JPH06141896A

JPH06141896A - 高感度測定法

Info

Publication number: JPH06141896A
Application number: JP34090192A
Authority: JP
Inventors: Shigeru Miwa; 茂三和
Original assignee: IMUNO BAION KK
Current assignee: IMUNO BAION KK
Priority date: 1992-11-08
Filing date: 1992-11-08
Publication date: 1994-05-24

Abstract

(57)【要約】【目的】微量の試料が測定できるように、ハイブリッ
ドされた核酸が高感度となり同時にその操作が簡便な方
法を確立することを目的する。【構成】塩の存在下において、核酸と増幅子を有する核
酸プローブとを液相系においてハイブリダイゼーション
を行うこと又は核酸とハイブリッドしている核酸プロー
ブとそのプローブに結合できる増幅子とを液相系で共存
させることにより高感度にすること。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、医療、農林水産業、獣
医学、食品加工の分野で応用可能な核酸・免疫化学・生
化学の高感度測定方法に関する。

【０００２】

【従来技術】核酸の特定配列を検出することは、遺伝
病、感染症などを診断したり、遺伝の研究をする上で重
要な課題となっている。しかし多くの場合に検体中の核
酸は微量しか存在しないため検出に限界があり、高感度
にするための技術開発が待ち望れていた。

【０００３】ＤＮＡの特定配列を増幅するための従来の
技術としては、ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ法
（特開昭６２−２８１）またはリガーゼを用いたＬｉｇ
ａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ法などがある。そ
の他に核酸とハイブリッド形成したプローブのシグナル
増幅法としては、ＲＮＡ依存ＲＮＡ合成酵素のＱβレプ
リカーゼを用いた増幅系またはＤＮＡ依存ＲＮＡ合成酵
素を用いた増幅系（特開平２−１３１５９９）などが報
告されている。

【０００４】免疫測定法においては高感度測定が可能な
酵素免疫測定法などが知られているが、特に標識酵素と
してアルカリホスファターゼを用い基質としてＮＡＤＰ
を用いた酵素サイクリング法は、発色測定が可能であり
非常に高感度である。

【０００５】

【発明が解決しようとする問題点】確かに前記のそれぞ
れの方法は、高感度にする点において優れているが特別
の装置または操作が必要なため繁雑で、高度の熟練者な
どを必要としその上時間がかかるなどの問題点がある。
そのため一般に日常的に使用するには適していない。こ
のため、本発明は分析の時間を短縮化し、微量の試料で
間に合うように高感度にすること及び操作が簡便な方法
を確立することを目的としている。

【０００６】

【課題を解決するための手段】この明細書における増幅
子とは、核酸とハイブリッド形成前又はハイブリッド形
成後に核酸プローブに結合できる部位（結合部位）を有
するもので、同時に塩の存在下及び液相系で感度増幅に
寄与する部位（増幅部位）を有するものである。又この
増幅子は検出するための標識部位を持っているか、標識
物質を結合できる部位（標識部位）を有する。明細書で
は主として増幅子は増幅部位、結合部位、標識部位の３
つの部位が独立して必要であるように書かれているが、
増幅部位、標識部位以外は必ずしも必要ではなく、標識
部位と結合部位が同じ場合又は結合部位が無い場合など
いろいろな場合がある。液相系とは、固相上のために或
いは固相の近くに存在しているために核酸の自由度が制
限されている状態ではなく、核酸が溶液中で十分に自由
度を保証されているか又は固相上に固定されていても核
酸の長さが十分あるため溶液中での特定部分の自由度が
十分あるような状態を意味する。

【０００７】本発明は、塩の存在下で、核酸と増幅子を
有する核酸プローブとを液相系においてハイブリダイゼ
ーションを行うこと又は核酸とハイブリッドしている核
酸プローブとそのプローブに結合できる増幅子とを液相
系で共存させることにより、核酸プローブとハイブリッ
ドを形成した核酸を高感度で検出できる方法を提供する
ものである。本発明の特徴は、特定配列を有する核酸を
増幅して高感度にするのでは無くて、核酸と増幅子を有
する核酸プローブ又は核酸と増幅子と結合しうる核酸プ
ローブがハイブリッド形成するとそれがあたかも引き金
となって、ある濃度以上の塩の存在下及び液相系で、増
幅子がその周りに集合体を形成するかのように数倍から
数十万倍高感度になる方法であり、既存の増幅系とは異
なる。

【０００８】以下に本発明を詳述する。ハイブリッド形
成した核酸を高感度で検出するためには、塩の存在が必
須である。例えばハイブリッド形成前に適当な塩濃度が
存在していても、ハイブリッド形成後に希釈すれば塩濃
度が薄まるため感度が低くなる。具体的には、塩濃度は
５０ｍＭ以上が望ましいが１５０ｍＭ以上のほうがより
好ましい。感度は塩の種類によっても異なるが、実際に
はハイブリッド形成または標識物質の検出を阻害しない
ように塩の種類と濃度を決めることになる。感度の増幅
においては例えば塩化ナトリウムより硫酸アンモニウム
の方が望ましい。

【０００９】核酸は天然、合成或いは修飾されたＤＮＡ
またはＲＮＡであり、１本鎖または２本鎖いずれでも良
い。一般にハイブリッド形成した核酸の検出感度の程度
の違いは核酸の種類により異なり、高等動植物において
感度が高く、例外もあるが下等生物においては感度が低
くなる傾向がある。また核酸の長さも重要でオリゴヌク
レオチドのような短いものは好ましくなく、数千以上の
塩基数の核酸が望ましい。

【００１０】ここで使われる核酸プローブは核酸に結合
できるものであれば何でも良く、特定の塩基配列に対し
て相補性のある特異的なものばかりでなく、非特異的に
結合しても問題ない。それ故、核酸に結合できるもので
あれば核酸プローブは修飾されていても又は非相補的な
配列を有していても構わない。核酸プローブと増幅子の
結合方法は共有結合または非共有結合のいずれでも良
い。

【００１１】本方法おいて感度を増幅するためには、核
酸とハイブリダイズする又はハイブリダイズした核酸プ
ローブは少なくとも増幅子と結合しなければならない。
増幅子としては例えばポリペプチド、蛋白質、酵素、オ
リゴペプチドまたはそれらの修飾されたものなどが有
る。より具体的には、アビジン、ペルオキシダーゼ結合
アビジン、アルカリフォスファターゼ結合アビジン、ペ
ルオキシダーゼ結合抗ビオチン抗体などがある。一般的
に核酸プローブに増幅子を結合させる位置は５′末端或
いは３′末端または両端が好ましい。特に核酸プローブ
にビオチンを結合させたものと増幅子としての標識アビ
ジンとの結合の組み合わせが望ましい。実用的には検出
するための標識部位を増幅子が持つことが望ましい。標
識としては放射性同位元素、ローダミンやフルオレッセ
インのような蛍光物質、アクリジンやルシフェリンのよ
うな発光物質、酵素、酵素基質または補酵素などがあ
る。ここで標識は増幅子側ではなく、核酸プローブの増
幅子結合端とは反対側の末端を標識しても前記の増幅子
の定義から増幅子の標識となる。

【００１２】ハイブリッド形成した核酸を高感度にする
ためには、ある範囲内で増幅子を有する核酸プローブの
濃度または増幅子の濃度に依存するため、増幅子を有す
る核酸プローブの濃度または増幅子の濃度が１０ｎＭ以
上であることが望ましい（特許出願番号３−３００００
２の実施例２に記載）。また増幅子を有する核酸プロー
ブの濃度または増幅子の濃度はハイブリッドを形成した
核酸の濃度よりも過剰量であることが好ましい。

【００１３】次にハイブリッド形成した高感度の核酸と
非結合の増幅子または標識物質とを区別するための方法
について述べる。後者の除去手段としてはゲル濾過クロ
マトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、吸
着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、疎水クロマトグラフィー、遠心分離、分子ふるいフ
ィルター、透析などの物理的な分離方法がある。しか
し、このような物理的分離をしなくても、高分子と低分
子を区別できるような例えば蛍光偏光測定方法などを利
用しても良く、また化学的処理でもって、非結合の増幅
子または標識物質を破壊しておいても良い。

【００１４】本発明は前記の条件を適切に組み合わせる
ことにより希望の感度に調整できる。それ故本発明は、
試料中の微量の核酸を高感度で分析できるだけでなく、
本発明による高感度検出可能な核酸に抗体（または抗
原）を結合し抗原（または抗体）と抗原抗体反応を行う
ことができるため、従来よりもより高感度な酵素免疫測
定法などへの適用が可能である。また同様に、本発明に
より高感度検出可能な核酸に核酸プローブを結合させる
ことにより、そのプローブと本発明では高感度化できな
い標的核酸特にオリゴヌクレオチドなどとハイブリダイ
ズさせることによりその標的核酸の高感度検出が可能と
なる。また、同様な工夫により血液凝固系への応用も可
能である。

【００１５】本発明は、仮に前記のすべての高感度化条
件を満足されていても、プラスの電荷をもった塩基性の
ポリペプチドまたは蛋白質など、具体的にはポリリジ
ン、プロタミン、一本鎖結合蛋白質などが、ある濃度以
上存在していると高感度化ができなくなるため、この様
な物質はなるべく避けなければならない。

【００１６】

【作用】塩濃度の存在下、核酸と標識された増幅子を有
する核酸プローブとを液相系においてハイブリダイゼー
ションを行った場合、ハイブリッドが形成され感度が増
幅する。そこで塩の存在下で適当な除去操作を行うとハ
イブリッドした核酸が高感度で検出できるようになる。
ここで予め核酸とプローブとをハイブリッドさせておい
てから標識された増幅子をプローブに結合させた場合
と、核酸と予め標識された増幅子を結合させたプローブ
とをハイブリッドさせた場合とではいずれも感度の程度
は変わらない。

【００１７】

【実施例１】１００μｇ／ｍｌ牛胸線ＤＮＡ（ベーリン
ガー）、１００ｍＭＭＥＳ緩衝液ＰＨ７．０、末端ビ
オチン化された２０ｎＭＫｉ−Ｒａｓ１２（正常型）プ
ローブ（宝酒造）溶液の入ったチューブに塩化ナトリウ
ムがそれぞれ７５ｍＭ、１５０ｍＭ、１５００ｍＭにな
るように添加された。これらを沸騰水で１０分間加熱し
室温に放置した。室温１０分後にペルオキシダーゼ結合
ストレプトアビジン（アマシャム）を５００倍希釈なる
ように添加しこれらを試料とした。これらの試料２０μ
ｌを吸着クロマトブラフィー用に処理された活性炭素カ
ラム（特許出願番号３−３００００２に記載）に加え２
ｍｌの０．５Ｍ硫酸アンモニウム溶出液で溶出した。こ
れらの溶出液に更に発色剤（１０ｍＭＴＭＢＺ、５０
ｍＭ過酸化水素）１００μｌ加えて３０分後に比色計
（６５０ｎｍ）で測定した。コントロールの値を差し引
いた結果を表１に示す。この結果から、本方法による感
度の増幅はある範囲内で塩濃度の影響を受けることが分
かる。

【００１８】

【表１】

【００１９】

【実施例２】２０μｇ／ｍｌ牛胸線ＤＮＡ（ベーリンガ
ー）、１００ｍＭＭＥＳ緩衝液ＰＨ６．５、末端ビオ
チン化された１０ｎＭＫｉ−Ｒａｓ６１（正常型）プロ
ーブ（宝酒造）、１０００ｍＭ塩化ナトリウム液の入っ
たチューブを沸騰水で１０分間加熱し室温に放置した。
室温１０分後にペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジ
ン（アマシャム）を５００倍希釈なるように添加しこれ
らを試料とした。ついでこの試料４０μｌをベッド体積
６０ｍｌのＴＳＫ−ＧＥＬトーヨパールＨＷ−５５（カ
ラム１．３ｃｍ×５０ｃｍ）に負荷した。カラム内は５
ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．０、５０ｍＭ塩化ナトリウム
のバッファー、または５ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．０、
５００ｍＭ塩化ナトリウムのバッファー溶出液で平衡化
したものを使用した。カラムに試料がしみこんだ後、そ
れぞれの溶出液をポンプで送液した。ボイド体積に出て
きたピークのＤＮＡを１ｍｌ試験管に集めて、これに実
施例１と同様に発色剤を加えて測定した。結果を表２に
示す。この結果から、試料の段階で高感度になっていて
も、分離の段階で塩濃度が低いと感度が小さくなること
が分かる。

【００２０】

【表２】

【００２１】

【実施例３】１００ｍＭＭＥＳ緩衝液ＰＨ７．０、末
端ビオチン化された２０ｎＭＫｉ−Ｒａｓ６１（正常
型）プローブ（宝酒造）、５００ｍＭ硫酸アンモニウム
溶液の入ったチューブに種類の異なる酵母、人、椎茸、
百合、大腸菌、シアノバクテリアのＤＮＡを添加した。
これらを沸騰水で１０分間加熱し室温に放置した。室温
１０分後にペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン
（アマシャム）を５００倍希釈なるように添加しこれら
を試料とした。これらの試料２０ｕｌを実施例１の活性
炭素カラムに加え２ｍｌの０．５Ｍ硫酸アンモニウム溶
出液で溶出した。これらの溶出液に更に発色剤（１０ｍ
ＭＴＭＢＺ、５０ｍＭ過酸化水素）１００μｌ加えて
３０分後に比色計（６５０ｎｍ）で測定した。コントロ
ールのプランク値を差し引きＤＮＡ１ｕｇ当りに換算し
た結果を表３に示す。この結果から分かるように、もし
百合ＤＮＡの場合にハプロイドあたりＫｉ−Ｒａｓ６１
のプローブと結合する遺伝子が１コピーだけ存在し塩基
数が１０^１１個だと仮定すると約５０万倍高感度になっ
ている計算になる。しかし、Ｅｃｏｌｉの場合には、ほ
とんど感度が無いようになっているが、それはこのプロ
ーブと結合できる配列が存在していないのかもしれな
い。

【００２２】

【表３】

【００２３】

【実施例４】３００ｍＭＭＥＳ緩衝液ＰＨ７．０、予
めアルカリホスファターゼ結合アビジンと結合させた１
０ｎＭの末端ビオチン化Ｋｉ−Ｒａｓ６１（正常型）プ
ローブ、予めペルオキシダーゼ結合アビジンと結合させ
た１０ｎＭの末端ビオチン化Ｋｉ−Ｒａｓ６１（異常
型）プローブ、５００ｍＭ硫酸アンモニウムを含んだ溶
液の入っているチューブに更にアルカリ変性させた牛胸
線ＤＮＡを加えて５０度で１０分反応させこれを試料と
した。この試料を実施例１の活性炭素カラムに加え２ｍ
ｌの５０ｍＭ硫酸アンモニウム溶出液で溶出した。これ
らの溶出液を２本の試験官に１ｃｃずつ分けた。次にそ
れぞれにペルオキシダーゼ活性測定用発色剤（ＴＭＢ
Ｚ、過酸化水素）、アルカリホスファターゼ活性測定用
発色剤（ＮＴＢ、ＢＣＩＰ）を加えて３０度２時間反応
させた。その結果、ペルオキシダーゼ活性は無く、アル
カリホスファターゼ活性だけがあった。このことから、
このアルカリホスファターゼ結合プローブがＤＮＡハイ
ブリッド形成した場合、同種の酵素だけが集合して高感
度になるが、異種のペルオキシダーゼ結合プローブはそ
の集合に関与しないことがわかる。

【００２４】

【発明の効果】本発明は数倍から数十万倍に数分で高感
度にすることができるため、試料中の核酸が微量で済
み、また簡易で迅速な方法なので信頼性の高い結果を得
ることができる。それ故、遺伝子の点突然変異、欠失、
挿入、増幅などの検出に役立つだけでなく、高感度な測
定法を必要とする酵素免疫測定法、生化学的測定法など
への応用も可能である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】塩の存在下において、核酸と増幅子を有す
る核酸プローブとを液相系においてハイブリダイゼーシ
ョンを行うこと又は核酸とハイブリッドしている核酸プ
ローブとそのプローブに結合できる増幅子とを液相系で
共存させることを特徴とする核酸プローブとハイブリッ
ドを形成する核酸の高感度測定法。
【請求項２】未結合の増幅子の除去操作を常に塩の存在
下で行う特許請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】除去操作がゲル濾過、吸着クロマトグラフ
ィまたはアフィニティクロマトグラフィによるものであ
る特許請求の範囲第２項に記載の方法。
【請求項４】塩濃度が５０ｍＭ以上である特許請求の範
囲第１項から第３項に記載の方法。
【請求項５】核酸が高等動植物ゲノム由来の核酸配列を
含むものである特許請求の範囲第１項から第４項に記載
の方法。
【請求項６】増幅子が少なくとも標識可能な蛋白質また
は酵素を有しているものである特許請求の範囲第１項か
ら第５項に記載の方法。
【請求項７】核酸プローブの５′末端、３′末端または
両端に増幅子を結合させたものである特許請求の範囲第
１項から第６項に記載の方法。
【請求項８】核酸プローブが末端ビオチン化核酸プロー
ブであり、増幅子が酵素結合アビジンである特許請求の
範囲第７に記載の方法。
【請求項９】１００倍以上の高感度となる特許請求の範
囲第１項から第８項に記載の方法。