JPH10136998A - ｍＲＮＡの定量法 - Google Patents
ｍＲＮＡの定量法Info
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- JPH10136998A JPH10136998A JP8299136A JP29913696A JPH10136998A JP H10136998 A JPH10136998 A JP H10136998A JP 8299136 A JP8299136 A JP 8299136A JP 29913696 A JP29913696 A JP 29913696A JP H10136998 A JPH10136998 A JP H10136998A
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- mrna
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ビタミンＤレセプター遺伝子などの遺伝子の
発現量と遺伝子多型を同時にあるいは遺伝子多型を利用
して該遺伝子の発現量を対立遺伝子ごとに解析する方法
を提供する。 【解決手段】 検出対象のｍＲＮＡから逆転写により合
成されたｃＤＮＡを、該ｃＤＮＡに対応する部分の染色
体ＤＮＡと共に増幅させることを含む競合ＰＣＲ法によ
るｍＲＮＡ定量法において、増幅させる塩基配列が一つ
のエクソン内にあり、前記塩基配列内に遺伝子多型があ
ることを特徴とする。
発現量と遺伝子多型を同時にあるいは遺伝子多型を利用
して該遺伝子の発現量を対立遺伝子ごとに解析する方法
を提供する。 【解決手段】 検出対象のｍＲＮＡから逆転写により合
成されたｃＤＮＡを、該ｃＤＮＡに対応する部分の染色
体ＤＮＡと共に増幅させることを含む競合ＰＣＲ法によ
るｍＲＮＡ定量法において、増幅させる塩基配列が一つ
のエクソン内にあり、前記塩基配列内に遺伝子多型があ
ることを特徴とする。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は組織中のｍＲＮＡの
定量法に関し、詳しくはビタミンＤレセプター遺伝子な
どの遺伝子の発現量と遺伝子の多型を同時にあるいは遺
伝子の多型を利用して該遺伝子の発現量を対立遺伝子ご
とに解析する方法に関するものである。
定量法に関し、詳しくはビタミンＤレセプター遺伝子な
どの遺伝子の発現量と遺伝子の多型を同時にあるいは遺
伝子の多型を利用して該遺伝子の発現量を対立遺伝子ご
とに解析する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】組織中又は細胞中の特定の遺伝子発現量
を正確に測定することは病態の診断や薬剤の効果判定に
極めて重要な情報を与え、さらに、対立遺伝子ごとの発
現量を測定することは、生体内の状態を詳細に調べる上
で非常に有用である。しかしながら、組織中のｍＲＮＡ
を正確に定量することは、その存在量が少ないために困
難であり、微量なｍＲＮＡを扱える定量性の高い方法が
望まれている。
を正確に測定することは病態の診断や薬剤の効果判定に
極めて重要な情報を与え、さらに、対立遺伝子ごとの発
現量を測定することは、生体内の状態を詳細に調べる上
で非常に有用である。しかしながら、組織中のｍＲＮＡ
を正確に定量することは、その存在量が少ないために困
難であり、微量なｍＲＮＡを扱える定量性の高い方法が
望まれている。
【０００３】従来、微量なｍＲＮＡの定量は、ｍＲＮＡ
から逆転写によりｃＤＮＡを合成し、これを、カリー・
バンクス・マリスが示した遺伝子増幅法（Polymerase C
hainReaction法、以下ＰＣＲ法と略す；特開昭６１−２
７４６９７号公報および特開昭６２−２８１号公報）に
より増幅するというＲＴ−ＰＣＲ法（ダニエルＡラボー
リーら、サイエンス２４１巻、７０８〜７１２頁、１９
８８年）を利用して行われている。これは、組織中の目
的とする特定の遺伝子（例えば、種々のホルモンレセプ
ター遺伝子等）と、細胞中で構成的に発現している目的
とする特定の遺伝子とは塩基配列の全く異なる遺伝子
（例えば、β−アクチン遺伝子）とに由来するｍＲＮＡ
を、同時に逆転写して各々のｃＤＮＡをつくり、これら
をＰＣＲ法にて増幅し、両者の比率により細胞中の相対
的な発現量を比較するというものである。この方法は、
発現量を比較する二つのｍＲＮＡの塩基配列が異なるの
で、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する際のｃＤＮ
Ａ合成効率が異なり、さらに、合成したｃＤＮＡをＰＣ
Ｒにより増幅させる際にも、その増幅効果が異なるとい
う欠点を有し、定量性に問題がある。したがって、この
方法では、あくまでも発現の有無の確認ないしは相対的
な発現量の比較しか行なえない。
から逆転写によりｃＤＮＡを合成し、これを、カリー・
バンクス・マリスが示した遺伝子増幅法（Polymerase C
hainReaction法、以下ＰＣＲ法と略す；特開昭６１−２
７４６９７号公報および特開昭６２−２８１号公報）に
より増幅するというＲＴ−ＰＣＲ法（ダニエルＡラボー
リーら、サイエンス２４１巻、７０８〜７１２頁、１９
８８年）を利用して行われている。これは、組織中の目
的とする特定の遺伝子（例えば、種々のホルモンレセプ
ター遺伝子等）と、細胞中で構成的に発現している目的
とする特定の遺伝子とは塩基配列の全く異なる遺伝子
（例えば、β−アクチン遺伝子）とに由来するｍＲＮＡ
を、同時に逆転写して各々のｃＤＮＡをつくり、これら
をＰＣＲ法にて増幅し、両者の比率により細胞中の相対
的な発現量を比較するというものである。この方法は、
発現量を比較する二つのｍＲＮＡの塩基配列が異なるの
で、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する際のｃＤＮ
Ａ合成効率が異なり、さらに、合成したｃＤＮＡをＰＣ
Ｒにより増幅させる際にも、その増幅効果が異なるとい
う欠点を有し、定量性に問題がある。したがって、この
方法では、あくまでも発現の有無の確認ないしは相対的
な発現量の比較しか行なえない。
【０００４】この方法の改良法として、競合鋳型として
目的の配列とホモロガスな配列を用いる方法が実施され
ている。すなわち、目的遺伝子に予め人為的変異を導入
（例えば、従来存在しない制限酵素認識部位を挿入、ま
たは、制限酵素認識部位を除去）しておき、この変異を
人為的に導入した遺伝子からｍＲＮＡを調製し、目的の
ｍＲＮＡとは区別出来るようにしておく。これを検体に
添加して同時にＰＣＲを行うと、塩基配列が一部のみ異
なるだけで他の領域は同一であるため、増幅効率が同等
となり定量性が向上する（マイケル・ベッカー・アンド
レら、ニュークレイック・アッシド・リサーチ １７
巻、９４３７〜９４４６頁、１９８９年）。しかしなが
ら、上記の改良法では、目的とする遺伝子に対応した点
突然変異等を導入したｍＲＮＡを予め調製しておく必要
がある。また、サンプルの重量ないしは抽出した全ｍＲ
ＮＡの量を別に測定しておく必要があり、サンプルが多
量にないと組織中の目的とするｍＲＮＡ量の正確な定量
を行えないという欠点がある。
目的の配列とホモロガスな配列を用いる方法が実施され
ている。すなわち、目的遺伝子に予め人為的変異を導入
（例えば、従来存在しない制限酵素認識部位を挿入、ま
たは、制限酵素認識部位を除去）しておき、この変異を
人為的に導入した遺伝子からｍＲＮＡを調製し、目的の
ｍＲＮＡとは区別出来るようにしておく。これを検体に
添加して同時にＰＣＲを行うと、塩基配列が一部のみ異
なるだけで他の領域は同一であるため、増幅効率が同等
となり定量性が向上する（マイケル・ベッカー・アンド
レら、ニュークレイック・アッシド・リサーチ １７
巻、９４３７〜９４４６頁、１９８９年）。しかしなが
ら、上記の改良法では、目的とする遺伝子に対応した点
突然変異等を導入したｍＲＮＡを予め調製しておく必要
がある。また、サンプルの重量ないしは抽出した全ｍＲ
ＮＡの量を別に測定しておく必要があり、サンプルが多
量にないと組織中の目的とするｍＲＮＡ量の正確な定量
を行えないという欠点がある。
【０００５】この欠点を補えるものとして、谷口の方法
（特開平７−２３１７９７号公報）が提案されている。
この方法によれば、ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを、染色体
のＤＮＡと直接比較定量することにより、変異を導入し
たｍＲＮＡを予め調製する必要がなく、さらに、サンプ
ルの重量ないしは抽出した全ｍＲＮＡの量を測定する必
要がなく、サンプルより抽出した核酸を全てＰＣＲのサ
ンプルとして用いることが可能となる。
（特開平７−２３１７９７号公報）が提案されている。
この方法によれば、ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを、染色体
のＤＮＡと直接比較定量することにより、変異を導入し
たｍＲＮＡを予め調製する必要がなく、さらに、サンプ
ルの重量ないしは抽出した全ｍＲＮＡの量を測定する必
要がなく、サンプルより抽出した核酸を全てＰＣＲのサ
ンプルとして用いることが可能となる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】近年、制限酵素断片長
多型（ＲＦＬＰ）などの遺伝子の多型と疾患との関連が
明らかにされつつある。例えば、ビタミンＤレセプター
の対立遺伝子からは、骨無機質密度、骨代謝回転および
ビタミンＤ内分泌系の生理学的関連などが予測される。
そのため、このような遺伝子の多型とｍＲＮＡの発現を
定量的に解析する方法が求められている。
多型（ＲＦＬＰ）などの遺伝子の多型と疾患との関連が
明らかにされつつある。例えば、ビタミンＤレセプター
の対立遺伝子からは、骨無機質密度、骨代謝回転および
ビタミンＤ内分泌系の生理学的関連などが予測される。
そのため、このような遺伝子の多型とｍＲＮＡの発現を
定量的に解析する方法が求められている。
【０００７】また、このような解析に用いるサンプルは
微量であることが多い。例えば、ビタミンＤレセプター
遺伝子の場合には、初代培養の骨細胞の分析が必要とな
る。従って、本発明の目的は、微量のサンプルに対して
も適用することのできる、遺伝子の発現量と遺伝子の多
型を同時にあるいは遺伝子の多型を利用して該遺伝子の
発現量を対立遺伝子ごとに定量的に解析できる方法を開
発することである。
微量であることが多い。例えば、ビタミンＤレセプター
遺伝子の場合には、初代培養の骨細胞の分析が必要とな
る。従って、本発明の目的は、微量のサンプルに対して
も適用することのできる、遺伝子の発現量と遺伝子の多
型を同時にあるいは遺伝子の多型を利用して該遺伝子の
発現量を対立遺伝子ごとに定量的に解析できる方法を開
発することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究した結果、微量のサンプルに
も適用できる、染色体ＤＮＡを競合物とすることを特徴
とする競合ＰＣＲ法によるｍＲＮＡの定量法において、
増幅するｍＲＮＡの塩基配列を設定する際に、遺伝子多
型領域を含むようにすることにより、ｍＲＮＡの発現量
を対立遺伝子ごとに区別して定量することが可能になる
ことを見い出し、本発明を完成するに至った。
を解決するために鋭意研究した結果、微量のサンプルに
も適用できる、染色体ＤＮＡを競合物とすることを特徴
とする競合ＰＣＲ法によるｍＲＮＡの定量法において、
増幅するｍＲＮＡの塩基配列を設定する際に、遺伝子多
型領域を含むようにすることにより、ｍＲＮＡの発現量
を対立遺伝子ごとに区別して定量することが可能になる
ことを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】すなわち、本発明のｍＲＮＡ定量法は、検
出対象のｍＲＮＡから逆転写により合成されたｃＤＮＡ
を、該ｃＤＮＡに対応する部分の染色体ＤＮＡと共に増
幅させることを含む競合ＰＣＲ法による定量法におい
て、増幅させる塩基配列が一つのエクソン内にあり、前
記塩基配列内に遺伝子の多型があることを特徴とするも
のである。
出対象のｍＲＮＡから逆転写により合成されたｃＤＮＡ
を、該ｃＤＮＡに対応する部分の染色体ＤＮＡと共に増
幅させることを含む競合ＰＣＲ法による定量法におい
て、増幅させる塩基配列が一つのエクソン内にあり、前
記塩基配列内に遺伝子の多型があることを特徴とするも
のである。
【００１０】好ましい態様では、組織もしくは細胞より
抽出したｍＲＮＡを鋳型にして、ｃＤＮＡを合成する際
に、新たに制限酵素認識部位を導入するか、または、制
限酵素認識部位を除去するように設定したオリゴヌクレ
オチド（ＲＴプライマー）が用いられる。
抽出したｍＲＮＡを鋳型にして、ｃＤＮＡを合成する際
に、新たに制限酵素認識部位を導入するか、または、制
限酵素認識部位を除去するように設定したオリゴヌクレ
オチド（ＲＴプライマー）が用いられる。
【００１１】本発明方法によれば、遺伝子のｍＲＮＡ由
来のｃＤＮＡを、染色体のＤＮＡと直接比較定量するこ
とにより、変異を導入したｍＲＮＡを予め調製する必要
がなく、さらに、サンプルの重量ないしは抽出した全ｍ
ＲＮＡの量を測定する必要がないため、サンプルより抽
出した核酸を全てＰＣＲのサンプルとして用いることが
可能となるのに加え、ｍＲＮＡの定量に用いる塩基配列
を設定する際に、遺伝子多型領域を含むようにすること
により、ｍＲＮＡの発現量を対立遺伝子ごとに区別して
定量することが可能となる。該遺伝子がビタミンＤレセ
プター遺伝子の場合には、この方法は骨粗鬆症のリスク
ファクターの検査となりうると予想される。
来のｃＤＮＡを、染色体のＤＮＡと直接比較定量するこ
とにより、変異を導入したｍＲＮＡを予め調製する必要
がなく、さらに、サンプルの重量ないしは抽出した全ｍ
ＲＮＡの量を測定する必要がないため、サンプルより抽
出した核酸を全てＰＣＲのサンプルとして用いることが
可能となるのに加え、ｍＲＮＡの定量に用いる塩基配列
を設定する際に、遺伝子多型領域を含むようにすること
により、ｍＲＮＡの発現量を対立遺伝子ごとに区別して
定量することが可能となる。該遺伝子がビタミンＤレセ
プター遺伝子の場合には、この方法は骨粗鬆症のリスク
ファクターの検査となりうると予想される。
【００１２】ｍＲＮＡの定量を行う遺伝子がビタミンＤ
レセプター遺伝子である場合には、増幅させる塩基配列
がビタミンＤレセプター遺伝子ｅｘｏｎ９内にあり、遺
伝子の多型がＴａｑＩ認識部位（Ｔ’ＣＧＡ）の有無で
あることが好ましい。この場合、ＲＴプライマーが配列
番号１または配列番号２に示す塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドであり、増幅の際に用いる同一エクソン内
のオリゴヌクレオチドが、ＲＴプライマーが配列番号１
の塩基配列を有する場合には、配列番号３および配列番
号４に示す塩基配列を有し、ＲＴプライマーが配列番号
２の塩基配列を有する場合には、配列番号３および配列
番号５に示す塩基配列を有するものであることがさらに
好ましい。
レセプター遺伝子である場合には、増幅させる塩基配列
がビタミンＤレセプター遺伝子ｅｘｏｎ９内にあり、遺
伝子の多型がＴａｑＩ認識部位（Ｔ’ＣＧＡ）の有無で
あることが好ましい。この場合、ＲＴプライマーが配列
番号１または配列番号２に示す塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドであり、増幅の際に用いる同一エクソン内
のオリゴヌクレオチドが、ＲＴプライマーが配列番号１
の塩基配列を有する場合には、配列番号３および配列番
号４に示す塩基配列を有し、ＲＴプライマーが配列番号
２の塩基配列を有する場合には、配列番号３および配列
番号５に示す塩基配列を有するものであることがさらに
好ましい。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明の方法を、以下に詳細に説
明する。先ず、本発明の基礎となる競合ＰＣＲ法につい
て説明する。この方法の特徴は、一組のＰＣＲプライマ
ーを用いてｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡと該ｃＤＮＡに対応
する部分の染色体ＤＮＡとをＰＣＲ法により同時に増幅
させることによりｍＲＮＡの発現量を特異的にかつ定量
的に検出することにある。なお、ここで、「ｃＤＮＡに
対応する部分」とは、同一プライマーを用いたＰＣＲ法
によって該ｃＤＮＡと同様に増幅される部分を意味す
る。
明する。先ず、本発明の基礎となる競合ＰＣＲ法につい
て説明する。この方法の特徴は、一組のＰＣＲプライマ
ーを用いてｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡと該ｃＤＮＡに対応
する部分の染色体ＤＮＡとをＰＣＲ法により同時に増幅
させることによりｍＲＮＡの発現量を特異的にかつ定量
的に検出することにある。なお、ここで、「ｃＤＮＡに
対応する部分」とは、同一プライマーを用いたＰＣＲ法
によって該ｃＤＮＡと同様に増幅される部分を意味す
る。
【００１４】この方法は、通常には、サンプルから抽出
されたｍＲＮＡから逆転写によりｃＤＮＡを合成し、次
いで、ＰＣＲを行い、その合成されたｃＤＮＡと染色体
ＤＮＡとを同時に増幅し、生成した該ｃＤＮＡおよび染
色体ＤＮＡ由来の増幅産物の量を比較することにより、
目的ｍＲＮＡを定量するものである。この染色体ＤＮＡ
は、ｍＲＮＡと同時に抽出されたものでもよいし、既知
量を添加したものであってもよい。また、増幅産物の量
の比較のためには、増幅産物をｃＤＮＡ由来のものと染
色体ＤＮＡ由来のものとに区別する必要があるので、ｃ
ＤＮＡの合成の際に、分子量あるいは制限酵素認識部位
が染色体ＤＮＡと相違するように、逆転写のためのプラ
イマー（ＲＴプライマー）を設定する。好ましくは、制
限酵素認識部位が異なるｃＤＮＡが合成されるように設
定する。この場合、組織もしくは細胞より抽出したｍＲ
ＮＡを鋳型にして、ｃＤＮＡを合成する際に、新たに制
限酵素認識部位を導入するか、または、制限酵素認識部
位を除去するように設定したオリゴヌクレオチドを用い
る。
されたｍＲＮＡから逆転写によりｃＤＮＡを合成し、次
いで、ＰＣＲを行い、その合成されたｃＤＮＡと染色体
ＤＮＡとを同時に増幅し、生成した該ｃＤＮＡおよび染
色体ＤＮＡ由来の増幅産物の量を比較することにより、
目的ｍＲＮＡを定量するものである。この染色体ＤＮＡ
は、ｍＲＮＡと同時に抽出されたものでもよいし、既知
量を添加したものであってもよい。また、増幅産物の量
の比較のためには、増幅産物をｃＤＮＡ由来のものと染
色体ＤＮＡ由来のものとに区別する必要があるので、ｃ
ＤＮＡの合成の際に、分子量あるいは制限酵素認識部位
が染色体ＤＮＡと相違するように、逆転写のためのプラ
イマー（ＲＴプライマー）を設定する。好ましくは、制
限酵素認識部位が異なるｃＤＮＡが合成されるように設
定する。この場合、組織もしくは細胞より抽出したｍＲ
ＮＡを鋳型にして、ｃＤＮＡを合成する際に、新たに制
限酵素認識部位を導入するか、または、制限酵素認識部
位を除去するように設定したオリゴヌクレオチドを用い
る。
【００１５】このような競合ＰＣＲ法としては、例え
ば、特開平７−２３１７９７号公報に記載されている方
法がある。以下、好ましい態様の競合ＰＣＲ法を、より
具体的に説明する。先ず、目的遺伝子の特定のエクソン
部分の３’側の領域に、新たな制限酵素認識部位を生じ
るように、または元々存在する制限酵素認識部位を除去
するように塩基置換した相補的ＲＴプライマーにより、
ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。これより後述するＰ
ＣＲで同時に増幅する染色体ＤＮＡには元来存在しなか
った制限酵素認識部位が導入あるいは除去されたｃＤＮ
Ａが合成される。この反応後に塩基置換した相補的ＲＴ
プライマーが残存する場合には、エクソヌクレアーゼＩ
等を用いて除去することができる。次に、制限酵素認識
部位が導入あるいは除去されたｃＤＮＡと元の塩基配列
を保有している染色体ＤＮＡとについて、前述のＲＴプ
ライマーの制限酵素認識部位を導入あるいは除去するよ
うに塩基置換した領域を含まない５’領域の少なくとも
一部と同一の配列のプライマーとｃＤＮＡの３’側の相
補的プライマーの二つのプライマーを用いてＰＣＲ法を
行うことにより、ｃＤＮＡ由来の新たに制限酵素認識部
位の導入あるいは除去された変異型ＰＣＲ産物と染色体
ＤＮＡ由来野性型ＰＣＲ産物とが増幅される。これら二
つのＰＣＲ産物は同じ一組のＰＣＲプライマーにより合
成され、また、ほとんど同じ配列を有するため、合成さ
れる比率は全く同じと考えられる。これによりＰＣＲ段
階での増幅効率の差は除外できる。増幅されたＰＣＲ産
物を前述した制限酵素認識部位に対応する制限酵素で処
理し、電気泳動により分子量に基づく分離を行い、染色
体由来のＰＣＲ産物とｃＤＮＡ由来ＰＣＲ産物を区別す
る。分離したＰＣＲ産物は、エチジウムブロマイド染色
等により検出することができる。また、検出したバンド
の濃度は、目視ないしはデンシトメター等により定量す
ることができる。この方法の概略を図１に示す。
ば、特開平７−２３１７９７号公報に記載されている方
法がある。以下、好ましい態様の競合ＰＣＲ法を、より
具体的に説明する。先ず、目的遺伝子の特定のエクソン
部分の３’側の領域に、新たな制限酵素認識部位を生じ
るように、または元々存在する制限酵素認識部位を除去
するように塩基置換した相補的ＲＴプライマーにより、
ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。これより後述するＰ
ＣＲで同時に増幅する染色体ＤＮＡには元来存在しなか
った制限酵素認識部位が導入あるいは除去されたｃＤＮ
Ａが合成される。この反応後に塩基置換した相補的ＲＴ
プライマーが残存する場合には、エクソヌクレアーゼＩ
等を用いて除去することができる。次に、制限酵素認識
部位が導入あるいは除去されたｃＤＮＡと元の塩基配列
を保有している染色体ＤＮＡとについて、前述のＲＴプ
ライマーの制限酵素認識部位を導入あるいは除去するよ
うに塩基置換した領域を含まない５’領域の少なくとも
一部と同一の配列のプライマーとｃＤＮＡの３’側の相
補的プライマーの二つのプライマーを用いてＰＣＲ法を
行うことにより、ｃＤＮＡ由来の新たに制限酵素認識部
位の導入あるいは除去された変異型ＰＣＲ産物と染色体
ＤＮＡ由来野性型ＰＣＲ産物とが増幅される。これら二
つのＰＣＲ産物は同じ一組のＰＣＲプライマーにより合
成され、また、ほとんど同じ配列を有するため、合成さ
れる比率は全く同じと考えられる。これによりＰＣＲ段
階での増幅効率の差は除外できる。増幅されたＰＣＲ産
物を前述した制限酵素認識部位に対応する制限酵素で処
理し、電気泳動により分子量に基づく分離を行い、染色
体由来のＰＣＲ産物とｃＤＮＡ由来ＰＣＲ産物を区別す
る。分離したＰＣＲ産物は、エチジウムブロマイド染色
等により検出することができる。また、検出したバンド
の濃度は、目視ないしはデンシトメター等により定量す
ることができる。この方法の概略を図１に示す。
【００１６】サンプルから抽出した全核酸をｃＤＮＡ合
成および増幅にそのまま用いた場合、染色体中の遺伝子
の量は、癌遺伝子等の遺伝子増幅もしくは欠失が起きて
いる場合を除いて常に一定であり、また、増幅に先だっ
て染色体ＤＮＡを添加する場合も添加量は既知であるか
ら、上記ＰＣＲ法による染色体ＤＮＡ由来ＰＣＲ産物と
ｃＤＮＡ由来ＰＣＲ産物の量の比較によってｍＲＮＡの
定量ができる。
成および増幅にそのまま用いた場合、染色体中の遺伝子
の量は、癌遺伝子等の遺伝子増幅もしくは欠失が起きて
いる場合を除いて常に一定であり、また、増幅に先だっ
て染色体ＤＮＡを添加する場合も添加量は既知であるか
ら、上記ＰＣＲ法による染色体ＤＮＡ由来ＰＣＲ産物と
ｃＤＮＡ由来ＰＣＲ産物の量の比較によってｍＲＮＡの
定量ができる。
【００１７】そして、本発明は、上記の競合ＰＣＲ法に
よるｍＲＮＡの定量法において、増幅させる塩基配列が
一つのエクソン内にあり、その塩基配列内に遺伝子の多
型があることを特徴とする。すなわち、遺伝子の多型を
有し且つ一つのエクソン内である部分をｍＲＮＡの定量
に用いる塩基配列として設定することを特徴とする。
よるｍＲＮＡの定量法において、増幅させる塩基配列が
一つのエクソン内にあり、その塩基配列内に遺伝子の多
型があることを特徴とする。すなわち、遺伝子の多型を
有し且つ一つのエクソン内である部分をｍＲＮＡの定量
に用いる塩基配列として設定することを特徴とする。
【００１８】本発明の方法の具体例としては、 １）定量対象のｍＲＮＡからのｃＤＮＡの合成を、新た
な制限酵素認識部位を導入するか、又は制限酵素認識部
位を除去するように選択したＲＴプライマーを用いて行
い、 ２）工程１）で合成したｃＤＮＡと、該ｃＤＮＡに対応
する部分の染色体ＤＮＡとを共に、遺伝子の多型を有し
且つ一つのエクソン内である部分で増幅させ得る塩基配
列を有する一組のＰＣＲプライマーを用いて、ＰＣＲを
行い、工程１）のＲＴプライマー配列部分を含むＰＣＲ
産物を得、 ３）工程２）で増幅したＰＣＲ産物を、工程１）で導入
又は除去した制限酵素認識部位に対応する制限酵素で処
理し、 ４）工程３）で処理したＰＣＲ産物を、分子量の違いに
よりｃＤＮＡ由来のＰＣＲ産物と染色体ＤＮＡ由来のＰ
ＣＲ産物と区別し、 ５）各々のＰＣＲ産物を定量することにより、検出対象
のｍＲＮＡを定量する各工程を含む方法が挙げられる。
な制限酵素認識部位を導入するか、又は制限酵素認識部
位を除去するように選択したＲＴプライマーを用いて行
い、 ２）工程１）で合成したｃＤＮＡと、該ｃＤＮＡに対応
する部分の染色体ＤＮＡとを共に、遺伝子の多型を有し
且つ一つのエクソン内である部分で増幅させ得る塩基配
列を有する一組のＰＣＲプライマーを用いて、ＰＣＲを
行い、工程１）のＲＴプライマー配列部分を含むＰＣＲ
産物を得、 ３）工程２）で増幅したＰＣＲ産物を、工程１）で導入
又は除去した制限酵素認識部位に対応する制限酵素で処
理し、 ４）工程３）で処理したＰＣＲ産物を、分子量の違いに
よりｃＤＮＡ由来のＰＣＲ産物と染色体ＤＮＡ由来のＰ
ＣＲ産物と区別し、 ５）各々のＰＣＲ産物を定量することにより、検出対象
のｍＲＮＡを定量する各工程を含む方法が挙げられる。
【００１９】この例のように、遺伝子の多型が、制限酵
素認識部位である場合には、その部位に対応する制限酵
素による処理および電気泳動により、遺伝子の多型を検
出することが可能であるが、多型はこれに限定されるも
のではない。例えば、塩基配列の一部の欠失などＰＣＲ
産物の分子量に影響を与えるものである場合には、ＰＣ
Ｒ産物をそのまま電気泳動に付することにより多型を検
出することが可能である。
素認識部位である場合には、その部位に対応する制限酵
素による処理および電気泳動により、遺伝子の多型を検
出することが可能であるが、多型はこれに限定されるも
のではない。例えば、塩基配列の一部の欠失などＰＣＲ
産物の分子量に影響を与えるものである場合には、ＰＣ
Ｒ産物をそのまま電気泳動に付することにより多型を検
出することが可能である。
【００２０】以下、ｍＲＮＡの発現量を測定する遺伝子
として、骨粗鬆症のリスクファクターと言われているビ
タミンＤレセプター遺伝子を例にとって説明するが、本
発明はこれに限定されるものではない。
として、骨粗鬆症のリスクファクターと言われているビ
タミンＤレセプター遺伝子を例にとって説明するが、本
発明はこれに限定されるものではない。
【００２１】例えば、増幅する部分として、骨無機成分
濃度に関連するｅｘｏｎ９のＴａｑＩ ＲＦＬＰ領域を
採用する。ＴａｑＩの認識部位はＴ’ＣＧＡであ
る（「’」は切断部位を示す）。ＴａｑＩ認識部位は、
オステオカルシンや骨密度とその多型が強く連鎖するこ
とが知られているＢｓｍＩ認識部位と強く連鎖してい
る。
濃度に関連するｅｘｏｎ９のＴａｑＩ ＲＦＬＰ領域を
採用する。ＴａｑＩの認識部位はＴ’ＣＧＡであ
る（「’」は切断部位を示す）。ＴａｑＩ認識部位は、
オステオカルシンや骨密度とその多型が強く連鎖するこ
とが知られているＢｓｍＩ認識部位と強く連鎖してい
る。
【００２２】ＲＴプライマーは、制限酵素認識部位が導
入されるかまたは除去されるように設定する。このよう
に設定したＲＴプライマーの例としては、配列番号１ま
たは配列番号２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドが挙げられる。配列番号１のＲＴプライマーは、Ｂ
ｇｌII認識部位を除去するように設定したものであり、
配列番号２のＲＴプライマーは、ＫｐｎＩ認識部位を導
入するように設定したものである。
入されるかまたは除去されるように設定する。このよう
に設定したＲＴプライマーの例としては、配列番号１ま
たは配列番号２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドが挙げられる。配列番号１のＲＴプライマーは、Ｂ
ｇｌII認識部位を除去するように設定したものであり、
配列番号２のＲＴプライマーは、ＫｐｎＩ認識部位を導
入するように設定したものである。
【００２３】増幅のためのプライマー（ＰＣＲプライマ
ー）は、多型領域が含まれるように設定する。アンチセ
ンスＰＣＲプライマーは、ＲＴプライマーにより導入さ
れるかまたは除去される制限酵素認識部位の塩基配列が
増幅されるように設定する。通常には、アンチセンスＰ
ＣＲプライマーとしては、ＲＴプライマーの５’末端側
の部分（改変した制限酵素認識部位よりも５’末端側の
部分）と同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが
使用される。このように設定したＰＣＲプライマーの例
としては、センスＰＣＲプライマーとして配列番号３に
示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、アンチセン
スＰＣＲプライマーとして配列番号４又は５に示す塩基
配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。配列番
号１のＲＴプライマーがｃＤＮＡの合成に使用された場
合には、配列番号４のＰＣＲプライマーが、配列番号２
のＲＴプライマーが使用された場合には、配列番号５の
ＰＣＲプライマーが使用される。
ー）は、多型領域が含まれるように設定する。アンチセ
ンスＰＣＲプライマーは、ＲＴプライマーにより導入さ
れるかまたは除去される制限酵素認識部位の塩基配列が
増幅されるように設定する。通常には、アンチセンスＰ
ＣＲプライマーとしては、ＲＴプライマーの５’末端側
の部分（改変した制限酵素認識部位よりも５’末端側の
部分）と同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが
使用される。このように設定したＰＣＲプライマーの例
としては、センスＰＣＲプライマーとして配列番号３に
示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、アンチセン
スＰＣＲプライマーとして配列番号４又は５に示す塩基
配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。配列番
号１のＲＴプライマーがｃＤＮＡの合成に使用された場
合には、配列番号４のＰＣＲプライマーが、配列番号２
のＲＴプライマーが使用された場合には、配列番号５の
ＰＣＲプライマーが使用される。
【００２４】上記のＲＴプライマーおよびＰＣＲプライ
マーを使用して、ｃＤＮＡの合成およびＰＣＲを行って
得られたＰＣＲ産物を、制限酵素による処理および該処
理物の電気泳動により解析する。
マーを使用して、ｃＤＮＡの合成およびＰＣＲを行って
得られたＰＣＲ産物を、制限酵素による処理および該処
理物の電気泳動により解析する。
【００２５】図２に示されるように、配列番号１のＲＴ
プライマーを用いてｃＤＮＡを合成し、配列番号３およ
び４のＰＣＲプライマーを用いて増幅を行って得られた
ＰＣＲ産物をＢｇｌIIにより消化し、電気泳動を行う
と、２７４ｂｐのｃＤＮＡ由来ＰＣＲ産物（以下、ｍＲ
ＮＡ由来ＰＣＲ産物という）のフラグメントと２５０ｂ
ｐの染色体ＤＮＡ由来ＰＣＲ産物（以下、ＤＮＡ由来Ｐ
ＣＲ産物という）のフラグメントとが検出される。これ
らのＰＣＲ産物の量を比較することにより、ｍＲＮＡの
定量を行うことができる。また、ＰＣＲ産物をＴａｑＩ
により消化し、電気泳動を行うと、２０１ｂｐのｔ型
（ＴａｑＩ認識部位有り）を示すフラグメントと２３２
ｂｐのＴ型（ＴａｑＩ認識部位無し）を示すフラグメン
トが検出され、これにより遺伝子型を決定することがで
きる。
プライマーを用いてｃＤＮＡを合成し、配列番号３およ
び４のＰＣＲプライマーを用いて増幅を行って得られた
ＰＣＲ産物をＢｇｌIIにより消化し、電気泳動を行う
と、２７４ｂｐのｃＤＮＡ由来ＰＣＲ産物（以下、ｍＲ
ＮＡ由来ＰＣＲ産物という）のフラグメントと２５０ｂ
ｐの染色体ＤＮＡ由来ＰＣＲ産物（以下、ＤＮＡ由来Ｐ
ＣＲ産物という）のフラグメントとが検出される。これ
らのＰＣＲ産物の量を比較することにより、ｍＲＮＡの
定量を行うことができる。また、ＰＣＲ産物をＴａｑＩ
により消化し、電気泳動を行うと、２０１ｂｐのｔ型
（ＴａｑＩ認識部位有り）を示すフラグメントと２３２
ｂｐのＴ型（ＴａｑＩ認識部位無し）を示すフラグメン
トが検出され、これにより遺伝子型を決定することがで
きる。
【００２６】配列番号２のＲＴプライマーと配列番号３
および５のＰＣＲプライマーを使用した場合には、制限
酵素としてＫｐｎＩを使用すると、１７９ｂｐのｍＲＮ
Ａ由来ＰＣＲ産物のフラグメントと２０６ｂｐのＤＮＡ
由来ＰＣＲ産物のフラグメントとが検出される。これら
のＰＣＲ産物の量を比較することにより、ｍＲＮＡの定
量を行うことができる。また、ＰＣＲ産物をＫｐｎＩお
よびＴａｑＩにより消化し、電気泳動を行うと、ｍＲＮ
Ａ由来ＰＣＲ産物から、１４８ｂｐのｔ型を示すフラグ
メントと１７９ｂｐのＴ型を示すフラグメントが、ＤＮ
Ａ由来ＰＣＲ産物から、１７５ｂｐのｔ型を示すフラグ
メントと２０６ｂｐのＴ型を示すフラグメントが検出さ
れ、これによりｍＲＮＡ由来遺伝子型とＤＮＡ由来遺伝
子型を同時に決定することができる。
および５のＰＣＲプライマーを使用した場合には、制限
酵素としてＫｐｎＩを使用すると、１７９ｂｐのｍＲＮ
Ａ由来ＰＣＲ産物のフラグメントと２０６ｂｐのＤＮＡ
由来ＰＣＲ産物のフラグメントとが検出される。これら
のＰＣＲ産物の量を比較することにより、ｍＲＮＡの定
量を行うことができる。また、ＰＣＲ産物をＫｐｎＩお
よびＴａｑＩにより消化し、電気泳動を行うと、ｍＲＮ
Ａ由来ＰＣＲ産物から、１４８ｂｐのｔ型を示すフラグ
メントと１７９ｂｐのＴ型を示すフラグメントが、ＤＮ
Ａ由来ＰＣＲ産物から、１７５ｂｐのｔ型を示すフラグ
メントと２０６ｂｐのＴ型を示すフラグメントが検出さ
れ、これによりｍＲＮＡ由来遺伝子型とＤＮＡ由来遺伝
子型を同時に決定することができる。
【００２７】従って、ビタミンＤレセプター遺伝子の発
現量と、ｅｘｏｎ９のＴａｑＩ ＲＦＬＰ領域の多型を
同時に解析でき、または、該遺伝子の発現量を対立遺伝
子（ｔ型およびＴ型）ごとに解析できる。また、この結
果に基づいて、この多型の部位と強く連鎖しているＢｓ
ｍＩ部位などの部位の多型を判定できる。
現量と、ｅｘｏｎ９のＴａｑＩ ＲＦＬＰ領域の多型を
同時に解析でき、または、該遺伝子の発現量を対立遺伝
子（ｔ型およびＴ型）ごとに解析できる。また、この結
果に基づいて、この多型の部位と強く連鎖しているＢｓ
ｍＩ部位などの部位の多型を判定できる。
【００２８】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。
説明する。
【００２９】
【実施例１】培養細胞ＨＬ６０の１×１０4、５×１
０4、１×１０5、５×１０5細胞のそれぞれからスマイ
テストＲ＆Ｄキット（住友金属）でＤＮＡとＲＮＡを抽
出し、最終液量１５μｌとした。このうち７μｌを新し
いチューブに移し、配列番号１に示す塩基配列を有する
１００ｆｍｏｌ／μｌのＲＴプライマー１μｌと滅菌純
水４μｌを添加し、６５℃で５分間加熱後、氷中にて急
冷し、１０×緩衝液（１００ｍＭトリス緩衝液ｐＨ８．
３、５００ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１
％（ｗ／ｖ）ゼラチン）２μｌ、０．５Ｕ／μｌのＲＮ
ａｓｅ阻害剤０．２μｌ、各１０ｍＭのｄＮＴＰ０．３
μｌ、１０Ｕ／μｌのＡＭＶ由来の逆転写酵素０．８μ
ｌを加え、最終液量２０μｌとして４２℃で１時間、ｃ
ＤＮＡ合成を行った。
０4、１×１０5、５×１０5細胞のそれぞれからスマイ
テストＲ＆Ｄキット（住友金属）でＤＮＡとＲＮＡを抽
出し、最終液量１５μｌとした。このうち７μｌを新し
いチューブに移し、配列番号１に示す塩基配列を有する
１００ｆｍｏｌ／μｌのＲＴプライマー１μｌと滅菌純
水４μｌを添加し、６５℃で５分間加熱後、氷中にて急
冷し、１０×緩衝液（１００ｍＭトリス緩衝液ｐＨ８．
３、５００ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１
％（ｗ／ｖ）ゼラチン）２μｌ、０．５Ｕ／μｌのＲＮ
ａｓｅ阻害剤０．２μｌ、各１０ｍＭのｄＮＴＰ０．３
μｌ、１０Ｕ／μｌのＡＭＶ由来の逆転写酵素０．８μ
ｌを加え、最終液量２０μｌとして４２℃で１時間、ｃ
ＤＮＡ合成を行った。
【００３０】ｃＤＮＡ反応終了後、６５℃、１０ｍｉｎ
の加熱により、反応を停止させた。このｃＤＮＡ反応物
を鋳型にして、配列番号３および４に示す塩基配列を有
するＰＣＲプライマーを用いて以下の反応液組成、反応
条件のもとＰＣＲ反応を行った。
の加熱により、反応を停止させた。このｃＤＮＡ反応物
を鋳型にして、配列番号３および４に示す塩基配列を有
するＰＣＲプライマーを用いて以下の反応液組成、反応
条件のもとＰＣＲ反応を行った。
【００３１】
【表１】 反応液組成： １０×緩衝液（１００ｍＭトリス緩衝液ｐＨ８．３、５００ｍＭ ＫＣｌ、１５ ｍＭ ＭｇＣ１2、０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチン） １．５μｌ ｃＤＮＡ反応物 １０μｌ ２５ｐｍｏｌ／μｌに調製した配列番号２および３に示す塩基配列を有するＰＣ Ｒプライマー 各０．２５μｌ 各１０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．３μｌ ＤＭＳＯ ０．１２μｌ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ） ０．２μｌ 最終液量を２５μｌとした。 反応条件： ９４℃ ３分 （９４℃ ３０秒、６２℃ ３０秒、７２℃ １分）３
５サイクル 使用機器：Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ２４００
５サイクル 使用機器：Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ２４００
【００３２】このＰＣＲ産物を定量するために反応液１
０μｌを新しいチューブに移し、７５０ｎｍｏｌ Ｎａ
Ｃｌ、１５０ｎｍｏｌ ＭｇＣｌ2、１５０ｎｍｏｌトリ
ス緩衝液（ｐＨ７．５）と２．０Ｕ ＢｇｌIIを加え滅
菌純水で最終液量１５μｌにして３７℃で１時間反応さ
せた。
０μｌを新しいチューブに移し、７５０ｎｍｏｌ Ｎａ
Ｃｌ、１５０ｎｍｏｌ ＭｇＣｌ2、１５０ｎｍｏｌトリ
ス緩衝液（ｐＨ７．５）と２．０Ｕ ＢｇｌIIを加え滅
菌純水で最終液量１５μｌにして３７℃で１時間反応さ
せた。
【００３３】遺伝子多型用として反応液を１０μｌ、新
しいチューブに移し、１．５μｍｏｌ ＮａＣｌ、７５
ｎｍｏｌ ＭｇＣｌ2、１．５ｍｏｌ ２−メルカプトエ
タノール、１５０ｎｍｏｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）
と２．０Ｕ ＴａｑＩを加え、滅菌純水で最終液量１５
μｌにして６５℃で１時間反応を行った。
しいチューブに移し、１．５μｍｏｌ ＮａＣｌ、７５
ｎｍｏｌ ＭｇＣｌ2、１．５ｍｏｌ ２−メルカプトエ
タノール、１５０ｎｍｏｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）
と２．０Ｕ ＴａｑＩを加え、滅菌純水で最終液量１５
μｌにして６５℃で１時間反応を行った。
【００３４】各制限酵素で反応処理を行ったＰＣＲ産物
をアガロース電気泳動により分離し、エチジウムブロマ
イド染色を行った。その結果、ｍＲＮＡ定量用のＢｇｌ
ＩＩ処理ＰＣＲ産物は、ｍＲＮＡ由来の２７４ｂｐと染
色体ＤＮＡ由来の２５０ｂｐのバンドとして検出され
た。各々の産物の定量結果は図４に示す。また、遺伝子
多型検出用のＴａｑＩ処理ＰＣＲ産物については、この
制限酵素で消化できるものは２０１ｂｐのバンドとし
て、消化できないものは２３２ｂｐのバンドとして検出
された。検出結果を図３に示す。２０１ｂｐのバンドの
み検出される場合はＴＴ型、２３２ｂｐのバンドのみ検
出される場合はｔｔ型、両方が検出される場合はＴｔ型
である。これらは、ＴａｑＩ認識部位多型がＢｓｍＩ認
識部位多型と強く連鎖しているので、それぞれ、ｂｂ
型、ＢＢ型、Ｂｂ型と判定できる。
をアガロース電気泳動により分離し、エチジウムブロマ
イド染色を行った。その結果、ｍＲＮＡ定量用のＢｇｌ
ＩＩ処理ＰＣＲ産物は、ｍＲＮＡ由来の２７４ｂｐと染
色体ＤＮＡ由来の２５０ｂｐのバンドとして検出され
た。各々の産物の定量結果は図４に示す。また、遺伝子
多型検出用のＴａｑＩ処理ＰＣＲ産物については、この
制限酵素で消化できるものは２０１ｂｐのバンドとし
て、消化できないものは２３２ｂｐのバンドとして検出
された。検出結果を図３に示す。２０１ｂｐのバンドの
み検出される場合はＴＴ型、２３２ｂｐのバンドのみ検
出される場合はｔｔ型、両方が検出される場合はＴｔ型
である。これらは、ＴａｑＩ認識部位多型がＢｓｍＩ認
識部位多型と強く連鎖しているので、それぞれ、ｂｂ
型、ＢＢ型、Ｂｂ型と判定できる。
【００３５】
【実施例２】小腸組織（ヒト女性小腸由来（クローンテ
ック））よりＲＮＡをＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）
で抽出し、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０Ｓｕｐｅｒ（Ｔ
ａＫａＲａ）を用いてｐｏｌｙＡ選択ＲＮＡを得た。こ
のｐｏｌｙＡ選択ＲＮＡの一部を使って、分光光度計に
より濃度を測定し１０ｎｇ／μｌとなるように調製し
た。このＲＮＡ（１０ｎｇ／μｌ）の０．１、０．５、
１．０、５．０、１０μｇのそれぞれに、ビタミンＤレ
セプターの発現がないことを確認したヒトリンパ球由来
ｐｏｌｙＡ選択ＲＮＡを加え、総量１μｇのＲＮＡにし
て、配列番号１または配列番号２に示す塩基配列を有す
る１００ｆｍｏｌ／μｌのＲＴプライマー１μｌと滅菌
純水を添加し最終液量１２μｌとして、６５℃５分間加
熱後、氷中にて急冷した。これに、１０×緩衝液（１０
０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ８．３、５００ｍＭ ＫＣｌ、
１５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）２
μｌ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ阻害剤０．２μｌ、
各１０ｍＭのｄＮＴＰ、０．３μｌ、ＡＭＶ由来の逆転
写酵素（１０Ｕ／μｌ）０．８μｌを加え、滅菌純水で
最終液量２０μｌとして４２℃、１時間、それぞれｃＤ
ＮＡ合成を行った。
ック））よりＲＮＡをＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）
で抽出し、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０Ｓｕｐｅｒ（Ｔ
ａＫａＲａ）を用いてｐｏｌｙＡ選択ＲＮＡを得た。こ
のｐｏｌｙＡ選択ＲＮＡの一部を使って、分光光度計に
より濃度を測定し１０ｎｇ／μｌとなるように調製し
た。このＲＮＡ（１０ｎｇ／μｌ）の０．１、０．５、
１．０、５．０、１０μｇのそれぞれに、ビタミンＤレ
セプターの発現がないことを確認したヒトリンパ球由来
ｐｏｌｙＡ選択ＲＮＡを加え、総量１μｇのＲＮＡにし
て、配列番号１または配列番号２に示す塩基配列を有す
る１００ｆｍｏｌ／μｌのＲＴプライマー１μｌと滅菌
純水を添加し最終液量１２μｌとして、６５℃５分間加
熱後、氷中にて急冷した。これに、１０×緩衝液（１０
０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ８．３、５００ｍＭ ＫＣｌ、
１５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）２
μｌ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ阻害剤０．２μｌ、
各１０ｍＭのｄＮＴＰ、０．３μｌ、ＡＭＶ由来の逆転
写酵素（１０Ｕ／μｌ）０．８μｌを加え、滅菌純水で
最終液量２０μｌとして４２℃、１時間、それぞれｃＤ
ＮＡ合成を行った。
【００３６】ｃＤＮＡ反応終了後、６５℃、１０ｍｉｎ
の加熱により、反応を停止させた。各反応終了液を新し
いチューブに１μｌ移し、さらに競合物として健常者よ
り常法に従って抽出した染色体ＤＮＡを１００ｎｇを同
チューブに添加し、配列番号１に示す塩基配列を有する
ＲＴプライマーにてｃＤＮＡを合成したものは配列番号
３および４に示す塩基配列を有するＰＣＲプライマーを
用いて、配列番号２に示す塩基配列を有するＲＴプライ
マーにてｃＤＮＡを合成したものは配列番号３および５
に示す塩基配列を有するＰＣＲプライマーを用いて以下
の反応条件のもとＰＣＲ反応を行った。
の加熱により、反応を停止させた。各反応終了液を新し
いチューブに１μｌ移し、さらに競合物として健常者よ
り常法に従って抽出した染色体ＤＮＡを１００ｎｇを同
チューブに添加し、配列番号１に示す塩基配列を有する
ＲＴプライマーにてｃＤＮＡを合成したものは配列番号
３および４に示す塩基配列を有するＰＣＲプライマーを
用いて、配列番号２に示す塩基配列を有するＲＴプライ
マーにてｃＤＮＡを合成したものは配列番号３および５
に示す塩基配列を有するＰＣＲプライマーを用いて以下
の反応条件のもとＰＣＲ反応を行った。
【００３７】
【表２】 反応液組成： １０×緩衝液（１００ｍＭトリス緩衝液ｐＨ８．３、５００ｍＭ ＫＣｌ、１５ ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチン） ２．５μｌ 各１０ｍＭのｄＮＴＰ ０．３μｌ ＤＭＳＯ ０．１２μｌ Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ） ０．２μｌ 最終液量を２５μｌとした。 反応条件： ９４℃ ３分 （９４℃ ３０秒、６２℃ ３０秒、７２℃ １分）３
５サイクル 使用機器：Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ２４００
５サイクル 使用機器：Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ２４００
【００３８】このＰＣＲ産物を定量するために反応液１
０μｌを新しいチューブに移し、７５０ｎｍｏｌ Ｎａ
Ｃｌ、１５０ｎｍｏｌ ＭｇＣｌ2、１５０ｎｍｏｌトリ
ス緩衝液（ｐＨ７．５）を含む溶液と２．０Ｕ ＢｇｌI
Iを加え最終液量１５μｌにして３７℃１時間反応させ
た。
０μｌを新しいチューブに移し、７５０ｎｍｏｌ Ｎａ
Ｃｌ、１５０ｎｍｏｌ ＭｇＣｌ2、１５０ｎｍｏｌトリ
ス緩衝液（ｐＨ７．５）を含む溶液と２．０Ｕ ＢｇｌI
Iを加え最終液量１５μｌにして３７℃１時間反応させ
た。
【００３９】また、遺伝子多型を検出するために反応液
を１０μｌ、新しいチューブに移し、１．５μｍｏｌ
ＮａＣｌ、７５ｎｍｏｌ ＭｇＣｌ2、１．５ｍｏｌ ２
−メルカプトエタノール、１５０ｎｍｏｌトリス緩衝液
（ｐＨ８．０）を含む溶液と２．０Ｕ ＴａｑＩを加
え、最終液量１５μｌにして６５℃１時間反応を行っ
た。
を１０μｌ、新しいチューブに移し、１．５μｍｏｌ
ＮａＣｌ、７５ｎｍｏｌ ＭｇＣｌ2、１．５ｍｏｌ ２
−メルカプトエタノール、１５０ｎｍｏｌトリス緩衝液
（ｐＨ８．０）を含む溶液と２．０Ｕ ＴａｑＩを加
え、最終液量１５μｌにして６５℃１時間反応を行っ
た。
【００４０】各制限酵素処理を行ったＰＣＲ産物をアガ
ロースゲル電気泳動に付した後、エチジウムブロマイド
染色により定量を行った。結果は図５に示す。
ロースゲル電気泳動に付した後、エチジウムブロマイド
染色により定量を行った。結果は図５に示す。
【００４１】
【発明の効果】本発明は、ＰＣＲ法を基本とし、さらに
それを発展させた、ビタミンＤレセプターなどの遺伝子
のｍＲＮＡの定量と遺伝子多型解析が同時にできるｍＲ
ＮＡの定量法を提供する。従来別々に定量と遺伝子多型
解析を行っていたものが同じ反応系において検出解析す
ることができ、従来法より優れた定量法である。
それを発展させた、ビタミンＤレセプターなどの遺伝子
のｍＲＮＡの定量と遺伝子多型解析が同時にできるｍＲ
ＮＡの定量法を提供する。従来別々に定量と遺伝子多型
解析を行っていたものが同じ反応系において検出解析す
ることができ、従来法より優れた定量法である。
【００４２】
配列番号：１ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ACAGGCTGTC CTAGTCAGGA GATATCATTG CCAAA 35
【００４３】配列番号：２ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 GCACTCAGGC TGGAAGGAGA GGCAGCGGTA CCGCTT 36
【００４４】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 ATCGTCCTGG GGTGCAGGAC 20
【００４５】配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 ACAGGCTGTC CTAGTCAGGA 20
【００４６】配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 GCACTCAGGC TGGAAGGAGA 20
【図１】競合的ＰＣＲ法の概略を示す。
【図２】本発明に用いたオリゴヌクレオチドおよび制限
酵素で消化したＰＣＲ産物の概略を示す。
酵素で消化したＰＣＲ産物の概略を示す。
【図３】制限酵素処理後のＰＣＲ産物の検出結果を示
す。
す。
【図４】ｍＲＮＡの定量結果を示す。
【図５】ｍＲＮＡの定量結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 畠 啓視 東京都板橋区志村３丁目30番１号 株式会 社三菱化学ビーシーエル内
Claims (4)
- 【請求項１】 検出対象のｍＲＮＡから逆転写により合
成されたｃＤＮＡを、該ｃＤＮＡに対応する部分の染色
体ＤＮＡと共に増幅させることを含む競合ＰＣＲ法によ
るｍＲＮＡ定量法において、 増幅させる塩基配列が一つのエクソン内にあり、前記塩
基配列内に遺伝子の多型があることを特徴とするｍＲＮ
Ａ定量法。 - 【請求項２】 組織もしくは細胞より抽出したｍＲＮＡ
を鋳型にして、ｃＤＮＡを合成する際に、新たに制限酵
素認識部位を導入するか、または、制限酵素認識部位を
除去するように設定したオリゴヌクレオチド（ＲＴプラ
イマー）を用いることを特徴とする請求項１記載の方
法。 - 【請求項３】 ｍＲＮＡの定量を行う遺伝子がビタミン
Ｄレセプター遺伝子であり、増幅させる塩基配列がビタ
ミンＤレセプター遺伝子ｅｘｏｎ９内にあり、遺伝子の
多型がＴａｑＩ認識部位（Ｔ’ＣＧＡ）の有無であるこ
とを特徴とする請求項１または２記載の方法。 - 【請求項４】 ＲＴプライマーが配列番号１または配列
番号２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであ
り、増幅の際に用いる同一エクソン内のオリゴヌクレオ
チドが、ＲＴプライマーが配列番号１の塩基配列を有す
る場合には、配列番号３および配列番号４に示す塩基配
列を有し、ＲＴプライマーが配列番号２の塩基配列を有
する場合には、配列番号３および配列番号５に示す塩基
配列を有するものであることを特徴とする請求項３記載
の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8299136A JPH10136998A (ja) | 1996-11-11 | 1996-11-11 | ｍＲＮＡの定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8299136A JPH10136998A (ja) | 1996-11-11 | 1996-11-11 | ｍＲＮＡの定量法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10136998A true JPH10136998A (ja) | 1998-05-26 |
Family
ID=17868596
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8299136A Pending JPH10136998A (ja) | 1996-11-11 | 1996-11-11 | ｍＲＮＡの定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10136998A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000032763A1 (fr) * | 1998-11-27 | 2000-06-08 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Synthese d'adn complementaire |
-
1996
- 1996-11-11 JP JP8299136A patent/JPH10136998A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000032763A1 (fr) * | 1998-11-27 | 2000-06-08 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Synthese d'adn complementaire |
| US6485917B1 (en) | 1998-11-27 | 2002-11-26 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Method for synthesizing cDNA |
| US6949634B2 (en) | 1998-11-27 | 2005-09-27 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Method for synthesizing cDNA |
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