CN111733238B - 一种鉴别PML-RARα融合基因3种剪切体的引物组及其试剂盒和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴别PML‑RARα融合基因3种剪切体的引物组及其试剂盒和应用,所述鉴别PML‑RARα融合基因3种剪切体的引物组,包含检测PML‑RARα融合基因bcr1、bcr2和bcr3剪切体的特异性正向引物、反向引物、特异性荧光探针及竞争性引物;本发明应用实时荧光定量PCR技术,采用多重PCR引物和特异性荧光探针,通过竞争引物可以实现一个反应中同时对样本中PML‑RARα融合基因的bcr1,bcr2,和bcr3三种剪切体进行检测,可广泛应用于PML‑RARα融合基因相关疾病临床早期诊断、药物疗效、愈后监测及科学研究等多个领域,具有检测半自动化、检测速度快、灵敏高、适用样本范围广的特点。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域,更具体地,涉及一种鉴别PML-RARΑ融合基因3种剪切体的引物组及其试剂盒和应用。
背景技术
急性早幼粒细胞白血病(APL,M3型)患者有90%以上是由染色体核型t(15;17)(q22;q21)易位导致,该易位使15q22中的PML基因与17q21中的RARα基因融合,产生PML-RARα和RARα-PML两个融合基因。PML-RARα融合基因具有异质性,在其形成过程中,RARα上的断裂点总是位于17kb长度范围的第2个内含子内,但是PML上的断裂点存在很多变异,主要集中在3个断裂点丛集区(bcr):断裂点bcrl在PML第6个内含子内,形成长型转录本(L);断裂点bcr2在PML第6个外显子内,产生可变型转录本(V);断裂点bcr3在PML第3个内含子内,产生短型转录本(S)。其中以长型(L型)和短型(S型)异构体为主,可变型(V型)最少见;内含子6(bcr1,约占55%);外显子6(bcr2,约占5%);内含子3(bcr3,约占40%),因此形成三种PML-RARα融合基因:L型(bcr1),V型(bcr2)和S型(bcr3)。
因APL常进展很快,早期诊断和确定治疗方案对预后非常重要。融合基因PML-RARα阳性急性早幼粒细胞白血病(APL)患者的早期、快速诊断,将有助于APL患者早期应用反式维甲酸(ATRA)进行有效“靶向”治疗,以减少APL患者致死性出血及其并发症,因此正确鉴定,区分L型、V型和S型三种PML-RARα融合基因,对临床治疗判定预后具有重要指导作用。
目前针对PML-RARα融合基因的检测方法主要有传统的DNA印迹技术(SouthernBlot)、荧光原位杂交技术(FISH),荧光PCR以及高通量测序技术等。DNA印迹技术对特定融合基因定性定量检测、基因突变分析、酶切图谱分析、基因重排和丢失检测方面具有广泛的应用,具有灵敏度高的特点,但同时也具有操作复杂、放射性污染、半衰期短、不稳定等缺点,难以在临床大规模使用;荧光原位杂交技术利用荧光标记的特异核酸探针与靶DNA分子杂交,通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号来确定与特异探针杂交后靶DNA被染色的数量,是目前临床常用的检测融合基因的方法,但其结果判读依赖于判读者的主观判读能力,对相关经验和判读技术要求较高,主观性较强,成本较高、通量低。
而关于利用荧光PCR技术检测PML-RARα融合基因3种剪切体,专利CN102925558A公开了一种检测PML-RARα融合基因mRNA表达量的试剂盒,其检测过程需要3个PCR反应体系才能同时检测PML-RARα融合基因可能存在的三种剪切体,无法实现在一个反应体系内对PML-RARα融合基因3种剪切体进行鉴定、区分的目的,存在着费时、费力、试剂成本高的缺点。Chen Z等(2015)公开了一种单管多重检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARa融合基因3种剪切体RT-qPCR方法(Chen,Zhanguo,et al."Development and Validation of a 3-PlexRT-qPCR Assay for the Simultaneous Detection and Quantitation of the ThreePML-RARa Fusion Transcripts in Acute Promyelocytic Leukemia."Plos One10.3(2015):e0122530.),通过3条引物和一条探针检测RARA,PML primer 5为bcr1和bcr2的引物;PML primer 6为bcr3的引物,这些引物共用1条探针(RARA probe),虽然是在一个反应体系内可同时检测PML-RARa融合基因3种剪切体,但是却依然不能有效区分PML-RARα的3种型别。因此,亟需寻找一种可以一管中同时对PML-RARαbcr1、PML-RARαbcr2和PML-RARαbcr3进行检测,有效鉴定、区分PML-RARα融合基因3种剪切体的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足,提供一种用于鉴别PML-RARα融合基因3种剪切体的引物组。。
本发明的另一目的在于提供一种鉴别PML-RARα融合基因3种剪切体的试剂盒。
本发明的再一目的在于提供所述鉴别PML-RARα融合基因3种剪切体的引物组和试剂盒的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的:
一种用于鉴别PML-RARα融合基因3种剪切体的引物组,包含检测PML-RARα融合基因bcr1、bcr2和bcr3剪切体的特异性正向引物、反向引物、特异性荧光探针及竞争性引物;其中,
PML-RARα融合基因bcr1剪切体特异性正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;
PML-RARα融合基因bcr2剪切体特异性正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示;
PML-RARα融合基因bcr3剪切体特异性正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示;
PML-RARα融合基因bcr1剪切体特异性反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示;
PML-RARα融合基因bcr2和bcr3剪切体特异性反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示;
PML-RARα融合基因bcr1剪切体特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示;
PML-RARα融合基因bcr2剪切体特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示;
PML-RARα融合基因bcr3剪切体特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示;
竞争性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
本发明针对PML-RARα融合基因bcr1、bcr2和bcr3剪切体设计的特异性正向引物、反向引物、特异性荧光探针可以在一个反应中通过多重荧光PCR同时对PML-RARαbcr1、PML-RARαbcr2和PML-RARαbcr3进行检测,且可以用于分型,以便于临床对APL的分子诊断。同时本发明引入了一条竞争性引物,可以大大提升PML-RARαbcr1、PML-RARαbcr 2和PML-RARαbcr3的特异性,降低假阳性的发生,从而实现一个反应中同时对样本中PML-RARα融合基因的bcr1,bcr2,和bcr3三种剪切体进行特异性检测,有效区分PML-RARα的3种型别。
具体地,所述PML-RARα融合基因bcr1、bcr2和bcr3剪切体的特异性荧光探针5’端分别标记有不同的荧光基团,用于多重荧光PCR时对三种剪切体的扩增曲线进行区分,可以有效区分PML-RARα融合基因3种剪切体。
优选地,所述PML-RARα融合基因bcr1剪切体特异性荧光探针的5’标记有FAM荧光基团,3’标记有淬灭基团BHQ1。
优选地,所述PML-RARα融合基因bcr2剪切体特异性荧光探针的5’标记有VIC荧光基团,3’标记有淬灭基团BHQ1。
优选地,所述PML-RARα融合基因bcr3剪切体特异性荧光探针的5’标记有Texas-Red荧光基团,3’标记有淬灭基团BHQ2。
本发明还请求保护上述引物组在鉴定PML-RARα融合基因bcr1、bcr2和bcr3剪切体或在制备鉴别PML-RARα融合基因bcr1、bcr2和bcr3剪切体的检测试剂盒中的应用。
一种鉴别PML-RARα融合基因3种剪切体的多重荧光PCR方法,包括如下步骤:
S1.提取样品RNA,;
S2.将步骤S1所述样品RNA逆转录成cDNA模板,利用上述引物组进行多重荧光定量PCR扩增反应;
S3.结果判定:通过扩增曲线进行判定,若扩增曲线呈明显单一S型曲线,则判定样品中有PML-RARα融合基因;再根据S型曲线对应的荧光通道,判定PML-RARα融合基因的型别。
优选地,步骤S2为一步法real-time RT-PCR反应,每人份PCR扩增反应体系包括逆转录酶1~3U、热启动Taq酶2~5U、dNTPs为6~12mmol、PCR缓冲液、PML-RARα融合基因bcr1、bcr2和bcr3剪切体特异性的正向引物、反向引物、竞争性引物、PML-RARα融合基因特异性荧光探针。
优选地,PML-RARα融合基因bcr1、bcr2和bcr3剪切体特异性正向引物正、反向引物的扩增体系终浓度均为0.15μmol/L,所述竞争性引物的扩增体系终浓度均为0.9μmol/L,所述bcr1和bcr3剪切体特异性荧光探针的扩增体系终浓度为0.04μmol/L,所述bcr2剪切体特异性荧光探针的扩增体系终浓度为0.04μmol/L。
优选地,PCR扩增反应程序为:50℃15min逆转录;95℃15min热启动;95℃15s,58℃45s(收集荧光),45个循环。
具体地,所述样品包括待测样品,阴性质控样品和阳性质控样品。所述待测样品包括患者的骨髓血、全血等样本类型。通过检测阴性质控样品和阳性质控样品进一步保证检测结果的有效性。
一种用于鉴别PML-RARα融合基因3种剪切体的检测试剂盒,包含上述用于同时鉴别PML-RARα融合基因3种剪切体的引物组。
优选地,所述试剂盒还包含PCR反应液、PCR反应酶系、bcr1、bcr2和bcr3阳性质控品以及阴性质控品。
优选地,所述PR-PCR反应液包括PCR缓冲液,由50mmol/L Tris-HCl、3~8mmol/LMgCl2(优选5mmol/L)和150~350mmol/L KCl(优选250 50mmol/L),0.2~0.3mg/ml BSA组成。
优选地,所述PCR反应酶系由逆转录酶、热启动Taq酶、dNTPs组成,每人份PCR反应酶系中逆转录酶的用量为1~3U,最佳用量2U;热启动Taq酶的用量为2~5U,最佳用量3U;dNTPs为6~12mmol,最佳用量10mmol。
优选地,所述PML-RARα融合基因bcr1、bcr2和bcr3剪切体特异性正向引物正、反向引物的扩增体系终浓度均为0.15μmol/L,所述竞争性引物的扩增体系终浓度均为0.9μmol/L,所述bcr1和bcr3剪切体特异性荧光探针的扩增体系终浓度为0.04μmol/L,所述bcr2剪切体特异性荧光探针的扩增体系终浓度为0.04μmol/L。
优选地,所述阴性质控品为hela细胞。
优选地,所述bcr1、bcr2和bcr3阳性质控品为基因合成方式制备的含PML-RARα融合基因bcr1、bcr2和bcr3剪切体的目的序列的慢病毒,且浓度为1×105copies/mL。
优选地,所述试剂盒还包含RNA提取试剂,可以对待测样品进行RNA提取,例如包含Trizol试剂。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明应用实时荧光定量PCR技术,采用多重PCR引物和特异性荧光探针,通过竞争引物可以实现一个反应中同时对样本中PML-RARα融合基因的bcr1,bcr2,和bcr3三种剪切体进行特异性检测,有效区分PML-RARα的3种型别,可广泛应用于PML-RARα融合基因相关疾病临床早期诊断、药物疗效、愈后监测及科学研究等多个领域,具有检测半自动化、检测速度快、特异性强、灵敏高,同时适用于骨髓血、全血等样本类型,具有适用样本范围广的特点。
附图说明
图1为本发明引物设计示意图。
图2为本发明的荧光定量PCR反应程序图。
图3为本发明的阴性质控品的扩增曲线图。
图4为本发明的阳性质控品的扩增曲线图。
图5为本发明特异性样本的扩增曲线图。
图6为本发明的PML-RARα的bcr1剪切体的扩增曲线图。
图7为本发明的PML-RARα的bcr2剪切体的扩增曲线图。
图8为本发明的PML-RARα的bcr3剪切体的扩增曲线图。
图9为本发明的bcr1定量标准品的扩增曲线图。
图10为本发明的bcr2定量标准品的扩增曲线图。
图11为本发明的bcr3定量标准品的扩增曲线图。
图12为本发明的bcr1样本在含竞争性引物的试剂盒的扩增曲线图。
图13为本发明的bcr2样本在含竞争性引物的试剂盒的扩增曲线图。
图14为本发明的bcr3样本在含竞争性引物的试剂盒的扩增曲线图。
图15为本发明的bcr1样本在不含竞争性引物的试剂盒的扩增曲线图。
图16为本发明的bcr2样本在不含竞争性引物的试剂盒的扩增曲线图。
图17为本发明的bcr3样本在不含竞争性引物的试剂盒的扩增曲线图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1鉴别PML-RARα融合基因3种剪切体的特异性引物、探针及竞争引物设计
本发明根据GenBank中登录的PML和RARα基因组序列,应用DNAMAN软件进行同源性分析,并找出相应的断裂点。根据相关断裂位点分别在PML基因上分别设计3种剪切体的上游引物,在RARα基因上设计各自的探针和下游引物,然后应用Oligo7.0软件分析所设计的引物及探针的二级结构,并通过NCBI的BLAST功能对其引物进行比对,对其特异性进行初步鉴定。bcr1剪切体的上游引物设计时选择靠近bcr1剪切体断裂点的位置,该引物和其他剪切体上无结合位点,同时在靠近上游引物的位置设计一条竞争性引物,该引物主要是用于抑制非特异性的扩增;bcr2剪切体的上游引物设计在Exon6断裂点的上游,其引物TM值和竞争引物一致;bcr3剪切体的上游引物设计在Exon3断裂点的上游,其引物TM值和竞争引物一致,引物设计示意图如图1所示。本发明经过初步筛选后虽然得到一系列符合引物设计要求的序列,但是实际检测效果并不好;因此后续又通过大量的筛选验证试验,最终得到检测PML-RARα融合基因bcr1、bcr2和bcr3剪切体的特异性正向引物、反向引物、特异性荧光探针及竞争性引物;PML-RARα的bcr1、bcr2和bcr3的探针分别用FAM、VIC、Texas-Red标记,以便于在检测中区分。其中,
PML-RARα融合基因bcr1剪切体特异性正向引物的核苷酸序列为:5’-CTGCCCAACAGCAACCAC-3’(SEQ ID NO:1);
PML-RARα融合基因bcr2剪切体特异性正向引物的核苷酸序列为:5’-ACCTGGATGGACCGCCTAG-3’(SEQ ID NO:2);
PML-RARα融合基因bcr3剪切体特异性正向引物的核苷酸序列为:5’-GCCTGCAGGACCTCAGC-3’(SEQ ID NO:3);
PML-RARα融合基因bcr1剪切体特异性反向引物的核苷酸序列为:5’-CAGTACTGGCAGCGGTTC-3’(SEQ ID NO:4);
PML-RARα融合基因bcr2和bcr3剪切体特异性反向引物的核苷酸序列为:5’-ACCCCATAGTGGTAGCCTGA-3’(SEQ ID NO:5)
PML-RARα融合基因bcr1剪切体特异性荧光探针的核苷酸序列为:5’-AGGGCTTCTTCCGCCGCAGCATCCAGA-3’;(SEQ ID NO:6)
PML-RARα融合基因bcr2剪切体特异性荧光探针的核苷酸序列为:5’-CGCATCTACAAGCCTTGCTTTG-3’;(SEQ ID NO:7)
PML-RARα融合基因bcr3剪切体特异性荧光探针的核苷酸序列为:5’-CCAGCCCTCCCTCGCCAC-3’;(SEQ ID NO:8)
竞争性引物的核苷酸序列为:5’-CGAGCCAACCTTGCCTCC-3’(SEQ ID NO:9)。
最终确定所述PML-RARα融合基因bcr1、bcr2和bcr3剪切体特异性正向引物正、反向引物在扩增体系终浓度均为0.15μmol/L,所述竞争性引物的扩增体系终浓度均为0.9μmol/L,所述bcr1和bcr3剪切体特异性荧光探针的扩增体系终浓度为0.04μmol/L,所述bcr2剪切体特异性荧光探针的扩增体系终浓度为0.04μmol/L。
多重荧光PCR的反应程序:50℃15min逆转录;95℃15min热启动;95℃15s,58℃45s(收集荧光),45个循环;
实施例2鉴别PML-RARα融合基因3种剪切体的检测试剂盒构建及其使用
1、制备包括下列组成成分的试剂盒:PCR反应液1管,PCR反应酶系1管,阳性质控品1管,阴性质控品1管;
(1)所述PCR反应液包括PCR缓冲液、实施例1设计筛选得到的PML-RARα融合基因bcr1,bcr2和bcr3剪切体特异性的正向引物、反向引物、PML-RARα融合基因特异性荧光探针和竞争性引物;
PCR缓冲液由终浓度50mmol/L Tris-HCl、5mmol/L MgCl2和250mmol/L KCl,0.2~0.3mg/ml BSA组成。
(2)所述PCR反应酶系:由逆转录酶、热启动Taq酶、dNTPs组成;每人份PCR反应酶系中逆转录酶的用量为1~3U,最佳用量2U;热启动Taq酶的用量为2~5U,最佳用量3U;dNTPs为6~12mmol,最佳用量10mmol。
(3)所述阳性质控品为hela细胞。
(4)所述阳性质控品为基因合成方式制备的含PML-RARα融合基因bcr1、bcr2和bcr3剪切体的目的序列的慢病毒,且浓度为1×104copies/mL。
2、实时荧光定量PCR扩增及检测
(1)试剂准备:PCR反应液18μL、PCR反应酶系2μL,充分混匀后备用。
(2)加样:向PCR反应管中,分别加入处理后的阴、阳性质控品各5μL,盖紧管盖,放入仪器样品槽。
控制所述PML-RARα融合基因bcr1、bcr2和bcr3剪切体特异性正向引物正、反向引物的扩增体系终浓度均为0.15μmol/L,所述竞争性引物的扩增体系终浓度均为0.9μmol/L,所述bcr1和bcr3剪切体特异性荧光探针的扩增体系终浓度为0.04μmol/L,所述bcr2剪切体特异性荧光探针的扩增体系终浓度为0.04μmol/L。
(3)编辑:(ABI Prism 7500荧光定量PCR仪)
打开Setup窗口,按对应顺序设置阴、阳性质控品和待测标本,并在Name栏中设置样品名称。选中所有设置样品孔,双击,选择Add Detector,选择Reporter,FAM和Quencher为none,再选择Reporter,HEX和Quencher为none;在Passive Reference中选择(none)。
打开instrument窗口设置循环条件:50℃15分钟;95℃15分钟;95℃15秒,58℃45秒(收集荧光),45个循环;Sample Volume 25(见附图2)。所有设置完成后保存文件,运行。
(4)结果分析
反应结束后保存检测数据文件。在Results下打开Amplification Plot窗口。选择分析的目的样品所在位置。将Baseline数值改为start:3,stop:10,并打开manual设定Threshold:2-6e+3。双击Rn坐标上数值打开Graph settings窗口,将Post Run Settings中Log改为Linear,OK后打开Analysis preferences窗口,在Analysis菜单下选择Analyze自动分析结果。
检测结果:阴性质控品的扩增曲线不呈S型(见附图3);阳性质控品的FAM、VIC和Texas-Red通道的扩增曲线均为明显S型曲线(见附图4)。
本次试验中,阴、阳性质控品的检测结果均为相应的阴或阳性,说明本试剂盒的质量可靠,可用于PML-RARα融合基因3种剪切体的检测。
实施例3应用PML-RARα融合基因3种剪切体试剂盒检测特异性标本
选取经过病毒培养方法分别鉴定为单纯疱疹病毒Ⅰ型、单纯疱疹病毒Ⅱ型、EB病毒、巨细胞病毒、CBFB-MYH11、E2A-PBX1(TCF3-PBX1)、FIP1L1-PDGFRA、MLL-AF4(KMT2A-AFF1)、MLL-AF9(KMT2A-MLLT3)、SIL-TAL1(STIL-SCL)、TEL-AML1(ETV6-RUNX1)、AML-MDS1、DEK-CAN、MLL-PTD、MLL-AF1q、MLL-AF1p、MLL-AF6、MLL-AF10、MLL-AF17、MLL-ELL、MLL-ENL、SET-CAN、TLS-ERG、ZNF198-FGFR1、BCR-FGFR1、TEL-PDGFRB、NPM1-MFL1、NPM1-ALK、E2A-HLF、KPN1-EV11、UNP98-HDXD13、UNP98-HDXA9、AML1-EAP的样本各1例作为特异性样本,对所有样本进行核酸提取,PCR扩增及结果分析步骤参照实施例2进行,同时进行阴,阳性质控品的检测。
检测结果:阴性质控品的扩增曲线不呈S型,阳性质控品的FAM、VIC和Texas-Red扩增曲线为明显S型曲线,阴、阳性质控品均符合试剂盒的质控要求,因此待检标本的检测结果是有效的。由待检标本的检测结果可知本试剂盒对单纯疱疹病毒Ⅰ型、单纯疱疹病毒Ⅱ型、EB病毒、巨细胞病毒、CBFB-MYH11、E2A-PBX1(TCF3-PBX1)、FIP1L1-PDGFRA、MLL-AF4(KMT2A-AFF1)、MLL-AF9(KMT2A-MLLT3)、SIL-TAL1(STIL-SCL)、TEL-AML1(ETV6-RUNX1)、AML-MDS1、DEK-CAN、MLL-PTD、MLL-AF1q、MLL-AF1p、MLL-AF6、MLL-AF10、MLL-AF17、MLL-ELL、MLL-ENL、SET-CAN、TLS-ERG、ZNF198-FGFR1、BCR-FGFR1、TEL-PDGFRB、NPM1-MFL1、NPM1-ALK、E2A-HLF、KPN1-EV11、UNP98-HDXD13、UNP98-HDXA9、AML1-EAP等无非特异扩增(见附图5)。
本次试验中,特异性标本的检测结果均为阴性,说明利用本试剂盒检测特异性是可行的,具有良好的特异性。
实施例4应用鉴别PML-RARα融合基因3种剪切体的检测试剂盒检测阳性样品
选取临床上已确诊的PML-RARα融合基因bcr1剪切体阳性样本(1例)、PML-RARα融合基因bcr2剪切体阳性样本(1例)和PML-RARα融合基因bcr3剪切体阳性样本(1例),对所有样本进行核酸提取,PCR扩增及结果分析步骤参照实施例2进行,同时进行阴、阳性质控品的检测。
检测结果:阴、阳性质控品均符合试剂盒的质控要求,因此待检标本的检测结果是有效的。3例阳性样本检测结果均为阳性,且相互之间无交叉,如图6、7、8所示。
本次试验中3例标本的检测结果与已知的临床结果完全吻合,说明利用本试剂盒鉴别检测PML-RARα融合基因3种剪切体是可行的,可以有效区分PML-RARα的3种型别。本试剂盒操作简便,检测时间短,可实现高通量检测,且价格低廉,可用于PML-RARα融合基因3种剪切体的鉴别检测。
实施例5应用PML-RARα融合基因3种剪切体试剂盒检测灵敏度标本
选取已定值的bcr1、bcr2和bcr3慢病毒用DEPC H2O分别稀释至1.0×104copies/mL、1.0×103copies/mL、1.0×102copies/mL、1.0×101copies/mL的制备成定量标准品,对所有定量标准品进行核酸提取,PCR扩增及结果分析步骤参照实施例2进行,同时进行阴、阳性质控品的检测。
检测结果:阴、阳性质控品均符合试剂盒的质控要求,因此待检标本的检测结果是有效的。bcr1的定量标准品检测结果均为阳性,且呈梯度扩增,如图9所示;bcr2的定量标准品检测结果均为阳性,且呈梯度扩增,如图10所示。Bcr3的定量标准品检测结果均为阳性,且呈梯度扩增,如图11所示。
本次试验中梯度稀释的定量标准品的检测结果均为阳性,1.0×101copies/mL的有扩增曲线且曲线比较光滑,利用本试剂盒可检出10copies/mL浓度的样本,具有较高的灵敏度。
实施例6应用PML-RARα融合基因3种剪切体试剂盒检测重复性
选取bcr1、bcr2和bcr3阳性质控品,且浓度为1×105copies/mL然后用DEPC H2O分别稀释至1.0×104copies/mL和1.0×103copies/mL的制备成重复性参考品,对重复性参考品进行核酸提取,PCR扩增及结果分析步骤参照实施例2进行,同时进行阴、阳性质控品的检测。
检测结果:阴、阳性质控品均符合试剂盒的质控要求,因此待检标本的检测结果是有效的。bcr1的重复性参考品检测结果均为阳性,Ct值如表1所示;bcr2的重复性参考品检测结果均为阳性,Ct值如表1所示。Bcr3的重复性参考品检测结果均为阳性,Ct值如表1所示。
表1试剂盒重复性检测结果
本次试验中重复性参考品的检测结果均为阳性,Ct值的变异系数均小于4%,说明本试剂盒具有较好的重复性。
实施例7应用PML-RARα融合基因3种剪切体试剂盒稳定性检测
将试剂盒置于-20±5℃冰箱中,分别于第0、3、5、7、9、11个月取出一个试剂盒,以企业工作参考品为待测样本,按操作说明书进行操作。其测试性能如表2所示。
表2试剂盒稳定性检测结果
根据上述实验结果可以看出,成品试剂盒储存在-20±5℃可放置11个月,试剂盒的效期为11个月,具有较好的稳定性。
实施例8应用PML-RARα融合基因3种剪切体试剂盒竞争性引物验证
配制包含竞争性引物的PCR反应液,所述PCR反应液包括PCR缓冲液、实施例1设计筛选得到的PML-RARα融合基因bcr1,bcr2和bcr3剪切体特异性的正向引物、反向引物、PML-RARα融合基因特异性荧光探针和竞争性引物;
同时配制不包含竞争性引物的PCR反应液,所述PCR反应液包括PCR缓冲液、实施例1设计筛选得到的PML-RARα融合基因bcr1,bcr2和bcr3剪切体特异性的正向引物、反向引物、PML-RARα融合基因特异性荧光探针;
将上述2种PCR反应液结合试剂盒的其他组分,以bcr1,bcr2和bcr3剪切体的临床样本进行检测,PCR扩增及结果分析步骤参照实施例2进行。
检测结果:阴、阳性质控品均符合试剂盒的质控要求,因此待检标本的检测结果是有效的。bcr1、bcr2和bcr3的临床样本在含竞争性引物的试剂盒中检测结果正常,不存在非特异性扩增,如图12~14所示;但在不含竞争性引物的试剂盒中检测结果不正常,bcr1的临床样本在bcr2和bcr3的通道均有扩增曲线,bcr2的临床样本在bcr3的通道有扩增曲线,如图15~17所示。
本次实验结果可以证明竞争性引物可有效降低试剂盒的非特异性,提升检测结果的准确性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州血康陆道培生物技术有限公司
<120> 一种鉴别PML-RARα融合基因3种剪切体的引物组及其试剂盒和应用
<141> 2020-05-26
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
ctgcccaaca gcaaccac 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 2
acctggatgg accgcctag 19
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 3
gcctgcagga cctcagc 17
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 4
cagtactggc agcggttc 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 5
accccatagt ggtagcctga 20
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 6
agggcttctt ccgccgcagc atccaga 27
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 7
cgcatctaca agccttgctt tg 22
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 8
ccagccctcc ctcgccac 18
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 9
cgagccaacc ttgcctcc 18
Claims (9)
1.一种用于鉴别PML-RARα融合基因3种剪切体的引物探针组,其特征在于,包含检测PML-RARα融合基因bcr1、bcr2和bcr3剪切体的特异性正向引物、反向引物、特异性荧光探针及竞争性引物;其中,
PML-RARα融合基因bcr1剪切体特异性正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;
PML-RARα融合基因bcr2剪切体特异性正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示;
PML-RARα融合基因bcr3剪切体特异性正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示;
PML-RARα融合基因bcr1剪切体特异性反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示;
PML-RARα融合基因bcr2和bcr3剪切体特异性反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示;
PML-RARα融合基因bcr1剪切体特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示;
PML-RARα融合基因bcr2剪切体特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示;
PML-RARα融合基因bcr3剪切体特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示;
竞争性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示;
所述PML-RARα融合基因bcr1、bcr2和bcr3剪切体的特异性荧光探针5’端分别标记有不同的荧光基团。
2.权利要求1所述的引物探针组在鉴定PML-RARα融合基因bcr1、bcr2和bcr3剪切体或在制备鉴别PML-RARα融合基因bcr1、bcr2和bcr3剪切体的检测试剂盒中的应用;所述鉴定为非疾病诊断目的。
3.一种非疾病诊断目的鉴别PML-RARα融合基因3种剪切体的多重荧光PCR方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1.提取样品RNA;
S2.利用权利要求1所述的引物探针组对步骤S1所述样品RNA进行一步法多重荧光定量PCR扩增反应;
S3.结果判定:通过扩增曲线进行判定,若扩增曲线呈明显单一S型曲线,则判定样品中有PML-RARα融合基因;再根据S型曲线对应的荧光通道,判定PML-RARα融合基因的型别。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤S2为一步法real-time RT-PCR反应,每人份PCR扩增反应体系包括逆转录酶1~3U、热启动Taq酶2~5U、dNTPs为6~12mmol、PCR缓冲液、PML-RARα融合基因bcr1、bcr2和bcr3剪切体特异性的正向引物、反向引物、竞争性引物、PML-RARα融合基因特异性荧光探针。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,PML-RARα融合基因bcr1、bcr2和bcr3剪切体特异性正向引物正、反向引物的扩增体系终浓度均为0.15μmol/L,所述竞争性引物的扩增体系终浓度均为0.9μmol/L,所述bcr1和bcr3剪切体特异性荧光探针的扩增体系终浓度为0.04μmol/L,所述bcr2剪切体特异性荧光探针的扩增体系终浓度为0.04μmol/L。
6.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,PCR扩增反应程序为:50℃ 15min 逆转录;95℃ 15min 热启动;95℃ 15s,58℃ 45s 收集荧光,45个循环。
7.一种用于鉴别PML-RARα融合基因3种剪切体的检测试剂盒,其特征在于,包含权利要求1所述的引物探针组。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,还包含PCR反应液、PCR反应酶系、bcr1、bcr2和bcr3阳性质控品以及阴性质控品。
9.根据权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,所述bcr1、bcr2和bcr3阳性质控品分别为含PML-RARα融合基因bcr1、bcr2和bcr3剪切体的目的序列的慢病毒,且浓度为1×105 copies/mL;所述阴性质控品为hela细胞。
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