CN110511984A - Egfr基因19号外显子缺失突变的快速荧光检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种EGFR基因19号外显子缺失突变的快速荧光检测方法及应用。本发明方法利用Lambda核酸外切酶既可以快速水解DNA双链中5’末端为两个碱基的突出结构且标记有荧光基团的单链，又可以连续水解双链DNA中具有5’磷酸化末端DNA单链的性质，将突变碱基识别、PCR产物单链化和荧光信号放大过程合并完成，极大地简化了整个检测流程，减少了检测时间，相对检出限低至0.01％，灵敏度高，在临床诊断、靶向用药指导和术后伴随检测等方面具有很好的应用前景。

Description

EGFR基因19号外显子缺失突变的快速荧光检测方法及应用

技术领域

本发明涉及一种检测EGFR基因19号外显子缺失突变(EGFR 19del)的快速、高灵敏度检测方法，属于基因突变检测领域，可以用于肺癌等的早期诊断、靶向药物用药指导和术后的伴随检测等领域。

背景技术

肺癌是当今世界上发病率最高的癌症之一，其中非小细胞肺癌(NSCLC)占75-80％^[1]，是重要的肺癌类型。亚洲非小细胞肺癌患者中人表皮生长因子受体(EGFR)突变发生率高达35％^[2]，是肺癌的重要标志物。EGFR是人表皮生长因子(EGF)促进细胞增殖过程中所结合的糖蛋白受体，EGF与EGFR结合后会使其发生二聚，EGFR胞内酪氨酸激酶结构域中的数个酪氨酸残基发生磷酸化，引发下游通路^[3]，进而促进细胞增殖。若EGFR发生突变，会导致其过度激活，引发细胞恶性增殖，对此，一系列酪氨酸激酶抑制剂(TKI)型小分子药物得以研发和应用。

研究表明，NSCLC患者对TKI的响应与其是否具有EGFR突变高度相关^[4]。在各种EGFR突变中，19号外显子缺失突变(EGFR 19del)最为常见，约占48％^[5]。EGFR 19del的主要类型为2235_2249delGGAATTAAGAGAAGC，可导致EGFR酪氨酸激酶结构域中E746-A750五个氨基酸残基的缺失，进而影响EGFR的结构。发展高灵敏度、可靠的EGFR 19del的检测方法对于肺癌的早期诊断、TKI靶向用药等具有重要的指导意义。

传统的突变检测方法主要针对组织活检。由于肿瘤具有异质性，组织活检难以反映全面的信息，且组织活检具有侵入性、滞后性，操作复杂，通常只能进行一次操作。为克服这些不足，近年来液体活检技术发展迅速。液体活检可以针对体液中的循环肿瘤细胞(CTC)、循环肿瘤DNA(ctDNA)等进行检测，可以更全面地反映肿瘤的突变信息，且操作安全、无侵入性。不仅可用于肿瘤的早期检测，还可进行多次跟踪检测。但是由于体液中存在着大量的正常细胞和野生型DNA，使得体液中突变DNA的丰度往往远低于组织样品中的突变丰度，这就要求突变检测方法具有很高的灵敏度。

目前用于检测EGFR 19del的方法主要有二代测序法(NGS)、数字液滴PCR法(ddPCR)和扩增阻碍突变系统法(ARMS)等。NGS灵敏度大幅提高，但其仪器成本高，检测周期长，难以实现实验室中的低成本便捷检测。ARMS成本较低，但其可靠的相对检出限仍仅为约0.1％；数字PCR检测结果准确，但其样品消耗量大、成本高，且可靠的相对检出限也只能达到约0.1％。

λ核酸外切酶具有5’至3’DNA外切酶活性，可快速水解双链DNA(dsDNA)中具有5’磷酸化末端的DNA单链，但对于单链DNA(ssDNA)本身或5’-OH末端的双链DNA水解速率很慢。λ核酸外切酶在连续催化过程中与底物不分离，具有持续性，直至将5’磷酸化末端的底物单链水解完全。在我们对λ核酸外切酶的性质进行系统研究的过程中发现，该酶的活性中心处不仅分布有带正电的氨基酸残基可以吸引磷酸基团，同时还分布有较多疏水性氨基酸残基。当DNA双链中一条链的5’末端为两个碱基的突出结构，并且在5’末端标记有含疏水结构的非磷酸基团时，该链也可以被λ核酸外切酶水解^[6]。利用此性质，我们在DNA一条单链的5’末端标记上FAM荧光基团，通过设计其末端碱基的种类，实现了对另一条链末端碱基是否存在错配的识别^[7]。

参考文献：

[1]Sanger,F.,Nicklen,S.&Coulson,A.R.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1977,74,5463–5467.

[2]Margulies,M.et al.Nature,2005,437,376–380.

[3]Hunter T.Cell,2000,100(1):113-127

[4]Paez J G,P A,Lee J C.Science,2004,304(5676):1497.

[5]Mitsudomi T.,Yatabe Y.Febs Journal,2010,277(2):301-308.

[6]Wu,T.,Yang,Y.,Chen,W.,Wang,J.,Yang,Z.,Wang,S.,Xiao,X.,Li M.,Zhao,M.Nucleic Acids Research,2018,46(6),3119–3129.

[7]Wu,T.,Chen,W.,Yang,Z.,Wang,J.,Xiao,X.,Li M.,Zhao,M.Nucleic AcidsResearch,2018,46(4),e24.

发明内容

本发明的目的在于进一步开发和利用Lambda核酸外切酶的新性质，发展一种高灵敏度的检测EGFR基因19号外显子缺失突变的新方法。

本发明提出的检测EGFR基因19号外显子缺失突变(EGFR 19del)的方法原理如下：

本发明的探针设计如图1所示。Lambda核酸外切酶要实现连续的切割需要同时具备两个条件：一是待水解单链的5’末端打开两个碱基，伸到酶的活性口袋区域；二是不被水解的互补链能顺利通过酶中心的纳米孔，使酶可以稳定结合在双链上，持续向下游移动。EGFR 19号外显子缺失主要为2235位至2249位GGAATTAAGAGAAGC这15个核苷酸的缺失，野生链含有上述序列，突变链不含上述序列。针对这种结构差异特点，本发明利用Lambda核酸外切酶的上述两个必备条件特征，设计DNA单链荧光探针总长为12-15nt，5’末端标记FAM荧光基团，3’末端标记BHQ1猝灭基团，紧邻5’末端的两个碱基依次与突变链中所缺失序列区域3’方向下游的第5个和第4个碱基相对应，且将探针距5’末端的第1位和第2位碱基分别设计为T碱基和G碱基，使之与待测链上对应的T碱基和A碱基分别形成T:T错配和G:A错配，探针的其余碱基均与突变链序列上的对应碱基完全匹配。这一设计使得野生链在距探针5’末端第5位-第6位之间的区域内多出15个核苷酸，从而形成一种内环结构，悬挂在主干DNA双链之外。这种二级结构可极大地阻碍Lambda核酸外切酶与该双链DNA的结合和对探针的水解反应。而对于突变链，由于与探针形成了5’末端两个碱基突出、其它碱基完全匹配的适宜双链DNA底物，使得探针可以被Lambda核酸外切酶快速切割并释放出荧光信号。

进一步地，利用Lambda核酸外切酶可以快速水解双链DNA(dsDNA)中具有5’磷酸化末端DNA单链的性质，本发明巧妙地将单链化过程和检测过程合并完成，极大地简化了整个检测流程，减少了检测所需的时间。具体做法是，在对样品中的待测DNA进行PCR扩增时，将正向引物设计为5’羟基末端，反向引物设计为5’磷酸末端。这样当PCR反应完成后，可直接加入λ核酸外切酶和荧光探针，λ核酸外切酶首先切除由反向引物延伸得到的DNA单链，释放出的正向引物延伸产物链紧接着在酶和探针的双重识别作用下被检测，获得突变链丰度的信息。

基于上述研究，本发明首先提供了一种用于检测EGFR基因19号外显子缺失突变(EGFR19del)的探针，该探针为DNA单链，长度为12-15nt；EGFR基因19号外显子的缺失区域对应于该探针距5’末端的第5位和第6位碱基之间，或者第4位和第5位之间；且该探针5’末端的第1位和第2位碱基是错配的，使得探针与待检测的突变链形成5’末端两个碱基突出、其它碱基完全匹配的双链DNA；在探针的两端分别标记有荧光基团和猝灭基团。

在本发明的实施例中，所述探针的序列如序列表中SEQ ID No：1或2或3所示，其中，荧光基团标记在5’末端的脱氧核糖核苷酸残基上，猝灭基团标记在3’末端的脱氧核糖核苷酸残基上。所述荧光基团和猝灭基团可以选自下表：

荧光基团	猝灭基团
		FAM	BHQ1、DABCYL、TAMRA
TET	BHQ1、DABCYL
		HEX	BHQ1、BHQ2、DABCYL
TAMRA	BHQ2
		ROX	BHQ2
Texas Red	BHQ2
		Cy5	BHQ2、BHQ3

本发明还提供了一种检测EGFR基因19号外显子缺失突变(EGFR 19del)的方法，包括以下步骤：

1)对待测DNA进行PCR扩增，其中正向引物设计为5’羟基末端，反向引物设计为5’磷酸末端；

2)添加λ核酸外切酶反应缓冲液、步骤1)扩增得到的目标DNA和本发明所述探针，混合均匀后加热至80～95℃，然后逐渐降温至37℃，加入λ核酸外切酶，在37℃测定实时荧光曲线，获得EGFR 19del突变丰度。

上述步骤1)中，优选的，利用所述正向引物和反向引物PCR扩增出来的目标片段长度在90～130bp，其中待测目标单链与探针结合后的3’末端突出序列的长度不超过40个碱基。

在本发明的实施例中，所用正向引物序列如序列表中SEQ ID No：4所示，反向引物序列如序列表中SEQ ID No：5所示；对应的EGFR 19del野生链序列如序列表中SEQ ID No：6所示；而突变链比野生链少了15个核苷酸残基，其序列如序列表中SEQ ID No：7所示。

步骤1)的PCR扩增反应体系优选Q5 DNA聚合酶，PCR过程：每个循环93℃8s，60℃20s，72℃20s，35个循环。

上述步骤2)的反应体系中，所加λ核酸外切酶的浓度优选为100～150U/mL，探针和目标DNA的终浓度相当；在进行荧光检测时，通常每5s采集一次荧光信号，对于荧光基团FAM来说，荧光激发和发射波长分别为470nm和510nm。荧光信号上升速率通过计算荧光曲线斜率得出。

优选的，在步骤2)根据标准品的荧光信号上升速率对不同突变丰度按照指数模型进行拟合，制作标准曲线，进而根据实际样品的荧光信号上升速率计算其突变丰度。

步骤2)中所述目标DNA可以是单链DNA，也可以是双链DNA。对于单链目标DNA，在本发明实施例的检测体系中浓度为100nM，探针的浓度为200nM；对于双链目标DNA，在本发明实施例的检测体系中浓度为200nM，探针的浓度为200nM。

同时，本发明还提供了一种检测EGFR基因19号外显子缺失突变(EGFR 19del)的试剂盒，包括：本发明所述的用于检测EGFR 19del的探针、λ核酸外切酶及其反应缓冲液。

进一步的，上述试剂盒还包括用于PCR扩增目标DNA的试剂，包括：DNA聚合酶及其反应缓冲液，正向引物和反向引物，dNTPs，以及不同突变链丰度的EGFR 19del标准ssDNA(用于制作标准曲线)。如果是进行实时荧光PCR，所述试剂中还包括荧光染料，例如LCGreen。所述DNA聚合酶优选为Q5 DNA聚合酶。

本发明具有明显优于现有技术的优点，主要包括：

(1)灵敏度高

目前广泛使用的二代测序法和数字液滴PCR法可以准确测出丰度低至0.1％的突变链，但对更低丰度的检测则需要大大增加测定次数和数据处理时间，或增大血液样品用量(约需10mL)，在临床检验中不易被接受。本发明的方法只需0.8mL即可以准确测出丰度低至0.01％的突变链，在临床检验领域具有广泛的应用前景。

(2)方法简便、速度快

二代测序法需要预先在实验室中进行样品制备，然后送至专门的实验室中进行测序和数据分析，测定周期长，过程繁琐。本方法仅需常规的实时荧光PCR仪，在实验室中即可进行，完成一个实际样品的测定仅需约3.5小时，具有简单易行的优势。

(3)成本低

二代测序法和数字液滴PCR法均依赖昂贵的仪器设备和复杂的检测流程，检测成本很高。本发明方法所需仪器设备简单，所用试剂成本低，有利于在临床上大规模推广应用。

综上，本发明提供的检测EGFR基因19号外显子缺失突变的方法相对检出限低至0.01％，灵敏度高，且其成本低、样品消耗量少、操作简便、周期短，在临床诊断、靶向用药指导和术后伴随检测等方面具有很好的应用前景。

附图说明

图1是EGFR-19del探针-3及其与突变链(A)和野生链(B)杂交双链的结构示意图。

图2是比较三种探针对EGFR-19del野生型单链和突变型单链的实时荧光响应曲线。

图3是EGFR-19del探针-3对单链突变链所占比例(丰度)的最低检测限测定结果。

图4A至图4C比较在不同条件下EGFR-19del探针-3对野生型单链/双链和突变型单链/双链的实时荧光响应曲线，其中图4A中目标单/双链DNA：终浓度100nM；lambda核酸外切酶：终浓度100U/mL；图4B中目标单/双链DNA：终浓度100nM；lambda核酸外切酶：终浓度200U/mL；图4C中目标单链DNA：终浓度100nM；目标双链DNA：终浓度200nM；lambda核酸外切酶：终浓度100U/mL。

图5是EGFR-19del探针-3测定EGFR-19del突变丰度的标准曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步阐述本发明。本领域的技术人员应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

以下实验中涉及的DNA序列如表1所示。

表1.本发明所涉及的DNA序列

^a FAM表示6-羧基荧光素修饰基团；^b BHQ1表示黑洞猝灭基团-1。

实施例1<关于EGFR 19del探针的结构设计及其灵敏度的研究>

要想实现低丰度突变链的高灵敏检测，最关键的问题是要提高探针对野生链和突变链的区分能力。在本发明的设计中，影响探针区分度的主要因素有：探针5’末端与突变区域的相对位置、5’末端的两个碱基打开的程度及探针的总长度等。探针序列的长度一般为12～15nt，过长或过短都会导致对突变链和野生链的区分度下降。对于EGFR 19del，由于突变区域附近序列的GC含量较低(约40％)，因此探针的长度设计为15nt。为尽可能降低探针对野生链的荧光响应，初步设计突变位置距离探针5’末端5-6个碱基。

参见图1，这一设计使得野生链在距探针5’末端第5位-6位之间的区域内多出15个核苷酸，从而形成一种内环结构，悬挂在主干DNA双链之外。这种二级结构可极大地阻碍Lambda核酸外切酶与该双链DNA的结合和对探针的水解反应。而对于突变链，由于与探针形成了5’末端两个碱基突出、其它碱基完全匹配的适宜双链DNA底物，使得探针可以被Lambda核酸外切酶快速切割并释放出荧光信号。

我们首先合成了EGFR-19del探针-1(序列见表1)，使突变区域对应于探针距5’末端的5-6位碱基之间。此探针与野生链的互补区域只有10bp，熔解温度约为38.2℃，在测定条件下二者的结合不够稳定，特别是野生链多出的15-nt外悬结构，严重阻碍了Lambda核酸外切酶与探针5’末端的结合作用，使得探针对野生链的荧光响应得到有效抑制；而对于突变链，探针与其互补区域为13bp，熔解温度为47.6℃。在测定条件下二者可以稳定结合，且结构为5’末端两个碱基打开、序列其它部分完全互补的双链结构，可以被Lambda核酸外切酶快速切割并释放出荧光信号。

在200μL的PCR管中加入5μL 10×Lambda Exonuclease Buffer、2μL 19del探针(终浓度200nM)、1μL目标单链DNA(终浓度为100nM)、水(使加酶后总体积为50μL)，混合均匀。将该溶液加热至85℃后逐渐降温至37℃。加入3μL Lambda核酸外切酶(终浓度100U/mL)，在37℃下使用Rotor-Gene Q 5plex HRM仪器测定实时荧光曲线。检测条件：gain＝10，荧光信号每5s采集一次，采集300次，荧光激发和发射波长分别为470nm和510nm。

EGFR-19del探针-1对目标单链的实时荧光响应曲线如图2所示，该探针对突变链和野生链的区分因子为33。对该探针的反应溶液条件进行了优化，发现当溶液中镁离子总浓度为10mM，硫酸铵浓度为0时，探针对突变链和野生链的区分因子(突变链荧光上升速率/野生链荧光上升速率)达到最大值，为167。为了进一步提高探针的区分因子，我们对探针序列进行了改进。新的EGFR-19del探针-2(序列见表1)使突变位点更接近5’末端(对应距5’末端第4-5位碱基之间)，并对碱基类型进行了优化。此探针对突变链的响应速率明显加快，但对野生链的响应速率也有上升(如图2所示)，对突变链和野生链的区分因子为55。在优化后的最佳反应液条件(含镁离子总浓度为2.5mM，硫酸铵浓度为20mM)下，区分因子达到185。在此基础上，我们对探针的结构进行了进一步优化，合成了EGFR-19del探针-3(序列见表1)，探针-3与探针-1的区别仅在5’末端紧邻的两个碱基种类不同，由图2可见，探针-3对突变链的响应速率很快，与探针-2非常接近，而探针-3对野生链的响应极慢，与探针-1的结果相近，这使得探针-3的区分因子高达872。我们也对照了在其它镁离子和硫酸铵浓度条件下探针-3区分因子的变化，结果表明在上述测定步骤所用的1×Lambda Exonuclease Buffer中的区分因子即是最高的，无需再额外调整镁离子的浓度或加入硫酸铵。探针-3对EGFR-19del突变链丰度的最低检测限达到0.01％(如图3所示)，为临床样品的检测提供了更加灵敏、可靠的方法。

实施例2<利用EGFR-19del探针-3直接测定EGFR 19del双链DNA突变链的突变丰度>

为了能将上述探针直接用于基因组样品中EGFR 19del的检测，获得定量可靠的结果，我们首先优化了EGFR 19del的PCR条件。对于常见的点突变，突变链和野生链的分子量差异通常只有几十g/mol。而对于EGFR 19del突变，涉及到15个核苷酸的缺失，导致突变链和野生链的分子量差异高达4674.1g/mol。为了减少这种差异可能带来的DNA定量误差，我们设计了较长的EGFR 19del扩增子序列，使突变链和野生链分子量的相对差异减小，从而可采用突变链和野生链的平均分子量计算出扩增序列的物质的量浓度。考虑到若待测目标单链的3’末端突出序列过长，对Lambda核酸外切酶与探针的结合不利，我们选择将目标链的5’末端向外延长至约60个碱基，而确保其与探针结合后的3’末端突出序列的长度不超过40个碱基。上述设计使突变链和野生链间的分子量相对差异减小至约10％，有利于扩增序列的准确定量。

最终确定的PCR步骤为：

在200μL的PCR管中加10μL 10×Q5 Reaction Buffer、5μL 19del正向引物(终浓度500nM)、5μL 19del反向引物(终浓度500nM)、1μL dNTPs(10mM each dNTP)、1μL 10×LCGreen、1μL 19del标准ssDNA(突变链和野生链总终浓度为10pM，改变突变链丰度)、Q5 DNA聚合酶(20U/mL)、水(补至50μL)。PCR过程(每个循环93℃8s，60℃20s，72℃20s，35个循环)在Rotor-Gene Q 5plex HRM仪器上进行。

进一步地，我们尝试将实施例1测定过程中所用的目标单链换成目标双链。在已报道的荧光探针检测方法中，通常都需要先将PCR产物双链DNA进行单链化处理，然后再用探针检测，不仅增加了处理样品和重新对目标链进行定量的步骤，而且容易损失目标链和引入其它污染物。在本实施例中，我们利用Lambda核酸外切酶自身可以快速水解dsDNA中具有5’磷酸化末端DNA单链的性质，设计了以下将单链化过程和检测过程合并完成的操作步骤：

在200μL的PCR管中加入5μL 10×Lambda Exonuclease Buffer、2μL 19del探针(终浓度200nM)、1μL目标双链DNA(终浓度为200nM)、水(使加酶后总体积为50μL)，混合均匀。将该溶液加热至85℃后逐渐降温至37℃。加入3μL lambda核酸外切酶(终浓度100U/mL)，在37℃下使用Rotor-Gene Q 5plex HRM仪器测定实时荧光曲线。检测条件：gain＝10，荧光信号每5s采集一次，采集300次，荧光激发和发射波长分别为470nm和510nm。荧光信号上升速率通过计算荧光曲线斜率得出。

其中，当目标双链DNA的加入量与之前的目标单链DNA相同(终浓度为100nM)、lambda核酸外切酶的加入量也保持不变(终浓度100U/mL)时，单/双野生链的荧光上升速率区别不大，但双链突变链的荧光上升速率变慢(图4A)，导致区分因子下降。我们尝试将lambda核酸外切酶的用量增加到原来的2倍，双链突变链的荧光上升速率明显加快，与单链突变链的荧光曲线几乎重合，但双链野生链的荧光上升速率也有所增加，导致区分因子反而下降(图4B)。之后，我们进一步尝试将目标双链DNA的用量增加到原来的2倍(终浓度为200nM)，lambda核酸外切酶的加入量仍保持终浓度100U/mL，测得单/双突变链的荧光曲线几乎重合，单/双野生链的荧光曲线也几乎一致，从而达到了区分因子的最大值(图4C)。

实施例3<利用EGFR-19del探针-3测定实际样品中循环游离DNA的EGFR 19del突变丰度>

将上述探针用于实际样品中循环游离DNA(cfDNA)EGFR 19del突变丰度的检测，操作步骤如下：

(1)利用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(QIAGEN,Hilden,Germany)提取样品中的cfDNA，并用NanoDrop 2000微量紫外光度计对提取出的DNA进行定量。

(2)在200μL的PCR管中加10μL 10×Q5 Reaction Buffer、5μL 19del正向引物(终浓度500nM)、5μL 19del反向引物(终浓度500nM)、1μL dNTPs(10mM每种dNTP)、1μL 10×LCGreen、1μL不同突变链丰度的19del标准ssDNA(突变链和野生链总终浓度为10pM，改变突变链丰度)或实际样品(DNA终浓度0.5至1.0μg/mL)、Q5 DNA聚合酶(20U/mL)、水(补至50μL)。PCR过程(每个循环93℃8s，60℃20s，72℃20s，35个循环)在Rotor-Gene Q 5plex HRM仪器上进行。实际样品设置4个平行实验，标准品设置2个平行实验。

(3)PCR结束后，分别将标准品和实际样品的平行样各自合并，并采用TIANquickMini Purification Kit进行纯化，洗脱至40μL TE buffer中。使用NanoDrop 2000微量紫外光度计测定所得洗脱液中目标DNA溶液的浓度。

(4)在200μL的PCR管中加入5μL 10×Lambda Exonuclease Buffer、2μL 19del探针(终浓度200nM)、1μL目标双链DNA(终浓度为200nM)、水(使加酶后总体积为50μL)，混合均匀。将该溶液加热至85℃后逐渐降温至37℃。加入3μL lambda核酸外切酶(终浓度100U/mL)，在37℃下使用Rotor-Gene Q 5plex HRM仪器测定实时荧光曲线。检测条件：gain＝10，荧光信号每5s采集一次，采集300次，荧光激发和发射波长分别为470nm和510nm。荧光信号上升速率通过计算荧光曲线斜率得出。

根据标准品的荧光信号上升速率对不同突变丰度按照指数模型进行拟合，制作标准曲线，进而根据实际样品的荧光信号上升速率计算其突变丰度。在低丰度突变范围的测定结果如图5所示。

由图5可见，在0.01％到1.0％的突变范围内，荧光上升速率与突变链丰度有良好的对数线性关系。利用上述方法测定了五名肺癌患者胸水样品中EGFR-19del的突变丰度，并与数字液滴PCR(ddPCR)的测定结果进行了比对。其中有两位患者的胸水中测到了较高的EGFR-19del突变丰度(>10％)，对应的ddPCR结果分别为46.0％和15％。另三位患者测得的突变丰度分别为0.07％、0.01％和0.01％，而对这三个样品中存在的EGFR-19del突变在ddPCR检测中均未检出。

综上，本发明在确保高灵敏度的同时，显著简化了整个检测流程，减少了检测所需的时间，降低了检测成本。在临床检验中具有良好的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京大学

<120> EGFR基因19号外显子缺失突变的快速荧光检测方法及应用

<130> WX2019-03-145

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tggttttgat agcga 15

<210> 2

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcttttgata gcgac 15

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acgttttgat agcga 15

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctctctgtca tagggactc 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atcgaggatt tccttgttg 19

<210> 6

<211> 112

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

ctctctgtca tagggactct ggatcccaga aggtgagaaa gttaaaattc ccgtcgctat 60

caaggaatta agagaagcaa catctccgaa agccaacaag gaaatcctcg at 112

<210> 7

<211> 97

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

ctctctgtca tagggactct ggatcccaga aggtgagaaa gttaaaattc ccgtcgctat 60

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Claims (11)

1.一种用于检测EGFR基因19号外显子缺失突变的探针，该探针为DNA单链，长度为12～15nt；EGFR基因19号外显子的缺失区域对应于该探针距5’末端的第5位和第6位碱基之间，或者第4位和第5位之间；且该探针5’末端的第1位和第2位碱基是错配的，使得探针与待检测的突变链形成5’末端两个碱基突出、其它碱基完全匹配的双链DNA；在探针的两端分别标记有荧光基团和猝灭基团。

2.如权利要求1所述的探针，其特征在于，所述探针的序列如序列表中SEQ ID No：1或2或3所示。

3.如权利要求1所述的探针，其特征在于，荧光基团标记在所述探针5’末端的脱氧核糖核苷酸残基上，猝灭基团标记在所述探针3’末端的脱氧核糖核苷酸残基上。

4.如权利要求1所述的探针，其特征在于，所述荧光基团和相应的猝灭基团选自下列组合中的一种：FAM和BHQ1/DABCYL/TAMRA，TET和BHQ1/DABCYL，HEX和BHQ1/BHQ2/DABCYL，TAMRA和BHQ2，ROX和BHQ2，Texas Red和BHQ2，Cy5和BHQ2/BHQ3。

5.一种检测EGFR基因19号外显子缺失突变的方法，包括以下步骤：

1)对待测DNA进行PCR扩增，其中正向引物设计为5’羟基末端，反向引物设计为5’磷酸末端；

2)添加λ核酸外切酶反应缓冲液、步骤1)扩增得到的目标DNA和权利要求1～4任一所述的探针，混合均匀后加热至80～95℃，然后逐渐降温至37℃，加入λ核酸外切酶，在37℃测定实时荧光曲线，获得EGFR基因19号外显子缺失突变的突变丰度。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)中，利用所述正向引物和反向引物PCR扩增出来的目标片段长度在90～130bp，其中待测目标单链与步骤2)所用探针结合后的3’末端突出序列的长度不超过40个碱基。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)所用正向引物序列如序列表中SEQ IDNo：4所示，反向引物序列如序列表中SEQ ID No：5所示。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤1)的PCR扩增采用Q5 DNA聚合酶，PCR过程为：每个循环93℃ 8s，60℃ 20s，72℃ 20s，35个循环。

9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)根据标准品的荧光信号上升速率对不同突变丰度按照指数模型进行拟合，制作标准曲线，进而根据实际样品的荧光信号上升速率计算其突变丰度。

10.一种检测EGFR基因19号外显子缺失突变的试剂盒，包括：权利要求1～4任一所述的探针，λ核酸外切酶及其反应缓冲液。

11.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括用于PCR扩增目标DNA的试剂，包括：DNA聚合酶及其反应缓冲液，5’羟基末端的正向引物，5’磷酸末端的反向引物，dNTPs，以及不同突变链丰度的EGFR基因19号外显子缺失突变的标准ssDNA。