CN1896278B - 乙型肝炎病毒耐药基因突变的荧光定量pcr检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种乙型肝炎病毒拉米夫定耐药基因突变的实时荧光定量PCR检测方法。乙型肝炎病毒拉米夫定耐药相关突变位于DNA多聚酶基因的rtL180M、rtM204V/I突变。该方法利用PCR反应中引物在3’末端存在错配时不能正确延伸的特点，将突变位点设计在荧光定量PCR引物的3’末端，采用合适的引物浓度，Touch-down PCR反应程序，同时结合嵌合有SyBrGreen I染料的PCR产物的熔点曲线。根据荧光定量PCR信号和熔点曲线，即可以判断拉米夫定位点是否发生突变。该发明能准确快速地检测乙肝病毒临床标本中DNA突变，同时亦适用于其它基因的突变检测。

Description

乙型肝炎病毒耐药基因突变的荧光定量PCR检测方法

技术领域

本发明涉及一种快速检测乙型肝炎病毒拉米夫定耐药基因突变的荧光定量降落PCR检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

肝炎是世界性传染疾病，我国是公认的肝炎大国，肝炎的患病率和发病率都居世界前列，尤其是乙型肝炎在全国范围内分布最广。肝炎病毒的感染，不仅与急、慢性肝炎，还与肝硬化、肝癌的发生密切相关。我国是乙型病毒感染的高发区，约50％-70％的人群受过乙肝的感染，8％-12％的人群为乙肝病毒表面抗原携带者，多达1亿人口。近些年来，通过接种乙肝疫苗在降低乙肝病毒感染方面发挥了重要作用，但乙肝的治疗和诊断尚需进一步的研究。

乙肝病毒持续感染的过程中，在自然或治疗诱导下会出现各种变异，它在肝炎病毒表面抗原区S、前核心抗原pre-C、核心抗原区C、X区与聚合酶基因P区均有分布。不同位点的突变，可引起不同后果，如免疫逃避、疫苗逃避和抗病毒逃避，在临床上表现为漏诊、盲目用药和延误治疗，最终导致患者病情加重。.

聚合酶基因P区是最大的读码框架，编码DNA的多聚酶蛋白。在该区有乙肝进行逆转录的活性部位酪氨酸(Y)-蛋氨酸(M)-天冬氨酸(D)-天冬氨酸(D)组成，而传统的乙肝病毒药物拉米夫定正是干扰病毒的复制结合位点。如果长期服用该药物会出现耐药性，使得血清中已经阴转的乙肝病毒DNA重新出现，肝功能异常，甚至伴有病情的突发。其原因是YMDD中的552位(M)蛋氨酸被(V)缬氨酸或(I)异亮氨酸取代，生成YV₅₅₂DD或YI₅₅₂DD，从而导致亚结构域的空间结构变化，防碍了与拉米夫定的结合。Tanaka等发现在拉米夫定平均用药约25月的36个病人中，25个病人DNA滴度升高，其中有18人出现乙肝的急性发作现象。在治疗前或治疗过程中及停药前后对乙型肝炎病毒进行耐药突变检测对于指导临床用药和判定疗效，推测预后都有非常重要的意义。

鉴于YMDD基序中的M，在A基因型中位于552位，而在B和C基因型中为550位，在D基因型为539位，在E和G基因型为549位。为了消除这种基因型之间的差异，有学者基于HBV多聚酶RT区长度一致，均为344个氨基酸。并且起始于一个保守序列EDWGPCDEHG。进而对其单独命名。即L528M对应rt L180M，M552V/I对应M204V/I。

目前检测乙肝病毒拉米夫定耐药突变的方法主要有基于PCR基础上的限制性片段长度多态性分析、测序以及基因芯片等技术。上述方法都是基于PCR基础上的操作，基因芯片技术操作烦琐而且杂交过程中不可避免的存在假阳性问题，准确度差；限制性片段长度多态性是在PCR(聚合酶链式反应)基础上对产物进行酶切处理，它要求PCR产物要足够酶切使用，同时酶切产物要经过琼脂糖凝胶电泳来识别，检测灵敏度大大降低。序列分析能精确地识别基因突变，但是对于混合感染株检测则存在瓶颈。

荧光定量PCR技术具有实时监测、定量和高通量检测等特点，而且操作简便，灵敏度高。荧光定量PCR分为基于Taqman(肽科曼)探针的定量PCR以及基于SyBrGreen(赛博绿)I染料的定量PCR，后者是在PCR反应中加入SyBrGreen I染料，它能特异性地嵌入DNA双链中，当它与DNA双链结合时，发出荧光；而从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。荧光定量PCR反应过程中，随着PCR产物的增加，产物与SyBrGreenI结合的量也增大，两者结合后形成的荧光信号可被仪器检测到，每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。

发明内容

本发明的技术任务在于提供一种简便的用于准确检测乙肝病毒拉米夫定耐药基因突变的荧光定量PCR方法，以期指导临床用药。

本发明所述的一种乙型肝炎病毒拉米夫定耐药基因突变的实时荧光定量PCR检测方法，根据乙型肝炎病毒拉米夫定耐药相关突变rtL180M、rtM204V/I，将突变位点分别设计在下游引物的3’端，上游引物为多聚酶区的一段保守的核苷酸序列。利用优化的荧光定量PCR反应程序，通过荧光定量PCR反应，对从血清样本提取的乙型肝炎病毒DNA进行PCR扩增，根据CT值和熔点曲线来检测是否有突变发生。

上述的位于多聚酶区的上游引物序列为5’CCAATCACTCACCAACCTCT 3’，长度为20bp，分别与5条下游引物配对。5条下游引物中，两条用于检测rtL180M位点突变与否，另三条用于检测rtM204V/I位点突变与否。

上述的优化的荧光定量PCR反应程序为降落PCR(Touch-down PCR)程序：94℃3分钟1个循环，94℃20秒、75℃-55℃20秒、72℃30秒，共计40个循环。其中退火温度随着每一循环的进行而递减0.5℃，即经40个循环后，退火温度由原来的75℃退为55℃；荧光信号的收集设在每一循环的退火温度。

本发明所述的一种乙型肝炎病毒拉米夫定耐药基因突变的实时荧光定量PCR检测方法，所述的荧光定量PCR反应的缓冲液为1×PCR缓冲液：包括50mmol/LTris-CI(pH8.3)、50mmol/LKCI、Mg²⁺浓度为3.5mM；dNTP浓度为0.2mmol/L；Pfu DNA聚合酶浓度为1.25U；上、下游引物的浓度为0.2μmol/L，在PCR反应中加入的SyBrGreenI染料终浓度为1×。

本发明优良效果如下：

现有技术中影响荧光定量PCR检测方法特异性的因素在于非特异性扩增以及引物二聚体的存在，本发明通过采用Pfu(Pyrococcus furiosus，激烈火球菌)高保真DNA(脱氧核糖核苷酸)聚合酶、合适的引物以及引物浓度、提高退火温度以及Touch-down PCR(降落PCR)等方法解决了非特异性扩增问题。

该方法利用PCR反应中引物在3’末端存在错配时不能正确延伸的特点，将突变位点设计在荧光定量PCR引物的3’末端，采用合适的引物浓度，Touch-down PCR反应程序，大大降低了由于引物3′端错配所引起的非特异性扩增。根据突变引物组与野生引物组扩增Ct值的差异以及参考相应的熔点曲线，能准确、快速的识别拉米夫定耐药基因突变。该发明能准确快速地检测乙肝病毒临床标本中DNA突变，同时亦适用于其它基因的突变检测。

附图说明

图1和图2分别是PU与YMDD-L(图1)、180W-L(图2)引物组合在55℃-72.0℃退火温度范围内，Ct值随退火温度升高而逐渐变化的荧光定量PCR扩增曲线。其中，横坐标代表循环数，纵坐标代表荧光强度，图中平行且远离横坐标的直线代表荧光阈值。

图3-图14分别是采用180位点为野生型的重组载体，PU与180W-L或180M-L引物组合在不同PCR程序中的荧光定量PCR扩增曲线及其相应的熔点曲线。其中，图3、图5、图7、图9、图11和图13分别为采用NT1、NT2、NT3、T1、T2、T3等PCR反应程序所得到的荧光定量PCR扩增曲线，其中，横坐标代表循环数，纵坐标代表荧光信号强度；图4、图6、图8、图10、图12和图14分别是图3、图5、图7、图9、图11和图13的相应的熔点曲线，横坐标代表融解温度，纵坐标代表荧光信号变化率。

图15-图20分别是上游引物PU与180W(M)-L引物组合进行荧光定量PCR扩增所得到的扩增曲线图、熔点曲线和相应的电泳图谱；图18、图19、图20分别为上游引物PU与YM(I/V)DD等引物组合进行荧光定量PCR扩增所得到的扩增曲线图、熔点曲线和相应的电泳图谱。图17中泳道：1，Marker2000；2，目的片段(360bp)，图20中泳道：1，Marker2000；2，目的片段(433bp)。图15和图18的横坐标代表循环数，纵坐标代表荧光信号强度；图16和图19的横坐标代表融解温度，纵坐标代表荧光信号变化率。

具体实施方式

实施例1.

一、乙肝病毒荧光定量PCR拉米夫定耐药基因突变引物的设计与合成

利用Beacon Designer2.1(分子信标设计软件2.1)设计荧光定量PCR拉米夫定耐药基因突变引物。其中，突变和野生位点均位于下游引物的3’末端，多聚酶C功能区的M204野生型引物以及突变的M204V、M204I所对应的下游引物分别为YMDD-L、YVDD-L、YIDD-L；多聚酶B功能区的L180以及突变的L180M的下游引物分别为180W-L、180M-L。上游引物PU是位于多聚酶的保守区域，用于和5条下游引物配对。其中，PU与180W-L、180M-L配对得到的PCR产物大小为360BP(Base Pair，碱基对)，与YMDD-L、YVDD-L、YIDD-L等下游引物配对得到的PCR产物大小为433BP。所用引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

400U105’ATTCCTCTTCATCCTGCTGC 3’

PU：  5’CCAATCACTCACCAACCTCT 3’(327U20)

180W-L：5’GCACTAGTAAACTGAGCCAG 3’

180M-L：5’GCACTAGTAAACTGAGCCAT 3’

YMDD-L：5’CCCAATACCACATCATCCAT 3’

YVDD-L：5’CCCAATACCACATCATCCAC 3’

YIDD-L：5’CCCCAATACCACATCATCA 3’

二、乙型肝炎病毒SyBrGreen I荧光定量PCR反应程序的优化1.SyBrGreenI荧光定量PCR退火温度的选择

为了降低非特异性扩增，同时保证较高的扩增效率，我们设定了55℃、56.3℃、58.3℃、61.2℃、65.6℃、68.7℃、70.8℃、72.0℃等8个退火梯度。扩增体系为20μl，其中包括：

10×PCR缓冲液   2.0μl

2.5mMdNTP       1.6μl

MgCI₂(25mM)     2.8μl

PU(5μM)        0.8μl

下游引物(5μM)    0.8μl

SyBrGreen I(10×) 2.0μl

Pfu酶(2.5u/μl)   0.5μl(Pfu DNA聚合酶)

质粒DNA           1.0μl

H₂O               8.5μl

20μl

其中10×PCR缓冲液的成分为500mMTris-CI(pH8.3)，500mMKCI；下游引物分别为180W-L、YMDD-L；退火温度梯度为55℃-72℃等8个梯度；其中，质粒DNA是整合有乙肝病毒DNA的pGEM-T载体，经测序分析该240及108位点均为野生型。Pfu DNA聚合酶购于天为时代公司，下同。

定量PCR扩增采用Bio-Rad(伯乐)公司PTC-225PCR扩增仪，程序为94℃3分钟1个循环；94℃20秒、55-72℃20秒(温度梯度)、72℃30秒，共计40个循环。其中荧光信号的收集设置在55-72℃20秒的退火温度循环中。

对于PU与YMDD-L引物组合组，在65.6℃、68.7℃、70.8℃、72.0℃等四个温度梯度中没有扩增曲线，55℃、56.3℃、58.3℃、61.2℃相对应的Ct值的平均值分别为20.9、22.1、22.9、24.7、30.65(图1)。由图可以看出，随着退火温度从55℃逐渐升高至61.2℃，PCR扩增效率降低。兼顾PCR扩增效率与保真性，我们采用60℃作为退火温度。

对于PU与180W-L引物组合组，在68.7℃、70.8℃、72.0℃等三个温度梯度中没有扩增曲线，55℃、56.3℃、58.3℃、61.2℃、65.6℃相对应的Ct值的平均值分别为11.03、10.9、11.4、11.03、11(图2)。由图可以看出，退火温度在55℃-65.6℃范围内，对PCR扩增效率几乎没有影响。结合两组实验，采用60℃作为退火温度。

2.Touch-down PCR与非Touch-down PCR的SyBrGreenI荧光定量PCR比较分析

为了比较分析Touch-down PCR与非降落PCR，以及退火或延伸时收集荧光信号对基因突变检测的影响，我们设计了6个PCR反应程序。

PCR程序1(NT1)：94℃3分钟1个循环；94℃20秒、60℃50秒，共计40个循环。该程序采用两步法，其中荧光信号的收集设在每一循环的第二步。

PCR程序2(NT2)：94℃3分钟1个循环，94℃20秒、60℃20秒，72℃30秒，共计40个循环，荧光信号的收集设在每一循环的退火温度。

PCR程序3(NT3)：同程序2，但荧光信号的收集设在每一循环的退火温度。

Touch-down PCR程序(T1)：94℃3分钟1个循环，94℃20秒、75℃50秒，共计40个循环。该程序采用两步法，即延伸和退火温度放在一起，其中延伸和退火温度合并，并随着每一循环的进行而递减0.5℃。荧光信号的收集设在每一循环的第二步。

Touch-down PCR程序2(T2)：94℃3分钟1个循环，94℃20秒、75℃20秒，72℃30秒，共计40个循环。该程序采用三步法，延伸温度和退火温度分开，其中退火温度随着每一循环的进行而递减0.5℃。荧光信号的收集设在每一循环的退火温度。

Touch-down PCR程序3(T3)：94℃3分钟1个循环，94℃20秒、75℃20秒，72℃30秒，共计40个循环。该程序和Touch-down PCR程序2相同，但荧光信号的收集设在72℃延伸温度。

PCR扩增体系为20l，其中包括

10×PCR缓冲液           2.0μl

2.5mMdNTP               1.6μl

MgCI₂(25mM)             2.8μl

PU(5μM)                0.8μl

180W-L或180M-L(5μM)    0.8μl

SyBrGreenI(10×)        2.0μl

Pfu酶(2.5u/μl)         0.5μl

质粒DNA                 1.0μl

H₂O                     8.5μl

20μl

其中10×PCR缓冲液的成分为500mMTris-CI(pH8.3)，500mMKCI；质粒DNA是整合有乙肝病毒DNA的pGEM-T载体，经测序分析180位点为野生型。

以上各程序经PCR扩增完成后，分别执行熔点曲线程序，95℃1分钟，1个循环；55℃1分钟，80个循环(其中，每增加一个循环，温度递增0.5℃)；55℃10秒钟，1个循环。

从图3、图5、图7可以看出，180位点为野生型的阳性标本，采用NT1、NT2与NT3程序分别扩增所得到的180位点的野生型与突变型的平均CT值为16.3、17.3(NT1)；17.7、19.1(NT2)；16.1、17.6(NT3)，各野生型与突变型的CT值差别相当，在1-1.5之间，很难判断该位点是否为野生或突变位点。同时对于程序NT2、NT3而言，在退火或是延伸温度收集荧光对PCR扩增曲线图没有影响。

从图9、图11、图13可以看出，180位点为野生型的阳性标本，采用T1、T2与T3程序分别扩增所得到的180位点的野生型的平均CT值为30.3(T1)、22.0(T2)、29.2(T3)，而各突变型引物均未有扩增曲线出现。

3.Touch-down荧光定量PCR检测乙肝病毒突变位点

3.1血清标本DNA的提取

乙型肝炎病毒患者血清50μl加入50μl 0.4MNaOH，80℃保温10分钟。12000rpm(转速/分钟)离心5分钟，取上清，加入25μl0.4MTris-HCl pH7.5。

3.2荧光定量PCR反应

荧光定量PCR反应体系同前(SyBrGreen I荧光定量PCR退火温度的选择)中的PCR反应条件，反应程序采用Touch-down荧光定量PCR中的T2程序。

3.3荧光定量PCR结果分析

从图15可以看出，上游引物PU与180W-L、180M-L的下游引物组合中，荧光定量PCR扩增所得到的CT平均值分别为13.5，26.8，熔点曲线图与电泳图见图16，17。从图18可以看出，在552位点与中上游引物PU与YMDD-L的下游引物组合中，荧光定量PCR扩增所得到的CT平均值为29.6，上游引物PU与YVDD-L、YIDD-L下游引物之间都没有扩增，熔点曲线图与电泳图见图19，20。表明该标本552、428位点均为野生型，无突变发生。

Claims (1)

1.一种乙型肝炎病毒拉米夫定耐药基因突变的实时荧光定量PCR检测用引物对，其特征在于，是由上游引物分别与5条下游引物配对而得，

所述上游引物序列为5’CCAATCACTCACCAACCTCT 3’，长度为20bp，

所述5条下游引物分别为：

180M-L 5’GCACTAGTAAACTGAGCCAT 3’，

180W-L 5’GCACTAGTAAACTGAGCCAG 3’，

YMDD-L 5’CCCAATACCACATCATCCAT 3’，

YVDD-L 5’CCCAATACCACATCATCCAC 3’，

YIDD-L 5’CCCCAATACCACATCATCA 3’。

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