CN100582245C - 同时检测乙型肝炎病毒基因亚型和耐药突变的试剂盒及方法 - Google Patents
同时检测乙型肝炎病毒基因亚型和耐药突变的试剂盒及方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及病毒亚型和耐药突变检测领域，提供了一种同时检测乙型肝炎病毒基因亚型和耐药突变的试剂盒及方法。该试剂盒包括2条特异性扩增乙型肝炎病毒基因或转录本的引物，3条检测乙型肝炎病毒基因亚型特异性的寡核苷酸探针，和13条检测耐药突变特异性的寡核苷酸探针，应用此试剂盒能够同时对HBV-B、C、D三种基因亚型进行区分，并检测是否存在拉米夫定和阿德福韦酯耐药突变，即将临床3项检测合并为1项检测，不仅降低了病人的经济负担，而且为临床诊疗提供了更为全面的参考信息。
Description
技术领域
本发明涉及病毒亚型和耐药突变检测领域，尤其涉及一种同时检测乙型肝炎病毒基因亚型和耐药突变的试剂盒及检测方法。
背景技术
据世界卫生组织统计，全球大约有3.5亿人携带了乙肝病毒，亚洲携带的人大约是2.2亿。我国是最主要的乙肝大国，2002年我国流行病学调查显示，乙肝表面抗原阳性率9.09％，约1.2亿，慢性乙型病毒性肝炎病人约3000万。目前这类人群正处在发病和治疗的高峰时期。HBV感染呈世界性流行，其基因型分布具有地域性特点，在我国和亚洲以B、C型为主，有少量的D型。目前许多研究结果都表明不同基因亚型的HBV病毒对药物的敏感不同与疾病进程的关系也不相同。例如，一些研究表明基因型C较B更容易引起严重的肝炎或肝癌，对干扰素的应答率A型高于D型，B型高于C型。因此对感染的HBV进行基因分型具有重要的临床意义。核苷类似物是当前公认的抗HBV药物，我国目前使用最多的是拉米夫定和阿德福韦酯。这些药物对多数乙型肝炎病人无法彻底清除体内的HBV，患者需要长期维持治疗，随着这些药物的广泛、长期应用，HBV在宿主体内感染以及抗病毒治疗的过程中会发生变异，并在宿主体内免疫系统的压力下以及在治疗干预过程中进行变异的优势选择，以达到逃逸免疫、对抗药物作用、实现物种生存的目的，随之出现病毒基因变异耐药的问题，病毒基因组序列分析对于发现基因型耐药非常重要，通常耐药变异是某种特定的变异，这种变异株在抗病毒治疗前很少存在。乙肝病毒一旦出现变异耐药后肝功能恶化的比例显著增高，甚至快速进展至肝衰竭。
中国专利200410025199.X和200510065445.9分别公开了一种检测拉米夫定耐药HBV DNA的方法，但利用该方法不能在测定耐药性的同时检测出HBV基因亚型。乙肝患者在治疗期间，临床医师需要掌握感染的乙肝病毒是哪种基因亚型，对抗病毒药物治疗的反应性差异，是否存在拉米夫定和阿德福韦酯耐药突变。这对指导患者选用何种抗病毒药、是否继续使用该抗病毒药、何时停用或换用何种抗病毒药都有很现实的临床意义，对病人抗病毒治疗的疗效判断、预后评估十分重要。至今为止国内外未见同时检测HBV基因分型和两种常用药耐药的产品和报道，因此临床上如果需要获得全面的参考信息，病人需要做多项检测，大大加重了病人的经济负担。
发明内容
本发明的目的在于提供一种乙型肝炎病毒基因亚型和耐药突变检测试剂盒及检测方法。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种同时检测乙型肝炎病毒基因亚型和耐药突变的试剂盒，所述试剂盒包括：
1)特异性扩增乙型肝炎病毒基因或转录本的引物，其碱基序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；
2)乙型肝炎病毒基因亚型特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；
3)乙型肝炎病毒耐药突变特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示；
上述乙型肝炎病毒基因亚型特异性寡核苷酸探针序列和乙型肝炎病毒耐药突变特异性寡核苷酸探针序列可由其碱基互补序列替换。
所述乙型肝炎病毒基因亚型特异性寡核苷酸探针和乙型肝炎病毒耐药突变特异性寡核苷酸探针固定在基质上。
所述乙型肝炎病毒基因亚型特异性寡核苷酸探针和乙型肝炎病毒耐药突变特异性寡核苷酸探针固定在尼龙膜上。
所述引物标记生物素。
一种同时检测乙型肝炎病毒基因亚型和耐药突变的方法，包括以下步骤：
1)制备血清，提取乙型肝炎病毒DNA；
2)以步骤1)所得乙型肝炎病毒DNA为模板，利用权利要求1所述特异性扩增乙型肝炎病毒基因或转录本的引物进行PCR扩增；
3)上述PCR产物与固定在基质上的权利要求1所述全部探针序列杂交；
4)洗膜及显色。
所述PCR扩增体系为：10×buffer 2.5μL
Primer 1 10pmol
Primer 2 10pmol
Template 0.1ng
dNTPs 50μM
TaqE 2.5U
加无菌水至25μL。
所述PCR扩增条件为：
50℃ 15min
95℃ 10min
72℃ 5min。
所述杂交温度为45-49℃。
本发明利用核酸分子杂交技术通过设计特殊的特异性扩增乙型肝炎病毒基因或转录本的引物和乙型肝炎病毒基因亚型特异性寡核苷酸探针、乙型肝炎病毒耐药突变特异性寡核苷酸探针。PCR扩增产物既能跟乙型肝炎病毒基因亚型特异性寡核苷酸探针杂交，又能跟乙型肝炎病毒拉米夫定和阿德福韦酯耐药突变特异性寡核苷酸探针杂交。上述探针固定在同一张膜条上，能够对HBV-B、C、D三种基因亚型进行区分，并同时检测是否存在拉米夫定和阿德福韦酯耐药突变，即将临床3项检测合并为1项检测，不仅降低了病人的经济负担，而且为临床诊疗提供了更为全面的参考信息。
附图说明
图1乙型肝炎病毒基因亚型和耐药突变检测结果图。
图2阴性对照显色图。
附图标号说明：
1.rt180L，SEQ ID NO：6，HBV逆转录酶第180位氨基酸为亮氨酸，HBV拉米夫定野生株(敏感)检测位点；
2.rt204M，SEQ ID NO：8，HBV逆转录酶第204位氨基酸为蛋氨酸，HBV拉米夫定野生株(敏感)检测位点；
3.rt207L/M，SEQ ID NO：12和13，HBV逆转录酶第207位氨基酸为亮氨酸或蛋氨酸，HBV拉米夫定野生株(敏感)检测位点；
4.rt207V，SEQ ID NO：11，HBV逆转录酶第207位氨基酸为缬氨酸，HBV拉米夫定野生株(敏感)检测位点；
5.rt181A，SEQ ID NO：6和7，HBV逆转录酶第181位氨基酸为丙氨酸，HBV阿德福韦酯野生株(敏感)检测位点；
6.rt236N，SEQ ID NO：16，HBV逆转录酶第236位氨基酸为天冬酰胺，HBV阿德福韦酯野生株(敏感)检测位点；
7.HBV-B，SEQ ID NO：3，HBV-B基因亚型，HBV分型检测位点；
8.HBV-D，SEQ ID NO：5，HBV-D基因亚型，HBV分型检测位点；
9.rt180M，SEQ ID NO：7，HBV逆转录酶第180位氨基酸为蛋氨酸，HBV拉米夫定变异株(耐药)检测位点；
10.rt204V，SEQ ID NO：9，HBV逆转录酶第204位氨基酸为缬氨酸，HBV拉米夫定变异株(耐药)检测位点；
11.rt204I，SEQ ID NO：10，HBV逆转录酶第204位氨基酸为异亮氨酸，HBV拉米夫定变异株(耐药)检测位点；
12.rt207I，SEQ ID NO：14，HBV逆转录酶第207位氨基酸为异亮氨酸，HBV拉米夫定变异株(耐药)检测位点；
13.rt181V，SEQ ID NO：15，HBV逆转录酶第181位氨基酸为缬氨酸，HBV阿德福韦酯变异株(耐药)检测位点；
14.rt236T，SEQ ID NO：17，HBV逆转录酶第236位氨基酸为苏氨酸，HBV阿德福韦酯变异株(耐药)检测位点；
15.HBV-C，SEQ ID NO：4，HBV-C基因亚型，HBV分型检测位点；
16.PC，显色内控，显色正常指标。
具体实施方式
实施例1
一、材料
1.试剂：
1)3％H2O2
2)20×SSC(pH 7.0)：NaCl 175.3g
柠檬酸钠 88.2g
加蒸馏水750mL溶解，用pH计调pH至7.0，最后定容至1000mL，并高压灭菌保存。
3)10％SDS(pH 7.0)：SDS 20g
加蒸馏水180mL溶解，用pH计调pH至7.0，最后定容至200mL。1M柠檬酸钠(pH 5.0)：柠檬酸钠 294g
加蒸馏水700mL溶解，用浓HCl调pH至5.0，最后定容至1000mL。
4)A液(2×SSC，0.1％SDS，pH 7.4)：20×SSC 100mL
10％SDS 10mL
加蒸馏水定容至1000mL。
5)B液(0.5×SSC，0.1％SDS，pH 7.4)：20×SSC 25mL
10％SDS 10mL
加蒸馏水定容至1000mL。
6)C液(0.1M柠檬酸钠，pH 5.4)：1M柠檬酸钠 100mL
加蒸馏水定容至1000mL。
7)显色液(新鲜配制使用，按顺序加入以下溶液)：
C液 19mL
四甲基联苯胺(TMB) 1mL
3％H2O2 10μL
2.仪器：PCR仪、分子杂交箱、离心机
3.引物设计：PCR扩增效率和扩增范围是衡量PCR的两个重要指标，要取得好的结果其前提是设计好的PCR引物。
HBV是一种自然突变率非常高的病毒，高达1010-11/天，不仅不同基因亚型间碱基差异大，就是在同一种亚型当中同一位置碱基也可能不同，也就是说其多态性严重。因此设计引物时首先要尽可能涵盖这些多态性，避免因引物不完全匹配造成漏检；采用简并引物(即在同一位置根据其多态性设计多个替代碱基)可以解决这个问题，但又可能会造成扩增效率下降。这是两个需要权衡的矛盾。因此本专利在设计引物时，首先从Genebank中收集HBV-B、HBV-C、HBV-D三种基因亚型全序列各30组以上，运用软件进行比对；然后在确保扩增片段涵盖各耐药突变位点的前提下，按照多态性小的原则来选择引物设计的位置。运用Primerpremier和Oligo两种专业引物设计软件设计多对引物，调整扩增条件，选取得到最佳的引物对，即本发明中的引物对，如SEQ ID NO：1-2所示。
4.探针设计：对于同一耐药检测位点，设计两组探针，即一组与野生型碱基序列匹配，另一组与突变型碱基序列匹配。这样不仅可以互为对照，而且对于用药过程中野生型和突变型复合感染的情况也能进行明确地检测，从而为临床诊疗提供更具体准确的信息，真正的实现动态监控。分型探针其设计原则就是两两区别，B、C、D互为对照，即使是少见的复合感染也不会漏检。
本发明在设计探针时通常是针对每个检测点设计多条探针，充分考虑多态性、二级结构和杂交温度的均一性，从特异性和灵敏度两个方面进行筛选，最后确定了本发明中的3条乙型肝炎亚型分型探针，如SEQ ID NO：3-5所示，12条耐药突变检测探针，如SEQ ID NO：6-17所示。
二、方法
1.血清的制备：
抽取静脉血5mL，置于离心管中，贴上编号标签。37℃孵育1小时，使之充分凝固。4000rpm离心4～10分钟，吸取透明的淡黄色液体约1.5mL，转入干净的1.5mL离心管，贴上相应的标签。血清室温放置不超过2小时，4℃保存不超过48小时，-20℃保存不超过半年，应避免反复冻融。
2.HBV DNA的提取：
参照分子生物学常规病毒DNA提取方法进行或使用市售的病毒DNA提取试剂盒。
3.PCR扩增
取出PCR反应管，在管壁上做好标记，于5000rpm离心2秒，而后分别加入已提取的待测样品DNA 5μL，反应总体系为25μL。每次扩增，设置一个空白对照，即以5μL无菌纯水为模板，加入1滴矿物油。PCR扩增体系：10×buffer 2.5μL
Primer 1 10pmol
Primer 2 10pmol
Template 0.1ng
dNTPs 50μM
TaqE 2.5U
加无菌水至25μL。
PCR按以下条件进行扩增：
50℃ 15min
95℃ 10min
72℃ 5min
4.杂交
取15mL塑料离心管，放入标有编号的膜条(应在膜条的一角用铅笔标记)，加入A液5～6mL及所有PCR产物(25μL)，将盖拧紧，混匀PCR产物，再将离心管盖稍拧松，以避免加热时管盖爆开。将离心管放入沸水浴中加热10分钟(确保杂交液液面完全位于沸水浴液面之下)，取出拧紧盖子，放入杂交箱47℃杂交1到4小时。
取50mL塑料管，加入40mL B液于杂交箱或水浴箱中进行预热至47℃。
对照：另取一张膜条与阴性对照PCR产物杂交，方法同上。
膜条上固定有3条乙型肝炎病毒基因亚型特异性寡核苷酸探针、12条乙型肝炎病毒耐药突变特异性寡核苷酸探针，膜条上探针排列顺序为：
| rt180L | rt204M | rt207L/M | rt207V | rt181A | rt236N | HBV-B | HBV-D |
| rt180M | rt204V | rt204I | rt207I | rt181V | rt236T | HBV-C | PC |
5.洗膜
取出膜条，移至装有预热B液的50mL管中，于51℃轻摇洗涤15分钟(每管40mL溶液，最多可同时洗涤4张膜)。
6.显色
用A液配制1∶2000的过氧化物酶(POD)溶液(单做两张膜只需4μLPOD母液，配制成8mL使用液，做四张膜可用6μLPOD母液，配制成12mL使用液)，室温轻摇浸泡30分钟，弃去POD溶液。用A液室温轻摇洗两次，每次5分钟。用C液室温洗膜1-2分钟，同时配制显色液(显色液需新鲜配制)。将膜条浸泡于显色液中避光显色30分钟左右即可观察结果。
三、结果判定
实验的每张膜条在PC位点处均应有蓝色斑点出现，此时结果的判读视为有效；阴性对照的杂交膜条除PC位点有蓝色斑点外，其它位点均不应显色，否则有可能是发生污染或实验不成功。
图1所示，16号位置PC位点显示为蓝色，说明结果的判读视为有效；15号位置显示为蓝色斑点，此血清感染的乙肝病毒为HBV-C基因亚型；4、9和10号位置显示为蓝色斑点，此血清感染的乙肝病毒对拉米夫定有耐药性；5号和6号位置显示为蓝色斑点，此血清感染的乙肝病毒对阿德福韦酯敏感。
图2所示，只有16号位置PC位点显示为蓝色，其它位点均不显色，说明实验未发生污染，结果可信。
本此检测在对HBV-B、C、D三种基因亚型进行区分的同时检测了乙型肝炎病毒是否存在拉米夫定和阿德福韦酯耐药突变，即将临床3项检测合并为1项检测，大大降低了病人的经济负担，缩短了检测时间，为临床诊疗提供了更为全面的参考信息。
SEQUENCE LISTING
<110>亚能生物技术(深圳)有限公司
<120>同时检测乙型肝炎病毒基因亚型和耐药突变的试剂盒及方法
<160>17
<170>PatentIn version 3.3
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aggyaaatgt atrcc
Claims (4)
1.同时检测乙型肝炎病毒基因亚型和耐药突变的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括：
1)特异性扩增乙型肝炎病毒基因或转录本的引物，其碱基序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；
2)乙型肝炎病毒基因亚型特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；
3)乙型肝炎病毒耐药突变特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：11、SEQID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示；
上述乙型肝炎病毒基因亚型特异性寡核苷酸探针序列和乙型肝炎病毒耐药突变特异性寡核苷酸探针序列可由其碱基互补序列替换。
2.根据权利要求1所述的同时检测乙型肝炎病毒基因亚型和耐药突变的试剂盒，其特征在于所述乙型肝炎病毒基因亚型特异性寡核苷酸探针和乙型肝炎病毒耐药突变特异性寡核苷酸探针固定在基质上。
3.根据权利要求1所述的同时检测乙型肝炎病毒基因亚型和耐药突变的试剂盒，其特征在于所述乙型肝炎病毒基因亚型特异性寡核苷酸探针和乙型肝炎病毒耐药突变特异性寡核苷酸探针固定在尼龙膜上。
4.根据权利要求1所述的同时检测乙型肝炎病毒基因亚型和耐药突变的试剂盒，其特征在于所述引物标记生物素。
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| Le Gal et al. | Eighth major clade for hepatitis delta virus | |
| Smith et al. | Variability and pathogenicity of hepatitis E virus genotype 3 variants | |
| Pourkarim et al. | Molecular identification of hepatitis B virus genotypes/subgenotypes: revised classification hurdles and updated resolutions | |
| Vinjé et al. | Simultaneous detection and genotyping of “Norwalk-like viruses” by oligonucleotide array in a reverse line blot hybridization format | |
| Olive et al. | Detection and differentiation of picornaviruses in clinical samples following genomic amplification | |
| Okamoto et al. | Evidence of hybridization between Taenia saginata and Taenia asiatica | |
| CN113215313A (zh) | 一种冠状病毒SARS-CoV-2及其突变毒株的检测试剂盒与其应用 | |
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| Noppornpanth et al. | Genotyping hepatitis C viruses from Southeast Asia by a novel line probe assay that simultaneously detects core and 5′ untranslated regions | |
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| CN105907890A (zh) | 一种快速区分HP-PRRS疫苗GDr180株与野毒株的引物、探针及方法 | |
| Chen et al. | Influenza A virus PB1-F2 gene in recent Taiwanese isolates | |
| Osoba et al. | Hepatitis C virus genotyping by polymerase chain reaction and DNA enzyme immunoassay among Saudi patients in the Western Province, Saudi Arabia | |
| CN101812537A (zh) | 同时检测乙型肝炎病毒三种核苷酸类似物耐药位点的方法及其试剂盒 | |
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| Lu et al. | Hepatitis C virus complete genome sequences identified from China representing subtypes 6k and 6n and a novel, as yet unassigned subtype within genotype 6 | |
| CN100422344C (zh) | 乙型肝炎病毒基因分型的荧光pcr检测方法及其试剂盒 | |
| Hsia et al. | Molecular and serological aspects of HBsAg‐negative hepatitis B virus infections in North America | |
| CN1858246B (zh) | 口蹄疫病毒rt-pcr检测和分型试剂 | |
| CN101974640A (zh) | 真菌快速检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN109837339A (zh) | 用于儿童安全用药相关基因检测的引物组、探针组、试剂盒及方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |