NL8800594A - Werkwijze voor de bepaling van nucleinezuren, alsmede reagenscombinatie en set daarvoor. - Google Patents
Werkwijze voor de bepaling van nucleinezuren, alsmede reagenscombinatie en set daarvoor. Download PDFInfo
- Publication number
- NL8800594A NL8800594A NL8800594A NL8800594A NL8800594A NL 8800594 A NL8800594 A NL 8800594A NL 8800594 A NL8800594 A NL 8800594A NL 8800594 A NL8800594 A NL 8800594A NL 8800594 A NL8800594 A NL 8800594A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- target nucleic
- nucleic acid
- primers
- copies
- selective
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Description
·*
Korte aanduiding: Werkwijze voor de bepaling van nucleïnezuren, alsmede reagenscombinatie en set daarvoor
De uitvinding heeft betrekking op een snelle en gevoelige werkwijze voor het bepalen van nucleïnezuren door middel van hybridisatietechnïe-ken, waarbij de detectorsondes gemodificeerde primers zijn die worden opgenomen in kopieën van het doelnucleïnezuur voorafgaand aan de hybridisa-5 tiereactie, alsmede op een reagenscombinatie en een set daarvoor.
Voorts heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor het bepalen van nucleïnezuren door middel van hybridisatietechnieken, waarbij de vangsondes gemodificeerde primers zijn die worden opgenomen in kopieën van het doelnucleïnezuur voorafgaand aan de hybridisatiereactie, alsmede 10 op een reagenscombinatie en een set daarvoor.
Achtergrond van de uitvinding
Bij hybridisatiereacties laat men een gelabelde oligo- of polynucleotide, d.w.z. de sonde, base-paring aangaan met het doelnucleïnezuur. Diverse hybridisatiemethoden zijn toegepast voor de detectie van nucleïne-15 zuren. Bij directe hybridisatiemethoden is het specimen hetzij in oplossing hetzij gefixeerd op een vaste drager. Het te identificeren nucleïne-zuur wordt gedemonstreerd onder toepassing van één gelabelde sonde.
In US-A-4 486 539 is een sandwich-hybridisatiemethode beschreven.
In deze methode worden twee afzonderlijke sondes toegepast, waarbij de 20 ene een detectorsonde is, gelabeld en gebruikt voor detectie, terwijl de andere een vangsonde is, geïmmobiliseerd op een vaste drager voor het afscheiden van het doelnucleïnezuur uit het reactiemengsel.
De methode van hybridisatie in oplossing is beschreven in de Britse octrooipublicatie 2 169 403. Twee verschillende sondes die zich beide in 25 dezelfde oplossingsfase bevinden worden in deze methode toegepast. De detectorsonde is gelabeld met een detecteerbaar label en aan de vangsonde is een groep bevestigd die affiniteit heeft voor een andere component. Na de hybridisatie kan de hybride, gevormd tussen de vangsonde, doelnucleïnezuur en de aetectorsonde uit de hybridisatieopiossing worden afgeschei-30 den met behulp var. de andere helft'van het affiniteitspaar,
De enzym-gekatalyseerde polymerisatie van DNA waarbij de nucleotide-sequentie van een eerder bestaande nucleïnezuurstreng, d.w.z. de sjabloon, nauwkeurig wordt gekopieerd in de complementaire streng daarvan,'
.eecPïsV
h t - 2 - behoort tot de stand van de techniek en is bijvoorbeeld beschreven in Kornberg, DNA replication, W.H. Freeman & Co, San Francisco, blz. 221-225 en 670-679, 1980, en in Maniatis e.a., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, blz. 122, 1982. Deze biologische 5 vermenigvuldiging wordt gebruikt in hybrisatiebepalingen waarin de te detecteren microbe wordt gekweekt, waardoor het DNA ervan wordt verrijkt, voorafgaand aan de test, en wordt beschreven in Woo, Methods Enzymol. 68, blz. 389, 1979, en in het Amerikaanse octrooischrift 4 358 535. Specifieke DNA-sequenties kunnen ook worden versterkt binnen levende cellen, bij-10 voorbeeld door toepassing van geschikte medicijnen, zoals beschreven door Clewell en Helinski in J. Bacteriol. 110, blz. 1135, 1972, en in de Europese octrooiaanvrage 55 742. Een meer specifieke DNA-verrijking wordt beschreven in de Europese octrooiaanvrage 175 689, waarin het doel wordt gebonden aan een plasmide-replicon en geïntroduceerd in een geschikte 15 cel. Nog een andere methode wordt beschreven in de Europese octrooiaanvrage 201 184, waarin de primer-afhankelijkheid van DNA-synthese wordt gebruikt om een in vitro reactie voor de versterking van het doel-DNA teweeg te brengen. In de Europese octrooiaanvrage 200 362 wordt een werkwijze voor het detecteren van versterkte genen voorgesteld.
20 Overzicht van de uitvinding
In de hybridisatiemethode volgens de uitvinding werken hetzij de detectorsondes hetzij de vangsondes als gemodificeerde primers die worden opgenomen in de kopieën van het doelnucleïnezuur in een sjabloon-afhanke-lijk polymerisatieproces voorafgaand aan de hybridisatiereactie.
25 In de werkwijze volgens de uitvinding is ten minste één primer noodzakelijk en zijn de primers altijd gemodificeerd. Indien de detectorsondes als primers fungeren in de polymerisatiereactie worden de primers voorzien van ten minste één geschikt, detecteerbaar label of van ten minste één specifieke plaats waaraan ten minste één geschikt, detecteerbaar 30 label kan worden gehecht.
Alternatief kunnen de vangsondes als primers worden gebruikt in de polymerisatiereactie, in welk geval de primers worden voorzien van ten minste één geschikte helft van een affiniteitspaar of van ten minste één specifieke plaats waaraan ten minste één geschikte helft van een affini-35 teitspaar kan worden gehecht.
De uitvinding verschaft tevens een reagenscombinatie en een set die in verpakte vorm een eenheid met meerdere houders omvat waarin de reagenscombinatie die vereist is voor het uitvoeren van de test aanwezig is.
Door toepassing van de detector- of de vangsondes als primers in een . δ £f-1 i -v 4 * - 3 - polymerisatiereactie is het raogelijk de gevoeligheid van de hybridisatie-reactie met enkele grootteorden te verhogen in vergelijking met werkwijzen waarbij het doel rechtstreeks wordt gemeten. Voorts verschaft de uitvinding een geschikte methode voor het uitvoeren van de hybridisetiereac-5 tie in oplossing zodanig dat de hybriden gemakkelijk en snel worden afgescheiden van de hybridisatieoplossing na de hybridisatiereactie.
De werkwijze volgens de uitvinding is geschikt voor het diagnosticeren van bepaalde ziekten, die met conventionele methoden zeer moeilijk te diagnosticeren zijn. Zo is de werkwijze bijzonder geschikt voor het iden-10 tificeren van cytomegalovirus en het HI- of AIDS-virus.
Korte beschrijving van de tekeningen
Fig. 1 geeft de base-sequentie van de gemodificeerde primers, P„ en Pjj, en van de selectieve sondes, Sj en S2, gebruikt in de Voorbeelden I, II en III, alsmede de relatieve plaatsen van de gemodificeerde primers, 15 Pa er. P^, en van de selectieve sondes, S-j en S2> op het doeinucieïnezuur in kwestie weer. De lange lijnen, A en B, geven de beide doelstrengen aan die zich in beide richtingen voortzetten. De pijlpunten op de primers, Pa en P^, geven de richting aan waarin ze worden verlengd in het polymerisa-tiepraces.
20 Fig. 2 geeft de base-sequentie van de gemodificeerde primers, P„ en P^, en van de selectieve sonde, S, gebruikt in Voorbeeld IV, alsmede de relatieve plaatsen van de gemodificeerde primers, P„ en P^, en van de selectieve sonde, S, op het doeinucieïnezuur in kwestie weer. Lijn A geeft het RNA en de identieke DNA-kopieën daarvan, aan en lijn B toont de 25 complementaire DNA-kopïeën. De pijlpunten op de primers P„ en P^ geven de richting aan waarin ze worden verlengd in het polymerisatieproces.
Gedetailleerde beschrijving van de uitvinding
Bereiding van testmateriaal
De in de werkwijze toegepaste sondes zijn oligo- of polynucleotiden.
30 De sondes kunnen synthetisch of semisynthetisch worden bereid, hetgeen de voorkeurswijzen zijn voor de bereiding van sondes, die tevens als primers zullen fungeren. Het is ook heel goed mogelijk de sondes te bereiden door recombinant-technieken, of uit nucleïnezuren die rechtstreeks uit de natuur geïsoleerd zijn. Een sonde kan gebonden zijn aan een geschikte 35 vector. Hij kan vectordelen bevatten of geheel vrij zijn van vectordelen.
Er is op het ogenblik een veelheid aan geschikte primers en sondes die toegepast kunnen worden in de handel verkrijgbaar.
De detectorsonaes als gemodificeerde primers.
In één van de werkwijzen volgens de uitvinding zijn de detector- » b L 'v v 3 l 4 * ** - A - sondes oligonucleotiden of polynucleotiden, die aan het doelnucleinezuur kunnen worden gebonden door base-paring en die als primers voor een sja-bloon-afhankelijk nucleïnezuur synthetiserend enzym kunnen fungeren. Het is wezenlijk dat de detectorpriraers zijn voorzien van ten minste één 5 geschikt detecteerbaar label of van ten minste één specifieke plaats waaraan ten minste één geschikt detecteerbaar label kan worden gehecht.
Diverse radioactieve isotopen of radioactief gelabelde verbindingen kunnen als labels worden gebruikt. De labelsubstantie kan ook fluorescerend, luminescerend, licht-emitterend, enzymatisch of immunologisch de-10 monstreerbaar, enz. zijn. Labels gebaseerd op de affiniteit van biotine en avidine of streptavidine, lanthanide-chelaten, ferritine en heme-ver-bindingen, en immunologisch demonstreerbare haptenen, zoals AAF en AIF (acetoxyacetylfluoreen-derivaten) kunnen als voorbeelden worden genoemd. Identificatie met behulp van mediatoren, bijvoorbeeld eiwitten, is ook 15 mogelijk.
De werkwijze volgens de uitvinding is niet afhankelijk van het gebruikte label. Alle op het ogenblik bekende labelsubstanties die geschikt zijn voor nucleïnezuur-hybridisatie kunnen vrijelijk op de werkwijze worden toegepast. Het is echter wezenlijk dat indien de detectorsondes 20 als primers werken het label wordt gekozen uit een groep van labels die de functie van de primer niet zullen verstoren. Het label moet op zodanige wijze aan de detectorprimer worden bevestigd dat het nucleïnezuurpoly-meriserende enzym deze nog als primer kan herkennen.
De vangsondes als gemodificeerde primers.
25 In de andere werkwijze volgens de uitvinding zijn de vangsondes oli gonucleotiden of polynucleotiden, die aan het doelnucleinezuur kunnen worden gebonden door base-paring en die als primers voor een sjabloonaf-hankelijk nuclexnezuursynthetiserend enzym kunnen fungeren. Het is wezenlijk dat de vangprimers zijn voorzien van ten minste één geschikte helft 30 van een affiniteitspaar of van ten minste één specifieke plaats waaraan ten minste één geschikte helft van een affiniteitspaar kan worden gehecht. Het is ook mogelijk de helft of helften van het affiniteitspaar via een mediator aan de vangprimer te bevestigen. De enige voorwaarden zijn dat het mogelijk is de hybride uit de hybridisatieoplossing af te 35 scheiden met behulp van het affiniteitspaar en dat de primerfunctie geen schade leidt.
De helft van het affiniteitspaar is een component met affiniteit voor een andere component. Voorbeelden van zulke affiniteitsparen zijn biotine / avidine of streptavidine, een zwaar-metaai-derivaat / een thio- . 8 ε c c: : 4 - 5 - groep, diverse homopoiynucleotiden, zoals poly-dG / poly-dC, poly-dA / poly-dT en poly-dA / poly-U. Maar ook andere componentparen kunnen worden toegepast, mits deze een voldoende sterke affiniteit hebben om de specifieke binding van de gemodificeerde vangprimers die zijn opgenomen in de 5 kopieën van het doelnucleïnezuur aan de vaste drager mogelijk te maken. Geschikte affiniteitsparen worden aangetroffen onder liganden én conjuga-ten die in immunologische methoden worden toegepast.
De selectieve vangsonde.
In één van de werkwijzen volgens de uitvinding, waarbij de detector-10 sondes als primers fungeren, is een selectieve vangsonde vereist om de selectieve afscheiding van de kopieën van het doelnucleïnezuur waarin de gemodificeerde primers zijn opgenomen mogelijk te maken. Het is wezenlijk dat de vangsondes voldoende homoloog aan het doelnucleïnezuur zijn om de speficieke hybridisatie daarvan met de kopieën van het doelnucleïnezuur 15 en daardoor selectieve afscheiding en detectie van de detectorprimers die zijn opgenomen in de kopieën van het doelnucleïnezuur mogelijk te maken.
De selectieve detectorsonde.
In de andere werkwijze volgens de uitvinding, waarbij de vangsondes als gemodificeerde primers fungeren, is een selectieve detectorsonde ver-20 eist om de detectie van de kopieën van het doelnucleïnezuur waarin de gemodificeerde primers zijn opgenomen mogelijk te maken. Het is wezenlijk dat de detectorsonde voldoende homoloog aan het doelnucleïnezuur is om het doelnucleïnezuur specifiek te hybridiseren en het daardoor selectief te identificeren. De detectorsondes kunnen worden voorzien van alle ge-25 schikte, detecteerbare labels, bijvoorbeeld de bovengenoemde.
Reagenscombinaties.
De detectorsonde als gemodificeerde primer.
De uitvinding heeft betrekking op een reagenscombinatie omvattende ten minste één gemodificeerde primer, voorzien van ten minste één ge-30 schikt detecteerbaar label of van ten minste één specifieke plaats waaraan ten minste één geschikt detecteerbaar label kan worden gehecht en ten minste één selectieve vangsonde, voorzien van ten minste één helft van een affiniteitspaar of ten minste één specifieke plaats waaraan ten minste één helft van een affiniteitspaar kan worden gehecht.
35 De vangsonde ais gemodificeerde primer.
.tevens
De uitvinding heeft'betrekking op een reagenscombinatie omvattende ten minste één gemodificeerde primer, voorzien van ten minste één geschikte helft van een affiniteitspaar of van ten minste één specifieke plaats waaraan ten minste één geschikte helft van een affiniteitspaar kan - 6 - worden gehecht en ten minste één selectieve detectorsonde, voorzien van ten minste één geschikt, detecteerbaar label of ten minste één geschikte plaats waaraan ten minste één geschikt, detecteerbaar label kan worden gehecht.
5 Sets.
De uitvinding heeft tevens betrekking op een geschikte set voor het bepalen van nucleïnezuren. De set omvat in verpakte vorm een eenheid met meerdere houders waarin één van de bovengenoemde reagenscombinaties is gecombineerd met ten minste één van de volgende reagentia of faciliteiten 10 die nodig zijn in de test, namelijk eventueel een houder die ten minste één agens voor sjabloonafhankelijke polymerisatie bevat, eventueel een houder met de vier deoxynucleosidetrifosfaten, eventueel een geschikte faciliteit voor het polymerisatie- en het hybridisatieproces, eventueel een geschikte faciliteit voor het afscheiden van de kopieën van de doel-15 nucleïnezuren en eventueel een geschikte faciliteit voor het bepalen van het label. De voorkeursfaciliteiten en -reagentia worden in het volgende deel van de beschrijving in meer detail beschreven.
De werkwijze volgens de uitvinding.
De voorkeurswerkwijze volgens de uitvinding begint met het toevoegen 20 van ten minste twee gemodificeerde primers, welke beide primers hetzij detector- hetzij vangprlmers zijn, aan een gedenatureerde monsteroplos-sing. De gemodificeerde primers zullen elk "annealen" aan hun complementaire streng van het doelnucleïnezuur, d.w.z. de sjabloon, en na toevoeging van een sjabloonafhankelijk nucleïnezuur-synthetiserend enzym zullen 25 de primers worden verlengd. De werkwijze verloopt doeltreffend in vitro onder vorming van nieuwe nucleïnezuurstrengen die verscheidene duizenden basen lang kunnen zijn, mits de omstandigheden geschikt zijn.
Door toepassing van een overmaat aan gemodificeerde primers kan de werkwijze worden herhaald om complementaire kopieën te vormen bij de pas 30 gesynthetiseerde strengen, hetgeen derhalve identieke kopieën van de eerste sjabloon zijn. Door herhaling van deze werkwijze wordt een cascade-reactie op gang gebracht waardoor het doelnucleïnezuur wordt vermenigvuldigd. De werkwijze kan zo vaak als gewenst worden herhaald, om de gewenste detectiegevoeligheid te verkrijgen. In gevallen waarin de doelnucleï-35 nezuurconcentratie niet extreem laag is is één vermenigvuldiging voldoende om het doelnucleïnezuur detecteerbaar te maken.
Het is ook mogelijk slechts één gemodificeerde primer toe te passen in de werkwijze volgens de uitvinding. In dit geval is de vermenigvuldiging echter niet zo doeltreffend als bij toepassing van ten minste twee .HO fclM' - 7 - primers doordat de reactie niet van het cascadetype is.
Zowel DNA als RNA kunnen worden bepaald door de werkwijze volgens de uitvinding. Indien het doelnucleïnezuur RNA is is het echter het handigst het RNA eerst te kopiëren naar het overeenkomstige cDNA door reverse 5 transcriptase enzym, waarna de werkwijze verloopt als hierboven beschreven.
Nadat de gemodificeerde primers zijn opgenomen in de kopieën van de doelnucleïnezuren wordt een geschikte selectieve sonde die de doelsequen-tie en de kopieën daarvan herkent aan het reactiemengsel toegevoegd en 10 wordt de hybridisatiereactie uitgevoerd onder omstandigheden die geschikt zijn voor het respectieve gekozen hybridisatieproces.
In de hybridisatiereactie wordt, afhankelijk van de keuze van de gemodificeerde primers, hetzij een selectieve vangsonde hetzij een selectieve detectorsonde in de gelegenheid gesteld te hybridiseren met de ko-15 pieën van het doelnucleïnezuur die nu aanwezig zijn in een hoeveelheden die een veelvoud zijn in vergelijking met de hoeveelheid doelnucleïnezuur in de oorspronkelijke toestand.
Indiër, het oorspronkelijke monster de doelsequentie bevatte zal de toegevoegde selectieve sonde hybridiseren tot nieuw gesynthetiseerde ko-20 pieën van het doelnucleïnezuur. Een hybride wordt gevormd tussen het ko-piemoiecuuï waarin de gemodificeerde primer is opgenomen en de selectieve sonde. De gevormde hybriden worden volgens de uitvinding op geschikte wijze van de hybridisatieoplossing afgescheiden met behulp van de helft van het affiniteitspaar die hetzij aan de vangprimer hetzij aan de selec-25 tieve vangsonde is bevestigd. Tijdens het fractioneren hechten deze vang-groep-bevattende hybriden aan een vaste drager door middel van de andere helft van het affiniteitspaar en de hoeveelheid selectieve detectorsonde of detectorprimer die aan de drager hecht kan worden gemeten door conventionele methoden rechtstreeks vanaf de drager of na elutie vanuit het 30 eluaat. De hoeveelheid label is een maat voor de hoeveelheid doelnucleïnezuur.
Voorafgaand aan de fractionering wordt de oplossing zonodig verdund, om de omstandigheden gunstig te maken voor het affiniteitspaar. Daarna wordt de oplossing in contact gebracht met de vaste drager. De drager in 35 kwestie kan bijvoorbeeld een affiniteïtschromatografiekolom, een filter, een kunststofoppervlak of een glasoppervlak, zijn..Geschikte faciliteiten voor het uitvoeren van de scheiding zijn verschillende types microtiter-platen, meetstoksystemer. of magnetische deeltjes, maar het is heel goed mogelijk de scheiding uit te voeren in reageerbuizen en op kralen, enz.
. U 1 u E '· t 0 - 8 -
Het dragermateriaal van de affiniteitskolom kan natuurlijk of synthetisch polymeer zijn, bijvoorbeeld cellulose, polyacrylamide, polystyreen, dextran of agarose. Deze materialen kunnen ook als suspensies in een reageerbuis worden gebruikt. Het is ook gunstig reageerbuizen te ge-5 bruiken waarin de andere helft van een affiniteitspaar is gefixeerd op het binnenoppervlak daarvan. Het is een vereiste voor het gekozen materiaal dat het mogelijk is daaraan een component te fixeren met affiniteit voor de helft van het affiniteitspaar die bevestigd is aan de vangprimer of de selectieve vangsonde.
10 Het is niet noodzakelijk de helft of helften van het affiniteitspaar aan de vangprimer te bevestigen aan het begin van de polymerisatie. Evenmin is het noodzakelijk het detecteerbare label voor de polymerisatie aan de detectorprimer te bevestigen. Deze kunnen ook na het polymerisatiepro-ces worden geaddeerd aan de gemodificeerde primer die is opgenomen in de 15 kopieën van het doeinucleïnezuur. Bijvoorbeeld wanneer het detecteerbare label gevoelig is voor de hybridisatieomstandigheden is het mogelijk het pas na de hybridisatie van de selectieve vangsonde met de kopieën van het doeinucleïnezuur te adderen.
Indien de detectorsondes werken als gemodificeerde primers die wor-20 den opgenomen in de kopieën van het doeinucleïnezuur kan de hybride van het reactiemengsel worden afgescheiden met behulp van selectieve vangson-des, geïmmobiliseerd op vaste dragers. In deze methode, die eveneens is beschreven in de Europese octrooiaanvrage 237 362, wordt de snelheid beperkende stap gecreëerd wanneer het doeinucleïnezuur en de kopieën daar-25 van, waarin detectorprimers zijn opgenomen, moeten hybridiseren met de selectieve vangsonde die is geïmmobiliseerd op een vaste drager. Derhalve is hybridisatie in oplossing een werkwijze volgens de uitvinding die meer de voorkeur heeft dan deze. Echter indien de werkwijze wordt uitgevoerd onder toepassing van een geïmmobiliseerde vangsonde wordt de op de vaste 30 drager gevormde hybride gewassen en wordt de hoeveelheid label op de drager volgens conventionele methoden gemeten.
Het principe van de test wordt toegelicht in de volgende voorbeelden.
Voorbeeld I
35 Detectie van cytomegalovirus-DNA onder toepassing van detectorsondes als gemodificeerde primers
In dit modelexperiment was het doel een recombinant-plasmide (pBR322/CMV HindlII L) met daarin ondergebracht een 12,3 kb fragment van het cytomegalovirus (CMV, AD 169, ATCC VR-538) genoom. De twee detector- . o u C 5 9 4 -9-.
primers die werden toegepast (Pa, P^, fig. 1) waren 20 nucleotiden lang en gesynthetiseerd volgens standaardmethoden in een geautomatiseerde syn-these-inrichting. Zij komen overeen met twee gebieden op de CMV-specifie-ke inlas die zich 111 nucleotiden van elkaar bevonden. Twee selectieve 5 vangsondes (S j, S^, fig. 1) herkenden gebieden op elk van de beide strengen tussen de beide detectorprimers. De detectorprimers P en waren •yp gelabeld met P aan de S'-uiteinden daarvan tot een specifieke activiteit van 4 x 10^ CPM/microgram onder toepassing van de algemeen bekende reactie met polynucleotide-kinase en gamma- P-ATP (Maniatis e.a., Moie-10 cular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). .
Gebiotinyleerde nucleotiden werden geaddeerd aan de 3’-uiteinden van de vansondes onder toepassing van bio-11-dUTP (BRL) en terminaal transferase (Promega Biotech.) ais beschreven door Riley e.a., DNA, 5 (4), biz. 333-337, 1986. De doel-plasmide was gelineariseerd door klieven met het 15 restrictie-enzym EcoRX. DNA-Polymerase, Kienow-fragment, werd gekocht van Boehringer-Mannheim en streptavidine-agarose van BRL.
Onder toepassing van deze reagentia werd het volgende experiment uitgevoerd.
Vier verschillende reactiemengsels werden aangemaakt, die resp.
20 0, Ιθ\ 106 en 10® moleculen {overeenkomend met 0, 2x10“®®, 2x10-1® en 1 fi 2x10” ° mol) van de doelpiasmide bevatten. Voorts bevatten alle vier de reactiemengsels in een totaal volume van 50 microliter: 2 pmoi van elk van de beide primers, 0,5 mM van elk van de vier deoxynucleosidetrifosfa-ten (d.w.z. dATP, dCTP, dGTP en dTTP), 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM 25 MgCl2, 50 mM NaCl en 10 mM dithiothreitol. Het mengsel werd 2 min tot 1QQ°C verwarmd, vervolgens 5 min bij 37°C geïncubeerd, waarna 1 microliter (gelijk aan 1 eenheid) DNA-polymerase werd toegevoegd. Vervolgens werd het mengsel opnieuw 10 min bij 37°C geïncubeerd. Het koken, gevolgd door annealen van de detectorprimers en een incubatie met toegevoegde 30 DNA-polymerase bij 37°C vormt een DNA-synthesecyclus.
In dit experiment werd de cyclus hetzij eenmaal uitgevoerd, hetzij 5 of 15 maal herhaald. Na de laatste cyclus werd het monster opnieuw tot 100°C verwarmd, waarna 10 pmol van de selectieve vangsonde werd toegevoegd, tezamen met NaCl (0,9 M), EDTA (20 mM), natriumfosfaat (pH 7,5; 35 20 mM) en natriumdociecylsuifaat (0,1%). Het volume nam toe tot 100 micro liter en de gegeven concentraties zijn als eindconcentraties. Het mengsel werd vervolgens 1 uur bij 50°C geïncubeerd. Na deze hybrxdisstiereactie werd 200 microliter van een 25%'ïge suspensie van streptavidine-agarose-' in 1M NaCl, 20 mM natriumfosfaat (pH 7,5) en 1 mM EDTA toegevoegd. Gebio-
. Ü ij 0 ü $ M
- ΊΟ - tinyleerde moleculen werden gedurende 15 min bij 37°C in een roterende menginrichting in de gelegenheid gesteld te binden aan de streptavidine-agarose. De agarose werd verzameld door een korte centrifugering en de bovendrijvende vloeistof werd verwijderd door afzuiging. De agarose werd 5 vervolgens eenmaal gewassen in gebufferd 1M NaCl en tweemaal in een oplossing die 150 mM NaCl, 15 mM natriumcitraat en 0,2% natriumdodecylsul-faat bevatte (pH 8) bij 37°C. De radioactiviteit van de agarose waaraan de gevormde hybriden waren gebonden werd vervolgens bepaald in een radio-activiteitsteller. De procedure voor het oogsten en wassen van DNA-hybri-10 den die een gebiotinyleerd merkteken bevatten behoort tot de stand van de techniek en is bijvoorbeeld beschreven in de Britse octrooipublicatie 2 169 403.
De resultaten van het experiment worden weergegeven in Tabel A. Men ziet dat één cyclus van DNA-synthese slechts dan voldoende radioactivi-15 teit voor detectie inbouwt indien hoge doelconcentraties aanwezig zijn, maar dat zelfs de zeer lage doelhoeveelheid detecteerbaar is na 15 cycli. Bij grotere hoeveelheden doel en 15 cycli werd de hoeveelheid detector-primer beperkend.
Tabel A
20 Hoeveelheid doel (mol) J P-activiteit in verzamelde hybriden a) (CPM boven achtergrond) 13) 1 5 15 cycli 0 0 0 0 2x1O-20 ND ND 650 25 2x10“18 ND 300 11000 2x10_16 700 13000 36000 a) Gemiddelde van twee bepalingen b) ND - niet detecteerbaar (minder radioactiviteit dan tweemaal de gemiddelde achtergrondactiviteit)
30 Voorbeeld II
Bepaling van cytomegalovirus-DNA onder toepassing van vangsondes als gemodificeerde primers
In dit voorbeeld fungeren de vangsondes als primers. De gebruikte reagentia waren dezelfde als in Voorbeeld I, met de volgende uitzonderin-35 gen: De vangprimers (P„, Pb, fig. 1) werden niet gelabeld met 32P maar de 5'-uiteinden ervan werden in plaats daarvan zodanig gemodificeerd dat . 68 0 0594 - 11 - deze een biotinerest bevatten. Deze chemische modificatie werd uitgevoerd onder toepassing van bekende methoden, beschreven door Chollet en Kawa-shima, Nucleic Acids Research, 13, blz. 1529-1541, 1985. De twee selectieve sondes (S-j, S2, fig. 1) werden in dit geval aan de 5’-uiteinden 5 daarvan gelabeld om als detectorsondes te fungeren. De specifieke activiteiten ervan waren resp. ongeveer 2x10^ en 2,5x10^ cpm/microgram.
De reactiemengsels werden aangemaakt als beschreven in Voorbeeld I. De gebiotinyleerde vangprïmers werden echter toegevoegd in 10-voudige hoeveelheden, d.w.z. 20 pmoi van elk per reactie. Er werden 1, 5 of 15 10 cycli uitgevoerd als beschreven, waarna de monsters werden verwarmd tot 100°C, en 0,5 pmoi van elk van de 82P-gelabelde sondes S1 en S2 werd toegevoegd. De hybridisatie werd uitgevoerd onder dezelfde omstandigheden als beschreven in Voorbeeld I.
De hybriden werden vervolgens verzameld op streptavidine-agarose, 15 gewassen en geteld op P-activiteit, als in Voorbeeld I. Het resultaat wordt weergegeven in Tabel B.
Tabel B
-50 <-·
Hoeveelheid doel (mol) J P-activiteit in verzamelde hybriden a (CPM boven achtergr-ond) 15) .
20 1 5 15 cycli 0 0 0 0 2x1O"20 ND ND 800 2x10"18 ND 400 13000 2xl0~16 300 11000 54000 25 a) Gemiddelde van twee bepalingen b) ND - niet detecteerbaar {vergelijk Voorbeeld I)
Voorbeeld III
Detectie van cytomegalovirus-DNA uit klinische monsters onder toepassing van vangsondes ais gemodificeerde primers 30 In dit voorbeeld wordt de toepasbaarheid van de werkwijze voor het bestuderen van klinische monsters aangetoond door detecteren van CMV uit de urine van eer. zuigeling waarvan bekend was dat deze leed aan cytomega-lovirusbesmetting.. De urine van een gezond kind werd meegenomen als controle. De beide monsters bedroegen 10 ml urine waaruit het totale DNA 35 werd geïsoleerd als beschreven in Virtanen e.a., J. Clin. Microbiol., 20 (6), blz. 1083-1088, 1984. De DNA's, opgelost in 20 microliter H20, wer- .88011 i: h - 12 - den als doel gebruikt in reacties die overigens werden uitgevoerd als beschreven in Voorbeeld II. Na 10 cycli van DNA-synthese werd de gelabelde selectieve sonde aan het monster toegevoegd, in de gelegenheid gesteld te hybridiseren, en de hybriden verzameld. Het DNA uit de urine van de pa-5 tiënt vertoonde een duidelijk hogere radioactiviteit in hybriden, terwijl het DNA afkomstig van de gezonde persoon slechts achtergrondradioactivi-teit vertoonde. De feitelijke cpm-waarden waren resp. 2300 en 240.
Voorbeeld IV
Detectie van Semiliki Forest virus RNA onder toepassing van vang-10 sondes als gemodificeerde primers
Voorbeeld IV is bedoeld om te laten zien dat de beschreven werkwijze ook kan worden toegepast voor de detectie van RNA. Het gebruikte model was het RNA uit Semiliki Forest virus (SFV).
De gebruikte reagentia waren twee 5'-gebiotinyleerde vangprimers 15 (fig. 2) (bereid als beschreven in Voorbeeld II), een enkele 5'-^^P-gelabelde selectieve detectorsonde (bereid als beschreven in Voorbeeld I), reverse transcriptase (Promega Biotech) en DNA-polymerase, Klenow-fragment (Boehringer Mannheim).
De eerste stap in de detectie van het SFV-RNA was het synthetiseren 20 van een cDNA-kopie. Het reactiemengsel van 20 microliter bevatte 10 mM tris-Cl (pH 8,3), 50 mM KC1, 10 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol, 0,5 mM van elk van de vier deoxynucleosidetrifosfaten, 0,5 microgram t-RNA, 10 pg SFV-RNA, 10 pmol vangprimer P en 100 U reverse transcriptase. Dit mengsel werd 15 min. tot 37°C geïncubeerd. Vervolgens werd het mengsel 25· 5 min bij 100°C verwarmd en tot omgevingstemperatuur gekoeld. Daarna werd 50 microliter van een oplossing die 10 mM Tris-Cl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol, 10 pmol van de vangprimer P^ en 0,5 mM van elk van de vier deoxynucleosidetrifosfaten toegevoegd. De temperatuur werd verhoogd tot 37°C en na 5 min. werd 1 U DNA-polymerase toegevoegd.
30 Na nog 10 min incuberen werd het reactiemengsel 5 min bij 100°C geïncubeerd, het mengsel werd tot 37°C gekoeld en 5 cycli van DNA-synthese wer-
C
den uitgevoerd. Na een afsluitende denaturatiestap werd 0,1 pmol (1,2x10 cpm) van de selectieve detectorsonde toegevoegd in 80 microliter 1M NaCl, 50 mM EDTA, 50 mM natriumfosfaat (pH 7,5) en 0,1% natriumdodecylsulfaat. 35 De oplossing werd vervolgens 2 uur bij 55°C geïncubeerd, waarna de hybriden werden verzameld en gewassen als beschreven in Voorbeeld I.
Als negatieve controle voor de reacties werd een identiek monster onderworpen aan dezelfde behandeling, uitgezonderd dat er geen reverse transcriptase werd toegevoegd. Het monster waarin het RNA met reverse
, 88O05M
- 13 -
OO
transcriptase in cDNA werd omgezet verschafte 420 cpm P-sctiviteit in gevangen hybriden, terwijl de negatieve controle 50 cpm opleverde. Voorbeeld V
Vergelijking van verschillende wijzen van detecteren van vermenig-5 vuldigd DNA
In dit voorbeeld werden drie verschillende wijzen van detecteren van vermenigvuldigd DNA vergeleken. De reagentia en het vermenigyuldigings-proces waren als beschreven in de Voorbeelden I en II, uitgezonderd dat de selectieve vang- of detectorsondes bestonden uit M13-klonen die onge-10 veer 100 nucleotiden tussen de primers herkenden.
De M13-klonen werden verkregen door subkloneren van een HaelII-restrictiefragment van de recombinantplasmide pBR322/CMV.HindIII L in de faagvector M13mp10 onder toepassing van standaardtechnieken. De als selectieve vangsondes toe te voegen M13-kionen werden gemodificeerd met 15 biotine onder toepassing van photoprobe (merknaam) biotine (Vector Laboratories). De als selectieve detectorsondes te gebruiken M13-klonen *30 werden gelabeld met JCP-dCTP onder toepassing van DNA-polymerase I (het Klenow-fragment) en primeruitbreiding (Hu en Messing, Gene 17, blz. -271-
O
277, 1982) tot een specifieke activiteit van 2x10 cpm/microgram.
20 De vermenigvuldiging van 3X10·5 moleculen (0,5x10 mol) van de ge- lineariseerde pBR322/CMV HindlII L plasmide werd uitgevoerd met 10 cycli.
op
Voor detectie volgens de Wijzen 1 en 2 werd 2 pmol van elk van de P-gelabelde detectorprimers P„ en P^ toegepast en het vermenigvuldigings-proces werd uitgevoera als beschreven in Voorbeeld I. Voor detectie vol-25 gens Wijze 3 werd 25 pmol van de gebiotinyleerde vangprimers toegepast in de vermenigvuldigingsprocedure en de reactie werd uitgevoerd als beschreven in Voorbeeld II.
Detectiewijze 1 - Toepassing van een selectieve vangsonde voor het verzamelen van hybriden die in oplossing zijn gevormd met de kopieën van 30 het doelnuclelnezuur
In deze detectiewijze werden gebiotinyleerde selectieve M13 vangson-des gebruikt voor het verzamelen van de vermenigvuldigde DNA-fragmenten.
Na de laatste vermenigvudigingscyclus werd het monstermengsel tot 100°C verwarmd en werden 2x10^ moleculen van elk van de gebiotinyleerde selec-35 tieve vangprimers toegevoegd, tezamen met NaCl (0,6 M), EDTA (5 mM), na-triumfosfaat (20 mM) en SDS (0,1%). Het volume nam toe tot 100 microliter en de eindconcentraties worden gegeven. Het mengsel werd 2 uur bij 65°C geïncubeerd. De gevormde hybriden werden verzameld op streptavidine-agarose als beschreven in Voorbeeld I, uitgezonderd dat er twee extra £ €1 ~ - 14 - wassingen van Ί min bij 50°C werden uitgevoerd met 15 mM NaCl, 1,5 mM natriumcitraat en 0,2% SDS. De radioactiviteit van de verzamelde hybriden werd gemeten.
Detectiewijze 2 - Selectieve vangsonde geïmmobiliseerd voorafgaand 5 aan de hybridisatie daarvan met de kopieën van het doelnucleïnezuur
In dit geval werden geïmmobiliseerde selectieve M13 sondes toegepast om het vermenigvuldigde DNA te vangen. Na de laatste vermenigvuldigings-cyclus werden de monsters verwarmd tot 100°C. NaCl (0,6 M), natriumcitraat (60 mM), Ficoll (merknaam) (0,02%), polyvinylpyrrolidon (0,02%), 10 runderserumalbumine (0,02%) en gedenatureerd haringsperma-DNA (0,2 mg/ml) werden toegevoegd om de aangegeven concentraties te geven in een eindvo- 1 o lume van 100 microliter. Een nitrocellulosefilterschijf, waarop 5x10 moleculen van elk van de selectieve sondes waren geïmmobliseerd volgens een eerder beschreven procedure (US-A-4 486 539) werd aan elk monster 15 toegevoegd. Het mengsel werd met de filters geïncubeerd bij 65°C gedurende 2 uur of 18 uur. Na de hybridisatiereactie werden de filters tweemaal gewassen gedurende 20 min bij 50°C met 15 mM NaCl, 1,5 mM natriumcitraat en 0,2% SDS en de aan de filters gebonden radioactiviteit werd gemeten. Detectiewijze 3 - Toepassing van selectieve detectorsonde voor de-20 tectie pp
Hier werden P-gelabelde selectieve M13 detectorsondes gebruikt voor de detectie van het vermenigvuldigde DNA en werden de hybriden verzameld met behulp van de vangprimers, gebiotinyleerd aan de 5'-uiteinden als beschreven in Voorbeeld II. De vermenigvuldigde monsters werden ver-25 warmd tot 100°C en 2x10® moleculen (2x10® cpm) van elk van de ®®P-gela-belde selectieve sondes werden toegevoegd tezamen met zouten als beschreven voor Wijze 1. Hybridisatie en verzameling van de gevormde hybriden werd uitgevoerd als voor Wijze 1.
Een vergelijking van de resultaten verkregen door de drie detectie-30 wijzen wordt getoond in Tabel C.
De Wijzen 1 en 3 hebben het voordeel van de hogere hybridisatiesnel-heid in oplossing in vergelijking met de filterhybridisatie in Wijze 2.
pp
De hoogste J P-activiteit wordt verkregen door Wijze 3 omdat de selectie- pp ve detectorsonde meerdere JtP-atomen per molecuul bevat.
„ e ε ' f rk * ·. * r« .
- 15 -
Tabel C
Wijze Primers Selectieve Hybridisatie- 22P-activiteit M13-sonde tijd (uren) in hybriden (cpm) a) 5 1 22P-gelabelde Gebiotinyleerde 2 870 detector vanging 2 22P-gelabelde Geïmmobiliseerde 2 43 detector vanging 18 920 3 Gebiotinyleerde 22P-gelabelde 2 7800 10 vanging detector a) Gemiddelde van drie bepalingen (cpm boven de achtergrond)
Voorbeeld VI
Vermenigvuldiging van cytomegalovirus-DNA onder toepassing van gebiotinyleerde detectorprimers en indirecte detectie met streptavidine-15 mierikswortelperoxidase
In dit Voorbeeld werd de vermenigvuldiging van de CMV-speCifieke plasmiöe (pBR322/CMV HindlII L) uitgevoerd onder toepassing van de in Voorbeeld II beschreven gebiotinyleerde primers Pa en P^ als detectorprimers. De in Voorbeeld V beschreven Ml3-kionen, gemodificeerd met sul-20 tongroeper., werden toegepast ais selectieve vangsondes. De gevormde hybriden werden verzameld in microtitratieputjes bekleed met antilichamen die sulfon-gemodificeerd DNA herkenden. De uiteindelijke detectie van de gevormde hybriden werd uitgevoerd met een streptavidine-mierikswortelper-oxidase-conjugaat, dat de biotinegroepen van de primers detecteert.
25 De M13-kIonen werden gemodificeerd door een sulfoneringsreactie on der toepassing van reagentia en de procedure aanbevolen door Orgenics Ltd (Yavne, Israel). Polystyreen-microtitratieputjes (Nunc, Denemarken) werden bekleed met 10 microgram/ml IgG, gezuiverd uit een monokionaal anti-lichaam tegen sulfon-gemodificeerd DNA (Orgenics Ltd) in 10 mM natrium-30 carbonaatbuffer (pH 9,6) gedurende een nacht bij 4°C.
Een reactiemergsel dat 3x10^ moleculen van de gelineariseerde PBR322/CMV HindlII L plasmiden of controles zonder de .plasmide en 25 pmol van elk van de gebiotinyleerde primers Pa en P^ bevatte werd gedurende 10 vermenïgvuldigingscycli behandeld bij de in Voorbeeld I beschreven om-35 shandigheden. De monsters werden verwarmd tot 100°C, waarna 2x10^ moleculen van eik van ae gesuifoneerde selectieve vangsondes werden toegevoegd, £ p ' • > 1 i V , V -t - 16 - tezamen met reagentia als beschreven voor Detectiewijze 1 in Voorbeeld V.
Het mengsel werd 2 uur bij 65°C geïncubeerd, verdund met 100 microliter 0,2% Tween 20 en overgebracht in de beklede microtitratieputjes.
De hybriden werden gedurende 2 uur bij 37°C in de gelegenheid gesteld 5 te binden aan de putjes. Het reactiemengsel werd weggegooid en de putjes werden driemaal gewassen met 0,1% Tween 20 in 0,15 M natriumchloride, 20 mM natriumfosfaat (pH 7,5) (PBS). 200 microliter van een streptavidi-ne-mierikswortelperoxidase-conjugaat (Amersham, UK), 1:2000 verdund in een oplossing van 1% runderserumalbumine, 0,1% Tween 20 in PBS werd toe-10 gevoegd en de putjes werden gedurende 45 min bij 37°C geïncubeerd. Na vier wassingen als hierboven werd 200 microliter van een substraatoplos-sing bestaande uit 0,46 mg/ml 0-fenyleendiamine, 0,01% H2O2 in 0,1 M na-triumacetaatbuffer (pH 5,0) toegevoegd. Na 15 min bij 22°C werd de reactie beëindigd door de toevoeging van 50 microliter 2N H2S0^ en het absor-15 berend vermogen van het gekleurde produkt werd gemeten met een spectro-fotometer bij 492 nm. De verzamel- en de detectieprocedure zijn eerder beschreven door Syvanen e.a. (Nucleic Acids Res, 14, biz. 5037-5048, 1986).
De resultaten van het experiment worden getoond in Tabel D.
20 3x103 Moleculen (0,5x10 mol) van de doelplasmide werden duidelijk gedetecteerd na 10 vermenigvuldigingscycli.
Tabel D
Hoeveelheid doel (mol) Absorberend vermogen bij 492 nm a) 0,5 x 10"18 0,348 25 0 0,120 a) Gemiddelde van drie bepalingen . 880
Claims (9)
1. Werkwijze voor het bepalen van nucleïnezuren door hybridisatie, met het kenmerk dat de vangsondes fungeren als gemodificeerde primers, die worden opgenomen in de kopieën van het doelnucleïnezuur, de aanwezig- 5 heid waarvan vervolgens wordt gedetecteerd door ten minste één selectieve detectorsonde.
2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk dat deze omvat: (a) voorzien van ten minste één primer van het doelnucleïnezuur van ten minste één helft van een affiniteitspaar of ten minste één specifieke 10 plaats waaraan ten minste één helft van een affiniteitspaar kan worden gehecht; (b) laten reageren van de genoemde vangprimer of -primers met het enkelstrengs doelnucleïnezuur onder omstandigheden gechikt voor een sja-bloonafhankelijke polymerisatiereactie; 15 (c) laten hybridiseren van de enkelstrengs kopieën van doelnucleïne zuur waarin de vangprimers zijn opgenomen met een detectorsonde die in staat is tot selectieve hybridisatie met het doelnucleïnezuur onder omstandigheden geschikt voor een hybridisatiereactie; (d) afscheiden van de kopieën van het doelnucleïnezuur waarin de 20 vangprimers zijn opgenomen met behulp van de andere helft van het affiniteitspaar; en (e) detecteren van de aanwezigheid van de selectieve detectorsondes die gehybridiseerd zijn met de kopieën van het doelnucleïnezuur.
3. Werkwijze voor het bepalen van nucleïnezuren door hybridisatie, 25 waarbij de detectorsondes fungeren als gemodificeerde primers die worden opgenomen in de kopieën van de doelnucleïnezuren, met het kenmerk dat de kopieën van de doelnucleïnezuren waarin de gemodificeerde primers zijn opgenomen eerst worden gehybridiseerd met ten minste één selectieve vangsonde en de gevormde hybride vervolgens wordt afgescheiden met behulp 30 van de genoemde vangsonde, waarna de aanwezigheid van de hybride wordt gedetecteerd.
4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk dat deze omvat: (a) voorzien van ten minste één primer van het doelnucleïnezuur van ten minste één detecteerbaar label of ten minste één specifieke plaats 35 waaraan ten minste één detecteerbaar label kan worden gehecht; (b) laten reageren van de genoemde detectorprimer of -primers met het enkelstrengs doelnucleïnezuur onder omstandigheden gechikt voor een sjabioonafhankeiijke polymerisatiereactie; (c) laten hybridiseren van de enkelstrengs kopieën van doelnucleïne-P Μ Γ Λ « W V» v l , ' *.·. ί % -IS - zuur waarin de detectorprimers zijn opgenomen met een vangsonde die in staat is tot selectieve hybridisatie met het doelnucleïnezuur onder omstandigheden geschikt voor een hybridisatiereactie; (d) afscheiden van de kopieën van het doelnucleïnezuur waarin de de-5 tectorprimers zijn opgenomen met behulp van de selectieve vangsonde; en (e) detecteren van de aanwezigheid van de kopieën van doelnucleïne-zuren.
5. Werkwijze volgens conclusie 3 of 4, met het kenmerk dat de selectieve vangsonde wordt voorzien van ten minste één helft van een affini- 10 teitspaar of ten minste één specifieke plaats waaraan ten minste één helft van een affiniteitspaar kan worden bevestigd.
6. Reagenscombinatie voor het bepalen van nucleïnezuren, met het kenmerk dat deze omvat: (a) ten minste één gemodificeerde primer van het doelnucleïnezuur, 15 voorzien van ten minste één detecteerbaar label of ten minste één specifieke plaats waaraan ten minste één detecteerbaar label kan worden gehecht; en (b) ten minste één vangsonde die in staat is tot selectieve hybridisatie met het doelnucleïnezuur, voorzien van minste één helft van een 20 affiniteitspaar of ten minste één specifieke plaats waaraan ten minste één helft van een affiniteitspaar kan worden bevestigd.
7. Reagenscombinatie voor het bepalen van nucleïnezuren, met het kenmerk dat deze omvat: (a) ten minste één gemodificeerde primer van het doelnucleïnezuur, 25 voorzien van ten minste één helft van een affiniteitspaar of ten minste één specifieke plaats waaraan ten minste één helft van een affiniteitspaar kan worden gehecht; en (b) ten minste één detectorsonde die in staat is tot selectieve hybridisatie met het doelnucleïnezuur, voorzien van ten minste één detec- 30 teerbaar label of ten minste één specifieke plaats waaraan ten minste één detecteerbaar label kan worden gehecht.
8. Set voor het bepalen van nucleïnezuren, met het kenmerk dat deze in verpakte vorm een eenheid met meerdere houders omvat met: (a) ten minste één gemodificeerde primer van het doelnucleïnezuur, 35 voorzien van ten minste één detecteerbaar label of ten minste één specifieke plaats waaraan ten minste één detecteerbaar label kan worden gehecht; (b) ten minste één vangsonde die in staat is tot selectieve hybridisatie met het doelnucleïnezuur, voorzien van minste één helft van een af- . 88 0 C5H .. '3' finiteitspaar of ten minste een specifieke plaats waaraan ten minste één helft van een affiniteitspaar kan worden bevestigd; (c) eventueel een houder die ten minste één agens voor sjabloon-afhankelijke polymerisatie bevat; 5 (d) eventueel een houder met de vier deoxynucleosidetrifosfaten; (e) eventueel een faciliteit voor het polymerisatie- en het hybridi-satieproces; (f) eventueel een faciliteit voor het afscheiden van de kopieën van het doeinucieinezuur; en 10 (g) eventueel een faciliteit voor het bepalen van het label.
9. Set voor het bepalen van nucleïnezuren, met het kenmerk dat deze in verpakte vorm een eenheid met meerdere houders omvat met: (a) ten minste één gemodificeerde primer van het doeinucieinezuur, voorzien van ten minste één helft van een affiniteitspaar of ten minste 15 één specifieke plaats waaraan ten minste één helft van een affiniteitspaar kan worden gehecht; (b) ten minste één detectorsonde die in staat is tot selectieve hybridisatie met het doeinucieinezuur, voorzien van minste één detecteerbaar label of ten minste één specifieke plaats waaraan ten minste één 20 detecteerbaar label kan woraen bevestigd; (c) eventueel een houder die ten minste één agens voor sjabloon-afhankelijke polymerisatie bevat; (d) eventueel een houder met vier nucleosidetrifosfaten; (e) eventueel een faciliteit voor het polymerisatie- en het hybridi- 25 satieproces; (f) eventueel een faciliteit voor het afscheiden van de kopieën van doeinucieinezuur; en (g) eventueel een faciliteit voor het bepalen van het label. . 8 C ? i .
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US2460487A | 1987-03-11 | 1987-03-11 | |
| US2460487 | 1987-03-11 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL8800594A true NL8800594A (nl) | 1988-10-03 |
| NL194922B NL194922B (nl) | 2003-03-03 |
| NL194922C NL194922C (nl) | 2003-07-04 |
Family
ID=21821443
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL8800594A NL194922C (nl) | 1987-03-11 | 1988-03-10 | Werkwijze voor de bepaling van nucleïnezuren, alsmede set daarvoor. |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5476769A (nl) |
| JP (1) | JP3244500B2 (nl) |
| AT (1) | AT395434B (nl) |
| AU (1) | AU622104B2 (nl) |
| BE (1) | BE1003990A5 (nl) |
| CA (1) | CA1338207C (nl) |
| CH (1) | CH677285A5 (nl) |
| DD (1) | DD272664A5 (nl) |
| DE (1) | DE3807994C2 (nl) |
| DK (1) | DK175384B1 (nl) |
| ES (1) | ES2006377A6 (nl) |
| FI (1) | FI94429C (nl) |
| FR (1) | FR2613077A1 (nl) |
| GB (1) | GB2202328B (nl) |
| GR (1) | GR1000315B (nl) |
| HU (1) | HU202583B (nl) |
| IE (1) | IE61664B1 (nl) |
| IL (3) | IL85480A0 (nl) |
| IT (1) | IT1216048B (nl) |
| LU (1) | LU87153A1 (nl) |
| NL (1) | NL194922C (nl) |
| NO (1) | NO172909C (nl) |
| NZ (1) | NZ223700A (nl) |
| PT (1) | PT86937B (nl) |
| SE (1) | SE500262C2 (nl) |
Families Citing this family (171)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4038804A1 (de) | 1990-10-09 | 1992-04-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur genus- oder/und spezies-spezifischen detektion von bakterien in einer probenfluessigkeit |
| US5753433A (en) * | 1909-12-05 | 1998-05-19 | Boehringer Mannheim Gmbh | Method for the sensitive detection of nucleic acids |
| US5714380A (en) | 1986-10-23 | 1998-02-03 | Amoco Corporation | Closed vessel for isolating target molecules and for performing amplification |
| FI80476C (fi) * | 1987-10-09 | 1990-06-11 | Orion Yhtymae Oy | Foerbaettrat hybridisationsfoerfarande, vid foerfarandet anvaent redskap och reagensfoerpackning. |
| CA1325761C (en) * | 1987-12-25 | 1994-01-04 | Takanori Oka | Method of detecting an intended nucleic acid in a sample |
| JPH0775560B2 (ja) * | 1987-12-25 | 1995-08-16 | 湧永製薬株式会社 | 検体中の目的核酸の検出法 |
| WO1989009281A1 (en) * | 1988-03-25 | 1989-10-05 | Akzo N.V. | Method for amplifying and detecting nucleic acid in a test liquid |
| US5817797A (en) * | 1988-06-01 | 1998-10-06 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Sequencing DNA; a modification of the polymerase chain reaction |
| AU629845B2 (en) * | 1988-08-30 | 1992-10-15 | Abbott Laboratories | Detection and amplification of target nucleic acid sequences |
| US5858652A (en) * | 1988-08-30 | 1999-01-12 | Abbott Laboratories | Detection and amplification of target nucleic acid sequences |
| GB8827160D0 (en) * | 1988-11-21 | 1988-12-29 | Apothekernes Lab | Detection & quantitative determination of rna & dna |
| CA2002076A1 (en) * | 1988-11-21 | 1990-05-21 | Brent A. Burdick | Diagnostic kit and method using a solid phase capture means for detecting nucleic acids |
| DK175170B1 (da) * | 1988-11-29 | 2004-06-21 | Sangtec Molecular Diagnostics | Fremgangsmåde og reagenskombination til bestemmmelse af nukleotidsekvenser |
| US5536648A (en) * | 1988-12-09 | 1996-07-16 | Amrad Corporation Limited | Amplified DNA assay using a double stranded DNA binding protein |
| WO1990006374A1 (en) * | 1988-12-09 | 1990-06-14 | Amrad Corporation Limited | Amplified dna assay |
| CA2004326A1 (en) * | 1988-12-23 | 1990-06-23 | Nanibushan Dattagupta | Assay of sequences using amplified genes |
| CA2008096A1 (en) * | 1989-01-19 | 1990-07-19 | Samuel Rose | Nucleic acid amplification using single primer |
| US5856092A (en) * | 1989-02-13 | 1999-01-05 | Geneco Pty Ltd | Detection of a nucleic acid sequence or a change therein |
| SG50434A1 (en) * | 1989-02-13 | 1998-07-20 | Geneco Pty Ltd | Detection of a nucleic acid sequence or a change therein |
| CA2011818A1 (en) * | 1989-03-17 | 1990-09-17 | Fred T. Oakes | Methods for purification, amplification and detection of a nucleic acid |
| CA2013317A1 (en) * | 1989-04-17 | 1990-10-17 | Fred T. Oakes | Diagnostic kit, primer composition and their use for replication or detection of nucleic acids |
| DE69003104T2 (de) * | 1989-06-12 | 1994-03-17 | Cis Bio International Saclay | Verfahren zum nachweis von spezifischen sequenzen von nukleinsäuren und ihre verwendungen. |
| GB8920097D0 (en) * | 1989-09-06 | 1989-10-18 | Ici Plc | Amplification processes |
| US5196305A (en) * | 1989-09-12 | 1993-03-23 | Eastman Kodak Company | Diagnostic and amplification methods using primers having thymine at 3' end to overcome primer-target mismatch at the 3' end |
| US5232829A (en) * | 1989-09-29 | 1993-08-03 | Hoffmann-La Roche Inc. | Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes |
| IL97222A (en) * | 1990-02-16 | 1995-08-31 | Orion Yhtymae Oy | Method and Responder for Determining Special Changes to Nucleotide |
| US6013431A (en) | 1990-02-16 | 2000-01-11 | Molecular Tool, Inc. | Method for determining specific nucleotide variations by primer extension in the presence of mixture of labeled nucleotides and terminators |
| US5387505A (en) * | 1990-05-04 | 1995-02-07 | Eastman Kodak Company | Preparation and isolation of single-stranded biotinylated nucleic acids by heat avidin-biotin cleavage |
| NZ240079A (en) * | 1990-10-09 | 1993-07-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | Method for the detection of a nucleic acid or part thereof |
| WO1992011390A1 (en) * | 1990-12-17 | 1992-07-09 | Idexx Laboratories, Inc. | Nucleic acid sequence detection by triple helix formation |
| DE4106251A1 (de) * | 1991-02-28 | 1992-09-03 | Boehringer Mannheim Gmbh | Nachweis von bakterien mit hilfe einer nukleinsaeureamplifikation |
| US6004744A (en) | 1991-03-05 | 1999-12-21 | Molecular Tool, Inc. | Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer |
| US5888819A (en) * | 1991-03-05 | 1999-03-30 | Molecular Tool, Inc. | Method for determining nucleotide identity through primer extension |
| CA2065719A1 (en) | 1991-04-30 | 1992-10-31 | John B. Findlay | Nucleic acid amplification and detection methods using rapid polymerase chain reaction cycle |
| US5387510A (en) * | 1991-10-02 | 1995-02-07 | Eastman Kodak Company | Detection of amplified nucleic acid using secondary capture oligonucleotides and test kit |
| IT1252295B (it) * | 1991-11-15 | 1995-06-08 | Schiapparelli Diagnostici Ismu | Metodo per rivelare acidi nucleici e relativo kit diagnostico |
| JPH07502655A (ja) * | 1991-12-23 | 1995-03-23 | バイエル コーポレイション | 溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイに用いるためのｃｍｖプローブ |
| US5863724A (en) * | 1994-04-13 | 1999-01-26 | Baylor College Of Medicine | Methods of screening for persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancy |
| US5658729A (en) | 1994-10-11 | 1997-08-19 | The University Of British Columbia | Method, reagent and kit for evaluating susceptibility to premature atherosclerosis |
| DE4421901A1 (de) * | 1994-06-23 | 1996-01-04 | Bayer Ag | Ein DNA-Schnelltest zum Nachweis von chinolonresistenten Staphylococcus aureus Erregern in klinischem Probenmaterial |
| US5705366A (en) * | 1994-09-15 | 1998-01-06 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Coamplification of target nucleic acids using volume exclusion agent in reaction composition, test kit and test device useful therefor |
| US5654141A (en) * | 1994-11-18 | 1997-08-05 | Thomas Jefferson University | Amplification based detection of bacterial infection |
| US5856096A (en) * | 1995-09-20 | 1999-01-05 | Ctrc Research Foundation | Rapid and sensitive assays for detecting and distinguishing between processive and non-processive telomerase activities |
| WO1997035033A1 (en) | 1996-03-19 | 1997-09-25 | Molecular Tool, Inc. | Method for determining the nucleotide sequence of a polynucleotide |
| US6132954A (en) * | 1996-08-20 | 2000-10-17 | Baylor College Of Medicine | Methods of screening for agents that delay a cell cycle and compositions comprising era and an analogue of wild-type era |
| US6043283A (en) * | 1996-09-20 | 2000-03-28 | Baylor College Of Medicine | Tyramine compounds and their neuronal effects |
| US6071493A (en) | 1996-09-20 | 2000-06-06 | Baylor College Of Medicine | Method of screening for an agent that inhibits mononuclear phagocyte-plaque component complex formation |
| US6482795B1 (en) | 1997-01-30 | 2002-11-19 | Myriad Genetics, Inc. | Tumor suppressor designated TS10q23.3 |
| US6262242B1 (en) | 1997-01-30 | 2001-07-17 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Tumor suppressor designated TS10Q23.3 |
| US6713300B1 (en) | 1997-02-27 | 2004-03-30 | University Of Utah Research Foundation | Nucleic acid and amino acid sequences for ATP-binding cassette transporter and methods of screening for agents that modify ATP-binding cassette transporter |
| IL122147A0 (en) * | 1997-11-10 | 1998-04-05 | Technion Res & Dev Foundation | Method for labeling polynucleotides |
| CN100340666C (zh) | 1997-12-18 | 2007-10-03 | 孟山都技术有限公司 | 抗昆虫的转基因植物以及用于改善δ－内毒素抵抗目标昆虫活性的方法 |
| US6673914B1 (en) | 1998-01-22 | 2004-01-06 | John Wayne Cancer Institute | Human tumor-associated gene |
| US20020147143A1 (en) | 1998-03-18 | 2002-10-10 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer |
| DE19824900B4 (de) | 1998-06-04 | 2006-05-04 | Roche Diagnostics Gmbh | DNA-Nachweis über einen Strangreassoziationskomplex |
| US6743906B1 (en) | 1998-10-02 | 2004-06-01 | Board Of Regents, The University Of Texas | PPP2R1B is a tumor suppressor |
| US6468523B1 (en) | 1998-11-02 | 2002-10-22 | Monsanto Technology Llc | Polypeptide compositions toxic to diabrotic insects, and methods of use |
| WO2000029008A2 (en) | 1998-11-16 | 2000-05-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Hiv-specific t-cell induction |
| US6432642B1 (en) | 1999-01-15 | 2002-08-13 | Pe Corporation (Ny) | Binary probe and clamp composition and methods for a target hybridization detection |
| US6156515A (en) * | 1999-02-09 | 2000-12-05 | Urocor, Inc. | Prostate-specific gene for diagnosis, prognosis and management of prostate cancer |
| WO2000066780A2 (en) | 1999-04-30 | 2000-11-09 | University Of Florida | Adeno-associated virus-delivered ribozyme compositions and methods of use |
| PT1471926E (pt) | 1999-06-01 | 2011-03-11 | Baylor College Medicine | Composições e métodos para a utilização terapêutica de uma sequência associada a atonal |
| US20040002068A1 (en) | 2000-03-01 | 2004-01-01 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies |
| WO2001081379A2 (en) | 2000-04-21 | 2001-11-01 | Corixa Corporation | Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection |
| WO2002000174A2 (en) | 2000-06-28 | 2002-01-03 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer |
| CA2415422C (en) | 2000-07-10 | 2014-07-08 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Chromosome 3p21.3 genes are tumor suppressors |
| CA2446788A1 (en) | 2001-05-09 | 2002-11-14 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer |
| WO2002095002A2 (en) | 2001-05-22 | 2002-11-28 | University Of Chicago | N4 virion single-stranded dna dependent rna polymerase |
| JP2005532780A (ja) | 2001-09-19 | 2005-11-04 | インタージェネティックス インコーポレイテッド | 発癌リスク層別化のための遺伝的解析 |
| EP1908851A3 (en) | 2001-09-19 | 2008-06-25 | Intergenetics Incorporated | Genetic analysis for stratification of cancer risk |
| ES2205998B1 (es) * | 2001-12-14 | 2005-08-16 | Consejo Sup. Investig. Cientificas. | Procedimiento para la deteccion del virus del amarilleo de las venas del pepino (cvyv). |
| CA2476755C (en) | 2001-12-17 | 2014-08-26 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of inflammatory bowel disease |
| US20060009409A1 (en) | 2002-02-01 | 2006-01-12 | Woolf Tod M | Double-stranded oligonucleotides |
| EP2213737B1 (en) | 2002-02-01 | 2012-11-07 | Life Technologies Corporation | Double-stranded oligonucleotides |
| ATE497774T1 (de) | 2002-07-15 | 2011-02-15 | Univ Texas | Screening kombinatorischer proteinbibliotheken mittels periplasmatischer expression |
| JP4796299B2 (ja) | 2002-08-12 | 2011-10-19 | ジェンネレックス インコーポレイティッド | ポックスウイルスおよび癌に関する方法および組成物 |
| AU2002951411A0 (en) | 2002-09-16 | 2002-09-26 | The University Of Sydney | Genotype screen |
| US7960522B2 (en) | 2003-01-06 | 2011-06-14 | Corixa Corporation | Certain aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use |
| CA2512108C (en) | 2003-01-06 | 2013-04-02 | Corixa Corporation | Certain aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use |
| DE602004029560D1 (de) | 2003-03-07 | 2010-11-25 | Rubicon Genomics Inc | Amplifikation und analyse von gesamtgenom- und gesamttranskriptom- bibliotheken, die durch ein dns-polymerisierungsverfahren produziert wurden |
| CN1878866B (zh) | 2003-07-25 | 2012-08-01 | 安比恩股份有限公司 | 用于从固定的样品中制备rna的方法和组合物 |
| US20050059024A1 (en) | 2003-07-25 | 2005-03-17 | Ambion, Inc. | Methods and compositions for isolating small RNA molecules |
| CN101133157A (zh) | 2004-06-03 | 2008-02-27 | 阿什洛米克斯控股有限公司 | 诊断应激的药物和方法 |
| US20080311564A1 (en) * | 2004-08-06 | 2008-12-18 | Fort Thomas L | Sequences and Methods for Detection of Cytomegalovirus |
| ES2345993T3 (es) | 2004-09-14 | 2010-10-07 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Metodo para el tratamiento con bucindolol basado en direccionamiento genetico. |
| JP5897780B2 (ja) | 2005-01-28 | 2016-03-30 | デューク ユニバーシティ | プリント回路基板上の液滴操作装置及び方法 |
| US7993853B2 (en) | 2005-05-06 | 2011-08-09 | Gen-Probe Incorporated | Methods of nucleic acid target capture |
| WO2007006091A1 (en) | 2005-07-07 | 2007-01-18 | Athlomics Pty Ltd | Polynucleotide marker genes and their expression, for diagnosis of endotoxemia |
| US7494788B2 (en) | 2005-07-11 | 2009-02-24 | Molecular Kinetics, Inc. | Entropic bristle domain sequences and their use in recombinant protein production |
| US8980246B2 (en) | 2005-09-07 | 2015-03-17 | Sillajen Biotherapeutics, Inc. | Oncolytic vaccinia virus cancer therapy |
| US8249814B2 (en) | 2005-10-21 | 2012-08-21 | Genenews Inc. | Method, computer readable medium, and system for determining a probability of colorectal cancer in a test subject |
| WO2008019162A2 (en) | 2006-01-18 | 2008-02-14 | University Of Chicago | Compositions and methods related to staphylococcal bacterium proteins |
| EP2007905B1 (en) | 2006-03-15 | 2012-08-22 | Micronics, Inc. | Integrated nucleic acid assays |
| CA2921048C (en) | 2006-09-15 | 2018-06-05 | Ottawa Hospital Research Institute | Oncolytic rhabdovirus |
| EP2102239B1 (en) | 2006-11-30 | 2012-04-25 | Research Development Foundation | Improved immunoglobulin libraries |
| US9938641B2 (en) * | 2006-12-18 | 2018-04-10 | Fluidigm Corporation | Selection of aptamers based on geometry |
| ES2599632T3 (es) | 2007-04-09 | 2017-02-02 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Composiciones de vectores rAAV que tienen proteínas de la cápside modificadas en tirosina y métodos para su uso |
| CA2685675C (en) | 2007-05-01 | 2016-02-16 | Research Development Foundation | Immunoglobulin fc libraries |
| BRPI0920041A2 (pt) | 2008-10-06 | 2017-06-27 | Univ Chicago | composições e processos relacionados às proteínas eap, emp e/ou adsa bacterianas |
| PL3281947T3 (pl) | 2009-04-03 | 2020-07-27 | The University Of Chicago | Kompozycje i sposoby związane z wariantami białka A (SpA) |
| KR101815716B1 (ko) | 2009-04-22 | 2018-01-05 | 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코퍼레이션 | 만성 폐쇄성 폐 질환 및 천식의 치료에 사용하기 위한 조성물 |
| EP2789689B1 (en) | 2009-06-29 | 2016-04-27 | Luminex Corporation | Chimeric primers with hairpin conformations and methods of using same |
| EP2272979A1 (en) | 2009-06-30 | 2011-01-12 | Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) | Method for testing a subject thought to be predisposed to having cancer |
| CN107090031A (zh) | 2009-07-17 | 2017-08-25 | 生物蛋白有限公司 | 在生产宿主中同时整合抗体/蛋白的性能和表达的筛选和演化的方法 |
| US9409983B2 (en) | 2009-07-23 | 2016-08-09 | The Board Of Trustess Of The University Of Illinois | Methods and compositions involving PBEF inhibitors for lung inflammation conditions and diseases |
| US9512481B2 (en) | 2009-09-11 | 2016-12-06 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Polymorphisms in the PDE3A gene |
| KR101759888B1 (ko) | 2009-09-14 | 2017-07-20 | 신라젠(주) | 종양 용해 백시니아 바이러스 병용 암 치료요법 |
| EP2510088B1 (en) | 2009-12-10 | 2016-10-05 | Ottawa Hospital Research Institute | Oncolytic rhabdovirus |
| WO2011079273A2 (en) | 2009-12-23 | 2011-06-30 | Arca Biopharma, Inc. | Methods and compositions for cardiovascular diseases and conditions |
| JP5791634B2 (ja) | 2010-01-29 | 2015-10-07 | マイクロニクス， インコーポレイテッド | サンプル−回答型のマイクロ流体カートリッジ |
| JP2013523818A (ja) | 2010-04-05 | 2013-06-17 | ザ・ユニバーシティー・オブ・シカゴ | 免疫反応のエンハンサーとしてのプロテインＡ（ＳｐＡ）抗体に関連する組成物および方法 |
| ES2911185T3 (es) | 2010-04-23 | 2022-05-18 | Univ Florida | Composiciones de rAAV-guanilato ciclasa y métodos para tratar la amaurosis congénita de Leber 1 (LCA1) |
| JP6002128B2 (ja) | 2010-07-02 | 2016-10-05 | ザ・ユニバーシティ・オブ・シカゴＴｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｃｈｉｃａｇｏ | プロテインＡ（ＳｐＡ）変種に関連する組成物および方法 |
| SG10201902596TA (en) | 2010-07-16 | 2019-04-29 | Bioatla Llc | Novel methods of protein evolution |
| WO2012034067A1 (en) | 2010-09-09 | 2012-03-15 | The University Of Chicago | Methods and compositions involving protective staphylococcal antigens |
| EP2455485A1 (de) | 2010-11-19 | 2012-05-23 | Anagnostics Bioanalysis GmbH | Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren |
| US9919047B2 (en) | 2011-01-04 | 2018-03-20 | Sillajen, Inc. | Generation of antibodies to tumor antigens and generation of tumor specific complement dependent cytotoxicity by administration of oncolytic vaccinia virus |
| EP2673299B1 (en) | 2011-02-07 | 2017-05-10 | Research Development Foundation | Engineered immunoglobulin fc polypeptides |
| WO2012158238A2 (en) | 2011-02-28 | 2012-11-22 | University Of Iowa Research Foundation | Anti-müllerian hormone changes in pregnancy and prediction ofadverse pregnancy outcomes and gender |
| CA2829300A1 (en) | 2011-03-08 | 2012-09-13 | King Abdullah University Of Science And Technology | Molecular biomarker set for early detection of ovarian cancer |
| EP2694534B1 (en) | 2011-04-08 | 2018-06-20 | Evaxion Biotech ApS | Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting staphylococcus aureus |
| US8945588B2 (en) | 2011-05-06 | 2015-02-03 | The University Of Chicago | Methods and compositions involving protective staphylococcal antigens, such as EBH polypeptides |
| EP2718427B1 (en) | 2011-06-08 | 2017-01-11 | Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute Inc. | Compositions for glioblastoma treatment |
| JP2014527398A (ja) | 2011-06-21 | 2014-10-16 | オンコファクター コーポレイション | がんの療法および診断のための組成物および方法 |
| US10040853B2 (en) | 2011-09-09 | 2018-08-07 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Methods and compositions involving NKG2D inhibitors and cancer |
| WO2013053899A1 (en) | 2011-10-12 | 2013-04-18 | Moeller Niels Iversen | Peptides derived from campylobacter jejuni and their use in vaccination |
| WO2013096798A2 (en) | 2011-12-22 | 2013-06-27 | Ibis Biosciences, Inc. | Amplification of a sequence from a ribonucleic acid |
| CA2861387A1 (en) | 2012-02-02 | 2013-08-08 | Invenra, Inc. | High throughput screen for biologically active polypeptides |
| DK2844275T3 (da) | 2012-04-26 | 2020-07-13 | Univ Chicago | Staphylokok-koagulase-antigener og fremgangsmåder til anvendelse af disse |
| US9416403B2 (en) * | 2012-08-31 | 2016-08-16 | Toray Industries, Inc. | Method of detecting target nucleic acid |
| EP2740805B1 (en) | 2012-12-07 | 2019-02-20 | SuppreMol GmbH | Stratification and treatment of patients suffering from idiopathic thrombocytopenic purpura |
| EP2934751B1 (en) | 2012-12-21 | 2019-05-29 | Micronics, Inc. | Low elasticity films for microfluidic use |
| US10065186B2 (en) | 2012-12-21 | 2018-09-04 | Micronics, Inc. | Fluidic circuits and related manufacturing methods |
| CN104919035B (zh) | 2012-12-21 | 2017-08-11 | 精密公司 | 便携式荧光检测系统和微测定盒 |
| US10125373B2 (en) | 2013-01-22 | 2018-11-13 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Geminiviral vector for expression of rituximab |
| CA2901501C (en) | 2013-02-21 | 2023-03-07 | Children's Hospital Of Eastern Ontario Research Institute Inc. | Vaccine composition |
| CA2911303C (en) | 2013-05-07 | 2021-02-16 | Micronics, Inc. | Methods for preparation of nucleic acid-containing samples using clay minerals and alkaline solutions |
| WO2014182844A1 (en) | 2013-05-07 | 2014-11-13 | Micronics, Inc. | Microfluidic devices and methods for performing serum separation and blood cross-matching |
| WO2014182847A1 (en) | 2013-05-07 | 2014-11-13 | Micronics, Inc. | Device for preparation and analysis of nucleic acids |
| EP3052193B1 (en) | 2013-10-03 | 2018-01-31 | Oklahoma Medical Research Foundation | Biomarkers for systemic lupus erythematosus disease activity, and intensity and flare |
| WO2015082536A1 (en) | 2013-12-03 | 2015-06-11 | Evaxion Biotech Aps | Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting staphylococcus aureus |
| DK3447493T3 (da) | 2014-01-07 | 2020-08-17 | Bioatla Llc | Proteinrettede ortologer |
| WO2015191916A1 (en) | 2014-06-11 | 2015-12-17 | Micronics, Inc. | Microfluidic cartridges and apparatus with integrated assay controls for analysis of nucleic acids |
| WO2016075305A2 (en) | 2014-11-13 | 2016-05-19 | Evaxion Biotech Aps | Peptides derived from acinetobacter baumannii and their use in vaccination |
| US10539566B2 (en) | 2014-12-08 | 2020-01-21 | Berg Llc | Use of markers including filamin A in the diagnosis and treatment of prostate cancer |
| EP4279080A3 (en) | 2015-01-12 | 2024-02-21 | Evaxion Biotech A/S | Treatment and prophylaxis of k. pneumoniae infection |
| AU2016219511B2 (en) | 2015-02-09 | 2020-11-12 | Research Development Foundation | Engineered immunoglobulin Fc polypeptides displaying improved complement activation |
| EP3070178B1 (en) | 2015-03-20 | 2020-02-12 | Albert-Ludwigs-Universität Freiburg | Method for diagnosing breast cancer |
| EP4116316A1 (en) | 2015-07-04 | 2023-01-11 | Evaxion Biotech A/S | Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting pseudomonas aeruginosa |
| AU2016297510B2 (en) | 2015-07-17 | 2021-09-09 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of amplifying nucleic acid sequences |
| WO2017040380A2 (en) | 2015-08-28 | 2017-03-09 | Research Development Foundation | Engineered antibody fc variants |
| WO2017144523A1 (en) | 2016-02-22 | 2017-08-31 | Evaxion Biotech Aps | Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting staphylococcus aureus |
| WO2017214068A1 (en) | 2016-06-05 | 2017-12-14 | Berg Llc | Systems and methods for patient stratification and identification of potential biomarkers |
| WO2018127545A1 (en) | 2017-01-05 | 2018-07-12 | Evaxion Biotech Aps | Vaccines targeting pseudomonas aeruginosa |
| CN110462062A (zh) | 2017-01-26 | 2019-11-15 | 俄克拉荷马医学研究基金会 | 系统性红斑狼疮疾病活动性、强度和急性发作的生物标志物 |
| KR102554477B1 (ko) | 2018-10-18 | 2023-07-11 | 오클라호마 메디컬 리써치 화운데이션 | 질병 활성도의 특징을 규명하는 전신 홍반성 낭창(sle) 질병 활성도 면역 지수를 위한 생체지표 |
| WO2020083904A1 (en) | 2018-10-22 | 2020-04-30 | Evaxion Biotech Aps | Vaccines targeting m. catharrhalis |
| US20220143168A1 (en) | 2019-02-27 | 2022-05-12 | Evaxion Biotech A/S | Vaccines targeting H. influenzae |
| US20200377951A1 (en) | 2019-04-30 | 2020-12-03 | Chondrial Therapeutics, Inc. | Frataxin-sensitive markers for determining effectiveness of frataxin replacement therapy |
| EP3772543B1 (en) | 2019-08-09 | 2023-09-27 | Albert-Ludwigs-Universität Freiburg | Method for diagnosing breast cancer |
| WO2021140123A1 (en) | 2020-01-06 | 2021-07-15 | Evaxion Biotech Aps | Vaccines targeting neisseria gonorrhoeae |
| CN115989415A (zh) | 2020-06-30 | 2023-04-18 | 健肺生命人工智能公司 | 用于检测肺癌的方法 |
| WO2022047359A1 (en) | 2020-08-31 | 2022-03-03 | Berg Llc | Protein biomarkers for pancreatic cancer |
| IL307528A (en) | 2021-04-06 | 2023-12-01 | Bpgbio Inc | Protein markers for the prognosis of breast cancer progression |
| WO2022216846A1 (en) | 2021-04-06 | 2022-10-13 | Berg Llc | Protein markers for estrogen receptor (er)-positive-like and estrogen receptor (er)-negative-like breast cancer |
| IL307530A (en) | 2021-04-06 | 2023-12-01 | Bpgbio Inc | Estrogen receptor-like (ER) breast cancer protein markers LUMINAL A (LA) and LUMINAL B1 (LB1) |
| CA3224564A1 (en) | 2021-07-05 | 2023-01-12 | Andreas Holm MATTSSON | Vaccines targeting neisseria gonorrhoeae |
| US20230357851A1 (en) | 2022-04-06 | 2023-11-09 | Larimar Therapeutics, Inc. | Frataxin-sensitive markers for monitoring frataxin-replacement therapy |
| WO2023230531A1 (en) | 2022-05-24 | 2023-11-30 | Lunglife Ai, Inc. | Methods for detecting circulating genetically abnormal cells |
| WO2023240201A1 (en) | 2022-06-08 | 2023-12-14 | Larimar Therapeutics, Inc. | Frataxin-sensitive markers for monitoring progression and treatment of leigh syndrome |
| US20240010742A1 (en) | 2022-06-10 | 2024-01-11 | Research Development Foundation | Engineered fcriib selective igg1 fc variants and uses thereof |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0185494A2 (en) * | 1984-12-13 | 1986-06-25 | Applied Biosystems, Inc. | Detection of specific sequences in nucleic acids |
| GB2169403A (en) * | 1985-01-02 | 1986-07-09 | Orion Yhtymae Oy | Identification of nucleic acids |
| EP0194545A2 (en) * | 1985-03-15 | 1986-09-17 | Molecular Diagnostics, Inc. | Labelling of oligonucleotides |
| EP0200362A2 (en) * | 1985-03-28 | 1986-11-05 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences |
| WO1986007612A1 (en) * | 1985-06-17 | 1986-12-31 | Amersham International Plc | Nucleic acid sequencing by exonuclease inhibition |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2422956A1 (fr) * | 1978-04-13 | 1979-11-09 | Pasteur Institut | Procede de detection et de caracterisation d'un acide nucleique ou d'une sequence de celui-ci, et reactif enzymatique pour la mise en oeuvre de ce procede |
| US4302204A (en) * | 1979-07-02 | 1981-11-24 | The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University | Transfer and detection of nucleic acids |
| FI63596C (fi) * | 1981-10-16 | 1983-07-11 | Orion Yhtymae Oy | Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser |
| BG36086A1 (en) * | 1982-01-19 | 1984-09-14 | Glbov | Method for inducing interferon |
| CA1223831A (en) * | 1982-06-23 | 1987-07-07 | Dean Engelhardt | Modified nucleotides, methods of preparing and utilizing and compositions containing the same |
| US4605735A (en) * | 1983-02-14 | 1986-08-12 | Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha | Oligonucleotide derivatives |
| CA1256005A (en) * | 1983-09-26 | 1989-06-20 | W. Peter Hansen | Sandwich hybridization method for nucleic acid detection |
| US4749647A (en) * | 1984-06-22 | 1988-06-07 | Genetic Systems Corporation | Polymerization-induced separation assay using recognition pairs |
| US4743562A (en) * | 1984-08-21 | 1988-05-10 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Purified human cytomegalovirus protein |
| US4563417A (en) * | 1984-08-31 | 1986-01-07 | Miles Laboratories, Inc. | Nucleic acid hybridization assay employing antibodies to intercalation complexes |
| CA1272443A (en) * | 1985-02-22 | 1990-08-07 | Nanibhushan Dattagupta | Solution-phase dual hybridization assay for detecting polynucleotide sequences |
| US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| GB8509367D0 (en) * | 1985-04-12 | 1985-05-15 | Amersham Int Plc | Nucleic acid hybridisation |
| US4751177A (en) * | 1985-06-13 | 1988-06-14 | Amgen | Methods and kits for performing nucleic acid hybridization assays |
| CA1284931C (en) * | 1986-03-13 | 1991-06-18 | Henry A. Erlich | Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids |
| EP0238332A2 (en) * | 1986-03-19 | 1987-09-23 | Cetus Corporation | Liquid hybridization method and kit for detecting the presence of nucleic acid sequences in samples |
| US4851331A (en) * | 1986-05-16 | 1989-07-25 | Allied Corporation | Method and kit for polynucleotide assay including primer-dependant DNA polymerase |
-
1988
- 1988-02-18 AU AU11937/88A patent/AU622104B2/en not_active Expired
- 1988-02-19 IL IL85480A patent/IL85480A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-02-19 IL IL10215488A patent/IL102154A/en not_active IP Right Cessation
- 1988-03-01 NZ NZ223700A patent/NZ223700A/en unknown
- 1988-03-03 FI FI880994A patent/FI94429C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-03-09 GR GR880100139A patent/GR1000315B/el not_active IP Right Cessation
- 1988-03-09 DD DD88313526A patent/DD272664A5/de unknown
- 1988-03-10 JP JP05731088A patent/JP3244500B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-10 NO NO881064A patent/NO172909C/no not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 SE SE8800864A patent/SE500262C2/sv not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 CA CA000561135A patent/CA1338207C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-03-10 GB GB8805681A patent/GB2202328B/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-10 CH CH902/88A patent/CH677285A5/de not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 IE IE69788A patent/IE61664B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 DE DE3807994A patent/DE3807994C2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-10 NL NL8800594A patent/NL194922C/nl not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 AT AT0064388A patent/AT395434B/de not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 LU LU87153A patent/LU87153A1/fr unknown
- 1988-03-10 FR FR8803107A patent/FR2613077A1/fr active Granted
- 1988-03-10 HU HU881159A patent/HU202583B/hu unknown
- 1988-03-10 PT PT86937A patent/PT86937B/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 IT IT8819722A patent/IT1216048B/it active
- 1988-03-10 BE BE8800267A patent/BE1003990A5/fr not_active IP Right Cessation
- 1988-03-10 DK DK198801295A patent/DK175384B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-03-11 ES ES8800740A patent/ES2006377A6/es not_active Expired
-
1990
- 1990-11-07 US US07/610,470 patent/US5476769A/en not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-06-10 IL IL102154A patent/IL102154A0/xx unknown
-
1997
- 1997-08-25 US US08/917,404 patent/US5989817A/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0185494A2 (en) * | 1984-12-13 | 1986-06-25 | Applied Biosystems, Inc. | Detection of specific sequences in nucleic acids |
| GB2169403A (en) * | 1985-01-02 | 1986-07-09 | Orion Yhtymae Oy | Identification of nucleic acids |
| EP0194545A2 (en) * | 1985-03-15 | 1986-09-17 | Molecular Diagnostics, Inc. | Labelling of oligonucleotides |
| EP0200362A2 (en) * | 1985-03-28 | 1986-11-05 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences |
| WO1986007612A1 (en) * | 1985-06-17 | 1986-12-31 | Amersham International Plc | Nucleic acid sequencing by exonuclease inhibition |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CHU, B. ET AL.: "synthesis of an amplifiable reporter RNA for bioassays", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 14, no. 14, pages 5591 - 5603, XP001189656 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NL8800594A (nl) | Werkwijze voor de bepaling van nucleinezuren, alsmede reagenscombinatie en set daarvoor. | |
| US5514550A (en) | Nucleic acid test article and its use to detect a predetermined nucleic acid | |
| EP0408738B1 (en) | Nucleic acid test article and its use to detect a predetermined nucleic acid | |
| EP0439222B1 (en) | Water-insoluble reagent, nucleic acid probe, test kit and diagnostic and purification methods | |
| JPH02299600A (ja) | 固相捕捉手段を使用する核酸の検出方法および診断キット | |
| JP2002538839A (ja) | 多重核酸検出のためのプローブ／移動度モディファイア複合体 | |
| JPH11506613A (ja) | 競合増幅を用いる核酸配列検出方法 | |
| JPH0398586A (ja) | プライマー３′末端におけるプライマーと標的のミスマッチを克服する診断および増幅方法 | |
| JPH02299599A (ja) | 診断キット、プライマー組成物および核酸の複製または検出のためのそれらの使用 | |
| KR920007664B1 (ko) | 핵산의 정제, 증폭 및 검사방법 | |
| EP0677589B1 (en) | Method, test element and test kit for semi-quantitative detection of target nucleic acid | |
| WO1989009281A1 (en) | Method for amplifying and detecting nucleic acid in a test liquid | |
| IE903415A1 (en) | Nucleic acid detection method using unequal primer¹concentrations in polymerase chain reaction | |
| JPH06141896A (ja) | 高感度測定法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BA | A request for search or an international-type search has been filed | ||
| BB | A search report has been drawn up | ||
| BC | A request for examination has been filed | ||
| CNR | Transfer of rights (patent application after its laying open for public inspection) |
Free format text: SANGTEC MEDICAL AB |
|
| CNR | Transfer of rights (patent application after its laying open for public inspection) |
Owner name: SANGTEC MOLECULAR DIAGNOSTICS AB |
|
| V4 | Discontinued because of reaching the maximum lifetime of a patent |
Effective date: 20080310 |