JP2007330260A - イヌ科動物の遺伝子型決定のためのマイクロサテライト配列 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】マイクロサテライト遺伝子座において、イヌの遺伝子型を決定する方法であって、以下の工程を含む方法。(1)該マイクロサテライト遺伝子座に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、染色体DNAの領域を増幅する工程であって、ここでDNAの該領域はAAAまたはTTTからなる反復テトラヌクレオチドモチーフを含み、第4の残基はG、C、AまたはTのいずれかである工程。(2)該増幅の産物をサイズ分画して、該プライマー間の染色体DNAのサイズの測定を提供する工程。ここで、該プライマー間の染色体DNAの該サイズは、該遺伝子座の対立遺伝子マーカーである。
【選択図】なし
Description
異なる種からの個体の遺伝子構成を分析する能力の増大によって、多くの新しい技術の開発が可能になった。遺伝的多型性の検出は、個体間の識別、血統試験、法医学的試験、個体の血縁関係の分析、およびマイクロサテライト反復に連結した目的の遺伝子のマッピングに有用である。
制限フラグメント長多型性を用いたヒトにおける遺伝連鎖マップの構築は、Botsteinら(1980)Amer. J. Hum. Genet. 32:314-331に記載されている。三量体および四量体のタンデム反復を用いたDNA分類および遺伝子マッピングは、Edwardsら(1991) Amer. J. Hum. Genet. 49:746-756に記載されている。ヒト(dC-dA)n.(dG-dT)nの多型性が多くの情報量を提供することは、Weber (1990) Genomics 7:524-530に記載されている。
(1)マイクロサテライト遺伝子座においてイヌを遺伝子型決定する方法であって、該遺伝子座に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて染色体DNAの領域を増幅する工程であって、ここで、DNAの該領域は、AAAまたはTTTからなる反復テトラヌクレオチドモチーフを含み、第4の残基はG、C、AまたはTのいずれかである、工程;
該増幅の産物をサイズ分画して、該プライマー間の染色体DNAのサイズの測定を提供する工程を包含し;
ここで、該プライマー間の染色体DNAの該サイズは、該遺伝子座の対立遺伝子マーカーである、方法。
(2)前記増幅する工程が、前記産物を検出可能な標識を用いて標識する工程をさらに包含する、項目1に記載の方法。
(3)前記増幅する工程がポリメラーゼ連鎖反応を使用する、項目2に記載の方法。
(4)少なくとも約5つの前記マイクロサテライト遺伝子座のパネルが遺伝子型決定され、ここで該遺伝子座の前記対立遺伝子マーカーが前記イヌの同定のための遺伝子フィンガープリントを提供する、項目3に記載の方法。
(5)マイクロサテライト遺伝子座においてイヌを遺伝子型決定する方法であって、
該遺伝子座に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて染色体DNAの領域を増幅する工程であって、ここで、DNAの該領域は、AAAG、GAAA、AAAT、TTTC、CTTT、TTTA、AAGG、GAAT、GAAG、GAAAA、AAAAAG、TGCおよびTTCからなる群より選択される反復モチーフを含む、工程;
該増幅の産物をサイズ分画して、該プライマー間の染色体DNAのサイズの測定を提供する工程を包含し;
ここで、該プライマー間の染色体DNAの該サイズは、該遺伝子座の対立遺伝子マーカーである、方法。
(6)前記増幅する工程が、前記産物を検出可能な標識を用いて標識する工程をさらに包含する、項目5に記載の方法。
(7)前記増幅する工程がポリメラーゼ連鎖反応を使用する、項目6に記載の方法。
(8)少なくとも約5つの前記マイクロサテライト遺伝子座のパネルが遺伝子型決定され、ここで該遺伝子座の前記対立遺伝子マーカーが前記イヌの同定のための遺伝子フィンガープリントを提供する、項目7に記載の方法。
(9)前記遺伝子座に特異的な前記オリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号21と41、22と42、23と43、24と44、25と45、26と46、27と47、28と48、29と49、30と50、31と51、32と52、33と53、34と54、35と55、36と56、37と57、38と58、39と59、および40と60からなる群より選択される、項目8に記載の方法。
(10)単離されたDNAフラグメントを含む組成物であって、ここで、該DNAの配列が配列番号1〜配列番号20からなる群より選択される、組成物。
(11)長さが少なくとも約18ntのオリゴヌクレオチドプライマーであって、ここで、該プライマーが、ストリンジェントな条件下で配列番号1〜配列番号20からなる群の隣接する領域の配列を有するDNAにハイブリダイズし得る、オリゴヌクレオチドプライマー。
(12)前記プライマーの配列が、配列番号21〜配列番号60からなる群より選択される、項目11に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(13)イヌを遺伝子型決定するにおいて使用するためのキットであって、オリゴヌクレオチド増幅プライマーの対を含み、ここで、該プライマーの配列が配列番号1〜配列番号20からなる群の隣接する領域より選択される、キット。
(14)前記プライマーの少なくとも1つが検出可能な標識に結合される、項目13に記載のキット。
(15)前記検出可能な標識が蛍光色素である、項目14に記載のキット。
(16)前記キットが、オリゴヌクレオチド増幅プライマーの少なくとも約5つの前記対のパネルを含む、項目15に記載のキット。
(17)前記オリゴヌクレオチド増幅プライマーの配列が、配列番号21と41、22と42、23と43、24と44、25と45、26と46、27と47、28と48、29と49、30と50、31と51、32と52、33と53、34と54、35と55、36と56、37と57、38と58、39と59、および40と60からなる群より選択される、項目16に記載のキット。
個体間の区別、血統試験、法医学鑑定、個体の関連性の解析、および目的の遺伝子のマッピングのためのイヌ科種の診断アッセイを行うための、方法および組成物が提供される。内部トリヌクレオチドおよびテトラヌクレオチドマイクロサテライト反復を有する独特のイヌ科DNA配列は、多型性のマーカーであり、これらは、個体間の相違について容易にアッセイされ得る。これらの多型性の検出は、遺伝子型決定の解析が行われるのを可能にする。
マイクロサテライトDNA反復の数における多型性を解析することにより、イヌ科を遺伝子型決定するための方法が提供される。反復に隣接する領域に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーが、内部反復配列を増幅するために用いられる。反復の数、そしてそれゆえプライマー間の距離は、集団において高度に変動し得る。単一の遺伝子座からの長さの多型性は、目的の遺伝子のマッピングのために用いられ得る。マイクロサテライト遺伝子座の特異的なプライマーおよび配列が提供され、ここでその遺伝子座はイヌ科集団において高いPIC値を有する。複数の遺伝子座からの組み合わせた情報は、近交系のイヌの品種の間でさえ個体を識別する手段、血統試験、法医学鑑定、および個体の関連性の解析のための手段を提供する。
U(R)nU’
を有し、ここでUおよびU'は、特定の遺伝子座を独特に同定する非反復隣接配列であり、Rは、反復モチーフ、そしてnは反復の数である。遺伝子座は、イヌ科の染色体上に存在する。特定の例は、配列表の配列番号1から配列番号20中に提供される。
ゲノムDNAの単離: 家畜用イヌ由来の重さ約5gの精巣を、液体窒素中で凍結させ、そして乳鉢と乳棒とを用いて、磨砕して細粉化した。滅菌した50mlのコニカル遠心分離チューブ中で、30mlの抽出緩衝液(10mM Tris 8.0、0.1M EDTA 8.0、20mg/ml RNAse A、および0.5% SDS)を、磨砕した組織に添加した。チューブを十分に混合し、そして30分間37℃にてインキュベートした。プロテイナーゼKを最終濃度100mg/mlになるように添加し、混合し、そして振とう台(rocking platform)上で、50〜55℃にて3時間インキュベートした。次いで、チューブを室温まで冷却し、そして等容量のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(1:1:24)を用いて、5回抽出を行った。10分の1の容量および2容量の3M酢酸ナトリウム、ならびに95%エタノールをそれぞれ添加した。溶液を十分に混合し、そしてDNAをガラス棒上に回収した。DNAを、70%エタノールで洗浄し、そして50〜55℃にて一晩振とうすることによってTE中に再懸濁した。
イヌ科動物集団の分析
表1および2は、提供されたヌクレオチド配列から設計されたPCRプライマーの有用性を示す。PIC値(Botsteinら、1980)は、各マイクロサテライトが有益であることを明らかにする。PIC値により、一般的なイヌ集団において(表1)、示した20のマーカーのうち19は、高度に有益であり(PIC>0.5)、そして1つが適度に有益である(0.25<PIC<0.5)。近縁のドイツシェパードの集団では、9つのマーカーが高度に有益であり、8つが適度に有益であり、そして3つのマーカーがあまり有益でなかった(表2)。観察されたヘテロ接合性は、特定のマーカーについてヘテロ接合性であった一部のイヌである。一般的なイヌ集団では、20のマーカーのうちの19は、0.5より大きな観察されたヘテロ接合性を示し、そして20のうちの10が0.7より大きな観察されたヘテロ接合性を示す(表1)。ドイツシェパード集団において、11のマーカーが0.5より大きなヘテロ接合性を示し、そして5のマーカーが0.7より大きなヘテロ接合性を示す(表2)。
種々の系統のイヌ集団における示されたイヌ科遺伝子座での
提供されたマイクロサテライトの特性
密に関連したシェパード集団における示されたイヌ科遺伝子座での
提供されたマイクロサテライトの特性
イヌの2つのファミリーにおける血統試験
フェネックギツネにおける遺伝子型決定のマーカーのいくつかの使用の説明を以下の表4に示す。キツネA〜Dは、いくつかの兄弟を含み得る野生型集団に由来する。
フェネックギツネの遺伝子型決定
Claims (21)
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19および配列番号20からなる群より選択される配列を含む、単離された核酸。
- 前記核酸が、異種核酸と作動可能に連結される、請求項1に記載の単離された核酸。
- 前記異種核酸がベクターである、請求項2に記載の単離された核酸。
- 前記ベクターがプラスミドまたはウイルスベクターである、請求項3に記載の単離された核酸。
- 請求項3または請求項4に記載の核酸を含む宿主細胞。
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19および配列番号20からなる群より選択される1または複数の単離された核酸、またはそのマイクロサテライト反復モチーフを含む、組成物。
- さらに固定相を含む、請求項6に記載の組成物。
- 前記固定相が、重合膜、重合ビーズ、マイクロアレイまたはゲルマトリクスを含むカラムである、請求項7に記載の組成物。
- 前記固定相はマイクロアレイである、請求項8に記載の組成物。
- 前記マイクロアレイが、前記1または複数の単離された核酸の1または複数のフラグメントを含み、該フラグメントが前記1または複数のマイクロサテライト反復モチーフを含む、請求項9に記載の組成物。
- 前記1または複数のフラグメントは標識を含む、請求項10に記載の組成物。
- 前記1または複数の単離された核酸は、1または複数の異種核酸に作動可能に連結された、請求項6に記載の組成物。
- 前記異種核酸は、ベクターである、請求項12に記載の組成物。
- 前記ベクターは、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである、請求項13に記載の組成物。
- 前記ベクターを含む複数の宿主細胞をさらに含む、請求項13または14に記載の組成物。
- 前記宿主細胞は、流体低温保存物中に含まれる、請求項15に記載の組成物。
- さらに固定相を含み、前記宿主細胞は、該固定相の表面に結合されている、請求項15に記載の組成物。
- さらに固定相を含み、前記ベクターは該固定相の表面に結合されている、請求項13または14に記載の組成物。
- 前記固定相は重合膜である、請求項18に記載の組成物。
- 前記固定相はニトロセルロースである、請求項19に記載の組成物。
- 本願明細書に記載されるような、マイクロサテライト配列
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