JPH0866197A - Ｈｌａクラスｉ ｄｎａタイプの決定方法及びそのためのキット - Google Patents

Ｈｌａクラスｉ ｄｎａタイプの決定方法及びそのためのキット

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JPH0866197A
JPH0866197A JP4295646A JP29564692A JPH0866197A JP H0866197 A JPH0866197 A JP H0866197A JP 4295646 A JP4295646 A JP 4295646A JP 29564692 A JP29564692 A JP 29564692A JP H0866197 A JPH0866197 A JP H0866197A
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nucleic acid
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ブガワン テオドリカ
Henry A Erlich
エイ．エーリッヒ ヘンリー
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F Hoffmann La Roche AG
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 ＨＬＡクラスＩ ＤＮＡのタイプ分け方法、
及びそのためのキットを提供する。 【構成】 サンプル中の核酸のＨＬＡクラスＩ ＤＮＡ
タイプの決定方法であって、（ａ）クラスＩ ＨＬＡ対
立遺伝子第２及び／又は第３エクソン配列を含有するサ
ンプル中の核酸を増幅し；（ｂ）段階（ａ）において増
幅された前記核酸と１パネルのオリゴヌクレオチドプロ
ーブとを、該プローブが正確に相補的な配列にのみハイ
ブリダイズする条件下でハイブリダイズせしめ；そして
（ｃ）段階（ｂ）のプローブハイブリダイゼーションの
パターンから、前記サンプル中の核酸が由来するクラス
Ｉ ＨＬＡ対立遺伝子を決定する；ことを含んで成る方
法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＨＬＡクラスＩ核酸のＤ
ＮＡタイプ分けのための方法及び試薬を提供する。さら
に詳しくは、本発明は、サンプル中の核酸のＨＬＡクラ
スＩ ＤＮＡタイプの決定方法であって、 （ａ）クラスＩ ＨＬＡ対立遺伝子第２及び／又は第３
エクソン配列を含有するサンプル中の核酸を増幅し； （ｂ）段階（ａ）において増幅された前記核酸と１パネ
ルのオリゴヌクレオチドプローブとを、該プローブが正
確に相補的な配列にのみハイブリダイズする条件下でハ
イブリダイズせしめ；そして （ｃ）段階（ｂ）のプローブハイブリダイゼーションの
パターンから、前記サンプル中の核酸が由来するクラス
Ｉ ＨＬＡ対立遺伝子を決定する；ことを含んで成る方
法を提供する。
【０００２】本発明は、ＲＮＡを含むサンプルやｃＤＮ
Ａ鋳型等の種々の源からのホモ接合性またはヘテロ接合
性のサンプルをタイプ分けし、そして今日の血清学的、
細胞的又は生化学的方法によっては識別できない対立遺
伝子変異体を検出することを可能にする。本発明のタイ
プ分け系は、移植のための組織のタイプ分け、固体の同
一性の決定、及び疾患にかかりやすい個体の特定を容易
にする。従って本発明は、一般に医薬の分野そして特に
医学研究及び診断の分野、法医学の分野、並びに分子生
物学の分野に用途を有する。
【０００３】
【従来の技術】主要組織適合性複合体(major histocomp
atibility complex; MHC) には糖蛋白質をコードする多
くの遺伝子が含まれ、この糖蛋白質はＴ細胞受容体（Ｔ
ＣＲ）と一緒になって外来抗原に対するＴ細胞の応答に
おける特異性の鍵要素である。Ｔ細胞の２つのサブセッ
トに抗原を提示するＭＨＣ分子の２つの構造的に別個
の、しかし関連するファミリー、すなわちＣＤ８細胞表
面糖蛋白質を発現するＴ細胞に抗原を提示するクラスＩ
ＭＨＣ分子、及びＣＤ４細胞表面糖蛋白質を発現する
Ｔ細胞に抗原を提示するクラスII ＭＨＣ分子が存在す
る。Bjorkman及び Parham, 1990, Ann.Rev.Biochem. 5
9： 253−288 を参照のこと。
【０００４】ＨＬＡクラスII蛋白質ＨＬＡ ＤＲ，ＨＬ
Ａ ＤＱ及びＨＬＡ ＤＰはヒト染色体６のショートア
ーム上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）領域中の遺伝
子にコードされる。クラスII蛋白質は約３４kDのα鎖と
約２９kDのβ鎖とから成るヘテロダイマー糖蛋白質であ
る。クラスII蛋白質はマクロファージ、Ｂ−細胞、活性
化されたＴ−細胞及び他の細胞タイプの細胞表面上に発
現され、そしてヘルパーＴ−リンパ球に抗原を提示する
ことに関与する。
【０００５】Giles及びCapra, 1985, Adv.Immunol. 3
7：１の「Structure, Fanction andgenetics of the Hu
man Class II分子」と題する論文を参照のこと。さら
に、クラスII蛋白質は成熟Ｔ−リンパ球において発現さ
れたＴ−細胞受容体のレパートリーを決定することによ
り特定の免疫応答性に影響を与える。ＨＬＡクラスII遺
伝子及び蛋白質の一般的概観のためには、Trowsdalら、
1985, Immunol.Rev. 85：５の「Structure, sequence
and polymorphism in the HLA D region」と題する論文
を参照のこと。
【０００６】個体のＨＬＡクラスII表現型を決定するた
めのＤＮＡに基礎を置くタイプ分け法を開発すべくかな
りの努力が行われている。制限断片長多形性（ＲＦＬ
Ｐ）に基礎を置く試験を記載している米国特許 No.４，
５８２，７８８明細書を参照のこと。しかしながら、こ
れらのＲＦＬＰに基礎を置く分析に多量の高分子量ＤＮ
Ａを必要とし、労力を要し、そして情報に富む制限酵素
の数が少いことが得られる結果を制限している。
【０００７】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の出現が
複雑なゲノムＤＮＡの分析及び扱いを促進している。Ｐ
ＣＲ法は、核酸の非常に複雑な混合物から出発して核酸
の特定の配列を増幅することを可能にし、そして米国特
許 No.４，６８３，１９５、No.４，６８３，２０２、
No.４，８８９，８１８及び No.４，９６５，１８８明
細書、並びにヨーロッパ特許公開 No.２３７，３６２及
び２５８，０１７に一層十分に記載されている。ＰＣＲ
法はまた、個体のクラスII ＨＬＡ ＤＮＡのタイプ分
けも促進した。科学者は、オリゴヌクレオチドプライマ
ーを設計し、そしてそれらのプライマーを用いて注目の
配列を増幅することにより、ゲノムＤＮＡ中のＤＲＢ遺
伝子座の多形性第二エクソンを研究した。
【０００８】Scharfら、 1988, Hum.Immunol. 22：61に
よる「Sequence analysis of the HLA DRB and HLA DQB
loci from three Pemphigus vulgaris patients」と題
する論文を参照のこと。ＰＣＲプライマーが制限酵素認
識配列を含む場合、増幅されたＤＮＡは配列決定用ベク
ターに直接クローン化されることができ、そして増幅生
成物のヌクレオチド配列が容易に決定され得る。Scharf
ら、1986, Science 233 , 1076の「Direct cloning and
sequence analysis of enzymatically amplified geno
mic sequence」と題する論文を参照のこと。
【０００９】増幅されたＤＮＡはまた、配列特異的オリ
ゴヌクレオチド（ＳＳＯ）プローブを用いる検出法によ
り研究され得る。 Saikiら、 1986, Nature 324 ：163
の「Analysis of enzymatically amplified betaglobin
and HLA DQalpha DNA withallele-specific oligonucl
eotide probe 」と題する論文を参照のこと。クラスII
ＨＬＡ ＤＮＡタイプ分けの分野における多くの重要
な発明が、特定のＨＬＡクラスII ＤＮＡ遺伝子座にお
ける個体の遺伝子型を決定するための簡単な試験法の商
業的開発を導いた。これらの発明にはヨーロッパ特許公
開 No.２３７，３６２、並びにＰＣＴ公開 No.８９／０
４８７５， No.８９／１１５４７， No.８９／１１５４
８及び９０／０３４４４が含まれる。
【００１０】クラスII ＨＬＡ ＤＮＡタイプ分けの分
野における発展にも拘らず、個体のクラスＩ ＨＬＡ
ＤＮＡタイプの決定のための方法の開発にはほとんど進
歩がない。この進歩に欠ける１つの理由はＨＬＡクラス
Ｉ遺伝子が複雑なことである。これらの遺伝子はクラス
Ｉ Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｅ，Ｆ及びＧ蛋白質をコードしてお
り、そしてＦ及びＧ遺伝子は今のところ多形性だとは信
じられていないが、Ａ，Ｂ及びＣ遺伝子は少なくとも６
５の異なる配列を含む。
【００１１】Ｅ遺伝子は４種類の異なるＤＮＡ配列変化
の集団中に存在する。現在知られている相異は主として
これらの遺伝子の第二及び第三エクソン中にある(Zemmo
ur及び Parham, 1991, Immunogenetics 33： 310−320)
が、これらのクラスＩ遺伝子の第四エクソン中の配列変
化も知られている。Malissenら、 1982, Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 79： 893−897 を参照のこと。
【００１２】クラスＩ ＨＬＡ遺伝子におけるこれらの
相違及び今まで知られていない変異に関する知識の欠如
が、個体のＨＬＡクラスＩ ＤＮＡタイプを決定するた
めの情報に富み且つ効率的な手段の開発を妨げてきた。
本発明は、新規な方法及び試薬を提供することにより、
効率的で且つ情報に富むクラスＩ ＤＮＡタイプ分け法
の要求にマッチするものである。これらの新規な方法及
び試薬は次に、本発明の方法によりタイプ分け可能であ
りそして同定され得る今まで知られていなかったクラス
Ｉ対立遺伝子の発見を導くであろう。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、増幅及び検
出方法、一般的及び対立遺伝子又は群特異的増幅プライ
マー、配列特異的オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）プロー
ブ、例えばクラスＩ遺伝子座の今まで知られていない対
立遺伝子を同定するための方法、並びに血清学的方法で
は識別され得ない対立遺伝子を含めてクラスＩ ＨＬＡ
遺伝子の対立遺伝子をタイプ分けするための迅速で、簡
単で且つ正確な系を提供する方法を実施するためのキッ
トを提供する。
【００１４】１つの観点において、本発明はサンプル中
の核酸のクラスＩ ＨＬＡ ＤＮＡタイプの決定方法を
提供し、この方法は、サンプル中の核酸のＨＬＡクラス
ＩＤＮＡタイプの決定方法であって、（ａ）クラスＩ
ＨＬＡ対立遺伝子第２及び／又は第３エクソン配列を含
有するサンプル中の核酸を増幅し；（ｂ）段階（ａ）に
おいて増幅された前記核酸と１パネルのオリゴヌクレオ
チドプローブとを、該プローブが正確に相補的な配列に
のみハイブリダイズする条件下でハイブリダイズせし
め；そして（ｃ）段階（ｂ）のプローブハイブリダイゼ
ーションのパターンから、前記サンプル中の核酸が由来
するクラスＩ ＨＬＡ対立遺伝子を決定する；ことを含
んで成る。後記のごとく、サンプル中の核酸を増幅しそ
して核酸へのプローブハイブリダイゼーションのパター
ンを決定するための広範囲の種類の方法が存在する。
【００１５】他の観点において、本発明の方法は、ＨＬ
Ａ ＣクラスＩ遺伝子のいずれか１つ又はいずれかの組
合せに関し、サンプル中の核酸、及びそのサンプルが由
来した個体の表現型の同定を与える。増幅試薬の適切な
選択により、及び本発明の方法への忠実により、クラス
Ｉ ＨＬＡ遺伝子のいずれかの特定の第二又は第三エク
ソンを増幅しそして検出することができる。本発明はま
た、クラスＩ ＨＬＡ遺伝子の第四エクソン配列のバリ
エーションを決定するために使用することもできる。
【００１６】好ましい態様において、本発明はサンプル
中のクラスＩ ＨＬＡ Ａ，Ｂ及びＣ核酸の同定を提供
する。単純化された方式において、本発明の方法及び試
薬は、クラスＩ ＨＬＡ Ａ，Ｂ及びＣ遺伝子からの第
二及び／又は第三エクソンを含む増幅された核酸へのプ
ローブハイブリダイゼーションにより、Ａ，Ｂ及びＣ遺
伝子の最もよく知られたクラスＩ ＨＬＡ対立遺伝子の
同定を提供する。
【００１７】本発明のタイプ分け系は、ｍＲＮＡから合
成されたｃＤＮＡをタイプ分けするため、並びに組織、
トランスジェニック系、疾患状態及びセルライン中のＨ
ＬＡクラスＩ遺伝子の発現をタイプ分けしそして研究す
るために用いることができる。クラスＩ抗原を発現しな
いか又は異常な血清反応性を示す細胞、例えば腫瘍細胞
を容易にタイプ分けすることができる。さらに、ＤＮＡ
サンプルが分解されている場合、又は非常に少量のみの
サンプルが分析のために使用可能な場合でも、異常な分
離源からのサンプル、例えば古代のＤＮＡ又は法医学的
サンプルをタイプ分けすることができる。
【００１８】ＰＣＲは標的ＤＮＡの断片を１００万倍を
超えて増幅することができるから、そして本発明の系は
ＰＣＲから生成した核酸を用いることができるから、放
射能標識したプローブは必要でなく、そしてホースラデ
ィッシュ・パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）に共有結合した
非アイソトープ性ＳＳＯが十分な検出感度を提供する。
本発明の特異的に結合したＨＲＰ−標識されたプローブ
の存在を、簡単なドット−ブロット方式において、クロ
モゲン色素又は化学ルミネセンス基質により短時間で検
出することができる。
【００１９】図１は、２対のプライマー及び固定化プラ
イマーを有する多膜ストリップを用いてクラスＩ ＨＬ
Ａ Ａ，Ｂ及びＣ対立遺伝子を同定する本発明の一態様
を示す。本発明は、クラスＩ ＨＬＡ ＤＮＡタイプ分
け系、及びクラスＩ対立遺伝子を分析するための配列特
異的オリゴヌクレオチドプローブ（ＳＳＯ）を提供す
る。本発明はｃＤＮＡ鋳型を含めて、種々の源からのヘ
テロ接合性サンプルのタイプ分けのために使用すること
ができ、そして血清学的方法によっては識別できない対
立遺伝子変異を検出するために使用することができる。
このタイプ分け系はドット−ブロット方式を用いること
ができ、この方式は単純でありそして迅速に実施でき、
数分間で検出可能なシグナルを提供し、そして組織のタ
イプ分け並びに個体の同定及び疾患感受性の決定のため
に価値があることが証明されるであろう。
【００２０】１つの態様において本発明は、２２クラス
Ｉ ＨＬＡ Ａ対立遺伝子、３１Ｂ対立遺伝子、１２
Ｃ対立遺伝子及び４ Ｅ対立遺伝子を含めて、ＤＮＡレ
ベルで配列決定されているサンプル中に存在するクラス
Ｉ ＨＬＡ遺伝子の対立遺伝子の何れか１つの間を識別
する方法を提供する。５０を超える異なるＨＬＡＢ血清
型が存在することが知られていることを当業者は認識
し、そして本発明は、異なる血清型の数に寄与するまだ
配列決定されていないＨＬＡ Ｂ対立遺伝子を同定する
ための方法を提供する。
【００２１】本発明が広く実施されるようになった後短
期間内に異なる血清型の数はおそらく１００を超え、そ
して新しい対立遺伝子が発見される。同様に、本発明の
実施により、他のＨＬＡクラスＩ遺伝子の今まで知られ
ていない対立遺伝子が発見されるであろう。好ましい態
様において、４つのＰＣＲプライマー及び幾つかのオリ
ゴヌクレオチドプローブが、Ａ及びＢ対立遺伝子にユニ
ークに特異的な多くの異なるＡ及びＢ第二及び第三エク
ソンの相違の同定を提供する。プローブハイブリダイゼ
ーションのパターンをスキャンニングしそしてコンピュ
ーターで解析することができ、サンプル中の核酸がそれ
に由来したクラスＩ対立遺伝子の同定が促進される。
【００２２】クラスＩ ＨＬＡ遺伝子の多様性及び集団
中のこれらの遺伝子の対立遺伝子の数の多さが、サンプ
ル中の核酸がそれに由来する特定のＨＬＡクラスＩ対立
遺伝子を同定する方法を困難にする。本発明は、大きな
特異性を伴ってこの決定を可能にし、そしてサンプルが
そこから採取された特定の個体を同定するために用いる
ことができる。この識別力が次に、法医学分野における
本発明の用途を導く。
【００２３】非常に少量のＤＮＡ（又は分解したＤＮ
Ａ）を増幅するためにＰＣＲ（又は他の増幅法、例えば
リガーゼ連鎖反応、又はＱ−βレプリカーゼ増幅）を使
用することができるため、口内綿球、１本の毛、及び保
存された古い標本のごとき異常な源からのＨＬＡ ＤＲ
Ｂ ＤＮＡをタイプ分けするために本発明を使用するこ
とができる。後者のサンプルについては、有史以前の
源、例えば原人からの対立遺伝子の分析が可能である。
本発明の目的のため、「増幅」は、核酸の複製又は転写
によりサンプル中の核酸の数を増加させるあらゆる方法
として定義される。
【００２４】従って、本発明の方法において使用される
増幅系には、ヨーロッパ特許公開 No.３６８，９０６、
No.３１０，２２９、 No.３５９，７８９、 No.３５
８，７３７、 No.３２９，８２２、 No.３８６，２２
８、 No.３６９，７７５、 No.３７３，９６０及び No.
４０８，２９５、並びにＰＣＴ特許公開 No.９０／０６
３７６， No.９０／０３４４５， No.９０／０２８２
０， No.９０／０２８１９及び No.９０／０１０６８に
記載されている系が含まれる。
【００２５】本発明の方法は、ＨＬＡクラスＩ遺伝子を
発現しない細胞のクラスＩ ＨＬＡＤＮＡタイプ分けの
ために使用することができる。この方法はまた、ｍＲＮ
Ａから合成されたｃＤＮＡのＤＮＡタイプ分けのために
も適当である。後者の方法は種々の細胞系又は組織中の
ＨＬＡ遺伝子の発現の研究を促進し、そしてＨＬＡ遺伝
子発現と、形質転換への感受性、自己免疫又は他の健康
状態との関連が存在するか否かを決定するために使用さ
れ得る。
【００２６】本発明の研究的可能性は、いかなる態様に
おいても、即座の臨床的適用を覆いかくすべきでない。
ＭＨＣの遺伝子及び遺伝子産物は個体の免疫的状態にお
いて中心的役割を演じ、そして特定のＭＨＣ遺伝子産物
は疾患抵抗性及び感受性と関連する。本発明はサンプル
中のＭＨＣクラスＩ遺伝子の決定を可能にするから、本
発明はまた、特に医学的診断法のための、医学分野にお
ける用途を有する。
【００２７】拒絶又は移植片対宿主病の危険を最小にす
るのに非常に正確なＨＬＡの一致が必須である場合、本
発明の系の識別力は価値があるであろう。上記の利点に
加えて、本発明はまた、今まで知られていないＨＬＡク
ラスＩ対立遺伝子の同定方法、並びに任意のクラスＩ対
立遺伝子の同定のための関連するプライマー、プローブ
及び方法を提供する。
【００２８】本発明はまた、本発明のタイプ分け法の実
施をさらに便利にするためのキットを提供する。キット
の１つのタイプは増幅試験及びタイプ分け試薬の両方を
含む。他のキットは本発明の１又は複数のプローブのみ
を含む。いずれのキットにおいても、プローブは標識さ
れていてもよく又は標識されていなくてもよく、あるい
は固体支持体に結合していてもよい。
【００２９】プライマーは、キット中に存在する場合に
は、検出を容易にするため、すなわちシグナル発生試薬
を結合するためもしくは固定化のため、又は両方のため
に標識されていてもよい。キットはまたプローブハイブ
リダイゼーションの検出を容易にする試薬、すなわちク
ロモゲン基質ＴＭＢ及びストレプトアビジン−結合ホー
スラディッシュ・パーオキシダーゼを含むことができ
る。要約すれば、本発明の方法の実施において有用な試
薬は、本発明の利用を促進する任意の構成でパッケージ
することができる。
【００３０】好ましい態様においては、本発明の試薬
は、ＤＢ３０８（配列番号：１）、ＤＢ３０９（配列番
号：２）、ＤＢ３１１（配列番号：３）及びＤＢ３３７
（配列番号：４）から成る群から選択された２以上の異
なるＰＣＲプライマーを含んで成る。これらのプライマ
ーを、次の表１に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】下記の表２に示すように、クラスＩ ＨＬ
Ａ ＤＮＡ配列を増幅するために表１のプローブを種々
の方法で使用することができる。
【００３３】
【表２】
【００３４】適当なプライマーを選択することにより、
任意のクラスＩ ＨＬＡ遺伝子の任意の第二及び／又は
第三エクソン配列を増幅するために表２のプライマーを
使用することができる。前記のように、ＨＬＡクラスＩ
遺伝子の広範な対立遺伝子の多様性は、クラスII β遺
伝子のそれのように第二エクソン中のみならず、第三エ
クソンにも位置している。一般に、第二及び第三エクソ
ン配列多形性のパターンは、特定の遺伝子座に集団的に
存在する場合、種々の異なる対立遺伝子中に見出される
特異的多形性セグメントの寄せ集め(patchwork) であ
る。
【００３５】原理的には、異なる対立遺伝子間に共有さ
れるこれらのエピトープは共通の子孫、遺伝子変換(gen
e convension) 又は収斂進化 (convergent evolution)
を反映できるであろう。しかしながら、オリゴヌクレオ
チドタイプ分けの目的のため、多型性のこの寄せ集め(p
atchwork) パターンは、多くの対立遺伝子が単一のオリ
ゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによって同
定され得ず、プローブのパネルとのハイブリダイゼーシ
ョンのユニークなパターンによって同定され得ることを
意味する。
【００３６】しかしながら、幾つかの場合、単に、特定
のクラスＩ ＨＬＡ遺伝子のいずれかの対立遺伝子がサ
ンプル中の核酸中に代表されているか否かを特定したい
であろう。本発明の方法はクラスＩ ＨＬＡ配列を含有
する核酸を増幅するために使用することができ、そして
遺伝子座特異的プローブを用いてそれらの核酸が生じた
遺伝子を同定することができる。
【００３７】本発明のこれらの遺伝子座特異的プローブ
は特定のクラスＩ ＨＬＡ遺伝子の任意の対立遺伝子に
ハイブリダイズするが、しかし他のクラスＩ遺伝子の対
立遺伝子にはハイブリダイズしない（適切な条件下で）
であろう。遺伝子座特異的プローブはまた、異なる複数
のプローブの混合物として調製することができ、あるい
は完全な配列特異的ハイブリダイゼーションを要求しな
い条件下でハイブリダイズするであろう。
【００３８】ＳＳＯと称される本発明の配列特異的オリ
ゴヌクレオチドプローブは、適切なハイブリダイゼーシ
ョン条件及び洗浄条件下で本発明の方法において使用さ
れる場合、非常に特異的であり、単一ヌクレオチド多形
を識別することができる。本発明のＳＳＯは、ＲＦＬＰ
法において用いられるプローブとは異なり、対立遺伝子
が異なるか否かのみならず、対立遺伝子がどこでいかに
異なるかを決定するためにも使用することができる。
「ＨＲＰ−ＳＳＯ」と称する、本発明のホースラディッ
シュ・パーオキシダーゼ−接合ＳＳＯは、使用するのが
容易であり且つ検出可能なシグナルを迅速に（典型的に
は１〜１０分間）生成するクロモゲン基質又は化学ルミ
ネセンス基質を用いる検出方法を可能にする。
【００３９】ＨＲＰ−ＳＳＯは、４℃にて貯蔵された場
合、活性の検出可能なロスを伴わないで２年間以上安定
である。Levenson及びChany, 1989, PCR Protocols: A
Guide to Methods and Applications (Innis, Gelfand,
Sninsky及び White編、Academic Press, Inc.San Dieg
o)の「Nonisotopically labeled probes and primers」
と題する論文を参照のこと。放射能標識したプローブを
使用することができるが、それは卓越した感度のために
必要ではなく、これは本発明により与えられる重要な利
点である。
【００４０】好ましい態様において、本発明の方法はＨ
ＬＡクラスＩ Ａ及びＢ対立遺伝子をタイプ分けするた
めのプローブのパネルを用いて実施される。次の表３に
おいて「領域」は、それに対してプローブがハイブリダ
イズするクラスＩ ＨＬＡＡ又はＢ対立遺伝子の第二エ
クソンの多形性コドンを特定する。領域ＡはＡ及びＢ対
立遺伝子の両方のエクソン２のコドン９〜１２を含む。
領域ＢはＡ対立遺伝子のエクソン２のコドン６２及び６
３を含む。領域ＣはＡ対立遺伝子のエクソン２のコドン
６５〜６７及びＢ対立遺伝子のエクソン２のコドン６９
−７１を含む。これらのプローブ、領域及び対立遺伝子
を下記の表３に示す。
【００４１】
【表３】
【００４２】上記の表において、Ｘはイノシンヌクレオ
チドを示す。ドット・ブロット検出方式が多数のサンプ
ルの迅速なタイプ分けを可能にし、そしてクラスＩ Ｈ
ＬＡ遺伝子の対立遺伝子頻度を決定するのに有用であろ
う。ＰＣＲ／ＳＳＯタイプ分けのための最近開発された
他の方法は、固定化逆ドットブロット方式である。 Sai
kiら、1989, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 86：6230の「Ge
netic analysis of amplified DNA with immobilized s
equence-specific oligonucleotide probes 」と題する
論文を参照のこと。この方法においてはＳＳＯプローブ
がフィルターに適用されそして固定される（増幅された
ＤＮＡがフィルターに適用されそして固定されるのでは
ない）。このため「逆ドットブロット」の用語が用いら
れる。
【００４３】逆ドットブロット法は、単一のサンプル
が、一連の固定化されたプローブを含む膜との単一のハ
イブリダイゼーションにおいて分析される。常用のドッ
トブロット方式は、サンプルの数が使用するプローブの
数を超える場合（例えば、患者対対照又は集団遺伝研
究）に有用である。プローブよりサンプル数の方が少な
い場合、逆ドットブロット方式は臨床的、診断的又は法
医学的分析のために価値がある。
【００４４】
【実施例】次の例は本発明の好ましい態様を例示する。
これらの実施例が示すところによれば、本発明は好まし
い態様において、簡単で、迅速で、そして異なる源から
の種々のサンプルについて正確なＤＮＡタイプ分けを可
能にするＨＬＡクラスＩＤＮＡタイプ分けのための非ア
イソトープ性ＰＣＲ／ＳＳＯ系を提供する。
【００４５】実施例１． 増幅及び検出法 サンプルのタイプ分けのため、 Saikaら、 1988, Scien
ce 239 ： 487及びScharfら、 1988, Hum.Immunol. 2
2：61、及びScharfら、 1989, Proc.Natl.Acad.Sci.USA
86：6215の「Primer-directed enzymatic amplificati
on of DNA witha thermostable DNA polymerase 」と題
する論文に記載されている反応条件を用いて、約０．５
μｇのヒトゲノムＤＮＡを増幅した。プライマーは反応
混合物中に５００nMで存在し、そして反応体積は１００
μｇであった。
【００４６】ＨＬＡ対立遺伝子の配列決定のため、１μ
ｇの精製されたヒトゲノムＤＮＡを増幅し、そして増幅
されたＤＮＡを、Scharfら、 1988, Hum.Immunol. 22：
61、及びScharfら、 1986, Hum.Immunol. 233 ：1076に
記載されている方法によりＭ１３ｍｐ１０にクローニン
グする。次に、Sangerら、1977, Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA, 74：5463に記載されているジデオキシチェイン−タ
ーミネーション法により挿入部の配列を決定する。
【００４７】下記の反応条件を用いてサンプルを３０〜
３５サイクル増幅した。１００μｌの反応体積当り、約
５ユニット（２．５ユニットではなく）のＴａｑポリメ
ラーゼを加えた。ＲＮＡを記載されているようにして増
幅する (Kawasaki, 1989, PCR Protocols: A Guide t
o Methods and Applications(Innisら、編、AcademicPr
ess, San Diego)の「Amplification of RNA」を参照の
こと) 。すべてのサンプルに１００μｌの高品質鉱油を
重層して蒸発を防止した。増幅の後油上層を１００μｌ
のクロロホルムにより抽出した。
【００４８】各サイクルの熱的プロフィールは、次の期
間にわたる次の温度であった：９４℃にて１分間（ＤＮ
Ａ鎖の変性のため）、６０℃にて３０秒間（プライマー
のアニーリングのため）、及び７２℃にて１分間（プラ
イムされた鋳型の伸長のため）。最終サイクルの後、熱
サイクラーを７２℃にて１０分間インキュベートするよ
うにプログラムし、最終伸長が完了することを保証し
た。サンプルの相互汚染を回避するように注意すべきで
あり、特に１つのＰＣＲの生成物が未増幅のサンプルを
汚染しないように特に注意すべきである。
【００４９】増幅の後、増幅されたＤＮＡの小部分を変
性し、そして一連のナイロンフィルターに適用し、次に
各フィルターを標識されたプローブの１つとハイブリダ
イズさせる。各ＳＳＯプローブはホースラディッシュ・
パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）に共有結合させることがで
き、そしてクロモゲン又は化学ルミネッセンス基質の存
在下での非アイソトープ検出の手段を提供する。
【００５０】そして、５μｌの増幅されたＤＮＡサンプ
ルを０．４Ｍ ＮａＯＨ及び２５mMＥＤＴＡから成る混
合物１００μｌと混合し、そして得られる混合物を、ド
ット−ブロットマニホールド(Bio Rad, Richmond, CA)
を用いてBioDyne Ｂナイロンフィルター (Pall Corp. G
len Cove, NY) に適用する。なおドット−ブロットマニ
ホールドの中にあるフィルターを１０mM Tris−ＨＣｌ
及び０．１mM ＥＤＴＡの混合物（pH８．０）ですす
ぎ、そしてWhatman ３ＭＭペーパー上で乾燥した。Stra
talinker (商標)(Stratagene, La Jolla, CA) ＵＶ光ボ
ックスを用いる５５mJ／cm2 の光束での紫外線照射によ
り、ＤＮＡをナイロンフィルターに固定化した。
【００５１】特にことわらない限り、すべてのフィルタ
ーは２×ＳＳＰＥ（塩化ナトリウム・リン酸ナトリウム
ＥＤＴＡ）、５×Denhatdt溶液及び０．５％ＳＤＳ中で
５mlのハイブリダイゼーション溶液当り２ｐモルのＨＲ
Ｐ ＳＳＯプローブと、４２℃にて１５分間ハイブリダ
イズさせた。Levenson及びChang, 1989, PCR Protocol
s: A Guide to Methods and Applications (Innisら、
編、Academic Press, Inc. San Diego) 及び Saikaら、
1988, N.Eng.J.Med. 319 ：537 により記載されている
ようにして、ホースラディッシュ・パーオキシダーゼ結
合オリゴヌクレオチドを調製する。各プローブのための
フィルターをＳＳＰＥ中で洗浄する。
【００５２】洗浄後、クロモゲン色素基質により発色さ
れるべきフィルターをＰＢＳ中で室温にて３０分間すす
ぎ、そして０．１mg／mlの３，３′，５，５′−テトラ
メチルベンジジン（ＴＭＢ）及び０．００１５％過酸化
水素を含有する１００mMクエン酸ナトリウム（pH５．
０）に入れ、そして穏やかに攪拌しながら５〜１５分間
室温にてインキュベートした。
【００５３】発色したフィルターをＰＢＳ中ですすぎ、
そしてすぐに写真を撮った。化学ルミネッセンス検出系
（ＥＣＬ；Amersham, Arlington Heights, IL)により発
色されたフィルターはＰＢＳ中で５分間すすぎ、そして
穏やかに攪拌しながらＥＣＬ溶液中に１分間置いた。次
に、フィルターをＸ−線フィルムに室温にて１〜５分間
暴露する。
【００５４】実施例２． 逆ドットブロット方式 本発明のこの態様においては、クラスＩ ＨＬＡプロー
ブを膜に固定し、そして増幅された標的ＤＮＡを膜結合
プローブにハイブリダイズさせる。タイプ分けプローブ
のセットは、各プローブがセット中の他のプローブと同
様に、同じ温度及び塩濃度において特定の標的配列とハ
イブリダイズする（そして同じ洗浄条件下でハイブリダ
イズしたままである）ように設計される。
【００５５】増幅に用いられるＰＣＲプライマーを、 P
CR Protocolsに記載されているようにしてビオチン化
し、膜に結合したプローブにハイブリダイズするすべて
の増幅されたＤＮＡが容易に検出され得るようにする。
プローブが標的核酸にハイブリダイズしているか否かを
決定するために本実施例とは異なる方法を用いることが
できることを当業者は認識する。
【００５６】１つの態様においては、ストレプトアビジ
ン（ＳＡ）結合ホースラディッシュ・パーオキシダーゼ
を、膜結合プローブにハイブリダイズしたビオチン化さ
れ増幅されたＤＮＡと反応せしめることにより検出を行
う。従って、ＨＲＰはＳＡ−ビオチン相互作用を介して
増幅されたＤＮＡに結合し、そして種々の周知の手段、
例えばテトラメチルベンジジンの酸化による着色化合物
の発生により、シグナルを発生させるために使用され得
る。プローブは任意の手段により膜に固定することがで
きるが、好ましい方法は、ポリ−ｄＴのより長い配列に
より約１３〜２５ヌクレオチドだけオリゴヌクレオチド
プローブ「テイル (tail) 」することを含む。次に、生
ずるポリ−ｄＴテイルを膜上のアミン基と反応させてプ
ローブを共有結合により膜に固定することができる。こ
の反応はＵＶ照射により促進される。
【００５７】商業的に入手可能なＤＮＡ合成機上でテイ
ルを有するプローブを合成することもできるが、ターミ
ナルジデオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼ
（ＴｄＴ，Ratliff Biochemicals；下記の反応のため約
１２０ユニット／μｌすなわち１００pmol／μｌの濃度
が予想される）を用いてプローブ上にポリ−ｄＴテイル
を形成することができる。しかしながら、ＤＮＡ合成機
を用いてテイルを有するプローブを作製する場合、テイ
ルをプローブの５′末端において、不所望の早過ぎる連
鎖停止がテイル領域で起こるようにすべきである。
【００５８】ＴｄＴ反応は、１×ＴｄＴ塩、２００pmの
オリゴヌクレオチド、８００Ｍ ｄＴＴ、及び６０ユニ
ットのＴｄＴを含有する約１００μｌの体積中で行われ
るべきである。１０×ＴｄＴ塩は１，０００mM酸カリウ
ム、１０mM ＣｏＣｌ2 ，２mMジチオスレイトール、２
５mM Tris−ＨＣｌ（pH７．６）であり、そしてRoycho
udhury及びWu, Meth Enzymol. 65：43−62に記載されて
いるようにして製造される。この文献の記載を引用によ
り本明細書に繰り入れる。便利のため８mM ｄＴＴＰの
１０×ストック溶液を調製する（ＮａＯＨによりpH７に
中和する）ことができる。
【００５９】ＴｄＴ反応は３７℃にて２時間行われそし
て次に１００μｌの１０mM ＥＤＴＡ（pH８）の添加に
より停止されるべきである。テイルされたオリゴヌクレ
オチドの最終濃度は１μＭであり、そしてホモポリマー
テイルの長さは約４００残基である。ｄＴＴＰとオリゴ
ヌクレオチドとのモル比を調査することによりテイルの
長さを変えることができる。テイルを有するプローブは
使用まで−２０℃にて貯蔵することができる。
【００６０】逆ドットブロット方式のためには２つのタ
イプのナイロン膜、すなわち、Biodyne(商標) ナイロン
膜、孔サイズ０．４５ミクロン、Pallにより製造；及び
Biotrans (商標) ナイロン膜、孔サイズ０．４５ミクロ
ン、ＩＣＮにより製造、が好ましい。BioRadにより製造
されたBio-Dot(商標) ドットブロット装置を用いて非常
に便利にプローブを膜上にスポットすることができる。
各プローブは膜上のユニークな別々の位置にスポットさ
れる。約５〜１０ピコモルの各テイルされたプローブを
６０〜１００μｌのＴＥ緩衝液と混合した後にドットブ
ロット装置に適用される。ドットブロットの後、膜を吸
収紙上に短時間置き、過剰の液体を吸い取る。
【００６１】次に、膜をＵＶ光ボックス、例えばStrata
geneにより製造されたStratalinker(商標) 光ボックス
に入れ、そして５０〜６０ミリジュールの光束に曝して
テイルを有するプローブをナイロン膜に固定する。未結
合のプローブを除去するために短時間すすいだ後（ハイ
ブリダイゼーション溶液中で約１５分間）、膜をビオチ
ン化されたＰＣＲ生成物とのハイブリダイゼーションの
ために用意する。０．５〜１ピコモル（典型的な１００
μｌ ＰＣＲ混合物の１／４〜１／２）のＰＣＲ生成物
をハイブリダイゼーションのために各プローブパネルに
加える。
【００６２】便宜上、この時点で約５０μｌの商業的に
入手可能なストレプトアビジン−ホースラディッシュ・
パーオキシダーゼ結合体を添加することができるが、ス
トレンジエンシー洗浄の後に別個のＳＡ−ＨＲＰインキ
ュベーション及び洗浄を行えばよりよい結果が得られ
る。ハイブリダイゼーションは典型的には、５０℃〜５
５℃にて３０分間、水浴中で、０．５％ＳＤＳ及び３×
〜５×ＳＳＰＥ、最も普通には４×ＳＳＰＥを用いて行
われる。ストリンジエンシー洗浄は、５０℃〜５５℃に
て１５分間水浴中で、そして０．１％ＳＤＳ及び１×Ｓ
ＳＰＥからなる洗浄溶液を用いて行われる。室温にて３
０分間の１×ＰＢＳの後洗浄はシグナルの質を増強する
ことができる。
【００６３】好ましい態様においては、４種類のすべて
のプライマーＤＢ３０８（配列番号：１）、ＤＢ３０９
（配列番号：２）、ＤＢ３３７（配列番号：４）及びＤ
Ｂ３１１（配列番号：３）を用いて増幅を行い第二及び
第三エクソンの両者のエクソンクラスＩ ＨＬＡ核酸配
列の同時増幅をもたらし、次にそれぞれが異なる膜スト
リップにセットされた４セットのプローブ（Ａ第二エク
ソンセット、Ｂ第二エクソンセット、Ａ第三エクソンセ
ット、及びＢ第三エクソンセットのプローブ）にハイブ
リダイズさせることによりタイプ分けする。
【００６４】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： GGCTGCAGCA CTCCATGAGG TATTTC 26
【００６５】配列番号：２ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： CAGGATCCCC TCGCTCTGGT TGTAGTA 27
【００６６】配列番号：３ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： GGCTGCAGTA CTACAACCAG AGCGAGG 27
【００６７】配列番号：４ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： CAGGATCCCT CCTTCCCGTT CTCCAGGT 28
【００６８】配列番号：５ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： GGATGTGAAG AAATACCTC 19
【００６９】配列番号：６ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： AGGTATTTCT ACACCTCC 18
【００７０】配列番号：７ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： AGGTATTTCT CCACATCC 18
【００７１】配列番号：８ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： GGATGTGGTG AAATACCTC 19
【００７２】配列番号：９ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： CGGGACACGG ATGTGTAG 18
【００７３】配列番号：１０ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： TTCTACACCT CCGTGTCC 18
【００７４】配列番号：１１ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： GGACATGGCG GTGTCGAA 18
【００７５】配列番号：１２ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： TTCTACACCG CCATGTCC 18
【００７６】配列番号：１３ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： CGGGACACGG CGGTGTA 17
【００７７】配列番号：１４ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： TTTCCACACC TCCGTGTC 18
【００７８】配列番号：１５ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： TTCCACACCG CCATGTCC 18
【００７９】配列番号：１６ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： GTATTGGGAC CAGGAGAC 18
【００８０】配列番号：１７ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： GTATTGGGAC GGGGAGAC 18
【００８１】配列番号：１８ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： GTATTGGGAC GAGGAGAC 18
【００８２】配列番号：１９ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： GTATTGGTAC CGGAACAC 18
【００８３】配列番号：２０ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： CGTGTCTGXA GGTCCCAAT 19
【００８４】配列番号：２１ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： TGTCTGXAGG TCCCAAT 17
【００８５】配列番号：２２ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： ACACGGAATA TGAAGGCC 18
【００８６】配列番号：２３ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： ACACGGAAAG TGAAGGCC 18
【００８７】配列番号：２４ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： GCCTTCACAT TCCGTGTC 18
【００８８】配列番号：２５ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： ACTGACCGAC GCAACCTG 18
【００８９】配列番号：２６ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： AGGTCCACTC GGTGAGTC 18
【００９０】配列番号：２７ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： AGGTCCACTC GGTCAGTC 18
【００９１】配列番号：２８ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： ACTGACCGAG CGAACCTG 18
【００９２】配列番号：２９ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： ATCGCGCTCC GCTACTAC 18
【００９３】配列番号：３０ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： TGTGTTGGTC TTGAAGATC 19
【００９４】配列番号：３１ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： ATCTCCAAGA CCAACACAC 19
【００９５】配列番号：３２ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： GCCTTGGCCT TGCAGATC 18
【００９６】配列番号：３３ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： GCGGAGGCCT TCAATTTC 18
【００９７】配列番号：３４ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： TACAAGGCCC AGGCACAG 18
【００９８】配列番号：３５ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： AAGTACAAGC GCCAGGCAC 19
【００９９】配列番号：３６ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： GACCGGAACA CACAGATC 18
【０１００】配列番号：３７ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： GATCTGTGTC TCCCGGTC 18
【０１０１】配列番号：３８ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： CTTCACATTC CGTGTGTTC 19
【０１０２】配列番号：３９ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： TGTGTTGGTC TTGCAGATC 19
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の一態様を示し、ここでは２つ
のプライマー対及び固定化されたプローブを有する多膜
ストリップがクラスＩ ＨＬＡ Ａ，Ｂ及びＣ対立遺伝
子を決定する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヘンリー エイ．エーリッヒ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94602, オークランド，ローダ アベニュ 3936

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 サンプル中の核酸のＨＬＡクラスＩ Ｄ
    ＮＡタイプの決定方法であって、 （ａ）クラスＩ ＨＬＡ対立遺伝子第２及び／又は第３
    エクソン配列を含有するサンプル中の核酸を増幅し； （ｂ）段階（ａ）において増幅された前記核酸と１パネ
    ルのオリゴヌクレオチドプローブとを、該プローブが正
    確に相補的な配列にのみハイブリダイズする条件下でハ
    イブリダイズせしめ；そして （ｃ）段階（ｂ）のプローブハイブリダイゼーションの
    パターンから、前記サンプル中の核酸が由来するクラス
    Ｉ ＨＬＡ対立遺伝子を決定する；ことを含んで成る方
    法。
  2. 【請求項２】 前記クラスＩ ＨＬＡ対立遺伝子がＡ，
    Ｂ及びＣ対立遺伝子から成る群から選択される、請求項
    １に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記クラスＩ ＨＬＡ対立遺伝子がＡ及
    びＢ対立遺伝子である、請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記段階（ａ）の増幅を一対のオリゴヌ
    クレオチドプローブを用いてポリメラーゼ連鎖反応によ
    り行う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記第二エクソン配列を増幅する、請求
    項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記プライマーがＤＢ３０８（配列番
    号：１）及びＤＢ３９９（配列番号：２）である、請求
    項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記第三エクソン配列を増幅する、請求
    項４に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記プライマーがＤＢ３３７（配列番
    号：４）及びＤＢ３１１（配列番号：３）である、請求
    項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記第二及び第三エクソン配列を増幅す
    る、請求項４に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記プライマーがＤＢ３０８（配列番
    号：１）、ＤＢ３０９（配列番号：２）、ＤＢ３３７
    （配列番号：４）及びＤＢ３３１（配列番号：３）であ
    る、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 オリゴヌクレオチドプローブの前記パ
    ネルが固体支持体に固定されており、各プローブが該固
    体支持体の別々の離れた位置に存在する、請求項１〜１
    ０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 オリゴヌクレオチドの前記パネルを含
    んで成る、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法
    を実施するためのキット。
  13. 【請求項１３】 前記第一及び／又は第二エクソン酸配
    列を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー対を
    さらに含んで成る、請求項１２に記載のキット。
  14. 【請求項１４】 プローブの前記パネルが、ＤＢ３１２
    （配列番号：５），ＤＢ３１３（配列番号：６），ＤＢ
    ３１４（配列番号：７），ＤＢ３１５（配列番号：
    ８），ＤＢ３１６（配列番号：９），ＤＢ３１７（配列
    番号：１０），ＤＢ３１８（配列番号：１１），ＤＢ３
    １９（配列番号：１２），ＤＢ３２０（配列番号：１
    ３），ＤＢ３２１（配列番号：１４），ＤＢ３２２（配
    列番号：１５），ＤＢ３２３（配列番号：１６），ＤＢ
    ３２４（配列番号：１７），ＤＢ３２５（配列番号：１
    ８），ＤＢ３２６（配列番号：１９），ＤＢ３２７（配
    列番号：２０），ＤＢ３２８（配列番号：２１），ＤＢ
    ３２９（配列番号：２２），ＤＢ３３０（配列番号２
    ３），ＤＢ３３１（配列番号：２４），ＤＢ３３２（配
    列番号：２５），ＤＢ３３３（配列番号：２６），ＤＢ
    ３３４（配列番号：２７），ＤＢ３３５（配列番号：２
    ８），ＤＢ３３６（配列番号：２９），ＲＡＰ１０（配
    列番号：３０），ＲＡＰ１１（配列番号：３１），ＲＡ
    Ｐ１２（配列番号：３２），ＲＡＰ１３（配列番号：３
    ３），ＲＡＰ１４（配列番号：３４），ＲＡＰ１５（配
    列番号：３５），ＲＡＰ１６（配列番号：３６），ＲＡ
    Ｐ１７（配列番号：３７），ＲＡＰ１８（配列番号：３
    ８），and ＲＡＰ１９（配列番号：３９）から成る群か
    ら選択される２以上のプローブを含んで成る、請求項１
    ２又は１３に記載のキット。
  15. 【請求項１５】 前記プライマーがＤＢ３０８（配列番
    号：１）及びＤＢ３０９（配列番号：２）である、請求
    項１３又は１４に記載のキット。
  16. 【請求項１６】 前記プライマーがＤＢ３３７（配列番
    号：４）及びＤＢ３１１（配列番号：３）である、請求
    項１３又は１４に記載のキット。
  17. 【請求項１７】 前記プライマーがＤＢ３０８（配列番
    号：１）、ＤＢ３０９（配列番号：２）、ＤＢ３３７
    （配列番号：４）及びＤＢ３１１（配列番号：３）であ
    る、請求項１３又は１４に記載のキット。
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