RU2662972C1 - Способ проведения ПЦР с аллель-специфичными зондами для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и К гена DGAT1 - Google Patents
Способ проведения ПЦР с аллель-специфичными зондами для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и К гена DGAT1 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2662972C1 RU2662972C1 RU2018115656A RU2018115656A RU2662972C1 RU 2662972 C1 RU2662972 C1 RU 2662972C1 RU 2018115656 A RU2018115656 A RU 2018115656A RU 2018115656 A RU2018115656 A RU 2018115656A RU 2662972 C1 RU2662972 C1 RU 2662972C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dgat1
- allele
- cattle
- gene
- alleles
- Prior art date
Links
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 title claims abstract description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 title claims abstract description 33
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 28
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 15
- 101150042222 DGAT1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 21
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102100036869 Diacylglycerol O-acyltransferase 1 Human genes 0.000 abstract description 27
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 101000927974 Homo sapiens Diacylglycerol O-acyltransferase 1 Proteins 0.000 abstract 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108010001348 Diacylglycerol O-acyltransferase Proteins 0.000 description 23
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 13
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 13
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 108050004099 Diacylglycerol O-acyltransferase 1 Proteins 0.000 description 4
- 101710088335 Diacylglycerol acyltransferase/mycolyltransferase Ag85A Proteins 0.000 description 4
- 101710088334 Diacylglycerol acyltransferase/mycolyltransferase Ag85B Proteins 0.000 description 4
- 101710088427 Diacylglycerol acyltransferase/mycolyltransferase Ag85C Proteins 0.000 description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 4
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 235000021243 milk fat Nutrition 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100499138 Bos taurus DGAT1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 102100030874 Leptin Human genes 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 235000021003 saturated fats Nutrition 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 235000021081 unsaturated fats Nutrition 0.000 description 2
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000002148 Diacylglycerol O-acyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 101150018889 FABP4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100030431 Fatty acid-binding protein, adipocyte Human genes 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 101150032906 LEP gene Proteins 0.000 description 1
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102100023421 Nuclear receptor ROR-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 101100008883 Oryza sativa subsp. japonica DGAT1-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150042659 RORC gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 101150097713 SCD1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000012405 in silico analysis Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N leptin Chemical compound O=C([C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CCSC)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N 0.000 description 1
- 229940039781 leptin Drugs 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005065 mining Methods 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000003441 saturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N tristearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярно-генетической диагностики. Раскрыт способ проведения ПЦР с аллель-специфичными зондами для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и К гена DGAT1. Изобретение позволяет расширить арсенал способов генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и К DGAT1 на основе ПЦР в реальном времени и повысить их надежность. 2 ил.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, генетики и селекции сельскохозяйственных животных, в частности к оценке аллельного полиморфизма гена, кодирующего диацилглицерол-О-ацилтрансферазу 1 (DGAT1) крупного рогатого скота молекулярно-генетическим методом исследования.
Диацилглицерол-О-ацилтрансфераза 1 (DGAT1, ЕС 2.3.1.20) является одним из ключевых ферментов метаболизма триглицеридов - катализирует заключительную стадию их биосинтеза, используя 1,2-диациллицерол и ацил-СоА в качестве субстрата (Farese Jr R.V., Cases S., Smith S.J. Triglyceride synthesis:insights from the cloning of diacylglycerol acyltransferase // Curr.Opin.Lipidol. - 2000. - Vol. 11. - P. 229-234). DGAT1 играет важную роль в ряде физиологических процессов высших эукариот, таких как регуляция концентрации триацилглицеридов в крови, формирование жировой ткани, созревание ооцитов и др. (Homa S.T., Racowsky С., McGaughey R.W. Lipid analysis of immature pig oocytes // J. Reprod. Fertil. - 1986. - Vol. 77. - P. 425-434.; Cases S., Smith S.J., Zheng Y.W., Myers H.M., Lear S.R., Sande E., Novak S., Collins C., Welch C.B., Lusis A.J., Erickson S.K., Farese R.V. Jr. Identification of a gene encoding an acyl CoA: diacylglycerol acyltransferase, a key enzyme in triacylglycerol synthesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1998. - Vol. 95. No. 22. - P. 13018-13023). Дефицит DGAT1 приводит к нарушению синтеза жирных кислот в жировой ткани и скелетных мышцах (Chen Н.С., Smith S.J., Ladha Z. Increased insulin and leptin sensitivity in mice lacking acyl CoA: diacylglycerol acyltransferase 1 // J. Clin. Invest. - 2002. - Vol. 109. - P. 1049-1055), a также лактации вплоть до ее отсутствия (Smith S.J., Cases S., Jensen D.R., Chen H.C., Sande E., Tow В., Sanan D.A., Raber J., Eckel R.H. and FareseR.V.Jr. Obesty resistance and multiple mechanisms of triglyceride // Nat. Genet. - 2000. - Vol. 25. - No. 1. - P. 87-90).
Ген, кодирующий DGAT1 у Bos taurus, расположен в центромерном участке хромосомы 14 вместе с другими генами, определяющими молочную продуктивность и качество молока и формирующими так называемый локус количественных признаков QTL (Quantitative trait loci) (Riquet J., Coppieters W., Cambisano N., et al. Identity-bydecent fine-mapping of QTL in outbred populations: Application to milk production in dairy cattle // Proc. Natl. Acad. Sci. - 1999. - Vol. 96. - P. 9252-9257; Farnir F.B., Grisart W., Coppieters J., et al. Simultaneous mining of linkage and linkage disequilibrium to fine map quantitative trait loci in outbred half-sib pedigrees: revisting the location of a quantitative trait locus with major effect on milk production on bovine chromosome 14 // Genetics. - 2002. - Vol. 161. - P. 275-287). Изучение аллельного полиморфизма гена DGAT1 позволило выявить в общей сложности около двух десятков однонуклеотидных замен, большинство из которых локализованы в некодирующих участках гена и, таким образом, не влияет на структуру самого фермента (Winter A., 
W, Werner F.A, Kollers S., Kata S., Durstewitz G., Buitkamp J., Womack J.E., Thaller G., Fries R. Association of a lysine-232/alanine polymorphism in a bovine gene encoding acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferase (DGAT1) with variation at a quantitative trait locus for milk fat content // Proc. Natl. Acad. Sci. - 2002. - Vol. 99. - P. 9300-9305; Grisart В., Coppieters W., Farnir F., Karim L et al. Positional candidate cloning of a QTL in dairy cattle: identification of a missense mutation in the bovine DGAT1 gene with major effect on milk yield and composition // Genome Res. - 2002. - Vol. 12. - No. 2, P. 222-231; Kong H.S., OhJ.D., LeeJ.H., YoonD.H., ChoiY.H., ChoB.W., Lee H.K. and JeonG.J. Association of Sequence Variations in DGAT 1 Gene with Economic Traits in Hanwoo (Korea Cattle) // Asian-Aust. J. Anim. Sci. - 2007. - No. 6. - P. 817-820; Rosse Ida C., Steinberg Rda S., Coimbra R.S., Peixoto M.G., Verneque R.S., Machado M.A., Fonseca C.G., Carvalho M.R. Novel SNPs and INDEL polymorphisms in the 3'UTR of DGAT1 gene: in silico analyses and a possibleassociation // Mol. Biol. Rep. - 2014. - Vol. 41. - No. 7. - P. 4555-4563). Исключением является двунуклеотидная замена GC→АА в экзоне 8 (позиция 10433/10434 в нуклеотидной последовательности гена DGAT1 GenBank No. AJ318490), которая приводит к замене аминокислотного остатка аланина на лизин в позиции 232 зрелого белка DGAT1 (А→K). Исследования, проведенные на разных породах крупного рогатого скота, выявили связь между наличием аллеля 232K и повышенным содержанием жира в молоке и преобладанием насыщенных жирных кислот С16:0 и С18:0 над ненасыщенными (Grisart В., Coppieters W., Farnir F., Karim L et al. Positional candidate cloning of a QTL in dairy cattle: identification of a missense mutation in the bovine DGAT1 gene with major effect on milk yield and composition // Genome Res. - 2002. - Vol. 12. - No. 2, P. 222-231; Spelman R.J., Ford C.A., Mcelhinney P., Gregory G.C., Snell R.G. Characterization of the DGAT1 gene in the New Zealand dairy population // J. Dairy Sci - 2002. - Vol. 85. - P. 3514-3517; Fisher P.J., Spelman R.J.. Verification of selective DNA pooling methodology through identification and estimation of the DGAT1 effect // Anim. Genet - 2004-. Vol. 35. - P. 201-205; Winter A., W, Werner F.A, Kollers S., Kata S., Durstewitz G., Buitkamp J., Womack J.E., Thaller G., Fries R. Association of a lysine-232/alanine polymorphism in a bovine gene encoding acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferase (DGAT1) with variation at a quantitative trait locus for milk fat content // Proc. Natl. Acad. Sci. - 2002. - Vol. 99. - P. 9300-9305; 
A., Balteanu V.A., Gal E., Pusta D., Mihaiu R., Dan S.D., A.F., Mihaiu M. Influence of DGAT1 K232A polymorphism on milk fat percentage and fatty acid profiles in Romanian holstein cattle. Anim. Biotechnol. - 2015 - Vol. 26. - No. 2. - P. 105-111). Также имеются данные о связи аллеля К с повышенным содержанием внутримышечного жира и мраморностью говядины (Thaller G., 
С., Winter A., Ewald G., Bellmann О., Wegner J., 
H., Fries R. DGAT1, a new positional and functional candidate gene for intramuscular fat deposition in cattle // Anim. Genet. - 2003. Vol. 34. - No. 5. - P. 354-357; Kong H.S., OhJ.D., LeeJ.H., YoonD.H., ChoiY.H., ChoB.W., Lee H.K. and JeonG.J. Association of Sequence Variations in DGAT 1 Gene with Economic Traits in Hanwoo (Korea Cattle) // Asian-Aust. J. Anim. Sci. - 2007. - No. 6. - P. 817-820; 
, PolvilloO., 
, 
, 
, Molina A. Associations between DGAT1, FABP4, LEP, RORC, and SCD1 gene polymorphisms and fat deposition in Spanish commercial beef // J. Anim. Sci. - 2013. - Vol. 91. - No. 10. - P. 4571-4577). Таким образом, ген DGAT1 признан геном-кандидатом для контроля содержания и состава жиров в молоке и мясе крупного рогатого скота. Селекция крупного рогатого скота по аллелю А может улучшить качество молока по содержанию ненасыщенных жиров, в то время как отбор животных по аллелю К может способствовать увеличению содержания насыщенных жиров в молоке и мясе.
Известны методы идентификации аллельных вариантов А и K гена DGAT1 с использованием ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция с последующим анализом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов). Метод ПЦР-ПДРФ включает следующие этапы: 1) выделение геномной ДНК; 2) амплификация полиморфного участка гена; 3) рестрикцию ампликона специфической эндонуклеазой (рестриктазой); 4) электрофоретическое разделение образующихся фрагментов ДНК и анализ полученных электрофореграмм. Существуют различные способы проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и K DGAT. Различия касаются используемых праймеров для ПЦР и эндонуклеазы для рестрикции ампликона. Так, в способе, предложенном Komisarek с соавторами (Komisarek J., Michalak A. A relationship between DGAT1 K232A polymporphism and selected reproductive traits in Polish Holstein-Friesian cattle // Anim. Sci. Pap. and Rep - 2008. - Vol. 26 - №2. - P. 89-95), используются праймеры F: 5-TGCCGCTTGCTCGTAGCTTTGGCC-3 R: 5-ACCTGGAGCTGGGTGAGGAACAGC-3, инициирующие амплификацию фрагмента гена DGAT1 длиной 378 п.н., и рестриктаза BglI. При этом получаются следующие генотип-специфичные профили: генотип АА=254/96/28 п.н., генотип KK=282/96 п.н., генотип AK=282/254/96/28 п.н. В способе, предложенном в статье Тюлькина С.В. с соавторами (Тюлькин С.В., Вафин P.P., Муратова А.В., Хатыпов И.И., Загидуллин Л.Р., Рачкова Е.Н., Ахметов Т.М., Равилов Р.Х. Разработка способа проведения ПЦР-ПДРФ на примере DGAT1-гена крупного рогатого скота // Фундаментальные исследования. - 2015. - №2-17. - С. 3773-3775) используются три праймера (DGAT1-1: 5'-CCGCTTGCTCGTAGCTTTCGAAGGTAACGC-3', DGAT 1-2: 5'-CCGCTTGCTCGTAGCTTTGGCAGGTAACAA-3' и DGAT1-3: 5'-AGGATCCTCACCGCGGTAGGTCAGG-3'), два из которых являются аллель-специфичными, а третий- общий для обоих аллелей гена DGAT1. С помощью праймеров осуществляется амплификация участка гена длиной 100 п.н., который затем расщепляется рестриктазой 
TaqI, создавая следующие профили: генотип АА=82/18 п.н., генотип КК=100 п.н. и АК=100/82/18 п.н. В методе, предложенном Kong с соавторами (Kong и др., 2007), использовались праймеры Forward: 5'-TTCCTCAAGCTGTTCTCCTA-3' и Reverse: 5'-CACGTACCTGCTGGATCA-3' и рестриктаза EaeI. Получаемые профили генотипов: КК=558 п.н., АА=369/189 п.н., АК=558/369/189 п.н. В методе, предложенном Winter (Winter и др., 2002) используются праймеры F: 5'-GCACCATCCTCTTCCTCAAG-3' и R: 5'-GGAAGCGCTTTCGGATG-3' и рестриктаза CfrI (профили генотипов -АА=203/208 п.н., КК=411 п.н., АК=411/203/208 п.н). В методе, предложенном нами ранее (Глазко и др., 2016), использовались праймеры DGAT1-dir: 5'-TGCTGGCCCTGATGGTCTACAC-3' и DGAT1-rev: 5-GAAGGAAGCAAGCGGACAGT-3' и рестриктаза AcoI. Получаемые профили генотипов: КК=540, АА=220/320, АК=540/220,320.
Основными недостатками метода ПЦР-ПДРФ являются: длительность и трудоемкость анализа (более 6-8 часов до получения результата), низкая производительность, отсутствие возможности автоматизации анализа, вероятность недостоверных результатов в случае неоптимального соотношения количества ДНК, рестриктазы и времени рестрикции. Лимитирующим фактором для применения данного метода является отсутствие рестриктаз к необходимому полиморфному участку гена.
Эффективной альтернативой ПЦР-ПДРФ анализу является метод ПЦР в реальном времени с использованием аллель-специфичных линейный разрушаемых зондов (TaqMan). Зонд типа TaqMan представляет собой олигонуклеотид, комплементарный нужному участку ПЦР-продукта и меченый флюорофором и гасителем флюоресценции. В структуре зонда TaqMan флуорофор и гаситель TaqMan зонда сближены настолько, что флуоресценция подавлена. При накоплении продукта реакции зонд гибридизуется на соответствующий участок ампликона, после чего разрушается за счет 5'-концевой активности Taq-полимеразы. Разрушение зонда приводит к отрыву флуорофора от гасителя и началу флуоресценции. Интенсивность флуоресцентного сигнала возрастает с каждым циклом ПЦР пропорционально накоплению целевого ПЦР-продукта. Дифференциация аллелей с помощью аллель-специфичных зондов TaqMan основана на эффективности их гибридизации на содержащие полиморфную позицию продукты ПЦР. И хотя различие в эффективности гибридизации зондов при однонуклеотидных заменах незначительна, эта небольшая разница накапливается от цикла к циклу и, в итоге, позволяет достоверно различать аллели (Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю., Семенов П.А., Савилова A.M., Кофиади И.А., Абрамов Д.Д. ПЦР в реальном времени // Бином. Лаборатория знаний, 2009).
Таким образом, в настоящее время существует несколько подходов для определения аллельных вариантов гена DGAT1, ассоциированных с содержанием и составом жиров в молоке и мясе крупного рогатого скота.
Из уровня техники известен способ генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и K гена DGAT1, обеспечивающий их идентификацию на основе ПЦР в реальном времени в формате гибридизационно-флуоресцентной детекции (прототип - патент РФ №2619167, 2017 г.). Способ состоит в том, что аллели диагностируют методом анти-праймер-опосредованной количественной ПЦР в реальном времени (anti-primer-based quantitative real-time PCR, aQRT-PCR) с помощью аллель-специфичных 5'-флуоресцентно-меченых праймеров с использованием анти-праймера, меченого гасителем флуоресценции с 3'-конца. Недостатком данного метода можно обозначить использование в реакции аллель-специфичных праймеров, которые при использовании неоптимальных условий проведения реакции способны неспецифично отжигаться на матрице ДНК, что может приводить к получению ложноположительных результатов и снижению надежности способа.
Техническим результатом предлагаемого способа является расширение арсенала способов генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и К DGAT1 на основе ПЦР в реальном времени и повышение их надежности.
Технический результат достигается тем, что способ проведения ПЦР с аллель-специфичными зондами для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и К гена DGAT1, отличающийся тем, что используются:
прямой общий праймер 5'-TGCTGGCCCTGATGGTCTACAC-3' (SEQ ID NO 1),
обратный общий праймер 5'-GCGGTAGGTCAGGTTGTCGG-3' (SEQ ID NO 2),
А-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд
5'-(FAM)TAAGGCGGCCAACGGGGGAGCTGC(BHQ1)-3' (SEQ ID NO 3),
К-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд
5'-(CY5)TAAGAAGGCCAACGGGGGAGCTGC(BHQ2)-3' (SEQ ID NO 4).
Перечень графических материалов.
На фиг. 1 представлены нуклеотидные последовательности фрагмента гена DGAT1 длиной 279 п.н., кодирующие аллели А и К DGAT1. Жирным шрифтом отмечены последовательности праймеров и зондов.
На фиг. 2 представлены: А - пример диаграммы распределения аллелей А и К DGAT1, Б - результат исследования гомозиготного образца по аллелю А (генотип АА), В - результат исследования гомозиготного образца по аллелю К (генотип КК), Г - кривые флуоресценции для гетерозигот АК.
Патентуемый способ заключается в проведения ПЦР в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллельным вариантам GC/AA гена DGAT1 в позиции 10433/10434 последовательности GenBank No. AJ318490, кодирующим в позиции 232 белка DGAT1 аланин/лизин, соответственно. Заявленный способ отличается тем, что используются два общих для аллельных вариантов праймера: прямой праймер DGAT1-F: 5'- TGCTGGCCCTGATGGTCTACAC-3' (SEQ ID NO: 1) и обратный праймер DGAT1-R: 5'-GCGGTAGGTCAGGTTGTCGG-3' (SEQ ID NO: 2) фланкирующие участок гена DGAT1 длиной 279 п.н., и два аллель-специфичных флуоресцентно-меченых зонда типа TaqMan: DGAT1 - A: 5'-(FAM)TAAGGCGGCCAACGGGGGAGCTGC(BHQ1)-3' (SEQ ID NO: 3) и DGAT1-К:5'-(Cy5)TAAGAAGGCCAACGGGGGAGCTGC(BHQ2)-3' (SEQ ID NO: 4). Точки мутаций те же, что и в прототипе (патент на изобретение 2619167 опубл. 12.05.2017 Бюл. №14), однако подход детекции иной: в заявленном изобретении осуществляется идентификация полиморфизма GC/AA гена DGAT1 в позиции 10433/10434 (локус №) с помощью двух аллель-специфичных TaqMan зондов.
В патентуемом способе идентификации аллельных вариантов А и K DGAT1 на основе ПЦР в реальном времени используются два праймера, общие для обоих аллелей гена DGAT1, и два аллель-специфичных флуоресцентно-меченых зонда типа TaqMan (Фиг. 1). Праймеры DGAT1-D и DGAT1-R инициируют амплификацию участка гена DGAT1 крупного рогатого скота длиной 279 п.н. Реакцию амплификации проводили в 10 мкл смеси ПЦР, содержащей 5 мкл реактива LightCycler® 480 ProbesMaster («Roche», Швейцария), по 0.4 мкМ прямого и обратного праймера, по 0.2 мкМ аллель-специфичных зондов, 20 нг ДНК. ПЦР проводили с помощью прибора LightCycler 96 («Roche», Швейцария) при следующих условиях: начальная денатурация в течение 10 мин при 95°С; последующие 40 циклов амплификации в следующем режиме - денатурация при 95°С в течение 15 с, отжиг при 60°С в течение 15 с, элонгация при 72°С в течении 15 с. Детекция флуоресценции проводилась на стадии элонгации по каналам FAM и Су5.
Идентификация аллелей А и К проводится на основании сравнения интенсивности флуоресценции красителей Fam и Су5, соответственно. Для определения генотипа животного используются конечные значения флуоресценции красителей Fam и Су5. Анализ результатов генотипирования проводили с использованием программного обеспечения для амплификатора LightCycler® 96 версии SW1.1. Программное обеспечение представляет результаты генотипирования в виде распределения аллелей (Фиг. 2А). Для гомозиготных образцов по аллелю А (генотип АА) детектируется нарастание флуоресценции по каналу Fam (Фиг. 2Б). Для гомозиготных образцов по аллелю К (генотип КК) детектируется сигнал по каналу Су5 (Фиг. 2В). Для гетерозиготного образца (генотип АК) наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции (Фиг. 2Г).
Наличие двух красителей, Fam и Су5, позволяет однозначно определить присутствие каждого из исследуемых аллелей гена DGAT1 в анализируемом образце ДНК и, соответственно, генотип животного.
Разработанный способ был апробирован на 50 образцах ДНК коров черно-пестрого голштинизированного скота. По результатам генотипирования 50% животных являлись гетерозиготами (генотип АК), 29,2% - гомозиготами по аллелю А (генотип АА) и 20,8% животных - гомозитотами по аллелю К (генотип КК). Валидацию способа проводили с помощью ПЦР-ПДРФ анализа (Глазко В.И., Андрейченко И.Н., Ковальчук С.Н., Глазко Т.Т., Косовский Г.Ю. Гены-кандидаты контроля характеристик молочной продуктивности крупного рогатого скота // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2016. - №5. - С. 45-50). Результаты обоих способов генотипирования полностью совпали. Однако патентуемый способ генотипирования крупного рогатого скота по аллелям К и А DGAT1 методом ПЦР в реальном времени позволяет значительно (до 1 часа) сократить время проведения анализа, что выгодно отличает его от ПЦР-ПДРФ анализа. На той же выборке патентуемый способ сравнивали со способом по прототипу: для 49-ти образцов результаты обоих способов и результаты ПЦР-ПДРФ анализа совпали. Один образец с генотипом АК определялся по методу прототипа как АА (ошибка составила 2%).
Таким образом, разработан эффективный и надежный способ для экспресс-идентификации аллельных вариантов К и А гена DGAT1 крупного рогатого скота методом ПЦР в реальном времени с использование аллель-специфичных зондов, который может быть использован при селекция крупного рогатого скота для прогноза качества молока и мяса по содержанию насыщенных и ненасыщенных жиров.
Claims (7)
- Способ проведения ПЦР с аллель-специфичными зондами для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и К гена DGAT1, отличающийся тем, что используются:
- прямой общий праймер 5'-TGCTGGCCCTGATGGTCTACAC-3'(SEQ ID NO 1),
- обратный общий праймер 5'-GCGGTAGGTCAGGTTGTCGG-3'(SEQ ID NO 2),
- А - аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд
- 5'-(FAM)TAAGGCGGCCAACGGGGGAGCTGC(BHQ1)-3'(SEQ ID NO 3),
- К - аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд
- 5'-(CY5)TAAGAAGGCCAACGGGGGAGCTGC(BHQ2) (SEQ ID NO 4).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018115656A RU2662972C1 (ru) | 2018-04-26 | 2018-04-26 | Способ проведения ПЦР с аллель-специфичными зондами для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и К гена DGAT1 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018115656A RU2662972C1 (ru) | 2018-04-26 | 2018-04-26 | Способ проведения ПЦР с аллель-специфичными зондами для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и К гена DGAT1 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2662972C1 true RU2662972C1 (ru) | 2018-07-31 |
Family
ID=63142444
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018115656A RU2662972C1 (ru) | 2018-04-26 | 2018-04-26 | Способ проведения ПЦР с аллель-специфичными зондами для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и К гена DGAT1 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2662972C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2803522C1 (ru) * | 2023-03-30 | 2023-09-14 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ генотипирования полиморфного локуса rs12561767 (GA) гена SERBP1 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003004630A2 (en) * | 2001-07-06 | 2003-01-16 | Arbeitsgemeinschaft Deutscher Rinderzüchter E.V. (Adr) | Method for determining the genetic predisposition of a mammal for its milk fat content and/or for its intramuscular fat content |
| JP2006166824A (ja) * | 2004-12-17 | 2006-06-29 | Japan Health Science Foundation | Ｄｇａｔ１またはｄｇａｔ２の活性を変化させる被試験物質のスクリーニング方法 |
| RU2012131283A (ru) * | 2009-12-21 | 2014-01-27 | Сантори Холдингз Лимитед | Гены диацилглицерол-ацилтрансферазы и их использование |
-
2018
- 2018-04-26 RU RU2018115656A patent/RU2662972C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003004630A2 (en) * | 2001-07-06 | 2003-01-16 | Arbeitsgemeinschaft Deutscher Rinderzüchter E.V. (Adr) | Method for determining the genetic predisposition of a mammal for its milk fat content and/or for its intramuscular fat content |
| JP2006166824A (ja) * | 2004-12-17 | 2006-06-29 | Japan Health Science Foundation | Ｄｇａｔ１またはｄｇａｔ２の活性を変化させる被試験物質のスクリーニング方法 |
| RU2012131283A (ru) * | 2009-12-21 | 2014-01-27 | Сантори Холдингз Лимитед | Гены диацилглицерол-ацилтрансферазы и их использование |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2803522C1 (ru) * | 2023-03-30 | 2023-09-14 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ генотипирования полиморфного локуса rs12561767 (GA) гена SERBP1 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов |
| RU2819936C1 (ru) * | 2023-12-23 | 2024-05-28 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ генотипирования полиморфного локуса rs3802963 (CG) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме реального времени с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов |
| RU2819930C1 (ru) * | 2023-12-26 | 2024-05-28 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ генотипирования полиморфного локуса rs10832676 (A>G) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов |
| RU2825465C1 (ru) * | 2024-01-23 | 2024-08-26 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs5762821 (G>A) гена длинной некодирующей РНК человека (lncRNA, Ensembl ID: ENSG00000226471) методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9040238B2 (en) | Polynucleotides for use in medicine | |
| KR101418402B1 (ko) | 돼지의 등심단면적 수준 판단용 ｓｎｐ 마커 및 이의 용도 | |
| KR101751932B1 (ko) | 신규한 dna 표지인자 및 이를 이용한 선별방법 | |
| EP1609876A1 (en) | Identification of the gene and mutation for progressive rod-cone degeneration in dog and method for testing same | |
| KR20100120669A (ko) | 고혈압 감수성 유전자군의 동정 | |
| KR101890350B1 (ko) | 돼지의 육질 예측용 snp 마커 및 이의 용도 | |
| KR20140087785A (ko) | 돼지의 흑모색 판단용 ｓｎｐ 마커 및 이의 용도 | |
| KR101796158B1 (ko) | 돼지의 산자수 예측용 nat9 유전자의 snp 마커 및 이를 이용한 돼지 다산 개체 선발 방법 | |
| RU2662972C1 (ru) | Способ проведения ПЦР с аллель-специфичными зондами для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и К гена DGAT1 | |
| US20160060696A1 (en) | Method for the identification by molecular techniques of genetic variants that encode no d antigen (d-) and altered c antigen (c+w) | |
| Kale et al. | FASN gene and its role in bovine milk production | |
| KR101784163B1 (ko) | 돼지의 등지방두께 저감 판단용 snp 마커 및 이의 용도 | |
| KR101076612B1 (ko) | 윌슨병 진단용 조성물 | |
| KR102001528B1 (ko) | 한국 재래돼지 식별용 유전자 마커 및 이의 용도 | |
| KR101929381B1 (ko) | 돼지의 지방산 조성 판별용 유전자 마커 및 이의 이용 | |
| KR101696692B1 (ko) | 돼지의 근육 내 근섬유타입 ⅰ의 수준 판단용 snp 마커 및 이의 용도 | |
| US20120183958A1 (en) | Methods for predicting fat and lean phenotypes in chickens | |
| RU2744174C1 (ru) | Способ генотипирования крупного рогатого скота по аллелям 878 СТ гена scd1 (rs41255693) методом ПЦР в режиме реального времени | |
| RU2722564C1 (ru) | Молекулярно-генетические маркеры цветовых вариаций американской норки и способ выявления особей, являющихся носителем аллелей, обуславливающих формирование желаемой цветовой вариации | |
| KR102083675B1 (ko) | 단일염기다형성 마커를 이용한 칡소 품종 식별 방법 | |
| KR101796167B1 (ko) | 돼지의 산자수 예측용 map3k3 유전자의 snp 마커 및 이를 이용한 돼지 다산 개체 선발 방법 | |
| JP2009065861A (ja) | ウシ脂肪交雑形成に関わる一塩基多型およびその利用 | |
| KR101796170B1 (ko) | 돼지의 산자수 예측용 igfbp 유전자의 snp 마커 및 이를 이용한 돼지 다산 개체 선발 방법 | |
| KR101796160B1 (ko) | 돼지의 산자수 예측용 dact3 유전자의 snp 마커 및 이를 이용한 돼지 다산 개체 선발 방법 | |
| KR101784164B1 (ko) | 돼지의 포화 및 불포화 지방산 함량을 조절하는 snp 및 이의 용도 |