CN114480649A - 一种检测e2a-znf384融合基因的引物组、试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测E2A‑ZNF384融合基因的引物组、试剂盒及方法。所述引物组包括一对外引物、一对内引物和一条探针，外引物采用锁核酸标记，内引物用于在外引物扩增基础上进行嵌套式扩增，同时通过探针进行荧光PCR信号收集，极大提高检测的灵敏度和特异性，其检测灵敏度达到1×10¹copies/mL，相当于可以稳定地达到每10⁶个有核细胞中检出一个含E2A‑ZNF384融合基因的白血病细胞；内外引物的Tm值落差保证了外扩增、内扩增反应在一个反应体系内分别独立进行，无需中途开盖增加污染风险、无需进行两次独立的PCR反应，简单、快捷，2小时内即可得到检测结果，从而满足白血病早期诊断、早期治疗的要求。

Description

一种检测E2A-ZNF384融合基因的引物组、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及医学检测技术领域，更具体地，涉及一种检测急性B细胞淋巴细胞白血病E2A-ZNF384融合基因的引物组、试剂盒及方法。

背景技术

急性B细胞淋巴细胞白血病(B-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL)是一种异质性血液系统疾病，其特点是淋巴分化受阻、不成熟、无功能的B细胞克隆迅速增殖。其临床症状主要包括贫血、肝脾肿大、关节疼痛以及全身淋巴结肿大等。约有30％～60％的患者表现为难治性或复发性，这也是导致B-ALL患者死亡的主要原因。B-ALL在治疗中存在化疗后缓解率低、复发率高以及长期生存率差等问题，目前B-ALL的诊治对人类来说仍然是一个严峻的挑战。如果未经早期诊断并治疗，疾病会迅速发展，可在数周至数月内致命，目前主要根据细胞形态学、免疫分型和遗传特征对B-ALL进行综合诊断。

随着分子生物学技术的发展及对白血病分子遗传学的深入研究，已知白血病中存在着染色体结构畸变，包括缺失、重复、倒位、易位等，涉及至少数十种融合基因，融合基因形成是白血病的发生和发展的重要机制，对相关融合基因检测，可以达到精准诊断的目的，同时融合基因的定性和定量分析还可以作为预后评估的有效手段，在形态学完全缓解的基础上，使诊断更加准确。

最近的研究表明，急性B细胞淋巴细胞白血病患者染色体畸变，导致锌指蛋白ZNF384基因和转录因子3(TCF3 or E2A)基因断裂易位形成E2A-ZNF384融合基因，E2A-ZNF384融合基因阳性在B-ALL病人中占比2.4％，且在治疗后是最容易复发的类型。目前检测融合基因mRNA表达的方法有高通量转录组测序分析、Northern blot、荧光原位杂交(FISH)和实时荧光定量PCR(qPCR)。A.高通量转录组测序分析可对细胞mRNA及非编码RNA进行整体测序分析，能够一次性分析已知的白血病相关融合基因及基因表达谱，但这样技术仅能用于科研，费用高昂、耗时极长，仅后续生物信息学分析就需一周时间，而且不能针对一个位点，是一种“大撒网”式技术，不能应用于临床快速检测。B.Northern blot采用琼脂糖凝胶电泳，在变性条件下将待检的RNA样品通过印迹转移至固相支持物如纤维素膜等上面，在用标记过的cDNA探针，根据碱基互补原则进行杂交后显影，显示强度可表明RNA在所测样本中的相对含量。缺点是灵敏度低、信号弱，纤维素膜显示后有高背景，影响判断。C.FISH是一种非放射性原位杂交技术，将cDNA片段标记上生物素等报告分子，通过杂交后报告分子与亲和素之间的免疫化学反应，在荧光显微镜下对待测RNA进行定性或定位分析。它的优点是定位准确、荧光信号强。缺点是杂交不能达到100％的效率，特别是在应用较短的cDNA探针时效率会明显下降，容易造成漏检，同时因为是通过荧光显微镜观察，主观性强，对操作人员的技术要求高，很难在医院大规模应用。而实时荧光定量PCR(qPCR)具有快速、精准的检测融合基因的优点，可应用于临床快速检测，例如中国专利CN111321227A、CN12522403A、CN111826375A、CN113684261A等分别公开了针对E2A-ZNF384融合基因的多重荧光PCR或荧光PCR技术，但由于E2A-ZNF384融合基因在病程早期表达量极低，目前的技术很难达到其检测下限，容易导致假阴性。因此，亟需针对E2A-ZNF384融合基因检测，开发灵敏度高特异性强的分子诊断产品。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种检测E2A-ZNF384融合基因的引物组。

本发明的第二个目的在于提供检测E2A-ZNF384融合基因的产品。

本发明的第三个目的在于提供一种检测E2A-ZNF384融合基因的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种检测E2A-ZNF384融合基因的引物组，包括一对外引物、一对内引物和一条探针；所述外引物的上游引物序列为5’-agCagcAcGtttgGtggcct-3’，下游引物序列为5’-ctcCaGcAgtCAtcaGtcCtg-3’，大写碱基为LNA修饰位点；所述内引物的上游引物序列为5’-atggagcagaggtgaacggt-3’，下游引物序列为5’-aggcaggcactgtcagcaa-3’；所述探针序列为5’-cccacagtctcaggtcagatc-3’，5端’标记荧光基团，3’标记淬灭基团。

本发明通过对E2A、ZNF384基因进行分析，找出对应断裂点并设计引物、探针，应用锁核酸技术，在PCR的基础上做进一步的升级，提升引物的Tm值，同时引入嵌套式扩增，使一个检测体系中检测一个基因的寡核苷酸达到五条(一对外引物、一对内引物、一条探针)。包括锁核酸(LNA)标记的20mer左右碱基长度的外引物对，外引物Tm值为72℃至78℃，及嵌套式扩增的内引物对及检测探针，内引物Tm值为55℃至60℃，使内外引物的Tm值有较大差异，通过控制退火温度，从而使嵌套式扩增可以在一个反应体系中进行检测，而传统嵌套式扩增必须是两次独立的PCR反应。检测时，外引物扩增首先启动(72℃至78℃)，完成痕量模板的特异性富集，再降温(55℃至60℃)启动同一管的内引物扩增及荧光PCR信号收集，实现一步巢式qPCR，最终在同一个PCR反应、同一管内完成嵌套式扩增，使低拷贝的E2A-ZNF384融合基因模板的扩增特异性和灵敏度也得到显著提升。

具体地，锁核酸是一种特殊的双环状核苷酸衍生物，结构中含有结构中含有一个或多个2′-O,4′-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核酸单体，核糖的2′-O位和4′-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3′-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。由于LNA与DNA/RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架，故其对DNA、RNA有很好的识别能力、强大的亲和力和杂交的稳定性。与其他寡核苷酸类似物相比，LNA有很多优点：a.和DNA、RNA互补的双链有很强的热稳定性，显著提升寡核苷酸的熔解温度(ΔTm＝3～8℃)；b.抗3′脱氧核苷酸酶降解的稳定性；c.高效的自动寡聚化作用。基于LNA以上的优点，本发明在外引物设计阶段，在特定的碱基位置，标记LNA，提升其Tm值至72℃至78℃。

而嵌套式扩增即巣式PCR的原理是设计两对引物，分别称为外引物对和内引物对。外引物扩增更长的目的基因片段，这一过程可看作是模板的特定富集和放大，在10至20个扩增循环后终止外引物扩增反应，同时启动较小基因片段的内引物扩增和探针识别，完成整个检测。由于内引物扩增在富集的模板上进行扩增，致检测的灵敏度大幅提升；同时因为PCR扩增存在一定的错配几率，外引物扩增的错配片段在内引物扩增时无法正常进行，这就保证了检测的高特异性。所以，嵌套式扩增的结果是灵敏度和特异性的同时提升。

本发明外引物标记LNA后，其Tm值升至72℃至78℃，这样内外引物同时在反应管的情况下，高退火温度扩增(72℃或以上)启动的是外扩增，内引物不参与反应。10至15个循环的外扩增反应结束后，进入40至45个循环的低退火温度(55℃至60℃)内扩增反应。由于较低浓度的外引物在外扩增反应中基本消耗了，同时低退火温度不利于残留外引物的扩增，所以内扩增反应实际上成为了较高浓度的内引物的优势扩增反应，这样内扩增反应在探针的参与下，完成整个嵌套式扩增的检测，无需中途开盖增加污染风险、无需进行两次独立的PCR反应。外扩增反应完成特异性模板富集，内扩增反应阶段同时完成荧光信号的收集，最终使融合基因检测灵敏度提高一个数量级以上。

优选地，所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、Cy5中的任意一种。

优选地，所述淬灭基团选自TAMRA、Cy3、BHQ1中的任意一种。

进一步优选地，所述荧光基团为FAM或VIC。

进一步优选地，所述淬灭基团为BHQ-1。

本发明还提供上述任一所述引物组在非疾病诊断目的检测E2A-ZNF384融合基因或在制备检测E2A-ZNF384融合基因的产品中的应用。

本发明还提供一种检测E2A-ZNF384融合基因的产品，包含上述任一所述引物组。

优选地，所述产品还还包含PCR反应液、PCR反应酶系、E2A-ZNF384融合基因阳性质控品以及阴性质控品。

进一步优选地，所述产品为试剂盒。

本发明还提供上述任一所述产品在非疾病诊断目的检测E2A-ZNF384融合基因中的应用。

一种非疾病诊断目的检测E2A-ZNF384融合基因的方法，包括如下步骤：

S1.提取样品RNA；

S2.将步骤S1所述样品RNA反转录成cDNA模板或直接以步骤S1所述样品RNA为模板，利用上述任一所述引物组进行一步巢式荧光定量PCR扩增反应；

S3.结果判定：通过扩增曲线进行判定，若扩增曲线呈明显单一S型曲线，则判定样品中有E2A-ZNF384融合基因。

优选地，所述一步巢式荧光定量PCR扩增体系为2μM外引物0.8μL，20μM内引物0.8μL，20μM探针0.4μL，5×一步法RT-PCR缓冲液5μL，热启动酶2U，MMLV酶100U，dNTPs 25mM 0.6μL。

优选地，所述一步巢式荧光定量PCR扩增程序为50℃15min；95℃3min；95℃15sec，72℃30sec，15个循环；再95℃5sec，58℃15sec，40个循环。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明检测E2A-ZNF384融合基因的引物组包括一对外引物、一对内引物和一条探针，外引物采用锁核酸标记，Tm值为72℃至78℃，内引物Tm值为55℃至60℃，通过控制退火温度，从而使嵌套式扩增可以在一个反应体系中进行检测，同时通过探针进行荧光PCR信号收集，极大提高检测的灵敏度和特异性，其检测灵敏度达到1×10¹copies/mL，相当于可以稳定地达到每10⁶个有核细胞中检出一个含E2A-ZNF384融合基因的白血病细胞；内外引物的Tm值落差保证了外扩增、内扩增反应在一个反应体系内分别独立进行，无需中途开盖增加污染风险、无需进行两次独立的PCR反应，简单、快捷，2小时内即可得到检测结果；能完全满足临床的低拷贝模板(10⁶个有核细胞中含1个融合基因细胞)、快速检测、精确度和准确度高的要求，同时成本较低，每个临床样品检测的试剂成本可控制在10元以内。

附图说明

图1为锁核酸嵌套式扩增结果。绿色：VIC通道；蓝色：FAM通道。

图2为普通荧光PCR扩增结果。绿色：VIC通道；蓝色：FAM通道

图3为锁核酸嵌套式扩增特异性测试结果(每条曲线代表测试的一种样本)。

图4为锁核酸嵌套式扩增灵敏度测试结果。

图5为普通荧光PCR灵敏度测试结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1检测E2A-ZNF384融合基因的引物、探针组设计

用DNAMAN软件对E2A(SEQ ID NO.1)和ZNF384(SEQ ID NO.2)进行基因的同源性分析，找出E2A、ZNF384基因对应断裂点并设计引物探针。确认好断裂点的位置和序列后，首先分别设计外引物上游和内引物上游，设计原则为在断裂点的更远端E2A基因序列上设计外引物上游，在断裂点的次远端E2A序列上设计内引物上游，内引物的3’端要尽量靠近断裂点的位置，同时在设计时两条引物的GC含量要基本一致，这样可减少检测非特异性的发生同时提高灵敏度。然后在ZNF384基因序列上设计外引物下游、内引物下游和探针，设计原则为在更远端ZNF384基因序列上设计外引物下游，在ZNF384基因的次远端序列上设计内引物下游和探针，探针5’端与断裂点距离不要超过50mer，同时在设计时两条引物的GC含量要基本一致，这样可减少检测非特异性的发生同时提高灵敏度。设计完成后，通过Oligo7.0软件分析上述5条寡核苷酸的二级结构，并通过NCBI的BLAST功能比对分析判断序列的特异性。初筛后再通过最终筛选验证试验，最终筛选得到如下所示引物组：

外引物上游：5’-agCagcAcGtttgGtggcct-3’(大写的C/A/G/G四个碱基均为LNA修饰位点)；

外引物下游：5’-ctcCaGcAgtCAtcaGtcCtg-3’(大写的C/G/A/C/A/G/C七个碱基均为LNA修饰位点)；

内引物上游：5’-atggagcagaggtgaacggt-3’；

内引物下游：5’-aggcaggcactgtcagcaa-3’；

探针：5’-FAM-cccacagtctcaggtcagatc-BHQ-1-3’；

扩增体系为2μM外引物0.8μL，20μM内引物0.8μL，20μM探针0.4μL，5×一步法RT-PCR缓冲液5μL，热启动酶2U，MMLV酶100U，dNTPs 25mM 0.6μL。

反应程序为50℃15min；95℃3min；95℃15sec，72℃30sec，15个循环；再95℃5sec，58℃15sec，40个循环。

实施例2与普通荧光PCR扩增对比测试实验

根据E2A-ZNF384融合基因序列构建重组质粒，浓度为1×10⁶copies/mL，然后用DEPC水稀释到1×10²copies/mL，测试15个重复样品，测试设备为ABI7500，扩增程序如下：

A：锁核酸嵌套式扩增反应：采用实施例1所述检测E2A-ZNF384融合基因的引物、探针组，反应体系和反应程序。

B：普通荧光PCR扩增反应

普通荧光PCR引物

上游引物：5’-ggtgtcaggtgtggttggag-3’；

下游引物：5’-aaagcgcaaggcgcagcg-3’；

探针：5’-FAM-tgcgtgtgagtgtgtgggtctgtct-BHQ-1-3’；

反应体系：扩增体系为20μM引物0.8μL，20μM探针0.4μL，5×一步法RT-PCR缓冲液5μL，热启动酶2U，MMLV酶100U，dNTPs 25mM 0.6μL。程序：50℃15min；95℃5min；95℃15sec，58℃45sec，45个循环。

C.测试模板：E2A-ZNF384融合基因质粒，设置空白对照。

D.测试靶标：E2A-ZNF384融合基因，为双色测试试剂。

E.标记基团：FAM标记E2A-ZNF384融合基因，VIC标记内参基因。

F.锁核酸嵌套式扩增结果如表1和图1所示，

表1

FAM(CT值)	VIC(CT值)
		29.81	29.88
29.90	29.94
		29.86	29.67
30.37	30.06
		30.14	30.21
30.24	29.93
		30.14	29.87
29.87	29.67
		29.81	29.62
29.57	29.58
		29.77	29.79
30.02	29.96
		30.18	30.41
30.20	30.73
		30.10	29.97
平均：29.99	29.95

G.普通荧光PCR扩增结果如表2和图2所示：

表2

H：对比测试实验结论：

①E2A-ZNF384融合基因(FAM通道)锁核酸嵌套式扩增组CT值平均前移3.27，检测提升达到一个数量级。

②两组实验空白对照均没有非特异性扩增。

上述结果表明，E2A-ZNF384融合基因采用锁核酸嵌套式扩增可以显著性提高检测的灵敏度，提升达一个数量级，且不会增加测试的非特异性表现。

实施例3特异性测试

取用病毒培养方法鉴定为BCR-ABL1、AML-MDS1、AML1-ETO、PML-RARA、MLL-AF9、TLS-ERG、MLL-AF6、MLL-AF10、MLL-AF17、SET-CAN、STIL-SCL、NPM1-MFL1、NPM1-ALK、KMT2A-AFF1的慢病毒样本作为特异性测试样本，每种病毒均经过核酸纯化、采用实施例1所述检测E2A-ZNF384融合基因的引物、探针组，反应体系和反应程序进行嵌套式扩增并分析结果，设置阴性、阳性质控品对照(E2A-ZNF384)。

十四种慢病毒测试结果如图3所示，所有慢病毒特异性测试样本均无特异性扩增曲线，为典型的阴性扩增。同时阳性质控品扩增曲线为正常S型典型扩增，阴性质控品为典型阴性扩增。表明本发明的检测E2A-ZNF384融合基因的引物、探针组特异性强。

实施例4灵敏度测试

根据E2A-ZNF384融合基因序列构建重组质粒，浓度为1×10⁶copies/mL，然后用DEPC水梯度稀释到较低拷贝数1×10³copies/mL、1×10²copies/mL、1×10¹copies/mL，采用实施例2中所述引物、体系、程序分别进行嵌套式和普通荧光PCR灵敏度扩增对比测试并分析结果，设置阴性、阳性质控品对照(E2A-ZNF384)。

嵌套式扩增测试结果如图4所述，嵌套式扩增的FAM与VIC双色各梯度均呈典型的阳性扩增，且扩增梯度明显，检测灵敏度低至1×10¹copies/mL，由于白血病患者白细胞数为1×10⁷/ml以上，1×10¹copies/mL则相当于每10⁶个白细胞中检出一个copy。

普通荧光PCR扩增结果如图5所示，普通PCR扩增的FAM与VIC双色仅有1×10³copies/mL、1×10²copies/mL有典型的阳性扩增，但1×10¹copies/mL组扩增呈阴性；和嵌套式扩增相比，扩增灵敏度明显下降。

序列表

<110> 广州血康陆道培生物技术有限公司

<120> 一种检测E2A-ZNF384融合基因的引物组、试剂盒及方法

<141> 2022-01-28

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1803

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

atgaaccagc cgcagaggat ggcgcctgtg ggcacagaca aggagctcag tgacctcctg 60

gacttcagca tgatgttccc gctgcctgtc accaacggga agggccggcc cgcctccctg 120

gccggggcgc agttcggagg ttcaggcaag agcggtgagc ggggcgccta tgcctccttc 180

gggagagacg caggcgtggg cggcctgact caggctggct tcctgtcagg cgagctggcc 240

ctcaacagcc ccgggcccct gtccccttcg ggcatgaagg ggacctccca gtactacccc 300

tcctactccg gcagctcccg gcggagagcg gcagacggca gcctagacac gcagcccaag 360

aaggtccgga aggtcccgcc gggtcttcca tcctcggtgt acccacccag ctcaggtgag 420

gactacggca gggatgccac cgcctacccg tccgccaaga cccccagcag cacctatccc 480

gcccccttct acgtggcaga tggcagcctg cacccctcag ccgagctctg gagtcccccg 540

ggccaggcgg gcttcgggcc catgctgggt gggggctcat ccccgctgcc cctcccgccc 600

ggtagcggcc cggtgggcag cagtggaagc agcagcacgt ttggtggcct gcaccagcac 660

gagcgtatgg gctaccagct gcatggagca gaggtgaacg gtgggctccc atctgcatcc 720

tccttctcct cagcccccgg agccacgtac ggcggcgtct ccagccacac gccgcctgtc 780

agcggggccg acagcctcct gggctcccga gggaccacag ctggcagctc cggggatgcc 840

ctcggcaaag cactggcctc gatctactcc ccggatcact caagcaataa cttctcgtcc 900

agcccttcta cccccgtggg ctccccccag ggcctggcag gaacgtcaca gtggcctcga 960

gcaggagccc ccggtgcctt atcgcccagc tacgacgggg gtctccacgg cctgcagagt 1020

aagatagaag accacctgga cgaggccatc cacgtgctcc gcagccacgc cgtgggcaca 1080

gccggcgaca tgcacacgct gctgcctggc cacggggcgc tggcctcagg tttcaccggc 1140

cccatgtcgc tgggcgggcg gcacgcaggc ctggttggag gcagccaccc cgaggacggc 1200

ctcgcaggca gcaccagcct catgcacaac cacgcggccc tccccagcca gccaggcacc 1260

ctccctgacc tgtctcggcc tcccgactcc tacagtgggc tagggcgagc aggtgccacg 1320

gtggccgcca gcgagatcaa gcgggaggag aaggaggacg aggagaacac gtcagcggct 1380

gaccactcgg aggaggagaa gaaggagctg aaggcccccc gggcccggac cagcagtacg 1440

gacgaggtgc tgtccctgga ggagaaagac ctgagggacc gggagaggcg catggccaat 1500

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atgtgccaga tgcacctcaa gtcggacaaa gcgcagacca agctgctcat cctgcagcag 1620

gccgtgcagg tcatcctggg gctggagcag caggtgcgag agcggaacct gaatcccaaa 1680

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tga 1803

<210> 2

<211> 3999

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

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caaggggtcc gggtttggta tcacgtcccc ctcaggctct cttgtgacca cagcatcatc 1620

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ggatgatgat gaccatcaga aagacggcaa gacctacagg tgccggatgt gctcactgac 1920

attctactcc aagtcggaga tgcagatcca ctccaagtca cacaccgaga ccaagcccca 1980

caagtgccca cattgctcca agaccttcgc caacagctcc tacctggccc agcacatccg 2040

tatacactca ggggctaagc cctacagttg taacttctgt gagaaatcct tccgccagct 2100

ctcccacctt cagcagcaca cccgaatccc actggtgata gaccatacaa atgtgcacac 2160

ccaggctgtg agaaagcctt cacacaactc tccaatctgc agtcccacag acggcaacac 2220

aacaaagata aacccttcaa gtgccacaac tgtcatcggg cgtacacgga tgcagcctca 2280

ctagaggtgc acctgtctac gcacacagtg aagcatgcca aggtgtacac ctgcactatc 2340

tgcagtcggg catacacatc agaaacatac cttatgaaac atatgcgcaa acacaacccg 2400

cctgatcttc agcaacaggt gcaggcagca gcagcagcgg cagcagtggc ccaggcccag 2460

gctcaagctc aagcccaggc tcaggctcag gctcaagccc aggcccaggc ccaggcctcc 2520

caggcatcac agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcaacagcca 2580

ccaccacact tccagtctcc tggggcagcc ccccagggtg ggggtggtgg ggacagcaat 2640

cccaaccctc caccccagtg ttcctttgac ctgaccccgt ataagacggc ggagcatcat 2700

aaggacatct gcctcactgt caccaccagc accatccagg tggagcacct ggccagctct 2760

tagagatccg tgctgccacc cactgggaag aggaagaagt agtcctggtg tcttctttct 2820

ccaactcttg gtgggaaaag tccttttctt ccttgacagg ccttggctcc atctccttgg 2880

gcctctgtca cggctttcct tcacaggata ccatcctttt tctgaactct tcttcaaaag 2940

gaacatcagc cctcctgatt gcaaaggaat actgagctga tggtgtcatc cagcagcctc 3000

ccctcccaag caaagcttct aaaactgggg gtcggtgctc aagggaagga tttgctatga 3060

cctcatagaa ccttgtccag tgtggccact taccctatcc ttaccctcct tatcctcaaa 3120

gtttgggctg atgtaagact agaggctggc cctcccagat aacagagaaa agggagcccc 3180

aaatgcaacc agcctcttgt tctattcttg cctgcaaaag aacagaggtt tctcaaatgc 3240

ctcagtccct gagagccatt tcttccccta catcgtctca ctttgcttcc tattgactgc 3300

tggtagaagg agatttgggg taggggctag acctcctttt atttgaaggg ggcaagggct 3360

gagatgtggt ccccaagggg ccagaaattc ccaagttggt cacaggtggc ttagaagtgt 3420

gtgttatggt tttacggatt tccttgaagc ctctctcctt ctctgcctac aaagacccta 3480

tactctcagt ctccccaacc cacccccaag gagctgtggg aggctttgtg ttatctgtga 3540

aactccaaaa caggggtgtt gcggagaagg gagagttcag gcaaacgcaa ggactggact 3600

tagctcccta ggtgccacag tcagatgccg gacacggatt tatatataaa tatatatata 3660

taaatatatt atactcactc atcacggcca tctttgttgt aaccatttct gtgtttataa 3720

atgcattatc tctgagaatt ttcatatttg atgttttgtt tatttttgtc ctttttttcc 3780

ctctctccac ccctgtcctc tagccacagc atttttcttt ttgtcttttt tttttttttt 3840

taaatcatgg cagatttcag aggaaaggaa attaaaaaaa aaatcaggaa accagttgtt 3900

ataaagtaat ttaaaaatga agaaaaaaag aaaaaaactt atgtacaaac caaggggtgt 3960

ttttagaaca ttgtatagaa ataaattcat gtaaaagga 3999

Claims (10)

1.一种检测E2A-ZNF384融合基因的引物组，其特征在于，包括一对外引物、一对内引物和一条探针；所述外引物的上游引物序列为5’-agCagcAcGtttgGtggcct-3’，下游引物序列为5’-ctcCaGcAgtCAtcaGtcCtg-3’；所述内引物的上游引物序列为5’-atggagcagaggtgaacggt-3’，下游引物序列为5’-aggcaggcactgtcagcaa-3’；所述探针序列为5’-cccacagtctcaggtcagatc-3’，5端’标记荧光基团，3’标记淬灭基团。

2.根据权利要求1所述引物组，其特征在于，所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、Cy5中的任意一种。

3.根据权利要求1所述引物组，其特征在于，所述淬灭基团选自TAMRA、Cy3、BHQ1中的任意一种。

4.权利要求1～3任一所述引物组在非疾病诊断目的检测E2A-ZNF384融合基因或在制备检测E2A-ZNF384融合基因的产品中的应用。

5.一种检测E2A-ZNF384融合基因的产品，其特征在于，包含权利要求1～3任一所述引物组。

6.根据权利要求5所述产品，其特征在于，还包含PCR反应液、PCR反应酶系、E2A-ZNF384融合基因阳性质控品以及阴性质控品。

7.权利要求5或6所述产品在非疾病诊断目的检测E2A-ZNF384融合基因中的应用。

8.一种非疾病诊断目的检测E2A-ZNF384融合基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.提取样品RNA；

S2.将步骤S1所述样品RNA反转录成cDNA模板或直接以步骤S1所述样品RNA为模板，利用权利要求1～3任一所述引物组进行一步巢式荧光定量PCR扩增反应；

S3.结果判定：通过扩增曲线进行判定，若扩增曲线呈明显单一S型曲线，则判定样品中有E2A-ZNF384融合基因。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述一步巢式荧光定量PCR扩增体系为2μM外引物0.8μL，20μM内引物0.8μL，20μM探针0.4μL，5×一步法RT-PCR缓冲液5μL，热启动酶2U，MMLV酶100U，dNTPs 25mM 0.6μL。

10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述一步巢式荧光定量PCR扩增程序为50℃15min；95℃3min；95℃15sec，72℃30sec，15个循环；再95℃5sec，58℃15sec，40个循环。

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