JP2001520052A - ブタにおける被毛色遺伝子型を決定する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ブタにおける被毛色遺伝子型を決定する方法が提供される。特に、これらの方法はＫＩＴ遺伝子の一つ以上のエキソン／イントロン・スプライス部位に突然変異が存在するか否かを決定することに基づいている。このような方法を実施するためのキットも記述される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明はブタの被毛色遺伝子型を決定するための方法に関する。とりわけ、そ
れはＫＩＴ遺伝子の対立遺伝子Ｉ、Ｉ^P 、Ｉ^* 及びｉの間を区別する方法に関す
る。

【０００２】 被毛色は幾つかの理由からブタ育種産業にとって重要である。第一に、多くの
市場で白色皮膚の肉に対する好みが存在する。これはブタ肉が皮膚がなお付着し
たままでしばしば市販され、そして着色ブタの皮膚は脱毛した場合でさえもなお
着色した毛根を示し、その肉の表面がカビによる斑点のように見えるため、消費
者にネガティブな印象を与え得るという事実によるものである。したがって、こ
れらの市場ではこのような生肉から皮膚を取り除くことが必要であり、これは余
分な出費を強いることになる。

【０００３】 例えば、アメリカ合衆国では、着色した生肉は、色素を除くための脱毛及び脱
皮を必要とする皮膚の約１％の皮膚欠陥を伴う。この結果、着色ブタの生肉は一
般にディスカウントされる。第二に、他の性質と遺伝的に密接に結び着いている
と主張されているブタの外観上の全体的な変化はブタを生産している顧客の心に
その動物の一貫性及び品質についての疑問を生じさせ得ることである。育種家は
繁殖集団における一貫性を確保したいと思うであろう。こうして、育種家は育種
交配により生産される子孫が常に白色であることを確保しようと望む。また、着
色した品種を生産する育種家は白色系統からの遺伝子が移入される場合でさえも
正しい被毛色の特性が維持されることを確保しようと望むことになる。

【０００４】 ブタの白色の被毛は（被毛色の阻害に因んで）Ｉと命名された優性な白遺伝子
座により制御されている。最近、ブタのＫＩＴ遺伝子中の構造的変化がＩの種々
の対立遺伝子と相関付けられ、そしてこれはおそらく見出された被毛色パターン
における相違の原因であり、あるいは見出される突然変異に密接に関連している
であろう（ヨハンソン モラーら、1996 Mammalian Genome 7, 822-830) 。ブタ
ＫＩＴ遺伝子の４種の構造的変異体が今日までに同定され、Ｉ、Ｉ^P 、Ｉ^* 及び
ｉと命名された（図１及び表１を参照）。ワイルドボールなどの完全に着色した
動物、したがって一般に野生型対立遺伝子と認められている動物中に見出される
変異体はｉである。この遺伝子の知られた他の変異体はすべてブタＫＩＴ遺伝子
の少なくとも一部の複製（duplication)を含んでいる。Ｉ^P は部分的に優性な対
立遺伝子でありそしてヘテロ接合体状態（Ｉ^P ／ｉ）では着色被毛と白の斑点と
いう特徴を持つ「斑点」表現型を惹起する。ＩとＩ^* は両方とも完全に優性であ
りヘテロ接合状態及びホモ接合状態の両方で白の表現型を惹起する。ＩとＩ^* の
間の唯一の相違はＩ対立遺伝子と関連する二つのＫＩＴ遺伝子コピーの一方のイ
ントロン１８に４塩基対の欠失が存在することである。この配列多型性が何らか
の機能的効果を持つとは予想できない。

【０００５】 幾つかの遺伝子組合せの表現型は以下にリストされており、Ｉ対立遺伝子はＩ ^P 及びｉよりも優性であり、そしてＩ^P はｉよりも優性である（ヨハンソンら 1
992 Genomics 14, 965-969) 。 遺伝子型 色 Ｉ／Ｉ 白色 Ｉ／Ｉ^P 白色 Ｉ／ｉ 白色 Ｉ^P ／ｉ 斑点 ｉ／ｉ 着色 Ｉ^* ／ｉ 白色

【０００６】 先にモラー ヨハンソンら（ 1996 Mammalian Genome 7, 822-830)はＫＩＴが
着色した（ｉ／ｉ）動物では単一コピー遺伝子として現れるが、Ｉ、Ｉ^* 及びＩ ^P 対立遺伝子では重複していることを明らかにした。この重複はＫＩＴの遺伝子
コピー数の検査を通じてＩ、Ｉ^* 及びＩ^P をｉから区別することを可能にし、そ
してＩ遺伝子座における異なる対立遺伝子を区別するためにＫＩＴ遺伝子の中又
はそのごく近辺における連結した多型性を使用することを可能にした。この取り
組みは国際特許出願ＷＯ９７／０５２７８の主題である。

【０００７】 しかしながら、この方法で残っている問題はそれがＩ^* とＩ^P の間を区別しな
いということである。この結果、ヒトが白色ブタ血統からＩ／Ｉ^P 遺伝子型のヘ
テロ接合体保持動物を除去するための遮蔽物を用いたいと望むときは、不必要に
Ｉ／Ｉ^* 動物をも排除することになる。もし育種ピラミッドの頂点で行われるの
であれば潜在的に極めて価値のある、この動物の除去は、その特定の動物群の他
の特性の改良の速度を不必要に低下させる可能性がある。他の結果としては、遺
伝的多様性の一般的喪失及び未だ発見されていない価値を持ちうる問題の遺伝子
座の対立遺伝子の喪失が挙げられる。絶対的に必要な場所の対立遺伝子のみを排
除することが必須である。

【０００８】 ゲノムＤＮＡのさらなる配列分析により、ＫＩＴ２のイントロン１７における
最初のヌクレオチドの突然変異がこのＫＩＴ遺伝子のこの特定のコピーから転写
されたＲＮＡのスプライシングに欠陥を生じさせることが明らかにされた。幾つ
かの品種のブタを用いる実験で、この突然変異はＩ及びＩ^* 対立遺伝子の存在と
完全な一致を示したが、ｉ及びＩ^P 対立遺伝子では見出されなかった。

【０００９】 真核遺伝子の大部分はコーディング（エキソン）領域及び介在している非コー
ディイグ（イントロン）領域の両方から構成されている。これらの配列の後者は
スプライシングとして知られている高度に正確な開裂及び連結反応により大きな
前−ｍＲＮＡから除去される。その結果はイントロン配列を欠いている成熟ｍＲ
ＮＡ転写物であり、それは翻訳のため細胞質に移送される。真核遺伝子のスプラ
イシングは二工程手順である蓋然性が高い。第一に、前ｍＲＮＡが５’（供与体
）スプライス部位で開裂し、続いて３’（受容体）スプライス部位で開裂する。
第二の工程はスプライスされたエキソンが再結合して介在しているイントロンを
排除する結果を生ずる工程を含む。したがって、スプライシングはこの開裂反応
及び連結反応の精度に決定的に左右される。この精度は５’及び３’エキソン／
イントロン境界にそれぞれ存在するほとんど完全に変化しないＧＴ及びＡＧジヌ
クレオチドに依存しているようにみえる。これらのジヌクレオチド及びしばしば
高度に保存されている周囲の配列はスプライス部位として知られ、そして開裂反
応及び連結反応を行うために必要なタンパク質因子と結合するのに役立つ。

【００１０】 スプライス部位内で起こる突然変異の結果は、生成する成熟ｍＲＮＡの量の減
少及び／又はその代わりのものとしての周辺の正しくないスプライス部位の利用
となりうる。その結果は付加的なイントロン配列を含むかまたはコーディング配
列の一部を欠くｍＲＮＡの生産である。突然変異が５’（供与体）スプライス部
位内で起こりそしてタンパク質因子の結合を阻害するときは、そのエキソンはも
はやそのようなものとして認識されず、その近辺のイントロンと共に削除される
。これは「エキソン・スキッピング」と呼ばれる（クーパー及びクローザックに
よる概説、1994 Human Gene Mutation, Bios Scientific Publishers, Oxford,
UK, 1994) 。

【００１１】 ここに同定された突然変異では、エキソン１７／イントロン１７境界領域にあ
る保存されたＧＴ対のこのＧがＡに変えられる。タンパク質に翻訳されるメッセ
ンジャーＲＮＡ中に変更があるということ、そしてその変化の存在が白色／斑点
表現型と相関しているということは、これが単なるリンクしたマーカーであると
いうよりも機能的な突然変異であることを示唆する。このスプライス変異体は、
成熟タンパク質中の４１個のアミノ酸が失われているので欠陥タンパク質を生ず
るものと予想される。したがって、本発明者らは、このスプライス突然変異がＩ
とＩ^P の間の相違の原因となる突然変異であると仮定する。Ｉ遺伝子座における
対立遺伝子間の分子的相違に関する本発明者らの現在の知識は表１に要約してあ
る。結論的には、本発明者らは二つの機能的に重要な突然変異を同定した。一つ
はＩ^P 、Ｉ^* 及びＩ中に存在する遺伝子重複であり、これは独力で斑点表現型を
惹起するようにみえる。この表現型効果に対する確かな理由は知られていないが
、マウスからの比較データに基づいて、ＫＩＴ遺伝子の重複したコピーが遺伝子
発現に欠陥を与え、これが今度はメラノサイトの移動に影響を与えるものと推測
することができる。このことは、ＤＮＡ多型性と特性それ自体の間の繋がりの切
断があり得ないという点で特に価値がある。これは、従来可能であったよりも有
意に大きな程度にまで、被毛色決定に関してＤＮＡ多型性の存在とこの動物の遺
伝子型の決定のためのある範囲のアッセイ法をわれわれが開発することを可能と
したのである。第二の突然変異は、優性な白色（Ｉ及びＩ^* ）対立遺伝子と関連
するＫＩＴコピーの一つで生ずるスプライス突然変異である。ＫＩＴタンパク質
の先端切断型の発現はＫＩＴ機能のより重大な欠損そして被毛色に対するより重
大な影響を惹き起こすと予想される。

【００１２】

【表１】

【００１３】 これらの二つの機能的に重要な突然変異に加えて、国際特許出願番号ＰＣＴ／
ＧＢ９６／０１７９４に記述されているように、Ｉ遺伝子座では、ＫＩＴ遺伝子
の既知の表現型効果を持たない突然変異、すなわちイントロン１８における４塩
基対の欠失が報告された。

【００１４】 こうして、第１の側面では本発明はブタの被毛色遺伝子型を決定する方法であ
って、 （ａ）ブタの核酸の試料を取得する工程、及び （ｂ）ＫＩＴ遺伝子の一つ以上のエキソン／イントロン・スプライス部位に突然
変異が存在するか／存在しないかを決定するため、工程（ａ）で得た核酸を分析
する工程、を含む方法を提供する。

【００１５】 特に、この方法はエキソン１７／イントロン１７境界に、例えば、保存された
ＧＴ対のＧがＡで置換される突然変異が存在するか／存在しないかを決定する。

【００１６】 ラージホワイト品種（Ｉ／Ｉ）の動物におけるＫＩＴｍＲＮＡのエキソン１６
〜１９領域の逆転写酵素に基づくポリメラーゼ連鎖分析（ＲＴ−ＰＣＲ）及びハ
ンプシャー動物（ｉ／ｉ）で転写されたものとの比較から、前者の動物では余分
の分子種が明らかにされた。両品種のＲＴ−ＰＣＲ分析は４２４塩基対の長さを
持つ生産物断片を生じた。これは両方のタイプの動物共ＫＩＴ遺伝子のこの領域
に対応する領域を含むＫＩＴｍＲＮＡ転写物を含んでいたことを示すものである
。しかしながら、Ｉ／Ｉ動物はさらに、３０１塩基対のＲＴ−ＰＣＲ生産物を生
じた。これはエキソン１６〜１９ＤＮＡ配列（実施例１を参照）の完全な転写を
含んでいなかったｍＲＮＡ種の存在を示している。これらの二つの転写物はこの
Ｉ対立遺伝子と関連するＫＩＴ遺伝子の別々の重複コピーから由来することが明
らかにされた。ＫＩＴエキソン１７／イントロン１７境界をカバーする配列決定
から、このＩ対立遺伝子と関連するＫＩＴ遺伝子のこの二つの重複コピーに存在
するイントロン境界配列に相違があることが明らかにされた（実施例２参照）。
これらの配列を以下に示す。

【００１７】 対立遺伝子 ＫＩＴ遺伝子 エキソン１７ イントロン１７ ｉ ＫＩＴ１ ‥‥ＡＡＣ ＧＴＧ‥‥ Ｉ^P ＫＩＴ１ ‥‥ＡＡＣ ＧＴＧ‥‥ Ｉ^P ＫＩＴ２ ‥‥ＡＡＣ ＧＴＧ‥‥ Ｉ ＫＩＴ１ ‥‥ＡＡＣ ＧＴＧ‥‥ Ｉ ＫＩＴ２ ‥‥ＡＡＣ ＡＴＧ‥‥

【００１８】 ＧＴ対からＡＴ対への５’イントロンスプライス部位のこの変化は前ｍＲＮＡ
のスプライシングに影響を与え、そしてＩ−ＫＩＴ２配列から転写されるｍＲＮ
Ａ由来のエキソン１７の全体の喪失を生ずる。この結果、機能及び表現型に関連
する変更を伴った修飾されたＫＩＴタンパク質が生ずることになる。配列の多型
性に基づいて、特定動物が保持する優性白色遺伝子座の対立遺伝子を決定するた
めの迅速な試験法を開発することができる。

【００１９】 一つの態様では、このような試験は、問題の動物に由来するゲノムＤＮＡを鋳
型として用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりこの領域を増幅する工程
を含む。ヌクレオチド配列ＣＡＴＧは制限酵素ＮｌａIII の認識部位を含んでい
る。この配列は接合位置におけるＩ−ＫＩＴ２配列中に存在するだけであり、し
たがって、この酵素又は適当な認識部位を持つ他の制限酵素を用いる増幅生産物
の消化によりこの二つの対立遺伝子から増幅されたＤＮＡ分子を区別することが
できる。

【００２０】 このような試験に使用するためのゲノムＤＮＡは、問題の動物由来の組織又は
産物から、利用可能な広範囲の方法により調製することができる。エキソン１７
／イントロン１７境界領域を含むＫＩＴ遺伝子の１７５塩基対断片は、下記のプ
ライマー対、すなわち ＫＩＴ２１（５’−ＧＴＡ ＴＴＣ ＡＣＡ ＧＡＧ ＡＣＴ ＴＧＧ ＣＧＧ
Ｃ−３’）、及び ＫＩＴ３５（５’−ＡＡＡ ＣＣＴ ＧＣＡ ＡＧＧ ＡＡＡ ＡＴＣ ＣＴＴ
ＣＡＣ ＧＧ−３’）、 を用いてブタゲノムＤＮＡから増幅することができる。

【００２１】 ＰＣＲ−ＲＦＬＰ試験でこのようなプライマーを使用すると、ＮｌａIII で消
化する前に１７５塩基対の断片が生ずる。イントロン１７（Ｉ−ＫＩＴ１タイプ
の配列）のヌクレオチド位置１にＧが存在する対立遺伝子では、この断片の末端
から４１塩基対の場所にＮｌａIII 開裂部位が一つだけ存在する。この部位はＫ
ＩＴ配列のすべての変異体に存在する。こうして、ｉ及びＩ^P 対立遺伝子から得
られた１７５塩基対断片を消化すると１３４塩基対と４１塩基対の二つの断片が
生ずる。ＩとＩ^* に存在するＩ−ＫＩＴ２配列のように、そのＧがＡに突然変異
すると、ＮｌａIII 開裂部位がさらに生じ、したがって消化すると８０塩基対と
５４塩基対と４１塩基対という生成物が生ずる（図３、実施例２を参照）。ブタ
のゲノムのこの領域の配列から、ＰＣＲプライマーとして適当な他の幾つかのオ
リゴヌクレオチドを容易に誘導することができるであろう。このようなＰＣＲ−
ＲＦＬＰ試験の一例は実施例３に示してある。上記のＰＣＲ−ＲＦＬＰ試験から
得られるであろう結果は以下に示すようなものである。

【００２２】 遺伝子型 断片のサイズ 断片のサイズ 134 + 41塩基対 80 + 54 + 41塩基対 Ｉ／Ｉ あり あり Ｉ／Ｉ^P あり あり Ｉ／ｉ あり あり Ｉ^P ／Ｉ^P あり なし Ｉ^P ／ｉ あり なし ｉ／ｉ あり なし Ｉ^* ／Ｉ あり あり Ｉ^* ／Ｉ^* あり あり ｉ／Ｉ^* あり あり Ｉ^* ／Ｉ^P あり あり

【００２３】 こうして、単に制限生産物を分析することにより、ある種の遺伝子型を区別す
ることができる。しかしながら、この試験のこの第一の配置で区別することがで
きない他の遺伝子型がある。さらなる改良により、各断片の量を計算することが
できるような方法でこの試験を行うことができる。バンドそれぞれの定量を可能
とする装置上で電気泳動を行うことにより、使用したゲノムＤＮＡ試料中の二つ
の形の鋳型の割合を求めることができる。このような装置の例としては、パーキ
ン・エルマー・アプライド・バイオシステムズ３７３及び３７７ＤＮＡシーケン
シング・システムが挙げられる。このタイプの装置の適用例は実施例４に示して
ある。二つの異なる配列由来の生産物の相対量を測定することができる装置であ
ればすべてこのような試験に同様に適用することができる。このような試験から
予想される結果を以下に示す。

【００２４】 遺伝子型 正常なＫＩＴ スプライス突然変異 正常／スプライス 配列コピー ＫＩＴコピー 突然変異の比 Ｉ／Ｉ ２ ２ １ Ｉ／Ｉ^P ３ １ ３ Ｉ／Ｉ^* ２ ２ １ Ｉ／ｉ ２ １ ２ Ｉ^P ／Ｉ^P ４ ０ ０ Ｉ^P ／Ｉ^* ３ １ ３ Ｉ^P ／ｉ ３ ０ ０ Ｉ^* ／ｉ ２ １ ２ Ｉ^* ／Ｉ^* ２ ２ １ ｉ／ｉ ２ ０ ０

【００２５】 こうして、このような試験を用いて、自分自身又はその子孫に非−白色の被毛
色（ｉ又はＩ^P ）を示させるかも知れない優性白色の対立遺伝子を保持するすべ
ての動物を、１以外の比を与えるものとして同定することができる。選択された
血統の要求及び誘導に応じて、動物の適当なサブセットを選ぶことができよう。
例えば、対立遺伝子Ｉ及びｉのみを保持する交配誘導動物では、ｉを保持するど
の白色個体（Ｉ／Ｉ又はＩ／ｉ）も、Ｉ／Ｉ動物に対する１とは対照的にこの試
験において２の比を持つであろうから、同定することができるであろう。対立遺
伝子ＩとＩ^* の区別は先に出願した特許公開ＷＯ９７／０５２７８に記述したよ
うに４塩基対の欠失に基づいて行うことができる。

【００２６】 この分野の専門家がスプライス突然変異を含む対立遺伝子と正常な配列を含む
対立遺伝子を識別することができる色々な技法がある。

【００２７】 動物の遺伝的構成の分析は幾つかの異なる起源の材料に基づいてなされ得る。
これらには、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ及びＫＩＴタンパク質それ自体が含まれる。
より間接的なアッセイを創りだすために測定することができる、他のタンパク質
、代謝物及びＲＮＡ種のレベルや性質に対する効果もありうる。

【００２８】 ＤＮＡは試験への幾つかのアプローチのための基礎として使用することもでき
よう。一つのアプローチはポリメラーゼ連鎖反応を用いる多型性を含むＤＮＡ領
域の増幅によるものである。これは、ついで、生産物の分析の幾つかの形と連結
されるであろう。電気泳動に基づく技法の例としては、一本鎖ＤＮＡ高次構造多
型（ＳＳＣＰ）、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）及びＰＣＲ生産物のＤＮＡ配列決
定又は直接的ゲノム配列決定が挙げられる。代わりに用いられうる他のＰＣＲに
基づく技法としては、パーキン・エルマー・タックマン・システムズ、シングル
・ヌクレオチド・ポリオモルフィック・エクステンション（ＳＮｕＰＥ）及びミ
ニシークェンシングが挙げられる。この領域からのＰＣＲ生産物はこの遺伝子座
における対立遺伝子の識別のためのハイブリダイゼーションに基づくアプローチ
にも適用できるかも知れない。ハイブリダイゼーション法は、対立遺伝子特異的
オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ断片又はタンパク質核酸（ＰＮＡ）のプロ
ーブでゲノムＤＮＡのサザン移転を探索することを含むかも知れない。適用の他
のストラテジーには、ゲノムＤＮＡ又はＰＣＲ生産物（特異的ゲノム又はゲノム
全体）のオリゴヌクレオチド配列、おそらくは「ＤＮＡチップ」の形での配列に
対するハイブリダイゼーションが含まれる。このような配列は、対立遺伝子特異
的な仕方で問題の遺伝子座由来のＤＮＡ又はＲＮＡと結合することができる如何
なる試薬から構成することもできよう。分析のさらに有用な方法は、オリゴヌク
レオチド連結アッセイ及びリガーゼ連鎖反応をも含む。点突然変異を検出する方
法についての総説としては、ランデグレン、1996、突然変異検出のための実験室
プロトコル、オックスフォード大学プレス、オックスフォードを参照のこと。

【００２９】 問題の遺伝子から生産されたＲＮＡに対する幾つかの効果が既に観察されそし
て将来観察されるであろう。この遺伝子の突然変異型と正常型の間のこのような
相違はすべて遺伝子型の決定のための有用な標的であり、そして多くの種類の方
法が当技術分野の熟練者にとって利用可能である。観察されうる変化及び分析の
方法は次のようなものである。ＲＮＡ転写物のサイズ、プロセッシングの速度、
安定性及び量の変化は、オリゴヌクレオチド又はＤＮＡ断片配列へのハイブリダ
イゼーションなどのＤＮＡ分析について上述した幾つかの技法並びにノーザンブ
ロッティング及びＲＴ−ＰＣＲなどの広く用いられている技法により測定するこ
とができよう。

【００３０】 使用することができる別のアプローチはエキソン／イントロン境界における変
更の有無と密接に関連するリンクした遺伝子多型性を用いることである。このよ
うな多型性はＫＩＴ遺伝子それ自体でも又はＫＩＴにリンクした染色体領域でも
起こりうる。重複の有無と完全に関連している単一連結マーカー又は部分的連結
を示すマーカーとの組合せを用いることにより、高度な情報を与える試験を開発
することができる。例えば、ＳＳＣＰ（一本鎖ＤＮＡ高次構造多型）法はこのよ
うな多型性を開発するために用いることができる。この方法の原理は、ＰＣＲに
よって生産された二本鎖ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡに変性され、次いで非−変性ゲル
電気泳動により分離されるというものである。非−変性条件下では、一本鎖ＤＮ
Ａは鎖内相互作用により二次構造を形成するが、ある割合の一本鎖ＤＮＡは再生
され二本鎖ＤＮＡを形成する。二つのタイプの多型性がこの方法により明らかに
されうる。第一に、二つの対立遺伝子間のヌクレオチド配列の相違は一本鎖ＤＮ
Ａの二次構造に影響を与え、それは電気泳動の際の移動速度の差として現れる。
第二に、ヌクレオチド配列の相違は、しばしばヘテロ二本鎖ＤＮＡ（ヘテロ二本
鎖とは異なる対立遺伝子を表す二つの一本鎖分子により形成される二本鎖ＤＮＡ
分子である）の移動性に影響を与える。

【００３１】 遺伝子マーカーと特定の性質の原因となる遺伝子の間の関連は遺伝子組換えに
より破壊することができる。こうして、マーカーと問題の遺伝子の間の物理的距
離が短ければ短い程、組換えがそれらを分離する蓋然性は小さくなることになる
。

【００３２】 特定の性質と関連することが既に証明されている特定の遺伝子（例えば、本出
願で論じているＫＩＴ遺伝子）と関連することが知られているＤＮＡマーカーの
対立遺伝子と代わりのＤＮＡマーカーの特定の対立遺伝子との間の連結を確立す
ることも可能である。こうして、現状では、ＫＩＴ遺伝子を例にとれば、択一的
な染色体８マーカーの特定の対立遺伝子の選択を通じ、ＫＩＴ遺伝子と関連する
マーカーの対立遺伝子を選択することにより、少なくとも短期間のうちに、特定
の被毛色を持つブタを選択することが可能となるであろう。ブタ染色体８上のＫ
ＩＴ遺伝子に連結することが知られているこのようなマーカーの例としては、Ｋ
ＩＴ遺伝子それ自体又は血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦＲＡ）のα−サブユニッ
ト及びアルブミンに密接に関連する遺伝子の遺伝子多型性が挙げられる。

【００３３】 ＫＩＴ遺伝子と関連する特定の遺伝子マーカーはミクロサテライトである。こ
れらは約５０，０００塩基毎にゲノムの周辺に本来的に無差別に（ハプロイドゲ
ノム当たり約６０，０００のミクロサテライト）現れる４、３、又は、より普通
には２ヌクレオチドの単純配列反復である。複製の間のＤＮＡポリメラーゼのど
もり（stuttering) や組換えの間の不均等な交差が反復単位の喪失又は形成を生
ずるものと考えられる。このことは、ミクロサテライトが通常多型性でありそし
て幾つかの反復長対立遺伝子を持つことができることを意味する。

【００３４】 リンクしたミクロサテライト配列の例としては、Ｓ００８６（エレグレンら、
Genomics, 16: 431-439 (1993)) 、Ｓ００１７（コッピーターズら、Animal Gen
etics 24: 163-170 (1993)) 、Ｓｗ５２７、Ｓｗｒ７５０及びＳＷ９１６（ロー
ラーら、Genetics, 136: 231-245 (1994))が挙げられる。上記のマーカーを用い
て、あるいは実際ブタ染色体８上の他のリンクしたマーカーを用いて、被毛色に
リンクしたＫＩＴ遺伝子の対立遺伝子を間接的に選択することが可能となるであ
ろう。

【００３５】 このＫＩＴタンパク質のレベルの変化は、ＥＬＩＳＡシステムで又はウエスタ
ン・ブロット上で試料に対する特異的抗体を用いることによるか又はこのタンパ
ク質の活性を測定するための種々の生化学的技法の使用によるかして測定するこ
とができよう。このような試験は遺伝子座における特異的対立遺伝子の存在によ
りそのレベル又は性質が変更される他のタンパク質又は代謝物にも適用できるで
あろう。特異的対立遺伝子の存在に起因する異なるタンパク質構造は構造特異的
抗体の使用により同定することができよう。ＤＮＡ及びＲＮＡに基づく方法に関
しては、これらのタンパク質の方法の全てが定量的な方法で適用することができ
、したがって完全な識別能力を可能とするであろう。

【００３６】 本明細書に記述された多型性の特異的分析そして既に報告された他の多型性の
組合せ分析を可能とする試薬そして特許公開ＷＯ９７／０５２７８の主題のため
のキットを製造することができよう。

【００３７】 本発明は以下の実施例を参照して詳細に説明する。これらは本発明を如何なる
意味でも制限するものと理解すべきでない。

【００３８】 実施例１ブタＫＩＴエキソン16〜19のＲＴ−ＰＣＲ i 血液試料からのｍＲＮＡの精製 新鮮な血液試料は、着色したハンプシャーブタ及びラージホワイトブタからク
エン酸塩チューブに回収した。白血球は、フィコール（Ficoll）100（ファルマ シア・バイオテク社）を用いて5 mlの血液から単離した。続いて、白血球からの
ｍＲＮＡの単離は、クイックプレップ・マイクロｍＲＮＡ精製キット（ファルマ
シア・バイオテク社）を用いて実施した。ｍＲＮＡは、逆転写酵素（ＲＴ）−Ｐ
ＣＲにおける使用前までの1ヶ月間−70℃のエタノール下で沈殿物として保存し た。

【００３９】 ii ＫＩＴ エキソン16〜19のＲＴ−ＰＣＲ 第一鎖cDNA合成は、ファースト−ストランドｃＤＮＡ合成キット（ファルマシ
ア・バイオテク社）を用いて行い、約100 ngのｍＲＮＡを15μlの全容量で0.1 μgのpd（N6）によりランダムプライミングした。完了した２μlの第一ｃＤＮＡ
鎖反応物を、次に、各10 pmolのマウス／ヒト由来プライマーＫＩＴ１Ｆ及びＫ ＩＴ７Ｒ（それぞれ５’-TCR TAC ATA GAA AGA GAY GTG ACT C及び5'-AGC CTT C
CT TGA TCA TCT TGT AG、モラー（Moller）ら、1996年、前出）、1.2 μlの10ｘ
ＰＣＲ緩衝液（10mMトリス−塩酸、pH 8.3、50 mM ＫＣｌ）、ならびにホットス
タートＰＣＲを行うために25℃で５分間等量のタックスタート抗体（クローンテ
ック社）でインキュベートした0.5 Uのアンプリタックポリメーラーゼ（パーキ ン−エルマー社）を含む10μlのＰＣＲ混合物を添加することにより、12μlのＰ
ＣＲ反応に直接使用した。この反応物は、20μlのミネラルオイルで覆い、94℃1
分間、55〜48℃1分間（最初の7サイクルは1サイクルにつき1度の温度低下、その
後、残りのサイクルは48℃）、及び72℃１分間で40サイクルでハイバイド・タッ
チダウン・マシン（ハイバイド社）でサーモサイクリングした。ＰＣＲ後、各試
料に2 μlのローディング染料を添加し、次いで、4％アガロースゲル（ヌシーブ
／シーケム，３：１、ＦＭＣ，バイオプロダクト社）にかけ、100 Vで80分間電 気泳動した。産物は、エチジウムブロマイド染色及びUV照射により可視化した。

【００４０】 iii ＲＴ−ＰＣＲ産物のクローニング及び配列決定 ＫＩＴエキソン16〜19を示すＲＴ−ＰＣＲ産物は、キアイーエックスゲル抽出
キット（キアーゲン社）を用いて２％アガロースゲルから抽出により精製し、シ
ュアクローン連結キット（ファルマシアバイオテク社）を用いてｐＵＣ１８ベク
ターにクローニングした。プラスミドは、キアフィルター・プラスミド・ミディ
・キット（キアーゲン社）を用いて単離した。クローン化されたプラスミド挿入
物は染料プライマー化学を用いて配列決定した。各サイクリング反応物は、プラ
スミド鋳型ＤＮＡ及びABIプリズムプロトコルP／N402113（パーキンエルマー社 ）に説明されているように蛍光標識されたＭ１３順方向又は逆方向プライマーを
含む調製済の反応混合物を用いて調製された。サイクリング及び試料のプーリン
グは、キャタリスト800モレキュラーバイオロジーワークステーション（ABI社）
を用いて機器使用者マニュアル（書類番号903877、パーキンエルマー社）に従っ
て行った。得られる伸長産物は、精製し、ローディングし、ならびに機器プロト
コルP／N402078（パーキンエルマー社）により説明されているように377ABIプリ
ズムシークェンサーを用いて分析した。

【００４１】 iv 結果及び論考 ＫＩＴのｃＤＮＡエキソン16〜19を含む424 bpの断片が、全てのブタから増幅
された。ハンプシャーブタは付加的産物を全く示さなかったが、一方、ラージホ
ワイトブタ（試験された8匹）は全て先端の欠けた301 bpのｃＤＮＡ断片を示し た（図２）。配列分析から、424 bpの断片は前記２品種で同一であるのに対して
、301 bpの断片からはエキソン17（123 bp）全体が欠けていることが明らかにな
った。これらの２産物の相対量に関する個体間の明白な差異は、ＫＩＴ遺伝子配
列のコピー数の相違を含む異なる遺伝子型、ｍＲＮＡ発現レベルにおける個体間
の差異、又はランダムＲＴ−ＰＣＲの結果のいずれかにより惹起されうる。

【００４２】 ラージホワイトブタに存在する上方の２断片は、301 bp及び424 bpの断片間の
ヘテロ二本鎖を表している（図２）。これは、424 bp及び301 bpのホモ二本鎖を
プーリングし、次いで熱変性させ、25℃に冷却することによりこれらの遅移動断
片を生じさせたという実験により証明された。さらに、ラージホワイトブタの下
方のヘテロ二本鎖画分のクローニングにより、これら二つのホモ二本鎖のいずれ
かに対応する挿入長を有するクローンを得た。

【００４３】 実施例２ＫＩＴエキソン17−イントロン17（５’スプライス部位）のＰＣＲ増幅及び配列 決定 i ＤＮＡ配列決定用鋳型を調製するためのＰＣＲ ＫＩＴ遺伝子のエキソン17とイントロン17の間の境界を含む175 bpの領域は、
順方向プライマーＫＩＴ２１（5'-GTA TTC ACA GAG ACT TGG CGG C-3'）及び逆 方向プライマーＫＩＴ３５（5'-AAA CCT GCA AGG AAA ATC CTT CAC GG-3'）を用
いて配列分析のために増幅した。ＰＣＲは、ＤＮＡサーマルサイクラー（パーキ
ンエルマー9600）上、25 ngのゲノムＤＮＡ、1.0 mM MgCl₂、50 mM KCl、pH 8.3
の10 mM トリス−塩酸、200 μM dNTPs、0.5 Uのアンプリタック・ゴールド（パ
ーキンエルマー社）及び10 pmolのＫＩＴ２１及びＫＩＴ３５の両プライマーを 含む全容量20μlでで行った。アンプリタック・ゴールドを活性化するために、 最初の熱変性は94℃で10分間、続いて94℃で45秒、55℃で45秒、及び72℃で45秒
からそれぞれ構成される32サイクルを行った。最終の伸長は72℃で7分間続けた 。PCR産物はシュアクローン連結キット（ファルマシアバイオテク社）を用いてp
UC18ベクターにクローニングした。

【００４４】 ii プラスミドＤＮＡの調製 プラスミドDNAは、ジェットスター・プラスミド・ミディ・キット（ジェノメ ッド社）を用いて細菌の一晩培養物から精製し、得られたDNAは150 ng/μlに希 釈した。

【００４５】 iii プラスミドＤＮＡの配列決定 ＤＮＡは実施例１の節iiiのように配列決定した。

【００４６】 iv 結果 ＫＩＴ 遺伝子のエキソン17及びイントロン17由来のDNA配列の一部を決定し、
これらの三個の対立遺伝子のそれぞれを持つ動物間で比較した。図3は、対立遺 伝子Ｉがイントロン17の部位１でスプライス部位突然変異を保有することを示す
。このＧからＡへの塩基置換は、各染色体上で保有される二つの遺伝子コピーの
一つに存在する。この塩基置換は、5‘エキソン／イントロン境界を特徴付ける 不変のＧＴジヌクレオチド中に存在する。対立遺伝子Ｉ^Pの分析は、スプライス 部位の突然変異が正常遺伝子（ＫＩＴ1 ）又はこの遺伝子の重複コピー（ＫＩＴ
２）のどちらにも存在しないことを示した。本発明者らは、スプライス部位の突
然変異が対立遺伝子Ｉにユニークであり、したがってI-ＫＩＴ2 配列を識別する
ことが可能になることを見出した。

【００４７】 実施例3ＰＣＲ・ＲＦＬＰを用いてスプライス部位突然変異の存在を試験する GからAへのスプライス部位突然変異の存在を容易に試験するために、制限エン
ドヌクレアーゼNlaIII（CATG）がイントロン17の部位１で同定された点置換を活
用するために用いられた（図３）。ＫＩＴ から増幅された断片におけるNlaIII 認識部位及び予期された制限産物が図４A及び４Bにそれぞれ図示してある。

【００４８】 i ＲＦＬＰ試験用のＤＮＡ調製 ＤＮＡは細胞核を含む任意の組織源、たとえば、白血球細胞、毛包、耳切痕、
及び筋肉から調製することができる。本明細書における手法は血液細胞調製物に
関する。他の組織は、材料を直接K緩衝液に懸濁し、次いで該血液手法の同段階 から続行させることにより同様に処理することができる。本明細書で概説される
方法は、ＰＣＲ増幅に適する粗ＤＮＡを含む細胞溶解液を調製する。しかしなが
ら、精製ＤＮＡ又は粗ＤＮＡの調製方法はいずれも等しく有効であるはずである
。

【００４９】 血液は凝固を防ぐために50 mM、pH 8.0のEDTA中に回収された。50μlの血液は
小さな微小遠心チューブ（0.5 mlのエッペンドルフ又は同等物）に分注した。赤
血球細胞（ヘム基はＰＣＲを阻害する）を溶解するために450 μlのTE緩衝液を 添加し、混合物を2秒間ボルテックスで攪拌した。続いて、無傷の白血球細胞及 び残存する赤血球細胞は微小遠心機で13,000 gで12秒間遠心分離した。この上清
は低圧真空ポンプシステムを用いて穏やかな吸引により除去した。次いで、前記
のように遠心分離により回収された残存する赤血球細胞及び白血球細胞を溶解す
るため、さらに450 μlのTE緩衝液を添加した。ペレットに少しでも赤色が残っ ていた場合は、ペレットが白くなるまでこの工程を反復した。ペレット化された
白血球細胞から上清の最後の一滴を除去した後、プロテイナーゼKを含む100 μl
のK緩衝液を添加し、その混合物を55度Cで2時間インキュベートした。続いて、 この混合物を95〜100度Cまで8分間加熱し、DNA溶解液を必要になるまで−20℃で
保存した。

【００５０】 試薬 T.E.緩衝液： 10 mM トリス−塩酸 pH 8.0 1 mM EDTA K緩衝液： 50 mM KCl 10 mM トリス−塩酸 pH 8.3 2.5 mM MgCl₂ 0.5%トゥィーン20

【００５１】 ii 制限酵素消化及び電気泳動 PCR増幅産物は長さ175 bpである。イントロン17の部位１における多型性を試 験するために、消化反応液は下記のように組み立てた。 3.0 μl のＰＣＲ増幅されたＤＮＡ 1.0μl の 10xＮＥ緩衝液４ 0.1μl のＢＳＡ（100 μg/ml） 0.1μl の NlaIII (10 U/μl) 5.8 μl の dH₂O （1xＮＥ緩衝液４（ニューイングランドバイオラブ社）は、50 mMの酢酸カリウ ム、20 mMのトリス酢酸塩、10 mMの酢酸マグネシウム及び1 mMのDTTを含む。）3
7℃で90分間のインキュベートした後、各10μlの反応容量に2 μlのローディン グ染料を添加し、この混合物を0.5xＴＢＥ（44.5 mM トリス pH 8.0、44.5 mM ホウ酸及び0.5 mM EDTA）中の8％未変性ポリアクリルアミドゲル（プロトゲル、
37.5：1 アクリルアミド：ビスアクリルアミド、ナショナルダイアグノスティッ
クス社、アトランタ）上に載せ、垂直スラブユニット（SE600ヘファー・サイエ ンティフィック・インスツルメント社）中で200 Vで３時間電気泳動した。産物 はエチジウムブロマイド染色により可視化した。

【００５２】 iii 結果 ＰＣＲ・ＲＦＬＰプロトコルは、置換が制限エンドヌクレアーゼNlaIIIの認識
部位内で起きるので、スプライス部位突然変異の存在を試験するために設計され
た。図４Ｂは、ＫＩＴ イントロン17の部位１でのGからAへの塩基置換の存在に より175 bpのDNA断片内における二つのNlaIII認識部位のそれぞれで結果的に制 限されることを図示する。電気泳動後、この制限は80 bp、54 bp及び41 bpの大 きさの断片を生じる。しかしながら、スプライス部位突然変異がないと、NlaIII
とのインキュベーションで認識部位１のみでの消化が生じる。電気泳動後、この
場合は134 bp及び41 bpの断片を生じる。不変のNlaIII認識部位１は、完全な消 化が起きたことを保証するための内部コントロールとして役に立つ。このＰＣＲ
・ＲＦＬＰ分析の結果は図４Ｃに図示される。スプライス部位突然変異を保有す
るクローン（レーン２）か又は正常なスプライス部位配列を保有するクローン（
レーン3）から増幅された断片について分析を行った。レーン４は、着色された 動物のゲノムＤＮＡから増幅されたＤＮＡを使用した場合の分析結果を示す。レ
ーン５は白色動物を試験して得られたバンドを示す。試験は7つの異なる品種の ブタから121個体を分析するために行われた。スプライス部位突然変異は優性の 白色表現型（I/-又はI*/i）をもつ97動物でのみ見出され、24個体の着色（I^P又 はi）例のいずれにも見出されなかった（表２）。I及びI*がスプライス部位突然
変異を保有するための唯一の対立遺伝子であるという点において、それらがユニ
ークであることをこの分析は確認する。

【００５３】

【表２】

【００５４】 実施例４正常ＫＩＴ及びスプライス突然変異ＫＩＴ (イントロン17ntI^G→^A)の定量 スプライス部位突然変異がIの重複領域の1つにのみ存在し、I^Pの重複領域には
存在しないので、多様な遺伝子型が表3に記載されるような属性を有することを 予想することができる。

【００５５】

【表３】

【００５６】 対立遺伝子Ｉの優性により、表２の三つの遺伝子型が白色動物によって保有さ
れ、したがってこれらを表現型の特徴によって同定することはできない。正常Ｋ
ＩＴ遺伝子及びスプライス突然突然変異ＫＩＴ遺伝子の相対量の定量により、こ
れら二つの間の比が計算できるため個々の動物の遺伝子型を予測することができ
る。これは、ＮｌａIII 消化に続いて二つのＤＮＡ断片の定量により達成された
。正常にスプライスされたＫＩＴ遺伝子に対応する１３４ｂｐの断片及びスプラ
イス突然変異ＫＩＴに対応する５４ｂｐの断片の量は、電気泳動に続いてジーン
スキャン・ソフトウエアを用いて測定された。

【００５７】 i 定量化用DNAを調製するためのＰＣＲ 実施例２の節iに記述したように行った。逆方向プライマーＫＩＴ３５は５’ 末端においてABI蛍光染料FAMで標識する。 ii 制限酵素消化 実施例２の節iiに記述したように行った。 iii ＤＮＡ断片の電気泳動及び定量 消化に続き、0.5 μl容量の反応物を、2.5 μlの脱イオン化ホルムアミド、0.
5 μlのGS350 ＤＮＡ標準（ABI）及び0.4 μlのブルーデキストラン溶液と混合 した後、90℃で2分間加熱し、氷上で急速に冷却した。次いで、この混合液３μl
を377ABIプリズム・シークェンサーにかけ、DNA断片を700 V、40 mA、32 Wで2時
間1xTBE緩衝液中、６％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ＫＩＴの正常形 態及びスプライス突然変異形態の両方に対応する断片のピーク面積をジーンスキ
ャン（ABI）ソフトウェアを用いて定量した。

【００５８】 iv 比の計算 各試料の比の値を計算するために、134 bpの断片(正常ＫＩＴ) のピーク面積 値を54 bpの断片（スプライス突然変異ＫＩＴ）のピーク面積値の2倍で割った。

【００５９】 v 結果 スウェーデンの野生ブタ／ラージホワイトの交配系統由来の動物について分析
を行い、連結マーカーを用いる従来の品種改良実験によりそれらのIでの遺伝子 型を決定した。図５及び表4は、I/I（予想比1：1）、I/i（予想比２：１）、及 びI/I^P（予想比3：1）の三つの遺伝子型クラスのそれぞれに由来する動物につい
て計算された突然変異ＫＩＴに対する正常ＫＩＴの比を示す。結果は予想比の値
と完全に一致し、三つの遺伝子型クラスはこの方法を用いて識別することができ
ることを示す。

【００６０】

【表４】

【００６１】 図５は、二つの遺伝子型Ｉ／Ｉ及びＩ／Ｉ^P について計算された比の値の範囲
が重複しないことを示す。これにより、I^P対立遺伝子を保有する動物を同定でき
、異なるブタ品種内での対立遺伝子の頻度を決定できる。比の値は、56頭のラン
ドレース及び33頭のラージホワイト動物について算定した。その結果を図６に示
す。約３以上の比の値を有する７頭のランドレース及び３頭のラージホワイト個
体で明確な双峰分布が観察される。これは、それらがＩ^P対立遺伝子（遺伝子型I
/Ｉ^P）を保有するヘテロ接合体であることを示唆する。これは、Ｉ^Pがランドレ ース及びラージホワイト品種内でそれぞれ6.25％（7/112被試験染色体）及び4.5
％（3/66被試験染色体）の遺伝子頻度推定値を有することを意味する。

【００６２】 実施例５PE ABIタックマン化学を用いるブタＫＩＴスプライス突然変異の存在及び定量の ための分析 方法 i ＰＣＲ用鋳型ＤＮＡの調製 ＤＮＡは実施例３の節iのように調製された。 ii タックマン（登録商標）ＰＣＲ反応 タックマン（登録商標）ＰＣＲ反応液は表５に示すように組み立てた。

【００６３】

【表５】

【００６４】 使用したＰＣＲプライマーは下記のものであった。 ＫＩＴTM-Nest-F (5'-CTC CTT ACT CAT GGT CGA ATC ACA-3') 及び ＫＩＴTM-Nest-R (5'-CGG CTA AAA TGC ATG GTA TGG-3') 使用したタックマン（登録商標）プローブは、ＫＩＴTM-A FAM (5'-TCA AAG G
AA ACA TGA GTA CCC ACG CTC-3') 及びＫＩＴTM-G TET (5'-TCA AAG GAA ACG TG
A GTA CCC ACG C-3') であった。タックマン（登録商標）プローブは、パーキン
エルマー製で、標準クエンチング基TAMRAならびに上記のFAM及びTETで標識した 。使用された10xタックマン（登録商標）緩衝液A、アンプリタックゴールド（登
録商標）、アンプエラーゼN-グリコシラーゼ、NTP's、及び25 mM MgCl₂は、パー
キンエルマー社によって供給されるタックマン（登録商標）PCRコア試薬キット の一部であった。

【００６５】 次いで、この反応液をパーキンエルマーABIプリズム7700配列検出器にかけ、5
0℃で２分、95℃で10分、続いて95℃で15秒、62℃で60秒の40サイクルという温 度処理を用いて反応を行った。反応は、「スペクトル補償」機能を活性化した「
シングルレポーター」及び「リアルタイム」のオプションを用いて「配列検出器
V.1.6」ソフトウェアの制御下で行った。泳動の完了後、各試料の即時プロファ イルをABI7700上で調べ、極めて不規則なプロファイルを示す試料を確認し、除 去した。Ｆａｍ及びＴｅｔの両染料に対する閾値は、ＰＣＲの指数相の間に各染
料を遮断するように設定した。「配列検出器V.1.6」における計算の更新後、結 果をさらなる分析のためマイクロソフト・エクセルに移した。

【００６６】 iii 結果の分析 １サイクルのＰＣＲにより対立遺伝子特異的プローブ由来のクエンチング染料
の切断量が二倍になり、したがってシグナルが倍になるという理論的原理に基づ
いて、分析されたII及びIi遺伝子型からの閾値サイクル数が以下のようになると
予測されるであろう。

【００６７】

【表６】

【００６８】 理論的には、標的配列の等しいコピー数がII動物に存在するから、Ｘ及びＹと
して表されるＴＥＴ及びＦＡＭシグナルに対するＣｔは同じであるべきである。
しかしながら、これは、実際には、ハイブリダイゼーション及びこれら二つのプ
ローブの切断効率における差異ならびにこの二つの染料シグナル間の閾値サイク
ルの設定における変動により必ずしもこの通りになるわけではない。Ii動物にお
いてスプライス突然変異を含まないもの（Ｇ）との対比でスプライス突然変異を
含む配列（Ａ）の減少のため、すなわちII遺伝子型の１：１ではなく、２：１の
Ｇ：Ａ比のため、ＦＡＭシグナルは遺伝子型Ii動物におけるＴＥＴシグナルより
１サイクル遅く閾値に到達するはずである。試験された試料の実際の結果は表７
に示す。

【００６９】

【表７】

【００７０】 平均値前後の変動にもかかわらず、予測されるように、II動物と比較すると、
Ii動物においては、ＴＥＴシグナルとの対比で、閾値レベルに達するＦＡＭシグ
ナルの遅延（約２サイクル分）が有意に増大することが表７からみられる。これ
はIi遺伝子型の動物に存在するスプライス突然変異（Ａ）配列のコピー数の減少
を反映している。分散プロットにおける各試料のプロッティング（図７）は、二
つの遺伝子型の集団を示し、そのうちのIiクラスターが、ＦＡＭプローブに特異
的なＫＩＴ２（Ａ）配列のコピー数の減少により、ＣｔＦＡＭ軸に沿って移動し
たことを示す。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は既知のブタＫＩＴ対立遺伝子の構造の図式的表示である。ここで４bp d
el'nは、モラーら、1996により報告されたような、重複したＫＩＴ遺伝子ＤＮＡ
の一つのコピーのイントロン１８における４塩基対の欠失を指す。そしてエキソ
ン１７−Ａは本出願において報告されたような野生型対立遺伝子中のＧからＡへ
のイントロン１７のヌクレオチド１の変化を指す。

【図２】 図２はプライマーＫＩＴ１Ｆ及びＫＩＴ７Ｒを用いるＫＩＴエキソン１６〜１
９のＲＴ−ＰＣＲ生産物を示すエレクトロフェログラム（４％アガロース・ヌシ
ーブ／シーケム３：１、１００Ｖ、８０分間）を示す。試料１〜３及び４〜６は
それぞれスウェーデンラージホワイトブタ及びハンプシャーブタである。４２４
塩基対断片と３０１塩基対断片の間のサイズの相違は後者の画分におけるエキソ
ン１７の欠如によるものである。ヨークシャーブタの二つの上方のバンドはヘテ
ロ二本鎖（ＨＤ）と解釈された。

【図３】 図３はＫＩＴエキソン１７の２１塩基対及びＫＩＴイントロン１７の２７塩基
対を含む４８塩基対配列を示す。この配列では、イントロン／エキソン境界の位
置は垂直の線で印を付けてあり、スプライス部位突然変異（nt1 ^G →^A ) は垂直
の矢印で示してあり、そして対立遺伝子Ｉ^P 及びｉにおける同一の塩基はドット
で印を付けてある。

【図４】 図４はＫＩＴ遺伝子のイントロン１７のスプライス部位突然変異の存在を検出
するために用いられたＮｌａIII ＰＣＲ・ＲＦＬＰ試験の結果を示す。図４Ａは
ＫＩＴ２１とＫＩＴ３５のプライマー対を用いて増幅されたＰＣＲ生産物内の二
つのＮｌａIII 認識部位の位置を示す。すべての距離は塩基対で与えてある。図
４Ｂは正常なＫＩＴかまたはスプライス突然変異ＫＩＴのＮｌａIII 消化の後に
得られる断片のサイズを示す。図４ＣはＰＣＲ・ＲＦＬＰ試験の使用を例示する
。レーン１は消化していないＫＩＴ２１／ＫＩＴ３５増幅断片を示す。消化は、
レーン２では、スプライス部位突然変異を含むクローン、レーン３では正常なス
プライス部位配列を含むクローン、レーン４では着色したブタ由来のゲノムＤＮ
Ａ、レーン５では白色ブタ由来のゲノムＤＮＡ、から増幅されたＰＣＲ生産物に
ついて行った。断片のサイズは塩基対で示してある。

【図５】 図５は、遺伝子型Ｉ／Ｉ、Ｉ／ｉ及びＩ／Ｉ^P の動物における、正常ＫＩＴの
スプライス突然変異ＫＩＴに対する比の比較を示す。

【図６】 図６は５６頭のランドレース動物と３３頭のラージホワイト動物についてのこ
の比の値を示す。明瞭な双峰分布が観察され、７頭のランドレースと３頭のラー
ジホワイトの個体は約３又はそれ以上の比の値を持つ。このことは、それらがＩ ^P 対立遺伝子（遺伝子型Ｉ／Ｉ^P ）に対するヘテロ接合体保持体であることを示
唆する。これは、ランドレース品種及びラージホワイト品種内でそれぞれＩ^P が
６．２５％（試験した染色体１１２のうちの７）及び４．５％（試験した染色体
６６のうちの３）の遺伝子頻度推定値を持つことを意味する。

【図７】 図７はタックマン（登録商標）化学を用いてＫＩＴスプライス突然変異遺伝子
型について分析した遺伝子型Ｉｉ及びＩＩの動物のＣｔＦＡＭ対ＣｔＴＥＴのプ
ロットを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ステファン マークルント スウェーデン国、ウプサラ、エス−75124、 ボックス597、ウプサラ バイオメディカ ル センター、スウェーディッシュ ユニ バーシティー オブ アグリカルチュラル サイエンシーズ、デパートメント オブ アニマル ブリーディング アンド ジ ェネティクス (72)発明者 ジェイムス キアス アメリカ合衆国、ニューヨーク州 14853、 イタカ、コーネル ユニバーシティー、カ レッジ オブ ベテリナリ メディシン、 ジェイムズ エイ．ベーカー インスティ チュート オブ アニマル ヘルス (72)発明者 マリア モラー スウェーデン国、ウプサラ エス−75239、 カールスロガタン 46 (72)発明者 リチャード ウエールズ 英国、シービー１ １キューピー、ケンブ リッジ、テニス コート ロード、ユニバ ーシティー オブ ケンブリッジ、デパー トメント オブ パソロジー、ピーアイシ ー グループ内

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）ブタの核酸の試料を取得する工程、及び （ｂ）工程（ａ）で得た核酸を分析して、ＫＩＴ遺伝子の一つ以上のエキソン／
   イントロンのスプライス部位に突然変異が存在するか／存在しないかを決定する
   工程、 を含む、ブタの被毛色遺伝子型を決定する方法。
2. 【請求項２】 工程（ｂ）における分析が、エキソン１７／イントロン１７
   の境界に突然変異が存在するか／存在しないかを決定するために行われるもので
   ある、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 この突然変異がＡによる保存されたＧＴ対のＧの置換からな
   るものである、請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 該核酸試料が分析の前に増幅されるものである請求項１〜請
   求項３いずれか１項に記載の方法。
5. 【請求項５】 該核酸がゲノムＤＮＡである請求項４記載の方法。
6. 【請求項６】 増幅がＰＣＲ及び少なくとも一対の適当なプライマーを用い
   て行われるものである請求項５記載の方法。
7. 【請求項７】 該適当な一対のプライマーが、 ５’−ＧＴＡ ＴＴＣ ＡＣＡ ＧＡＧ ＡＣＴ ＴＧＧ ＣＧＧ Ｃ−３’ 及び ５’−ＡＡＡ ＣＣＴ ＧＣＡ ＡＧＧ ＡＡＡ ＡＴＣ ＣＴＴ ＣＡＣ Ｇ
   Ｇ−３’ である請求項６記載の方法。
8. 【請求項８】 増幅後に該核酸が制限酵素で処理され、続いて断片長分析に
   付されるものである請求項５〜請求項７いずれか１項に記載の方法。
9. 【請求項９】 該核酸が制限酵素ＮｌａIII で処理されるものである請求項
   8 記載の方法。
10. 【請求項１０】 制限断片長の比が決定されるものである請求項８又は請求
    項９記載の方法。
11. 【請求項１１】 該核酸がｍＲＮＡである請求項４記載の方法。
12. 【請求項１２】 該核酸がＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅されるものである請求
    項１１記載の方法。
13. 【請求項１３】 ＲＴ−ＰＣＲ生成物の長さが決定されるものである請求項
    １２記載の方法。
14. 【請求項１４】 ブタの被毛色遺伝子型を決定する方法であって、ブタのＫ
    ＩＴタンパク質がスプライス変異型タンパク質であるかどうかを決定するために
    このタンパク質の試料を分析する工程を含むものである方法。
15. 【請求項１５】 ブタの被毛色遺伝子型を決定する際に使用するためのキッ
    トであって、ＫＩＴ遺伝子のエキソン／イントロン・スプライス部位の一つ以上
    に突然変異が存在するか／存在しないかを決定するための一つ以上の適当な試薬
    を含んで成るキット。
16. 【請求項１６】 ＰＣＲを行うための一つ以上の試薬と一以上の適当なプラ
    イマー対を含む請求項１５記載のキット。
17. 【請求項１７】 下記のプライマー対、すなわち ５’−ＧＴＡ ＴＴＣ ＡＣＡ ＧＡＧ ＡＣＴ ＴＧＧ ＣＧＧ Ｃ−３’ 及び ５’−ＡＡＡ ＣＣＴ ＧＣＡ ＡＧＧ ＡＡＡ ＡＴＣ ＣＴＴ ＣＡＣ Ｇ
    Ｇ−３’ を含む請求項１６記載のキット。