KR20130118331A - 증폭 핵산 검출 방법 및 검출 디바이스 - Google Patents

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Abstract

하이브리다이제이션법의 특이성이 높음을 활용하고, 또한, PCR 산물의 검출 공정에 요하는 시간과 공정을 줄이고, 특수한 장치를 필요로 하지 않고, 간편 또한 고정밀도로, 목시(目視)로 검출하는 핵산 검출 방법, 및 핵산 검출 디바이스 또는 키트를 제공하는 것을 과제로 한다. 시료 중의 표적 핵산을 검출하는 방법에 있어서, 표적 핵산 서열을 증폭할 때에, 그 양말단에 1본쇄 영역을 부가한 부분적으로 2본쇄 구조를 갖는 증폭 산물을 합성하는 공정, 당해 증폭 산물의 1본쇄 영역과 전개 매체에 결합한 핵산 서열, 및 표지 화합물에 결합한 핵산 서열로 샌드위치 하이브리다이제이션 복합체를 형성하는 공정으로 이루어지는 표적 핵산의 검출법 및 검출 디바이스를 제공한다.

Description

증폭 핵산 검출 방법 및 검출 디바이스{AMPLIFIED NUCLEIC ACID DETECTION METHOD AND DETECTION DEVICE}
본 발명은, 증폭 핵산의 간편한 검출 방법, 및 그 디바이스에 관한 것이다.
분자 생물학의 연구 분야, 유전자 검사 등의 임상 응용 분야에 있어서, 표적 핵산 서열을 특이적으로 증폭하는 방법은 매우 중요한 기술이 되어 있다. 핵산 증폭법에 의해 얻어진 증폭 산물을 특이적으로 검출하는 방법의 하나로서, 표적 서열을 포함하는 핵산 단편을 고상으로 고정하여 검출하는 방법이 있다. 이 방법에서는, 표적 핵산을 특이적으로 고상으로 포착함으로써, 세정 등에 의해 비특이적인 핵산 서열을 용이하게 제거하고, 검출 특이성을 올리는 것이 가능하다.
이때, 표적 핵산을 고상으로 포착하는 방법으로서는, 특이적인 결합을 형성할 수 있는 항원-항체의 조합, 혹은, 리간드-리셉터의 조합을 이용하는 방법을 들 수 있다. 예를 들면, 비특허문헌 1에서는, 한쪽의 프라이머의 말단을 비오틴 수식하고, 다른 쪽의 프라이머를 형광 물질 수식한 프라이머를 사용하여 증폭한 PCR 산물의 검출법이 개시되어 있다. 이 방법에서는, PCR 산물을 스트렙트아비딘-아가로오스로 이루어지는 고상과 접촉시키고, 스트렙트아비딘-비오틴 복합체를 형성시키는 것에 의해 고상으로 결합시키고, 그 형광을 측정함으로써 목적의 증폭 산물의 검출이 가능하다.
그러나, 표지에 사용 가능한 항원/항체나 리간드/리셉터의 조합에는 제한이 있기 때문에, 동시에 다수의 표적 핵산을 검출하는 것은 실질적으로는 곤란하다. 또한, 형광 표지 핵산은 고가라는 비용면의 문제도 갖는다.
표적 핵산을 고상으로 포착하는 다른 방법으로서, 표적 핵산에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브를 고상 상에 고정화하고, 표적 핵산과 프로브의 하이브리다이제이션을 통하여, 표적 핵산을 고상으로 간접적으로 고정화하는 방법이 있다. 이 방법에서는 하이브리드 형성에 의한 시그널 강도의 검출을 행한다. 이러한 핵산 해석법은, 프로브 서열을 바꿈으로써 복수의 표적 서열을 한번에 해석하는 것이 가능하다.
그러나, 고정화한 프로브와 표적 핵산을 고상 상에서 하이브리다이제이션시키기 위해서는, 일반적으로 PCR법으로 증폭한 2본쇄 핵산을, 열처리에 의해 1본쇄로 변성하는 공정이 필요하지만, 가열 처리는 번잡할 뿐만 아니라, 재어닐링에 의한 하이브리다이제이션 효율의 저하가 문제이다. 또한, 1본쇄 DNA는 구상화하기 쉽고, 검출 감도가 뒤떨어진다는 문제도 갖고 있다. 특허문헌 1에서는, 가열 처리를 행하지 않고, 뉴클레아제 처리에 의해 1본쇄 핵산을 증폭하는 방법이 개시되어 있지만, 이것도 조작은 번잡하여, 1본쇄의 구상화의 문제가 있다.
핵산의 검출 방법 중에서도, 조작성이 뛰어나고, 신속, 간편한 표적 핵산의 검출 방법으로서, 특허문헌 2에 기재된 크로마토그래피에 의거한 방법이 있다. 이 방법은, 세포, 바이러스 또는 세균으로부터 유전자를 추출하는 공정, 임의 추출된 유전자의 단편화 공정, 및 검출 공정이, 단일의 유전자 검출 장치 상에서, 임의 추출된 유전자 또는 그 단편을 함유하는 액체 시료를 캐필러리 작용에 의해 이동시키는 것에 의해 연속하여 행해지는 유전자 검출 방법이다. 목적 유전자의 존부를 판단하고, 또한 그 종류를 동정하는 것이 가능해진다.
단, 특허문헌 2에서도 NASBA법에 의해 1본쇄 핵산을 증폭하고 있다. 1본쇄 핵산의 사용상의 과제는 상술과 같다.
상기의 문제를 해결하기 위해, 특허문헌 3 및 특허문헌 4에서는, 프라이머 영역의 5' 측에 DNA 폴리머라제에 의한 핵산 합성을 저해하는 비천연형 핵산 태그, 헤어핀 구조, 또는 슈도노트(pseudo-knot) 구조를 가짐으로써, PCR 반응 후에도 2본쇄 핵산의 편방에 1본쇄 영역을 남기고 있다. 특수한 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 행하는 것만으로, 2본쇄 DNA의 편방의 말단에 하이브리다이제이션 가능한 1본쇄 영역을 갖는 증폭 산물이 제작 가능하다는 점에서 뛰어나 있다. 그러나, 검출에는 형광 표지나, 표면 플라스몬 공명차 이미징에 의한 검출이 필요하기 때문에, 고가인 전용 장치가 필요하며, 신속성, 간편성의 면에서 문제가 있다.
일본 특개평5-252998호 공보 일본 특개2006-201062호 공보 국제공개 제2006/095550호 팸플릿 일본 특개2009-296948호 공보
Analytical biochemistry, 193, 231-235, (1991)
임상 현장에 있어서의 유전자 진단이나 검사에 있어서는, 검사 장치가 대형 또한 고가인 것, 및, 검사 시간을 요함으로써, 환자의 검사 비용이나 수 회의 통원으로의 수고나 부담을 요하는 것이 많다. 그래서, 검사의 정확성을 유지하면서도 환자 및 검사자의 부담을 경감할 필요가 있다는 이유로부터, 간편, 신속 또한 특이성이 높은 방법, 저비용으로 특수한 장치를 필요로 하지 않는 방법이 요구된다. 본 발명은, 상기 문제에 감안하여 이루어진 것으로서, 그 목적은 하이브리다이제이션법의 특이성이 높음을 활용하고, 또한, PCR 산물의 검출 공정에 요하는 시간과 공정을 줄이고, 특수한 장치를 필요로 하지 않고, 간편 또한 고정밀도로, 목시(目視)로 검출하는 핵산 검출 방법, 및 핵산 검출 디바이스 또는 키트를 제공하는 것을 과제로 한다. 또한, 지금까지는 고가인 표지 태그를 표적 핵산마다 제작할 필요가 있고, 수고와 비용면에서 개선의 여지가 있었다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 검토를 행한 결과, 표적 핵산을, 양말단 각각에 1본쇄 영역을 갖는 2본쇄 핵산으로서 증폭하고, 당해 증폭 단편을, 상기 1본쇄 영역의 한쪽과 하이브리다이제이션할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 갖는 고상과 결합시키고, 이것을 검출하는 것에 의해, 특수한 장치를 필요로 하지 않고, 상기 DNA 증폭 단편을 간편 또한 고정밀도로 검출할 수 있는 것을 독자적으로 알아내어, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
즉, 본 발명은, 양말단에 천연 뉴클레오티드를 포함하는 1본쇄 영역을 갖는 2본쇄 DNA 증폭 단편의 한쪽의 1본쇄 영역과, 고상 상에 고정한 제1 올리고뉴클레오티드 프로브를, 하이브리다이즈시키는 공정을 포함하는 핵산 검출 방법에 관한 것이다.
상기 DNA 증폭 단편의 다른 쪽의 1본쇄 영역과, 표지 물질이 결합한 제2 올리고뉴클레오티드 프로브를, 하이브리다이즈시키는 공정을 더 포함하는 것이 바람직하다.
표지 물질이 착색 담체(擔體)로 이루어져, 상기 DNA 증폭 단편을 목시 검출할 수 있는 것이 바람직하다.
상기 DNA 증폭 단편을 핵산 검출 디바이스 상에서 검출하는 공정을 포함하는 것이 바람직하다.
크로마토그래피로 상기 DNA 증폭 단편을 검출하는 것이 바람직하다.
하기 공정(a)∼(c) :
(a) 상기 핵산 검출 디바이스 상의, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정되어 있는 영역과는 다른 영역에, 상기 DNA 증폭 단편을 배치하는 공정,
(b) 용매를 사용하여, 상기 DNA 증폭 단편을, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정되어 있는 영역의 방향에, 상기 디바이스 상에서 확산시키는 공정, 및
(c) 상기 제1 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정되어 있는 영역에 있어서, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 프로브와, 상기 DNA 증폭 단편을, 하이브리다이즈시키는 공정
을 포함하는 것이 바람직하다.
상기 공정(c) 전에, 상기 DNA 증폭 단편과, 상기 표지 물질이 결합한 제2 올리고뉴클레오티드 프로브를 하이브리다이즈시키는 공정을 더 포함하는 것이 바람직하다.
(d) 상기 핵산 검출 디바이스 상의, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정되어 있는 영역과는 각각 다른 영역에, 상기 DNA 증폭 단편, 및 상기 표지 물질이 결합한 제2 올리고뉴클레오티드 프로브를 각각 배치하고,
(e) 용매를 사용하여, 상기 DNA 증폭 단편을, 상기 표지 물질이 결합한 제2 올리고뉴클레오티드 프로브가 배치되어 있는 영역의 방향으로 확산시키고,
(f) 상기 표지 물질이 결합한 제2 올리고뉴클레오티드 프로브가 배치되어 있는 영역에 있어서, 상기 DNA 증폭 단편과, 표지 물질이 결합한 제2 올리고뉴클레오티드 프로브를 하이브리다이즈시키고,
(g) 공정(f)에서 하이브리다이즈한 복합체를 상기 제1 올리고뉴클레오티드 프로브가 배치되어 있는 방향으로, 전개 매체 상에서 확산시키고,
(h) 상기 제1 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정되어 있는 영역에 있어서, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 프로브와 상기 복합체를 하이브리다이즈시키는 것이 바람직하다.
상기 천연 뉴클레오티드를 포함하는 1본쇄 영역이, 2본쇄 DNA 영역과 동일 방향으로 이루어지는 서열인 것이 바람직하다.
상기 DNA 증폭 단편은, 핵산 증폭 반응에 있어서 2본쇄화되지 않는 태그 영역을 갖는 2개의 프라이머를 사용하여 핵산 증폭법에 의해 얻어진 산물인 것이 바람직하다.
상기 DNA 증폭 단편이, 표적 핵산의 주형에 하이브리다이즈 가능한 서열, 및, 당해 주형에 하이브리다이즈 불가능한 공통 서열을 갖는 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트, 및, 상기 공통 서열의 상보 서열과 하이브리다이즈 가능한 서열, 및 핵산 증폭 반응에 있어서 2본쇄화되지 않는 태그 영역을 갖는 프라이머를 포함하는 제2 프라이머 세트를 사용하여, 핵산 증폭법에 의해 얻어진 산물인 것이 바람직하다.
상기 핵산 증폭 반응에 있어서 2본쇄화되지 않는 태그 영역이, 천연 뉴클레오티드로 이루어지고, 제2 프라이머 세트의 프라이머 전장(全長)이 동일 방향으로 이루어지는 서열인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은, 상기 핵산 검출 방법에 사용하는 핵산 검출 디바이스로서, 상기 DNA 증폭 단편을 배치하는 영역, 상기 DNA 증폭 단편과 결합하는 상기 제1 올리고뉴클레오티드 프로브를 유지한 크로마토그래피 담체, 및, 표지 물질이 결합한 상기 제2 올리고뉴클레오티드 프로브를 구비하여 이루어지는 검출 디바이스에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 핵산 증폭 반응에 있어서 2본쇄화되지 않는 태그 영역을 갖는 2개의 프라이머를 사용하여 핵산 증폭법에 의해 얻어지는, 양말단에 천연 뉴클레오티드를 포함하는 1본쇄 영역을 갖는 2본쇄 DNA 증폭 단편에 관한 것이다.
프라이머의 핵산 증폭 반응에 있어서 2본쇄화되지 않는 태그 영역이, 천연 뉴클레오티드로 이루어지고, 프라이머 전장이 동일 방향으로 이루어지는 서열인 것이 바람직하다.
본 발명에 따르면, DNA 증폭 산물의 1본쇄 영역을 이용하여 특이적으로 고상과 결합시킬 수 있고, 또한 다른 한쪽의 1본쇄 영역을 이용하여 표지 화합물과의 복합체를 형성할 수 있으며, 특수한 장치를 사용하지 않고 DNA 증폭 산물을 간편, 신속하게 목시 판정하는 것이 가능해진다. 또한, 구조적으로 안정한 2본쇄 DNA를 검출하는 것에 의해, 전장 1본쇄의 검출과 비교하여 검출 감도가 향상된다. 또한, 고상에 결합시키기 위한 증폭 산물의 1본쇄 영역과, 이것에 상보적인 고상 상의 올리고뉴클레오티드 프로브의 조합을 복수종 준비함으로써, 시료 중에 존재하는 2종 이상의 표적 핵산을 동시에 판별하는 것도 가능해진다. 또한, 본 발명의 다른 태양을 사용하여 저렴한 조인트 프라이머를 개재하는 것에 의해 모든 표적 핵산에 동일한 1본쇄 영역을 부가하는 것이 가능해진다. 그 동일한 1본쇄 영역을 이용하여, 동일한 표지 태그 및 디바이스를 사용하여 검출이 가능해진다. 이 경우, 고가인 표지 태그를 표적 핵산마다 제작할 필요가 없고, 수고와 비용을 대폭 개선할 수 있다.
도 1은 본 발명의 PCR용 프라이머의 개념도.
도 2는 본 발명의 PCR용 제1 프라이머의 개념도.
도 3은 본 발명의 PCR용 제2 프라이머의 개념도.
도 4는 본 발명에 있어서의 부분 2본쇄 핵산의 합성법의 개념도.
도 5는 본 발명에 있어서의 부분 2본쇄 핵산의 합성법의 다른 태양의 개념도.
도 6은 본 발명의 핵산 크로마토그래피 디바이스의 일례를 나타내는 개략도.
도 7은 본 발명에 있어서의 PCR 산물 검출 원리의 개념도.
도 8은 본 발명의 마이크로어레이(DNA칩)의 일례를 나타내는 개략도.
도 9는 본 발명의 비드 담체의 일례를 나타내는 개략도.
본 발명은, 양말단에 천연 뉴클레오티드를 포함하는 1본쇄 영역을 갖는 2본쇄 DNA 증폭 단편의 한쪽의 1본쇄 영역과, 고상 상에 고정한 제1 올리고뉴클레오티드 프로브를, 하이브리다이즈시키는 공정을 포함하는 핵산 검출 방법에 관한 것이다.
2본쇄 DNA 증폭 단편은, 주형이 되는 시료 DNA에 대하여, 특정한 프라이머 세트를 사용하여 핵산 증폭 반응을 행하는 것에 의해 얻어진다.
시료 DNA는 특별히 한정되지 않고, 핵산 증폭 반응의 주형으로서 사용할 수 있으면 된다. 구체적으로는, 혈액, 체액, 조직, 구강 내 점막, 모발, 손톱, 배양 세포, 동물, 식물, 미생물 등의 모든 생물 시료 유래의 DNA를 사용할 수 있다. 또한, 상기 시료 DNA는 게놈 DNA, cDNA, 미토콘드리아 DNA, 및 엽록체 DNA 등이어도 된다. 또한, RNA를 주형에 역전사 후에 얻어진 cDNA를 사용할 수도 있다. 이들 DNA는, 증폭시키는 DNA 단편에 따라, 적시 선택하면 된다. 또한, 시료 DNA는 정제된 DNA일 필요는 없고, 시료 DNA를 포함하는 세포나 조직을, 정제 처리하지 않고, 그대로 핵산 증폭 반응에 적용할 수 있다.
양말단에 1본쇄 영역을 갖는 2본쇄 DNA 증폭 단편은, 핵산 증폭 반응에 있어서 2본쇄화되지 않는 태그 영역을 갖는 2개의 프라이머를 사용하여 핵산 증폭법에 의해 얻어진 산물인 것이 바람직하다. 이 경우에 있어서, 2본쇄 DNA 증폭 단편의 양말단의 1본쇄 영역은, 핵산 증폭 반응에 사용하는 프라이머 중, 핵산 증폭 반응에 의해 2본쇄화되지 않는 태그 영역에 유래하는 영역이다.
도 1에 핵산 증폭용 프라이머를 나타낸다. 이 프라이머는, 프라이머 본체 영역(1)과, 상기 프라이머 본체부의 5' 측에 핵산 증폭 반응에 의해 2본쇄화되지 않는 태그 영역(2)으로 이루어진다. 또한, 프라이머 본체 영역과 태그 영역 사이에, 폴리머라제 반응 저해 영역(3)으로 이루어지는 스페이서 구조를 갖고 있어도 된다.
또한, 2본쇄 DNA 증폭 단편은, 표적 핵산의 주형에 하이브리다이즈 가능한 서열, 및, 당해 주형에 하이브리다이즈 불가능한 공통 서열을 갖는 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트, 및, 상기 공통 서열의 상보 서열과 하이브리다이즈 가능한 서열, 및 핵산 증폭 반응에 있어서 2본쇄화되지 않는 태그 영역을 갖는 프라이머를 포함하는 제2 프라이머 세트를 사용하여, 핵산 증폭법에 의해 얻어진 산물인 것이 바람직하다. 도 2에 PCR용 제1 프라이머 세트를 구성하는 프라이머를 나타낸다. PCR용 제1 프라이머(조인트 프라이머)는, 표적 핵산의 주형에 하이브리다이즈 가능한 프라이머 본체 영역(4)과, 상기 프라이머 본체 영역의 5' 측에 제2 프라이머와 공통의 서열로 이루어지는 공통 영역(5)으로 이루어지는 것을 특징으로 한다. 도 3에 PCR용 제2 프라이머 세트를 구성하는 프라이머를 나타낸다. 제2 프라이머는, 상기 제1 프라이머와 공통인 서열을 갖는 프라이머 본체 영역(6)과, 본체 영역(6)의 5' 측에 핵산 증폭 반응에 의해 2본쇄화되지 않는 태그 영역(7)으로 이루어지는 것을 특징으로 한다. 제2 프라이머 본체 영역과 태그 영역 사이에, 폴리머라제 반응 저해 영역(8)으로 이루어지는 스페이서 구조를 갖고 있어도 된다.
프라이머 본체 영역이란, 핵산 증폭 반응에 있어서의 프라이머로서 기능할 수 있는 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 영역을 의미한다. 구체적으로는, 표적 핵산의 표적 염기 서열에 있어서의 5' 말단 측 또는 3' 말단 측과 하이브리다이즈할 수 있는 서열이며, 일반적으로는, 표적 염기 서열의 5' 말단 측 또는, 3' 말단 측의 염기 서열과 상보적인 염기 서열이다. 이들의 프라이머 본체 영역은, 표적 핵산과 특이적으로 결합 가능하면, 염기 결손이나 삽입, 및 미스 매치 부위를 갖고 있어도 된다. 프라이머 본체 영역의 길이는, 8염기 이상인 것이 바람직하고, 12염기 이상인 것이 보다 바람직하고, 15염기 이상인 것이 더 바람직하다. 또한, 프라이머의 쇄 길이에는 특별히 상한은 없지만, 그 합성의 비용 등의 관점에서, 통상은 50염기 이하, 혹은 40염기 이하인 것이 호적하다.
프라이머의 태그 영역은, 천연 뉴클레오티드를 포함하는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 천연 뉴클레오티드란, 천연 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 우라실의 염기, 및, 디옥시리보오스, 리보오스의 당부, 및, 인산기로 구성되는 뉴클레오티드이며, 각 부분이 인공적인 수식을 받고 있지 않은 뉴클레오티드이다. 천연 뉴클레오티드는, D형 뉴클레오티드여도 되며, L형 뉴클레오티드여도 된다. D형 뉴클레오티드란, D형의 디옥시리보오스 혹은 리보오스로 이루어지는 뉴클레오티드를 나타낸다. 또한, L형 뉴클레오티드란, L형의 디옥시리보오스 혹은 리보오스로 이루어지는 뉴클레오티드를 나타낸다. 태그 영역이 천연 뉴클레오티드를 포함하는 것에 의해, 합성이 저렴하며 용이하다는 효과를 나타낸다. 또한, 프라이머의 태그 영역에 있어서의 천연 뉴클레오티드의 비율은, 5% 이상인 것이 바람직하고, 20% 이상인 것이 보다 바람직하고, 50% 이상인 것이 더 바람직하고, 70% 이상인 것이 보다 더 바람직하고, 90% 이상인 것이 가장 바람직하다. 태그 영역의 길이는 특별히 한정되지 않고, 상보쇄 핵산과 하이브리다이즈하기 위하여 충분한 길이를 갖고 있으면 된다. 통상, 5염기∼60염기이며, 바람직하게는 6염기∼40염기이다.
프라이머의 태그 영역의 핵산의 방향은 프라이머 본체 영역과 동일 방향으로 배열되어 있는 것이 바람직하다. 프라이머의 태그 영역의 핵산의 방향이 프라이머 본체 영역과 동일 방향으로 배열되는 것에 의해, 합성이 저렴하며 용이하다는 효과를 나타낸다. 예를 들면, 아조벤젠과 같은 비천연 화합물이 태그 영역과 프라이머 본체 영역 사이에 들어 있는 경우와 같이, 태그 영역과 프라이머 본체 영역이 직접 연결되지 않아도, 동일 방향으로 배열되어 있는 것이 바람직하다. 여기에서, 핵산이 동일 방향이라는 것은, 인접하는 뉴클레오티드끼리가, 뉴클레오티드 중의 당의 3' 위치끼리나 5' 위치끼리가 아닌, 5' 위치와 3' 위치 사이에서 포스포디에스테르 결합하고 있는 것을 말한다. 예를 들면, 태그 영역에 있어서, 뉴클레오티드끼리가 포스포디에스테르 결합에 의해 당의 5' 위치와 3' 위치 사이에서 결합되어 있을 경우에는, 본체 영역에 있어서도, 뉴클레오티드끼리가 당의 5' 위치와 3' 위치 사이에서 형성되어 있는 것을 말한다.
폴리머라제 반응 저해 영역이란, 폴리머라제에 의한 핵산 신장 반응을 저해하고, 당해 영역을 1본쇄 구조로 유지하는 것이 가능하면 특별히 한정되지 않는다. 이러한 구조에는, 강고한 헤어핀 구조나 슈도노트 구조와 같이 폴리머라제의 진행을 저해하는 입체 구조를 갖는 핵산 서열이나, L형 핵산이나 인공 핵산 등의 비천연형 핵산이나, RNA, 및, 지방쇄와 같은 비핵산 구조가 포함된다.
「헤어핀 구조」나 「슈도노트 구조」란, 동일 분자 내의 다른 1본쇄 영역과 대합하여 형성되는, 안정한 루프 구조를 의미한다. L형 DNA는, L형의 디옥시리보오스로 이루어지는 DNA이며, 일반적으로 사용되고 있는 DNA 폴리머라제에 인식되지 않으므로, DNA 신장 반응의 주형으로서 기능하지 않는다. 또한, L형 DNA는 반시계 방향의 이중 나선 구조를 형성하므로, 천연에 존재하는 D형 핵산과 하이브리드를 형성하는 일은 없고, L형 핵산끼리로만 하이브리드를 형성할 수 있다. 인공 핵산이란, 천연 핵산 서열 중에 존재하지 않는 화합물을 인공적으로 삽입한 것을 의미한다. 예를 들면, 펩티드 핵산(PNA), 가교화 핵산(BNA 혹은 LNA) 또는 아조벤젠, Fluorescein, Cy3, Cy5 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
PNA란 주쇄에 펩티드 구조를 유지한, DNA나 RNA를 닮은 구조를 갖는 분자이며, N-(2-아미노에틸)글리신이 아미드 결합으로 결합한 것이 주쇄로 되어 있다. 그리고, 핵산 염기에 상당하는 푸린환이나 피리미딘환이, 메틸렌기와 카르보닐기를 통하여 주쇄에 결합하고 있다. BNA(LNA)란, DNA 혹은 RNA의 당부 구조를 가교 수식하는 것에 의해 인공적으로 합성한 핵산을 나타낸다.
태그 영역이 천연 뉴클레오티드만으로 이루어지고, 태그 영역의 핵산의 방향이 프라이머 본체 영역과 같은 방향인 경우에는, 통상, 프라이머 영역 사이에 폴리머라제 반응 저해 영역을 요한다. 한편, 태그 영역이 L형 핵산이나 인공 핵산 등과 같이, DNA 폴리머라제에 의한 반응의 주형이 되지 않고 핵산 증폭 반응 후에도 2본쇄화되지 않을 경우에는, 폴리머라제 반응 저해 영역은 생략하는 것도 가능하다. 또한, 본 발명의 프라이머는, 헤어핀 구조, 슈도노트 구조 등의 안정한 루프 구조, L형 핵산, 인공 핵산 등의 비천연 핵산, 및 지방쇄 등의 비핵산 구조 등을 단독으로 갖는 것이어도 되며, 복수를 조합시켜서 갖는 것이어도 된다.
프라이머는, 올리고뉴클레오티드의 표지에 통상 사용되는 다양한 분자에 의해 표지하는 것도 가능하다. 이러한 분자로서는, 효소, 자성 입자, 형광 색소, 방사성 동위 원소 등을 들 수 있다. 이들을 단독으로 사용해도 되며, 복수를 조합시켜서 사용해도 된다.
설계한 프라이머를 제조하는 방법은, 특별히 한정되는 것은 아니며, 공지의 방법에 의해 제조할 수 있다. 구체적으로는, DNA 합성 장치를 사용하거나, 수탁 합성 서비스를 이용함으로써, 설계한 프라이머를 용이하게 얻을 수 있다.
핵산 증폭법은, 상술의 프라이머를 사용하여, 양말단에 천연 뉴클레오티드를 포함하는 1본쇄 영역을 갖는 2본쇄 DNA 증폭 단편이 얻어지는 방법이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, PCR을 들 수 있다. 또한, LAMP법, ICAN법 등의 등온 증폭법도 사용할 수 있다.
핵산 증폭법으로서 PCR을 사용하는 경우, PCR 반응에 사용하는 리버스 프라이머와 포워드 프라이머의 조합으로서는, 양쪽의 프라이머에 다른 폴리머라제 반응 저해 영역을 사용해도 되며, 편방에 폴리머라제 반응 저해 영역을 사용하고, 또 다른 편방에는 폴리머라제 반응 저해 영역을 도입하지 않고 비오틴 등의 수식을 행해도 된다.
PCR 조건은 특별히 한정되는 것은 아니며, 상술한 시료 DNA를 주형으로서, 상기 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 행했을 때에, 시료 DNA의 소망의 영역이 증폭되는 조건이면 된다. 구체적으로는, PCR에 사용하는 폴리머라제는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 내열성 DNA 폴리머라제인 것이 보다 바람직하고, 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 실질적으로 갖지 않는 내열성 DNA 폴리머라제인 것이 보다 바람직하다. 이러한 내열성 DNA 폴리머라제로서는, Ex-Taq(다카라바이오사제) 등을 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 또한, 온도, 시간, 완충액 조성 등의 PCR의 반응 조건도 특별히 한정되는 것은 아니며, 선택한 DNA 폴리머라제, 프라이머의 서열, 목적 서열 부분의 길이 등에 따라, 적의 설정하면 된다. 핵산 증폭 반응에 의해 증폭되는 DNA의 길이는, 20염기 이상인 것이 바람직하고, 40염기 이상인 것이 보다 바람직하다. 20염기 미만이면 비특이적 증폭이 늘어나는 경향이 있다.
상기 프라이머 세트를 사용하여, 정법(定法)에 의해 PCR을 행함으로써, 표적 핵산 서열의 양말단에 1본쇄 영역을 부가한 증폭 산물을 얻을 수 있다. 도 4에는, 증폭 반응의 일례로서, 프라이머 본체 영역과 태그 영역으로 이루어지는 프라이머를 사용했을 경우의 증폭 반응의 모식도를 나타낸다. 포워드 프라이머(10)는 표적 핵산 서열(9)의 5' 말단 측의 일부와 동일한 서열로 이루어지는 프라이머 본체 영역(11)과, 그 5' 말단 측에 태그 영역(12)을 갖는다. 리버스 프라이머(13)는, 표적 핵산 서열의 3' 말단 측의 일부와 상보적인 서열로 이루어지는 프라이머 본체 영역(14)과, 그 5' 말단 측에 태그 영역(15)을 갖는다. 양 프라이머에 결합하는 태그 영역의 서열은 통상, 각각 다른 서열을 갖고 있다. 상기 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 행하면, 양 프라이머에 부가된 태그 영역은 실질적으로 PCR 반응에 관여하지 않기 때문에, 양말단에 1본쇄 영역을 갖는 DNA 증폭 산물(16)이 얻어진다. 양말단에 1본쇄 영역을 갖는 DNA 증폭 단편이란, 도 4에서 나타낸 바와 같이 표적 DNA 영역과 동일한 2본쇄 DNA부, 및, 그 양측의 각각의 5' 말단에 태그부로서 1본쇄 영역을 갖는 DNA 증폭 산물을 의미한다. 즉, 상기 DNA 증폭 단편을 보다 상세히 설명하면, 양말단에 수식되고 있지 않은 핵산으로 구성되는 1본쇄 영역을 갖는 2본쇄 DNA 증폭 단편을 나타내고 있으며, 또한, 양말단의 1본쇄 영역은 각각 연속하는 DNA쇄와 동일 방향으로 이루어지는 서열을 갖고 있다.
도 5에는, 증폭 반응의 일례로서, 조인트 프라이머 세트로서 프라이머 본체 영역과 공통 서열 영역으로 이루어지는 프라이머, 및, 공통 서열과 태그 영역으로 이루어지는 프라이머를 사용했을 경우의 증폭 반응의 모식도를 나타낸다. 제1, 및, 제2 프라이머 세트를 사용하여, 정법에 의해 PCR을 행함으로써, 표적 핵산 서열의 양말단에 1본쇄 영역을 부가한 증폭 산물을 얻을 수 있다.
포워드 제1 프라이머(18)는 표적 핵산 서열(17)의 5' 말단 측의 일부와 동일한 서열로 이루어지는 프라이머 본체 영역(19)과, 그 5' 말단 측에 공통 서열 영역(20)을 갖는다. 리버스 제1 프라이머(21)는, 표적 핵산 서열의 3' 말단 측의 일부와 상보적인 서열로 이루어지는 프라이머 본체 영역(22)과, 그 5' 말단 측에 공통 서열 영역(23)을 갖는다. 양 프라이머에 부가하는 공통 영역의 서열은 통상, 각각 다른 서열을 갖고 있다. 상기 제1 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 행하면 공통 영역을 갖는 2본쇄 DNA 증폭 산물(24)이 얻어진다.
또한 DNA 증폭 산물(24)의 양단의 공통 서열 영역의 포워드 제2 프라이머(25)는 상기 공통 영역을 갖는 2본쇄 DNA 증폭 산물(24)의 5' 말단 측의 일부와 공통인 서열로 이루어지는 프라이머 본체 영역(26)과, 그 5' 말단 측에 태그 영역(27)을 갖는다. 리버스 제2 프라이머(28)는, 상기 공통 영역을 갖는 2본쇄 DNA 증폭 산물(24)의 3' 말단 측의 일부와 공통인 상보적인 서열로 이루어지는 프라이머 본체 영역(29)과, 그 5' 말단 측에 태그 영역(30)을 갖는다. 양 프라이머에 결합하는 태그 영역의 서열은 통상, 각각 다른 서열을 갖고 있다. 상기 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 행하면, 양 프라이머에 부가된 태그 영역은 실질적으로 PCR 반응에 관여하지 않기 때문에, 양말단에 1본쇄 영역을 갖는 DNA 증폭 산물(31)이 얻어진다. 본 태양에 있어서는, 제1 프라이머를 사용한 PCR 반응, 및, 제2 프라이머를 사용한 PCR 반응을 도 5와 같이 연속하여 행하지만, 그 순번은, 제1 프라이머와 제2 프라이머를 동시에 가해도 된다. 혹은, 제2 프라이머를 나중에 가해도 된다.
양말단에 1본쇄 영역을 갖는 DNA 증폭 단편이란, 도 5의 31로 나타낸 바와 같이 표적 DNA 영역과 동일한 2본쇄 DNA부, 및, 그 양측의 각각의 5' 말단에 태그부로서 1본쇄 영역을 갖는 DNA 증폭 산물을 의미한다.
제1, 및, 제2 프라이머 세트를 사용하는 것에 의해, 표적 핵산을 변경해도, 공통 서열을 동일한 서열로 해둠으로써, 제2 프라이머는 동일한 프라이머를 사용할 수 있고, 동일한 1본쇄 태그 서열을 만들어 내는 것이 가능해진다. 상기 DNA 증폭 단편을 보다 상세히 설명하면, 양말단에 수식되고 있지 않은 핵산으로 구성되는 1본쇄 영역을 갖는 2본쇄 DNA 증폭 단편을 나타내고 있으며, 또한, 양말단의 1본쇄 영역은 각각 연속하는 DNA쇄와 동일 방향으로 이루어지는 서열을 갖고 있다.
상기 프라이머를 사용하여 얻어진, 상기 증폭 산물의 1본쇄 영역을 이용하여, 하이브리다이제이션 복합체를 형성한다. 하이브리다이제이션이란 핵산을 포함하는 분자가 상보적으로 복합체를 형성하는 것을 말하고, DNA/DNA 외, DNA/RNA, DNA/PNA, L-DNA/L-DNA 등이 포함된다. 본 발명의 핵산 검출 방법에서는 DNA 증폭 단편이 1본쇄 영역을 가지므로, 핵산 증폭 공정에서 얻어진 DNA 증폭 산물은, 열처리 등의 1본쇄화 처리 등을 행하지 않고, 하이브리다이제이션 반응에 사용할 수 있다.
양말단에 천연 뉴클레오티드를 포함하는 1본쇄 영역 태그를 갖는 2본쇄 DNA 증폭 단편의 한쪽의 1본쇄 영역과, 포착용 담체(고상)에 고정한 제1 올리고뉴클레오티드 프로브를 하이브리다이즈시킬 수 있다. 또한, 2본쇄 DNA 증폭 단편의 다른 쪽의 1본쇄 영역과, 표지 물질이 직접적 또는 간접적으로 결합한 제2 올리고뉴클레오티드 프로브를 하이브리다이즈하는 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 2본쇄 DNA 증폭 단편, 제1 올리고뉴클레오티드 프로브, 및 제2 올리고뉴클레오티드 프로브로 이루어지는 3자 복합체 형성을 샌드위치 하이브리다이제이션이라고 부른다. 또, 3자의 하이브리다이제이션의 순서는 특별히 한정되지 않는다.
제1 올리고뉴클레오티드 프로브의 길이는, 2본쇄 DNA 증폭 단편의 1본쇄 영역과 하이브리다이즈할 수 있으면 특별히 한정되지 않지만, 5∼60염기 길이인 것이 바람직하고, 10∼40염기 길이인 것이 보다 바람직하다.
제2 올리고뉴클레오티드 프로브의 길이는, 2본쇄 DNA 증폭 단편의 1본쇄 영역과 하이브리다이즈할 수 있으면 특별히 한정되지 않지만, 5∼60염기 길이인 것이 바람직하고, 10∼40염기 길이인 것이 보다 바람직하다.
제2 올리고뉴클레오티드 프로브에 결합하는 표지 물질은, 2본쇄 DNA 증폭 단편의 검출을 실현하는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 착색 담체로서 2본쇄 DNA 증폭 단편의 목시 검출을 실현할 수 있는 것이 바람직하다. 이러한 착색 담체로서는, 착색 입자나 효소, 색소 결합 담체 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 착색 입자를 사용하는 것이 바람직하다.
착색 입자로서는, 금, 은, 구리, 백금 등의 금속으로 이루어지는 콜로이드 입자나, 안료나 염료 등으로 라텍스를 착색하여 이루어지는 착색 라텍스, 색소 분자를 실리카(이산화규소) 입자 내부에 고정화한 실리카 나노 입자 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 금 콜로이드 입자나, 청색, 적색 등으로 착색된 수분산형 고분자 중합체로 이루어지는 착색 라텍스 입자를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 착색 입자를 사용하는 것에 의해, DNA 증폭 단편의 목시 판정을 보다 용이한 것으로 할 수 있다. 특히 다항목을 동시에 검출할 때에는, 항목마다 다른 색의 착색 입자를 사용하는 것에 의해, 다수의 항목을 동시에 목시 판정하는 것이 용이해진다.
착색 입자를 사용하는 경우, 그 입경은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 샌드위치 하이브리다이제이션 복합체의 형성, 및, 표적 서열을 포함하는 증폭 산물의 고상에의 포착에 악영향이 작고, 또한, 검출 시에 발색이 좋은 것이 바람직하다. 착색 입자의 입경은, 후술의 크로마토그래피용 매체의 공경보다 작은 입경으로부터 선택된다. 구체적으로는, 통상 500㎚ 이하가 사용되고, 그 중에서도 0.1㎚∼100㎚로 하는 것이 바람직하고, 1㎚∼50㎚로 하는 것이 보다 바람직하다. 착색 담체로서 사용하는 효소란, 발색, 혹은, 발광하는 기질의 반응을 촉매하는 단백질이다. 예를 들면, 퍼옥시다아제, 알칼리포스파타아제, 루시페라아제 등을 들 수 있지만, 육안으로 검출 가능하면 이것에 한정되지 않는다.
2본쇄 DNA 증폭 단편의 말단의 1본쇄 영역과, 제1 또는 제2 올리고뉴클레오티드 프로브와의 하이브리다이제이션 조건은, 하이브리다이제이션이 일어나는 조건이면 특별히 한정되지 않지만, 실온하, 10mM 인산 완충액 중에서 반응시키는 것이 바람직하다. 이때 염화나트륨 등의 염을 넣음으로써, 하이브리다이제이션의 효율은 상승한다.
포착용 담체(고상) 상의 인식 가능한 위치에 형성된 샌드위치 하이브리다이제이션 복합체에 포함되는 표지 물질을 검출하는 것에 의해, 표적 핵산의 유무를 판정할 수 있다. 검출은, 목시로 판별하는 것이 바람직하다. 본 발명의 검출법에 따르면, 핵산 증폭 반응의 증폭 산물은 열변성 등의 1본쇄화 처리를 행하지 않고, 그대로 하이브리다이제이션 반응에 사용하는 것이 가능하다. 또한, 특수한 장치를 필요로 하지 않고, 표적 핵산의 유무를 간편, 신속하게 목시로 판별하는 것이 가능하다.
상기의 샌드위치 하이브리다이제이션 복합체의 형성에 의한 핵산 검출 방법은, 핵산 검출 디바이스 상에서 행해지는 것이 바람직하다. 또한, 크로마토그래피로 DNA 증폭 핵산이 검출되는 것이 바람직하다.
도 6의 핵산 크로마토그래피 디바이스는, 기재가 되는 부재(36) 상에, 샘플 패드(32)(DNA 증폭 산물을 첨가하기 위한 담체), 컨쥬게이트 패드(33)(착색 담체 결합 올리고뉴클레오티드를 배치한 담체), 포착용 올리고뉴클레오티드를 유지한 담체(34)(크로마토그래피용 매체), 및 흡수 패드(35)를, 점착제 등을 사용하여 첩합(貼合)한 것이다. 담체(34) 상에는, 포착용 올리고뉴클레오티드를 도포한 테스트 라인(37), 및, 컨트롤 라인(38)이 마련되어 있다. 착색 담체 결합 올리고뉴클레오티드를 전개 용액에 혼합하는 경우는, 컨쥬게이트 패드(33)가 없어도 된다.
크로마토그래피로는, 하기 공정(a)∼(c) : (a) 핵산 검출 디바이스 상의, 제1 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정되어 있는 영역과는 다른 영역에, DNA 증폭 단편을 배치하는 공정, (b) 용매를 사용하여, DNA 증폭 단편을, 제1 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정되어 있는 영역의 방향으로, 디바이스 상에서 확산시키는 공정, 및 (c) 제1 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정되어 있는 영역에 있어서, 제1 올리고뉴클레오티드 프로브와 DNA 증폭 단편을 하이브리다이즈시키는 공정을 포함하는 방법에 의해, 2본쇄 DNA 증폭 단편이 검출되는 것이 바람직하다.
예를 들면, 도 6의 핵산 크로마토그래피 디바이스의 경우, 공정(a)에서는 샘플 패드(32)에 DNA 증폭 단편을 배치한다. 공정(b)에서는 화살표 방향으로 DNA 증폭 단편을 확산시킨다. 공정(c)에서는 테스트 라인(37)에 있어서, 고정된 제1 올리고뉴클레오티드 프로브와의 하이브리다이즈에 의해, DNA 증폭 단편을 포착한다.
공정(c) 전에, DNA 증폭 단편과, 표지 물질이 결합한 제2 올리고뉴클레오티드 프로브를 하이브리다이즈시키는 공정을 더 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 도 6의 핵산 크로마토그래피 디바이스의 경우, 컨쥬게이트 패드(33)에 있어서, DNA 증폭 단편과 제2 올리고뉴클레오티드 프로브를 하이브리다이즈시킨다.
또한, 크로마토그래피로는, (d) 핵산 검출 디바이스 상의, 제1 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정되어 있는 영역과는 각각 다른 영역에, DNA 증폭 단편, 및 표지 물질이 결합한 제2 올리고뉴클레오티드 프로브를 각각 배치하고, (e) 용매를 사용하여, DNA 증폭 단편을, 표지 물질이 결합한 제2 올리고뉴클레오티드 프로브가 배치되어 있는 영역의 방향으로 확산시키고, (f) 표지 물질이 결합한 제2 올리고뉴클레오티드 프로브가 배치되어 있는 영역에 있어서, DNA 증폭 단편과, 표지 물질이 결합한 제2 올리고뉴클레오티드 프로브를 하이브리다이즈시키고, (g) 공정(f)에서 하이브리다이즈한 복합체를 제1 올리고뉴클레오티드 프로브가 배치되어 있는 방향으로, 전개 매체 상에서 확산시키고, (h) 상기 제1 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정되어 있는 영역에 있어서, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 프로브와 상기 복합체를 하이브리다이즈시키는 것이 바람직하다.
예를 들면, 도 6의 핵산 크로마토그래피 디바이스의 경우, 공정(d)에서는 샘플 패드(32)에 DNA 증폭 단편을 배치하고, 컨쥬게이트 패드(33)에 제2 올리고뉴클레오티드 프로브를 배치한다. 공정(e)에서는, DNA 증폭 단편을, 샘플 패드(32)로부터 화살표 방향으로 확산시킨다. 공정(f)에서는 컨쥬게이트 패드(33)에 있어서, DNA 증폭 단편과, 제2 올리고뉴클레오티드 프로브가 하이브리다이즈한다. 공정(g)에서는 DNA 증폭 단편과, 표지 물질이 결합한 제2 올리고뉴클레오티드 프로브와의 하이브리다이즈에 의한 복합체를, 화살표 방향으로 확산시킨다. 공정(h)에서는 테스트 라인(37)에 있어서 제1 올리고뉴클레오티드 프로브와 복합체를 하이브리다이즈시킨다.
멤브레인 상의 테스트 라인에는 상기 DNA 증폭 단편의 한쪽의 태그 영역과 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브가, 포착용의 제1 올리고뉴클레오티드 프로브로서 고정화되어 있다. 포착용의 제1 올리고뉴클레오티드 프로브는, 직접 멤브레인에 결합해도 되며, 관능기를 통하여 결합하고 있어도 되며, 어떠한 물질을 통하여 멤브레인에 결합하고 있어도 된다. 그 중개가 되는 물질은, 펩티드, 단백질, 핵산 등을 들 수 있지만 한정되지 않는다. 중개가 되는 물질이 아비딘인 경우는, 포착용 올리고뉴클레오티드에 비오틴 수식이 필요해진다.
멤브레인 상의 컨트롤 라인에는, 착색 담체 포착용의 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정화되어 있다. 컨트롤 라인용의 올리고뉴클레오티드 프로브는, 표지 물질이 결합한 제2 올리고뉴클레오티드 프로브와 상보적인 서열을 갖고 있어, 용액이 전개하면 반드시 표지 물질이 포착되도록 되어 있다. 컨트롤 라인용의 올리고뉴클레오티드 프로브에 관해서도 상술과 같이 직접 멤브레인에 결합해도 되며, 관능기를 통하여, 결합하고 있어도 되며, 어떠한 물질을 통하여 멤브레인에 결합하고 있어도 된다. 그 중개가 되는 물질은, 펩티드, 단백질, 핵산 등을 들 수 있지만, 한정되지 않는다. 중개가 되는 물질이 아비딘인 경우는, 포착용 올리고뉴클레오티드에 비오틴 수식이 필요해진다.
테스트 라인에 있어서의 정색에 의해, 시료 중의 타겟 핵산의 존재를 목시로 판별하는 것이 가능하다. 한편, 컨트롤 라인에 있어서의 정색에 의해, 정상인 전개와 정색 반응을 행할 수 있는 것을 목시로 판별하는 것이 가능하다. 여기에서, 목시란 육안으로 관찰하여 색을 판단하는 것을 말한다.
크로마토그래피용 매체로서는, 정성 여과지, 정량 여과지, 분액 여과지, 유리 섬유 여과지, 실리카 섬유 여과지, 복합 섬유 여과지로 이루어지는 여과지 등을 들 수 있다. 또한, 니트로셀룰로오스 등의 셀룰로오스로 이루어지는 여과지나, 폴리에테르설폰 멤브레인 등의 합성 수지의 막이나, 실리카겔, 아가로오스, 덱스트란, 젤라틴 등의 다공질 겔도 사용할 수 있다. 또한, 나일론 멤브레인도 호적하게 사용할 수 있다. 실제의 사용에 있어서, 이 크로마토그래프 매체의 형태 및 크기는 특별히 제한되는 것은 아니며, 조작 및 반응 결과의 관찰에 있어서 적절하면 된다.
이들의 담체는, 친수성이나 화합물의 결합성을 향상시키기 위하여 다양한 수식을 실시하는 것도 가능하다. 조작을 보다 간편하게 하기 위해서는, 반응 부위가 표면에 형성되어 있는 크로마토그래피 매체의 이면에, 플라스틱 등으로 이루어지는 지지체를 마련하는 것이 바람직하다.
디바이스 내의 전개 방향으로서는, 도 6에 나타낸 바와 같이 수평 방향이어도 되며, 수직 방향이어도 되며 특별히 한정되지 않는다. 전개 용매로서는, 핵산 증폭 반응에 있어서의 용매를 사용할 수 있으므로, 핵산 증폭 반응 후의 반응액을 그대로, 도 6에 있어서의 샘플 패드(32)에 적하할 수 있다. 또는, 증폭 반응 후의 반응액에, 별도 전개 용액을 첨가하여 샘플 패드에 첨가하는 것도 가능하다. 전개 용매로서는, 액체이면 특별히 한정되지 않지만, 인산 완충액이나, Tris 완충액 등의 굿 완충액이 사용 가능하다. 또한, 용매에는 염, 계면 활성제, 단백질, 혹은, 핵산을 용해하여 두어도 된다.
도 7에서, 본 발명의 실시 형태의 일례로서, 크로마토 담체 상에서의 샌드위치 하이브리다이제이션 복합체의 형성을 예로 들어서 설명한다. 핵산 증폭 공정에서 얻어진 DNA 증폭 단편(16)은, 열처리 등의 1본쇄화 처리 등을 행하지 않고 다음 복합체 형성 공정에 사용한다. 상기 DNA 단편의 한쪽의 태그 영역(12)과 특이적으로 결합 가능한 핵산 서열(39) 및 착색 담체(40)를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브와, DNA 증폭 단편(16) 사이의 하이브리다이제이션에 의해, 제1 복합체(41)가 형성된다. 복합체(41)는, PCR의 반응 용기와 같이, 전개 매체에 어플라이 전에 형성해도 되며, DNA 증폭 단편을 담체 상에 어플라이하고, 모세관 현상에서 이동 중에 상기 표지 분자 결합 올리고뉴클레오티드를 도포, 건조시킨 담체를 통과시켜서 형성하는 것도 가능하다.
복합체(41)는, 다공질 멤브레인 등으로 이루어지는 크로마토그래피용 매체(42) 상의 식별 가능한 위치에 미리 결합한 포착용 올리고뉴클레오티드 프로브(43)와, 전개 매체 상에서 접촉한다. 상기 포착용의 올리고뉴클레오티드(43)는, 상기 DNA 증폭 단편의 또 다른 한쪽의 태그 서열(15)과 상보적인 서열을 갖고 있으며, 복합체(41)와 포착용 올리고뉴클레오티드의 하이브리다이제이션에 의해, 샌드위치 하이브리다이제이션 복합체가 형성된다.
샌드위치 하이브리다이제이션 복합체를 형성하는 순서는 특별히 한정되지 않는다. DNA 증폭 단편과 표지 물질이 결합한 제2 올리고뉴클레오티드 프로브의 복합체(41)를 형성 후, 포착용의 제2 올리고뉴클레오티드 프로브와의 복합체를 형성하는 것이 바람직하지만, DNA 증폭 단편을 포착용의 제1 올리고뉴클레오티드 프로브에서 전개 매체 상에서 농축 후, 표지 물질이 결합한 제2 올리고뉴클레오티드를 전개하고, 샌드위치 하이브리다이제이션 복합체를 형성하는 것도 가능하다.
그 외의 핵산 검출 디바이스 형태로서는, 도 8에서 나타낸 바와 같은 마이크로어레이(DNA칩)를 들 수 있다. 마이크로어레이(44) 상의 포착용 올리고뉴클레오티드를 고정한 웰 내에, 샌드위치 하이브리다이제이션에 의해 3자 복합체를 형성시키는 것이 가능하다.
또한, 도 9에서 나타낸 바와 같은 비드 형태를 들 수 있다. 포착용 올리고뉴클레오티드를 유지한 비드 담체(45) 상에서, 샌드위치 하이브리다이제이션에 의한 3자 복합체를 형성시키는 것이 가능하다.
본 발명의 핵산 검출 방법, 및 핵산 검출 디바이스는, 핵산 증폭 공정을 포함하는 모든 기술에 사용할 수 있다. 바꿔 말하면, 핵산 증폭법에 의한 DNA 증폭 단편(예를 들면, PCR 산물)을 검출하는 것을 포함하는 모든 분야의 기술에 사용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 분자 생물학의 연구 분야, 병원체의 검출, 알레르겐 등 식품 중의 혼입물의 검출, 식품의 품질 관리(위장 표시 식품, 유전자 조합 식품 등의 검사), 가축 관리, 염기 다형(이하, 「SNP」라고도 한다)의 검출, 암 등의 질환 검사 등에 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명에는, 본 발명에 따른 핵산 검출 방법을 한 공정으로서 포함하는, 병원체에 의한 감염증의 검출 방법, 식품 중의 혼합물(예를 들면, 알레르겐)의 검출 방법, 식품의 품질 관리, 가축의 관리 방법, 및 염기 다형의 검출 방법 등도 포함된다.
여기에서, 본 발명의 이용의 한 실시 형태로서, 본 발명에 따른 병원체의 검출 방법, 및 알레르겐의 검출 방법에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 병원체의 검출 방법은, 본 발명에 따른 핵산 검출 방법을 사용하여, 병원체가 특이적으로 갖는 유전자를 검출하는 공정을 포함하고 있으면 된다. 상기 병원체는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 구체적으로는, 예를 들면, 병원성 세균, 병원성 바이러스, 식중독 세균, 원내 감염 원인 세균 및 바이러스 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 예를 들면, C형 간염 바이러스(HCV), 사이토메갈로 바이러스(CMV), 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스(EBV), 헤르페스 바이러스, 인간 면역 부전 바이러스(HIV) 등의 바이러스, 0157 등의 대장균, 결핵균, 티푸스균, 살모넬라균 혹은 장염 비브리오균 등의 세균, 또는 마이코플라스마 등의 미생물을 예시할 수 있다.
본 발명에 따른 병원체의 검출 방법에 대하여, 보다 구체적으로 설명하면, 예를 들면, 병원체의 유무를 검사하는 대상이 되는 시료로부터 조제한 DNA 시료에, 상기 병원체가 특이적으로 갖는 유전자가 포함되는지의 여부를 상기 핵산 검출 방법을 사용하여 판정한다. 또한, DNA 시료를 조제하지 않고, 병원체의 유무를 검사하는 대상이 되는 시료를 그대로 핵산 증폭법의 주형으로서 사용할 수도 있다. 예를 들면, 병원체로서 대장균 등의 세균을 검출하는 경우에, 세균의 콜로니의 현탁액을 주형으로서 사용할 수 있다. 그 결과, 병원체가 특이적으로 갖는 유전자가 검출되었을 경우에는, 당해 시료에는 병원체가 포함되어 있다고 판정한다. 이것에 의해, 특수한 장치를 필요로 하지 않고, 간편하고, 또한, 고정밀도로, 시료 중에 병원체가 포함되어 있는지의 여부를 판정할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 병원체의 검출 방법은, 미생물 감염증의 진단에 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 알레르겐의 검출 방법은, 본 발명에 따른 핵산 검출 방법을 사용하여, 알레르겐을 코드하는 유전자를 검출하는 공정을 포함하고 있으면 된다. 상기 알레르겐은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 구체적으로는, 예를 들면, 식품 중에 포함되는 알레르겐을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 난백 알레르겐, 젖 알레르겐, 밀 알레르겐, 메밀 알레르겐, 및 낙화생(落花生) 알레르겐 등을 들 수 있다. 본 발명에 따른 알레르겐의 검출 방법에 대하여, 보다 구체적으로 설명하면, 예를 들면, 식품으로부터 조제한 DNA 시료에, 달걀, 젖, 밀, 메밀, 낙화생 등의 알레르겐을 코드하는 유전자가 포함되는지의 여부를 상기 핵산 검출 방법을 사용하여 판정한다. 그 결과, 이러한 유전자가 검출되었을 경우에는, 당해 식품에는, 알레르겐을 함유하는 원료가 포함되어 있다고 판정한다.
이것에 의해, 특수한 장치를 필요로 하지 않고, 간편하고, 또한, 고정밀도로 식품 등의 시료 중에, 알레르겐을 함유하는 원료가 포함되어 있는지의 여부를 판정할 수 있다. 또, 알레르겐의 유래는, 상기 예시한 것에 한정되는 것은 아니며, 예를 들면, 곡류를 예로 들면, 벼, 옥수수, 조, 기장, 피, 메밀, 및 콩류의 전부가 포함되며 또한, DNA는, 열에 안정적이어서, 가공 식품 중에서도 미량으로 검출된다. 따라서, 본 발명에 따른 알레르겐의 검출 방법에 의해 얻어진 데이터는, 식품의 표시에 이용하거나, 식품의 알레르기 정보로서 이용하거나 하는 것에 더하여, 가공 조제나 캐리 오버 등 식품 첨가물의 매우 미량의 잔존, 혹은 제조 라인간의 상호 오염의 유무 등의 생산자가 의도하고 있지 않은 물질의 혼입의 검출에 사용할 수 있다.
그 외, 본 발명은, 인간을 포함하는 포유 동물의 친자 감정, 가축 혈통의 특정, 농산물 품종의 특정, SNP 검출, 유전자 변이에 의한 질환(암 등)의 검출 등에 사용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 가축에 대하여 말하면, 혈통 등록, 개체 식별, 친자 판정, 병원 유전자의 캐리어 개체의 제거 등의 목적에 이용할 수 있다. 또 본 발명은, 이상 설시한 각 구성에 한정되는 것은 아니며, 특허청구범위에 나타낸 범위에서 각종의 변경이 가능하며, 다른 실시 형태에 각각 개시한 기술적 수단을 적의 조합시켜서 얻어지는 실시 형태에 대해서도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
[실시예]
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더 상세히 설명한다. 단, 본 발명은 이들의 실시예에 그 기술적 범위가 한정되는 것은 아니다.
<실시예1>
(1) L-DNA 태그 부착 프라이머의 합성
본 실시예에서는, 주형으로서 pUC19(다카라바이오사제)를 사용하여, PCR 증폭에 의해 약 330염기쌍이 증폭하도록 포워드 프라이머(F) 및 리버스 프라이머(R)를 설계했다. 또한 각각의 5' 말단 측에 비천연형(L형) DNA쇄로 이루어지는 태그 서열T1 및 T2를 도입한 L-DNA 태그 부착 프라이머, T1-F 및 T2-R을 설계했다. L-DNA 태그 부착 프라이머의 합성은, 0.2μM 스케일의 칼럼을 사용하고, 일반적인 포스포르아미디트법에 의거하여, DNA 자동 합성기(H-8-SE : Gene World)로 합성했다.
본 검토에서 제작한 프라이머 세트를 제시한다.
프라이머F : 5'-Dd(GGAAACAGCTATGACCATGA)-3'(서열 번호1)
프라이머R : 5'-Dd(CTATGCGGCATCAGAGCAG)-3'(서열 번호2)
태그 서열T1 : 5'-Ld(GACAACGGAGACAGAGCCAA)-3'(서열 번호3)
태그 서열T2 : 5'-Ld(ATGCTACCGTATGCCCAGTG)-3'(서열 번호4)
프라이머T1-F : 5'-Ld(GACAACGGAGACAGAGCCAA)-Dd(GGAAACAGCTATGACCATGA)-3'(서열 번호5)
프라이머T2-R : 5'-Ld(ATGCTACCGTATGCCCAGTG)-Dd(CTATGCGGCATCAGAGCAG)-3'(서열 번호6).
(2) L-DNA 태그 부착 프라이머 세트를 사용한 PCR 반응
상기 공정(1)에서 실시하여 제작한 프라이머 세트를 사용한 PCR 반응을 행했다. 프라이머F와 프라이머R을 각 15p㏖과, 10ng의 pUC19를 0.2㎖의 PCR용 튜브에 넣고, ExTaq PCR 디바이스(다카라바이오사제)의 설명서에 따라, 100㎕의 PCR 반응액을 조제했다. 그 후, 튜브를 서멀 사이클러(GeneAmp PCR System, 어플라이드 바이오시스템사제)에 세트하고, 95℃에서 5분간 열처리 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초 사이클을 35회 행하여, 목적의 약 330bp를 증폭했다. 또한, pUC19를 첨가하지 않고 같은 반응을 행하여, 네가티브 컨트롤로 했다.
(3) 라텍스 결합 L형 올리고뉴클레오티드 프로브의 제작
카르복시기 함유 폴리스티렌 라텍스(고형분 10%(w/w), Bangs사제)와 아미노기 함유 L형 올리고뉴클레오티드 프로브(서열 번호7, 서열 번호3의 상보쇄)를, 수용성 카르보디이미드를 필요량 첨가한 MES 완충액 중에서 혼합하고, 결합 후, 모노에탄올아민으로 블록킹을 행했다. 상기 반응액을 원심 분리 후, 상청을 제거하고, 얻어진 침전을 수세했다. 세정 후, 계면 활성제를 함유하는 HEPES 완충액에 재현탁하고, 글래스 파이버제 패드에 균일해지도록 첨가한 후, 진공 건조기로 건조시켜, 컨쥬게이션 패드로 했다.
뉴클레오티드 프로브1 : 5'-Ld(TTGGCTCTGTCTCCGTTGTC)-NH2-3'(서열 번호7).
(4) L형 올리고뉴클레오티드 프로브의 고상에의 고정화
카르복시기 수식 나일론 멤브레인(니혼폴사제, 6㎜×60㎜)을 수용성 카르보디이미드에 의해 처리하고, 탈이온수로 세정했다. 활성화한 멤브레인의 일단으로부터 30㎜의 개소에, 서열 번호4에 대하여 상보적인 서열(서열 번호8)을 갖는 아미노기 함유 L형 올리고뉴클레오티드 프로브를, 디스펜서를 사용하여 라인 상에 도포하고, 15분간 풍건(風乾)했다. 그 후, 멤브레인을 Tris 완충액으로 처리하고, 블록킹 후, 멤브레인을 수세, 건조했다.
뉴클레오티드 프로브2 : 5'-Ld(CACTGGGCATACGGTAGCAT)-NH2-3'(서열 번호8).
(5) 핵산 크로마토그래피형 테스트 스트립의 제작
백킹 시트로 이루어지는 기재에, 상기에서 제작한 나일론 멤브레인으로 이루어지는 크로마토그래피 매체, 컨쥬게이션 패드, 시료 첨가부인 범용성의 샘플 패드, 전개한 시료나 표지 물질을 흡수하기 위한 흡수 패드를 도 6에 나타낸 바와 같이 첩합하여, L형 DNA 태그 부착 프라이머 세트를 사용한 PCR 증폭 산물의 검출용 테스트 스트립을 제작했다.
(6) 테스트 스트립에 의한 PCR 산물의 검출
공정(2)에서 제작한 PCR 산물을 변성하지 않고, 즉시 공정(5)에서 제작한 테스트 스트립 상의 시료 첨가 부위에 어플라이하고, 크로마토그래피에 의한 검출을 행했다. 공정(2)에서 검체로서 pUC19를 첨가했을 경우, 테스트 라인 상에 표적 핵산 특이적인 착색 라인이 검출되었다. 한편, 네가티브 컨트롤로서 물을 첨가했을 경우, 라인의 검출은 인정되지 않았다. 또한, 크로마토그래피에 의한 검출에 요한 시간은, 10∼15분으로 단시간이었다.
<실시예2>
(1) 헤어핀 태그 부착 프라이머의 합성
실시예1의 공정(1)과 같이, 주형으로서 pUC19(다카라바이오사제)를 사용하여, PCR 증폭에 의해 약 330염기쌍이 증폭하도록 포워드 프라이머(F) 및 리버스 프라이머(R)를 설계했다. 그 5' 말단 측에 헤어핀 구조를 갖는 폴리머라제 반응 저해 영역(H), 및 태그 서열T3 및 T4를 도입한 태그 부착 프라이머, T3-H-F 및 T4-H-R을 합성했다.
본 검토에서 제작한 프라이머 세트를 나타낸다.
폴리머라제 반응 저해 서열H : 5'-Dd(AGGCGAGGTCGCGAGCGCACATGTGCGCTCGCGACCTC GCCT)-3'(서열 번호9)
태그 서열T3 : 5'-Dd(TATGATATGCTTCTCCACGCATAAT)-3'(서열 번호10)
태그 서열T4 : 5'-Dd(TGCTCTGTACACTTGCTCAAT)-3'(서열 번호11)
프라이머T3-H-F : 5'-Dd(TATGATATGCTTCTCCACGCATAATAGGCGAGGTCGCGAGCGCACATG TGCGCTCGCGACCTCGCCTGGAAACAGCTATGACCATGA)-3'(서열 번호12)
프라이머T4-H-R : 5'-Dd(TGCTCTGTACACTTGCTCAATAGGCGAGGTCGCGAGCGCACATGTGC GCTCGCGACCTCGCCTCTATGCGGCATCAGAGCAG)-3'(서열 번호13).
(2) 헤어핀 태그 부착 프라이머 세트를 사용한 PCR 반응
상기 공정(1)에서 실시하여 제작한 프라이머 세트를 사용한 PCR 반응을 행했다. 프라이머F와 프라이머R을 각 15p㏖과, 10ng의 pUC19를 0.2㎖의 PCR용 튜브에 넣고, ExTaq PCR 디바이스(다카라바이오사제)의 설명서에 따라, 100㎕의 PCR 반응액을 조제했다. 그 후, 튜브를 서멀 사이클러(GeneAmp PCR System, 어플라이드 바이오시스템사제)에 세트하고, 95℃에서 5분간 열처리 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초 사이클을 35회 행하여, 목적의 약 330bp를 증폭했다. 또한, pUC19를 첨가하지 않고 같은 반응을 행하여, 네가티브 컨트롤로 했다.
(3) 라텍스 결합 올리고뉴클레오티드 프로브의 제작
카르복시기 함유 폴리스티렌 라텍스(고형분 10%(w/w), Bangs사제)와 아미노기 함유 올리고뉴클레오티드 프로브(서열 번호14, 서열 번호10의 상보쇄)를, 수용성 카르보디이미드를 필요량 첨가한 MES 완충액 중에서 혼합하고, 결합 후, 모노에탄올아민으로 블록킹을 행했다. 상기 반응액을 원심 분리 후, 상청을 제거하고, 얻어진 침전을 수세했다. 세정 후, 계면 활성제를 함유하는 HEPES 완충액에 재현탁하고, 글래스 파이버제 패드에 균일해지도록 첨가한 후, 진공 건조기로 건조시켜, 컨쥬게이션 패드로 했다.
올리고뉴클레오티드 프로브3 : 5'-Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA)-NH2-3'(서열 번호14).
(4) 올리고뉴클레오티드 프로브의 고상에의 고정화
카르복시기 수식 나일론 멤브레인(니혼폴사제, 6㎜×60㎜)을 수용성 카르보디이미드에 의해 처리하고, 탈이온수로 세정했다. 활성화한 멤브레인의 일단으로부터 30㎜의 개소에, 서열 번호11의 상보적인 서열(서열 번호15)을 갖는 아미노기 함유 L형 올리고뉴클레오티드 프로브를, 디스펜서를 사용하여 라인 상에 도포하고, 15분간 풍건했다. 그 후, 멤브레인을 Tris 완충액으로 처리하고, 블록킹 후, 멤브레인을 수세, 건조했다.
올리고뉴클레오티드 프로브4 : 5'-Dd(ATTGAGCAAGTGTACAGAGCA)-NH2-3'(서열 번호15).
(5) 핵산 크로마토그래피형 테스트 스트립의 제작
백킹 시트로 이루어지는 기재에, 상기에서 제작한 나일론 멤브레인으로 이루어지는 크로마토그래피 매체, 컨쥬게이션 패드, 시료 첨가부인 범용성의 샘플 패드, 전개한 시료나 표지 물질을 흡수하기 위한 흡수 패드를 도 6에 나타낸 바와 같이 첩합하여, 헤어핀 태그 부착 프라이머 세트를 사용한 PCR 증폭 산물의 검출용 테스트 스트립을 제작했다.
(6) 테스트 스트립에 의한 PCR 산물의 검출
공정(2)에서 제작한 PCR 산물을 변성하지 않고, 즉시 공정(5)에서 제작한 테스트 스트립 상의 시료 첨가 부위에 어플라이하고, 크로마토그래피에 의한 검출을 행했다. 공정(2)에서 검체로서 pUC19를 첨가했을 경우, 테스트 라인 상에 표적 핵산 특이적인 착색 라인이 검출되었다. 한편, 네가티브 컨트롤로서 물을 첨가했을 경우, 라인의 검출은 인정되지 않았다. 또한, 크로마토그래피에 의한 검출에 요한 시간은, 10∼15분으로 단시간이었다.
<실시예3>
(1) 인공 핵산(아조벤젠) 삽입 프라이머의 합성
실시예1의 공정(1)과 같이, 주형으로서 pUC19(다카라바이오사제)를 사용하여, PCR 증폭에 의해 약 330염기쌍이 증폭하도록 포워드 프라이머(F) 및 리버스 프라이머(R)를 설계했다. 각각의 5' 말단 측에 인공 핵산인 아조벤젠을 함유하는 폴리머라제 반응 저해 영역(X), 및 태그 서열T5 및 T6을 도입한 태그 부착 프라이머, T5-X-F 및 T6-X-R을 합성했다. 이 2종의 아조벤젠 삽입 프라이머는 츠쿠바올리고서비스 가부시키가이샤에서 수탁 합성을 행하여 구입했다. 본 검토에서 제작한 프라이머 세트를 나타낸다.
태그 서열T5 : 5'-Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG)-3'(서열 번호16)
태그 서열T6 : 5'-Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA)-3'(서열 번호17)
프라이머T5-X-F : 5'-Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG X GGAAACAGCTATGACCATGA)-3'(서열 번호18)
프라이머T6-X-R : 5'-Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA X TCTATGCGGCATCAGAGCAG)-3'(서열 번호19)
또, 프라이머에 삽입된 아조벤젠은 하기 식(1)으로 표시된다.
Figure pct00001
(2) 아조벤젠 삽입 프라이머 세트를 사용한 PCR 반응
상기 공정(1)에서 실시하여 제작한 프라이머 세트를 사용한 PCR 반응을 행했다. 프라이머T5-X-F와 프라이머T6-X-R을 각 15p㏖과, 10ng의 pUC19를 0.2㎖의 PCR용 튜브에 넣어, ExTaq PCR 디바이스(다카라바이오사제)의 설명서에 따라, 100㎕의 PCR 반응액을 조제했다. 그 후, 튜브를 서멀 사이클러(GeneAmp PCR System, 어플라이드 바이오시스템사제)에 세트하고, 95℃에서 5분간 열처리 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초 사이클을 35회 행하여, 목적의 약 330bp를 증폭했다. 또한, pUC19를 첨가하지 않고 같은 반응을 행하여, 네가티브 컨트롤로 했다.
(3) 라텍스 결합 올리고뉴클레오티드 프로브의 제작
카르복시기 함유 폴리스티렌 라텍스(고형분 10%(w/w), Bangs사제)와 아미노기 함유 올리고뉴클레오티드 프로브(서열 번호20, 서열 번호16의 상보쇄)를, 수용성 카르보디이미드를 필요량 첨가한 MES 완충액 중에서 혼합하고, 결합 후, 모노에탄올아민으로 블록킹을 행했다. 상기 반응액을 원심 분리 후, 상청을 제거하고, 얻어진 침전을 수세했다. 세정 후, 계면 활성제를 함유하는 HEPES 완충액에 재현탁하고, 글래스 파이버제 패드에 균일해지도록 첨가한 후, 진공 건조기로 건조시켜, 컨쥬게이션 패드로 했다.
올리고뉴클레오티드 프로브5 : 5'-Dd(CTATAAACCCAGTGAAAAATGTTGCCA)-NH2-3'(서열 번호20).
(4) 올리고뉴클레오티드 프로브의 고상에의 고정화
카르복시기 수식 나일론 멤브레인(니혼폴사제, 6㎜×60㎜)을 수용성 카르보디이미드에 의해 처리하고, 탈이온수로 세정했다. 활성화한 멤브레인의 일단으로부터 30㎜의 개소에, 서열 번호17의 상보적인 서열(서열 번호21)을 갖는 아미노기 함유 D형 올리고뉴클레오티드 프로브를, 디스펜서를 사용하여 라인 상에 도포하고, 15분간 풍건했다. 그 후, 멤브레인을 Tris 완충액으로 처리하고, 블록킹 후, 멤브레인을 수세, 건조했다.
올리고뉴클레오티드 프로브6 : 5'-Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)-NH2-3'(서열 번호21).
(5) 핵산 크로마토그래피형 테스트 스트립의 제작
백킹 시트로 이루어지는 기재에, 상기에서 제작한 나일론 멤브레인으로 이루어지는 크로마토그래피 매체, 컨쥬게이션 패드, 시료 첨가부인 범용성의 샘플 패드, 전개한 시료나 표지 물질을 흡수하기 위한 흡수 패드를 도 6에 나타낸 바와 같이 첩합하여, 아조벤젠 삽입 프라이머 세트를 사용한 PCR 증폭 산물의 검출용 테스트 스트립을 제작했다.
(6) 테스트 스트립에 의한 PCR 산물의 검출
공정(2)에서 제작한 PCR 산물을 변성하지 않고, 즉시 공정(5)에서 제작한 테스트 스트립 상의 시료 첨가 부위에 어플라이하고, 크로마토그래피에 의한 검출을 행했다. 공정(2)에서 검체로서 pUC19를 첨가했을 경우, 테스트 라인 상에 표적 핵산 특이적인 착색 라인이 검출되었다. 한편, 네가티브 컨트롤로서 물을 첨가했을 경우, 라인의 검출은 인정되지 않았다. 또한, 크로마토그래피에 의한 검출에 요한 시간은, 10∼15분으로 단시간이었다.
<실시예4>
(1) 금 콜로이드 결합 올리고뉴클레오티드 프로브의 제작
Gold Colloid(40㎚, 9.0×1010(입자수/㎖), British BioCell International사제)와 티올기 함유 올리고뉴클레오티드 프로브(서열 번호22, 서열 번호16의 상보쇄)를 혼합하고, 50℃에서 16시간 인큐베이트했다. 6000rpm으로 15분간 원심 분리하고, 상청을 제거, 0.05M 염화나트륨, 5mM 인산 버퍼, pH7을 첨가하여 혼화 후, 다시 50℃에서 40시간 인큐베이트했다.
인큐베이트 후, 원심(6000rpm, 15분간)을 행하고, 상청을 제거하여, 5mM 인산 버퍼(pH7)를 첨가했다. 이 버퍼 치환을 다시 행했다.
조제한 금 콜로이드 용액을 글래스 파이버제 패드에 균일해지도록 첨가한 후, 진공 건조기로 건조시켜, 컨쥬게이션 패드로 했다.
올리고뉴클레오티드 프로브7 : 5'-Dd(CTATAAACCCAGTGAAAAATGTTGCCA)-SH-3'(서열 번호22).
(2) 올리고뉴클레오티드 프로브의 고상에의 고정화
서열 번호17에 상보적인 서열(서열 번호23)을 갖는 3' 말단 비오틴 수식 올리고뉴클레오티드 프로브를, 스트렙트아비딘과 혼합한다. 그 혼합액을 니트로셀룰로오스 멤브레인(상품명 : Hi-Flow 180, 밀리포어사제)에 디스펜서를 사용하여 라인 상에 도포하고, 40℃에서 30분간 풍건했다.
올리고뉴클레오티드 프로브8 : 5'-Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)-Biotin-3'(서열 번호23).
(3) 핵산 크로마토그래피형 테스트 스트립의 제작
백킹 시트로 이루어지는 기재에, 상기에서 제작한 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 이루어지는 크로마토그래피 매체, 컨쥬게이션 패드, 시료 첨가부인 범용성의 샘플 패드, 전개한 시료나 표지 물질을 흡수하기 위한 흡수 패드를 도 6에 나타낸 바와 같이 첩합하여, 아조벤젠 삽입 프라이머 세트를 사용한 PCR 증폭 산물의 검출용 테스트 스트립을 제작했다.
(4) 테스트 스트립에 의한 PCR 산물의 검출
실시예3의 공정(2)에서 제작한 PCR 산물을 변성하지 않고, 즉시 공정(3)에서 제작한 테스트 스트립 상의 시료 첨가 부위에 어플라이하고, 크로마토그래피에 의한 검출을 행했다. 실시예3의 공정(2)에서 검체로서 pUC19를 첨가했을 경우, 테스트 라인 상에 표적 핵산 특이적인 착색 라인이 검출되었다. 한편, 네가티브 컨트롤로서 물을 첨가했을 경우, 라인의 검출은 인정되지 않았다. 또한, 크로마토그래피에 의한 검출에 요한 시간은, 10∼15분으로 단시간이었다.
<실시예5>
(1) 올리고뉴클레오티드 프로브의 고상에의 고정화
서열 번호17에 상보적인 서열(서열 번호24)을 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브를 UltraBind 어피니티 멤브레인(니혼폴사제)에 디스펜서를 사용하여 라인 상에 도포하고, 80℃에서 1시간 풍건했다.
올리고뉴클레오티드 프로브9 : 5'-Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)-3'(서열 번호24).
(2) 핵산 크로마토그래피형 테스트 스트립의 제작
백킹 시트로 이루어지는 기재에, 상기에서 제작한 UltraBind 어피니티 멤브레인으로 이루어지는 크로마토그래피 매체, 컨쥬게이션 패드, 시료 첨가부인 범용성의 샘플 패드, 전개한 시료나 표지 물질을 흡수하기 위한 흡수 패드를 도 6에 나타낸 바와 같이 첩합하여, 아조벤젠 삽입 프라이머 세트를 사용한 PCR 증폭 산물의 검출용 테스트 스트립을 제작했다.
(3) 테스트 스트립에 의한 PCR 산물의 검출
실시예3의 공정(2)에서 제작한 PCR 산물을 변성하지 않고, 즉시 공정(2)에서 제작한 테스트 스트립 상의 시료 첨가 부위에 어플라이하고, 크로마토그래피에 의한 검출을 행했다. 실시예3의 공정(2)에서 검체로서 pUC19를 첨가했을 경우, 테스트 라인 상에 표적 핵산 특이적인 착색 라인이 검출되었다. 한편, 네가티브 컨트롤로서 물을 첨가했을 경우, 라인의 검출은 인정되지 않았다. 또한, 크로마토그래피에 의한 검출에 요한 시간은, 10∼15분으로 단시간이었다.
<실시예6>
(1) 인공 핵산(아조벤젠) 삽입 프라이머의 합성
본 실시예에서는, 표적 핵산의 주형으로서는 pUC19(다카라바이오사제), EcoRI 메틸라아제 유전자, 및, BamHI 메틸라아제 유전자의 3종류를 템플레이트로서 사용하여, PCR 증폭에 의해 약 330염기쌍, 약 200염기쌍, 및, 약 100염기쌍이 증폭하도록 포워드 프라이머(F1)와 리버스 프라이머(R1), 포워드 프라이머(F2)와 리버스 프라이머(R2), 및, 포워드 프라이머(F3)와 리버스 프라이머(R3)의 3조의 프라이머를 각각 설계했다. 각각의 5' 말단 측에 인공 핵산인 아조벤젠을 함유하는 폴리머라제 반응 저해 영역(X), 및 태그 서열T10과 T11, 태그 서열T12와 T13, 및, 태그 서열T14와 T15를 도입한 태그 부착 프라이머, T10-X-F1과 T11-X-R1, T12-X-F2와 T13-X-R2, 및, T14-X-F3과 T15-X-R3을 합성했다. 이 6종의 아조벤젠 삽입 프라이머는 츠쿠바올리고서비스 가부시키가이샤에서 수탁 합성을 행하여 구입했다. 이하에 본 검토에서 제작한 3조의 프라이머 세트를 나타낸다.
태그 서열T10 : 5'-Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG)-3'(서열 번호25)
태그 서열T11 : 5'-Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA)-3'(서열 번호26)
프라이머T10-X-F1 : 5'-Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG X GGAAACAGCTATGACCATGA)-3'(서열 번호27)
프라이머T11-X-R1 : 5'-Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA X TCTATGCGGCATCAGAGCAG)-3'(서열 번호28)
태그 서열T12 : 5'-Dd(CGCATTGAGCAAGTGTACAGAGCAT)-3'(서열 번호29)
태그 서열T13 : 5'-Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA)-3'(서열 번호30)
프라이머T12-X-F2 : 5'-Dd(CGCATTGAGCAAGTGTACAGAGCAT X AGCATTATGAATTATATGGT)-3'(서열 번호31)
프라이머T13-X-R2 : 5'-Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA X TTGTTTACATTTATAGCATC)-3'(서열 번호32)
태그 서열T14 : 5'-Dd(AATTGCGCATGTCCATGTGTAA)-3'(서열 번호33)
태그 서열T15 : 5'-Dd(TACTTTAGAGGAAACTGCTGAG)-3'(서열 번호34)
프라이머T14-X-F3 : 5'-Dd(AATTGCGCATGTCCATGTGTAA X TGGTTTTAAAACTCTGATAC)-3'(서열 번호35)
프라이머T15-X-R3 : 5'-Dd(TACTTTAGAGGAAACTGCTGAG X AGTATGATGAGGGTGTAACA)-3'(서열 번호36)
(2) 아조벤젠 삽입 프라이머 세트 3조를 사용한 PCR 반응
상기 공정(1)에서 실시하여 제작한 3조의 프라이머 세트를 사용한 PCR 반응을 행했다. 프라이머T10-X-F1, 프라이머T11-X-R1, 프라이머T12-X-F2, 프라이머T13-X-R2, 프라이머T14-X-F3, 및, 프라이머T15-X-R3을 각 15p㏖과, 각 템플레이트 10ng을 0.2㎖의 PCR용 튜브에 넣어, ExTaq PCR 디바이스(다카라바이오사제)의 설명서에 따라, 100㎕의 PCR 반응액을 조제했다. 반응액은 다음 5종류를 준비했다.
(ⅰ) 템플레이트로서 pUC19(다카라바이오사제)를 첨가,
(ⅱ) 템플레이트로서 EcoRI 메틸라아제 유전자를 첨가,
(ⅲ) 템플레이트로서 BamHI 메틸라아제 유전자를 첨가,
(ⅳ) 템플레이트로서 pUC19(다카라바이오사제), EcoRI 메틸라아제 유전자, 및, BamHI 메틸라아제 유전자의 3종류 전부 첨가, 그리고,
(ⅴ) 템플레이트 없음
이들 반응액을 조제 후, 튜브를 서멀 사이클러(GeneAmp PCR System, 어플라이드 바이오시스템사제)에 세트하고, 95℃에서 5분간 열처리 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초 사이클을 30회 행하여, 각각 목적의 서열을 갖는 DNA 단편을 다음과 같이 얻었다.
(ⅰ) 약 330bp, (ⅱ) 약 200bp, (ⅲ) 약 100bp, 및, (ⅳ) 약 330bp, 약 200bp, 약 100bp의 3종류, (ⅴ) 증폭 DNA 단편 없음(네가티브 컨트롤로 한다)을 증폭했다.
(3) 라텍스 결합 올리고뉴클레오티드 프로브의 제작
카르복시기 함유 폴리스티렌 라텍스(청색)(고형분 10%(w/w), Bangs사제)와 아미노기 함유 올리고뉴클레오티드 프로브16(서열 번호37, 서열 번호25의 상보쇄), 카르복시기 함유 폴리스티렌 라텍스(오렌지색)(고형분 10%(w/w), Bangs사제)와 아미노기 함유 올리고뉴클레오티드 프로브17(서열 번호38, 서열 번호29의 상보쇄), 및, 카르복시기 함유 폴리스티렌 라텍스(녹색)(고형분 10%(w/w), Bangs사제)와 아미노기 함유 올리고뉴클레오티드 프로브18(서열 번호39, 서열 번호33의 상보쇄)을, 각각 수용성 카르보디이미드를 필요량 첨가한 MES 완충액 중에서 혼합하고, 결합 후, 모노에탄올아민으로 블록킹을 행했다. 상기 반응액을 원심 분리 후, 상청을 제거하고, 얻어진 침전을 수세했다. 세정 후, 계면 활성제를 함유하는 HEPES 완충액에 재현탁하고, 올리고뉴클레오티드 프로브16 결합 라텍스(청색), 올리고뉴클레오티드 프로브17 결합 라텍스(오렌지색), 올리고뉴클레오티드 프로브18 결합 라텍스(녹색)를 제작했다.
이 3종의 라텍스를 글래스 파이버제 패드에 균일해지도록 첨가한 후, 진공 건조기로 건조시켜, 컨쥬게이션 패드로 했다.
올리고뉴클레오티드 프로브16 : 5'-Dd(CTATAAACCCAGTGAAAAATGTTGCCA)-NH2-3'(서열 번호37).
올리고뉴클레오티드 프로브17 : 5'-Dd(TTGCTCTGTACACTTGCTCAATGCG)-NH2-3'(서열 번호38)
올리고뉴클레오티드 프로브18 : 5'-Dd(TTACACATGGACATGCGCAATT)-NH2-3'(서열 번호39)
(4) 3종의 올리고뉴클레오티드 프로브의 고상에의 고정화
서열 번호26에 상보적인 서열(서열 번호40)을 갖는 3' 말단 비오틴 수식 올리고뉴클레오티드 프로브, 서열 번호30에 상보적인 서열(서열 번호41)을 갖는 3' 말단 비오틴 수식 올리고뉴클레오티드 프로브, 및, 서열 번호34에 상보적인 서열(서열 번호42)을 갖는 3' 말단 비오틴 수식 올리고뉴클레오티드 프로브를, 각각 스트렙트아비딘과 혼합한다. 그들의 혼합액을 니트로셀룰로오스 멤브레인(상품명 : Hi-Flow 135, 밀리포어사제) 상의 3개소에 디스펜서를 사용하여, 상류 측으로부터 순서대로 서로 떨어진 위치에서 라인 상에 도포하고, 40℃에서 30분간 풍건했다. 3개의 검출 라인을 제작했다.
올리고뉴클레오티드 프로브19 : 5'-Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)-Biotin-3'(서열 번호40).
올리고뉴클레오티드 프로브20 : 5'-Dd(TATGATATGCTTCTCCACGCATAAT)-Biotin-3'(서열 번호41).
올리고뉴클레오티드 프로브21 : 5'-Dd(CTCAGCAGTTTCCTCTAAAGTA)-Biotin-3'(서열 번호42).
(5) 핵산 크로마토그래피형 테스트 스트립의 제작
백킹 시트로 이루어지는 기재에, 상기에서 제작한 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 이루어지는 크로마토그래피 매체, 공정(3)에서 제작한 컨쥬게이션 패드, 시료 첨가부인 범용성의 샘플 패드, 전개한 시료나 표지 물질을 흡수하기 위한 흡수 패드를 도 6에 나타낸 바와 같이 첩합하여, 아조벤젠 삽입 프라이머 세트를 사용한 PCR 증폭 산물의 검출용 테스트 스트립을 제작했다.
(6) 테스트 스트립에 의한 PCR 산물의 검출
공정(2)에서 제작한 (ⅰ)∼(ⅴ)의 PCR 산물을 각각 변성하지 않고, 즉시 공정(5)에서 제작한 테스트 스트립 상의 시료 첨가 부위에 각각 어플라이하고, 크로마토그래피에 의한 검출을 행했다. 그 결과는 이하에 나타낸다.
(ⅰ) : 1개째의 검출 라인만 청색으로 착색
(ⅱ) : 2개째의 검출 라인만 오렌지색으로 착색
(ⅲ) : 3개째의 검출 라인만 녹색으로 착색
(ⅳ) : 1개째의 검출 라인이 청색으로, 2개째의 검출 라인이 오렌지색으로, 3개째의 검출 라인이 녹색으로 각각 착색
(ⅴ) : 어느 검출 라인도 착색은 인정되지 않음
이 결과로부터, 각각의 표적 유전자 특이적으로 검출이 가능하며, 3종류의 동시 검출도 확인할 수 있었다.
또한, 크로마토그래피에 의한 검출에 요한 시간은, 10∼15분으로 단시간이었다.
<실시예7>
(1) 조인트 프라이머의 합성
본 실시예에서는, 표적 핵산의 주형으로서는 pUC19(다카라바이오사제), EcoRI 메틸라아제 유전자, 및, BamHI 메틸라아제 유전자의 3종류를 템플레이트로서 사용하여, PCR 증폭에 의해 약 330염기쌍, 약 200염기쌍, 및, 약 100염기쌍이 증폭하도록 포워드 프라이머(Fj1)와 리버스 프라이머(Rj1), 포워드 프라이머(Fj2)와 리버스 프라이머(Rj2), 및, 포워드 프라이머(Fj3)와 리버스 프라이머(Rj3)의 3조의 프라이머를 각각 설계했다. 각각의 5' 말단 측에 공통 서열KF1과 KR1, 공통 서열KF2와 KR2, 및, 공통 서열KF3과 KR3을 도입한 공통 서열 부가 프라이머, KF1-Fj1과 KR1-Rj1, KF2-Fj2와 KR2-Rj2, 및, KF3-Fj3과 KR3-Rj3을 합성했다. 이 6종의 공통 서열 부가 프라이머(조인트 프라이머)는 츠쿠바올리고서비스 가부시키가이샤에서 수탁 합성을 행하여 구입했다. 이하에 본 검토에서 제작한 3조의 프라이머 세트를 나타낸다.
공통 서열KF1 : 5'-Dd(TGGGCTGACCTAGAGGTCTT)-3'(서열 번호43)
공통 서열KR1 : 5'-Dd(ATGAAATGCAGGCCATTCGG)-3'(서열 번호44)
프라이머KF1-Fj1 : 5'-Dd(TGGGCTGACCTAGAGGTCTT GGAAACAGCTATGACCATGA)-3'(서열 번호45)
프라이머KR1-Rj1 : 5'-Dd(ATGAAATGCAGGCCATTCGG TCTATGCGGCATCAGAGCAG)-3'(서열 번호46)
공통 서열KF2 : 5'-Dd(CCGGAACAGACACCAGGTTT)-3'(서열 번호47)
공통 서열KR2 : 5'-Dd(GAAGCTGTACCGTCACATGA)-3'(서열 번호48)
프라이머KF2-Fj2 : 5'-Dd(CCGGAACAGACACCAGGTTT AGCATTATGAATTATATGGT)-3'(서열 번호49)
프라이머KR2-Rj2 : 5'-Dd(GAAGCTGTACCGTCACATGA TTGTTTACATTTATAGCATC)-3'(서열 번호50)
공통 서열KF3 : 5'-Dd(ATACCGATGAGTGTGCTACC)-3'(서열 번호51)
공통 서열KR3 : 5'-Dd(TGGCCTGTGTGACACTATGC)-3'(서열 번호52)
프라이머KF3-Fj3 : 5'-Dd(ATACCGATGAGTGTGCTACC TGGTTTTAAAACTCTGATAC)-3'(서열 번호53)
프라이머KR3-Rj3 : 5'-Dd(TGGCCTGTGTGACACTATGC AGTATGATGAGGGTGTAACA)-3'(서열 번호54)
(2) 인공 핵산(아조벤젠) 삽입 프라이머의 합성
본 실시예에서는, 공정1에서 제작한 조인트 프라이머 세트가 각각 증폭하는 3종류의 PCR 증폭 단편에 결합할 수 있도록, 각각의 조인트 프라이머와 동일한 공통 서열을 갖는 프라이머를 3조 설계했다. 각각의 프라이머는, 5' 말단 측에 인공 핵산인 아조벤젠을 함유하는 폴리머라제 반응 저해 영역(X), 및 태그 서열T22와 T23, 태그 서열T24와 T25, 및, 태그 서열T26과 T27을 도입한 태그 부착 프라이머, T22-X-KF1과 T23-X-KR1, T24-X-KF2와 T25-X-KR2, 및, T26-X-KF3과 T27-X-KR3을 합성했다. 이 6종의 아조벤젠 삽입 프라이머는 츠쿠바올리고서비스 가부시키가이샤에서 수탁 합성을 행하여 구입했다. 이하에 본 검토에서 제작한 3조의 프라이머 세트를 나타낸다.
태그 서열T22 : 5'-Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG)-3'(서열 번호55)
태그 서열T23 : 5'-Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA)-3'(서열 번호56)
프라이머T22-X-KF1 : 5'-Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG X TGGGCTGACCTAGAGGTCTT )-3'(서열 번호57)
프라이머T23-X-KR1 : 5'-Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA X ATGAAATGCAGGCCATTCGG )-3'(서열 번호58)
태그 서열T24 : 5'-Dd(CGCATTGAGCAAGTGTACAGAGCAT)-3'(서열 번호59)
태그 서열T25 : 5'-Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA)-3'(서열 번호60)
프라이머T24-X-KF2 : 5'-Dd(CGCATTGAGCAAGTGTACAGAGCAT X CCGGAACAGACACCAGGTTT)-3'(서열 번호61)
프라이머T25-X-KR2 : 5'-Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA X GAAGCTGTACCGTCACATGA)-3'(서열 번호62)
태그 서열T26 : 5'-Dd(AATTGCGCATGTCCATGTGTAA)-3'(서열 번호63)
태그 서열T27 : 5'-Dd(TACTTTAGAGGAAACTGCTGAG)-3'(서열 번호64)
프라이머T26-X-KF3 : 5'-Dd(AATTGCGCATGTCCATGTGTAA X ATACCGATGAGTGTGCTACC)-3'(서열 번호65)
프라이머T27-X-KR3 : 5'-Dd(TACTTTAGAGGAAACTGCTGAG X TGGCCTGTGTGACACTATGC)-3'(서열 번호66)
(3) 조인트 프라이머, 및, 아조벤젠 삽입 프라이머를 사용한 PCR 반응
상기 공정(1) 및 (2)에서 실시하여 제작한 6조의 프라이머 세트를 사용한 PCR 반응을 행했다. 프라이머KF1-Fj1, 프라이머KR1-Rj1, 프라이머KF2-Fj2, 프라이머KR2-Rj2, 프라이머KF3-Fj3, 프라이머KR3-Rj3, 프라이머T22-X-KF1, 프라이머T23-X-KR1, 프라이머T24-X-KF2, 프라이머T25-X-KR2, 프라이머T26-X-KF3, 프라이머T27-X-KR3을 각 8p㏖과, 각 템플레이트 10ng을 0.2㎖의 PCR용 튜브에 넣어, ExTaq PCR 디바이스(다카라바이오사제)의 설명서에 따라, 100㎕의 PCR 반응액을 조제했다. 반응액은 다음 5종류를 준비했다.
(ⅰ) 템플레이트로서 pUC19(다카라바이오사제)를 첨가,
(ⅱ) 템플레이트로서 EcoRI 메틸라아제 유전자를 첨가,
(ⅲ) 템플레이트로서 BamHI 메틸라아제 유전자를 첨가,
(ⅳ) 템플레이트로서 pUC19(다카라바이오사제), EcoRI 메틸라아제 유전자, 및, BamHI 메틸라아제 유전자의 3종류 전부 첨가, 그리고,
(ⅴ) 템플레이트 없음
이들 반응액을 조제 후, 튜브를 서멀 사이클러(GeneAmp PCR System, 어플라이드 바이오시스템사제)에 세트하고, 95℃에서 5분간 열처리 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초 사이클을 30회 행하여, 각각 목적의 서열을 갖는 DNA 단편을 다음과 같이 얻었다. (ⅰ) 약 360bp, (ⅱ) 약 230bp, (ⅲ) 약 130bp, 및, (ⅳ) 약 360bp, 약 230bp, 약 130bp의 3종류, (ⅴ) 증폭 DNA 단편 없음(네가티브 컨트롤로 한다)을 증폭했다.
(4) 라텍스 결합 올리고뉴클레오티드 프로브의 제작
카르복시기 함유 폴리스티렌 라텍스(청색)(고형분 10%(w/w), Bangs사제)와 아미노기 함유 올리고뉴클레오티드 프로브28(서열 번호67, 서열 번호55의 상보쇄), 카르복시기 함유 폴리스티렌 라텍스(오렌지색)(고형분 10%(w/w), Bangs사제)와 아미노기 함유 올리고뉴클레오티드 프로브29(서열 번호68, 서열 번호59의 상보쇄), 및, 카르복시기 함유 폴리스티렌 라텍스(녹색)(고형분 10%(w/w), Bangs사제)와 아미노기 함유 올리고뉴클레오티드 프로브30(서열 번호69, 서열 번호63의 상보쇄)을, 각각 수용성 카르보디이미드를 필요량 첨가한 MES 완충액 중에서 혼합하고, 결합 후, 모노에탄올아민으로 블록킹을 행했다. 상기 반응액을 원심 분리 후, 상청을 제거하고, 얻어진 침전을 수세했다. 세정 후, 계면 활성제를 함유하는 HEPES 완충액에 재현탁하고, 올리고뉴클레오티드 프로브28 결합 라텍스(청색), 올리고뉴클레오티드 프로브29 결합 라텍스(오렌지색), 올리고뉴클레오티드 프로브30 결합 라텍스(녹색)를 제작했다.
이 3종의 라텍스를 글래스 파이버제 패드에 균일해지도록 첨가한 후, 진공 건조기로 건조시켜, 컨쥬게이션 패드로 했다.
올리고뉴클레오티드 프로브28 : 5'-Dd(CTATAAACCCAGTGAAAAATGTTGCCA)-NH2-3'(서열 번호67).
올리고뉴클레오티드 프로브29 : 5'-Dd(TTGCTCTGTACACTTGCTCAATGCG)-NH2-3'(서열 번호68)
올리고뉴클레오티드 프로브30 : 5'-Dd(TTACACATGGACATGCGCAATT)-NH2-3'(서열 번호69)
(5) 3종의 올리고뉴클레오티드 프로브의 고상에의 고정화
서열 번호56에 상보적인 서열(서열 번호70)을 갖는 3' 말단 비오틴 수식 올리고뉴클레오티드 프로브, 서열 번호60에 상보적인 서열(서열 번호71)을 갖는 3' 말단 비오틴 수식 올리고뉴클레오티드 프로브, 및, 서열 번호64에 상보적인 서열(서열 번호72)을 갖는 3' 말단 비오틴 수식 올리고뉴클레오티드 프로브를, 각각 스트렙트아비딘과 혼합한다. 그들의 혼합액을 니트로셀룰로오스 멤브레인(상품명 : Hi-Flow 135, 밀리포어사제) 상의 3개소에 디스펜서를 사용하여, 상류 측으로부터 순서대로 서로 떨어진 위치에서 라인 상에 도포하고, 40℃에서 30분간 풍건했다. 3개의 검출 라인을 제작했다.
올리고뉴클레오티드 프로브31 : 5'-Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)-Biotin-3'(서열 번호70).
올리고뉴클레오티드 프로브32 : 5'-Dd(TATGATATGCTTCTCCACGCATAAT)-Biotin-3'(서열 번호71).
올리고뉴클레오티드 프로브33 : 5'-Dd(CTCAGCAGTTTCCTCTAAAGTA)-Biotin-3'(서열 번호72).
(6) 핵산 크로마토그래피형 테스트 스트립의 제작
백킹 시트로 이루어지는 기재에, 상기에서 제작한 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 이루어지는 크로마토그래피 매체, 공정(4)에서 제작한 컨쥬게이션 패드, 시료 첨가부인 범용성의 샘플 패드, 전개한 시료나 표지 물질을 흡수하기 위한 흡수 패드를 도 6에 나타낸 바와 같이 첩합하여, 아조벤젠 삽입 프라이머 세트를 사용한 PCR 증폭 산물의 검출용 테스트 스트립을 제작했다.
(7) 테스트 스트립에 의한 PCR 산물의 검출
공정(3)에서 제작한 (ⅰ)∼(ⅴ)의 PCR 산물을 각각 변성하지 않고, 즉시 공정(6)에서 제작한 테스트 스트립 상의 시료 첨가 부위에 각각 어플라이하고, 크로마토그래피에 의한 검출을 행했다. 그 결과는 이하에 나타낸다.
(ⅰ) : 1개째의 검출 라인만 청색으로 착색
(ⅱ) : 2개째의 검출 라인만 오렌지색으로 착색
(ⅲ) : 3개째의 검출 라인만 녹색으로 착색
(ⅳ) : 1개째의 검출 라인이 청색으로, 2개째의 검출 라인이 오렌지색으로, 3개째의 검출 라인이 녹색으로 착색
(ⅴ) : 어느 검출 라인도 착색은 인정되지 않음
이 결과로부터, 각각의 표적 유전자 특이적으로 검출이 가능하며, 3종류의 검출도 확인할 수 있었다. 또한, 크로마토그래피에 의한 검출에 요한 시간은, 10∼15분으로 단시간이었다.
<실시예8>
(1) 조인트 프라이머의 합성
본 실시예에서는, 표적 핵산의 주형으로서는 pUC19(다카라바이오사제)를 템플레이트로서 사용하여, PCR 증폭에 의해 약 330염기쌍이 증폭하도록 포워드 프라이머(F)와 리버스 프라이머(R)를 설계했다. 각각의 5' 말단 측에 공통 서열KF와 KR을 도입한 공통 서열 부가 프라이머, KF-F와 KR-R을 합성했다. 이 2종의 공통 서열 부가 프라이머(조인트 프라이머)는 츠쿠바올리고서비스 가부시키가이샤에서 수탁 합성을 행하여 구입했다. 이하에 본 검토에서 제작한 프라이머 세트를 나타낸다.
공통 서열KF : 5'-Dd(TGGGCTGACCTAGAGGTCTT)-3'(서열 번호73)
공통 서열KR : 5'-Dd(ATGAAATGCAGGCCATTCGG)-3'(서열 번호74)
프라이머KF-F : 5'-Dd(TGGGCTGACCTAGAGGTCTT GGAAACAGCTATGACCATGA)-3'(서열 번호75)
프라이머KR-R : 5'-Dd(ATGAAATGCAGGCCATTCGG TCTATGCGGCATCAGAGCAG)-3'(서열 번호76)
(2) 비오틴 수식 프라이머 및 FITC 수식 프라이머의 합성
본 실시예에서는, 공정(1)에서 제작한 조인트 프라이머 세트가 증폭하는 PCR 증폭 단편에 결합할 수 있도록, 각각의 조인트 프라이머와 동일한 공통 서열을 갖는 프라이머를 각각 설계했다. 한쪽의 프라이머는, 5' 말단 측에 비오틴 수식한 것을 합성하고, 또 다른 한쪽의 프라이머는 5' 말단 측에 FITC 수식한 것을 합성했다. 이 2종의 수식 프라이머는 츠쿠바올리고서비스 가부시키가이샤에서 수탁 합성을 행하여 구입했다. 이하에 본 검토에서 제작한 프라이머 세트를 나타낸다.
프라이머KF2 : 5'-Biotin-Dd(TGGGCTGACCTAGAGGTCTT)-3'(서열 번호77)
프라이머KR2 : 5'-FITC-Dd(ATGAAATGCAGGCCATTCGG)-3'(서열 번호78)
(3) 조인트 프라이머, 및, 수식 프라이머를 사용한 PCR 반응
상기 공정(1) 및 (2)에서 실시하여 제작한 프라이머 세트를 사용한 PCR 반응을 행했다. 프라이머KF-F, 프라이머KR-R, 프라이머KF2, 프라이머KR2를 각 8p㏖, 및, 템플레이트로서 10ng의 pUC19를 0.2㎖의 PCR용 튜브에 넣어, ExTaq PCR 디바이스(다카라바이오사제)의 설명서에 따라, 100㎕의 PCR 반응액을 조제했다. 반응액을 조제 후, 튜브를 서멀 사이클러(GeneAmp PCR System, 어플라이드 바이오시스템사제)에 세트하고, 95℃에서 5분간 열처리 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초 사이클을 30회 행하고, 약 360bp의 목적 서열을 갖는 DNA 단편을 증폭했다.
(4) 라텍스 결합 스트렙트아비딘의 제작
카르복시기 함유 폴리스티렌 라텍스(청색)(고형분 10%(w/w), Bangs사제)와 스트렙트아비딘(와코쥰야쿠고교사제)을, 수용성 카르보디이미드를 필요량 첨가한 MES 완충액 중에서 혼합하고, 결합 후, 모노에탄올아민으로 블록킹을 행했다. 상기 반응액을 원심 분리 후, 상청을 제거하고, 얻어진 침전을 수세했다. 세정 후, 계면 활성제를 함유하는 HEPES 완충액에 재현탁하고, 스트렙트아비딘 결합 라텍스(청색)를 제작했다. 이 라텍스 용액을 글래스 파이버제 패드에 균일해지도록 첨가한 후, 진공 건조기로 건조시켜, 컨쥬게이션 패드로 했다.
(5) 항FITC(플루오로세인이소티오시아네이트) 항체의 고상에의 고정화
항FITC 항체(인비트로젠사제)를 5mM 트리스 버퍼(pH 7.5)에 용해하고, 니트로셀룰로오스 멤브레인(상품명 : Hi-Flow 135, 밀리포어사제) 상에 디스펜서를 사용하여, 라인 상에 도포하고, 40℃에서 30분간 풍건했다. 검출 라인을 제작했다.
(6) 핵산 크로마토그래피형 테스트 스트립의 제작
백킹 시트로 이루어지는 기재에, 상기에서 제작한 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 이루어지는 크로마토그래피 매체, 공정(4)에서 제작한 컨쥬게이션 패드, 시료 첨가부인 범용성의 샘플 패드, 전개한 시료나 표지 물질을 흡수하기 위한 흡수 패드를 도 6에 나타낸 바와 같이 첩합하여, 비오틴 수식 프라이머와 FITC 수식 프라이머 세트를 사용한 PCR 증폭 산물의 검출용 테스트 스트립을 제작했다.
(7) 테스트 스트립에 의한 PCR 산물의 검출
공정(3)에서 제작한 PCR 산물을 변성하지 않고, 즉시 공정(6)에서 제작한 테스트 스트립 상의 시료 첨가 부위에 각각 어플라이하고, 크로마토그래피에 의한 검출을 행했다. 그 결과, 공정(3)에서 검체로서 pUC19를 첨가했을 경우, 테스트 라인 상에 표적 핵산 특이적인 착색 라인이 검출되었다. 한편, 네가티브 컨트롤로서 물을 첨가했을 경우, 라인의 검출은 인정되지 않았다. 또한, 크로마토그래피에 의한 검출에 요한 시간은, 10∼15분으로 단시간이었다.
<실시예9>
(1) 조인트 프라이머의 합성
본 실시예에서는, 표적 핵산의 주형으로서는 pUC19(다카라바이오사제), EcoRI 메틸라아제 유전자, 및, BamHI 메틸라아제 유전자의 3종류를 템플레이트로서 사용하여, PCR 증폭에 의해 약 330염기쌍, 약 200염기쌍, 및, 약 100염기쌍이 증폭하도록 포워드 프라이머(Fj1)와 리버스 프라이머(Rj1), 포워드 프라이머(Fj2)와 리버스 프라이머(Rj2), 및, 포워드 프라이머(Fj3)와 리버스 프라이머(Rj3)의 3조의 프라이머를 각각 설계했다. 각각의 5' 말단 측에 공통 서열KF1과 KR1, 공통 서열KF2와 KR2, 및, 공통 서열KF3과 KR3을 도입한 공통 서열 부가 프라이머, KF1-Fj1과 KR1-Rj1, KF2-Fj2와 KR2-Rj2, 및, KF3-Fj3과 KR3-Rj3을 합성했다. 이 6종의 공통 서열 부가 프라이머(조인트 프라이머)는 츠쿠바올리고서비스 가부시키가이샤에서 수탁 합성을 행하여 구입했다. 이하에 본 검토에서 제작한 3조의 프라이머 세트를 나타낸다.
공통 서열KF1 : 5'-Dd(TGGGCTGACCTAGAGGTCTT)-3'(서열 번호79)
공통 서열KR1 : 5'-Dd(ATGAAATGCAGGCCATTCGG)-3'(서열 번호80)
프라이머KF1-Fj1 : 5'-Dd(TGGGCTGACCTAGAGGTCTT GGAAACAGCTATGACCATGA)-3'(서열 번호81)
프라이머KR1-Rj1 : 5'-Dd(ATGAAATGCAGGCCATTCGG TCTATGCGGCATCAGAGCAG)-3'(서열 번호82)
공통 서열KF2 : 5'-Dd(CCGGAACAGACACCAGGTTT)-3'(서열 번호83)
공통 서열KR2 : 5'-Dd(GAAGCTGTACCGTCACATGA)-3'(서열 번호84)
프라이머KF2-Fj2 : 5'-Dd(CCGGAACAGACACCAGGTTT AGCATTATGAATTATATGGT)-3'(서열 번호85)
프라이머KR2-Rj2 : 5'-Dd(GAAGCTGTACCGTCACATGA TTGTTTACATTTATAGCATC)-3'(서열 번호86)
공통 서열KF3 : 5'-Dd(ATACCGATGAGTGTGCTACC)-3'(서열 번호87)
공통 서열KR3 : 5'-Dd(TGGCCTGTGTGACACTATGC)-3'(서열 번호88)
프라이머KF3-Fj3 : 5'-Dd(ATACCGATGAGTGTGCTACC TGGTTTTAAAACTCTGATAC)-3'(서열 번호89)
프라이머KR3-Rj3 : 5'-Dd(TGGCCTGTGTGACACTATGC AGTATGATGAGGGTGTAACA)-3'(서열 번호90)
(2) 인공 핵산(아조벤젠) 삽입 프라이머, 및, 비오틴 수식 프라이머의 합성
본 실시예에서는, 공정(1)에서 제작한 조인트 프라이머 세트가 각각 증폭하는 3종류의 PCR 증폭 단편에 결합할 수 있도록, 각각의 조인트 프라이머와 동일한 공통 서열을 갖는 프라이머를 3조 설계했다. 3조의 각각의 한쪽의 프라이머로서 5' 말단을 비오틴화 수식한 프라이머, KF1, KF2, 및, KF3을 합성했다. 또한, 3조의 각각의 또 다른 한쪽의 프라이머로서, 5' 말단 측에 인공 핵산인 아조벤젠을 함유하는 폴리머라제 반응 저해 영역(X), 및 태그 서열T34, 태그 서열T35, 및, 태그 서열T36을 도입한 태그 부착 프라이머, T34-X-KR1, T35-X-KR2, 및, T36-X-KR3을 합성했다. 이 6종의 수식 프라이머는 츠쿠바올리고서비스 가부시키가이샤에서 수탁 합성을 행하여 구입했다. 제작한 3조의 프라이머 세트를 이하에 나타낸다.
태그 서열T34 : 5'-Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA)-3'(서열 번호91)
프라이머KF1 : 5'-Biotin-Dd(TGGGCTGACCTAGAGGTCTT)-3'(서열 번호92)
프라이머T34-X-KR1 : 5'-Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA X ATGAAATGCAGGCCATTCGG)-3'(서열 번호93)
태그 서열T35 : 5'-Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA)-3'(서열 번호94)
프라이머KF2 : 5'-Biotin-Dd(CCGGAACAGACACCAGGTTT)-3'(서열 번호95)
프라이머T35-X-KR2 : 5'-Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA X GAAGCTGTACCGTCACATGA)-3'(서열 번호96)
태그 서열T36 : 5'-Dd(TACTTTAGAGGAAACTGCTGAG)-3'(서열 번호97)
프라이머KF3 : 5'-Biotin-Dd(ATACCGATGAGTGTGCTACC)-3'(서열 번호98)
프라이머T36-X-KR3 : 5'-Dd(TACTTTAGAGGAAACTGCTGAG X TGGCCTGTGTGACACTATGC)-3'(서열 번호99)
(3) 조인트 프라이머, 및, 아조벤젠 삽입 프라이머를 사용한 PCR 반응
상기 공정(1) 및 (2)에서 실시하여 제작한 6조의 프라이머 세트를 사용한 PCR 반응을 행했다. 프라이머KF1-Fj1, 프라이머KR1-Rj1, 프라이머KF2-Fj2, 프라이머KR2-Rj2, 프라이머KF3-Fj3, 프라이머KR3-Rj3, 프라이머KF1, 프라이머T34-X-KR1, 프라이머KF2, 프라이머T35-X-KR2, 프라이머KF3, 프라이머T36-X-KR3을 각 8p㏖과, 각 템플레이트 10ng을 0.2㎖의 PCR용 튜브에 넣어, ExTaq PCR 디바이스(다카라바이오사제)의 설명서에 따라, 100㎕의 PCR 반응액을 조제했다. 반응액은 다음 5종류를 준비했다.
(ⅰ) 템플레이트로서 pUC19(다카라바이오사제)를 첨가
(ⅱ) 템플레이트로서 EcoRI 메틸라아제 유전자를 첨가
(ⅲ) 템플레이트로서 BamHI 메틸라아제 유전자를 첨가
(ⅳ) 템플레이트로서 pUC19(다카라바이오사제), EcoRI 메틸라아제 유전자, 및, BamHI 메틸라아제 유전자의 3종류 전부 첨가, 그리고,
(ⅴ) 템플레이트 없음
이들 반응액을 조제 후, 튜브를 서멀 사이클러(GeneAmp PCR System, 어플라이드 바이오시스템사제)에 세트하고, 95℃에서 5분간 열처리 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초 사이클을 30회 행하여, 각각 목적의 서열을 갖는 DNA 단편을 다음과 같이 얻었다. (ⅰ) 약 360bp, (ⅱ) 약 230bp, (ⅲ) 약 130bp, 및, (ⅳ) 약 360bp, 약 230bp, 약 130bp의 3종류, (ⅴ) 증폭 DNA 단편 없음(네가티브 컨트롤로 한다)을 증폭했다.
(4) 금 콜로이드 결합 스트렙트아비딘의 제작
Gold Colloid(입경 40㎚, British BioCell International사제)와 스트렙트아비딘을 혼합하고, 50℃에서 16시간 인큐베이트했다. 6000rpm으로 15분간 원심 분리하고, 상청을 제거, 0.05M 염화나트륨, 5mM 인산 버퍼, pH7을 첨가하여 혼화 후, 다시 50℃에서 40시간 인큐베이트했다.
인큐베이트 후, 원심(6000rpm, 15분간)을 행하고, 상청을 제거하여, 5mM 인산 버퍼(pH7)를 첨가했다. 이 버퍼 치환을 다시 행했다.
조제한 금 콜로이드 용액을 글래스 파이버제 패드에 균일해지도록 첨가한 후, 진공 건조기로 건조시켜, 컨쥬게이션 패드로 했다.
(5) 3종의 올리고뉴클레오티드 프로브의 고상에의 고정화
서열 번호91에 상보적인 서열(서열 번호100)을 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브, 서열 번호94에 상보적인 서열(서열 번호101)을 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브, 및, 서열 번호97에 상보적인 서열(서열 번호102)을 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성한다. 그들의 프로브 용액을 니트로셀룰로오스 멤브레인(상품명 : Hi-Flow 135, 밀리포어사제) 상의 3개소에 디스펜서를 사용하여, 상류 측으로부터 순서대로 서로 떨어진 위치에서 라인 상에 도포하고, 40℃에서 30분간 풍건했다. 3개의 검출 라인을 제작했다.
올리고뉴클레오티드 프로브37 : 5'-Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)-3'(서열 번호100).
올리고뉴클레오티드 프로브38 : 5'-Dd(TATGATATGCTTCTCCACGCATAAT)-3'(서열 번호101).
올리고뉴클레오티드 프로브39 : 5'-Dd(CTCAGCAGTTTCCTCTAAAGTA)-3'(서열 번호102).
(6) 핵산 크로마토그래피형 테스트 스트립의 제작
백킹 시트로 이루어지는 기재에, 상기에서 제작한 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 이루어지는 크로마토그래피 매체, 공정(4)에서 제작한 컨쥬게이션 패드, 시료 첨가부인 범용성의 샘플 패드, 전개한 시료나 표지 물질을 흡수하기 위한 흡수 패드를 도 6에 나타낸 바와 같이 첩합하여, 비오틴 수식 프라이머와 아조벤젠 삽입 프라이머의 세트를 사용한 PCR 증폭 산물의 검출용 테스트립을 제작했다.
(7) 테스트 스트립에 의한 PCR 산물의 검출
공정(3)에서 제작한 (ⅰ)∼(ⅴ)의 PCR 산물을 각각 변성하지 않고, 즉시 공정(6)에서 제작한 테스트 스트립 상의 시료 첨가 부위에 각각 어플라이하고, 크로마토그래피에 의한 검출을 행했다. 그 결과는 이하에 나타낸다.
(ⅰ) : 1개째의 검출 라인만 착색
(ⅱ) : 2개째의 검출 라인만 착색
(ⅲ) : 3개째의 검출 라인만 착색
(ⅳ) : 1개째, 2개째, 3개째의 검출 라인이 각각 착색
(ⅴ) : 어느 검출 라인도 착색은 인정되지 않음
이 결과로부터, 각각의 표적 유전자 특이적으로 검출이 가능하며, 3종류의 검출도 확인할 수 있었다. 또한, 크로마토그래피에 의한 검출에 요한 시간은, 10∼15분으로 단시간이었다.
<실시예10>
(1) 인공 핵산(아조벤젠) 삽입 프라이머의 합성
본 실시예에서는, 표적으로서 플러스미드 pUC19를 도입한 대장균(E.coli DH5α)을 사용한다. pUC19가 주형이 될 때에, PCR 증폭에 의해 약 330염기쌍이 증폭하도록 포워드 프라이머(F) 및 리버스 프라이머(R)를 설계했다. 각각의 5' 말단 측에 인공 핵산인 아조벤젠을 함유하는 폴리머라제 반응 저해 영역(X), 및 태그 서열T37 및 T38을 도입한 태그 부착 프라이머, T37-X-F 및 T38-X-R을 합성했다. 이 2종의 아조벤젠 삽입 프라이머는 츠쿠바올리고서비스 가부시키가이샤에서 수탁 합성을 행하여 구입했다. 본 검토에서 제작한 프라이머 세트를 나타낸다.
태그 서열T37 : 5'-Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG)-3'(서열 번호103)
태그 서열T38 : 5'-Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA)-3'(서열 번호104)
프라이머F : 5'-Dd(GGAAACAGCTATGACCATGA)-3'(서열 번호105)
프라이머R : 5'-Dd(TCTATGCGGCATCAGAGCAG)-3'(서열 번호106)
프라이머T37-X-F : 5'-Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG X GGAAACAGCTATGACCATGA)-3'(서열 번호107)
프라이머T38-X-R : 5'-Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA X TCTATGCGGCATCAGAGCAG)-3'(서열 번호108)
(2) 아조벤젠 삽입 프라이머 세트를 사용한 PCR 반응
플러스미드 pUC19를 도입한 대장균(E.coli DH5α)의 콜로니를 취하여, 1㎖ 수중에 혼화했다. 상기 공정(1)에서 제작한 프라이머 세트를 사용한 PCR 반응을 행했다. 프라이머F와 프라이머R을 각 5p㏖과, 상기 대장균의 현탁액 1㎕를 0.2㎖의 PCR용 튜브에 넣고, ExTaqPCR 디바이스(다카라바이오사제)의 설명서에 따라, 25㎕의 PCR 반응액을 조제했다. 그 후, 튜브를 서멀 사이클러(GeneAmp PCR System, 어플라이드 바이오시스템사제)에 세트하고, 95℃에서 5분간 열처리 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초 사이클을 30회 행하여, 목적의 약 330bp를 증폭했다. 또한, 현탁액을 첨가하지 않고 같은 반응을 행하여, 네가티브 컨트롤로 했다.
(3) 금 콜로이드 결합 올리고뉴클레오티드 프로브의 제작
Gold Colloid(10㎚, 5.7×1012(입자수/㎖), British BioCell International사제)와 항FITC 항체 용액(5mM 인산 버퍼, pH7)을 혼합하고, 20분, 실온에서 정치했다. 1% BSA, 0.1% PEG 용액을 1/2양 첨가하고, 10000rpm으로 25분간 원심 분리하고, 상청을 제거, 1% BSA, 0.1% PEG 용액을 첨가하여 혼화 후, 10000rpm으로 25분간 원심 분리했다. 원심 후에 상청을 제거하고, 5mM 인산 버퍼(pH7)를 첨가했다. 이 버퍼 치환을 다시 행했다.
조제한 금 콜로이드 용액에 3' 말단 FITC 수식 올리고뉴클레오티드 프로브40(서열 번호109, 서열 번호103의 상보쇄)을 혼합하고, 글래스 파이버제 패드에 균일해지도록 첨가한 후, 진공 건조기로 건조시켜, 컨쥬게이트 패드로 했다.
올리고뉴클레오티드 프로브40 : 5'-Dd(CTATAAACCCAGTGAAAAATGTTGCCA)-FITC-3'(서열 번호109).
(4) 올리고뉴클레오티드 프로브의 고상에의 고정화
서열 번호104에 상보적인 서열(서열 번호110)을 갖는 3' 말단 비오틴 수식 올리고뉴클레오티드 프로브41을, 스트렙트아비딘과 혼합한다. 그 혼합액을 니트로셀룰로오스 멤브레인(상품명 : Hi-Flow 180, 밀리포어사제)에 디스펜서를 사용하여 라인 상에 도포하고, 40℃에서 30분간 풍건했다.
올리고뉴클레오티드 프로브41 : 5'-Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)-Biotin-3'(서열 번호110).
(5) 핵산 크로마토그래피형 테스트 스트립의 제작
백킹 시트로 이루어지는 기재에, 상기에서 제작한 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 이루어지는 크로마토그래피 매체, 컨쥬게이션 패드, 시료 첨가부인 범용성의 샘플 패드, 전개한 시료나 표지 물질을 흡수하기 위한 흡수 패드를 도 6에 나타낸 바와 같이 첩합하여, 아조벤젠 삽입 프라이머 세트를 사용한 PCR 증폭 산물의 검출용 테스트 스트립을 제작했다.
(6) 테스트 스트립에 의한 PCR 산물의 검출
공정(2)에서 제작한 PCR 산물을 변성하지 않고, 즉시 공정(5)에서 제작한 테스트 스트립 상의 시료 첨가 부위에 어플라이하고, 크로마토그래피에 의한 검출을 행했다. 공정(2)에서 검체로서 대장균을 첨가했을 경우, 테스트 라인 상에 표적 핵산 특이적인 착색 라인이 검출되었다. 한편, 네가티브 컨트롤로서 대장균을 첨가하지 않을 경우, 라인의 검출은 인정되지 않았다. 또한, 크로마토그래피에 의한 검출에 요한 시간은, 10∼15분으로 단시간이었다.
1. 프라이머 영역
2. 태그 영역
3. 폴리머라제 반응 저해 영역(스페이서 영역)
4. 제1 프라이머(조인트 프라이머)의 프라이머 영역
5. 제1 프라이머(조인트 프라이머)의 공통 영역
6. 제2 프라이머의 공통 영역
7. 제2 프라이머의 태그 영역
8. 제2 프라이머의 폴리머라제 반응 저해 영역(스페이서 영역)
9. 표적 핵산 서열
10. 포워드 프라이머
11. 포워드 프라이머의 프라이머 영역
12. 포워드 프라이머의 태그 영역
13. 리버스 프라이머
14. 리버스 프라이머의 프라이머 영역
15. 리버스 프라이머의 태그 영역
16. 부분 2본쇄 핵산 구조를 갖는 PCR 산물
17. 표적 핵산 서열
18. 포워드 제1 프라이머
19. 포워드 제1 프라이머의 프라이머 영역
20. 포워드 제1 프라이머의 태그 영역
21. 리버스 제1 프라이머
22. 리버스 제1 프라이머의 프라이머 영역
23. 리버스 제1 프라이머의 태그 영역
24. 제1 프라이머에 의한 2본쇄 PCR 산물
25. 포워드 제2 프라이머
26. 포워드 제2 프라이머의 프라이머 영역
27. 포워드 제2 프라이머의 태그 영역
28. 리버스 제2 프라이머
29. 리버스 제2 프라이머의 프라이머 영역
30. 리버스 제2 프라이머의 태그 영역
31. 부분 2본쇄 핵산 구조를 갖는 PCR 산물
32. 샘플 패드
33. 컨쥬게이트 패드
34. 포착용 올리고뉴클레오티드를 유지한 담체
35. 흡수 패드
36. 기재
37. 테스트 라인
38. 컨트롤 라인
39. 표지 분자 결합용 올리고뉴클레오티드
40. 표지 분자
41. PCR 산물-표지 분자 복합체
42. 다공질 멤브레인
43. 포착용 올리고뉴클레오티드
44. 포착용 올리고뉴클레오티드를 각 웰에 유지한 담체(마이크로어레이)
45. 포착용 올리고뉴클레오티드를 유지한 비드 담체
SEQUENCE LISTING <110> KANEKA CORPORATION <120> AMPLIFIED NUCLEIC ACID DETECTION METHOD AND DETECTION DEVICE <130> B100423WO01 <150> JP2010-261728 <151> 2010-11-24 <150> JP2011-143424 <151> 2011-06-28 <160> 110 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer F <400> 1 ggaaacagct atgaccatga 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer R <400> 2 ctatgcggca tcagagcag 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Tag sequence T1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> L-form DNA <400> 3 gacaacggag acagagccaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Tag sequence T2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> L-form DNA <400> 4 atgctaccgt atgcccagtg 20 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer T1-F <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> L-form DNA <400> 5 gacaacggag acagagccaa ggaaacagct atgaccatga 40 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer T2-R <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> L-form DNA <400> 6 atgctaccgt atgcccagtg ctatgcggca tcagagcag 39 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe 1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> L-form DNA <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> modified with amino group. <400> 7 ttggctctgt ctccgttgtc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe 2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> L-form DNA <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> modified with amino group. <400> 8 cactgggcat acggtagcat 20 <210> 9 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR inhibitory sequence H <400> 9 aggcgaggtc gcgagcgcac atgtgcgctc gcgacctcgc ct 42 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Tag sequence T3 <400> 10 tatgatatgc ttctccacgc ataat 25 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Tag sequence T4 <400> 11 tgctctgtac acttgctcaa t 21 <210> 12 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer T3-H-F <400> 12 tatgatatgc ttctccacgc ataataggcg aggtcgcgag cgcacatgtg cgctcgcgac 60 ctcgcctgga aacagctatg accatga 87 <210> 13 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer T4-H-R <400> 13 tgctctgtac acttgctcaa taggcgaggt cgcgagcgca catgtgcgct cgcgacctcg 60 cctctatgcg gcatcagagc ag 82 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe 3 <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> modified with amino group. <400> 14 attatgcgtg gagaagcata tcata 25 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe 4 <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> modified with amino group. <400> 15 attgagcaag tgtacagagc a 21 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Tag sequence T5 <400> 16 tggcaacatt tttcactggg tttatag 27 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Tag sequence T6 <400> 17 ggttagcttc caaccacgtg tagatca 27 <210> 18 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer T5-X-F <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is the azobenzene represented by Formula (1) of the specification. <400> 18 tggcaacatt tttcactggg tttatagngg aaacagctat gaccatga 48 <210> 19 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer T6-X-R <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is the azobenzene represented by Formula (1) of the specification. <400> 19 ggttagcttc caaccacgtg tagatcantc tatgcggcat cagagcag 48 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe 5 <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> modified with amino group. <400> 20 ctataaaccc agtgaaaaat gttgcca 27 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe 6 <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> modified with amino group. <400> 21 gatcatacac gtggttggaa gctaacc 27 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe 7 <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> modified with thiol group. <400> 22 ctataaaccc agtgaaaaat gttgcca 27 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe 8 <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> modified with biotin. <400> 23 gatcatacac gtggttggaa gctaacc 27 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe 9 <400> 24 gatcatacac gtggttggaa gctaacc 27 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Tag sequence T10 <400> 25 tggcaacatt tttcactggg tttatag 27 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Tag sequence T11 <400> 26 ggttagcttc caaccacgtg tagatca 27 <210> 27 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer T10-X-F1 <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is the azobenzene represented by Formula (1) of the specofocati on. <400> 27 tggcaacatt tttcactggg tttatagngg aaacagctat gaccatga 48 <210> 28 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer T11-X-R1 <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is the azobenzene represented by Formula (1) of the specificati on. <400> 28 ggttagcttc caaccacgtg tagatcantc tatgcggcat cagagcag 48 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Tag sequence T12 <400> 29 cgcattgagc aagtgtacag agcat 25 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Tag sequence T13 <400> 30 attatgcgtg gagaagcata tcata 25 <210> 31 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer T12-X-F2 <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is the azobenzene represented by Formula (1) of the specificati on. <400> 31 cgcattgagc aagtgtacag agcatnagca ttatgaatta tatggt 46 <210> 32 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer T13-X-R2 <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is the azobenzene represented by Formula (1) of the specificati on. <400> 32 attatgcgtg gagaagcata tcatanttgt ttacatttat agcatc 46 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Tag sequence T14 <400> 33 aattgcgcat gtccatgtgt aa 22 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Tag sequence T15 <400> 34 tactttagag gaaactgctg ag 22 <210> 35 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer T14-X-F3 <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is the azobenzene represented by Formula (1) of the specificati on. <400> 35 aattgcgcat gtccatgtgt aantggtttt aaaactctga tac 43 <210> 36 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer T15-X-R3 <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is the azobenzene represented by Formula (1) of the specificati on. <400> 36 tactttagag gaaactgctg agnagtatga tgagggtgta aca 43 <210> 37 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe 16 <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> modified with amino group. <400> 37 ctataaaccc agtgaaaaat gttgcca 27 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe 17 <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> modified with amino group. <400> 38 ttgctctgta cacttgctca atgcg 25 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe 18 <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> modified with amino group. <400> 39 ttacacatgg acatgcgcaa tt 22 <210> 40 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe 19 <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> modified with biotin. <400> 40 gatcatacac gtggttggaa gctaacc 27 <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe 20 <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> modified with biotin. <400> 41 tatgatatgc ttctccacgc ataat 25 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe 21 <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> modified with biotin. <400> 42 ctcagcagtt tcctctaaag ta 22 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence KF1 <400> 43 tgggctgacc tagaggtctt 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence KR1 <222> (1)..(20) <223> <400> 44 atgaaatgca ggccattcgg 20 <210> 45 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer KF1-Fj1 <400> 45 tgggctgacc tagaggtctt ggaaacagct atgaccatga 40 <210> 46 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer KR1-Rj1 <400> 46 atgaaatgca ggccattcgg tctatgcggc atcagagcag 40 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence KF2 <400> 47 ccggaacaga caccaggttt 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence KR2 <400> 48 gaagctgtac cgtcacatga 20 <210> 49 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer KF2-Fj2 <400> 49 ccggaacaga caccaggttt agcattatga attatatggt 40 <210> 50 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer KR2-Rj2 <400> 50 gaagctgtac cgtcacatga ttgtttacat ttatagcatc 40 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence KF3 <400> 51 ataccgatga gtgtgctacc 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence KR3 <400> 52 tggcctgtgt gacactatgc 20 <210> 53 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer KF3-Fj3 <400> 53 ataccgatga gtgtgctacc tggttttaaa actctgatac 40 <210> 54 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer KR3-Rj3 <400> 54 tggcctgtgt gacactatgc agtatgatga gggtgtaaca 40 <210> 55 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Tag sequence T22 <400> 55 tggcaacatt tttcactggg tttatag 27 <210> 56 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Tag sequence T23 <400> 56 ggttagcttc caaccacgtg tagatca 27 <210> 57 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer T22-X-KF1 <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is the azobenzene represented by Formula (1) of the specificati on. <400> 57 tggcaacatt tttcactggg tttatagntg ggctgaccta gaggtctt 48 <210> 58 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer T23-X-KR1 <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is the azobenzene represented by Formula (1) of the specificati on. <400> 58 ggttagcttc caaccacgtg tagatcanat gaaatgcagg ccattcgg 48 <210> 59 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Tag sequence T24 <400> 59 cgcattgagc aagtgtacag agcat 25 <210> 60 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Tag sequence T25 <400> 60 attatgcgtg gagaagcata tcata 25 <210> 61 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer T24-X-KF2 <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is the azobenzene represented by Formula (1) of the specificati on. <400> 61 cgcattgagc aagtgtacag agcatnccgg aacagacacc aggttt 46 <210> 62 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer T25-X-KR2 <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is the azobenzene represented by Formula (1) of the specificati on. <400> 62 attatgcgtg gagaagcata tcatangaag ctgtaccgtc acatga 46 <210> 63 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Tag sequence T26 <400> 63 aattgcgcat gtccatgtgt aa 22 <210> 64 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Tag sequence T27 <400> 64 tactttagag gaaactgctg ag 22 <210> 65 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer T26-X-KF3 <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is the azobenzene represented by Formula (1) of the specificati on. <400> 65 aattgcgcat gtccatgtgt aanataccga tgagtgtgct acc 43 <210> 66 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer T27-X-KR3 <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is the azobenzene represented by Formula (1) of the specificati on. <400> 66 tactttagag gaaactgctg agntggcctg tgtgacacta tgc 43 <210> 67 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe 28 <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> modified with amino group. <400> 67 ctataaaccc agtgaaaaat gttgcca 27 <210> 68 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe 29 <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> modified with amino group. <400> 68 ttgctctgta cacttgctca atgcg 25 <210> 69 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe 30 <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> modified with amino group. <400> 69 ttacacatgg acatgcgcaa tt 22 <210> 70 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe 31 <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> modified with biotin. <400> 70 gatcatacac gtggttggaa gctaacc 27 <210> 71 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe 32 <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> modified with biotin. <400> 71 tatgatatgc ttctccacgc ataat 25 <210> 72 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe 33 <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> modified with biotin. <400> 72 ctcagcagtt tcctctaaag ta 22 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence KF <400> 73 tgggctgacc tagaggtctt 20 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence KR <400> 74 atgaaatgca ggccattcgg 20 <210> 75 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer KF-F <400> 75 tgggctgacc tagaggtctt ggaaacagct atgaccatga 40 <210> 76 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer KR-R <400> 76 atgaaatgca ggccattcgg tctatgcggc atcagagcag 40 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer KF2 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> modified with biotin. <400> 77 tgggctgacc tagaggtctt 20 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer KR2 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> modified with FITC. <400> 78 atgaaatgca ggccattcgg 20 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence KF1 <400> 79 tgggctgacc tagaggtctt 20 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence KR1 <222> (1)..(20) <223> <400> 80 atgaaatgca ggccattcgg 20 <210> 81 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer KF1-Fj1 <400> 81 tgggctgacc tagaggtctt ggaaacagct atgaccatga 40 <210> 82 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer KR1-Rj1 <400> 82 atgaaatgca ggccattcgg tctatgcggc atcagagcag 40 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence KF2 <400> 83 ccggaacaga caccaggttt 20 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence KR2 <400> 84 gaagctgtac cgtcacatga 20 <210> 85 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer KF2-Fj2 <400> 85 ccggaacaga caccaggttt agcattatga attatatggt 40 <210> 86 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer KR2-Rj2 <400> 86 gaagctgtac cgtcacatga ttgtttacat ttatagcatc 40 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence KF3 <400> 87 ataccgatga gtgtgctacc 20 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence KR3 <400> 88 tggcctgtgt gacactatgc 20 <210> 89 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer KF3-Fj3 <400> 89 ataccgatga gtgtgctacc tggttttaaa actctgatac 40 <210> 90 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer KR3-Rj3 <400> 90 tggcctgtgt gacactatgc agtatgatga gggtgtaaca 40 <210> 91 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Tag sequence T34 <400> 91 ggttagcttc caaccacgtg tagatca 27 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer KF1 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> modified with biotin. <400> 92 tgggctgacc tagaggtctt 20 <210> 93 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer T34-X-KR1 <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is the azobenzene represented by Formula (1) of the specificati on. <400> 93 ggttagcttc caaccacgtg tagatcanat gaaatgcagg ccattcgg 48 <210> 94 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Tag sequence T35 <400> 94 attatgcgtg gagaagcata tcata 25 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer KF2 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> modified with biotin. <400> 95 ccggaacaga caccaggttt 20 <210> 96 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer T35-X-KR2 <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is the azobenzene represented by Formula (1) of the specificati on. <400> 96 attatgcgtg gagaagcata tcatangaag ctgtaccgtc acatga 46 <210> 97 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Tag sequence T36 <400> 97 tactttagag gaaactgctg ag 22 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer KF3 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> modified with biotin. <400> 98 ataccgatga gtgtgctacc 20 <210> 99 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer T36-X-KR3 <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is the azobenzene represented by Formula (1) of the specificati on. <400> 99 tactttagag gaaactgctg agntggcctg tgtgacacta tgc 43 <210> 100 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe 37 <400> 100 gatcatacac gtggttggaa gctaacc 27 <210> 101 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe 38 <400> 101 tatgatatgc ttctccacgc ataat 25 <210> 102 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe 39 <400> 102 ctcagcagtt tcctctaaag ta 22 <210> 103 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Tag sequence T37 <400> 103 tggcaacatt tttcactggg tttatag 27 <210> 104 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Tag sequence T38 <400> 104 ggttagcttc caaccacgtg tagatca 27 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer F <400> 105 gg aaacagctat gaccatga 20 <210> 106 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer R <400> 106 tc tatgcggcat cagagcag 20 <210> 107 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer T37-X-F <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is the azobenzene represented by Formula (1) of the specification. <400> 107 tggcaacatt tttcactggg tttatagngg aaacagctat gaccatga 48 <210> 108 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer T38-X-R <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is the azobenzene represented by Formula (1) of the specification. <400> 108 ggttagcttc caaccacgtg tagatcantc tatgcggcat cagagcag 48 <210> 109 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe 40 <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> modified with FITC. <400> 109 ctataaaccc agtgaaaaat gttgcca 27 <210> 110 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe 41 <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> modified with biotin. <400> 110 gatcatacac gtggttggaa gctaacc 27

Claims (15)

  1. 양말단에 천연 뉴클레오티드를 포함하는 1본쇄 영역을 갖는 2본쇄 DNA 증폭 단편의 한쪽의 1본쇄 영역과, 고상 상에 고정한 제1 올리고뉴클레오티드 프로브를, 하이브리다이즈시키는 공정을 포함하는 핵산 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 DNA 증폭 단편의 다른 쪽의 1본쇄 영역과, 표지 물질이 결합한 제2 올리고뉴클레오티드 프로브를, 하이브리다이즈시키는 공정을 더 포함하는 핵산 검출 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    표지 물질이 착색 담체(擔體)로 이루어져, 상기 DNA 증폭 단편을 목시(目視) 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 핵산 검출 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 DNA 증폭 단편을 핵산 검출 디바이스 상에서 검출하는 공정을 포함하는 핵산 검출 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    크로마토그래피로 상기 DNA 증폭 단편을 검출하는 핵산 검출 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    하기 공정(a)∼(c) :
    (a) 상기 핵산 검출 디바이스 상의, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정되어 있는 영역과는 다른 영역에, 상기 DNA 증폭 단편을 배치하는 공정,
    (b) 용매를 사용하여, 상기 DNA 증폭 단편을, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정되어 있는 영역의 방향으로, 상기 디바이스 상에서 확산시키는 공정, 및
    (c) 상기 제1 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정되어 있는 영역에 있어서, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 프로브와, 상기 DNA 증폭 단편을, 하이브리다이즈시키는 공정
    을 포함하는 핵산 검출 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 공정(c) 전에, 상기 DNA 증폭 단편과, 상기 표지 물질이 결합한 제2 올리고뉴클레오티드 프로브를 하이브리다이즈시키는 공정을 더 포함하는 핵산 검출 방법.
  8. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    (d) 상기 핵산 검출 디바이스 상의, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정되어 있는 영역과는 각각 다른 영역에, 상기 DNA 증폭 단편, 및 상기 표지 물질이 결합한 제2 올리고뉴클레오티드 프로브를 각각 배치하고,
    (e) 용매를 사용하여, 상기 DNA 증폭 단편을, 상기 표지 물질이 결합한 제2 올리고뉴클레오티드 프로브가 배치되어 있는 영역의 방향으로 확산시키고,
    (f) 상기 표지 물질이 결합한 제2 올리고뉴클레오티드 프로브가 배치되어 있는 영역에 있어서, 상기 DNA 증폭 단편과, 표지 물질이 결합한 제2 올리고뉴클레오티드 프로브를 하이브리다이즈시키고,
    (g) 공정(f)에서 하이브리다이즈한 복합체를 상기 제1 올리고뉴클레오티드 프로브가 배치되어 있는 방향으로, 전개 매체 상에서 확산시키고,
    (h) 상기 제1 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정되어 있는 영역에 있어서, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 프로브와 상기 복합체를 하이브리다이즈시키는,
    핵산 검출 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 천연 뉴클레오티드를 포함하는 1본쇄 영역이, 2본쇄 DNA 영역과 동일 방향으로 이루어지는 서열인 것을 특징으로 하는 핵산 검출 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 DNA 증폭 단편은, 핵산 증폭 반응에 있어서 2본쇄화되지 않는 태그 영역을 갖는 2개의 프라이머를 사용하여 핵산 증폭법에 의해 얻어진 산물인 것을 특징으로 하는 핵산 검출 방법.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 DNA 증폭 단편이, 표적 핵산의 주형에 하이브리다이즈 가능한 서열, 및, 당해 주형에 하이브리다이즈 불가능한 공통 서열을 갖는 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트, 및, 상기 공통 서열의 상보 서열과 하이브리다이즈 가능한 서열, 및 핵산 증폭 반응에 있어서 2본쇄화되지 않는 태그 영역을 갖는 프라이머를 포함하는 제2 프라이머 세트를 사용하여, 핵산 증폭법에 의해 얻어진 산물인 것을 특징으로 하는 핵산 검출 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 핵산 증폭 반응에 있어서 2본쇄화되지 않는 태그 영역이, 천연 뉴클레오티드로 이루어지고, 공통 서열의 상보 서열과 하이브리다이즈 가능한 서열과 동일 방향으로 이루어지는 서열인 것을 특징으로 하는 핵산 검출 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 핵산 검출 방법에 사용하는 핵산 검출 디바이스로서, 상기 DNA 증폭 단편을 배치하는 영역, 상기 DNA 증폭 단편과 결합하는 상기 제1 올리고뉴클레오티드 프로브를 유지한 크로마토그래피 담체, 및, 표지 물질이 결합한 상기 제2 올리고뉴클레오티드 프로브를 구비하여 이루어지는 검출 디바이스.
  14. 핵산 증폭 반응에 있어서 2본쇄화되지 않는 태그 영역을 갖는 2개의 프라이머를 사용하여 핵산 증폭법에 의해 얻어지는, 양말단에 천연 뉴클레오티드를 포함하는 1본쇄 영역을 갖는 2본쇄 DNA 증폭 단편.
  15. 제14항에 있어서,
    프라이머의, 핵산 증폭 반응에 있어서 2본쇄화되지 않는 태그 영역이, 천연 뉴클레오티드로 이루어지고, 프라이머 전장(全長)이 동일 방향으로 이루어지는 서열인 것을 특징으로 하는 2본쇄 DNA 증폭 단편.
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Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2012070618A1 (ja) 2010-11-24 2014-05-19 株式会社カネカ 増幅核酸検出方法及び検出デバイス
MY157586A (en) * 2011-09-14 2016-06-16 Ngk Insulators Ltd Method for detecting target nucleic acid
JP5932808B2 (ja) * 2011-09-14 2016-06-08 日本碍子株式会社 標的核酸の検出方法
JP2013198482A (ja) * 2012-02-22 2013-10-03 Nippon Meat Packers Inc 核酸の検出方法
CN104254620B (zh) * 2012-04-27 2022-11-08 株式会社钟化 核酸的扩增方法及扩增核酸的检测方法
BE1020816A5 (fr) * 2012-07-04 2014-05-06 Coris Bioconcept Sprl Procede et dispositif pour la detection rapide de sequences nucleotidiques amplifiees.
JP6321318B2 (ja) * 2012-09-14 2018-05-09 日本碍子株式会社 標的核酸の検出方法
JP5967785B2 (ja) * 2013-07-24 2016-08-10 日本碍子株式会社 標的核酸の検出方法
WO2015076356A1 (ja) * 2013-11-22 2015-05-28 株式会社カネカ 短鎖ｒｎａの検出方法
CA2938817A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. Nucleic acid detection or quantification method using mask oligonucleotide, and device for same
EP3216852A4 (en) * 2014-11-04 2018-09-26 Toppan Printing Co., Ltd. Method for introducing nucleic acid, method for detecting nucleic acid, method for analyzing biological component, array device for biological component assay, and kit for analyzing biological component
JP6616574B2 (ja) * 2015-01-30 2019-12-04 倉敷紡績株式会社 目視判定可能な遺伝子検査
CN105713964A (zh) * 2015-03-13 2016-06-29 常州易顺生物技术有限公司 一种基于PCR扩增产生单链标签Tag的方法
JP2018133998A (ja) * 2015-07-03 2018-08-30 株式会社カネカ 標的核酸の検出法
CN104928397B (zh) * 2015-07-15 2018-04-10 福建省农业科学院植物保护研究所 豇豆疫霉菌pcr检测引物及其检测方法
JP6679852B2 (ja) * 2015-07-28 2020-04-15 東ソー株式会社 核酸の検出方法および当該方法を利用した試薬キット
JP6829198B2 (ja) * 2015-08-26 2021-02-10 株式会社カネカ 核酸検出用デバイス及び核酸検出方法
JP6523874B2 (ja) * 2015-08-27 2019-06-05 株式会社理研ジェネシス 核酸増幅基板、該基板を用いた核酸増幅方法、及び核酸検出キット
JP2017200446A (ja) * 2016-05-02 2017-11-09 東洋製罐グループホールディングス株式会社 核酸クロマトグラフィー検査器具、核酸クロマトグラフィー検査キット、及び核酸クロマトグラフィー検査器具の使用方法
WO2018003550A1 (ja) 2016-07-01 2018-01-04 株式会社カネカ ２以上の標的核酸を検出するためのプライマーセット、キット及び方法
AU2017325833B2 (en) * 2016-09-15 2022-06-16 Abbott Laboratories Devices and methods for sample analysis
CN106498077B (zh) * 2016-12-09 2019-09-06 青岛千卓分子生物科技有限公司 Dna扩增产物快速检测方法
EP3572509B1 (en) 2017-01-19 2023-09-20 Kaneka Corporation Primer set, probe, kit, and method for detecting mycobacterium kansasii
JP2019170322A (ja) * 2018-03-29 2019-10-10 国立大学法人東北大学 塩基多型の検出方法
JP7068469B2 (ja) * 2018-08-09 2022-05-16 警察庁科学警察研究所長 大麻草ｄｎａを検出するためのプライマー対、キット及び方法
JP7068468B2 (ja) * 2018-08-09 2022-05-16 警察庁科学警察研究所長 大麻草ｄｎａを検出するためのプライマー混合物、キット及び方法
EP3990660A1 (en) * 2019-06-25 2022-05-04 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Methods and devices for identifying pathogens and antibodies and treatment device therefore
EP4083202A1 (en) 2019-12-27 2022-11-02 Kaneka Corporation Primer set and method for detecting target nucleic acid using same
TW202204640A (zh) 2020-04-01 2022-02-01 國立感染症研究所長代表之日本國 判別屬於膿腫分枝桿菌複合群之抗酸菌之erm(41)基因之單鹼基突變之方法、用於該方法之引子組及探針
US11543332B2 (en) * 2021-04-23 2023-01-03 Poppy Health, Inc. System and method for characterizing, monitoring, and detecting bioaerosol presence and movement in an indoor environment
US11597980B2 (en) 2021-07-08 2023-03-07 Poppy Health, Inc. System and method for detecting pathogens in an environment via an electrostatic air sampler
CN114231401B (zh) * 2022-02-21 2022-05-03 北京芯迈微生物技术有限公司 一种核酸检测试剂盒及检测方法

Family Cites Families (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5310650A (en) 1986-09-29 1994-05-10 Abbott Laboratoires Method and device for improved reaction kinetics in nucleic acid hybridizations
CA1303983C (en) * 1987-03-27 1992-06-23 Robert W. Rosenstein Solid phase assay
US5403711A (en) 1987-11-30 1995-04-04 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved
EP0387696B1 (en) 1989-03-17 1997-08-27 Abbott Laboratories Method and device for improved reaction kinetics in nucleic acid hybridizations
US5629158A (en) * 1989-03-22 1997-05-13 Cemu Bitecknik Ab Solid phase diagnosis of medical conditions
GB8920097D0 (en) 1989-09-06 1989-10-18 Ici Plc Amplification processes
JP3408265B2 (ja) 1992-03-13 2003-05-19 国際試薬株式会社 Ｐｃｒ増幅ｄｎａの測定法
US5500375A (en) 1993-04-13 1996-03-19 Serex, Inc. Integrated packaging-holder device for immunochromatographic assays in flow-through or dipstick formats
JP3489102B2 (ja) 1993-09-07 2004-01-19 Ｊｓｒ株式会社 標的核酸の検出方法およびそのためのキット
US6037127A (en) 1994-03-31 2000-03-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for detection of non-denatured nucleic acid fragments
US5475098A (en) * 1994-06-14 1995-12-12 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Distinctive DNA sequence of E. coli 0157:H7 and its use for the rapid, sensitive and specific detection of 0157:H7 and other enterohemorrhagic E. coli
US5925518A (en) 1995-05-19 1999-07-20 Akzo Nobel N.V. Nucleic acid primers for amplification of a mycobacteria RNA template
US20040110167A1 (en) 1995-07-13 2004-06-10 Gerdes John C. Lateral flow system for nucleic acid detection
US5874216A (en) * 1996-02-23 1999-02-23 Ensys Environmental Products, Inc. Indirect label assay device for detecting small molecules and method of use thereof
CZ293215B6 (cs) 1996-08-06 2004-03-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Rekombinantní tepelně stálá DNA polymeráza, způsob její přípravy a prostředek, který ji obsahuje
US6124092A (en) * 1996-10-04 2000-09-26 The Perkin-Elmer Corporation Multiplex polynucleotide capture methods and compositions
GB9812768D0 (en) * 1998-06-13 1998-08-12 Zeneca Ltd Methods
US6136610A (en) * 1998-11-23 2000-10-24 Praxsys Biosystems, Inc. Method and apparatus for performing a lateral flow assay
WO2000040592A1 (en) 1998-12-30 2000-07-13 Oligos Etc. Inc. Acid stable backbone modified end-blocked nucleic acids and therapeutic uses thereof
GB9902970D0 (en) * 1999-02-11 1999-03-31 Zeneca Ltd Novel matrix
DE60029225T2 (de) 1999-07-02 2007-07-05 Invitrogen Corp., Carlsbad Zusammensetzungen und verfahren zu höhere empfindlichkeit und spezifität von nukleinsäuresynthese
WO2001021637A1 (fr) 1999-09-20 2001-03-29 Makoto Komiyama Oligonucleotide sensible a la lumiere
JP2001157598A (ja) * 1999-12-01 2001-06-12 Matsushita Electric Ind Co Ltd 遺伝子検出方法およびその方法を利用した装置
EP1130113A1 (en) * 2000-02-15 2001-09-05 Johannes Petrus Schouten Multiplex ligation dependent amplification assay
GB0016813D0 (en) 2000-07-07 2000-08-30 Lee Helen Improved dipstick assays (4)
GB0016814D0 (en) 2000-07-07 2000-08-30 Lee Helen Improved dipstick assays (3)
GB0016836D0 (en) 2000-07-07 2000-08-30 Lee Helen Improved dipstick assays (1)
GB0016833D0 (en) 2000-07-07 2000-08-30 Lee Helen Improved dipstick assays (2)
DE10046184A1 (de) * 2000-09-18 2002-04-04 November Ag Molekulare Medizin Verfahren zum Nachweis mindestens einer Nukleinsäuresequenz
DE10154291B4 (de) 2001-11-05 2005-05-19 Hain Lifescience Gmbh Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren in Form eines Trockenschnelltestes
EP1465913A4 (en) * 2001-12-21 2008-02-13 Applera Corp HETERO-CONFIGURED POLYNUCLEOTIDE AND METHOD OF USE
JP2003294742A (ja) * 2002-03-29 2003-10-15 Inst Of Physical & Chemical Res ハイブリダイゼーション用基板及びその使用方法
WO2004065582A2 (en) 2003-01-15 2004-08-05 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Amplification of dna in a hairpin structure, and applications
JP3923917B2 (ja) * 2003-03-26 2007-06-06 株式会社東芝 ターゲットの製造方法、標的配列検出方法、ターゲットおよび標的配列検出用アッセイキット
FR2853077B1 (fr) * 2003-03-28 2005-12-30 Vedalab Procedes immunochromatographiques en phase solide
JP5117719B2 (ja) * 2003-04-18 2013-01-16 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 免疫増幅
JP4659734B2 (ja) 2003-05-07 2011-03-30 コリス バイオコンセプト エスピーアールエル 一ステップオリゴクロマトグラフィー装置及びその使用方法
CN1459506A (zh) * 2003-05-30 2003-12-03 山东大学 中国对虾抗菌肽基因的重组表达与应用
JP2006526788A (ja) 2003-06-03 2006-11-24 バイエル・ヘルスケア・エルエルシー 光学検査機器のための検証装置及び方法
JP4518754B2 (ja) * 2003-06-30 2010-08-04 パナソニック株式会社 ヌクレオチド鎖修飾方法
JPWO2006043387A1 (ja) 2004-09-28 2008-05-22 第一化学薬品株式会社 検体の免疫学的検査方法及びその方法に用いる検査器具
JP5165383B2 (ja) * 2004-12-23 2013-03-21 アイ−スタツト・コーポレイシヨン 分子診断システム及び方法
JP4268944B2 (ja) * 2005-01-21 2009-05-27 株式会社カイノス 核酸の検出あるいは定量方法
EP1862558A4 (en) * 2005-02-18 2009-07-15 Japan Science & Tech Agency GENNACHWEISVERFAHREN
WO2006095550A1 (ja) * 2005-03-04 2006-09-14 Kyoto University Ｐｃｒプライマー、それを利用したｐｃｒ法及びｐｃｒ増幅産物、並びにｐｃｒ増幅産物を利用するデバイス及びｄｎａ-タンパク複合体
JP4879975B2 (ja) 2005-05-31 2012-02-22 アプライド バイオシステムズ リミテッド ライアビリティー カンパニー 短い核酸のマルチプレックス増幅
CN100513577C (zh) * 2005-07-04 2009-07-15 北京大学 一种pcr方法
DE102005047617A1 (de) 2005-10-05 2007-04-19 Qiagen Gmbh Polymerase-Kettenreaktions-Verfahren unter Einsatz einer DNA-Polymerase mit Proofreading-Eigenschaft
CA2634735A1 (en) 2005-12-29 2007-07-12 I-Stat Corporation Molecular diagnostics amplification system and methods
WO2007103549A2 (en) 2006-03-08 2007-09-13 Archemix Corp. Complement binding aptamers and anti-c5 agents useful in the treatment of ocular disorders
WO2008105814A2 (en) 2006-08-22 2008-09-04 Los Alamos National Security, Llc Miniturized lateral flow device for rapid and sensitive detection of proteins or nucleic acids
US8377379B2 (en) 2006-12-15 2013-02-19 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Lateral flow assay device
US8314220B2 (en) 2007-01-26 2012-11-20 Agilent Technologies, Inc. Methods compositions, and kits for detection of microRNA
US9689031B2 (en) 2007-07-14 2017-06-27 Ionian Technologies, Inc. Nicking and extension amplification reaction for the exponential amplification of nucleic acids
JP2009050217A (ja) * 2007-08-28 2009-03-12 Olympus Corp 標的ｄｎａを検出する方法
JPWO2009034842A1 (ja) 2007-09-11 2010-12-24 株式会社カネカ 核酸検出方法、および核酸検出キット
US8008019B2 (en) * 2007-11-28 2011-08-30 Luminex Molecular Diagnostics Use of dual-tags for the evaluation of genomic variable repeat regions
JP2009162535A (ja) 2007-12-28 2009-07-23 Sekisui Medical Co Ltd 固相作製用試薬及び該試薬を使用して作製した固相
JP2009296948A (ja) 2008-06-13 2009-12-24 Olympus Corp Ｐｃｒ用プライマー、標的核酸の検出方法及び標的生体分子の検出方法
JP5231106B2 (ja) 2008-07-03 2013-07-10 株式会社カイノス 検体検査用具
EP2352028A4 (en) 2008-11-28 2012-05-02 Konica Minolta Med & Graphic IMMUNOCHROMATOGRAPHY MEDIUM AND IMMUNOCHROMATOGRAPHY PROCEDURE
KR101747091B1 (ko) 2009-03-19 2017-06-14 가부시키가이샤 가네카 핵산의 검출 방법 및 키트, 디바이스
CN102449167B (zh) * 2009-05-26 2014-12-17 厦门大学 一种检测核酸序列变异的方法
EP2789689B1 (en) * 2009-06-29 2016-04-27 Luminex Corporation Chimeric primers with hairpin conformations and methods of using same
CA2796856A1 (en) 2010-05-07 2011-11-10 Quantibact A/S Method for generating a double stranded nucleic acid with a single stranded overhang
CN101845511A (zh) * 2010-06-12 2010-09-29 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种核酸检测方法及其专用试剂盒
EP2580355B1 (en) 2010-06-14 2018-03-07 National University of Singapore Modified stem-loop oligonucleotide mediated reverse transcription and base-spacing constrained quantitative pcr
US9029103B2 (en) * 2010-08-27 2015-05-12 Illumina Cambridge Limited Methods for sequencing polynucleotides
JPWO2012070618A1 (ja) 2010-11-24 2014-05-19 株式会社カネカ 増幅核酸検出方法及び検出デバイス
JP5932808B2 (ja) 2011-09-14 2016-06-08 日本碍子株式会社 標的核酸の検出方法
MY157586A (en) 2011-09-14 2016-06-16 Ngk Insulators Ltd Method for detecting target nucleic acid
CN103946398B (zh) 2011-09-15 2019-08-13 健能泰格技术公司 探针：反义探针组合物对高特异性dna或rna的检测
CN104254620B (zh) 2012-04-27 2022-11-08 株式会社钟化 核酸的扩增方法及扩增核酸的检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN103228785B (zh) 2016-09-07
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WO2012070618A1 (ja) 2012-05-31
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JP5869715B2 (ja) 2016-02-24
EP2644699B1 (en) 2018-02-21
US10829805B2 (en) 2020-11-10
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US9920356B2 (en) 2018-03-20
JP6063069B2 (ja) 2017-01-18
EP2644699A1 (en) 2013-10-02
US20180155771A1 (en) 2018-06-07
JP2016195614A (ja) 2016-11-24

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