。 

无关序列指示DNA                     1ul 

5’端指示引物Primer(5uM)            1ul 

3’  端指示引物Primer(5uM)          1ul 

10×pfu buffer                      5ul 

10mM dNTP                           1ul 

pfu                                 1ul 

dH₂O                                40ul 

                                    50ul 

置95℃变性5分钟，25个循环，94℃ 30秒，52℃ 30秒，72℃45秒。25个循环后72℃ 10分钟。 

指示PCR产物经天根Tiangen公司的DNA凝胶纯化试剂盒按说明书纯化。 

(2).合成平端双链抑制Oligo寡聚物： 

搜寻一段与待测模板和指示DNA都无关((定义4base碱基或4碱基以上连续相同为相关，反之无关)的短序列，合成一段8-20base单链Oligo，再合成一段与之序列互补反意义链的8-20base单链Oligo，双链Oligo(100uM)混合，95℃加热5分钟，快速冰浴冷却，贮存。 

本实施例采用非常稀有的归位内切酶Homing Endonucleases I-Ceu I部分识别序列： 5’-ggt cct aag gta gcg-3’和互补反意义链：5’-cgc tac ctt agg acc-3’。 

(3).合成反向PCR引物： 

取指示DNA正中间约40bp长的序列，右半部分约20base长的有意义链序列作为5’端反向PCR引物RevF：5’-at ggt gat gtt aaa tta aca c-3’；左半部分约20base长的反意义链作为3’端反向PCR引物RevR：5’-atc aat ata ata agg aag att g-3’。 

(二)待测标本的纯化： 

临床标本核酸纯化： 

(1)HBV DNA样本的纯化： 

等量酚-氯仿抽提，商业DNA纯化柱纯化(详细步骤按Tiangen说明书进行) 

1)：加100-200ul样本于1.5ml EP管中加等量的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提，漩涡振荡，台式离心机离心最高速5分钟。 

2)：上清100-200ul转移至新EP管中，加等量氯仿，振荡，离心。 

3)：上清加4倍的Tiangen结合缓冲液移至纯化柱，洗涤缓冲液洗柱两次，加50ul dH₂O洗脱收集纯化的样本。 

(2)HBV RNA样本的纯化： 

异硫氰酸胍一步法提取总RNA(Chomczynski，P.et，al.1987 Anal.Biochem.Vol162：p156)。 

样本于EP管中加1ml的Trizole(0.5ml 4M异硫氰酸胍，和0.5ml酚，加0.05ml2M醋酸钠PH4.0)变性液裂解，强烈漩涡振荡或用针头反复抽吸，再加200ul氯仿振荡，离心5分钟，取上清加等量0.5ml异丙醇置-20℃2小时再离心沉淀，70％乙醇洗涤一次，加50ul DEPC处理的dH₂O溶解。 

Oligo(dT)顺磁珠纯化mRNA：一般没有必要纯化mRNA，如需要更纯的模板，按Promega公司说明书进行。 

(三)待测标本与指示加首尾DNA杂交连接酶反应： 

纯化的待测样本               1ul 

纯化的指示加首尾DNA          1ul 

10X Taq连接酶缓冲液          1ul 

抑制Oligo(100uM)             1ul 

dH₂O                         16ul 

                             20ul 

置95℃变性5分钟，上述20ul杂交反应液中再加耐热连接酶(采用自制连接酶TaL) 0.5-1ul，置50℃(40℃-70℃)温育10分钟。 

如果此步骤(三)采用连接酶链反应Ligase Chain Reaction热循环连接催化，第一循环产生的指示DNA环可以作为第二轮循环的杂交模板，从而进一步提高最终PCR检测的灵敏度。 

(四)反向PCR： 

杂交连接酶反应液       2ul 

反向引物PrimerRev F    1ul 

反向引物PrimerRev R    1ul 

10mM dNTP              2ul 

10×Taq PCRbuffer      5ul 

Taq polymerase         1ul 

dH₂O                   38ul 

                       50ul 

置94℃变性5分钟，25-30个循环，94℃30秒，54℃30秒，72℃30秒。25-30个循环后72℃10分钟。 

(五)PCR产物分析： 

1.琼酯糖凝胶1.5％-2.0％agarose电泳分析或在反向PCR液中加1ul荧光分子探针或SYBRGreen染料，荧光PCR扩增实时检测。 

2.电泳结果(见图2A)： 

乙型肝炎6例慢性感染血清标本，其3例YMDD阳性(见电泳凝胶2-4lanes)，凝胶显示300bp大小片段；仅一例YIDD阳性(电泳凝胶lane 6)，显示200bp片段；一例YVDD阳性(电泳凝胶lane 7)，显示150bp片段；还有一例为YMDD和YIDD混合感染(电泳凝胶lane 5)，同时显示300bp和200bp大小两条带。正常血清标本没有扩增(电泳凝胶lane 1)；阳性对照pUCYMDD/YIDD/YVDD混合质粒组(电泳凝胶lane 9)同时显示300bp、200bp和150bp三条带。阴性pUC19对照没有扩增(电泳凝胶lane 8)，不显示任何DNA条带。 

乙型肝炎YIDD和YVDD阳性标本基因经克隆，商业测序检测(见图2B)，其基因序列为YIDD和YVDD突变。 

实验证明，本发明的检测结果与商业测序相符合。 

Claims (8)

1.一种检测乙型肝炎病毒P基因YMDD motif及变异的置换扩增法，将待测P基因RT区DNA/RNA作为保留杂交序列与包括一套以上的指示加首尾DNA的首尾互补序列杂交，连接酶反应，指示加首尾DNA的首尾共价连接，形成置换指示DNA环，再反向PCR扩增所述置换指示DNA环；所述待测P基因RT区包括YMDD、及变异YIDD和YVDD基因的DNA样本，所述保留杂交序列为待测基因中P基因RT区含变异序列长度为20-100bp序列；从变异基因开始断开形成左、右半部分序列，链长10-50base；所述指示DNA的序列是与HBV基因包括P基因RT区序列无关的基因序列，序列长度为80-1000bp；所述首尾互补杂交序列是指保留杂交序列的右半部分序列加在指示DNA上游首端，左半部分序列反接在指示DNA的下游尾端，形成指示加首尾DNA，所述连接酶反应包括0℃-20℃连接反应和热循环连接反应；所述反向PCR扩增是采用指示DNA正中间序列的右半部分作为反向引物Rev F，左半部分以互补反义序列作为反向引物Rev R，反向扩增置换指示DNA环，其特征在于：所述检测YMDD基因的其中一套指示加首尾DNA由以下引物扩增日本血吸虫谷胱苷肽-S-转移酶GST基因而得：

YMDD 3’端引物MR：5’-tg gat gat gtg gtW ttg gta ggt tat tgg aaa att aag g-3’，

YMDD 3’端引物MR：5’-t ata act gaa agc caR aca gtc ttt act ata tgc aat tc-3’；

所述检测变异YIDD基因的其中一套指示加首尾DNA由以下引物扩增日本血吸虫谷胱苷肽-S-转移酶GST基因而得：

YIDD 5’端引物IF：5’-t gat gat gtg gtW ttg gaa gag cat ttg tat gag c-3’，

YIDD 3’端引物IR：5’-at ata act gaa agc caR aca gtc tgc acg ctc ttt tgg-3’；

所述检测变异YIDD基因的其中一套指示加首尾DNA由以下引物扩增日本血吸虫谷胱苷肽-S-转移酶GST基因而得，

YVDD 5’端引物VF：5’-g gat gat gtg gtW ttg gat gaa ggt gat aaa tgg-3’，

YVDD 3’端引物VR：5’-ac ata act gaa agc caR aca gcc acc caa cat gtt gtg-3’；

所述反向扩增引物Rev F和Rev R如下：

Rev F：5’-at ggt gat gtt aaa tta aca c-3’；RevR：5’-atc aat ata ata agg aag att g-3’。

2.根据权利要求1所述的置换扩增法，其特征在于：所述连接酶反应中的连接酶指DNA ligase。

3.根据权利要求2所述的置换扩增法，其特征在于：DNA ligase为T4 ligase或Taq ligase。

4.根据权利要求1所述的置换扩增法，其特征在于：所述置换扩增体系中还包括有荧光分子信标或荧光染料。

5.根据权利要求4所述的置换扩增法，其特征在于：所述荧光分子信标为MolecularBeacon，Taqmen或LightCycler，荧光分子信标序列与待测模板保留序列杂交或与指示模板序列杂交。

6.根据权利要求4所述的置换扩增法，其特征在于：所述荧光染料为DNA荧光染料。

7.根据权利要求6所述的置换扩增法，其特征在于：所述DNA荧光染料为SYBRGreen。

8.一种检测乙型肝炎病毒P基因YMDD变异的试剂盒，包括DNA/RNA纯化试剂，Taq连接酶及缓冲液、抑制Olligo、dNTP、Taq Polymerase及缓冲液，DNA荧光染料或分子信标，凝胶电泳试剂，其特征在于：还包括分别检测P基因YMDD、P基因变异YIDD，P基因变异YVDD的三套指示加首尾DNA和反向扩增引物Rev F、Rev R，

所述检测YMDD基因的指示加首尾DNA由以下引物扩增日本血吸虫谷胱苷肽-S-转移酶GST基因而得：

YMDD 3’端引物MR：5’-tg gat gat gtg gtW ttg gta ggt tat tgg aaa att aag g-3’，

YMDD 3’端引物MR：5’-t ata act gaa agc caR aca gtc ttt act ata tgc aat tc-3’；

所述检测变异YIDD基因的指示加首尾DNA由以下引物扩增日本血吸虫谷胱苷肽-S-转移酶GST基因而得：

YIDD 5’端引物IF：5’-t gat gat gtg gtW ttg gaa gag cat ttg tat gag c-3’，

YIDD 3’端引物IR：5’-at ata act gaa agc caR aca gtc tgc acg ctc ttt tgg-3’；

所述检测变异YIDD基因的指示加首尾DNA由以下引物扩增日本血吸虫谷胱苷肽-S-转移酶GST基因而得，

YVDD 5’端引物VF：5’-g gat gat gtg gtW ttg gat gaa ggt gat aaa tgg-3’，

YVDD 3’端引物VR：5’-ac ata act gaa agc caR aca gcc acc caa cat gtt gtg-3’；

所述反扩增向引物RevF和RevR如下：

Rev F：5’-at ggt gat gtt aaa tta aca c-3’；RevR：5’-atc aat ata ata agg aag att g-3’。

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