CN115820862A - 一种检测人egfr基因多突变位点的数字pcr试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测人EGFR基因多突变位点的数字PCR试剂盒，属于基因检测技术领域，用于人类EGFR基因19de l、T790M和L858R多重突变的数字PCR检测，通过数字PCR平台的方法将多重突变检测集中在一张芯片上进行，能精确方便地实现对19de l、T790M和L858R各缺失型进行四‑五通道的高灵敏度检测，灵敏度可达0.1％，能够降低成本，减少样本的消耗，提高检测准确度和灵敏度，降低假阳性，尤其对于样本比较稀缺的ctDNA，也方便肿瘤组织等其他样本类型的检测，为非小细胞肺癌的患者提供一定的用药指导。
Description
技术领域
本发明涉及一种PCR试剂盒，具体涉及一种检测人EGFR基因多突变位点的数字PCR试剂盒，属于基因检测技术领域。
背景技术
表皮生长因子受体(EGFR)是I型酪氨酸激酶受体，是原癌基因c-erB-1(HER-1)的表达产物；其参与细胞通路PI3K/Akt/mTOR、RAS/RAF/MEK/ERK-MAPK等，通过这些通路调节细胞的生长、增值、转化等重要生理过程；同时EGFR基因也是靶向治疗的重要作用靶点。
研究表明，EGFR基因突变主要发生在第19～21号外显子，包括第19号外显子的缺失突变，第20号外显子的片段插入和第21号外显子的点突变，约占EGFR基因突变的90％。NSCLC患者其EGFR突变80％以上发生的突变为外显子l9的缺失突变(Ex19Del)及外显子21的L858R突变。其中外显子19缺失突变占约46％，而L858R突变占约42％。第19号外显子的缺失导致EGFR蛋白中氨基酸序列丢失，从而改变了细胞对TKIs的敏感性；引起耐药的主要原因是第20号外显子第790位密码子(核苷酸位置2669碱基替换)出现T-M转换突变；第21号外显子的点突变主要是第858位密码子出现T-G转换，使该位点的亮氨酸转变为精氨酸，简称为L858R。研究表明，EGFR酪氨酸激酶抑制剂药物(EGFR-TKI)(例如吉非替尼、厄罗替尼、埃克替尼)的治疗与EGFR基因突变有密切相关性；其中，19#外显子的缺失突变和21#外显子上的L858R点突变个体表现出对此类药物较强的敏感性，20#外显子上的T790M点突变表现出对此类药物的耐药性。EGFR酪氨酸激酶抑制剂药物(EGFR-TKI)是通过抑制EGFR胞内磷酸化而阻滞信号转导，抑制肿瘤细胞增值，实现靶向治疗。另外，EGFR基因L858R和19del突变引起EGFR胞内酪氨酸激酶功能区结构变化，提高了其与靶向药物的结合能力。因此，通过检测EGFR基因L858R和19del突变，以及T790M突变，可使疾病的诊断和用药更加精准有效。
目前，常用的基因突变检测方法有两种：测序法和PCR法。测序法中包含直接测序法和二代测序(NGS)。直接测序法是金标准，可以检测已知突变和未知突变，缺点是灵敏度低，需要丰度达到20％，耗时长，假阴性高。NGS二代测序能同时检测多种基因突变，灵敏度达到5％但是成本较高，耗时也长。患者一般需等待一周才能拿到检测报告。
PCR法中包括高分辨率溶解曲线法(high-resolution melting，HRM)、扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system，ARMS)和数字PCR法等。
高分辨率熔解曲线是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，可以检测出单个碱基的差异，但检测敏感度约5％，只能检测已知突变，不适合做多重PCR。
扩增阻滞突变系统是一种基于PCR法检测DNA点突变的新方法，其原理是：在严格反应条件下，只有引物3’端与模板配对时，PCR扩增反应才能正常进行，从而得到扩增产物。当3’端与模板不匹配时，Taq DNA聚合酶缺少3’-5’的外切酶活性，因此无法切下不匹配的碱基，导致3’末端无法正常延伸，反应终止，得不到扩增产物。通过设计3’端与突变模板互补但是与野生型模板不互补的引物进行PCR反应，根据有无特异长度的产物来判断样品模板中是否存在突变。该方法的灵敏度能达到1％，目前广泛应用于肿瘤组织中的突变检测。
数字PCR法是一种核酸分子绝对定量技术，可直接测出模板的拷贝数。利用数字PCR结合Taqman或MGB探针可将检测灵敏度得到提升。
目前用数字PCR检测EGFR Ex19Del缺失突变常见的方法有2种：
1、Ex19Del缺失突变位置相对固定，在缺失位置设计检测探针或Block阻断探针，在缺失位置外侧设计通用探针，然后再设计外围通用引物，通过缺失位置检测探针或Block阻断探针的结合与否区分野生型和突变型。这种方法只能间接判断缺失区域是否存在与野生型不一致序列，当缺失区域存在SNP或者其他类型的碱基变化时，这种方法会出现“假阳”；
2、针对每个缺失突变型都设计专用的缺失突变检测探针，这种方法可以直接的特异性检测每个缺失突变型，但由于检测体系中探针总浓度过高而导致荧光本底值过高，从而导致“阳性信号堆”与“阴性信号堆”界限模糊，影响阈值线确定，影响检测。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种检测人EGFR基因多突变位点的数字PCR试剂盒，用于人类EGFR基因19del、T790M和L858R多重突变的数字PCR检测，本发明提供的引物和探针组合，包括19del的上游引物、下游引物、通用探针、针对每个缺失突变型专用的缺失突变检测探针以及新型猝灭探针；T790M上游引物、下游引物、通用探针和突变探针；L858R上游引物、下游引物、通用探针和突变探针；内参基因的上游引物、下游引物、检测探针；通过数字PCR平台的方法将多重突变检测集中在一张芯片上进行，能精确方便地实现对19del、T790M和L858R各缺失型进行四-五通道的高灵敏度检测，灵敏度可达0.1％，能够降低成本，减少样本的消耗，提高检测准确度和灵敏度，降低假阳性，尤其对于样本比较稀缺的ctDNA，也方便肿瘤组织等其他样本类型的检测，为非小细胞肺癌的患者提供一定的用药指导。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测人EGFR基因多突变位点的数字PCR试剂盒，所述试剂盒包括：10×dPCRBuffer、dPCR酶、EGFR基因检测体系、阳性对照品、阴性对照品、数字PCR芯片、数字PCR用油相A和数字PCR用油相B；
所述EGFR基因检测体系包括检测Ex19Del的每个缺失突变型的检测引物、缺失突变检测探针和新型荧光猝灭探针、检测L858R位点和T790M位点的检测引物和Taqman荧光猝灭探针。
在上述技术方案的基础上，本发明还作出了进一步限定：
进一步，所述EGFR基因检测体系包括200-800nM检测引物、50-400nM检测探针、50-400nM新型荧光猝灭探针。
进一步，L858R突变检测的引物如下序列所示：
上游引物SEQ ID NO:1：AGCATGTCAAGATCACAGATTT；
上游引物SEQ ID NO:2：cgcagcatgtcaagatcacagat；
上游引物SEQ ID NO:3：gaaaacaccgcagcatgtcaag；
下游引物SEQ ID NO:4：CCTCCTTCTGCATGGTATTC；
下游引物SEQ ID NO:5：TTTGCCTCCTTCTGCATGGT；
下游引物SEQ ID NO:6：ACTTTGCCTCCTTCTGCATG；
探针如下序列所示：
突变探针SEQ ID NO:7：5’荧光标记-TGGCCCGCCCAAA-3’猝灭基团；
突变探针SEQ ID NO:8：5’荧光标记-TGGCCCGCCCAA-3’猝灭基团；
突变探针SEQ ID NO:9：5’荧光标记-TGGGCGGGCCAAA-3’猝灭基团；
突变探针SEQ ID NO:10：5’荧光标记-TGGGCGGGCCA-3’猝灭基团；
通用探针SEQ ID NO:11：5’荧光标记-TGGGTGCGGAAGAGAAAG-3’猝灭基团；
通用探针SEQ ID NO:12：5’荧光标记-TGCTGGGTGCGGAAGAG-3’猝灭基团；
通用探针SEQ ID NO:13：5’荧光标记-GTGCGGAAGAGAAAGAATACC-3’猝灭基团。
进一步，Ex19del突变的具体基因型为E746-A750del(1)，和/或E746-A750del(2)，和/或l747-p753>S，和/或E746_T751>I，和/或E746_S752>V，和/或L747_T751>Q，和/或L747_E749del，和/或L747_S752del，和/或L747_A750>P，和/或L747_P753>Q，和/或L747_T751del，和/或L747_T751>P。
进一步，检测Ex19del突变的引物序列如下所示：
上游引物SEQ ID NO:14：AGTTAAAATTCCCGTCGCT；
上游引物SEQ ID NO:15：TTAAAATTCCCGTCGCTAT；
上游引物SEQ ID NO:16：ATCCCAGAAGGTGAGAAAGTT；
下游引物SEQ ID NO:17：GCCTGAGGTTCAGAGCCAT；
下游引物SEQ ID NO:18：CAAAGCAGAAACTCACATCG；
下游引物SEQ ID NO:19：GAGAAAAGGTGGGCCTGAG；
检测探针序列如下所示：
突变探针del1 SEQ ID NO:20：5’荧光标记-TCGGAGATGTTTTGATAGCGACG-3’猝灭基团；
突变探针del1 SEQ ID NO:21：5’荧光标记-ttcggagatgttttgatagcgac-3’猝灭基团；
突变探针del1 SEQ ID NO:22：5’荧光标记-ctttcggagatgttttgatagcg-3’猝灭基团；
突变探针del2 SEQ ID NO:23：5’荧光标记-CGGAGATGTCTTGATAGCGACG-3’猝灭基团；
突变探针del2 SEQ ID NO:24：5’荧光标记-ttcggagatgtcttgatagcgac-3’猝灭基团；
突变探针del2SEQ ID NO:25：5’荧光标记-gctttcggagatgtcttgatagcg-3’猝灭基团；
突变探针del3 SEQ ID NO:26：5’荧光标记-TGGCTTTCGGAACCTTGATAGC-3’猝灭基团；
突变探针del3SEQ ID NO:27：5’荧光标记-gctttcggaAccttgatagcgac-3’猝灭基团；
突变探针del3 SEQ ID NO:28：5’荧光标记-ctttcggaAccttgatagcgacgg-3’猝灭基团；
突变探针del4 SEQ ID NO:29：5’荧光标记-TGGCTTTCGATTCCTTGATAGCG-3’猝灭基团；
突变探针del4 SEQ ID NO:30：5’荧光标记-TTGGCTTTCGATTCCTTGATAGC-3’猝灭基团；
突变探针del4 SEQ ID NO:31：5’荧光标记-ggctttcgattccttgatagcgac-3’猝灭基团；
突变探针del5 SEQ ID NO:32：5’荧光标记-TGGCTTTCGGAGATTCCTTGATAG-3’猝灭基团；
突变探针del5 SEQ ID NO:33：5’荧光标记-ctttcggagattccttgatagcga-3’猝灭基团；
突变探针del5 SEQ ID NO:34：5’荧光标记-CGGAGATTCCTTGATAGCGACG-3’猝灭基团；
通用探针SEQ ID NO:35：5’荧光标记-AGCCAACAAGGAA-3’猝灭基团；
通用探针SEQ ID NO:36：5’荧光标记-CGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCG-3’猝灭基团；
通用探针SEQ ID NO:37：5’荧光标记-AGCCAACAAGGAAATCCTCG-3’猝灭基团；
新型荧光猝灭探针SEQ ID NO:38：GCTATCAA；
新型荧光猝灭探针SEQ ID NO:39：ACATCTCCG；
新型荧光猝灭探针SEQ ID NO:40：CGAAAGCCA。
进一步，T790M突变检测的引物序列如下所示：
上游引物SEQ ID NO:41：TCTGCCTCACCTCCAC；
上游引物SEQ ID NO:42：ATCTGCCTCACCTCCAC；
上游引物SEQ ID NO:43：ATCTGCCTCACCTCCA；
下游引物SEQ ID NO:44：TTGTGTTCCCGGACATAG；
下游引物SEQ ID NO:45：TTTGTGTTCCCGGACATAG；
下游引物SEQ ID NO:46：TTTGTGTTCCCGGACATA；
检测探针序列如下所示：
突变探针SEQ ID NO:47：5’荧光标记-CAGCTGCATGATGA-3’猝灭基团；
突变探针SEQ ID NO:48：5’荧光标记-AGCTGCATGATGAT-3’猝灭基团；
突变探针SEQ ID NO:49：5’荧光标记-AGCTGCATGATG-3’猝灭基团；
突变探针SEQ ID NO:50：5’荧光标记-AGCTGCATGATGA-3’猝灭基团；
通用探针SEQ ID NO:51：5’荧光标记-AAGCTGCGTGATGA-3’猝灭基团；
通用探针SEQ ID NO:52：5’荧光标记-GCTGCGTGATGA-3’猝灭基团；
通用探针SEQ ID NO:53：5’荧光标记-AGCTGCGTGATGA-3’猝灭基团。
进一步，在序列的5’端，和/或3’端标记BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、磷酸化的任一种或两种；
荧光标记为FAM、HEX、VIC、ROX、CY5、CY5.5中的任一种；3’端为BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、磷酸化中的任一种。
进一步，所述试剂盒包括Ex19Del突变探针相同的荧光探针，L858R和T790M的野生探针和/或通用探针使用另外的不同的4种荧光通道。
进一步，所述PCR Buffer包括10-100mM Tris-HCl、1-5mM MgCl2、0-100mM KCl、0-50mM硫酸铵、0.2-0.4mM dNTP、0.01％-0.5％吐温-20、0.01％-0.5％聚乙二醇、0.01％-0.5％Triton X-100、0.01％-0.5％CA-630；
所述dPCR酶包括1-5U Taq DNA聚合酶、0.01-1U UNG酶、20-80％甘油。
进一步，所述数字PCR用油相A包括含氢量0.1％-0.8％的含氢硅油、0.01％-0.5％Triton X-100；
所述数字PCR用油相B包括端乙烯基硅油、0.1％的铂催化剂、0.15％的EM90。
本发明实现了如下技术效果：
1、通量高：本试剂盒实现了Ex19Del突变、T790M突变和L858R位点合为一芯片检测，提高了检测通量，降低了试剂耗材成本，提高了临床样本的利用率；
2、灵敏度高：本试剂盒在复杂的检测背景下，检测灵敏仍可达0.1％，相比于ARMS方法的1％灵敏度更有优势；
3、特异性强：本试剂盒针对EGFR基因的多种Ex19Del突变型设计了特定的检测突变型探针，所述引物和探针组合在PCR扩增反应时特异性强，20ng野生型基因组背景下无非特异信号；
4、阴阳性信号堆集中，信噪比高，节约荧光通道：本试剂盒采用新型猝灭探针方法，只需占用一个荧光通道，即可直接的特异性检测Ex19Del的5-12种缺失突变，克服了由于探针总浓度过高导致的荧光本底值高，“阳性信号堆”与“阴性信号堆”界限清晰，阈值线确定准确，检测结果可靠。
附图说明
图1为本发明实施例2数字PCR检测结果图；
图2为本发明实施例2数字PCR检测结果图；
图3为本发明实施例2数字PCR检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
检测人EGFR基因多突变位点的数字PCR试剂盒，包括：10×dPCR Buffer(10-100mMTris-HCl、1-5mM MgCl2、0-100mM KCl、0-50mM硫酸铵、0.2-0.4mM dNTP、0.01％-0.5％吐温-20、0.01％-0.5％聚乙二醇、0.01％-0.5％Triton X-100、0.01％-0.5％CA-630)、dPCR酶(1-5U Taq DNA聚合酶、0.01-1U UNG酶、20-80％甘油)、EGFR基因检测体系(200-800nM检测引物、50-400nM检测探针、50-400nM新型荧光猝灭探针，序列如下表1-3)、阳性对照品、阴性对照品、数字PCR芯片、数字PCR用油相A(含氢量0.1％-0.8％的含氢硅油、0.01％-0.5％Triton X-100)和数字PCR用油相B(端乙烯基硅油、0.1％的铂催化剂、0.15％的EM90)；
表1 L858R突变检测序列
表2 Ex19del突变检测序列
表3 T790M突变检测序列
可选的，在序列的5’端，和/或3’端标记BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、磷酸化的任一种或两种；
荧光标记为FAM、HEX、VIC、ROX、CY5、CY5.5中的任一种；3’端为BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、磷酸化中的任一种；
核酸序列可与待猝灭探针的5’端或3’端互补；
互补核酸序列Tm值可选择≤50℃、或≤60℃；
试剂盒包括Ex19Del突变探针相同的荧光探针，L858R和T790M的野生探针和/或通用探针使用另外的不同的4种荧光通道。
实施例2
实施例1中试剂盒引物探针效果检测
1、制备本申请试剂盒的引物探针
选用上表1-3中的序列及数字PCR试剂盒中的其他组分作为检测体系，以不含表2中新型荧光猝灭探针的混合体系作为对照。
2、扩增试剂准备
按如下表4准备扩增试剂。
表4试剂组分及含量
| 试剂组分 | 加入体积(μL) |
| 10×dPCR Buffer | 3 |
| dPCR酶 | 1 |
| 人EGFR基因检测体系 | 11 |
| DNA样本 | 15 |
3、进样
按PCR操作说明，将步骤2中配制的反应液完成数字PCR芯片进样。
4、PCR反应
扩增程序如下表5
表5扩增程序
5、数据读取
从专用PCR仪中取出芯片，将芯片放入数字PCR芯片阅读仪中进行阅读分析。
6、结果
结果如图1-3所示，由图可知，图1的对比检测试剂中的阴性和阳性分界线不明显；而本申请试剂盒的检测结果的阳性信号和阴性信号分界线明显，信噪比高。
说明，本申请试剂盒中加入新型猝灭探针后检测效果更好。
实施例3
实施例1中试剂盒最低检出限检测
1、制备最低检测限质控品
检测限参考品涵盖每种突变类型，包括七份企业参考品(由突变类型的质粒与人EGFR野生型细胞系DNA混合制备)，均用数字PCR定量突变比例。
DNA模板量为20ng，突变比例为0.1％的样本作为本实施例的检出限质控品。最低检测限质控品具体如表6所示：
表6最低检测限质控品
2、步骤同实施例2。
3、试剂盒的突变率计算和质控
本申请试剂盒可定量检测Ex19Del突变型、Ex19Del野生型、T790M突变型、T790M野生型、L858R突变型和L858R野生型，L858R的突变率可用L858R突变型/(L858R突变型+L858R野生型)计算；T790M的突变率可用T790M突变型/(T790M突变型+T790M野生型)计算；Ex19DEL的突变率可用19del突变型/(19del突变型+19del野生型)计算；
L858R定量结果(L858R突变型+L858R野生型)，或T790M定量结果(T790M突变型+T790M野生型)，或19del突变型/(19del突变型+19del野生型)，或内参基因用于质控模板DNA的浓度和质量，这样使得本发明体系更加完善。
4、重复性检测20次，检测得到的实验结果如表7所示：
表7重复性检测结果
| 名称 | 定性结果 |
| EGFRL858R | 阳性 |
| EGFRE746-A750del(1) | 阳性 |
| EGFRT790M | 阳性 |
| E746-A750del(2) | 阳性 |
| l747-p753>S | 阳性 |
| E746-S752>V | 阳性 |
| E747-T751del | 阳性 |
由表7可知，DNA模板量为20ng，本申请试剂盒能检出0.1％的EGFR突变。
实施例4
实施例1中试剂盒重复性检测
1、制备重复性质控品
2、选用EGFR基因L858R、T790M及19del突变的DNA质粒和EGFR阴性的细胞系基因组DNA按比例混合，配制突变体的突变比例为1％的标本，作为本实施例的重复性质控品，具体如表8所示：
表8重复性质控品
3、步骤同实施例2。
4、重复性检测10次，检测得到的实验结果如表9-15所示：
表9
由表9的实验结果可知，重复检查10次，检测结果阳性符合率100％；
表10
由表10的实验结果可知，重复检查10次，检测结果阳性符合率100％；
表11
由表11的实验结果可知，重复检查10次，检测结果阳性符合率100％；
表12
由表12的实验结果可知，重复检查10次，检测结果阳性符合率100％；
表13
由表13的实验结果可知，重复检查10次，检测结果阳性符合率100％；
表14
由表14的实验结果可知，重复检查10次，检测结果阳性符合率100％；
表15
由表15的实验结果可知，重复检查10次，检测结果阳性符合率100％。
Claims (10)
1.一种检测人EGFR基因多突变位点的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：10×dPCR Buffer、dPCR酶、EGFR基因检测体系、阳性对照品、阴性对照品、数字PCR芯片、数字PCR用油相A和数字PCR用油相B；
所述EGFR基因检测体系包括检测Ex19Del的每个缺失突变型的检测引物、缺失突变检测探针和新型荧光猝灭探针、检测L858R位点和T790M位点的检测引物和Taqman荧光猝灭探针。
2.根据权利要求1所述的检测人EGFR基因多突变位点的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述EGFR基因检测体系包括200-800nM检测引物、50-400nM检测探针、50-400nM新型荧光猝灭探针。
3.根据权利要求1所述的检测人EGFR基因多突变位点的数字PCR试剂盒，其特征在于，L858R突变检测的引物如下序列所示：
上游引物SEQ ID NO:1：AGCATGTCAAGATCACAGATTT；
上游引物SEQ ID NO:2：cgcagcatgtcaagatcacagat；
上游引物SEQ ID NO:3：gaaaacaccgcagcatgtcaag；
下游引物SEQ ID NO:4：CCTCCTTCTGCATGGTATTC；
下游引物SEQ ID NO:5：TTTGCCTCCTTCTGCATGGT；
下游引物SEQ ID NO:6：ACTTTGCCTCCTTCTGCATG；
探针如下序列所示：
突变探针SEQ ID NO:7：5’荧光标记-TGGCCCGCCCAAA-3’猝灭基团；
突变探针SEQ ID NO:8：5’荧光标记-TGGCCCGCCCAA-3’猝灭基团；
突变探针SEQ ID NO:9：5’荧光标记-TGGGCGGGCCAAA-3’猝灭基团；
突变探针SEQ ID NO:10：5’荧光标记-TGGGCGGGCCA-3’猝灭基团；
通用探针SEQ ID NO:11：5’荧光标记-TGGGTGCGGAAGAGAAAG-3’猝灭基团；
通用探针SEQ ID NO:12：5’荧光标记-TGCTGGGTGCGGAAGAG-3’猝灭基团；
通用探针SEQ ID NO:13：5’荧光标记-GTGCGGAAGAGAAAGAATACC-3’猝灭基团。
4.根据权利要求1所述的检测人EGFR基因多突变位点的数字PCR试剂盒，其特征在于，Ex19del突变的具体基因型为E746-A750del(1)，和/或E746-A750del(2)，和/或l 747-p753>S，和/或E746_T751>I，和/或E746_S752>V，和/或L747_T751>Q，和/或L747_E749del，和/或L747_S752del，和/或L747_A750>P，和/或L747_P753>Q，和/或L747_T751 del，和/或L747_T751>P。
5.根据权利要求4所述的检测人EGFR基因多突变位点的数字PCR试剂盒，其特征在于，检测Ex19del突变的引物序列如下所示：
上游引物SEQ ID NO:14：AGTTAAAATTCCCGTCGCT；
上游引物SEQ ID NO:15：TTAAAATTCCCGTCGCTAT；
上游引物SEQ ID NO:16：ATCCCAGAAGGTGAGAAAGTT；
下游引物SEQ ID NO:17：GCCTGAGGTTCAGAGCCAT；
下游引物SEQ ID NO:18：CAAAGCAGAAACTCACATCG；
下游引物SEQ ID NO:19：GAGAAAAGGTGGGCCTGAG；
检测探针序列如下所示：
突变探针del 1SEQ ID NO:20：5’荧光标记-TCGGAGATGTTTTGATAGCGACG-3’猝灭基团；
突变探针del 1SEQ ID NO:21：5’荧光标记-ttcggagatgttttgatagcgac-3’猝灭基团；
突变探针del 1SEQ ID NO:22：5’荧光标记-ctttcggagatgttttgatagcg-3’猝灭基团；
突变探针del 2SEQ ID NO:23：5’荧光标记-CGGAGATGTCTTGATAGCGACG-3’猝灭基团；
突变探针del 2SEQ ID NO:24：5’荧光标记-ttcggagatgtcttgatagcgac-3’猝灭基团；
突变探针del 2SEQ ID NO:25：5’荧光标记-gctttcggagatgtcttgatagcg-3’猝灭基团；
突变探针del 3SEQ ID NO:26：5’荧光标记-TGGCTTTCGGAACCTTGATAGC-3’猝灭基团；
突变探针del 3SEQ ID NO:27：5’荧光标记-gctttcggaAccttgatagcgac-3’猝灭基团；
突变探针del 3SEQ ID NO:28：5’荧光标记-ctttcggaAccttgatagcgacgg-3’猝灭基团；
突变探针del4 SEQ ID NO:29：5’荧光标记-TGGCTTTCGATTCCTTGATAGCG-3’猝灭基团；
突变探针del4 SEQ ID NO:30：5’荧光标记-TTGGCTTTCGATTCCTTGATAGC-3’猝灭基团；
突变探针del4 SEQ ID NO:31：5’荧光标记-ggctttcgattccttgatagcgac-3’猝灭基团；
突变探针del5 SEQ ID NO:32：5’荧光标记-TGGCTTTCGGAGATTCCTTGATAG-3’猝灭基团；
突变探针del5 SEQ ID NO:33：5’荧光标记-ctttcggagattccttgatagcga-3’猝灭基团；
突变探针del5 SEQ ID NO:34：5’荧光标记-CGGAGATTCCTTGATAGCGACG-3’猝灭基团；
通用探针SEQ ID NO:35：5’荧光标记-AGCCAACAAGGAA-3’猝灭基团；
通用探针SEQ ID NO:36：5’荧光标记-CGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCG-3’猝灭基团；
通用探针SEQ ID NO:37：5’荧光标记-AGCCAACAAGGAAATCCTCG-3’猝灭基团；
新型荧光猝灭探针SEQ ID NO:38：GCTATCAA；
新型荧光猝灭探针SEQ ID NO:39：ACATCTCCG；
新型荧光猝灭探针SEQ ID NO:40：CGAAAGCCA。
6.根据权利要求1所述的检测人EGFR基因多突变位点的数字PCR试剂盒，其特征在于，T790M突变检测的引物序列如下所示：
上游引物SEQ ID NO:41：TCTGCCTCACCTCCAC；
上游引物SEQ ID NO:42：ATCTGCCTCACCTCCAC；
上游引物SEQ ID NO:43：ATCTGCCTCACCTCCA；
下游引物SEQ ID NO:44：TTGTGTTCCCGGACATAG；
下游引物SEQ ID NO:45：TTTGTGTTCCCGGACATAG；
下游引物SEQ ID NO:46：TTTGTGTTCCCGGACATA；
检测探针序列如下所示：
突变探针SEQ ID NO:47：5’荧光标记-CAGCTGCATGATGA-3’猝灭基团；
突变探针SEQ ID NO:48：5’荧光标记-AGCTGCATGATGAT-3’猝灭基团；
突变探针SEQ ID NO:49：5’荧光标记-AGCTGCATGATG-3’猝灭基团；
突变探针SEQ ID NO:50：5’荧光标记-AGCTGCATGATGA-3’猝灭基团；
通用探针SEQ ID NO:51：5’荧光标记-AAGCTGCGTGATGA-3’猝灭基团；
通用探针SEQ ID NO:52：5’荧光标记-GCTGCGTGATGA-3’猝灭基团；
通用探针SEQ ID NO:53：5’荧光标记-AGCTGCGTGATGA-3’猝灭基团。
7.根据权利要求3、5、6任一项所述的检测人EGFR基因多突变位点的数字PCR试剂盒，其特征在于，在序列的5’端，和/或3’端标记BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、磷酸化的任一种或两种；
荧光标记为FAM、HEX、VIC、ROX、CY5、CY5.5中的任一种；3’端为BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、磷酸化中的任一种。
8.根据权利要求1所述的检测人EGFR基因多突变位点的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括Ex19Del突变探针相同的荧光探针，L858R和T790M的野生探针和/或通用探针使用另外的不同的4种荧光通道。
9.根据权利要求1所述的检测人EGFR基因多突变位点的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述PCR Buffer包括10-100mM Tris-HCl、1-5mM MgCl 2、0-100mM KCl、0-50mM硫酸铵、0.2-0.4mM dNTP、0.01％-0.5％吐温-20、0.01％-0.5％聚乙二醇、0.01％-0.5％Triton X-100、0.01％-0.5％CA-630；
所述dPCR酶包括1-5U Taq DNA聚合酶、0.01-1U UNG酶、20-80％甘油。
10.根据权利要求1所述的检测人EGFR基因多突变位点的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述数字PCR用油相A包括含氢量0.1％-0.8％的含氢硅油、0.01％-0.5％Triton X-100；
所述数字PCR用油相B包括端乙烯基硅油、0.1％的铂催化剂、0.15％的EM90。
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