RU2722564C1 - Молекулярно-генетические маркеры цветовых вариаций американской норки и способ выявления особей, являющихся носителем аллелей, обуславливающих формирование желаемой цветовой вариации - Google Patents
Молекулярно-генетические маркеры цветовых вариаций американской норки и способ выявления особей, являющихся носителем аллелей, обуславливающих формирование желаемой цветовой вариации Download PDFInfo
- Publication number
- RU2722564C1 RU2722564C1 RU2019106876A RU2019106876A RU2722564C1 RU 2722564 C1 RU2722564 C1 RU 2722564C1 RU 2019106876 A RU2019106876 A RU 2019106876A RU 2019106876 A RU2019106876 A RU 2019106876A RU 2722564 C1 RU2722564 C1 RU 2722564C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- polymorphic
- variation
- color
- sequence
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 241000772415 Neovison vison Species 0.000 title claims abstract description 44
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 title claims abstract description 28
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 239000000969 carrier Substances 0.000 title claims description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 54
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 101150047326 mlpH gene Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 241000282339 Mustela Species 0.000 claims abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 45
- 101001055386 Homo sapiens Melanophilin Proteins 0.000 claims description 28
- 102100026158 Melanophilin Human genes 0.000 claims description 26
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 13
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 7
- 238000007844 allele-specific PCR Methods 0.000 claims description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 3
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 15
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 6
- 238000005070 sampling Methods 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 238000011161 development Methods 0.000 description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 10
- 108010050345 Microphthalmia-Associated Transcription Factor Proteins 0.000 description 8
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 8
- 102000013760 Microphthalmia-Associated Transcription Factor Human genes 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 4
- 101150087532 mitF gene Proteins 0.000 description 4
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 4
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 241000519995 Stachys sylvatica Species 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 229910052594 sapphire Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010980 sapphire Substances 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241001137251 Corvidae Species 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 101001018064 Homo sapiens Lysosomal-trafficking regulator Proteins 0.000 description 1
- 102100033472 Lysosomal-trafficking regulator Human genes 0.000 description 1
- 101710158003 Melanophilin Proteins 0.000 description 1
- 208000009795 Microphthalmos Diseases 0.000 description 1
- 241000772416 Neovison Species 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 1
- 230000037308 hair color Effects 0.000 description 1
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003061 melanogenesis Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 201000010478 microphthalmia Diseases 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 239000011049 pearl Substances 0.000 description 1
- 235000015108 pies Nutrition 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/02—Breeding vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
Abstract
Предложенная группа изобретений относится к области медицины, в частности к молекулярной биологии. Предложен способ выявления особи американской норки, являющейся носителем не менее чем одного аллеля, обуславливающего формирование желаемой цветовой вариации, включающий генотипирование животного по гену MLPH и выявление наличия или отсутствия полиморфной вариации с. 901+1G>A (р), а также генотипирование по гену MITF-M и выявление наличия или отсутствия полиморфной вариации с. 33+1G>A (h). Предложено применение указанного способа для отбора особей американской норки среди имеющегося поголовья фермерских норок. Предложенная группа изобретений обеспечивает повышение эффективности производства меха заданной окраски и разведение соответствующих линий животных. 2 н. и 13 з.п. ф-лы, 2 табл., 4 пр.
Description
Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетическим исследованиям в селекции и пушном звероводстве. Изобретение раскрывает новые генетические маркеры, а именно специфические мутации в генах меланофилина (белок MLPH) и транскрипционного фактора, ассоциированного с микрофтальмией/меланогенезом (белок MITF), а также способ идентификаций генов, вовлеченных в регуляцию формирование окраски меха у американской норки. Авторы изобретения обнаружили, что их функционирование связано с развитием серебристо-голубой (р/р) и белой Хедлюнд (h/h) окрасок меха американской норки (Neovison visori) соответственно. Предложен также способ отбора животных, являющихся носителем какого-либо из указанных маркеров, и применение данного способа в звероводстве для отбора производителей, обладающих генетическими характеристиками, необходимыми для получения потомства желаемой цветовой окраски. Возможность определения наличия или отсутствия данных маркеров в образце ДНК животного методами молекулярной биологии показана на примере их выявления путем проведения ПЦР-анализа и последующего секвенирования биологических образцов американской норки. Раскрыта тест-система, включающая генотипирование животного для выявления у него маркерной полиморфной нуклеотидной вариации, ассоциированной с наличием у животного аллеля, проявляющегося в развитии определенной цветовой вариации. Предложенные в качестве маркеров нуклеотидные вариации в геноме ассоциированы с изменением физиологической активности белков MLPH и MITF-M. Для выявления данных вариаций проводят генотипирование полиморфных локусов в генах MLPH и MITF. В частности, в качестве маркера наличия в генотипе животного аллеля р используют SNP в гене MLPH, и в качестве маркера наличия аллеля h используют SNP в гене MITF.
Цвет окраски меха важен для промышленного разведения норки. Поэтому желательно развивать те популяции норки, которые будут размножаться в соответствии с определенным цветом меха. Тем не менее, создание таких групп особей было бы трудоемким и дорогостоящим с использованием традиционных методов промышленного разведения (тестовых программ). Поэтому желательно уметь определить окраску меха норки на основании генотипа отдельных животных. Авторы изобретения показали, что гены MLPH и MLTF у норки участвует в определении цвета меха. В частности, авторы изобретения впервые обнаружили, что мутация в гене MLPH с. 901+1G>A (р), ответственна за определенный фенотипический признак, а именно - определяет серебристо-голубую (аллели р/р) окраску меха норки, а мутация гена MITF-M с. 33+1G>A (h) определяет белую Хедлюнд (аллели h/h) окраску меха. Авторы изобретения впервые показали ассоциированность физиологической активности белков MITF и MLPH с окраской меха американской норки, что и послужило основой создания нового способа отбора животных, являющих носителями аллелей, обеспечивающих определенную окраску, а также их число. Любые генетические изменения, затрагивающие физиологическую активность генов MITF-M и MLPH, в том числе и внесенные методами геномного редактирования, методами генной инженерии или направленным мутагенезом и другими способами, могут применяться в качестве генетических маркеров для отбора животных, являющихся носителями аллелей желаемой окраски. Авторы раскрывают также референсные последовательности, при сравнении с которыми могут быть выявлены различные новые генетические маркеры, которые могут быть применены для генотипирования животных. В качестве таких маркеров могут быть использованы любые геномные изменения, нарушающие функционирование гена на всех уровнях его функционирования, а также изменения, затрагивающие структуру белка и влияющие таким образом на его физиологическую активность. Раскрыты также два новых маркера, которые могут быть использованы для генотипирования животных с целью выявления животных - носителей аллелей определенных цветовых вариаций.
Открытие мутаций в генах MITF-M и MLPH позволило авторам изобретения разработать методы для различения аллелей Р/р и H/h, таким образом определяя генотип отдельных норок по генам/мутациям, обуславливающим развитие определенных окрасок меха. В соответствии с настоящим изобретением предлагаются способы отбора особей для получения желаемой окраски меха на основе определения генотипа отдельных особей норки.
Эффективность производства меха заданной окраски и разведения соответствующих линий животных может быть повышена, при возможности определения, до скрещивания, является ли животное носителем той или иной мутации, влияющей на окраску меха. Используя данную информацию, селекционер сможет грамотно планировать скрещивания животных, увеличив, таким образом, долю потомства с интересующей его окраской, что в конечном итоге приведет к уменьшению расходов звероводческой организации. В качестве инструмента для отбора животных предложено использовать наличие мутации в гене MLPH с. 901+1G>A, которая в гомозиготном состоянии (р/р) обуславливает развитие серебристо-голубой окраски меха у норки и наличие мутации в гене MITF-M с. 33+1G>A, которая в гомозиготном состоянии (h/h) обуславливает развитие белой Хедлюнд окраски у животного. Данные мутации можно использовать в качестве маркеров, позволяющих определить наличие или отсутствие у животного аллелей р и h (а также их число), обуславливающих исследуемую окраску меха (серебристо-голубую и белую, соответственно).
Изобретение раскрывает также способ селекции и разведения фермерской американской норки по желательному признаку (для получения особей с заданной окраской меха). Способ включает в себя отбор особей, генетически соответствующих по желательному признаку (заданной окраске меха) среди имеющегося поголовья фермерских норок для использования в направленных селекционных программах (получение потомства с заданной окраской меха). Данный способ отбора норок для селекции также может быть использован для защиты от генетической кражи селекционных линий американских норок определенной окраски.
Из всех представителей семейства куньи американская норка (Neovison vison) - наиболее широко распространена, так как является основным объектом клеточного пушного звероводства, на ее долю приходится более 80% международной торговли необработанным мехом [Henning, 2014]. Одна из причин популярности американской норки в пушном звероводстве - чрезвычайно высокое разнообразие окрасочных форм. С 1931 г., когда впервые была описана первая цветовая мутация для американских норок, обусловливающая серебристо-голубую окраску меха, описано и зафиксировано 35 мутаций доминантой, полудоминантной и рецессивной природы, затрагивающих окраску волосяного покрова, на основе которых селекционерами сформировано более 100 комбинативных окрасочных форм [Трапезов и Трапезова, 2009]. Впервые описанная более 80 лет назад, мутация, обуславливающая серебристо-голубую окраску меха (наследующуюся как моногенный аутосомно-рецессивный признак, обозначаемый как р/р), с течением времени стала чрезвычайно популярной, и в сейчас она является одной из наиболее часто используемых мутаций в меховой промышленности норки. В сочетании с другими мутациями она участвует в формировании наиболее популярных окрасок меха, таких как фиолетовая (а/а m/m р/р), сапфир (а/а р/р), жемчуг (k/k р/р или а/а k/k р/р) и другие [Трапезов и Трапезова, 2009; Cirera et al., 2013].
Другой популярной окраской меха у американской норки является белая окраска. Описано по меньшей мере две мутации, приводящей к формированию белой окраски меха у норки. Она из них является классической альбино-окраской, так же известной как королевская белая окраска, данная окраска наследуется как моногенный аутосомно-рецессивный признак (обозначается как с/с) и обуславливается мутацией в гене (TYR) [Anistoroaei et al., 2008]. Вторая белая окраска меха - белый Хедлюнд (h/h) отличается от альбино-формы окраской глаз, у белых Хедлюнд норок глаза темные, в то время как у альбиносов - красные. Окраска белый Хедлюнд наследуется как моногенный кодоминантный признак - гомозиготы h/h имеют белую окраску и часто являются глухими, а гетерозиготы H/h - имеют пятнистую, пегую окраску и нормальный слух [Markakis et al., 2014]. Белый мех востребован на рынке, так как легко может быть покрашен [Anistoroaei et al., 2008].
В настоящее время с молекулярно-генетической точки зрения описано всего лишь 4 из более чем 30 мутаций, обуславливающих формирование цветных форм американкой норки. Это мутации, обуславливающие королевскую белую (с/с), гималайскую (ch/ch), алеутскую (а/а) окраски, а также окраску американский паломино (k/k) [Anistoroaei et al., 2008; Benkel et al., 2009; Anistoroaei et al., 2013; Cirera et al., 2016]. В случае, если генетические маркеры животных-носителей данных мутаций неизвестны, носительство определяют, используя генеалогический метод - это метод изучения родословных, с помощью которого прослеживается наследование признака в группе с указанием типа родственных связей между членами родословной. Молекулярно-генетический маркеры для животных, являющихся носителями признака «белый Хедлюнд» и «серебристо-голубая» до настоящего времени не были известны и впервые предложены в заявленном изобретении.
Авторы изобретения провели полногеномное секвенирование и последующее сравнение геномов американских норок, характеризующихся тремя различными окрасками: стандартной темно-коричневой (дикий тип, +/+), серебристо-голубой (аллели р/р) и белой Хедлюнд (аллели h/h). У животных с серебристо-голубой и белой Хедлюнд окрасками были обнаружены изменения в структуре белок-кодирующих транскриптов генов MLPH и MITF, которые приводят к продукции нефункциональных белков MLPH и
MITF-M соответственно. В результате проведенных экспериментов, авторы изобретения, выявили у норок с серебристо-голубой окраской меха мутацию с. 901+1G>А в гене MLPH, ранее не описанную для животных с такой окраской, и убедительно доказали, что данная мутация приводит к серьезным нарушениям в структуре транскрипта гена MPLH (полня потеря 7-го экзона, длиной 196 п.н.). На расширенной выборке животных авторами изобретения было продемонстрированно, что мутация MLPH с. 901+1G>А в гомозиготном состоянии встречается только у животных серебристо-голубой окраски или животных с комбинантными окрасками, в формировании которых задействован локус р, что является доказательством того, что мутация с. 901+1G>A в гене MLPH обуславливает развитие серебристо-голубой окраски у животных, гомозиготных по данной мутации (аллели р/р).
Данная мутация никогда не была описана у животных с серебристо-голубой окраской меха ранее, а также не была связана с развитием данного типа окраски меха. Следует отметить, что хотя ранее в работе Cirera S. et al, 2013 была показана взаимосвязь между геном MLPH и формированием серебристо-голубой окраски меха и была выявлена крупная делеция в данном гене, предложенная авторами статьи для генетического тестирования норок с серебристо-голубой окраской меха, однако ассоциаций для конкретного определенного полиморфного варианта гена MLPH, а именно для мутации с. 901+1G>A с серебристо-голубой окраской меха выявлено не было. Таким образом, авторы изобретения выявили новый генетический вариант гена MLPH, обуславливающий развитие определенного фенотипического признака у норки - серебристо-голубую цветовую окраску шерсти.
Также авторами изобретения впервые была выявлена мутация MITF-M с. 33+1G>A в гене MITF, которая обуславливает развитие белой Хедлюнд (h/h) окраски. Ранее Markakis M.N. et al. 2014 изучали влияние гена MITF на формирование белой Хедлюнд (h/h) окраски меха у американской норки, однако, при анализе кодирующей области данного гена Markakis M.N с соавторами не сумели выявить мутаций, потенциально обуславливающих формирование данной окраски, о чем они прямо заявляют в своей работе. В ходе проведенных экспериментов, авторы данного изобретения убедительно доказали, что окраска белый Хедлюнд у американской норки обуславливается мутаций MITF-M с. 33+1G>A. Было показано, что мутация MITF-M с. 33+1G>A приводит к нарушению сплайсинга меланоцито-специфичной изоформы гена MITF, являющейся важным регулятором процессов развития и выживания меланоцитов. На расширенной выборке животных авторами заявки продемонстрировано, что мутация MITF-M с. 33+1G>A в гомозиготном состоянии встречается только у животных белой Хедлюнд окраски, и не выявлена в гомозиготном состоянии ни у одного из животных с окраской меха дикого типа или другим типом окраски. Таким образом, авторы изобретения выявили новый генетический вариант гена MITF-M, обуславливающий развитие определенного фенотипического признака у норки - белой Хедлюнд окраски шерсти.
Таким образом, данное изобретение относится, прежде всего, к использованию обнаруженных мутаций в генах MLPH и MITF в качестве молекулярно-генетических маркеров, позволяющих определить наличие или отсутствие у животного аллелей р и h (а также их число). Изобретение относится также к способу проведения этого определения, который основан на проведении следующих стадий:
1) взятие пробы геномной ДНК от американской норки;
2) исследование геномной ДНК, полученной на стадии (1), для определения, наличия или отсутствия у животного аллелей р и h (а также их числа)
Соответственно, стадия (2), а именно - определение, наличия или отсутствия у животного аллелей р и h (а также их числа), осуществляются путем проведения генотипирования по мутациям MLPH с. 901+1G>A и MITF-M с. 33+1G>A Причем специалисту понятно, что для осуществления генотипирования по мутациям MLPH с. 901+1G>A и MITF-M с. 33+1G>A может быть использован любой известный в настоящее время способ определения нуклеотидной последовательности ДНК и\или наличия определенной мутации (секвенирование по Сэнгену, NGS, аллельспецифичная ПЦР, ПЦР-ПДРФ, TaqMan Real-Time PCR и др.). Изобретение относится к способу отбора особей норки, пригодных в племенной работе для получения желаемой окраски меха. Изобретение относится также к референсным последовательностям генов MLPH и MITF, любые изменения в которых, приводящие к изменению функционирования кодируемых ими белков, а также уровня их продукции, могут быть использованы в качестве генетических маркеров носительства аллелей (а также их числа), ассоциированных с определенной окраской меха. Изобретение относится также к мутации в гене MLPH, которая приводит к нарушению структуры мРНК MLPH и, как следствие, к продукции укороченного белка и развитию серебристо-голубой окраски меха.
Изобретение относится также к способу выявления особи американской норки, являющейся носителем не менее чем одного аллеля, обуславливающего формирование вариации белой Хедлюнд, включающего генотипирование животного для выявления у него маркерного SNP, представляющего собой MITF (MITF-M с. 33+1G>A), наличие которого является маркером проявления белой Хедлюнд окраски у животного, гомозиготного по h-аллелю (h/h) и пятнистой/пегой окраски у животного в гетерозиготного по h-аллелю (h/+).
Референсные нуклеотидные последовательности, сравнение с которыми может привести к обнаружению мутаций, ассоциированных с окраской меха у американской норки:
1) SEQ ID NO: 1: частичная последовательность гена MLPH: CCTCCAGAAGAGCAGATGGACAGCCTCTCCCCTGTGGGACAGGACACCCTCACTGAGCTCTGCGTCCCTGGAGAGTCCCGCAGGACAGCCCTGGGGACTGCTGCTGCAGCTGGTAGGTCCCTTGATGGGCTCTGCATTGGGGAAGGGGTCAGCAGAAAACCCACCCACTGCCCTGATTTGTGCAGACACGCCGGCCGATTGATAGCAACCCCTTCCTTCACCGCCTTGTCTGGCATGTCTGGTCCTGGTAGACACCACTCCCCACCCACTGCCCCCCACCCCCAGGCTGGGTGCTGCCGTCCTGACACTCAGAAGTCCCAGCATCAATAGCTC;
2) SEQ ID NO: 2: частичная последовательность гена MITF-M: CTTCTCTATGCCCGTCAGTCTTTGAACTGGAATTACAGAAAGTAGAGAGAGTGAATAGTCTACCGTTTCTCTCGTTGGACTGGGGCCACCTAAAACGTTGTTATGCTGGAAATGCTAGAATACAATCACTATCAGGTGAGCTTTATTCTTATTCATATGCAGTGTCTGAAATGTAATGCAGTGAATTGAGTAATTTGCCTTTTCATGTTATTGTACTCTTTCCAATAAGTGCAGGTCTACTAGTTTAATACTGTTTACTGTTTGATACCGTAAGAGGTAATTCAATGTGGTTTTGAACAAAGTAAATATAGTAGGGTATTTTTTTTTTCCCTAGTGCCTGGCTGTGCTCTCTCCATCAGCTCCTGTTC.
В настоящее время аналогов представляемым маркерам и способу их использования для определения окраски меха у американской норки не существует.
Для осуществления генотипирования по мутациям MLPH с. 901+1G>A и MITF-M с. 33+1G>A может быть использован любой известный в настоящее время стандартный метод для определения наличия конкретной нуклеотидной последовательности ДНК и\или наличия определенной мутации (секвенирование по Сэнгену, NGS, аллельспецифичная ПЦР, ПЦР-ПДРФ, TaqMan Real-Time PCR и др.). В качестве одного из примеров генотипирования авторами приводится метод с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Таким образом, предпочтительный аспект изобретения включает в себя этап, на котором определение того, присутствует ли полиморфизм (ы) в нуклеотидных последовательностях MLPH и MITF-M, включает амплификацию ДНК в присутствии олигонуклеотидных праймеров, выбранных из SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 для гена MLPH и SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6 для гена MITF-M (таблица 2).
Последостальености праймеров, используемых в ПЦР, представлены в Таблице 2.
Ниже представлены примеры проведения генотипирования животных по мутациям MLPH с. 901+1G>A и MITF-M с. 33+1G>A, а также применение данного способа в селекции.
Пример 1. Генотипирование биологического образца.
Получение ДНК
ДНК может быть получена из любой исходной ткани животного, содержащей клеточные ядра, например, лейкоцитов, волосяных фолликулов, ткани уха и мышечной ткани, клеток буккального эпителия и др. Пригодная для проведения ПЦР ДНК может быть выделена из образа при помощи наборов QIAamp DNA Mini Kit компании Qiagen (www.qiagen.com). Однако любой метод выделения ДНК должен быть в равной степени эффективным.
Амплификация участков генома американской норки, содержащих исследуемые мутации
Может быть осуществлена с помощью наборов GenPack PCR Core компании «Изоген», на приборах GeneAmp PCR System 9700 Thermal Cycler компании «Applied Biosystems» по следующей программе: 94°C - 5 мин; (94°C - 30 сек; 58°C - 30 сек; 72°C -30 сек) * 35 циклов; 72°C - 10 мин. Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала: 10 мкл PCR Diluent, по 0,5 пмоль прямого и обратного праймеров (Таблица 2), 10 нг геномной ДНК.
Секвенирование полученных ПЦР продуктов
Полученные в результате ПЦР фрагменты очищали с использованием наборов Cleanup компании «Евроген».
Сиквенсную реакцию проводили с помощью набора реагентов BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit компании «Applied Biosystems», реакционная смесь объемом 10 мкл содержала: 2 мкл BigDye™ Terminator v3.1 Ready Reaction Mix, 1 мкл BigDye™ Terminator v3.1 5X Sequencing Buffer, 0,1 пмоль прямого или обратного праймер (Таблица 2), и очищенный ПЦР продукт.
Полученные продукты реакции очищали на колонках DyeEx 2.0 Spin Kit («Qiagen») и секвенировали на приборе ABI PSISN 3730x1 компании «Applied Biosystems».
Анализ полученных нуклеотидных последовательностей
Проводили с использованием программ Chromas, GeneDoc и веб-сервиса Clustal Omega.
Проводили выравнивание и сравнение полученных нуклеотидных последовательностей, исследуемых особей с нуклеотидной последовательность норки стандартной, темно-коричневой (+/+), окраски (Таблица 1).
Пример 2. Способ отбора особей норки для получения у потомства окраски
Серебристо-голубая:
Зная исходные генотипы животных, возможно предсказать долю потомства с желаемой окраской.
Условные обозначения:
Аллель Р - MLPH с. 901+1G
Аллель р - MLPH с. 901+1А
Для выведения животных с серебристо-голубой окраской меха необходимо, чтобы оба производителя были:
1) гомозиготами рр, тогда 100% потомства будет иметь серебристо-голубую окраску меха;
2) гетерозиготами Рр, тогда 25% потомства будет иметь серебристо-голубую окраску меха (рр), 75% стандартную окраску (РР/Рр)
3) гомозиготой рр и гетерозиготой Рр, тогда 50% потомства будет иметь серебристо-голубую окраску меха (рр), а 50% стандартную окраску (Рр).
Следует отметить, что, в случае, если скрещиваемые организмы являются носителями других мутаций, оказывающих влияние на окраску меха (например, мутации LYST c. 9468delC, обуславливающей алеутскую окраску меха (a)) [Anistoroaei et al., 2013] то окраски меха животных потомства от таких скрещиваний могут отличаться от выше описанных за счет формирования комбинационных окрасок меха (например, сапфир (аа pp)).
Пример 3. Способ отбора особей норки для получения белой Хедлюнд окраски.
Зная исходные генотипы животных возможно предсказать долю потомства с желаемой окраской.
Условные обозначения:
Н - MITF-M с. 33+1G
h - MITF-M с. 33+1А
Для выведения животных с белой Хедлюнд окраской необходимо, чтобы оба производителя были:
1) гомозиготами hh, тогда 100% потомства будет иметь белую Хедлюнд окраску меха;
2) гетерозиготами Hh, тогда 25% потомства будет иметь белую Хедлюнд окраску меха (hh), 50% будут иметь стандартную окраску с белыми пятнами (пегость) (Hh), 25% будут иметь стандартную окраску;
3) гомозиготой hh и гетерозиготой Hh, тогда 50% потомства будет иметь белую Хедлюнд окраску меха (рр), а 50% будут иметь стандартную окраску с белыми пятнами (пегость) (Hh).
Пример 4. Применение способа в селекционной работе. Условные обозначения:
Предположим, имеется популяция норок стандартной темно-коричневой окраски. В результате проведенного генотипирования по мутации MLPH с. 901+1G>A было выяснено, что 50% популяции гомозиготы по аллелю MLPH с. 901+1G (РР), а 50% популяции гетерозиготы по аллелю MLPH с. 901+1А (Рр).
1) В случае случайного скрещивания в потомстве ожидается следующее распределение по окраскам и генотипам:
2) В случае целенаправленного скрещивания животных с генотипом Рр в потомстве от таких скрещиваний ожидается следующее распределение по окраскам и генотипам:
Таким образом, применение предложенного способа определения окраски меха американской норки, с использованием молекулярных маркеров ДНК, может существенно увеличить долю животных с заданной окраской в потомстве.
>Neovison vison MPLH (часть)
CCTCCAGAAGAGCAGATGGACAGCCTCTCCCCTGTGGGACAGGACACCCTCACTGAGCTCTGCGTCCCTGGAGAGTCCCGCAGGACAGCCCTGGGGACTGCTGCTGCAGCTGGTAGGTCCCTTGATGGGCTCTGCATTGGGGAAGGGGTCAGCAGAAAACCCACCCACTGCCCTGATTTGTGCAGACACGCCGGCCAATTGATAGCAACCCCTTCCTTCACCGCCTTGTCTGGCATGTCTGGTCCTGGTAGACACCACTccccacccactgccccccacccccaGGCTGGGTGCTGCCGTCCTGACACTCAGAAGTCCCAGCATCAATAGCTC
>Neovison vison MITF (часть)
CTTCTCTATGCCCGTCAGTCTTTGAACTGGAATTACAGAAAGTAGAGAGAGTGAATAGTCTACCGTTTCTCTCGTTGGACTGGGGCCACCTAAAACGTTGTTATGCTGGAAATGCTAGAATACAATCACTATCAGGTGAGCTTTATTCTTATTCATATGCAGTGTCTGAAATGTAATGCAGTGAATTGAGTAATTTGCCTTTTCATGTTATTGTACCCTTTCCAATAAGTGCAGGTCTACTAGTTTAATACTGTTTACTGTTTGATACCGTAAGAGGTAATTCAATGTGGTTTTGAACAAAGTAAATATAGTAGGGTAttttttttttCCCTAGTGCCTGGCTGTGCTCTCTCCATCAGCTCCTGTTC
>S-b_dir
CCTCCAGAAGAGCAGATGG
>S-b_rev
GAGCTATTGATGCTGGGACT
>WH_dir
CTTCTCTATGCCCGTCAGTC
>WH_rev
GAACAGGAGCTGATGGAGAG
Claims (15)
1. Способ выявления особи американской норки, являющейся носителем не менее чем одного аллеля, обуславливающего формирование желаемой цветовой вариации, включающий генотипирование животного по гену MLPH, а именно: а) определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК с использованием праймеров SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4; б) сравнение последовательности указанной ДНК с последовательностью SEQ ID NO: 1; в) выявление наличия или отсутствия полиморфной вариации, с. 901+1G>A (р) в гене MLPH, в амплифицированной последовательности; а также включающий генотипирование животного по гену MITF-M, а именно: а) определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК с использованием праймеров SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6; б) сравнение последовательности указанной ДНК с последовательностью SEQ ID NO: 2; в) выявление наличия или отсутствия полиморфной вариации, с. 33+1G>A (h) в гене MITF-M, в амплифицированной последовательности.
2. Способ по п. 1, где мутация является маркером проявления серебристо-голубой окраски у животного, гомозиготного по р-аллелю (р/р).
3. Способ по п. 1, где мутация является маркером проявления белой Хедлюнд окраски у животного, гомозиготного по h-аллелю (h/h).
4. Способ по п. 1, где полиморфная нуклеотидная вариация расположена в регуляторном участке гена, кодирующего белок MLPH, и наличие полиморфных изменений коррелирует с изменением активности гена.
5. Способ по п. 1, где полиморфная нуклеотидная вариация расположена в структурном участке гена, кодирующего белок MLPH, и наличие полиморфных изменений коррелирует с изменением структуры белка, кодируемого этим геном.
6. Способ по п. 1, где полиморфная нуклеотидная вариация расположена в регуляторном участке гена, кодирующего белок MITF-M, и наличие полиморфных изменений коррелирует с изменением активности гена.
7. Способ по п. 1, где полиморфная нуклеотидная вариация расположена в структурном участке гена, кодирующего белок MITF-M, и наличие полиморфных изменений коррелирует с изменением структуры белка, кодируемого этим геном.
8. Способ по п. 1, где определение нуклеотидной последовательности ДНК проводят секвенированием по методу Сенгера.
9. Способ по п. 1, где определение нуклеотидной последовательности ДНК проводят секвенированием NGS.
10. Способ по п. 1, где выявление наличия или отсутствия полиморфной вариации в амплифицированной последовательности проводят методом ПЦР-ПДРФ.
11. Способ по п. 1, где выявление наличия или отсутствия полиморфной вариации в амплифицированной последовательности проводят методом TaqMan Real-Time PCR.
12. Способ по п. 1, где выявление наличия или отсутствия полиморфной вариации в амплифицированной последовательности проводят методом аллельспецифичной ПЦР.
13. Способ по п. 1, где выявление наличия или отсутствия полиморфной вариации в амплифицированной последовательности проводят методом гибридизации на чипах.
14. Применение способа по п. 1 для отбора особей американской норки, являющихся носителем не менее чем одного аллеля, обуславливающего формирование желаемой цветовой вариации, среди имеющегося поголовья фермерских норок.
15. Применение по п. 14, где отобранных животных используют для получения от них потомства с заданной окраской меха.
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2019106876A RU2722564C1 (ru) | 2019-03-12 | 2019-03-12 | Молекулярно-генетические маркеры цветовых вариаций американской норки и способ выявления особей, являющихся носителем аллелей, обуславливающих формирование желаемой цветовой вариации |
PCT/RU2020/000126 WO2020185119A2 (ru) | 2019-03-12 | 2020-03-11 | Молекулярно-генетические маркеры цветовых вариаций американской норки и способ выявления особей, являющихся носителем аллелей, обуславливающих формирование желаемой цветовой вариции |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2019106876A RU2722564C1 (ru) | 2019-03-12 | 2019-03-12 | Молекулярно-генетические маркеры цветовых вариаций американской норки и способ выявления особей, являющихся носителем аллелей, обуславливающих формирование желаемой цветовой вариации |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2722564C1 true RU2722564C1 (ru) | 2020-06-01 |
Family
ID=71067377
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2019106876A RU2722564C1 (ru) | 2019-03-12 | 2019-03-12 | Молекулярно-генетические маркеры цветовых вариаций американской норки и способ выявления особей, являющихся носителем аллелей, обуславливающих формирование желаемой цветовой вариации |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2722564C1 (ru) |
WO (1) | WO2020185119A2 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2810183C1 (ru) * | 2022-10-21 | 2023-12-22 | Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования "Научно-технологический университет "Сириус" | Молекулярно-генетический маркер цветовой вариации "черный хрусталь" у американской норки и способ выявления особи норки, являющейся носителем аллеля, обуславливающего формирование желаемой цветовой вариации |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2044480C1 (ru) * | 1992-04-23 | 1995-09-27 | Илья Борисович Тихомиров | Способ получения новых окрасок меха у норок |
-
2019
- 2019-03-12 RU RU2019106876A patent/RU2722564C1/ru active
-
2020
- 2020-03-11 WO PCT/RU2020/000126 patent/WO2020185119A2/ru not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2044480C1 (ru) * | 1992-04-23 | 1995-09-27 | Илья Борисович Тихомиров | Способ получения новых окрасок меха у норок |
Non-Patent Citations (8)
Title |
---|
CIRERA S. et al. New insights into the melanophilin (MLPH) gene controlling coat color phenotypes in American mink. Gene. 2013 Sep 15; 527(1): 48-54. * |
DATABASE, GenBank, AH013244.2, 10.06.2016, стр.1-3 [Найдено 02.03.2020] [он-лайн]. Найдено из Интернет: URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ . * |
DATABASE, GenBank, XM_013051834.1, 01.07.2015, стр.1-2 [Найдено 02.03.2020] [он-лайн]. Найдено из Интернет: URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ . * |
KOONIN E.V. et al. Sequence - Evolution - Function. Computational Approaches in Comparative Genomics. Boston: Kluwer Academic. 2003. [Найдено 06.02.2020] [он-лайн]. Найдено из Интернет: URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK20255/. * |
MARKAKIS M.N. et al. Association of MITF gene with hearing and pigmentation phenotype in Hedlund white American mink (Neovison vison). J Genet. 2014 Aug; 93(2): 477-81. * |
MARKAKIS M.N. et al. Association of MITF gene with hearing and pigmentation phenotype in Hedlund white American mink (Neovison vison). J Genet. 2014 Aug; 93(2): 477-81. ТРАПЕЗОВ О.В. и др. Воспроизводящаяся коллекция генотипов американской норки (Mustela vison Schreber, 1777) на экспериментальной звероферме Института цитологии и генетики СО РАН. Информ. Вестник ВОГиС. 2009; 13(3): 554-570. ANISTOROAEI R. et al. A frameshift mutation in the LYST gene is responsible for the Aleutian color and the associated Chediak-Higashi syndrome in American mink. Anim Genet. 2013 Apr; 44(2): 178-83. DATABASE, GenBank, XM_013051834.1, 01.07.2015, стр.1-2 [Найдено 02.03.2020] [он-лайн]. Найдено из Интернет: URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ . DATABASE, GenBank, * |
стр.1-3 [Найдено 02.03.2020] [он-лайн]. Найдено из Интернет: URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ . KOONIN E.V. et al. Sequence - Evolution - Function. Computational Approaches in Comparative Genomics. Boston: Kluwer Academic. 2003. [Найдено 06.02.2020] [он-лайн]. Найдено из Интернет: URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK20255/. * |
ТРАПЕЗОВ О.В. и др. Воспроизводящаяся коллекция генотипов американской норки (Mustela vison Schreber, 1777) на экспериментальной звероферме Института цитологии и генетики СО РАН. Информ. Вестник ВОГиС. 2009; 13(3): 554-570 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2810183C1 (ru) * | 2022-10-21 | 2023-12-22 | Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования "Научно-технологический университет "Сириус" | Молекулярно-генетический маркер цветовой вариации "черный хрусталь" у американской норки и способ выявления особи норки, являющейся носителем аллеля, обуславливающего формирование желаемой цветовой вариации |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2020185119A2 (ru) | 2020-09-17 |
WO2020185119A3 (ru) | 2020-11-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2009275988B2 (en) | A genetic marker test for Brachyspina and fertility in cattle | |
KR102275752B1 (ko) | 결정적 제한 부위 전체 게놈 증폭에 의해 수득된 dna 서열의 라이브러리의 게놈 무결성 및/또는 품질을 측정하기 위한 방법 및 키트 | |
JP7343264B2 (ja) | Dnaライブラリーの作製方法及びdnaライブラリーを用いたゲノムdna解析方法 | |
CN107586857B (zh) | 用于快速鉴定猪的红黑毛色基因的核酸、试剂盒及方法 | |
KR101890350B1 (ko) | 돼지의 육질 예측용 snp 마커 및 이의 용도 | |
KR102235340B1 (ko) | 토종닭의 성장 형질을 예측하기 위한 snp 마커 세트 및 이의 용도 | |
JP2001520052A (ja) | ブタにおける被毛色遺伝子型を決定する方法 | |
JP2011500062A (ja) | 血液型群遺伝子の検出 | |
JP2018529377A (ja) | 所望のハプロタイプ中の外来対立遺伝子の存在を同定する方法 | |
RU2722564C1 (ru) | Молекулярно-генетические маркеры цветовых вариаций американской норки и способ выявления особей, являющихся носителем аллелей, обуславливающих формирование желаемой цветовой вариации | |
KR101823372B1 (ko) | 우리흑돈 품종 식별용 snp 마커 및 이를 이용한 우리흑돈 품종 식별 방법 | |
KR101701105B1 (ko) | 한국 토종오리의 피모색 구분을 위한 유전자 마커 및 이의 용도 | |
WO2008014550A1 (en) | Markers for pigmentation | |
KR102001528B1 (ko) | 한국 재래돼지 식별용 유전자 마커 및 이의 용도 | |
RU2810183C1 (ru) | Молекулярно-генетический маркер цветовой вариации "черный хрусталь" у американской норки и способ выявления особи норки, являющейся носителем аллеля, обуславливающего формирование желаемой цветовой вариации | |
CA2312269A1 (en) | A dna marker for cattle growth | |
EP1741791A9 (en) | Method and kit for the genotypification of hla-b27 based on real time pcr | |
CA2832242C (en) | Detecting the brachyspina mutation | |
WO2008074069A1 (en) | Sheep pigmentation | |
RU2662972C1 (ru) | Способ проведения ПЦР с аллель-специфичными зондами для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и К гена DGAT1 | |
AU2001260263B2 (en) | Method and probes for the genetic diagnosis of hemochromatosis | |
KR101929340B1 (ko) | 단일염기다형성 분석을 이용한 서양종꿀벌 계통 판별용 프라이머 세트 또는 이를 함유하는 조성물 | |
CA2539551A1 (en) | Adrenergic receptor snp for improved milking characteristics | |
JP2005027566A (ja) | シバ属植物の個体識別方法 | |
KR20230073565A (ko) | 흑모형질 연관 유전자를 이용한 난축맛돈 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도 |