JP2003038161A - 遺伝子検査容器 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 遺伝子増幅から検出までを単一の容器で特殊
な機器を使用することなく実施するための容器、ならび
に核酸サンプルの汚染を予防する手段を含んだ核酸増幅
と検出を実施するための方法と容器を提供すること。 【解決手段】サンプルチャージャー、反応チューブ、サ
ンプルパッド、フロー膜、吸水パッドを含む遺伝子検査
容器容器。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【本発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子検査操作
例えば核酸増幅と増幅遺伝子の検出を増幅産物の汚染を
予防し迅速で簡便に実施するための単一容器またはモジ
ュールに関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子検査の技法で、標的遺伝子を増幅
および核酸プローブによる検出の方法は公知であり、種
々の方式で実際の検査・診断に利用されている。これら
の方法は有効ではあるが、未だ特殊な装置、検査員の熟
練、専用の実験室を要求され、一部の専門検査受託セン
ター、専門大学病院や研究機関での実施に限定さている
のが現状である。従って、開業医、診療所、あるいはベ
ッドサイドでの遺伝子検査が現実実施できる簡便で迅速
な技術は開発されていない。このような遺伝子検査の普
及を不可能にしている原因は以下のような点である。第
一に、増幅した遺伝子を検出するためにプローブ検出系
へ物理的に移されなければならず、この過程で増幅産物
が実験環境中へ飛散したり、逆に環境中の汚染核酸が試
料中に混入する危険性が発生し、偽陽性結果を与える可
能性が残されていることである。第二に、現在のこの物
理的移動により誤認識や試料の取り違えが発生する危険
性を排除できないことである。第三に、プローブ検出に
代表される増幅遺伝子の検出には高額で特殊な専用装置
が必要でありベッドサイド検査にはコスト的にも不向き
であることである。

【０００３】従来、これらの問題点を解決するためにい
くつかの試みがなされてきた。例えば、Ｐａｕｌ Ｎ．
Ｓｃｈｎｉｐｅｌｓｋｙらは米国特許第５，２２９，
２９７号において、試料、増幅試薬および廃物部を連結
する通路からなる遺伝子増幅および検出のためのキュベ
ットを記載している。これは、ローラーという特殊な装
置を用いて試料を例えば左から右へ順に圧搾・圧迫する
ことで、試料および検出試薬がはじめ隔離されて保存さ
れていたものが、隔壁が破れ、通路を通り検出部さらに
廃物部へ押し出されるキュベットを提供する。しかし、
隔壁の破壊やローラーによる圧迫という特殊で複雑な方
法、容器であり具現化を困難にしている。

【０００４】特許第２６７５９８９号には核酸増幅のた
めの装置が記載されている。これは導入されたサンプル
を空気吸引／排出手段を使用して移動させることによっ
て、サンプルの反応チャンバーへの導入および反応液の
取り出しを行うものである。この装置の使用のために
は、空気吸引／排出手段（例えば、ピペット）をさらに
使用する必要がある。またこの装置には増幅産物の検出
手段が含まれておらず、検出のためには別の工程（電気
泳動など）を必要とするので、ベッドサイド検査には不
向きである。

【０００５】さらに、リアルタイム遺伝子増幅検出法も
種々開示されている。例えば、米国特許第５，９９４，
０５６号公報に記載のインターカレーターを用いる検出
方法、米国特許第５，１１８，８０１号公報等に記載の
モレキュラービーコン法のようなホモジニアス系でのプ
ローブ検出方法あるいは、米国特許第５，２１０，０１
５号公報等に記載のタックマンプローブ法を利用し、シ
ングルチューブ内で蓋を開けることなく遺伝子増幅から
検出までをリアルタイムで測定できるものである。しか
しながら、これらの方法は蛍光を検出するための特殊で
高価な機器が必要であり、ベッドサイドの検査に適した
ものではなかった。

【０００６】一方、臨床検査の現場では現在様々な検査
容器が採用されており、特に尿検査、免疫検査の分野で
は、米国特許４，７０３，０１７号公報、米国特許４，
８５５，２４０号公報、欧州公開公報０８１０４３６
号、米国特許５，５６４，１６２号公報、米国特許４，
９５４，４５２号公報、米国特許５，０７５，０７８号
公報等に記載されている妊娠診断薬に代表されるイムノ
クロマトグラフィー法が汎用されている。この方法は、
液体移動層膜などに抗原または抗体が固定化されており
検体液がこの膜を移動する間に抗原抗体反応がおこり、
さらに金コロイドなどで標識された抗体や抗原が反応し
光学的なシグナルをバンドあるいはスポットとして発生
するもので、簡便で肉眼で即座に容易に結果判定ができ
る方法であり、診療所から大病院に至るまで広くあらゆ
る臨床の場で活用されている。しかし、あくまでもタン
パク質やホルモンの検出に応用されているだけであり、
遺伝子検査への応用は不可能である。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、
（１）遺伝子増幅から検出までを単一の容器で特殊な機
器を使用することなく実施するための容器を提供するこ
と、及び（２）核酸サンプルの汚染を予防する手段を含
んだ核酸増幅と検出を実施するための方法と容器を提供
することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者は、かかる目的
を達成するために鋭意検討した結果、標的核酸を増幅
し、該増幅産物を光学的シグナルによって検出するため
の迅速、高感度でかつキャリーオーバーによるコンタミ
ネーションを予防できる遺伝子検査容器を開発し、本発
明を完成させた。

【０００９】即ち、本発明の第１の態様は、遺伝子検査
操作における検体、試薬、検出方法、および増幅サンプ
ルによる汚染に関する前記問題を解決するための容器に
関する。該容器は、 （ａ）標的遺伝子を含有する可能性のある液状検体を導
入するためのサンプルチャージャーであって、反応チュ
ーブ用キャップおよび液状検体導入用手段を含む、サン
プルチャージャー； （ｂ）少なくともひとつの反応チューブであって、該反
応チューブ内に遺伝子増幅試薬が含有され、該反応チュ
ーブの開口部はその形状に適合した穴を有するサンプル
パッドと連結しており、該反応チューブの開口部がサン
プルパッドを介してまたは介さないでサンプルチャージ
ャーによってキャッピングされる、反応チューブ； （ｃ）反応チューブと連結しているサンプルパッド； （ｄ）液体の流れを引き起こすためのフロー膜であっ
て、該フロー膜はサンプルパッドに連結しており、該フ
ロー膜上に固定化された増幅産物をトラップするための
キャプチャー分子を有する、フロー膜；および （ｅ）フロー膜に連結している吸水パッドを含む。

【００１０】本発明の第２の態様は、遺伝子検査方法で
あって、以下の工程： （ａ）標的遺伝子を含有する可能性のある液状検体をサ
ンプルチャージャーを使用して遺伝子増幅試薬を含有す
る反応チューブに導入する工程； （ｂ）遺伝子増幅反応を行う工程； （ｃ）遺伝子増幅反応液を反応チューブに連結したサン
プルパッド、該サンプルパッドに連結したフロー膜およ
び該フロー膜に連結した吸収パッドへ移動させる工程；
および （ｄ）フロー膜上に固定化されたキャプチャー分子にト
ラップされた増幅産物を検出する工程、を包含し、工程
（ａ）〜（ｄ）が１つの容器中で行われる方法に関す
る。

【００１１】

【発明の実施の形態】上記のように、本発明は、遺伝子
検査、さらに詳しくは遺伝子増幅と遺伝子検出を単一容
器内で連続して実施するための方法および容器を提供す
る。概説すれば、本発明の一つの態様は、サンプルチャ
ージャーならびに増幅反応チューブさらにサンプルパッ
ド、フロー膜、吸水パッドを有する容器を提供する。

【００１２】本発明に用いられる液状検体は、標的遺伝
子を含有する可能性のあるいずれかの液状検体である。
通常、液状検体は、標的核酸（すなわち、ＲＮＡ、ＤＮ
Ａ）を含む水溶性調製物である。従って、本発明の遺伝
子検査容器は、特に限定はされないが、例えばポリメラ
ーゼ チェーン リアクション（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ
法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法など様々な増幅法において
使用することができる。特に、本発明の容器は国際公開
第００／５６８７７号パンフレットに記載の、等温増幅
法でかつ試薬の種類が少ないＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒ
ｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉ
ｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）法において好適に使用
できる。

【００１３】本発明の容器の底面は通常長方形であるが
三角形、楕円形など様々な形態で作製することができ
る。１つの実施態様において、反応チューブと吸水パッ
ドは互いに容器の両端に位置しており、フロー膜は反応
チューブと吸水パッドの間に位置する。

【００１４】本発明の容器の１つの実施態様を図１に示
す。核酸を含有する液状検体はサンプルチャージャー１
から反応チューブ２内へ移される。反応チューブ２中に
含有される遺伝子増幅試薬によって核酸増幅が起こり、
アンプリコン（本明細書において増幅産物ともいう）が
生成される。この増幅反応液は次にサンプルパッド３へ
移される。増幅反応液のサンプルパッド３への移動は、
通常、容器を反転させ、反応液を反応チューブ２とサン
プルチャージャー１との間に位置するサンプルパッド３
の面と接触させることによって行われる。サンプルパッ
ド３内の反応液は、サンプルパッド３に連結されたフロ
ー膜４に連結された吸水パッド５の吸水力の補助によっ
て、フロー膜４に移り、最終的に吸水パッド５へ移動す
る。フロー膜４は支持体７によって支持されている。フ
ロー膜４自体が十分な強度を有する場合はこのような支
持体は必ずしも必要ではない。反応液中のアンプリコン
は、フロー膜上に固定されたキャプチャー分子１０にト
ラップされる。試薬導入口８からサンプルパッド３へ標
識試薬や発色試薬など様々な検出に必要な試薬を添加す
ることによって、最終的にフロー膜４上に固定化された
キャプチャー分子１０にトラップされたアンプリコンが
検出される。検出は例えば、キャプチャー分子１０を固
定化した位置が観察できるようにハウジング容器９に配
置された検出窓６を通して肉眼で実施される。

【００１５】反応チューブは例えば、約２１ｍｍの長
さ、約６ｍｍの直径、そして円錐部の斜辺が約１２ｍｍ
の名目上の寸法を有する。また、この反応チューブに連
結する検出部（サンプルパッド、フロー膜、吸水パッド
を含む）はほぼ直方体の形状を有し、例えば、長さが約
６０ｍｍ、幅が約１５ｍｍ、高さが約２ｍｍの名目上の
寸法を有する。

【００１６】サンプルチャージャーは上記反応チューブ
用キャップおよび液状検体導入用手段を含む。サンプル
チャージャーは、例えば、高さ約６ｍｍ、直径約５．８
ｍｍの形状を有しさらに長さ２５ｍｍの針状突起物をそ
の中心に有するものである。このサンプルチャージャー
によって液状検体（例えば、１０〜１００μｌの容量）
を採取し増幅反応チューブ内の反応試薬に導くことにな
る。液状検体導入用手段は液状検体を保持できるもので
あり、例えば、上記のように針状突起物の形態である。
採取および導入は液体の付着によってもよいが、サンプ
ルチャージャーは液状検体の採取および反応チューブへ
の導入のための手段（例えば、スポイド）をさらに含ん
でもよい。上記記載の寸法は特定される物ではなく、容
器が実質的に所望の遺伝子増幅ならびにアンプリコンの
検出の実施のための容器として十分に機能するならば変
更可能である。

【００１７】図１では、反応チューブ２の開口部が、サ
ンプルパッド３を介してサンプルチャージャー１の反応
チューブ用キャップ部分によってキャッピングされる態
様を説明した。しかし、反応の間は反応チューブをサン
プルチャージャーの反応チューブ用キャップで直接キャ
ッピングして密閉し、反応終了後に反応チューブ（また
はサンプルチャージャー）を移動させることによって反
応液をサンプルパッドと接触可能にするか、または反応
液をサンプルチャージャーに付着させてサンプルパッド
に移すこともできる。これにより、反応の間の反応液の
蒸発を防止することができるが、ＩＣＡＮ法などの等温
遺伝子増幅法を比較的低い温度（例えば、５０〜６０
℃）で実施する場合はこのような操作は必ずしも必要で
はない。

【００１８】フロー膜にはアンプリコンをトラップする
ためのキャプチャー分子が固定化される。キャプチャー
分子はアンプリコンをトラップする分子であり、アンプ
リコンに特異的に結合する核酸、タンパク質を包含す
る。キャプチャー分子は適切な当該分野において公知の
方法によって固定化される。

【００１９】反応容器の材質は、それぞれの用途に適切
であるように選択される。サンプルパッドおよび吸水パ
ッドの材質はフロー膜を通る液体の移動に適切であるよ
うに選択され、例えば、セルロースである。フロー膜に
使用できる材料は、反応液中のアンプリコンが移動可能
であり、キャプチャー分子が固定化できる材料であり、
ニトロセルロース、ＰＶＤＦ、ナイロンを包含する。

【００２０】本発明の好ましい態様においては、遺伝子
増幅試薬は液状で反応チューブ内におかれる。また、米
国特許第４，８９１，３１９号に記載されている試薬の
安定な乾燥化技術によって乾燥状態で置かれてもよい。
また、核酸増幅用酵素の安定化法としては特表平１０−
５０３３８３公表公報に記載の方法を用いても良い。

【００２１】さらに、本発明において、トレハロースお
よび／またはポリビニールピロリドンを安定化剤として
用いることができる。特に限定はされないが、例えばＩ
ＣＡＮ法用の試薬の場合、トレハロースの濃度は、好ま
しくは、０．０５Ｍ〜０．５Ｍの範囲、特に好ましくは
０．１Ｍ〜０．３Ｍの範囲が好適である。また、ポリビ
ニールピロリドンの濃度は、好ましくは、０．１％〜２
０％の範囲、特に好ましくは１％〜５％の範囲が好適で
ある。また、凍結乾燥したＩＣＡＮ法用試薬の場合にお
いても上記トレハロースおよび／またはポリビニールピ
ロリドンの存在下において、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメ
ラーゼならびにＲＮａｓｅＨ活性、さらにＩＣＡＮ反応
活性が安定に保持できる。従って、本発明の容器はこの
安定化された核酸増幅試薬を含有することで、ベッドサ
イドでの遺伝子検査を実現できるものになった。

【００２２】アンプリコンの存在はあらゆる適切な手
段、例えばアンプリコンに特異的に結合する核酸プロー
ブを用いて検出されるが、この核酸プローブが検出可能
な基（例えば、酵素、ラジオアイソトープ、蛍光物質、
ビオチン、ハプテン、金コロイド）で修飾されているこ
とが望ましく、修飾方法は当業界において公知である。
尚、別法として検出に必要な試薬を本容器に付属したエ
リア、チューブおよび試薬を含有してもよい。肉眼で観
察可能な標識を使用して検出を実施することがベッドサ
イド検査のためには便利であるが、適切な検出装置を使
用して検出を行うことも可能である。この場合、本発明
の容器は検出装置による検出に適切なように設計され
る。

【００２３】１つの実施態様において、本発明の容器
は、遺伝子増幅反応前に汚染を除去するための試薬を含
有する汚染除去反応チューブをさらに有する。本発明の
容器を用いた遺伝子検査において、汚染除去の一方法と
して米国特許第５、０３５、９９６号公報記載の方法を
応用することもできる。この特許に記載される方法にお
いて、ｄＵＴＰ含む基質を用いて増幅された増幅核酸が
混入している可能性のある検体を、ウラシルＮ−グリコ
シラーゼ（ＵＮＧ）で処理した後、増幅反応に供するこ
とによって、増幅核酸のクロスコンタミネーションを防
止することができる。例えば、まず液体検体を付着させ
たサンプルチャージャーをＵＮＧを含有する汚染除去反
応チューブに浸し、次いでＵＮＧで処理された液体検体
を付着させたサンプルチャージャーを反応チューブに移
すことによって、汚染を除去することができる。この場
合、目的の核酸をトラップするための手段（例えば、ポ
リｄＴまたは特異的プローブ）を先端に固定化したサン
プルチャージャーを使用することがより有効である。

【００２４】さらに本発明は、上記遺伝子検査用容器を
使用する遺伝子検査を実施するための方法を提供する。

【００２５】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるもので
はない。 参考例１ （１）ピロコッカス フリオサス ゲノムＤＮＡの調製 トリプトン（ディフコラボラトリーズ社製）１％、酵母
エキス（ディフコラボラトリーズ社製）０．５％、可溶
性でんぷん（ナカライテスク社製）１％、ジャマリンＳ
・ソリッド（ジャマリンラボラトリー社製）３．５％、
ジャマリンＳ・リキッド（ジャマリンラボラトリー社
製）０．５％ 、ＭｇＳＯ₄ ０．００３％、ＮａＣｌ
０．００１％、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０００１％、
ＣｏＳＯ₄０．０００１％、ＣａＣｌ₂・７Ｈ₂Ｏ ０．
０００１％、ＺｎＳＯ₄ ０．０００１％、ＣｕＳＯ₄・
５Ｈ₂Ｏ ０.１ｐｐｍ、ＫＡｌ(ＳＯ₄)₂ ０.１ｐｐ
ｍ、Ｈ₃ＢＯ₄ ０.１ｐｐｍ、Ｎａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ
０.１ｐｐｍ、ＮｉＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ ０.２５ｐｐｍの組
成の培地２ｌを２ｌ容のメジュウムボトルにいれ、１２
０℃、２０分間殺菌した後、窒素ガスを吹き込み、溶存
酸素を除去し、これにピロコッカス フリオサス（Pyroc
occus furiosus、ドイッチェ ザムルンク フォン ミ
クロオルガニスメンより購入：ＤＳＭ３６３８）を接種
して、９５℃、１６時間静置培養した後、遠心分離によ
って菌体を得た。次に、得られた菌体を４ｍｌの２５％
ショ糖、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁
し、０．４ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ塩化リゾチーム（ナカ
ライテスク社製）水溶液を加えて、２０℃で１時間反応
させた。反応終了後、この反応液に２４ｍｌの１５０ｍ
ＭＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０）、０．２ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテ
イナーゼＫ（宝酒造社製）及び２ｍｌの１０％ラウリル
硫酸ナトリウム水溶液を加え、３７℃で１時間保温し
た。反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、続い
てエタノール沈殿を行い、約１ｍｇのゲノムＤＮＡを調
製した。

【００２６】（２）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニ
ング ピロコッカス ホリコシ（Pyrococcus horikoshii）の
全ゲノム配列が公開されており〔Ｋａｗａｒａｂａｙａ
ｓｉ，Ｙら、ＤＮＡ リサーチ（DNA Research）、第５
巻、第５５−７６頁（１９９８）〕、ＲＮａｓｅＨＩＩ
のホモログをコードする遺伝子（ＰＨ１６５０）が１つ
存在することが明らかになっている（配列番号１、日本
国経済産業省製品評価センター ホームページ：http:/
/www.nite.go.jp/）。そこで、このＰＨ１６５０遺伝子
と一部公開されているピロコッカス フリオサスのゲノ
ム配列（University of Utah, Utah Genome Centerホー
ムページ：http://www.genome.utah.edu/sequence.htm
l）でホモロジー検索をおこなった。その結果、非常に
ホモロジーの高い配列が見つかった。得られた配列をも
とにプライマー１６５０Ｎｄｅ（配列番号２）及び１６
５０Ｂａｍ（配列番号３）を合成した。

【００２７】上記（１）で得たピロコッカス フリオサ
スＤＮＡ ２００ｎｇを鋳型にして、２０ｐｍｏｌの１
６５０Ｎｄｅ及び２０ｐｍｏｌの１６５０Ｂａｍをプラ
イマーに用い、１００μｌの容量でＰＣＲ行った。ＰＣ
ＲでのＤＮＡポリメラーゼはタカラＥｘタック（宝酒造
社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９
４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイ
クルとし、３０サイクル行った。増幅した約０．７ｋｂ
のＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ(ともに宝酒造
社製)で消化し、得られたＤＮＡ断片をプラスミドベク
ターｐＥＴ３ａ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ及びＢａ
ｍＨＩ間に組込んだプラスミドｐＰＦＵ２２０を作製し
た。

【００２８】（３）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片の塩基配列の決定 上記（２）で得られたｐＰＦＵ２２０の挿入ＤＮＡ断片
の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。得られた
塩基配列の結果を解析したところ、ＲＮａｓｅＨＩＩを
コードすると考えられるオープンリーディングフレーム
が見出された。このオープンリーディングフレームの塩
基配列を配列表の配列番号４に示す。また、該塩基配列
から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列を配列
表の配列番号５に示す。

【００２９】なお、プラスミドｐＰＦＵ２２０で形質転
換された大腸菌ＪＭ１０９は、Escherichia coli JM109
／pPFU220と命名、表示され、平成１２年９月５日より
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、独立
行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受
託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８０２０として寄託され、ま
た、前記独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託
センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６５４［国際寄
託への移管請求日：平成１３年７月９日］として寄託さ
れている。

【００３０】（４）精製ＲＮａｓｅＨＩＩ標品の調製 上記（２）で得られたｐＰＦＵ２２０で大腸菌ＨＭＳ１
７４（ＤＥ３）（ノバジェン社製）を形質転換し、得ら
れたｐＰＦＵ２２０を含む大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ
３）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｌのＬ
Ｂ培地に植菌し、３７℃で１６時間振盪培養した。培養
終了後、遠心分離によって集めた菌体を６６．０ｍｌの
ソニケーションバッファー〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭフェニルメ
タンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕
機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間
の遠心分離を行い、得られた上清を８０℃、１５分間の
熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍで１０
分の遠心分離を行い、上清を集め、６１．５ｍｌの熱処
理上清液を得た。

【００３１】この熱処理上清液をバッファーＡ〔５０ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ〕
で平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｑカラム（アマシャム
ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシ
ステム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）
を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、Ｒ
ＮａｓｅＨＩＩはＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｑカラムを素通り
した。素通りしたＲＮａｓｅＨＩＩ画分６０．０ｍｌを
バッファーＡで平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｓカラム
（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供
し、ＦＰＬＣシステムを用いて０〜５００ｍＭ ＮａＣ
ｌ直線濃度勾配により溶出し、約１５０ｍＭ ＮａＣｌ
のところに溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩ画分を得た。こ
のＲＮａｓｅＨＩＩ画分２．０ｍｌをセントリコン−１
０（アミコン社製）を用いた限外ろ過により濃縮し、２
５０μｌの濃縮液を１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲルろ過カラ
ム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供
し、同じバッファーで溶出を行った結果、ＲＮａｓｅＨ
ＩＩは、１７キロダルトンの分子量に相当する位置に溶
出された。この分子量は、ＲＮａｓｅＨＩＩが１量体と
して存在する場合に相当する。こうして溶出されたＲＮ
ａｓｅＨＩＩをＰｆｕＲＮａｓｅＨＩＩ標品とした。

【００３２】上記で得られたＰｆｕＲＮａｓｅＨＩＩ標
品１μｌに４０℃であらかじめインキュベーションした
反応液〔２０ｍＭヘペス−水酸化カリウム（ｐＨ７．
８）、０．０１％ 牛血清アルブミン（宝酒造社製）、
１％ジメチルスルホキシド、４ｍＭ酢酸マグネシウム、
２０μｇ／ｍｌポリ（ｄＴ）（アマシャム ファルマシ
ア バイオテク社製）、３０μｇ／ｍｌポリ（ｒＡ）
（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）〕１０
０μｌを添加し、４０℃で１０分間反応さた後、０．５
Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）１０μで反応を停止し、２
６０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、ＰｆｕＲＮａ
ｓｅＨＩＩ標品にＲＮａｓｅＨ活性が認められた。

【００３３】実施例１ （１）容器のアッセンブリーは、以下のようにして行っ
た。即ち、検出部分はミリポア社のハイフロー・プラス
開発キットを用いて構築した。ハイフロー・プラス開発
キットのニトロセルロース製膜上にストレプトアビジン
（ナカライテスク社）をＰＢＳ中５μｇ／ｍｌとなるよ
うに溶解した液０．１ｍｌをバンド状に塗り乾燥させ
た。以下、この部分をキャプチャー部位という。次にハ
イフロー・プラス開発キットのサンプルパッド部に直径
５ｍｍの穴をパンチで開け、ここにＰＣＲ用０．２ｍｌ
チューブ（アシスト社）を接着した。このＰＣＲチュー
ブのキャップの内側にフレックスチップ（日本ジェネテ
ィクス社）の先端を切り取り接着し、サンプルチャージ
ャーとした。

【００３４】（２）結核菌遺伝子増幅用試薬を調製し、
上記（１）の反応チューブ部分に５０μｌ入れ凍結乾燥
した。反応液組成を表１に示す。配列表の配列番号６〜
７に使用するＭＴＩＳ２Ｆ及びＭＴＩＳ２ＲＢプライマ
ーの塩基配列を示す。

【００３５】

【表１】

【００３６】なお、対照としてトレハロースならびにポ
リビニールピロリドンのかわりに注射用蒸留水を加えた
安定化剤を添加しない試薬組成も調製し、凍結乾燥し
た。凍結乾燥後、一部は４℃で、また一部は４５℃で２
４時間保存し、安定化剤の効果を検討した。

【００３７】（３）上記遺伝子検査容器を用いて、結核
菌の検出を行った。即ち、結核菌２０細胞に相当するゲ
ノムＤＮＡを含有する喀痰抽出液５０μｌをサンプルチ
ャージャーに付着させ、ＩＣＡＮ増幅試薬の凍結乾燥物
が含有された反応チューブにキャッピングし、抽出液に
よって凍結乾燥物を溶解し、６０℃で１時間ＩＣＡＮ反
応を行った。

【００３８】反応終了後、本容器の上下を逆転すること
により反応液をサンプルパッドに接触させ、自動的にニ
トロセルロース膜上をアンプリコンを含有する反応液を
キャプチャー部位へ展開させた。その後０．１Ｎ Ｎａ
ＯＨ５０μｌを外部よりサンプルパッドに添加し、キャ
プチャー部位にトラップされたビオチン化増幅産物を変
性させ一本鎖とした。次にＦＩＴＣで標識された配列表
の配列番号８記載のＭＩＴＳ２ＢＦプローブを５ｐｍｏ
ｌ／ｍｌとなるようにハイブリダイゼーションバッファ
ーで希釈し、該溶液２００μｌを外部からサンプルパッ
ドに添加し展開した。引き続きＨＲＰ標識された抗ＦＩ
ＴＣウサギ抗体（ケミコン社）を２５％ブロックエース
（大日本製薬社）含有ＰＢＳで５００倍希釈した液２０
０μｌを外部からサンプルパッドに添加し展開した。引
き続きＰＢＳ１ｍｌを外部からサンプルパッドに添加
し、キャプチャー部位にトラップされなかった未反応の
試薬を洗い流した。最後に、発色試薬（トゥルーブルー
・パーオキシダーゼ基：ＫＰＬ社）を外部からサンプル
パッドに添加し展開した。

【００３９】全操作（核酸抽出液の添加からＩＣＡＮ増
幅さらに検出まで）は約７０分であり、キャプチャー部
位に青色のバンドが検出された場合を陽性（＋）とし、
検出されない場合を陰性（−）とした。その結果を表２
に示す。

【００４０】

【表２】

【００４１】表２に示したように、安定化剤が含まれて
いる場合には結核菌の検出が可能であり、安定化剤が含
まれない場合は検出できなかった。また、本遺伝子検査
容器を用いることにより、簡便で迅速、高感度に結核菌
の検出を行うことができた。

【００４２】

【発明の効果】以上のことから、本発明により従来困難
であったベッドサイドでの迅速で高感度で安定で簡便な
クロスコンタミを予防しうる、遺伝子検査容器ならびに
方法が提供された。

【００４３】

【配列表フリーテキスト】 SEQ ID NO:2: PCR primer 1650Nde for cloning a gene encoding a polypept ide having a RNaseHII activity from Pyrococcus furiosus. SEQ ID NO:3: PCR primer 1650Bam for cloning a gene encoding a polypept ide having a RNaseHII activity from Pyrococcus furiosus. SEQ ID NO:6: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as MI TS2F to amplify the DNA fragment of IS6110 gene derived from Micrococcus tuberuclosis. Nucleotides at positions 16 to 18 are ribonucleotides. SEQ ID NO:7: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as MI TS2F to amplify the DNA fragment of IS6110 gene derived from Micrococcus tuberuclosis. Nucleotides at positions 19 to 21 are ribonucleotides. SEQ ID NO:8: Designed oligonucleotide probe to amplify a portion of IS 6110 gene derived from Micrococcus tuberuclosis.

【００４４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> TAKARA HOLDINGS INC. <120> Vessel for examining gene <130> 183932 <150> JP 2001-137336 <151> 2001-05-08 <160> 8 <210> 1 <211> 663 <212> DNA <213> Pyrococcus horikoshii <400> 1 atgaaggttg ctggagttga tgaagcgggg agggggccgg taattggccc gttagtaatt 60 ggagtagccg ttatagatga gaaaaatatt gagaggttac gtgacattgg ggttaaagac 120 tccaaacaat taactcctgg gcaacgtgaa aaactattta gcaaattaat agatatccta 180 gacgattatt atgttcttct cgttaccccc aaggaaatag atgagaggca tcattctatg 240 aatgaactag aagctgagaa attcgttgta gccttgaatt ctttaaggat caagccgcag 300 aagatatatg tggactctgc cgatgtagat cctaagaggt ttgctagtct aataaaggct 360 gggttgaaat atgaagccac ggttatcgcc gagcataaag ccgatgcaaa gtatgagata 420 gtatcggcag catcaataat tgcaaaggtc actagggata gagagataga gaagctaaag 480 caaaagtatg gggaatttgg ttctggctat ccgagtgatc cgagaactaa ggagtggctt 540 gaagaatatt acaaacaata tggtgacttt cctccaatag ttaggagaac ttgggaaacc 600 gctaggaaga tagaggaaag gtttagaaaa aatcagctaa cgcttgataa attccttaag 660 tga 663 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 1650Nde for cloning a gene encoding a polypeptide havin g a RNaseHII activity from Pyrococcus furiosus. <400> 2 caggaggaga gacatatgaa aataggggga att 33 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 1650Bam for cloning a gene encoding a polypeptide havin g a RNaseHII activity from Pyrococcus furiosus. <400> 3 gaaggttgtg gatccacttt ctaaggtttc tta 33 <210> 4 <211> 672 <212> DNA <213> Pyrococcus furiosus <400> 4 atgaaaatag ggggaattga cgaagcagga agaggaccag cgatagggcc attagtagta 60 gctactgtcg tcgttgatga gaaaaacatt gagaagctca gaaacattgg agtaaaagac 120 tccaaacaac taacacccca tgaaaggaag aatttatttt cccagataac ctcaatagcg 180 gatgattaca aaatagtgat agtatcccca gaagaaatcg acaatagatc aggaacaatg 240 aacgagttag aggtagagaa gtttgctctc gccttaaatt cgcttcagat aaaaccagct 300 cttatatacg ctgatgcagc ggatgtagat gccaatagat ttgcaagctt gatagagaga 360 agactcaatt ataaggcgaa gattattgcc gaacacaagg ccgatgcaaa gtatccagta 420 gtttcagcag cttcaatact tgcaaaggtt gttagggatg aggaaattga aaaattaaaa 480 aagcaatatg gagactttgg ctctgggtat ccaagtgatc caaaaaccaa gaaatggctt 540 gaagagtact acaaaaaaca caactctttc cctccaatag tcagacgaac ctgggaaact 600 gtaagaaaaa tagaggaaag cattaaagcc aaaaaatccc agctaacgct tgataaattc 660 tttaagaaac ct 672 <210> 5 <211> 224 <212> PRT <213> Pyrococcus furiosus <400> 5 Met Lys Ile Gly Gly Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Ala Ile 1 5 10 15 Gly Pro Leu Val Val Ala Thr Val Val Val Asp Glu Lys Asn Ile 20 25 30 Glu Lys Leu Arg Asn Ile Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Thr 35 40 45 Pro His Glu Arg Lys Asn Leu Phe Ser Gln Ile Thr Ser Ile Ala 50 55 60 Asp Asp Tyr Lys Ile Val Ile Val Ser Pro Glu Glu Ile Asp Asn 65 70 75 Arg Ser Gly Thr Met Asn Glu Leu Glu Val Glu Lys Phe Ala Leu 80 85 90 Ala Leu Asn Ser Leu Gln Ile Lys Pro Ala Leu Ile Tyr Ala Asp 95 100 105 Ala Ala Asp Val Asp Ala Asn Arg Phe Ala Ser Leu Ile Glu Arg 110 115 120 Arg Leu Asn Tyr Lys Ala Lys Ile Ile Ala Glu His Lys Ala Asp 125 130 135 Ala Lys Tyr Pro Val Val Ser Ala Ala Ser Ile Leu Ala Lys Val 140 145 150 Val Arg Asp Glu Glu Ile Glu Lys Leu Lys Lys Gln Tyr Gly Asp 155 160 165 Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Lys Thr Lys Lys Trp Leu 170 175 180 Glu Glu Tyr Tyr Lys Lys His Asn Ser Phe Pro Pro Ile Val Arg 185 190 195 Arg Thr Trp Glu Thr Val Arg Lys Ile Glu Glu Ser Ile Lys Ala 200 205 210 Lys Lys Ser Gln Leu Thr Leu Asp Lys Phe Phe Lys Lys Pro 215 220 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as MITS2F to a mplify the DNA fragment of IS6110 gene derived from Micrococcus tuberucl osis. Nucleotides at positions 16 to 18 are ribonucleotides. <400> 6 tctcgtccag cgccgcuu 18 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as MITS2F to a mplify the DNA fragment of IS6110 gene derived from Micrococcus tuberucl osis. Nucleotides at positions 19 to 21 are ribonucleotides. <400> 7 gacaaaggcc acgtaggcga a 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe to amplify a portion of IS6110 gene derived from Micrococcus tuberuclosis. <400> 8 gacctcacct atgtgtcgac 20

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の容器の一例の断面を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 37/00 １０１ Ｇ０１Ｎ 37/00 １０１ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｆターム(参考） 2G045 AA28 BA01 BA11 BA13 BB53 CB21 DA12 DA13 DA14 FA18 FB02 FB07 FB11 FB17 HA09 4B024 AA11 BA11 CA02 CA09 DA06 EA04 HA11 HA14 HA19 4B029 AA07 AA08 BB20 FA01 GA08

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 遺伝子検査容器であって、 （ａ）標的遺伝子を含有する可能性のある液状検体を導
   入するためのサンプルチャージャーであって、反応チュ
   ーブ用キャップおよび液状検体導入用手段を含む、サン
   プルチャージャー； （ｂ）少なくともひとつの反応チューブであって、該反
   応チューブ内に遺伝子増幅試薬が含有され、該反応チュ
   ーブの開口部はその形状に適合した穴を有するサンプル
   パッドと連結しており、該反応チューブの開口部がサン
   プルパッドを介してまたは介さないでサンプルチャージ
   ャーによってキャッピングされる、反応チューブ； （ｃ）反応チューブと連結しているサンプルパッド； （ｄ）液体の流れを引き起こすためのフロー膜であっ
   て、該フロー膜はサンプルパッドに連結しており、該フ
   ロー膜上に固定化された増幅産物をトラップするための
   キャプチャー分子を有する、フロー膜；および （ｅ）フロー膜に連結している吸水パッドを含む容器。
2. 【請求項２】 反応チューブと吸水パッドが互いに容器
   の両端に位置しており、フロー膜が反応チューブと吸水
   パッドの間に位置する、請求項１記載の遺伝子検査容
   器。
3. 【請求項３】 反応チューブ、サンプルチャージャー、
   サンプルパッド、フロー膜、吸水パッドがハウジング容
   器によりパッケージングされた、請求項１記載の遺伝子
   検査容器。
4. 【請求項４】 サンプルパッドへの液体添加口を有す
   る、請求項３記載の遺伝子検査容器。
5. 【請求項５】 遺伝子増幅反応前に汚染を除去するため
   の試薬を含有する汚染除去反応チューブをさらに有す
   る、請求項１記載の遺伝子検査容器。
6. 【請求項６】 遺伝子増幅試薬が、トレハロース、ポリ
   ビニールピロリドン、ならびにスクロースから選択され
   る安定化剤を含有することを特徴とする請求項１記載の
   遺伝子検査容器。
7. 【請求項７】 遺伝子増幅がＩＣＡＮ法によって行われ
   る、請求項１〜６のいずれか１項記載の遺伝子検査容
   器。
8. 【請求項８】 遺伝子検査方法であって、以下の工程： （ａ）標的遺伝子を含有する可能性のある液状検体をサ
   ンプルチャージャーを使用して遺伝子増幅試薬を含有す
   る反応チューブに導入する工程； （ｂ）遺伝子増幅反応を行う工程； （ｃ）遺伝子増幅反応液を反応チューブに連結したサン
   プルパッド、該サンプルパッドに連結したフロー膜およ
   び該フロー膜に連結した吸収パッドへ移動させる工程；
   および （ｄ）フロー膜上に固定化されたキャプチャー分子にト
   ラップされた増幅産物を検出する工程、を包含し、工程
   （ａ）〜（ｄ）が１つの容器中で行われる方法。