JP2018133998A - 標的核酸の検出法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、核酸増幅反応と固相担体上にて核酸増幅産物を検出することを含む標的核酸の検出方法において、プライマーダイマーの非特異的な検出を回避することを可能とする、判定精度の高い検出方法を提供することを目的とする。【解決手段】Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法による核酸増幅反応と固相担体上にて核酸増幅産物を検出することを含む、標的核酸の検出方法。【選択図】なし

Description

本発明は、２段階の核酸増幅反応を利用する標的核酸の増幅と固相担体上にて核酸増幅産物を検出することを含む、標的核酸の検出方法に関する。

今日、分子生物学の研究分野や、遺伝子検査や病原体検査等の臨床応用の分野において、標的核酸を特異的に検出する方法は非常に重要な技術となっている。その中でも、核酸増幅反応と核酸クロマトグラフィーとを利用する標的核酸の検出方法は、その迅速性と簡便性から注目を集めている。この検出方法は概ね、標的核酸に特異的なプライマーにタグを付して用いて、標的核酸を含むＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」と記載する）等の核酸増幅反応を行い、得られた増幅産物を、多孔質状の固相担体内をキャピラリー現象により拡散・移動させ、増幅産物の両端に付されたタグを介して標識及び固相担体に捕捉・結合し、標的核酸を目視にて検出する（特許文献１）。

しかしながら、この検出方法においては、増幅産物の両端に付されたプライマー由来のタグに依拠して、標識及び固相担体への捕捉・結合を行っているために、標的核酸に由来する特異的な増幅産物と非特異的な反応により形成されるプライマーダイマーとを区別できない場合があり、プライマーダイマーの検出に基づいて偽陽性判定を行う虞があった。

そのため、本検出方法においては、このようなプライマーダイマーの非特異的な検出を回避して、高い判定精度が得られるような改善が望まれていた。

ＷＯ２０１２／０７０６１８

本発明は、核酸増幅反応と固相担体上にて核酸増幅産物を検出すること（例えば、核酸クロマトグラフィー法）を含む標的核酸の検出方法において、プライマーダイマーの非特異的な検出を回避することを可能とする、判定精度の高い新たな検出方法を提供することを目的とする。

核酸増幅反応においてプライマーダイマーの形成を防ぐためには、核酸増幅反応のサイクル数を少なくすることが必要であるが、当該サイクル数を少なくした場合には、標的核酸のコピー数を核酸クロマトグラフィー法等により目視で検出可能な程度に増大させることができない場合があり、検出感度を低下させ得る。したがって、核酸クロマトグラフィー法等により目視で検出可能な程度に標的核酸のコピー数を増大させながらも、プライマーダイマーの形成を防ぐことを可能とする手法が要求される。

本発明者らは、標的核酸の増幅を２段階の核酸増幅反応（Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法）を実施すること、すなわちタグが付されていないプライマーセットを用いて行う１段階目の核酸増幅反応とタグが付されたプライマーセットを用いて行う２段階目の核酸増幅反応とを実施することにより、１段階目の核酸増幅反応により標的核酸のコピー数を増大させることができ、タグが付されたプライマーセットを利用する２段階目の核酸増幅反応をダイマー形成が生じないサイクル数で実施することによって、標的核酸を核酸クロマトグラフィー法等により特異的にかつ高い感度にて検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
［１］ 標的核酸の検出方法であって、
（ａ）標的核酸の第１の塩基配列と相同な配列を含むプライマーと、該第１の塩基配列の下流側に位置する第２の塩基配列の相補鎖配列と相同な配列を含むプライマーからなる第１のプライマーセットを用いて、試験ＤＮＡを鋳型として核酸増幅反応を実施することにより、第１の核酸増幅産物を得る工程、
（ｂ）該第１の塩基配列の下流側かつ該第２の塩基配列の上流側に位置する第３の塩基配列と相同な配列を含むプライマーと、該第３の塩基配列の下流側かつ該第２の塩基配列の上流側に位置する第４の塩基配列の相補鎖配列と相同な配列を含むプライマーからなる第２のプライマーセットであって、いずれか一つのプライマーが標識物質と結合可能な第１のタグと結合されており、かつ他方のプライマーが固相担体と結合可能な第２のタグと結合されている、該第２のプライマーセットを用いて、該第１の核酸増幅産物を鋳型として核酸増幅反応を実施することにより、各端に該第１のタグ及び該第２のタグがそれぞれ付加された第２の核酸増幅産物を得る工程、
（ｃ）該第２の核酸増幅産物と、第１のタグと結合可能な標識物質とを接触させることにより、標識された核酸増幅産物を得る工程、
（ｄ）該標識された核酸増幅産物と、固相担体とを接触させることにより、該標識された核酸増幅産物を該固相担体に捕捉する工程、ならびに
（ｅ）該固相担体に捕捉された該標識された核酸増幅産物を検出する工程、
を含む、上記方法。
［２］ 前記工程（ａ）と前記工程（ｂ）とを、同一の反応容器内で連続して行うことを特徴とする、［１］の方法。
［３］ 前記工程（ａ）における核酸増幅反応のアニーリング温度が、前記工程（ｂ）における核酸増幅反応のアニーリング温度より高いことを特徴とする、［１］又は［２］の方法。
［４］ 前記工程（ｂ）における核酸増幅反応の増幅サイクル数が、前記工程（ａ）における核酸増幅反応の増幅サイクル数より少ないことを特徴とする、［１］〜［３］のいずれかの方法。
［５］ （ａ）標的核酸の第１の塩基配列と相同な配列を含むプライマーと、該第１の塩基配列の下流側に位置する第２の塩基配列の相補鎖配列と相同な配列を含むプライマーからなる第１のプライマーセット、
（ｂ）該第１の塩基配列の下流側かつ該第２の塩基配列の上流側に位置する第３の塩基配列と相同な配列を含むプライマーと、該第３の塩基配列の下流側かつ該第２の塩基配列の上流側に位置する第４の塩基配列の相補鎖配列と相同な配列を含むプライマーからなる第２のプライマーセットであって、いずれか一つのプライマーが標識物質と結合可能な第１のタグと結合されており、かつ他方のプライマーが固相担体と結合可能な第２のタグと結合されている、該第２のプライマーセット、
（ｃ）該第１のタグと結合可能な標識物質、ならびに、
（ｄ）該第２のタグと結合可能な固相担体、
を含む、標的核酸を検出するためのキット。
［６］ 前記第２のプライマーセットにおける、前記第１のタグおよび前記第２のタグの少なくとも一方が、オリゴヌクレオチドからなるタグであることを特徴とする、［５］のキット。
［７］ 前記オリゴヌクレオチドからなるタグが、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制または停止可能なスペーサーを介してプライマーと結合されていることを特徴とする、［６］のキット。
[８] 前記スペーサーが、アゾベンゼン、脂肪鎖、又はＩｎｖｅｒｔｅｄ塩基であることを特徴とする、[７]のキット。
[９] 前記第１のタグがオリゴヌクレオチドからなるタグであり、標識物質が該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、[６]〜[８]のいずれかのキット。
[１０] 前記第１のタグがビオチン、ジゴキシゲニン、及びＦＩＴＣから選択されるいずれかの低分子化合物からなるタグであり、標識物質が該タグと結合可能なタンパク質を含む、[６]〜[９]のいずれかのキット。
[１１] 前記第２のタグがオリゴヌクレオチドからなるタグであり、固相担体が該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、[６]〜[１０]のいずれかのキット。
[１２] 前記第１のプライマーセットに含まれる一又は両方のプライマーのＴｍ値が、前記第２のプライマーセットに含まれる一又は両方のプライマーのＴｍ値よりも高いことを特徴とする、[５]〜[１１]のいずれかのキット。

本発明によれば、核酸増幅反応と固相担体上にて核酸増幅産物を検出すること（例えば、核酸クロマトグラフィー法）を含む標的核酸の検出方法において、プライマーダイマーの非特異的な検出を回避することを可能とする、判定精度の高い検出方法を提供することができる。

ラテラルフロー型核酸検出デバイスの模式図を示す。１：固相担体、２：コンジュゲートパッド、３：サンプルパッド、４：吸収パッド、５：基材、６：捕捉手段。 実施例にて利用した各プライマーの認識配列に対応する領域を示す。 （Ａ）実施例１にてアウタープライマーセット及びインナープライマーセットを用いたＮｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法により得られた増幅産物を、核酸検出デバイスを用いて検出した結果を示す写真図である。（Ｂ）比較例１にてインナープライマーのみを用いたＰＣＲ法により得られた増幅産物を、核酸検出デバイスを用いて検出した結果を示す写真図である。各図において数値は反応系に加えた鋳型ＤＮＡ量を示す。

Ｉ．標的核酸の検出方法
本発明に係る標的核酸の検出方法は、概ね以下の工程：
標的核酸を増幅する工程、
増幅した標的核酸を標識する工程、及び
標識した標的核酸を固相担体に捕捉、検出する工程、を含む。以下、各工程について説明する。

１．標的核酸を増幅する工程
本発明方法において、標的核酸の増幅はＮｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法を利用して行うことができる。すなわち、第１のプライマーセットを用いて、試験ＤＮＡを鋳型として第１の核酸増幅反応を実施し第１の核酸増幅産物を得て、次いで、それぞれタグが結合された第２のプライマーセットを用いて、第１の核酸増幅産物を鋳型として第２の核酸増幅反応を実施し第２の核酸増幅産物を得る工程を含む。本手法によれば、第１のプライマーセットを用いて第１の核酸増幅反応を実施し、標的核酸を含む（存在する場合）第１の核酸増幅産物のコピー数を増大させることができ、これによりタグが結合された第２のプライマーセットを用いた第２の核酸増幅反応のサイクル数を減らし、タグが結合された第２のプライマーセットのプライマーダイマーの形成を抑制できると共に、検出するのに十分なコピー数の標的核酸を含む（存在する場合）所望の第２の核酸増幅産物を得ることができる。さらに、第１のプライマーセット及び第２のプライマーセットをそれぞれ用いた２段階の核酸増幅反応を経ることにより、標的核酸に対する指向性を高めることができ、標的核酸とは異なる非特異的な核酸増幅を低減又は回避することができる。

本発明において「標的核酸」とは検出すべき任意の核酸配列又は核酸分子を意味し、天然のものであっても、人工的に合成されたものであってもよく、特に限定されない。標的核酸としては例えば、特定の形質を有することや、特定の疾患の発症もしくは発症の可能性を示す遺伝子マーカー、細菌やウイルス等の病原体由来の遺伝子、アレルギー物質由来の遺伝子、一塩基多型や先天的もしくは後天的変異を示す塩基配列等が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明方法において、「第１のプライマーセット」及び「第２のプライマーセット」に含まれる各プライマー（所謂、順方向（フォワード）プライマー及び逆方向（リバース）プライマー）は、Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法における一般的な手法に従って設計することができる（中山広樹著「バイオ実験イラストレイテッド ３ 本当にふえるＰＣＲ」秀潤社発行、１９９７年）。

「第１のプライマーセット」は標的核酸である二本鎖ＤＮＡの一の鎖上の特定の塩基配列（第１の塩基配列）と相同な配列を含むか、当該配列からなるプライマーと、当該第１の塩基配列より下流側（３’側）に位置する特定の塩基配列（第２の塩基配列）の相補鎖配列と相同な配列（すなわち、二本鎖ＤＮＡの他方の鎖の塩基配列と相同な配列）を含むか、当該配列からなるプライマーとの組合せとすることができる。ここで「相同な配列」を有するプライマーには、前記第１の塩基配列と同一な配列、及び前記第２の塩基配列の相補鎖配列と同一な配列だけでなく、標的核酸と結合し核酸増幅反応を促すことができるかぎり、前記第１の塩基配列及び前記第２の塩基配列の相補鎖配列において１〜数個の塩基の欠失、置換、付加または挿入を有する塩基配列や、前記第１の塩基配列及び前記第２の塩基配列の相補鎖配列とＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するプライマーも含まれる。ここで「１〜数個」とは特に限定されないが、例えば、１から１０個、好ましくは１から５個である（以下においても、同じ意味で使用する）。

第１のプライマーセットのプライマーの大きさは、８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上の長さとすることができ、上限は特に限定されないが、５０塩基以下、４０塩基以下、又は３０塩基以下の長さとすることができる。各プライマーの大きさは、同一であっても良いし、異なっていても良い。

第１のプライマーセットは、第２のプライマーセットを用いた第２の核酸増幅反応におけるアニーリング温度よりも、５℃以上、好ましくは１０℃以上、さらに好ましくは１５℃以上、高いアニーリング温度を有する第１の核酸増幅反応の条件下において標的核酸を増幅することが可能なものとすることができる。すなわち、第１のプライマーセットに含まれるいずれか一つ、より好ましくは両方のプライマーのＴｍ値は、第２のプライマーセットに含まれるいずれか一つ、より好ましくは両方のプライマーのＴｍ値よりも、５℃以上、好ましくは１０℃以上、さらに好ましくは１５℃以上、高くなるように設計することができる。これにより第１のプライマーセットを用いた第１の核酸増幅反応系に第２のプライマーセットが含まれる場合においても、第１のプライマーセットのＴｍ値に合わせた高いアニーリング温度で第１の核酸増幅反応を実施することにより、第２のプライマーセットの標的核酸への結合やプライマーダイマーの形成を抑制又は回避することができる。なお、第２のプライマーセットにおける各プライマーの「Ｔｍ値」は、下記タグ領域やスペーサー領域を含めない領域に基づいて算出される値を意味する。

「第２のプライマーセット」は、前記第１の塩基配列より下流側（３’側）に位置し、かつ前記第２の塩基配列の上流側（５’側）に位置する特定の塩基配列（第３の塩基配列）と相同な配列を含むか、当該配列からなるプライマーと、当該第３の塩基配列より下流側（３’側）に位置し、かつ前記第２の塩基配列の上流側（５’側）に位置する特定の塩基配列（第４の塩基配列）の相補鎖配列（すなわち、二本鎖ＤＮＡのうち他方の鎖の塩基配列と相同な配列）と相同な配列を含むか、当該配列からなるプライマーとの組合せとすることができる。すなわち、第２のプライマーセットは、第１のプライマーセットに挟まれた領域（つまり、第１の核酸増幅産物）内に設計することができる。ここで「相同な配列」を有するプライマーには、前記第３の塩基配列と同一な配列、及び前記第４の塩基配列の相補鎖配列と同一な配列だけでなく、標的核酸と結合し核酸増幅反応を促すことができるかぎり、前記第３の塩基配列及び前記第４の塩基配列の相補鎖配列において１〜数個の塩基の欠失、置換、付加または挿入を有する塩基配列や、前記第３の塩基配列及び前記第４の塩基配列の相補鎖配列とＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するプライマーも含まれる。あるいは、別の実施形態では、第２のプライマーセットのいずれか一方のプライマーは、第１のプライマーセットのいずれか一方のプライマーの配列全体又はその一部の配列と同一の配列を有していても良い。

第２のプライマーセットのプライマーの大きさは、８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上の長さとすることができ、上限は特に限定されないが、５０塩基以下、４０塩基以下、又は３０塩基以下の長さとすることができる。各プライマーの大きさは、同一であっても良いし、異なっていても良い。なお、ここで「プライマーの大きさ」とは、下記タグ領域やスペーサー領域を含めない大きさを意味する。

第１のプライマーセット及び第２のプライマーセットの各プライマーの設計は、公知のプライマー設計ソフト・設計サイト等を用いて行うことができる。このようなプライマー設計ソフト・設計サイトとしては例えば、ＯｌｉｇｏＥｖａｌｕａｔｏｒ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｐｒｉｍｅｒ３（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、Ｐｒｉｍｅｒ−ＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ）等を利用することができる（これらに限定はされない）。

第１のプライマーセット及び第２のプライマーセットの各プライマーの製造は、公知の手法により行うことができ、ＤＮＡ合成装置を利用して行ってもよいし、あるいは受託合成サービスを利用して行うことができる。

なお、本明細書中、第１のプライマーセットに含まれるプライマーを「アウタープライマー」と記載し、第２のプライマーセットに含まれるプライマーを「インナープライマー」と記載する場合がある。

第２のプライマーセットにおける各プライマーの５’端には、タグが結合されている。タグは、標識物質と結合可能な第１のタグ及び固相担体と結合可能な第２のタグより選択され、第２のプライマーセットにおける各プライマー（順方向（フォワード）プライマー及び逆方向（リバース）プライマー）にいずれかのタグがそれぞれ結合される。「第１のタグ」は下記にて詳述する標識物質と結合可能なものであればよく、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチドなど）、タンパク質、ペプチド、もしくは低分子化合物（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、ＦＩＴＣ等）、またはそれらの組合せからなるものを利用することができ、特に限定はされない。好ましくは、オリゴヌクレオチドを含むか、オリゴヌクレオチドからなるものである。「第２のタグ」は下記にて詳述する固相担体と結合可能なものであればよく、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチドなど）、タンパク質、ペプチド、もしくは化合物、またはそれらの組合せからなるものを利用することができ、特に限定はされない。好ましくは、オリゴヌクレオチドを含むか、オリゴヌクレオチドからなるものである。

プライマーとタグとは任意の手段により結合することができ、直接的に、又は間接的に結合することができる。ただし、プライマーに結合されるタグが核酸よりなる場合、核酸増幅反応により当該タグ領域がプライマー領域と共に二本鎖化されないように、ＤＮＡポリメラーゼ反応の進行を抑制または停止することが可能なスペーサーを介して、プライマーとタグとは結合される。このような「スペーサー」としては、鋳型鎖に含まれたときに、ＤＮＡポリメラーゼ反応の進行を抑制または停止することができ、タグ領域の二本鎖化を防ぐものであればよい。ＤＮＡポリメラーゼによる伸長には、鋳型となる核酸（または塩基）が必要であり、鋳型がないとＤＮＡ鎖は伸長しない。すなわち、当該スペーサーは、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応の鋳型となり得ない構造を有している。このようなスペーサーとしては、例えば、Ｌ型核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、架橋化核酸（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＢＮＡ）もしくはＬｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ））などの人工核酸塩基、下記式Ｉで表されるアゾベンゼン構造を有するスペーサー、アルキレン鎖やポリオキシアルキレン鎖などの脂肪鎖、Ｉｎｖｅｒｔｅｄ塩基（天然核酸塩基を５’-５’結合、あるいは３’-３’結合で連結したもの）、強固なヘアピン構造やシュードノット構造を有する核酸配列等が挙げられるがこれらに限定はされない。

スペーサーとして脂肪鎖を用いる場合、鎖長の元素数は２以上４０以下が好ましい。元素数が１以下では、ＤＮＡポリメラーゼの伸長反応の阻害が不完全になり、２本鎖化を抑制できず、元素数が４０を超えると水への溶解性が低下するからである。ＤＮＡポリメラーゼ反応の阻害効率を考慮すると、脂肪鎖の鎖長は元素数２以上３６以下が好ましく、３以上１８以下がより好ましい。脂肪鎖スペーサーとしては、例えば、以下の式ＩＩで表されるスペーサーが挙げられる。
５’−Ｏ−Ｃ_ｍＨ_２ｍ−Ｏ−３’ （式ＩＩ）
（式中、５’は、５’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、３’は、３’側のリン酸ジエステル結合のリン酸原子を表し、ｍは２以上４０以下の整数を表す。）
式ＩＩにおいてｍは好ましくは２以上３６以下であり、より好ましくは３以上１８以下であり、さらに好ましくは３または６である。

第１の核酸増幅反応及び第２の核酸増幅反応は、一般的なＰＣＲ法に従って行うことができる。すなわち、標的核酸を含む鋳型ＤＮＡに対し、上記の第１のプライマーセット及び第２のプライマーセットをそれぞれ用いてＰＣＲを行った場合に、所望の領域が増幅されるＰＣＲ条件にて行うことができる。

第１の核酸増幅反応においては、試験ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして利用する。「試験ＤＮＡ」とは標的核酸を含む可能性のあるＤＮＡ試料を意味し、例えば、動物や植物もしくはその一部（器官、組織、細胞など）、微生物、ウイルス、飲食品等の試料に由来するＤＮＡやそれら試料より調製されたｃＤＮＡが挙げられる（これらに限定はされない）。試験ＤＮＡは、試料より抽出・精製された形態であってもよいし、粗精製された形態であってもよい。あるいは、細胞や組織の一部等をそのまま試験ＤＮＡとして、反応系に含めることもできる。

第２の核酸増幅反応においては、第１の核酸増幅反応によって産生された第１の核酸増幅産物を鋳型ＤＮＡとして利用する。第２の核酸増幅反応におけるＰＣＲのサイクル数は、第１の核酸増幅反応におけるＰＣＲのサイクル数と比べて少ないことが好ましい。第２の核酸増幅反応におけるＰＣＲのサイクル数を少なくすることにより、第２のプライマーセットによるプライマーダイマーの形成を抑制又は回避することができる。プライマーダイマーの形成の有無は、第２の核酸増幅産物を常法に従ってアガロースゲル等の適当なゲルにて電気泳動することによって確認することができ、プライマーダイマーの形成を生じない第２の核酸増幅反応におけるＰＣＲのサイクル数を適宜設定することができる。

ＰＣＲに用いるＤＮＡポリメラーゼは、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼであればよく、特に限定はされない。本発明においては、市販のＤＮＡポリメラーゼを利用することが可能であり、例えばＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標）やＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ等を好適に利用することができる。また、温度、時間、緩衝液の組成等は、用いるＤＮＡポリメラーゼや、プライマーの配列、および目的の核酸増幅領域の大きさ等に応じて、適宜選択することができる。

第１の核酸増幅反応と第２の核酸増幅反応とは別個の反応容器内で順次行ってもよいし、あるいは第１の核酸増幅反応と第２の核酸増幅反応とを同一の反応容器内で連続して行ってもよい。第１の核酸増幅反応と第２の核酸増幅反応とを別個の反応容器内で順次行うとは、第１の核酸増幅反応後、得られた第１の核酸増幅産物を取り出し（必要に応じて希釈した後）、ＤＮＡポリメラーゼや第２のプライマーセット等を含んでなる別個に用意された第２の核酸増幅反応系に加えて第２の核酸増幅反応を行うことを意味する。一方、第１の核酸増幅反応と第２の核酸増幅反応とを同一の反応容器内で連続して行うとは、第１の核酸増幅反応後、第１の核酸増幅産物を取り出すことなく、第２の核酸増幅反応を実施することを意味する。第１の核酸増幅反応と第２の核酸増幅反応とを同一の反応容器内で連続して行う場合において、第２のプライマーセットは第１の核酸増幅反応の開始前に予め反応系に添加されていてもよいし、第１の核酸増幅反応後、第２の核酸増幅反応開始前に反応系に添加されてもよい。また、必要に応じて、第１の核酸増幅反応後、第２の核酸増幅反応開始前に、ＤＮＡポリメラーゼを補充してもよい。好ましくは、第１の核酸増幅反応と第２の核酸増幅反応とは、操作容易性から同一の反応容器内で連続して行う。さらに、好ましくは、第１の核酸増幅反応と第２の核酸増幅反応とを同一の反応容器内で連続して行い、第２のプライマーセットは第１の核酸増幅反応の開始前に予め反応系に添加される。この場合、第１のプライマーセットに含まれるいずれか一つ、より好ましくは両方のプライマーのＴｍ値は、第２のプライマーセットに含まれるいずれか一つ、より好ましくは両方のプライマーのＴｍ値よりも高いことが好ましい。これにより第１のプライマーセットを用いた第１の核酸増幅反応におけるアニーリング温度は、第２のプライマーセットを用いた第２の核酸増幅反応におけるアニーリング温度よりも高い温度条件にて実施することが可能であり、第１の核酸増幅反応条件下にて第２のプライマーセットが試験ＤＮＡ中に含まれる標的核酸と結合することやプライマーダイマーの形成を抑制又は回避することができる。

２．増幅した標的核酸を標識する工程
上記核酸増幅により得られた、標的核酸を含む（存在する場合）第２の核酸増幅産物は、第２のプライマーセットに起因する第１のタグ及び第２のタグをそれぞれ各端に有する。第２の核酸増幅産物の標識は、標識物質を当該標識物質と結合可能な第１のタグと接触及び結合させることにより行うことができる。標識物質は第２の核酸増幅産物の検出を可能とするものであればよく特に限定はされないが、好ましくは第２の核酸増幅産物の目視検出を可能とするものである。このような標識物質としては、着色粒子、色素、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ等）等が挙げられるが、好ましくは着色粒子である。「着色粒子」とは、金属コロイド（例えば、金、銀、銅、白金等）粒子、着色されたラテックス粒子、色素を包含するシリカナノ粒子等が挙げられるが、これらに限定はされない。標識物質の大きさは第２の核酸増幅産物を固相担体に捕捉するのを妨げるものでなく、かつ検出の際に発色の良いものであればよく、下記固相担体や核酸検出デバイスの各種多孔質部材の孔径よりも小さなサイズとなるように、適宜選択することができる。例えば、標識物質の大きさはおよそ５００ｎｍ以下、好ましくはおよそ０．１ｎｍ〜２５０ｎｍ、より好ましくはおよそ１ｎｍ〜１００ｎｍの粒径とすることができる。

標識物質と第１のタグとの接触及び結合は、直接的結合であっても、間接的結合であってもよく、結合手段は利用する標識物質と第１のタグに応じて適宜好適なものを選択することができ、核酸−核酸相互作用、タンパク質−タンパク質相互作用、低分子化合物−タンパク質相互作用等を利用することができる。例えば、第１のタグがオリゴヌクレオチドを含む場合、標識物質を当該オリゴヌクレオチドの塩基配列と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドに結合することによって、両者のオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションさせることによって、標識物質と第１のタグとを間接的に結合することができる。標識物質とオリゴヌクレオチドとの結合はペプチド、タンパク質、核酸などを介して行ってもよいし、適当な官能基を介して行ってもよい。ハイブリダイゼーションの条件は、ハイブリダイゼーションが生じる条件であればよく特に限定はされないが、例えば２０℃〜４０℃にて、１０ｍＭ〜５０ｍＭのリン酸を含む緩衝液（ｐＨ６．５〜７．５）中で反応させることにより行うことができる。ハイブリダイゼーション効率を高めるべく、緩衝液にはさらに塩化ナトリウム等の塩を含めることができる。あるいは、第１のタグが低分子化合物であるビオチンを含む場合、標識物質をアビジン（ストレプトアビジン）に結合することによって、両者を結合することができる。また、第１のタグが低分子化合物であるジゴキシゲニンやＦＩＴＣを含む場合、標識物質を抗ＤＩＧ抗体や抗ＦＩＴＣ抗体に結合することによって、両者を結合することができる。

３．標識した標的核酸を固相担体に捕捉、検出する工程
上記標識された第２の核酸増幅産物は、固相担体に捕捉し、検出することができる。第２の核酸増幅産物の固相担体への捕捉（すなわち、結合）は、固相担体と第２の核酸増幅産物における当該固相担体と結合可能な第２のタグとを接触させることにより行うことができる。固相担体は特に限定はされないが、樹脂、金属、多糖類、鉱物等からなるものを利用することができ、メンブレン、フィルム、不織布、プレート、ゲル等の形状とすることができる。好ましくは固相担体は、溶液中の第２の核酸増幅産物や標識物質が展開できるように多孔質構造を有するものである。本発明において利用可能な固相担体としては、例えば、ろ紙、ニトロセルロースメンブレン、ポリエーテルスルフォンメンブレン、ナイロンメンブレンや乾燥させた各種ゲル（シリカゲル、アガロースゲル、デキストランゲル、ゼラチンゲル）等が挙げられる。固相担体の大きさ及び形態は、各種操作や検出に適切なものを適宜選択することができる。

固相担体と第２のタグとの接触及び捕捉（すなわち、結合）は、直接的結合であっても、間接的結合であってもよく、結合手段は利用する固相担体と第２のタグに応じて適宜好適なものを選択することができる。例えば、第２のタグがオリゴヌクレオチドを含む場合、固相担体に当該オリゴヌクレオチドの塩基配列と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドを固定化してタグ捕捉手段とし、両者のオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションさせることによって、固相担体と第２のタグとを間接的に結合することができる。固相担体へのオリゴヌクレオチドの固定化はペプチド、タンパク質、核酸などを介して行ってもよいし、適当な官能基を介して行ってもよい。オリゴヌクレオチドを固相担体に固定化する場合、特定の領域に限局して固定化することによって、捕捉された第２の核酸増幅産物は所定の領域のみに限局して検出されるため、陽性又は陰性の判別を容易にすることができる。ハイブリダイゼーションの条件は、上記した条件により行うことができる。

第２の核酸増幅産物の検出は、固相担体に捕捉された第２の核酸増幅産物に結合した上記標識物質を検出、好ましくは目視検出することにより行うことができる。標的核酸が存在する場合には、固相担体に捕捉・結合された核酸増幅反応産物の標識物質が検出される。当該検出の有無を指標にして、第２の核酸増幅反応産物中の標的核酸の有無を判別することができる。

４．核酸検出デバイス
上記の「増幅した標的核酸を標識する工程」及び「標識した標的核酸を固相担体に捕捉、検出する工程」は核酸クロマトグラフィーを利用する核酸検出デバイスを用いて行うことができる。当該核酸検出デバイスを利用することにより、第２の核酸増幅産物中の標的核酸の有無を、特殊な装置を必要とすることなく検出・判別することができ、簡便かつ迅速に結果を得ることができる。

核酸検出デバイスは、核酸クロマトグラフィー法により標識された核酸増幅産物を検出するために利用される公知の核酸検出デバイス（ＷＯ２０１２／０７０６１８）を利用することができる。

本発明にて利用可能な核酸検出デバイスの一実施形態の模式図を図１に示すが、核酸検出デバイスは本実施形態に限定されるものではない。なお、以下の説明において、各部材に付された符号は、図１中に示される符号に対応する。

図１の核酸検出デバイスは、基材（５）の上に、第２の核酸増幅産物を添加するためのサンプルパッド（３）、標識物質を配置したコンジュゲートパッド（２）、標識された第２の核酸増幅産物を捕捉するための固相担体（１）及び吸収パッド（４）を順次重ねて配置してなる。固相担体（１）には、標識された第２の核酸増幅産物を捕捉するための手段（捕捉手段）（６）（例えば、上記オリゴヌクレオチド等）が限局して配置・固定化されている。サンプルパッド（３）、コンジュゲートパッド（２）、固相担体（１）及び吸収パッド（４）は上記固相担体として利用可能な多孔質構造を有する部材よりなる。これらは同一の部材より構成されていてもよいし、異なる部材より構成されていてもよい。基材（５）はその上に配置された各種部材を支持することができ、核酸検出デバイスの操作を容易にするものであればよく、例えば樹脂、金属、鉱物等からなるものを利用することができる。標識物質を展開溶液中に混合する場合には、コンジュゲートパッド（２）は省略することができる。

第２の核酸増幅反応後、得られた第２の核酸増幅反応産物はサンプルパッド（３）に添加する。核酸増幅反応後の反応液をそのまま滴下してもよいし、適当な展開溶液（例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、グッド緩衝液、ＳＳＣ緩衝液）と共に滴下してもよい。展開溶液には必要に応じて、界面活性剤、塩、タンパク質、核酸等をさらに含めることができる。サンプルパッド（３）に添加された第２の核酸増幅反応産物は、図１中の矢印で示す方向に上流から下流に向かってキャピラリー現象により展開する。

第２の核酸増幅反応産物は標識物質が配置されたコンジュゲートパッド（２）を通過する際に、標識物質と接触し第１のタグを介して標識物質により標識される。

次いで、標識された第２の核酸増幅反応産物は、固相担体（１）を通過する際に、捕捉手段（６）と接触し、第２のタグを介して固相担体（１）に捕捉・結合される。

標的核酸が存在する場合には、捕捉手段（６）により固相担体（１）に捕捉・結合された核酸増幅反応産物の標識物質が捕捉手段（６）の領域に検出される。標識物質が目視確認できるものであれば、標識物質に起因して捕捉手段（６）の領域が呈色する。当該標識物質の検出（呈色）の有無を指標にして、第２の核酸増幅反応産物中の標的核酸の有無を判別することができる。

ＩＩ．核酸検出キット
本発明に係る核酸検出キットは、上記の第１のプライマーセット、第２のプライマーセット、標識物質及び固相担体を含み、上記本発明における核酸の検出方法において利用することができる。標識物質及び固相担体は、上記核酸検出デバイスの形態とすることができる。

核酸検出キットにはさらに、ＰＣＲ用緩衝液、ｄＮＴＰｓ、ＤＮＡポリメラーゼ、核酸クロマトグラフィー展開溶液等を含めることができる。

以下、実施例により本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
（Ｉ）金コロイド結合オリゴヌクレオチドの作製
Ｇｏｌｄ Ｃｏｌｌｏｉｄ（４０ｎｍ，９．０×１０^１０（粒子数／ｍｌ）、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）と下記配列番号１で表されるチオール基含有オリゴヌクレオチドを混合し、５０℃で１６時間インキュベートした。６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を除去し、０．０５Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）を添加し混和後、再度５０℃で４０時間インキュベートした。

インキュベート後、遠心（６０００ｒｐｍ、１５分間）を行い、上清を除去し、５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）を添加した。このバッファー置換を再度行った。

調製した金コロイド溶液をグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲートパッドとした。

（チオール基含有オリゴヌクレオチド）：５’−ＣＴＡＴＡＡＡＣＣＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＧＴＴＧＣＣＡ−ＳＨ−３’（配列番号１）

（ＩＩ）タグ捕捉手段を固定化したメンブレンの作製
タグ捕捉手段として、下記配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドプローブを含む溶液を、メルクミリポア社製ニトロセルロースメンブレン（Ｈｉ−Ｆｌｏｗ１８０）に、ディスペンサーを用いてライン状に塗布した。その後４０℃で３０分間乾燥させることでタグ捕捉手段を備えたメンブレンとした。

（オリゴヌクレオチドプローブ）：５’−ＡＴＣＡＣＡＣＡＴＴＡＧＣＴＧＴＣＡＣＴＣＧＡＴＧＣＡ−３’（配列番号２）

（ＩＩＩ）ラテラルフロー型核酸検出デバイスの作製
作製したラテラルフロー型核酸検出デバイスは、図１の模式図に示される検出デバイスに準拠して作製した。

すなわち、基材（５）としてポリプロピレン製バッキングシート（Ｌｏｈｍａｎｎ社）、コンジュゲートパッド（２）として上記（Ｉ）で作製したコンジュゲートパッド、固相担体（１）及び捕捉手段（６）として上記（ＩＩ）で作製したタグ捕捉手段を備えたメンブレン、サンプルパッド（３）としてグラスファイバー製のサンプルパッド、吸収パッド（４）としてセルロース製の吸収パッドを、それぞれ図１に示すように互いに重なり合わせて貼り合わせ、ラテラルフロー型核酸検出デバイスを作製した。

（ＩＶ）標的検出用プライマーの設計
本実施例では、配列番号３で表される合成核酸を鋳型ＤＮＡとし、ＰＣＲ増幅を行った場合に、鋳型配列の特定領域の約２３０塩基対が増幅するようにインナープライマーＦ（配列番号４）及びインナープライマーＲ（配列番号５）を設計した。

さらに各インナープライマーのそれぞれ上流側（５’末端側）に、インナープライマーの認識配列を挟むようにアウタープライマーＦ（配列番号６）及びアウタープライマーＲ（配列番号７）を設計した。

設計に際しては、アウタープライマーのＴｍ値が、インナープライマーのＴｍ値より１０℃以上高くなるように設計した。

各プライマーの配列及びＴｍ値を表１に示す。また、各プライマーの認識配列に対応する領域を図２に示す。

各インナープライマーの５’末端には、ポリメラーゼ反応阻害領域であるアゾベンゼンを有するスペーサー（上記式（Ｉ）で表される）を介して、下記タグ配列１（配列番号８）及びタグ配列２（配列番号９）をそれぞれ連結し、インナープライマー−Ｔａｇ１−Ｆ（配列番号１０）及びインナープライマー−Ｔａｇ２−Ｒ（配列番号１１）を作製した。
（タグ配列１）：５’−ＴＣＧＡＧＴＧＡＣＡＧＣＴＡＡＴＧＴＧＴＧＡＴＴ−３’（配列番号８）
（タグ配列２）：５’−ＡＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＧＴＴＴＡＴＡＧＴ−３’（配列番号９）
（インナープライマー−Ｔａｇ１−Ｆ）：５’−ＴＣＧＡＧＴＧＡＣＡＧＣＴＡＡＴＧＴＧＴＧＡＴＴ−Ｘ−ＣＧＧＡＧＧＴＴＣＣＧＣＡＡＡＡＧＡＴＧ−３’（配列番号１０）
（インナープライマー−Ｔａｇ２−Ｒ）：５’−ＡＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＧＴＴＴＡＴＡＧＴ−Ｘ−ＣＣＴＣＣＡＧＡＧＴＧＡＴＣＧＡＴＧＴＴ−３’（配列番号１１）
（上記配列中、「Ｘ」とはスペーサーを示す）

（Ｖ）標的核酸の増幅反応
ＰＣＲ試薬はＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ）を用い、１×ＥＸ Ｔａｑバッファー、各０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０．５μＭインナープライマー−Ｔａｇ１−Ｆ、０．５μＭインナープライマー−Ｔａｇ２−Ｒ、０．１１μＭアウタープライマーＦ、０．１１μＭアウタープライマーＲ、０．９３７５Ｕｎｉｔ ＴａＫａＲａ ＥＸ Ｔａｑ（登録商標）、鋳型合成ＤＮＡ（配列番号３）（０ｐｇ／ｔｅｓｔ，０．５ｐｇ／ｔｅｓｔ，５ｐｇ／ｔｅｓｔ，又は５０ｐｇ／ｔｅｓｔ）を含む反応溶液にて、Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ反応を行った。

反応条件は、９５℃で２分後、９５℃で１０秒、７２℃で２０秒を１セットとして５５サイクル実施し、その後、９０℃で５秒、６０℃で１０秒、７２℃で１０秒を１セットとして１５サイクル実施し、増幅産物を得た。得られた増幅産物は各インナープライマーに起因する１本鎖ＤＮＡからなるタグ配列を有する。

（ＶＩ）ラテラルフロー型核酸検出デバイスを用いた増幅産物の検出
上記（Ｖ）にて得られた増幅産物を、上記（ＩＩＩ）で作製したラテラルフロー型核酸検出デバイスにて検出を行った。

Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ後の反応溶液（５μＬ）をデバイス上のサンプルパッドに添加し、さらに８０μＬの展開溶液（１×ＳＳＣ，１％Ｔｗｅｅｎ２０，０．１％ＳＤＳ）を添加することで、反応溶液を展開した。室温で１０分後、メンブレン上のライン状に固定化されたタグ捕捉手段の着色の有無を確認した。

結果を図３（Ａ）に示す。０．５ｐｇ／ｔｅｓｔの鋳型合成ＤＮＡを添加したサンプルにおいても、適切に金コロイドに由来する赤色ラインが観察され、鋳型合成ＤＮＡに由来する増幅産物を検出することができた。一方、鋳型合成ＤＮＡを添加しないサンプル（０ｐｇ／ｔｅｓｔ）においては着色を認めず、増幅産物に由来しない非特異的な着色は示さないことが確認された。

（比較例１）
実施例１で作製したタグ配列を連結したインナープライマーのみを用いて、配列番号３で表される合成核酸を鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ試薬はＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ）を用い、１×ＥＸ Ｔａｑバッファー、各０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０．４μＭインナープライマー−Ｔａｇ１−Ｆ、０．４μＭインナープライマー−Ｔａｇ２−Ｒ、０．９３７５Ｕｎｉｔ ＴａＫａＲａ ＥＸ Ｔａｑ（登録商標）、鋳型合成ＤＮＡ（配列番号３）（０ｐｇ／ｔｅｓｔ，０．５ｐｇ／ｔｅｓｔ，５ｐｇ／ｔｅｓｔ，又は５０ｐｇ／ｔｅｓｔ）を含む反応溶液にて、ＰＣＲ反応を行った。

反応条件は定法に従い、９５℃で２分後、９５℃で２０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒を１セットとして４０サイクル実施し、増幅産物を得た。得られた増幅産物は、実施例１と同様にラテラルフロー型核酸検出デバイスにて増幅産物の検出を行った。

結果を図３（Ｂ）に示す。鋳型合成ＤＮＡを添加しないサンプル（０ｐｇ／ｔｅｓｔ）においても、非特異的な着色が認められた。この着色の原因について、増幅産物をアガロースゲル電気泳動法により解析したところ、プライマーダイマーの形成が認められ、これが非特異的に検出されたことが判明した。

（実施例２）
実施例１に記載のＰＣＲ条件のうち、第２の増幅工程は、プライマーダイマーによる非特異増幅を生じない１５サイクルに固定し、第１の増幅工程のサイクル数を１０サイクルから６０サイクルの範囲で増減した場合の感度、特異度を検討した。

結果を以下の表２に示す。第１の増幅工程におけるサイクル数が２５以上の場合、鋳型ＤＮＡに特異的な着色が確認された。また、５０サイクル以上の場合、鋳型ＤＮＡが０．５ｐｇ／ｔｅｓｔであっても特異的な着色が確認された。第２の増幅工程を１５サイクルにした条件では、鋳型合成ＤＮＡを添加しないサンプル（０ｐｇ／ｔｅｓｔ）の疑陽性着色は確認されなかった。

（比較例２）
比較例１に記載のＰＣＲ条件のうち、ＰＣＲにおけるサイクル数を１０サイクルから６０サイクルの範囲で変え、各ＰＣＲ条件における検出能を評価した。実施例１と同様の条件にてラテラルフロー型核酸検出デバイスを用いて増幅産物の検出試験を行った。

結果を以下の表２に示す。ＰＣＲにおけるサイクル数が２５サイクル以上の場合、着色が確認された。しかし、鋳型合成ＤＮＡを添加しないサンプル（０ｐｇ／ｔｅｓｔ）においても疑陽性着色が確認された。このため、いずれの条件においても陽性・陰性判定は不可となった。

以上の結果より、本発明方法によれば、プライマーダイマーによる非特異的な増幅産物の検出を回避することができ、標的核酸に由来する増幅産物を簡便かつ効率的に、また高感度にて検出することができる。

本発明は、核酸増幅法により得られたＤＮＡ断片を検出する工程を含む各種試験及び研究に利用することができる。より具体的には、本発明によれば、分子生物学の研究分野、病原体の検出、飲食品中のアレルゲンの検出、家畜管理、塩基多型の検出、疾患（例えば癌等）の検出を簡便かつ迅速に行うことができる。本発明はこのような分野において大いに貢献することが期待される。

Claims (12)

1. 標的核酸の検出方法であって、
   （ａ）標的核酸の第１の塩基配列と相同な配列を含むプライマーと、該第１の塩基配列の下流側に位置する第２の塩基配列の相補鎖配列と相同な配列を含むプライマーからなる第１のプライマーセットを用いて、試験ＤＮＡを鋳型として核酸増幅反応を実施することにより、第１の核酸増幅産物を得る工程、
   （ｂ）該第１の塩基配列の下流側かつ該第２の塩基配列の上流側に位置する第３の塩基配列と相同な配列を含むプライマーと、該第３の塩基配列の下流側かつ該第２の塩基配列の上流側に位置する第４の塩基配列の相補鎖配列と相同な配列を含むプライマーからなる第２のプライマーセットであって、いずれか一つのプライマーが標識物質と結合可能な第１のタグと結合されており、かつ他方のプライマーが固相担体と結合可能な第２のタグと結合されている、該第２のプライマーセットを用いて、該第１の核酸増幅産物を鋳型として核酸増幅反応を実施することにより、各端に該第１のタグ及び該第２のタグがそれぞれ付加された第２の核酸増幅産物を得る工程、
   （ｃ）該第２の核酸増幅産物と、第１のタグと結合可能な標識物質とを接触させることにより、標識された核酸増幅産物を得る工程、
   （ｄ）該標識された核酸増幅産物と、固相担体とを接触させることにより、該標識された核酸増幅産物を該固相担体に捕捉する工程、ならびに
   （ｅ）該固相担体に捕捉された該標識された核酸増幅産物を検出する工程、
   を含む、上記方法。
2. 前記工程（ａ）と前記工程（ｂ）とを、同一の反応容器内で連続して行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記工程（ａ）における核酸増幅反応のアニーリング温度が、前記工程（ｂ）における核酸増幅反応のアニーリング温度より高いことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記工程（ｂ）における核酸増幅反応の増幅サイクル数が、前記工程（ａ）における核酸増幅反応の増幅サイクル数より少ないことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. （ａ）標的核酸の第１の塩基配列と相同な配列を含むプライマーと、該第１の塩基配列の下流側に位置する第２の塩基配列の相補鎖配列と相同な配列を含むプライマーからなる第１のプライマーセット、
   （ｂ）該第１の塩基配列の下流側かつ該第２の塩基配列の上流側に位置する第３の塩基配列と相同な配列を含むプライマーと、該第３の塩基配列の下流側かつ該第２の塩基配列の上流側に位置する第４の塩基配列の相補鎖配列と相同な配列を含むプライマーからなる第２のプライマーセットであって、いずれか一つのプライマーが標識物質と結合可能な第１のタグと結合されており、かつ他方のプライマーが固相担体と結合可能な第２のタグと結合されている、該第２のプライマーセット、
   （ｃ）該第１のタグと結合可能な標識物質、ならびに、
   （ｄ）該第２のタグと結合可能な固相担体、
   を含む、標的核酸を検出するためのキット。
6. 前記第２のプライマーセットにおける、前記第１のタグおよび前記第２のタグの少なくとも一方が、オリゴヌクレオチドからなるタグであることを特徴とする、請求項５に記載のキット。
7. 前記オリゴヌクレオチドからなるタグが、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制または停止可能なスペーサーを介してプライマーと結合されていることを特徴とする、請求項６に記載のキット。
8. 前記スペーサーが、アゾベンゼン、脂肪鎖、又はＩｎｖｅｒｔｅｄ塩基であることを特徴とする、請求項７に記載のキット。
9. 前記第１のタグがオリゴヌクレオチドからなるタグであり、標識物質が該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載のキット。
10. 前記第１のタグがビオチン、ジゴキシゲニン、及びＦＩＴＣから選択されるいずれかの低分子化合物からなるタグであり、標識物質が該タグと結合可能なタンパク質を含む、請求項６〜９のいずれか一項に記載のキット。
11. 前記第２のタグがオリゴヌクレオチドからなるタグであり、固相担体が該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項６〜１０のいずれか一項に記載のキット。
12. 前記第１のプライマーセットに含まれる一又は両方のプライマーのＴｍ値が、前記第２のプライマーセットに含まれる一又は両方のプライマーのＴｍ値よりも高いことを特徴とする、請求項５〜１１のいずれか一項に記載のキット。

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