KR20160127753A - 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용한 핵산의 검출, 정량 방법 및 그 장치 - Google Patents

마스크 올리고뉴클레오티드를 이용한 핵산의 검출, 정량 방법 및 그 장치 Download PDF

Info

Publication number
KR20160127753A
KR20160127753A KR1020167024485A KR20167024485A KR20160127753A KR 20160127753 A KR20160127753 A KR 20160127753A KR 1020167024485 A KR1020167024485 A KR 1020167024485A KR 20167024485 A KR20167024485 A KR 20167024485A KR 20160127753 A KR20160127753 A KR 20160127753A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
oligonucleotide
region
nucleic acid
target nucleic
anchor
Prior art date
Application number
KR1020167024485A
Other languages
English (en)
Inventor
노리히코 스기모토
소우지 에다
마사히로 아사쿠라
카나코 아베
히로츠구 우에하라
카즈마사 카메이
요시히코 우에사카
유이치 오쿠
유스케 시바하라
Original Assignee
후소 야쿠힝 고교 가부시끼가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 후소 야쿠힝 고교 가부시끼가이샤 filed Critical 후소 야쿠힝 고교 가부시끼가이샤
Publication of KR20160127753A publication Critical patent/KR20160127753A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/162—Helper probe
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/10—Detection mode being characterised by the assay principle
    • C12Q2565/133—Detection mode being characterised by the assay principle conformational analysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/10—Detection mode being characterised by the assay principle
    • C12Q2565/137—Chromatographic separation

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)

Abstract

분석에 제공하는 핵산의 단일 가닥 영역(single-stranded region)의 올리고뉴클레오티드 프로브가 혼성화(hybridized) 영역을 사이에 두고 위치하는 영역에 마스크 올리고뉴클레오티드(mask oligonucleotides)를 혼성화시킴으로써, 상기 프로브가 혼성화 영역을 개방하고 또한 표적 핵산의 단일 가닥 영역을 안정된 상태로 유지하고 또한, 이러한 단일 가닥 영역을 갖는 핵산을 핵산 크로마토그래피에 제공함으로써 목적으로하는 표적 핵산을 매우 간편하게, 한편 고감도로 검출, 정량하는 것을 달성했다.

Description

마스크 올리고뉴클레오티드를 이용한 핵산의 검출, 정량 방법 및 그 장치{NUCLEIC ACID DETECTION AND ASSAY METHOD USING MASK OLIGONUCLEOTIDE, AND DEVICE FOR SAME}
본 발명은 바이러스, 세균 및 미생물을 비롯한 다양한 생물에서 유래한 핵산 (예를 들어, 천연 핵산, 게놈 DNA, cDNA, RNA, 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 등으로 증폭된 핵산 등)을 간편하면서도 높은 감도로 검출, 정량하는 방법 및 그 방법의 실시에 이용하는 장치 및 키트(devices and kits)에 관한 것이다.
인간을 비롯한 포유 동물 숙주 생물, 식물, 식품 혹은 음료 등의 세균이나 바이러스에 의한 감염의 유무나 정도의 검사, 바이러스나 세균에 의한 감염 또는 유전자의 돌연변이가 원인으로 의심되는 다양한 질환 (감염, 암, 대사성 질환, 유전 질환 등)의 원인을 파악하기 위한 검사 방법으로써 유전자 검사법은 그 특이성 및 감도의 높이의 점에서 매우 유용한 방법으로 사용되어오고 있다.
이 유전자 검사법은 크게 핵산의 혼성화를 이용하는 방법과 핵산 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 이용하는 방법으로 구별할 수 있다.
핵산의 혼성화(hybridization)- 프로그램을 이용하는 방법은 감지할 표적 핵산이 이중 가닥인 경우에는 이중 가닥 핵산을 변성하여 단일 가닥으로 한 후, 검출 가능한 표지로 표지된, 표적인 단일 가닥 핵산의 일부에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 혼성화시키고 해당 표지를 지표로 표적 핵산의 검출을 수행하는 방법이다.
PCR을 이용하는 방법은 검출할 핵산이 이중 가닥인 경우에는 이중 가닥 핵산을 열에 의해 변성시켜 단일 가닥으로 하거나, 또는 단일 가닥 영역을 생기게 한 후 단일 가닥 핵산의 일부에 상보적인 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 결합시켜 DNA 중합 효소를 이용하여 핵산을 복제하는 공정을 반복하여 표적인 핵산을 몇 배나 증폭시키고 증폭된 핵산(PCR 산물)을 전기 영동에 의해 미리 예측된 크기의 밴드의 출현 여부를 지표로 표적 핵산을 검출하는 방법이다.
어떤 방법에 의한 경우에도 검출해야 할 핵산이 이중 가닥인 경우에는 이중 가닥 핵산을 변성하여 단일 가닥으로 하거나 또는 단일 가닥 영역을 만들 필요가 있다. 한편, 검출할 핵산이 rRNA나 이미 변성된 DNA 등의 단일 가닥 핵산인 경우처럼 이미 단일 가닥 핵산인 경우에도 상기 방법에 의한 검출시 미리 단일 가닥으로 할 필요가 있다. 이것은 rRNA 등의 단일 가닥 핵산 분자 내에 존재하는 상보적 염기 배열 사이의 수소 결합에 의한 자기 회의(self-association)에 의해 형성되는 분자 내 루프 등의 이차 구조를 가지고 있으며, 올리고뉴클레오티드 프로브를 결합시키기 위해 변성에 의해 분자 내 루프 등의 이차 구조를 없앤 단일 가닥 핵산으로 할 필요가 있기 때문이다.
표적 핵산을 단일 가닥으로 또는 단일 가닥 영역을 만들 경우, 많은 경우 알칼리 또는 열에 의한 변성을 수행하지만 어떤 방법에 의한 경우에도 변성 조건을 완화 (중화)하면, 표적 핵산은 즉시 이중 가닥으로 되돌아가 버린다. 따라서, 단일 가닥으로 한 표적 핵산에 올리고뉴클레오티드 프로브를 혼성화시키기 위해 수소 결합 등 분자간 결합력을 약하게 하여 이중 가닥에 회합하기 어렵게 표적 핵산을 단일 가닥의 상태로 유지하기 위해 고온 상태를 유지하거나, 염 농도와 pH를 조절하고 또는 무질서 이온(chaotropic ions), 포름 아미드(formamide) 등의 변성제를 추가할 필요가 있다.
또한, 변성 조건에서 혹은 단일 가닥 핵산 상태에서 재구성된 이중 가닥 핵산 중 일부는 분자 내에 존재하는 상보적 염기 배열 사이의 수소 결합에 의해 형성되는 분자 내 루프 등의 이차 구조를 가지고 있는 것이나, 일부 불완전한 이중 가닥이 형성된 것이 있다.
또한 상술한 rRNA 등은 DNA의 이중 가닥이 나선 구조 형성 및 동종의 인력에 의한 3 차 구조를 형성하고 있다.
이러한 이차와 삼차 구조의 본질적인 부분은 고온, 염의 존재 무질서 이온, 포름 아미드 등의 변성제의 존재와 같은 변성 조건에서 사라지기 쉽지 않고, 표적 핵산이 그런 고차 구조를 가짐으로써 올리고뉴클레오티드 프로브와 표적 핵산의 하이브리드 형성이 억제되거나 방해된다. 또한 이러한 혼성화를 억제됨으로써, 올리고뉴클레오티드 프로브는 표적 핵산의 본래 결합해야 표적으로하는 상호 보완적인 영역 이외의 영역에 특이적으로 결합하여 표적 단일 가닥 핵산의 표적 부분 새로운 이차, 삼차 구조가 형성된다. 그 결과, 표적 핵산을 정확하게 검출할 수 없다.
한편 대상으로 rRNA의 형광 표지 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용한 혼성화 분석에 의한 검출에서 표적인 rRNA에 올리고뉴클레오티드 프로브가 결합 영역에 인접 또는 동떨어진 영역에 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 결합시켜 올리고뉴클레오티드 프로브가 결합하는 영역이 막히지 않도록 하여 rRNA에 올리고뉴클레오티드 프로브의 결합 억제에 작동하는 위와 같은 고차 구조 형성, 올리고뉴클레오티드 프로브의 표적 rRNA에 비특이적인 결합을 감소시켜 올리고뉴클레오티드 프로브의 표적 rRNA에 특이적인 결합이 증가할 수 있고, 그 결과, 형광 표지 올리고뉴클레오티드 프로브가 발하는 형광을 지표로 한 표적 rRNA의 검출의 효과가 증대한 것으로 보고된 바 있다(특허문헌 1, 비특허문헌 1 및 비특허문헌 2).
다음으로, PCR을 이용한 표적 핵산의 검출 방법에서는 PCR 기기를 이용한 핵산 증폭 자체는 그 작업은 특히 복잡한 것이 아니고, 또한 핵산 증폭 시간 약 4 시간 정도로 비교적 단시간에서 가능하다.
그러나 PCR에 의해 증폭된 핵산 (PCR 산물)을 탐지, 식별하려면 agarose 전기 영동을 실시한 후, EtBr 등의 형광 염색 및 탈색하는 공정을 거치고, UV 트랜스 일루미네이터 등의 특수 장비를 사용하여 핵산을 검출하고, 그 분자량을 측정하는 복잡한 처리 공정이 필요하게 된다. 또한 이러한 PCR 산물의 검출, 분류에서는 목적으로 하는 PCR 산물의 분자량에 가까운 분자량의 비특이적인 PCR 산물이 검출될 수 있으며, 위양성(false positive)의 원인이 된다. 또한 감지할 표적 핵산이 야생형 핵산인 경우 시료 중의 핵산의 변이 (염기의 삽입 및 결손 등)이 인식되는 경우 야생형 핵산의 PCR 산물의 예상 분자량은 다른 분자량의 PCR 산물이 검출되어 본래 양성(positive)으로 인식되어야 PCR 산물이 비특이적 증폭에 의한 PCR 산물로 인식하여 위음성(false negatives)의 원인이된다.
한편, 항원이나 단백질의 탐지, 식별에 사용되는 항원 항체 반응을 이용하는 측면유동면역발색법(lateral-flow immunochromatography)을 핵산 탐지, 식별에 이용하려는 시도도 보고되고 있다.
이 측면유동면역발색법은 니트로 셀룰로오스 등을 소재로 하는 끈 모양의 막 (멤브레인 스트립)의 일 말단에 항원 포착용 표지 항체 (캡처 항체)를 배치하고 거기에 항원을 포함한 시료를 추가하여 멤브레인 스트립에서 전개된 항원과 캡처 항체의 복합체를 멤브레인의 다른 한쪽에 고정된 검출용 항체 (검출 항체)에 결합시켜 표지를 지표로 항원을 검출하는 것을 원칙으로 하는 방법이며, 일부 변법이 알려져있다(특허문헌 2, 특허문헌 3).
하나의 시도는, 표적 핵산 서열 및 그 상보 사슬에 혼성화할 수 있도록 설계되어 각각 다른 표지 (예는 비오틴, 형광 색소, 디곡시게닌 등)로 표지된 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 (예를 들어, 한 올리고뉴클레오티드 프라이머는 반응성 성분 쌍의 한쪽 (예, 비타민 B 복합체)로 표시되어 있으며, 다른 올리고뉴클레오티드 프라이머는 검출 가능한 물질 (예를 들면, 형광 색소)로 분류되는 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머)를 설계; 상기 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 표적 핵산을 증폭하고, 상기 2 개의 다른 신호를 갖는 이중 가닥 DNA (표적 증폭 핵산)를 얻고; 그 일 말단에 상기 반응성 성분 쌍의 다른 한편 (예, 아비딘)을 배치한 멤브레인 스트립 중에 상기 증폭된 표적 핵산을 전개하여 반응성 성분 (예를 들면, 아비딘)에 의해 포착된 표적 증폭 핵산을 표적 핵산이 갖는 다른 표식 (예, 형광 색소)를 지표로 핵산을 검출하는 방법이다(특허문헌 4).
다른 하나의 시도는 이중 가닥의 핵산을 검출하는 방법이며, 검출할 핵산을 PCR에 제공하여, PCR 프라이머의 연구에 의해 각각의 말단에 단일 가닥의 오버행을 갖는 이중 가닥의 표적 핵산을 준비하고 멤브레인 스트립의 일 말단에 표적 이중 가닥 핵산을 상기 말단의 오버행 부분의 핵산을 통해 포착하기 위한 표지 올리고뉴클레오티드를 배치하고 거기에 대상 이중 가닥 핵산을 더해 멤브레인 스트립에서 전개된 표지 올리고뉴클레오티드와 표적 이중 가닥 핵산과의 결합물을 상기 말단의 오버행 부분의 핵산을 통해 멤브레인의 다른 한쪽에 고정된 검출용의 올리고뉴클레오티드에 결합시켜 표식을 지표에 이중 가닥 핵산을 검출하는 방법이다(특허문헌 5).
다른 하나의 시도는 증폭된 RNA를 검출하는 방법이며, 증폭된 RNA를 추출하여 멤브레인 스트립의 일 말단에 표적 RNA를 포착하기 위한 표지 올리고뉴클레오티드를 배치하고 거기에 표적 RNA를 추가하여 멤브레인 스트립에서 전개된 표지 올리고뉴클레오티드와 표적 RNA와의 결합물을 멤브레인의 다른 한쪽에 고정된 검출용의 올리고뉴클레오티드에 결합시켜 표지를 지표로 표식 RNA를 검출하는 방법이다(특허문헌 6).
[특허문헌 1] 특허 제 2820749 호 공보 [특허문헌 2] 특허 제 3197277 호 공보 [특허문헌 3] 특개평 10-253632 호 공보 [특허문헌 4] 특허 제 3001906 호 공보 [특허문헌 5] 국제 공개 WO 2012/070618 호 공보 [특허문헌 6] 특개평 2006-201062 호 공보
[비특허문헌 1] Applied and Environmental Microbiology, Vol.66, No.8, p.3603-3607, 2000 [비특허문헌 2] BioTechniques, Vol.36, No.1, p.124-132, 2004
상술한 바와 같이, 인간을 비롯한 포유 동물, 숙주 생물, 식물, 식품 혹은 음료 등의 세균이나 바이러스에 의한 감염의 유무나 정도의 검사, 바이러스나 세균에 의한 감염 또는 유전자의 돌연변이 검출에서 검출해야 하는 표적 핵산의 일부 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하는 혼성화와 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 PCR을 이용하여 유전자 검사법이 유용하게 사용되고 있지만, 분석을 실시하는 동안 표적 핵산을 안정적 단일 가닥의 상태 또는 단일 가닥 영역을 보유한 상태로 유지하면서, 또한 복잡한 조작을 수반하지 않고 표적 핵산을 간편하면서도 높은 감도로 검출, 정량할 수 있는 방법은 아직까지 제공되지 않고, 요즈음 전염병에 대한 우려, 식품 안전에 대한 요구, 및 질환의 원인 파악, 상기 질환의 치료 및 치료 방법의 개발에 대한 요구에 부응 얻는 상기 검출 정량을 가능하게 하는 새로운 방법의 개발, 제공을 요구되고 있다.
본 발명은 바이러스, 박테리아, 미생물 및 유전자 변형 식물을 비롯한 다양한 생물에서 유래한 핵산 (예를 들어, 천연 핵산, 게놈 DNA, cDNA, RNA, PCR 등으로 증폭된 핵산 등)을 매우 간편하고 또한 고감도로 검출, 정량하는 방법 및 그 방법의 실시에 이용하는 장치 및 키트를 제공하고 그로 인하여 이러한 사회적 요구를 충족하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 바이러스, 세균, 미생물 및 유전자 변형 식물을 비롯한 다양한 생물에서 유래한 핵산을 간편하고 고감도로 검출 정량하는 방법에 대해 활발히 연구를 실시하여, 분석에 제공하는 단일 가닥 영역을 갖는 표적 핵산의 올리고뉴클레오티드 프로브가 혼성화 영역을 사이에 두고 위치하는 영역에 마스크 올리고뉴클레오티드 (후술하는 올리고뉴클레오티드 M1', 올리고뉴클레오티드 M2', ......, 올리고뉴클레오티드 MX')을 혼성화시킴으로써, 상기 프로브가 혼성화 영역을 개방하고, 또한 표적 핵산을 안정적으로 단일 가닥의 상태 또는 단일 가닥 영역을 유지한 상태로 유지하고 더 나아가, 이러한 단일 가닥 영역을 갖는 표적 핵산을 멤브레인에 전개하고, 올리고뉴클레오티드 프로브로 포착하고, 포착된 표적 핵산 (본 발명에서는 상기 표적 핵산이 다른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드와 혼성화하여 형성된 핵산 하이브리드를 의미)가 있거나 발생하는 표지를 지표로 표적 핵산을 검출 및 정량하는 크로마토그래피 (이하 "핵산 크로마토그래피"라 함) 또는 면역 측정법에 제공하는 것으로, 목적으로 하는 표적 핵산을 매우 간편하게, 한편으로 고감도로 검출, 정량할 수 있는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성했다.
즉 본 발명은 구체적으로, 하기에 기재하는 방법, 장치 및 키트 등에 관한 것이다.
[실시양태 1]
하기의 단계를 포함하는, 시료 중에 포함되는 1 종류 또는 서로 다른 2 개 이상의 표적 핵산을 크로마토그래피로 검출 또는 정량하는 방법:
(a) 영역 R1, 영역 R1을 사이에 두고 위치하는 각각의 영역 M1 및 영역 M2, 영역 R1과는 다른 영역 R2, 그리고 영역 R2를 사이에 두고 위치하는 각각의 영역 M3 및 영역 M4를 포함하는 표적 핵산 N의 단일 가닥 영역(single-stranded region) 중, 영역 M1, 영역 M2, 영역 M3 및 영역 M4의 적어도 하나의 영역에 대한 각각의 영역에 상보적인 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 M1', 올리고뉴클레오티드 M2', 올리고뉴클레오티드 M3' 및 올리고뉴클레오티드 M4'의 적어도 하나의 혼성화(hybridizing) 단계;
(b) 영역 R1에 표식(label) L1로 표지화된 상기 영역에 상보적인 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 R1'의 혼성화 단계;
(c) 영역 R2에, 상기 영역에 상보적인 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 R2' 또는 이의 말단에 앵커(anchor) A를 갖는 올리고뉴클레오티드 R2'의 혼성화 단계; 및
(d) 상기 (a) 내지 (c)를 거친 핵산 혼성 형성의 표식 L1을 지표로 하는 검출 또는 정량하는 단계; 및
(e) 필요에 따라, 시료 중 서로 다른 2 종류 이상의 표적 핵산 N이 포함된 경우에는 각각의 표적 핵산 N의 검출 또는 정량을 위해, 각각의 표적 핵산 N에 대한 상기의 (a) 내지 (d)를 수행하는 단계.
[실시양태 2]
실시양태 1에 있어서, 상기 (a)의 혼성화는 하기 중 어느 하나를 포함하는 것인 방법:
(i) 영역 M1 및 영역 M2는 적어도 하나의 영역에 대한, 올리고뉴클레오티드 M1' 및 올리고뉴클레오티드 M2' 각각의 적어도 하나의 혼성화;
(ii) 영역 M3 및 영역 M4의 적어도 하나의 영역에 대한, 올리고뉴클레오티드 M3' 및 올리고뉴클레오티드 M4' 각각의 적어도 하나의 혼성화;
(iii) 영역 M1 및 영역 M2는 적어도 하나의 영역에 대한, 올리고뉴클레오티드 M1' 및 올리고뉴클레오티드 M2' 각각의 적어도 하나의 혼성화, 및 영역 M3 및 영역 M4의 적어도 하나의 영역에 대한, 올리고뉴클레오티드 M3' 및 올리고뉴클레오티드 M4' 각각의 적어도 하나의 혼성화;
(iv) 영역 M1 및 영역 M2의 두 영역에 대한, 올리고뉴클레오티드 M1' 및 올리고뉴클레오티드 M2' 각각의 혼성화;
(v) 영역 M3 및 영역 M4의 두 영역에 대한, 올리고뉴클레오티드 M3' 및 올리고뉴클레오티드 M4' 각각의 혼성화;
(vi) 영역 M1 및 영역 M3의 두 영역에 대한, 올리고뉴클레오티드 M1' 및 올리고뉴클레오티드 M3' 각각의 혼성화;
(vii) 영역 M1 및 영역 M4의 두 영역에 대한, 올리고뉴클레오티드 M1' 및 올리고뉴클레오티드 M4' 각각의 혼성화;
(viii) 영역 M2 및 영역 M3의 두 영역에 대한, 올리고뉴클레오티드 M2' 및 올리고뉴클레오티드 M3' 각각의 혼성화;
(ix) 영역 M2 및 영역 M4의 두 영역에 대한, 올리고뉴클레오티드 M2' 및 올리고뉴클레오티드 M4' 각각의 혼성화; 또는
(x) 영역 M1 및 영역 M2의 두 영역에 대한, 올리고뉴클레오티드 M1' 및 올리고뉴클레오티드 M2' 각각의 혼성화, 및 영역 M3 및 영역 M4의 두 영역에 대한, 올리고뉴클레오티드 M3' 및 올리고뉴클레오티드 M4' 각각의 혼성화.
[실시양태 3]
실시양태 1 또는 실시양태 2에 있어서, 상기 크로마토그래피는 상기 (a) 및 (b), 또는 (a) 내지 (c)를 거쳐 형성된 핵산 하이브리드를 포착하여, 검출 또는 정량하기 위한 적어도 하나의 감지 영역(detection zone)을 구비하는 전개 요소(development element)에 있어서, 상기 전개 요소의 모세관 현상에 따라 실시되는 것인 방법.
[실시양태 4]
실시양태 3에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 올리고뉴클레오티드 R2'가 고정화되고, 또한,
상기 전개 요소의 일부에 하기 혼합물을 적용하는 것인 방법:
(i) 표적 핵산(target nucleic acid) N을 포함한 시료;
(ii) 상기 올리고뉴클레오티드 M1', 상기 올리고뉴클레오티드 M2', 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4'의 적어도 하나; 및
(iii) 표식 L1으로 표지된 상기 올리고뉴클레오티드 R1'.
[실시양태 5]
실시양태 3에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 앵커 A와 결합할 수 있는 수용체(acceptor) A'가 고정화되고, 또한,
상기 전개 요소의 일부에 하기의 혼합물을 적용하는 것인 방법:
(i) 표적 핵산 N을 포함한 시료;
(ii) 상기 올리고뉴클레오티드 M1', 상기 올리고뉴클레오티드 M2', 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나;
(iii) 표식 L1으로 표지된 상기 올리고뉴클레오티드 R1'; 및
(iv) 말단에 앵커 A를 포함하는 상기 올리고뉴클레오티드 R2'.
[실시양태 6]
실시양태 1 또는 실시양태 2에 있어서, 상기 크로마토그래피는 하기를 갖추는 장치를 이용하여 전개 요소의 모세관 현상에 따라 실시되는 것인 방법:
(i) 상기 (a) 및 (b), 또는 (a) 내지 (c)를 거쳐 형성된 핵산 하이브리드를 포착하여, 검출 또는 정량하기 위한 적어도 하나의 감지 영역을 구비한 전개 요소; 및
(ii) 상기 전개 요소에 접촉하여 구비된 적어도 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료를 적용하는 적용 영역(application zone).
[실시양태 7]
실시양태 6에 있어서, 상기 장치에
(iii) 상기 적용 영역 및 상기 전개 요소 모두에 접촉하여 제공되는 목표로 하는 올리고뉴클레오티드를 봉입하는 봉입 영역(enclosing zone),
을 추가적으로 갖춘 것인 방법.
[실시양태 8]
실시양태 6 또는 실시양태 7에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 올리고뉴클레오티드 R2' 가 고정화되어 있으며,
상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에
(i) 상기 올리고뉴클레오티드 M1', 상기 올리고뉴클레오티드 M2', 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나; 및
(ii) 상기 표식 L1으로 표지된 올리고뉴클레오티드 R1',
이 봉입되어 있으며, 또한,
상기 적용 영역에 상기 목표 핵산 N을 포함한 시료를 적용하는 것인 방법.
[실시양태 9]
실시양태 6 또는 실시양태 7에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 올리고뉴클레오티드 R2'가 고정화되어 있고,
상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에 상기 표식 L1으로 표지된 올리고뉴클레오티드 R1'이 봉입되어 있으며, 또한,
상기 적용 영역에
(i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료; 및
(ii) 상기 올리고뉴클레오티드 M1', 상기 올리고뉴클레오티드 M2', 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나,
의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
[실시양태 10]
실시양태 6 또는 실시양태 7에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 올리고뉴클레오티드 R2' 가 고정화되어 있고,
상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에 상기 올리고뉴클레오티드 M1' , 상기 올리고뉴클레오티드 M2', 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나가 봉입되어 있으며, 또한,
상기 적용 영역에
(i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료; 및
(ii) 상기 표식 L1로 표지된 올리고뉴클레오티드 R1'
의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
[실시양태 11]
실시양태 6 또는 실시양태 7에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 올리고뉴클레오티드 R2' 가 고정화되고, 또한
상기 적용 영역에
(i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료;
(ii) 상기 올리고뉴클레오티드 M1' , 상기 올리고뉴클레오티드 M2', 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나; 및
(iii) 상기 표식 L1으로 표지된 올리고뉴클레오티드 R1' ,
의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
[실시양태 12]
실시양태 6 또는 실시양태 7에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 앵커 A와 결합할 수 있는 수용체 A' 가 고정화되어있고,
상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에
(i) 상기 올리고뉴클레오티드 M1', 상기 올리고뉴클레오티드 M2', 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나;
(ii) 표식 L1으로 표지된 상기 올리고뉴클레오티드 R1'; 및
(iii) 말단에 앵커 A를 갖는 상기 올리고뉴클레오티드 R2',
이 봉입되어 있으며, 또한,
상기 적용 영역에 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료를 적용하는 것인 방법.
[실시양태 13]
실시양태 6 또는 실시양태 7에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 앵커 A와 결합할 수 있는 수용체 A'가 고정화되어 있고,
상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에
(i) 표식 L1으로 표지된 상기 올리고뉴클레오티드 R1' ; 및
(ii) 말단에 앵커 A를 갖는 상기 올리고뉴클레오티드 R2' ,
이 봉입되어 있으며, 또한
상기 적용 영역에
(i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료; 및
(ii) 상기 올리고뉴클레오티드 M1', 상기 올리고뉴클레오티드 M2', 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나;
의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
[실시양태 14]
실시양태 6 또는 실시양태 7에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 앵커 A와 결합할 수 있는 수용체 A'가 고정화되어 있고,
상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에 말단에 앵커 A를 갖는 상기 올리고뉴클레오티드 R2'가 봉입되어 있으며, 또한
상기 적용 영역에
(i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료;
(ii) 상기 올리고뉴클레오티드 M1', 상기 올리고뉴클레오티드 M2', 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나; 및
(iii) 표식 L1으로 표지된 상기 올리고뉴클레오티드 R1',
의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
[실시양태 15]
실시양태 6 또는 실시양태 7에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 앵커 A와 결합할 수 있는 수용체 A'가 고정화되어 있고,
상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에
(i) 상기 올리고뉴클레오티드 M1', 상기 올리고뉴클레오티드 M2', 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나; 및
(ii) 말단에 앵커 A를 갖는 상기 올리고뉴클레오티드 R2',
이 봉입되어 있으며, 또한
상기 적용 영역에
(i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료; 및
(ii) 표식 L1으로 표지된 상기 올리고뉴클레오티드 R1',
의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
[실시양태 16]
실시양태 6 또는 실시양태 7에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 앵커 A와 결합할 수 있는 수용체 A'가 고정화되어 있고,
상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에 상기 올리고뉴클레오티드 M1', 상기 올리고뉴클레오티드 M2', 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나가 봉입되어 있으며, 또한
상기 적용 영역에
(i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료;
(ii) 표식 L1으로 표지된 상기 올리고뉴클레오티드 R1'; 및
(iii) 말단에 앵커 A를 갖는 상기 올리고뉴클레오티드 R2'
의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
[실시양태 17]
실시양태 6 또는 실시양태 7에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 앵커 A와 결합할 수 있는 수용체 A'가 고정화되어 있고,
상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에
(i) 상기 올리고뉴클레오티드 M1', 상기 올리고뉴클레오티드 M2', 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나; 및
(ii) 표식 L1으로 표지된 상기 올리고뉴클레오티드 R1'
이 봉입되어 있으며, 또한
상기 적용 영역에
(i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료; 및
(ii) 말단에 앵커 A를 갖는 상기 올리고뉴클레오티드 R2',
의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
[실시양태 18]
실시양태 6 또는 실시양태 7에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 앵커 A와 결합할 수 있는 수용체 A'가 고정화되어 있고
상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에 상기 표식 L1으로 표지된 올리고뉴클레오티드 R1'가 봉입되어 있으며, 또한
상기 적용 영역에
(i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료;
(ii) 상기 올리고뉴클레오티드 M1', 상기 올리고뉴클레오티드 M2', 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나; 및
(iii) 말단에 앵커 A를 갖는 상기 올리고뉴클레오티드 R2',
의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
[실시양태 19]
실시양태 6 또는 실시양태 7에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 앵커 A와 결합할 수 있는 수용체 A'가 고정화되어 있고, 또한
상기 적용 영역에
(i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료;
(ii) 상기 올리고뉴클레오티드 M1', 상기 올리고뉴클레오티드 M2', 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나;
(iii) 표식 L1으로 표지된 상기 올리고뉴클레오티드 R1', 및
(iv) 말단에 앵커 A를 갖는 상기 올리고뉴클레오티드 R2',
의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
[실시양태 20]
실시양태 1 내지 실시양태 3, 실시양태 5 내지 실시양태 7 및 실시양태 12 내지 실시양태 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 앵커 A가 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide), 비오틴(biotin), 항체(antibody), 단백질(protein) 또는 당쇄(sugar chain)이며, 상기 수용체 A'가 올리고뉴클레오티드, 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 항체 또는 단백질인 것인 방법.
[실시양태 21]
실시양태 20에 있어서, 상기 앵커 A가 비오틴이며, 상기 수용체 A'가 아비딘 또는 스트렙타비딘인 방법.
[실시양태 22]
실시양태 20에 있어서, 상기 수용체 A'가 항체인 방법.
[실시양태 23]
실시양태 3 내지 22항 중 어느 한 항에 있어서, 시료 중에 다른 2 종류 이상의 표적 핵산 N이 포함된 경우, 상기 전개 요소가 (i) 각각의 표적 핵산 N에 혼성화하는 상기 올리고뉴클레오티드 R2'의 각각이 고정화된 2 개 이상의 감지 영역, 또는 (ii) 각각의 표적 핵산 N에 혼성화하는 각각 다른 앵커 A를 그 말단에 갖는 올리고뉴클레오티드 R2'와 각각 결합할 수 있는 각각 다른 수용체 A'가 고정화된 2 개 이상의 감지 영역을 구비하는 것을 특징으로 하는, 방법.
[실시양태 24]
실시양태 6 내지 실시양태 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장치가 상기 전개 요소와 접촉하여 갖추어진, 상기 감지 영역을 넘어 확장된 시료를 흡수하는 흡수 영역(absorption zone)을 추가적으로 구비한 것인 방법.
[실시양태 25]
실시양태 1 내지 실시양태 24 중 어느 한 항에 있어서, 표식 L1은 금속 콜로이드 입자(colloidal metal particle), 라텍스 입자(latex particle), 착색 리포좀(pigmented liposome) 또는 효소(enzyme)인 방법.
[실시양태 26]
실시양태 25에 있어서, 금속 콜로이드 입자는 금 콜로이드 입자(colloidal gold particle), 백금 콜로이드 입자(colloidal platinum particle), 백금-금 콜로이드 입자(colloidal platinum-gold particle), 팔라듐 입자(palladium particle), 은 콜로이드 입자(colloidal silver particle), 로듐 콜로이드 입자(colloidal rhodium particle), 루테늄 콜로이드 입자(colloidal ruthenium particle) 또는 이리듐 콜로이드 입자(colloidal iridium particle)인 방법.
[실시양태 27]
실시양태 25에 있어서, 효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 포도당 산화 효소(glucose oxidase), 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase) 또는 베타-갈라토시다아제(β-galactosidase)인 방법.
[실시양태 28]
실시양태 3 내지 실시양태 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전개 요소 또는 상기 장치가 불침습성 고체 재료(moisture-impermeable solid material)인 케이스 내부에 배치된 것인 방법.
[실시양태 29]
하기를 포함하는, 시료 중에 포함되는 1 종류 또는 서로 다른 2 개 이상의 표적 핵산을 크로마토그래피에 의해 검출 또는 정량하는 방법:
(a) 영역 R1, 및 영역 R1을 사이에 두고 위치하는 각각 영역 M1 및 영역 M2를 포함하는 표식 L2로 표지된 표적 핵산 N의 단일 가닥 영역 중 영역 M1 및 영역 M2는 적어도 하나에 대한, 각각의 영역에 상보적인 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 M1' 및 올리고뉴클레오티드 M2' 중 적어도 하나의 혼성화 단계;
(b) 영역 R1에 표식 L1로 표지된, 상기 영역에 상보적인 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 R1'의 혼성화 단계; 및
(c) 상기 (a) 및 (b)를 거쳐 형성된 핵산 하이브리드의, 상기 표식 L2 및 상기 표식 L2에 결합하는 물질과의 결합을 통해 포착하는 단계, 및 상기 표식 L1을 지표로 하는 검출 또는 정량 단계; 및
(d) 필요에 따라서, 시료 중 다른 2 종류 이상의 표적 핵산 N이 포함된 경우에는 각각의 표적 핵산 N의 검출 또는 정량을 위하여, 각각의 표적 핵산 N에 대한 상기의 (a) 내지 (c)를 수행하는 단계.
[실시양태 30]
실시양태 29에 있어서, 상기 (a)의 혼성화는 영역 M1 및 영역 M2의 두 영역에 대하여 올리고뉴클레오티드 M1' 및 올리고뉴클레오티드 M2' 각각의 혼성화를 포함하는 것인 방법.
[실시양태 31]
실시양태 29 또는 실시양태 30에 있어서, 상기 크로마토그래피는 전개 요소의 모세관 현상에 따라 실시되는 것으로, 상기 전개요소는 상기 (a) 및 (b)를 거쳐 형성된 핵산 하이브리드를 포착하여, 검출 또는 정량하기 위한 적어도 하나의 감지 영역을 갖춘 것인 방법.
[실시양태 32]
실시양태 31에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 표식 L2에 결합하는 물질이 고정화되고, 또한
상기 전개 요소의 일부에 하기의 혼합물을 적용하는 것인 방법:
(i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료;
(ii) 상기 올리고뉴클레오티드 M1' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M2' 중 적어도 하나; 및
(iii) 상기 표식 L1으로 표지된 올리고뉴클레오티드 R1'.
[실시양태 33]
실시양태 29 또는 실시양태 30에 있어서, 상기 크로마토그래피가 하기를 갖춘 장치를 이용하여 전개 요소의 모세관 현상에 따라 실시되는 것인 방법:
(i) 상기 (a) 및 (b)를 거쳐 형성된 핵산 하이브리드를 포착하여, 검출 또는 정량하기 위한 적어도 하나의 감지 영역을 갖춘 전개 요소; 및
(ii) 상기 전개 요소에 접촉하여 구비된 적어도 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료를 적용하는 적용 영역.
[실시양태 34]
실시양태 33에 있어서, 상기 장치에
(iii) 상기 적용 영역 및 상기 전개 요소 모두에 접촉하여 구비된, 목표로 하는 올리고뉴클레오티드를 봉입하기 위한 봉입 영역,
을 추가적으로 갖춘 방법.
[실시양태 35]
실시양태 33 또는 실시양태 34에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 표식 L2에 결합하는 물질이 고정화되어있고,
상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에
(i) 상기 올리고뉴클레오티드 M1' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M2' 중 적어도 하나; 및
(ii) 상기 표식 L1으로 표지된 올리고뉴클레오티드 R1',
이 봉입되어 있으며, 또한
상기 적용 영역에 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료를 적용하는 것인 방법.
[실시양태 36]
실시양태 33 또는 실시양태 34에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 표식 L2에 결합하는 물질이 고정화되어있고,
상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에 상기 표식 L1으로 표지된 올리고뉴클레오티드 R1'가 봉입되어 있으며, 또한
상기 적용 영역에
(i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료; 및
(ii) 상기 올리고뉴클레오티드 M1' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M2' 중 적어도 하나,
의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
[실시양태 37]
실시양태 33 또는 실시양태 34에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 표식 L2에 결합하는 물질이 고정화되어있고,
상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에 상기 올리고뉴클레오티드 M1' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M2' 중 적어도 하나가 봉입되어 있으며, 또한
상기 적용 영역에
(i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료; 및
(ii) 상기 표식 L1으로 표지된 올리고뉴클레오티드 R1',
의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
[실시양태 38]
실시양태 33 또는 실시양태 34에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 표식 L2에 결합하는 물질이 고정화되어있고, 또한
상기 적용 영역에
(i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료;
(ii) 상기 올리고뉴클레오티드 M1' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M2' 중 적어도 하나; 및
(iii) 상기 표식 L1으로 표지된 올리고뉴클레오티드 R1',
의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
[실시양태 39]
실시양태 31 내지 실시양태 38 중 어느 한 항에 있어서, 시료 중에 서로 다른 2 종류 이상의 표적 핵산 N이 포함된 경우, 각각의 표적 핵산 N은 각각 서로 다른 표식 L2로 표지되며, 상기 전개 요소가 상기 각각의 표식 L2에 결합하는 서로 다른 물질이 각각 고정된 2 개 이상의 감지 영역을 구비하는 것을 특징으로 하는 방법.
[실시양태 40]
하기를 포함하는, 시료 중에 포함되는 1 종류 또는 서로 다른 2 개 이상의 표적 핵산을 검출 또는 정량하는 방법:
(a) 영역 R2, 및 영역 R2를 사이에 두고 위치하는 영역 M3 및 영역 M4 각각을 포함하는 표식 L2로 표지된 표적 핵산 N의 단일 가닥 영역 중 영역 M3 및 영역 M4 중 적어도 하나에 대한, 각각의 영역에 상보적인 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 M3' 및 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나의 혼성화 단계;
(b) 영역 R2에, 상기 영역에 상보적인 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 R2' 또는 말단에 앵커 A를 갖는 올리고뉴클레오티드 R2'의 혼성화 단계; 및
(c) 상기 (a) 및 (b)를 거쳐 형성된 핵산 하이브리드의, 상기 표식 L2를 지표로 하는 검출 또는 정량 단계; 및
(d) 필요에 따라 시료 중 서로 다른 2 종류 이상의 표적 핵산 N이 포함된 경우, 각각의 표적 핵산 N의 검출 또는 정량을 위하여 각각의 표적 핵산 N에 대한 상기의 (a) 내지 (c)를 수행하는 단계.
[실시양태 41]
실시양태 40에 있어서, 상기 (a)의 혼성화는 영역 M3 및 영역 M4의 두 영역에 대하여 올리고뉴클레오티드 M3' 및 올리고뉴클레오티드 M4' 각각의 혼성화를 포함하는 것인 방법.
[실시양태 42]
실시양태 40 또는 실시양태 41에 있어서, 상기 검출 또는 정량이
(A) 상기 (a) 및 (b)를 거쳐 형성된 핵산 하이브리드를 포착하여, 검출 또는 정량하기 위한 적어도 하나의 감지 영역을 갖춘 전개 요소에서 모세관 현상을 이용하는 크로마토그래피; 또는
(B)
(i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료;
(ii) 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나; 및
(iii) 상기 말단에 앵커 A를 갖는 올리고뉴클레오티드 R2',
의 혼합물을, 그 표면에 상기 앵커 A와 결합할 수 있는 수용체 A'가 고정된 양을 갖는 고체 지지체에 적용하는 단계, 및
상기 앵커 A와 상기 수용체 A'의 결합을 통해 포착된 상기 (a) 및 (b)를 거쳐 형성된 핵산 하이브리드의 검출 또는 정량하는 단계,
에 의해 수행되는 것인 방법.
[실시양태 43]
실시양태 42에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 올리고뉴클레오티드 R2'가 고정화되고, 또한
상기 전개 요소의 일부에 하기 혼합물을 적용하는 방법:
(i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료; 및
(ii) 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나.
[실시양태 44]
실시양태 40 또는 실시양태 41에 있어서, 상기 검출 또는 정량이 하기를 갖추는 장치를 이용하여, 전개 요소의 모세관 현상을 이용하는 크로마토그래피에 의해 수행되는 방법:
(i) 상기 (a)와 (b)를 거쳐 형성된 핵산 하이브리드를 포착하여, 검출 또는 정량하기 위한 적어도 하나의 감지 영역을 갖춘 전개 요소; 및
(ii) 상기 전개 요소에 접촉하여 구비된 적어도 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료를 적용하기 위한 적용 영역.
[실시양태 45]
실시양태 44에 있어서, 상기 장치가
(iii) 상기 적용 영역 및 상기 전개 요소 모두에 접하여 구비된 목표로 하는 올리고뉴클레오티드를 봉입하는 봉입 영역,
을 추가적으로 갖춘 방법.
[실시양태 46]
실시양태 44 또는 실시양태 45에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 올리고뉴클레오티드 R2'가 고정화되어있고,
상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나가 봉입되어 있으며, 또한
상기 적용 영역에 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료를 적용하는 방법.
[실시양태 47]
실시양태 44 또는 실시양태 45에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 올리고뉴클레오티드 R2'가 고정화되고, 또한
상기 적용 영역에
(i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료; 및
(ii) 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나,
의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
[실시양태 48]
실시양태 44 또는 실시양태 45에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 앵커 A와 결합할 수 있는 수용체 A'가 고정화되어 있고,
상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에
(i) 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나; 및
(ii) 말단에 앵커 A를 갖는 상기 올리고뉴클레오티드 R2',
이 봉입되어 있으며, 또한
상기 적용 영역에 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료를 적용하는 것인 방법.
[실시양태 49]
실시양태 44 또는 실시양태 45에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 앵커 A와 결합할 수 있는 수용체 A'가 고정화되어 있고
상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에 말단에 앵커 A를 갖는 상기 올리고뉴클레오티드 R2'가 봉입되어 있으며, 또한
상기 적용 영역에
(i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료; 및
(ii) 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나,
의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
[실시양태 50]
실시양태 44 또는 실시양태 45에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 앵커 A와 결합할 수 있는 수용체 A'가 고정화되어 있고,
상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나가 봉입되어 있으며, 또한
상기 적용 영역에
(i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료; 및
(ii) 말단에 앵커 A를 갖는 상기 올리고뉴클레오티드 R2',
의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
[실시양태 51]
실시양태 44 또는 실시양태 45에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 앵커 A와 결합할 수 있는 수용체 A'가 고정화되어 있고,
상기 적용 영역에
(i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료;
(ii) 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4'의 하나; 및
(iii) 말단에 앵커 A를 갖는 상기 올리고뉴클레오티드 R2',
의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
[실시양태 52]
실시양태 48 내지 실시양태 51 중 어느 한 항에 있어서, 시료 중에 서로 다른 2 종류 이상의 표적 핵산 N이 포함된 경우, 각각의 표적 핵산 N이 동일한 표식 L2로 표지되며, 상기 전개 요소가 각각의 표적 핵산 N에 혼성화하는 각각 다른 앵커 A를 그 말단에 갖는 올리고뉴클레오티드 R2'와 각각 결합할 수 있는 각각 다른 수용체 A'가 고정된 2 개 이상의 감지 영역을 갖춘 것을 특징으로 하는 방법.
[실시양태 53]
실시양태 48 내지 실시양태 51 중 어느 한 항에 있어서, 시료 중에 서로 다른 2 종류 이상의 표적 핵산 N이 포함된 경우에는 각각의 표적 핵산 N은 각각 다른 표식 L2로 표지되는 것을 특징으로 하는 방법.
[실시양태 54]
실시양태 29 내지 실시양태 53에 있어서, 상기 표식 L2는, 비오틴(biotin), 형광 색소(fluorescent dye), 디곡시게닌(digoxigenin ; DIG), 항체 또는 효소인 것인 방법.
[실시양태 55]
실시양태 54에 있어서, 상기 표식 L2가 비오틴이며, 또한 상기 표식 L2에 결합하는 물질은 아비딘 또는 스트렙타비딘인 것인 방법.
[실시양태 56]
실시양태 29 내지 실시양태 38 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표식 L2에 결합하는 물질이 항체 또는 효소로 표지된 항체인 방법.
[실시양태 57]
실시양태 33 내지 실시양태 39 및 실시양태 44 내지 실시양태 56 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장치가, 상기 전개 요소와 접촉하여 구비된, 상기 감지 영역을 넘어 확장된 시료를 흡수하는 흡수 영역을 추가적으로 갖춘 것인 방법.
[실시양태 58]
실시양태 29 내지 실시양태 39 중 어느 한 항에 있어서, 표식 L1은 금속 콜로이드 입자, 라텍스 입자, 착색 리포좀(pigmented liposome) 또는 효소인 것인 방법.
[실시양태 59]
실시양태 58에 있어서, 금속 콜로이드 입자가 금 콜로이드 입자, 백금 콜로이드 입자, 백금-금 콜로이드 입자, 팔라듐 입자, 은 콜로이드 입자, 로듐 콜로이드 입자(colloidal rhodium particle), 루테늄 콜로이드 입자(colloidal ruthenium particle) 또는 이리듐 콜로이드 입자(colloidal iridium particle)인 것인 방법.
[실시양태 60]
실시양태 58에 있어서, 효소는 퍼옥시다아제, 포도당 산화 효소, 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase) 또는 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase)인 것인 방법.
[실시양태 61]
실시양태 31 내지 실시양태 39 및 실시양태 41 내지 실시양태 60 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전개 요소 또는 상기 장치가 불침습성 고체 재료인 케이스 내부에 배치되어 있는 것인 방법.
[실시양태 62]
실시양태 1 내지 실시양태 61 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산 N의 단일 가닥 영역이 이중 가닥 핵산(double-stranded nucleic acid)의 변성(denaturing)에 의해 생성되는 것인 방법.
[실시양태 63]
실시양태 1 내지 실시양태 62 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산 N이 DNA 또는 RNA인 것인 방법.
[실시양태 64]
실시양태 1 내지 실시양태 63 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산 N은 진핵 생물(eukaryote), 원핵 생물(prokaryote), 세균(bacterium) 또는 바이러스(virus)의 게놈에서 유래한 핵산; 상기 게놈을 제한 효소로 절단하여 생기는 게놈 단편에서 유래하는 핵산; 또는 인위적으로 증폭된 핵산인 것인 방법.
[실시양태 65]
실시양태 64에 있어서, 세균의 게놈 유래의 핵산이 하기 중 어느 하나인 것인 방법:
1) GenBank Accession No. FR714927로 식별되는 황색 포도상 구균 (Staphylococcus aureus, 이하 SA)의 게놈 DNA 중 2653499 ~ 2662118 번째 영역, 2656232 ~ 2657658 번째 영역 또는 2656470 ~ 2656799 번째 영역의 일부 또는 모든 핵산 서열을 포함하는 황색 포도상 구균의 게놈 핵산;
2) GenBank Accession No. AE015929로 식별되는 표피 포도상 구균 (Staphylococcus epidermidis, 이하 SE)의 게놈 DNA 중 384731 ~ 393399 번째 영역, 385337 ~ 388504 번째 영역 또는 385517 ~ 385796 번째 영역의 일부 또는 모든 핵산 서열을 포함하는 표피 포도상 구균의 게놈 핵산;
3) GenBank Accession No. CP004061로 식별되는 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa, 이하 PA)의 게놈 DNA 중 2386558 ~ 2391818 번째 영역, 2386678 ~ 2388735 번째 영역 또는 2387395 ~ 2387664 번째 영역의 일부 또는 모든 핵산 서열을 포함하는 녹농균의 게놈 핵산;
4) GenBank Accession No. HF558530로 식별되는 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis, 이하 EF)의 게놈 DNA 중 1837695 ~ 1841178 번째 영역, 1838789 ~ 1839704 번째 영역 또는 1839147 ~ 1839386 번째 영역의 일부 또는 모든 핵산 서열을 포함하는 엔테로코커스 패칼리스의 게놈 핵산;
5) GenBank Accession No. AP012306로 식별되는 대장균 (Escherichia coli, 이하 EC)의 게놈 DNA 중 1286884 ~ 1291840 번째 영역, 1290625 ~ 1291839 번째 영역 또는 1291152 ~ 1291460 번째 영역의 일부 또는 모든 핵산 서열을 포함하는 대장균의 게놈 핵산;
6) GenBank Accession No. CP001918로 식별되는 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae)의 게놈 DNA 중 1566239 ~ 1568859 번째 영역 또는 1566732 ~ 1566956 번째 영역의 일부 또는 모든 핵산 서열을 포함하는 엔테로박터 클로아케의 게놈 핵산; 또는
7) GenBank Accession No. CP003785로 식별되는 폐렴 간균 (Klebsiella pneumoniae, 이하 KP)의 게놈 DNA 중 4082686 ~ 4083937 번째 영역, 4082686 ~ 4083380 번째 영역 또는 4082799 ~ 4083096 번째 영역의 일부 또는 모든 핵산 서열을 포함하는 폐렴 간균 게놈 핵산.
[실시양태 66]
실시양태 1 내지 실시양태 65 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전개 요소를 사용하는 크로마토그래피가 적어도 하나의 변성제(denaturant) 또는 카오트로픽 시약(chaotropic agent), 또는 적어도 하나의 변성제 또는 카오트로픽 시약 및 적어도 하나의 무기염(inorganic salt)을 포함하는 버퍼 내에서 실시되는 것인 방법.
[실시양태 67]
실시양태 24 내지 실시양태 28 및 실시양태 57 내지 실시양태 66 중 어느 한 항의 방법에 사용하기 위한, 하기를 갖춘 장치:
(i) 상기 형성된 핵산 하이브리드를 포착하여, 검출 또는 정량하기 위한 적어도 하나의 감지 영역을 구비한 전개 요소;
(ii) 상기 전개 요소에 접촉하여 구비된 적어도 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료를 적용하기 위한 적용 영역;
(iii) 상기 적용 영역 및 상기 전개 요소 모두에 접촉하여 구비된, 목표로 하는 올리고뉴클레오티드를 봉입하는 봉입 영역; 및
(iv) 상기 전개 요소와 접촉하고 구비된, 상기 감지 영역을 넘어 확장된 시료를 흡수하기 위한 흡수 영역.
[실시양태 68]
실시양태 67에 있어서, 상기 전개 요소가 불침습성 고체 재료인 케이스 내부에 배치되어 있는 것인 장치.
본 발명의 마스크 올리고뉴클레오티드(mask oligonucleotides) (상기 실시양태에서 "올리고뉴클레오티드 M1", "올리고뉴클레오티드 M2", "올리고뉴클레오티드 M3", "올리고뉴클레오티드 M4", ..... , "올리고뉴클레오티드 MX")을 이용한 핵산 크로마토그래피 또는 면역 측정법에 의한 핵산을 검출, 정량하는 방법 및 상기 방법에 이용하기 위한 장치 및 키트는 첫 번째로, 마스크 올리고뉴클레오티드(mask oligonucleotides)라고 하는 기술적 특징을 이용하는 것으로 다음의 효과를 얻는다.
1) 검출할 표적 핵산 중 단일 가닥 영역의 올리고뉴클레오티드 프로브가 혼성화하는 영역이 분석 중 오픈 상태로 유지된다.
2) 분석 중, 표적 핵산을 안정적으로 단일 가닥의 상태 또는 단일 가닥 영역을 유지한 상태로 유지한다.
3) 그 결과, 올리고뉴클레오티드 프로브의 표적 핵산에의 혼성화의 속도가 증가한다.
4) 마스크 올리고뉴클레오티드를 사용하지 않는 경우에는 올리고뉴클레오티드 프로브가 표적 핵산에 혼성화하지 않도록 표적 핵산에서도 마스크 올리고뉴클레오티드를 사용하고, 본 발명의 핵산 크로마토그래피 또는 면역 측정법을 적용하여 상기 표적 핵산의 검출이 가능해진다.
5) 또한 일반 핵산 혼성화에서 이중 가닥 핵산을 단일 가닥의 상태 또는 단일 가닥 영역을 유지한 상태로 하기 위해 적용되는 변성 조건 (고온, 염 농도, 무질서 이온이나 포름아미드 등의 변성제의 존재)과 같은 비 생리적 조건에서 단백질이나 효소 등은 쉽게 실활하기 때문에 핵산 혼성화법을 이용한 유전자 검사에 사용되는 표지 물질은 형광 물질이나 디곡시게닌 등 저분자 화합물과 방사성 동위 원소 등에 한정되는 반면, 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용하여 변성 조건을 완화할 수 있기 때문에 지금까지 사용할 수 없었던 단백질 등의 표지 물질 또는 DNA 중합 효소 등이 이용 가능해진다.
게다가, 본 발명의 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용한 핵산 크로마토그래피 또는 면역 측정법에 의한 핵산을 검출, 정량하는 방법 및 상기 방법에 이용하기 위한 장치 및 키트는 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용하여 올리고뉴클레오티드 프로브가 결합하는 영역이 오픈 상태가 된 안정적인 단일 가닥 핵산 또는 단일 가닥 영역을 갖는 핵산 핵산 크로마토그래피라는 기술적 특징을 더 이용하여 지금까지 전혀 보고되지 않은 매우 간편하고 단시간에, 또한 고감도에서 표적 핵산을 검출, 정량 할 수 있다는 효과를 나타낸다.
본 발명의 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용한 핵산 크로마토그래피 또는 면역 측정법에 의한 핵산을 검출, 정량하는 방법 및 상기 방법에 이용하기 위한 장치 및 키트는 이러한 유리한 효과를 나타내는 것으로부터, 바이러스, 박테리아 및 미생물을 비롯한 다양한 생물에서 유래하는 모든 핵산 (예를 들어, 천연 핵산, 게놈 DNA, cDNA, RNA, PCR 등으로 증폭된 핵산 등)을 간편하고, 또한 고감도로 검출, 정량할 수 있다.
그 결과, 본 발명의 방법, 장치 및/또는 키트를 이용하면, 인간을 비롯한 포유 동물, 숙주 생물, 식물, 식품 혹은 음료 등의 세균이나 바이러스에 의한 감염의 유무와 정도, 바이러스나 세균에 의한 감염 또는 유전자의 돌연변이가 원인으로 의심되는 다양한 질환 (감염, 암, 대사성 질환, 유전 질환 등)의 원인 및 유전자의 다양성에 의한 다양한 유전적 특성을 간편하면서도 단시간에 높은 정밀도로 특정 할 수 있게 된다.
[도 1] 본 발명의 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용한 핵산 크로마토그래피 또는 면역 측정법에 포함되는 원리를 모식적으로 나타내는 도면.
[도 2] 상기에 예시한 각 형태의 표적 핵산의 포착 및 검출 방법의 원리를 모식적으로 나타내는 도면.
(1)과 (2)는, 상기의 실시양태 8 ~ 11 및 23 (후술하는 표 1에 나타난 형태 (a) 내지 (d)에 해당)에서 예시적으로 나타나는 방법의 원리를 나타낸다.
(3)은 상기의 실시양태 12 ~ 19 및 23 (후술하는 표 1에 나타난 형태 (e) 내지 (l)에 해당)에서 예시적으로 나타나는 방법의 원리를 나타낸다.
(4)는 상기 실시양태 35 ~ 39 (후술하는 표 1에 나타난 형태 (m) 내지 (p)에 해당)에서 예시적으로 나타나는 방법의 원리를 나타낸다.
(5) 및 (6)은 상기의 실시양태 46 및 47 (후술하는 표 1에 나타난 형태 (q)와 (r)에 해당)에서 예시적으로 나타나는 방법의 원리를 나타낸다.
(7)은 상기 실시양태 48 ~ 52 (후술하는 표 1에 나타난 형태 (s) 내지 (v)에 해당)에서 예시적으로 나타나는 방법의 원리를 나타낸다.
[도 3-1] 상기에 실시양태 8 ~ 11 및 23 (후술하는 표 1에 나타난 형태 (a) 내지 (d)에 해당)에 포함되는 형태의 원리를 모식적으로 나타내는 도면.
[도 3-2] 상기에 실시양태 12 ~ 19 및 23 (후술하는 표 1에 나타난 형태 (e) 내지 (l)에 해당)에 포함되는 형태의 원리를 모식적으로 나타내는 도면.
[도 3-3] 상기에 실시양태 35 ~ 39 (후술하는 표 1에 나타난 형태 (m) 내지 (p)에 해당)에 포함되는 형태의 원리를 모식적으로 나타내는 도면.
[도 3-4] 상기에 실시양태 46 및 47 (후술하는 표 1에 나타난 형태 (q)와 (r)에 해당)에 포함되는 형태의 원리를 모식적으로 나타내는 도면.
[도 3-5] 상기에 실시양태 48 내지 52 (후술하는 표 1에 나타난 형태 (s) 내지 (v)에 해당)에 포함되는 형태의 원리를 모식적으로 나타내는 도면.
[도 4-1] 상기에 실시양태 11 (후술하는 표 1에 나타난 형태 (d)에 해당)에 포함되는 형태의 원리를 모식적으로 나타내는 도면.
[도 4-2] 상기에 실시양태 9 (후술하는 표 1에 나타난 형태 (b)에 해당)에 포함되는 형태의 원리를 모식적으로 나타내는 도면.
[도 4-3] 상기에 실시양태 19 (후술하는 표 1에 나타난 형태 (l)에 해당)에 포함되는 형태의 원리를 모식적으로 나타내는 도면.
[도 4-4] 상기에 실시양태 18 (후술하는 표 1에 나타난 형태 (k)에 해당)에 포함되는 형태의 원리를 모식적으로 나타내는 도면.
[도 4-5] 상기에 실시양태 38 (후술하는 표 1에 나타난 형태 (p)에 해당)에 포함되는 형태의 원리를 모식적으로 나타내는 도면.
[도 4-6] 상기에 실시양태 36 (후술하는 표 1에 나타난 형태 (n)에 해당)에 포함되는 형태의 원리를 모식적으로 나타내는 도면.
[도 4-7] 상기에 실시양태 51 (후술하는 표 1에 나타난 형태 (v)에 해당)에 포함되는 형태의 원리를 모식적으로 나타내는 도면.
[도 4-8] 상기에 실시양태 40 (후술하는 표 1에 나타난 형태 (v)에 해당)에 포함되는 혼성화 -ELISA 측면의 원리를 모식적으로 나타내는 도면.
[도 4-9] 상기에 실시양태 23 (시료 중에 서로 다른 2 종류 이상의 표적 핵산이 포함된 경우에 있어서 아래의 표 1에 나타난 형태 (e) ~ (l)에 해당)에 포함된 형태의 원리를 모식적으로 나타내는 도면.
[도 4-10] 상기에 실시양태 39 (시료 중에 다른 2 종류 이상의 표적 핵산이 포함된 경우에 있어서 아래의 표 1에 나타난 형태 (m) ~ (p)에 해당)에 포함된 형태의 원리를 모식적으로 나타내는 도면.
[도 4-11] 상기에 실시양태 52 (시료 중에 다른 2 종류 이상의 표적 핵산이 포함된 경우에 있어서 아래의 표 1에 나타난 형태 (s) ~ (v)에 해당)에 포함된 형태의 원리를 모식적으로 나타내는 도면.
[도 4-12] 상기에 실시양태 53 (시료 중에 다른 2 종류 이상의 표적 핵산이 포함된 경우에 있어서 아래의 표 1에 나타난 형태 (s) ~ (v)에 해당)에 포함된 형태의 원리를 모식적으로 나타내는 도면.
[도 5-1] 본 발명의 핵산 크로마토그래피를 실시하기 위한 시트 형상의 전개 요소를 포함한 장치 및 상기 장치가 배치되는 케이스 (하우징; housing)의 하나의 예시적인 실시양태를 개략적으로 나타낸 도면 .
[도 5-2] 본 발명의 핵산 크로마토그래피를 실시하기 위한 시트 형상의 전개 요소를 포함하는 장치 (표적 핵산을 검출하기 위한 테스트 라인으로 감지 구역 이외에, 상기 장치가 제대로 작동하는지 여부를 확인하기 위한 인터널 컨트롤 (대조)로 핵산을 검출하기 위한 컨트롤 라인으로 감지 영역을 함께 갖춤), 및 상기 장치가 배치되는 케이스 (하우징)의 하나의 예시적인 실시형태를 모식적으로 나타내는 도면.
[도 6] 황색 포도상 구균 (Staphylococcus aureus, "SA"로 약칭; 균주 ATCC12600), 표피 포도상 구균 (Staphylococcus epidermidis, "SE"로 약칭; 균주 ATCC14990), 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa, "PA"로 약칭; 균주 JCM5962), 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis, "EF"로 약칭; 균주 JCM5803), 대장균 (Escherichia coli, "EC"로 약칭; 균주 JCM1649), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae, "ET"로 약칭; 균주 JCM1232) 및 폐렴 간균 (Klebsiella pneumoniae, "KP"로 약칭; 균주 JCM 1662)의 각각의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR 산물의 agarose gel 전기 영동으로 검색 결과를 보여주는 그림.
그림에서 M은 분자량 마커를 나타내며, 왼쪽에 있는 숫자는 분자량 (bp)를 나타낸다.
[도 7] 황색 포도상 구균 (Staphylococcus aureus, "SA"로 약칭; 균주 ATCC12600), 표피 포도상 구균 (Staphylococcus epidermidis, "SE"로 약칭; 균주 ATCC14990), 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa, "PA"로 약칭; 균주 JCM5962), 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis, "EF"로 약칭; 균주 JCM5803), 대장균 (Escherichia coli, "EC"로 약칭; 균주 JCM1649), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae, "ET"로 약칭; 균주 JCM1232) 및 폐렴 간균 (Klebsiella pneumoniae, "KP"로 약칭; 균주 JCM 1662)의 각각의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR 산물을 본 발명의 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용한 핵산 크로마토그래피 및 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용하지 않는 핵산 크로마토그래피에 각각 제공한 경우의, 상기 PCR 산물의 검출 결과를 나타내는 그림.
[도 8] 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae, “ET”로 약칭; 균주 JCM1232) 및 대장균 (Escherichia coli, "EC"로 약칭; 균주 JCM1649)의 각각의 게놈 DNA의 제한 효소 처리 단편을 ET에 특이적으로 혼성화하도록 설계한 본 발명의 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용한 핵산 크로마토그래피에 제공한 경우의, 상기 게놈 단편의 검출 결과를 나타내는 그림.
[도 9] Campylobacter jejuni (균주 ATCC700819), Campylobacter jejuni (균주 81-176), Campylobacter coli (균주 ATCC33559), Campylobacter coli (균주 ATCC43478), Campylobacter fetus (균주 ATCC27374), Campylobacter fetus (균주 ATCC19438), Campylobacter hyointestinalis (균주 ATCC35217), Campylobacter lari (균주 ATCC43675) 및 Campylobacter upsaliensis (균주 ATCC43956 주)의 각각의 게놈 DNA를 주형으로한 멀티플렉스 PCR에 의한 PCR 산물의 agarose gel 전기 영동으로 검색 결과를 보여주는 그림.
[도 10] Campylobacter jejuni (균주 ATCC700819), Campylobacter jejuni (균주 81-176), Campylobacter coli (균주 ATCC33559), Campylobacter coli (균주 ATCC43478), Campylobacter fetus (균주 ATCC27374), Campylobacter fetus (균주 ATCC19438), Campylobacter hyointestinalis (균주 ATCC35217), Campylobacter lari (균주 ATCC43675), Campylobacter upsaliensis (균주 ATCC43956) 및 Escherichia coli (균주 C600)의 각각의 게놈 DNA를 주형으로 한 멀티플렉스 PCR에 의한 PCR 산물을 본 발명의 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용한 핵산 크로마토그래피 및 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용하지 않는 핵산 크로마토그래피 각각에 제공한 경우의, 상기 PCR 산물의 검출 결과를 나타내는 그림.
[도 11] 본 발명의 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용하는 핵산 크로마토그래피의 마스크 올리고 뉴클레오타이드가 검출 감도에 미치는 효과의 비교 결과를 나타내는 그림.
[도 12] 본 발명의 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용하는 핵산 크로마토그래피의 마스크 올리고뉴클레오티드 사용의 실시양태에 따른 감도의 비교 결과를 나타내는 그림.
[도 13] 본 발명의 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용하는 핵산 크로마토그래피의 정량성을 나타내는 그림.
[도 14] 본 발명의 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용하는 핵산 크로마토그래피에서 마스크 올리고뉴클레오티드 사용의 실시양태에 따른 감도의 비교 결과를 나타내는 그림.
[도 15] 인간 베타(β) 글로빈 및 대장균 (Escherichia coli, "EC"로 약칭; 균주 JCM1649)의 각각의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR 산물의 agarose gel 전기 영동으로 검색 결과를 보여주는 그림.
그림에서 M은 분자량 마커를 나타내며, 왼쪽에 있는 숫자는 분자량 (bp)를 나타내고있다.
[도 16] 각종 세균의 각각의 16S rRNA를 주형으로 하여 PCR 산물을 본 발명의 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용한 핵산 크로마토그래피에 제공한 경우의, 상기 PCR 산물의 검출 결과를 나타내는 그림.
[도 17] 각종 칸디다 (Candida) 속 균의 각각의 게놈 DNA의 ITS 영역을 주형으로 하여 PCR 산물의 agarose gel 전기 영동으로 검색 결과를 보여주는 그림.
[도 18] 각종 칸디다 (Candida) 속 균의 각각의 게놈 DNA의 ITS 영역을 주형으로 하여 PCR 산물을 본 발명의 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용한 핵산 크로마토그래피에 제공한 경우의, 상기 PCR 산물의 검출 결과를 나타내는 그림.
본 발명은 상술한 [1] 내지 [68]에 예시적으로 기술된 대로의 발명으로서, 본 발명의 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용한 핵산 크로마토그래피 또는 면역 측정법에 의해 핵산을 검출, 정량하는 방법 및 상기 방법에 이용하기 위한 장치 및 키트 등을 제공한다.
또한, 본 명세서에서 인용된 모든 선행 기술 문헌은 참조로서 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 방법은 상술한 도 2에서 모식적으로 나타나는 표적 핵산의 포착 및 검출 방법의 각 원리 (1) ~ (7)을 이용하는 것을 특징으로 하고, 각 형태는 하기 표 1에 예시적으로 나타나는 실시양태가 포함된다.
Figure pct00001
표 1에 나타난 형태 (a) 내지 (d)는 상기 실시양태 8 ~ 11 (및 23)에 각각 해당한다.
표 1에 나타난 형태 (e) 내지 (l)은 상기의 실시양태 12 ~ 19 (및 23)에 각각 해당한다.
표 1에 나타난 형태 (m) 내지 (p)는 상기 실시양태 35 ~ 38 (및 39)에 각각 해당한다.
표 1에 나타난 형태 (q)와 (r)은 상기의 실시양태 46 및 47에 각각 해당한다.
표 1에 나타난 형태 (s) 내지 (v)는 상기 실시양태 48 ~ 51 (및 52)에 각각 해당한다.
본 발명에서 "시료"란, 어떤 생물 (동물, 식물, 미생물, 세균 등) 또는 바이러스의 생체 또는 그 일부 (기관, 조직, 체액, 장기 또는 성분 배아(embryo/fetus), 씨앗, 알, 난자(egg cell) 또는 정자(sperm) 배설물(excrement) 또는 그 일부 등), 그 처리 물, 또는 그들 중 하나에서 유래하는 후술하는 "핵산"(게놈 DNA, cDNA, mRNA, tRNA, rRNA 등) 또는 그 단편을 포함하는 조제물 (용액, 현탁액, 배양액, 배양 상청, 원심 상청, 원심 잔유물 등)을 의미한다.
또한, 상기의 모든 생물은 진핵생물(eukaryotes)(예를 들어, 동물, 식물, 균류(fungi)(mycetes와 동의어, 예를 들어, molds, 효모, 버섯 등), 조류, 및 원생 생물(protozoa)), 원핵생물(prokaryotes)(세균, 고세균(archaebacteria), 방선균(actinomycetes), 남조(cyanobacteria) 등), 미생물(microorganisms) 등이 포함된다.
본 발명에서 "동물"은, 예를 들어, 척추동물 (예를 들어, 포유류, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 무악 류(jawless vertebrates) 등) 및 무척추동물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한 상기 동물에는 유전자 변형 동물도 포함된다.
본 발명에서 "식물"은, 예를 들어, 종자 식물, 양치 식물(pteridophytes), 이끼 식물(bryophytes), 스트렙토 식물(Streptophyta), 녹색 식물, 원시 색소체 생물(Archaeplastida) 및 쌍편모생물(bikonts)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 식물에는 유전자 변형 식물도 포함된다.
본 발명에서 "미생물"은 예를 들어, 원핵 생물 (진정세균(eubacteria; 세균), 고세균), 조류, 원생 동물(protists), fungi, slime molds, mycetes, 프로토조아(protozoa)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 미생물은 유전자 변형 미생물도 포함된다.
곰팡이(fungi)로 예를 들어, Candida , Aspergillus , Cryptococcus , Mucor , Pneumocystis, Trichophyton, 및 Trichosporon 등을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
프로토조아(protozoa)로는, 예를 들어 Cryptosporidium , Cyclospora , Kudoa (Sarcosporidia), 아메바성 이질(amebic dysentery), Sarcocystis , Leishmania , Toxoplasma, 및 Trypanosoma 등을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "세균(Bacteria)"은, 예를 들어, 국제 세균 명명 규약 (International Code of Nomenclature of Bacteria)에 따라 분류되는 모든 세균 (예를 들면, 그람 양성균, 그람 음성균 등의 세균)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 세균은 유전자 변형 세균도 포함된다.
세균으로는 예를 들면, Staphylococcus, Streptococcus, Escherichia , Enterobacter, Haemophilus , Klebsiella , Pseudomonas , Campylobacter , Bacteroides, Serratia , Acinetobacter , Mycoplasma , Mycobacterium, Clostridium, Bacillus, Proteus , Neisseria , Salmonella, Shigella , Vibrio , Aeromonas , Yersinia, Listeria , Cronobacter , Citrobacter , Brucella , Pasteurella , Helicobacter, Moraxella , Legionella , Treponema , Rickettsia, Chlamydia , Enterococcus, Burkholderia , Stenotrophomonas , Edwardsiella , Hafnia , Kluyvera , Morganella, Pantoea , Providencia , Corynebacterium , Micrococcus , Sphingobacterium, Brevundimonas , Achromobacter , Alcaligenes , Chromobacterium , Porphyromonas, Prevotella , Fusobacterium , Lactobacillus, Peptoniphilus , Eggerthella, Propionibacterium , Capnocytophaga , Haemophilus, 및 Gardnerella 속 균 등을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "바이러스"는 예를 들어, 국제 바이러스 분류 위원회 (International Committee on Taxonomy of Viruses)에 의해 분류되는 모든 바이러스 및 그 변종을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 이중 가닥 DNA 바이러스, 단일 가닥 DNA 바이러스, 이중 가닥 RNA 바이러스, 단일 가닥 RNA (+strand) 바이러스, 단일 가닥 RNA (-strand) 바이러스, 단일 가닥 RNA (역전사) 바이러스, 또는 이중 가닥 DNA (역전사) 바이러스로 분류되는 모든 바이러스가 포함된다. 또한, 상기 바이러스는 유전자 변형 바이러스도 포함된다.
바이러스로는 예를 들어, 인간 면역 결핍 바이러스(human immunodeficiency virus), 인간 T 림프 호기성 바이러스(human T-lymphotropic virus), 사이토 메갈로 바이러스(cytomegalovirus), 헤르페스 바이러스(herpesvirus), EB 바이러스, 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 간염 바이러스(hepatitis virus), 노로 바이러스(norovirus), 로타 바이러스(rotavirus), 아데노 바이러스(adenovirus), 아스트로 바이러스(astrovirus), 유두종 바이러스(papillomavirus), RS 바이러스, 멈프스 바이러스(mumps virus), 코로나 바이러스(coronavirus), 루비 바이러스(rubivirus), SARS 바이러스 등을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 "핵산"은 천연 또는 인공적으로 제조된 임의의 핵산 (게놈 DNA, cDNA, 미토콘드리아 DNA (mtDNA), mRNA, tRNA, rRNA, short interfering (siRNA) shRNA (short hairpin RNA) , miRNA (micro RNA), snRNA (small nuclear RNA) tmRNA (transfer messenger RNA) 등) 또는 그 단편을 의미한다.
예를 들어, 표적 핵산 (즉, 표적 핵산 N)이 원핵 생물인 세균 유래의 핵산의 경우에는 세균 rRNA 유전자 중 23S, 16S 또는 5S 서브 유닛을 들 수 있다. 표적 핵산 (즉, 표적 핵산 N)이 진핵 생물인 곰팡이 유래의 핵산의 경우에는 곰팡이 rRNA 유전자 중 28S, 18S, 5.8S 또는 5S 서브 유닛 또는 그 주변의 internal transcribed spacer (ITS) 영역 또는 intergenic spacer (IGS) 영역을 포함한다.
상기 핵산은 이중 가닥 또는 단일 가닥의 어느 것이라도 좋고, 이중 가닥인 경우에는 후술하는 “변성”에 의해 단일 가닥이 될 수 있다.
상기 핵산은 또한, 자가 결합(self-association)에 의해 분자 내 루프 등을 포함한 이차 또는 삼차 구조를 갖는 것도 포함된다. 이러한 고차 구조는 후술하는 “변성” 및 기타 통상적인 방법에 따라 해소시킬 수 있다.
상기 천연 핵산은 상기 생물, 세균이나 바이러스 등에 유래한 핵산이며, 상기 생물, 세균 또는 바이러스의 생체 또는 그 일부에서 취득되는 핵산 및 상기 취득된 핵산에 따라 효소 반응(DNA 중합 효소, RNA 중합 효소, 역전사 효소 등)에 의해 인위적으로 증폭 조제된 핵산을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
상기 산소 반응에 의한 핵산의 증폭 조제는 중합 효소 연쇄 반응 (PCR; polymerase chain reaction), LAMP (loop-mediated isothermal amplification), TMA (transcription-mediated amplification), TRC (transcription-reverse transcription concerned reaction), LCR (ligase chain reaction), SDA (standard displacement amplification), NASBA (nucleic acid sequence-based amplification) 등 (임상 의학, Vol.36, p.19-24,2007)에 의해 실시할 수 있다.
상기 인위적으로 증폭, 조제된 핵산은 또한 목적에 따라 설계된 염기 서열에 따라 DNA/RNA 합성 장치를 이용하여 제조되는 임의의 핵산이 포함된다.
본원 발명은 상기의 PCR, LAMP, TMA, TRC, LCR, SDA 또는 NASBA 등의 방법으로 증폭, 조제된 핵산은 그 방법에 있어서 어떤 조건 (각 프라이머의 농도, 염 농도, 반응 시간, 반응 온도, 반응주기 등)에서 증폭, 조제된 핵산이 포함된다. 예를 들어, PCR에 의한 핵산의 증폭에 있어서 각 프라이머의 농도를 예로 들면 PCR로 사용되는 한 쌍 또는 두 쌍 이상의 쌍의 프라이머 (정방향 프라이머, 역방향 프라이머)에서 정방향 프라이머와 역방향 프라이머의 농도는 동일하거나 달라도 좋다(비대칭 PCR).
본 발명의 핵산은 임의의 크기, 사이즈, 염기 길이를 가지고 있어도 좋고, 예를 들면, 약 50～약 100,000bp、약 50～약 50,000bp、약 50-약 10,000bp、약 50-약 5,000bp、약 100～약 100,000bp、약 100～약 50,000bp、약 100-약 10,000bp、약 100-약 5,000bp、약 200～약 100,000bp、약 200～약 50,000bp、약 200-약 10,000bp、약 200-약 5,000bp、약 300～약 100,000bp、약 300～약 50,000bp、약 300-약 10,000bp、약 300-약 5,000bp、약 400～약 100,000bp、약 400～약 40,000bp、약 400-약 10,000bp、약 400-약 5,000bp、약 500～약 100,000bp、약 500～약 50,000bp、약 500-약 10,000bp、약 500-약 5,000bp、약 600～약 100,000bp、약 600～약 50,000bp、약 600-약 10,000bp、약 600-약 5,000bp、약 700～약 100,000bp、약 700～약 50,000bp、약 700-약 10,000bp、약 700-약 5,000bp、약 800～약 100,000bp、약 800～약 50,000bp、약 800-약 10,000bp、약 800-약 5,000bp、약 900～약 100,000bp、약 900～약 50,000bp、약 900-약 10,000bp、약 900-약 5,000bp、약 1,000～약 100,000bp、약 1,000～약 50,000bp、약 1,000-약 10,000bp、약 1,000-약 5,000bp 등일 수 있다.
상기 핵산 단편은 상기와 같이 천연 또는 인위적으로 증폭, 조제한 핵산을, 시판의 다양한 제한 효소 (예를 들어, I 형 제한 효소 타입, II 제한 효소 등)의 하나 이상의 의해 처리, 절단하여 생성되는 임의의 크기의 핵산을 포함한다.
예를 들어, 본 발명의 방법 및 장치를 이용하여 황색 포도상 구균 (Staphylococcus aureus, "SA"로 약칭), 표피 포도상 구균 (Staphylococcus epidermidis, "SE"로 약칭), 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa , " PA "로 약칭), 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis, "EF"로 약칭), 대장균 (Escherichia coli, "EC"로 약칭), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae. “ET”로 약칭) 및 폐렴 간균 (Klebsiella pneumoniae, "KP"로 약칭)의 게놈 유래의 핵산을 검출, 정량하는 경우에는 각각 다음의 게놈 내의 영역의 일부 또는 전부를 대상으로 할 수 있다.
황색 포도상 구균 ( Staphylococcus aureus )
GenBank Accession No. FR714927 (최종 등록 일자 : 2011 년 11 월 21 일)로 식별되는 황색 포도상 구균 (Staphylococcus aureus, "SA"로 약칭)의 게놈 DNA 중 2653499 ~ 2662118 번째 영역, 2656232 ~ 2657658 번째 영역 또는 2656470 ~ 2656799 번째 영역의 일부 또는 전부의 핵산 서열.
표피 포도상 구균 ( Staphylococcus epidermidis , "SE")
GenBank Accession No. AE015929 (최종 등록 일자 : 2010 년 3 월 5 일)로 식별되는 표피 포도상 구균 (Staphylococcus epidermidis, "SE"로 약칭)의 게놈 DNA 중 384731 ~ 393399 번째 영역 385337 ~ 388504 번째 영역 또는 385517 ~ 385796 번째 영역의 일부 또는 전부의 핵산 서열.
녹농균 ( Pseudomonas aeruginosa , "PA")
GenBank Accession No. CP004061 (최종 등록 일자 : 2013 년 4 월 9 일)로 식별되는 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa, "PA"로 약칭)의 게놈 DNA 중 2386558 ~ 2391818 번째 영역, 2386678 ~ 2388735 번째 영역 또는 2387395 ~ 2387664 번째 영역의 일부 또는 전부의 핵산 서열.
엔테로코커스 패칼리스 ( Enterococcus faecalis , " EF ")
GenBank Accession No. HF558530 (최종 등록 일자 : 2012 년 12 월 3 일)로 식별되는 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis, "EF"로 약칭)의 게놈 DNA 중 1837695 ~ 1841178 번째 영역, 1838789 ~ 1839704 번째 영역 또는 1839147 ~ 1839386 번째 영역의 일부 또는 전부의 핵산 서열.
대장균 ( Escherichia coli , "EC")
GenBank Accession No. AP012306 (최종 등록 일자 : 2013 년 3 월 29 일)로 식별되는 대장균 (Escherichia coli, "EC"로 약칭)의 게놈 DNA 중 1286884 ~ 1291840 번째 영역, 1290625 ~ 1291839 번째 영역 또는 1291152 ~ 1291460 번째 영역의 일부 또는 전부의 핵산 서열.
엔테로박터 클로아케 ( Enterobacter cloacae , "ET")
GenBank Accession No. CP001918 (최종 등록 일자 : 2010 년 4 월 23 일)로 식별되는 Enterobacter cloacae ("ET"로 약칭)의 게놈 DNA 중 1566239 ~ 1568859 번째 영역 또는 1566732 ~ 1566956 번째 영역 일부 또는 전부의 핵산 서열.
폐렴 간균 ( Klebsiella pneumoniae , " KP ")
GenBank Accession No. CP003785 (최종 등록 일자 : 2013 년 3 월 12 일)로 식별되는 폐렴 간균 (Klebsiella pneumoniae, "KP"로 약칭)의 게놈 DNA 중 4082686 ~ 4083937 번째 영역, 4082686 ~ 4083380 번째 영역 또는 4082799 ~ 4083096 번째 영역의 일부 또는 전부의 핵산 서열.
상기의 이중 가닥의 핵산과 고차 구조를 갖는 핵산은 열, 산, 알칼리, 카오트로픽시약(chaotropic agent) 또는 변성제에 의해 변성 (상보적인 뉴클레오티드 사슬 간의 수소 결합을 절단)시킴으로써 단일 가닥으로, 또는 일부의 고차 구조를 해소시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 핵산을 고온 (약 90 ℃ 이상), 높은 pH (알칼리성; pH 약 9 이상), 저염 농도, 무질서 이온, 변성제의 존재, 가압, 교반 등의 조건에 교부 하에서 대하여 변성되어 단일 가닥으로 되거나 또는 일부의 고차 구조를 해소시킬 수 있다.
카오트로픽시약으로는 예를 들어, 포름 아미드(formamide), 우레아(urea), 티오 우레아(thiourea), 구아니딘(guanidine), 구아니딘 염산(guanidine hydrochloride), 구아니딘 이소티오시아네이트(guanidine isothiocyanate), 요오드화물 이온(iodide ions) 또는 과염소산 이온(perchlorate ions)을 들 수 있다.
본 발명에서 "표적 핵산"은 본 발명의 검출 및 정량 방법 또는 상기 방법에 사용되는 장치 또는 키트에 의해 검출, 정량되어야하는 시료 중에 포함되거나 상기 시료 유래 핵산을 의미하며 바람직하게는 원래 단일 가닥인 핵산 또는 변성의 결과를 발생시키는 단일 가닥의 핵산 또는 단일 가닥 영역을 갖는 핵산이다.
상기 표적 핵산에는 후술하는 각종 표지 물질로 표지된 핵산, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브 및/또는 하나 이상의 마스크 올리고뉴클레오티드 (상기 본 발명의 실시양태 및 후술하는 “올리고뉴클레오티드 M1”, “올리고뉴클레오티드 M2”, “올리고뉴클레오티드 M3”, “올리고뉴클레오티드 M4”, ...... , “올리고뉴클레오티드 MX”)가 혼성화된 후의 표적 핵산도 포함된다.
본 발명에서는 이러한 표적 핵산에 하나 이상의 올리고뉴클레오티드가 혼성화하여 형성된 핵산을 "핵산 하이브리드(nucleic acid hybrids)”라고 칭한다.
상기 단일 가닥의 표적 핵산은 본 발명의 검출, 정량의 과정에서, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브 및/또는 상기 마스크 올리고뉴클레오티드와 결합 후 보완적인 핵산과 어닐링함으로써 다시 이중 가닥이 될 수 있지만, 이러한 형태도 본 발명의 실시양태에 포함된다.
본 발명은 후술하는 본 발명의 핵산 크로마토그래피에 포함된 표적 핵산의 단일 가닥 영역에 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브 및/또는 하나 이상의 마스크 올리고 뉴클레오타이드의 혼성화를, 후술하는 핵산 또는 핵산 하이브리드 전개 요소 중에서 전개하기 위하여 버퍼 중 적어도 하나의 상기의 변성제 또는 카오트로픽시약을 존재시킴으로써 조절할 수 있다. 상기 버퍼 중에는 더욱 핵산의 혼성화에서 일반적으로 사용되는 적어도 하나의 무기염을 존재시킬 수 있다.
즉, 이러한 혼성화 공정에 있어서, 상기의 변성제 또는 카오트로픽시약을 존재시킴으로써 표적 핵산과 각종 올리고뉴클레오티드의 비특이적 반응에 의한 결합을 줄이고 특이적 반응을 촉진함으로써 해상도를 높여 검출 한계를 저하시킴으로써 표적 핵산의 검출, 정량 감도, 정확성 및 신속성을 증대시킬 수 있다.
상기 버퍼 중에 예를 들어, 10-40 %, 보다 바람직하게는 15-30 %, 더욱 바람직하게는 20-25 %의 포름 아미드, 1-7 M, 더욱 바람직하게는 1-4 M, 더욱 바람직하게는 2.5-4 M의 우레아 또는 티오 우레아, 0.5-5 M, 더욱 바람직하게는 1-4 M, 더욱 바람직하게는 1.2-3 M의 구아니딘 또는 구아니딘 이소티오시아네이트 및/또는 요오드화물 이온이나 과염소산 이온 등의 카오트로픽시약을 첨가할 수 있다. 상기 버퍼는 또한 혼성화에서 일반적으로 사용되는 무기 염류를 추가할 수 있다.
상기 시료 중에는, 1 종류 또는 서로 다른 2 개 이상의 표적 핵산이 포함되어있을 수 있으며, 후술하는 바와 같이, 본 발명의 방법 및 장치 또는 키트를 이용하면 시료 중에 포함되는 상기 2 종류 이상 다른 표적 핵산을 동시에 검출, 정량할 수 있다.
본 발명의 표적 핵산의 검출, 정량의 하나의 실시양태 (예를 들어, 상기에 예시 한 본 발명의 실시양태 1 ~ 66로 대표되지만, 이에 한정되지 않음)에서 예를 들어, 단일 가닥의 표적 핵산 (이하, "표적 핵산 N”'라고 칭함. 문자 N은 nucleic acid의 머리 글자 N.)의 영역 (이하, “영역 R1”라고 칭함)에 올리고뉴클레오티드 프로브 R1’(이하, “올리고뉴클레오티드 R1’”라고 칭함. 후술하는 표식 L1으로 표지되어 있을 수 있음.)의 혼성화에 의한 표적 핵산 N의 포착 (capture)을 포함한다.
또한, 본 발명에서는, 상기 올리고뉴클레오티드 R1’(표식 L1으로 표지되어 있을 수 있음)을, 캡처 올리고뉴클레오티드라고 칭하는 경우가 있다.
영역 R1으로는 예를 들어, 표적 핵산 N의 5’ 말단 또는 3' 말단의 근연의 영역이 있다. 상기 영역 R1의 길이는 예를 들면, 약 10 ~ 약 300mer 약 10 ~ 약 200mer 약 10 ~ 약 150mer 약 10 ~ 약 100mer 약 10 ~ 약 90mer 약 10 ~ 약 80mer 약 10 ~ 약 70mer 약 10 ~ 약 60mer 약 10 ~ 약 50mer 약 10 ~ 약 40mer 약 10 ~ 약 30mer 약 10 ~ 약 20mer 약 15 ~ 약 300mer 약 15 ~ 약 200mer 약 15 ~ 약 150mer, 약 15 ~ 약 100mer 약 15 ~ 약 90mer 약 15 ~ 약 80mer 약 15 ~ 약 70mer 약 15 ~ 약 60mer 약 15 ~ 약 50mer 약 15 ~ 약 40mer 약 15 ~ 약 30mer 약 15 ~ 약 20mer 약 20 ~ 약 300mer 약 20 ~ 약 200mer 약 20 ~ 약 250mer 약 20 ~ 약 100mer 약 20 ~ 약 90mer 약 20 ~ 약 80mer 약 20 ~ 약 70mer 약 20 ~ 약 60mer 약 20 ~ 약 50mer 약 20 ~ 약 40mer 약 20 ~ 약 30mer 약 25 ~ 약 300mer 약 25 ~ 약 200mer 약 25 ~ 약 150mer 약 25 ~ 약 100mer 약 25 ~ 약 90mer, 약 25 ~ 약 80mer 약 25 ~ 약 70mer 약 25 ~ 약 60mer 약 25 ~ 약 50mer 약 25 ~ 약 40mer 약 25 ~ 약 30mer일 수 있다.
영역 R1에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 프로브 R1’(올리고뉴클레오티드 R1')는 영역 R1의 염기 서열과 상보적인 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드이다. 올리고뉴클레오티드 프로브 R1’의 길이는 영역 R1의 길이에 대응하고, 예를 들면, 약 10 ~ 약 300mer 약 10 ~ 약 200mer 약 10 ~ 약 150mer 약 10 ~ 약 100mer 약 10 ~ 약 90mer 약 10 ~ 약 80mer 약 10 ~ 약 70mer 약 10 ~ 약 60mer 약 10 ~ 약 50mer 약 10 ~ 약 40mer 약 10 ~ 약 30mer 약 10 ~ 약 20mer 약 15 ~ 약 300mer 약 15 ~ 약 200mer 약 15 ~ 약 150mer 약 15 ~ 약 100mer 약 15 ~ 약 90mer 약 15 ~ 약 80mer 약 15 ~ 약 70mer 약 15 ~ 약 60mer 약 15 ~ 약 50mer 약 15 ~ 약 40mer 약 15 ~ 약 30mer 약 15 ~ 약 20mer 약 20 ~ 약 300mer 약 20 ~ 약 200mer 약 20 ~ 약 250mer 약 20 ~ 약 100mer 약 20 ~ 약 90mer 약 20 ~ 약 80mer 약 20 ~ 약 70mer 약 20 ~ 약 60mer 약 20 ~ 약 50mer 약 20 ~ 약 40mer 약 20 ~ 약 30mer 약 25 ~ 약 300mer 약 25 ~ 약 200mer 약 25 ~ 약 150mer 약 25 ~ 약 100mer 약 25 ~ 약 90mer 약 25 ~ 약 80mer 약 25 ~ 약 70mer 약 25 ~ 약 60mer 약 25 ~ 약 50mer 약 25 ~ 약 40mer 약 25 ~ 약 30mer일 수 있다.
또한 이러한 올리고뉴클레오티드 프로브 R1’(올리고뉴클레오티드 R1')는 영역 R1에 혼성화하는 만큼 선택적으로 영역 R1의 염기 서열에 대해 1 이상의 불일치(mismatches) 또는 팽창(bulges)을 가지고 있을 수 있다.
본 발명에서는 영역 R1에 혼성화 올리고뉴클레오티드 프로브 R1’(올리고뉴클레오티드 R1')은 표식 물질 (이하, "표식 L1”이라고 칭함. 문자 L은 label의 L.)으로 표지되어 있을 수 있다.
표식 L1은 예를 들어, 금속 콜로이드 입자 (금 콜로이드 입자, 백금 콜로이드 입자, 백금 - 금 (Pt-Au) 콜로이드 입자, 팔라듐 콜로이드 입자, 은 콜로이드 입자, 구리 콜로이드 입자, 니켈 콜로이드 입자, 로듐 콜로이드 입자, 루테늄 콜로이드 입자, 이리듐 콜로이드 입자 등), 라텍스 입자 (흰색 라텍스 입자, 착색 라텍스 입자, 형광 라텍스 입자, 자기 라텍스 입자, 관능기 자격 라텍스 입자 등), 착색 리포솜 비금속 콜로이드 (예를 들면, 셀렌 콜로이드), 각종 효소 (알칼리 포스파타제, 퍼 옥시다아제, 포도당 산화 효소 또는 β-galactosidase 등), 착색 수지 입자, 염료 콜로이드 불용성 미립자 물질, 형광 색소, 방사성 동위 원소 등을 들 수 있다.
본 발명의 표적 핵산의 검출, 정량에서는 또한 표적 핵산 N 중에서 영역 R1과는 다른 다른 어떤 지역 (이하, “영역 R2"라고 칭함)에 올리고뉴클레오티드 프로브 R2’(이하, "올리고뉴클레오티드 R2’'라고 칭함. 말단에 후술하는 앵커 A를 가지고 있을 수 있음.)의 혼성화를 포함한다.
후술하는 바와 같이, 이러한 올리고뉴클레오티드 R2’를 통해 L1 표식 올리고뉴클레오티드 R1'과 결합한 표적 핵산 N은 크로마토그래피에 의해 포착할 수 있다 (예를 들면, 상기 본 발명의 실시양태 1 ~ 23; 도 2의 예 (1) ~ (3); 표 1의 실시양태 (a) ~ (l)).
또한, 본 발명에서는, 상기 올리고뉴클레오티드 R2’(앵커 A를 가지고 있을 수 있음)를 검출 올리고뉴클레오티드(detection oligonucleotide)라고 칭하는 경우가 있다.
상기 올리고뉴클레오티드 R2’가 혼성화 표지 핵산 N 중에서 영역 R2로는 예를 들어, 표적 핵산 N의 5' 말단 또는 3’ 말단의 근연의 영역이 있다. 상기 영역 R2의 길이는 예를 들면, 약 10 ~ 약 300mer 약 10 ~ 약 200mer 약 10 ~ 약 150mer 약 10 ~ 약 100mer 약 10 ~ 약 90mer 약 10 ~ 약 80mer 약 10 ~ 약 70mer 약 10 ~ 약 60mer 약 10 ~ 약 50mer 약 10 ~ 약 40mer 약 10 ~ 약 30mer 약 10 ~ 약 20mer 약 15 ~ 약 300mer 약 15 ~ 약 200mer 약 15 ~ 약 150mer, 약 15 ~ 약 100mer 약 15 ~ 약 90mer 약 15 ~ 약 80mer 약 15 ~ 약 70mer 약 15 ~ 약 60mer 약 15 ~ 약 50mer 약 15 ~ 약 40mer 약 15 ~ 약 30mer 약 15 ~ 약 20mer 약 20 ~ 약 300mer 약 20 ~ 약 200mer 약 20 ~ 약 250mer 약 20 ~ 약 100mer 약 20 ~ 약 90mer 약 20 ~ 약 80mer 약 20 ~ 약 70mer 약 20 ~ 약 60mer 약 20 ~ 약 50mer 약 20 ~ 약 40mer 약 20 ~ 약 30mer 약 25 ~ 약 300mer 약 25 ~ 약 200mer 약 25 ~ 약 150mer 약 25 ~ 약 100mer 약 25 ~ 약 90mer, 약 25 ~ 약 80mer 약 25 ~ 약 70mer 약 25 ~ 약 60mer 약 25 ~ 약 50mer 약 25 ~ 약 40mer 약 25 ~ 약 30mer일 수 있다.
영역 R2에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 프로브 R2’(올리고뉴클레오티드 R2')은 영역 R2의 염기 서열과 상보적인 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드이다. 올리고뉴클레오티드 프로브 R2’의 길이는 영역 R2의 길이에 대응하고, 예를 들면, 약 10 ~ 약 300mer 약 10 ~ 약 200mer 약 10 ~ 약 150mer 약 10 ~ 약 100mer 약 10 ~ 약 90mer 약 10 ~ 약 80mer 약 10 ~ 약 70mer 약 10 ~ 약 60mer 약 10 ~ 약 50mer 약 10 ~ 약 40mer 약 10 ~ 약 30mer 약 10 ~ 약 20mer 약 15 ~ 약 300mer 약 15 ~ 약 200mer 약 15 ~ 약 150mer 약 15 ~ 약 100mer 약 15 ~ 약 90mer 약 15 ~ 약 80mer 약 15 ~ 약 70mer 약 15 ~ 약 60mer 약 15 ~ 약 50mer 약 15 ~ 약 40mer 약 15 ~ 약 30mer 약 15 ~ 약 20mer 약 20 ~ 약 300mer 약 20 ~ 약 200mer 약 20 ~ 약 250mer 약 20 ~ 약 100mer 약 20 ~ 약 90mer 약 20 ~ 약 80mer 약 20 ~ 약 70mer 약 20 ~ 약 60mer 약 20 ~ 약 50mer 약 20 ~ 약 40mer 약 20 ~ 약 30mer 약 25 ~ 약 300mer 약 25 ~ 약 200mer 약 25 ~ 약 150mer 약 25 ~ 약 100mer 약 25 ~ 약 90mer 약 25 ~ 약 80mer 약 25 ~ 약 70mer 약 25 ~ 약 60mer 약 25 ~ 약 50mer 약 25 ~ 약 40mer 약 25 ~ 약 30mer일 수 있다.
또한, 이러한 올리고뉴클레오티드 프로브 R2’(올리고뉴클레오티드 R2')은 영역 R2에 혼성화하는 만큼 선택적으로 영역 R2의 염기 서열에 대해 1 이상의 불일치 또는 팽창을 가지고 있을 수 있다.
본 발명의 표적 핵산의 검출, 정량의 하나의 실시양태 (예를 들어, 상기 예시한 본 발명의 실시양태 12 ~ 19, 23, 48 ~ 52 등으로 대표되지만, 이에 한정되지 않음)에서는 상기 올리고뉴클레오티드 R2’는 예를 들어 그 말단에 임의의 앵커 (이하, “앵커 A”라 칭함)을 가지고 있어도 좋다. 한편, 후술하는 핵산의 크로마토그래피에 사용하는 "전개 요소"의 "감지 구역”에, 상기 앵커 A에 결합할 수 있는 앵커 A는 다른 "수용체 A’”를 고정화하여 둠으로써, 상기 앵커 A와 수용체 A’의 결합을 통해 표적 핵산 N을 포함하는 핵산 하이브리드 (표적 핵산 N에 하나 이상의 마스크 올리고뉴클레오티드, 표식 L1로 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브 R1' 및/또는 상기 앵커 A를 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브 R2’가 혼성화하여 형성된 핵산 하이브리드)가 포착되어 표적 핵산을 검출, 정량할 수 있다.
상기 앵커 A로는 올리고뉴클레오티드, 비오틴, 항체, 단백질 또는 당쇄 등을 들 수 있으며, 상기 수용체 A’로는, 올리고뉴클레오티드, 아비딘, 스트렙타비딘 항체 또는 단백질을 들 수 있다.
바람직한 실시양태의 하나로서, 상기 앵커 A가 비오틴이며, 및 상기 수용체 A’가 아비딘 또는 스트렙타비딘의 조합이다.
또한 시료 중에 여러 가지 표적 핵산 N이 포함된 경우에는 각각의 표적 핵산에 대한 올리고뉴클레오티드 프로브 R2’에 각각 다른 앵커 A를 결합시킴으로써, 이러한 여러 가지 표적 핵산을 크로마토그래피로 동시에 검출, 정량할 수 있다 (예를 들어, 도 4-9, 4-11, 4-12 등).
한편, 본 발명의 표적 핵산의 검출, 정량의 하나의 실시양태 (예를 들어, 상기에 예시한 본 발명의 실시양태 29 ~ 52; 도 2의 예 (4) ~ (7); 표 1의 형태 (m) ~ (v))로 대표되는데, 이에 한정되지 않음)에서는 표적 핵산 N은 표지 물질 (이하, “표식 L2”라고 칭함. 문자 L은 label의 L.)로 표지된다(이하, 경우에 따라 "L2 표지 표적 핵산 N"이라 칭함).
그리고 본 발명에서는, 상기 L2 표지 표적 핵산 N에 후술하는 하나 이상의 마스크 올리고 뉴클레오타이드의 혼성화 및 표적 핵산 N 중 임의의 영역 (상기의 "영역 R2"와 동일)에 올리고뉴클레오티드 프로브 R2’(상기 “올리고뉴클레오티드 R2'”와 동일)의 혼성화 또는 표적 핵산 N 중 어떤 영역 (상기의 "영역 R1”과 동일)에, L1 표지 올리고뉴클레오티드 프로브 R1’ (상기의 “L1 표지 올리고뉴클레오티드 R1’”과 동일)의 혼성화를 통해 L2 표지 표적 핵산 N의 포착을 포함한다.
본 발명의 표적 핵산의 검출, 정량의 하나의 형태 (예를 들어, 상기에 예시한 본 발명의 실시양태 35 ~ 39; 도 2의 예 (4); 표 1의 형태 (m) ~ (p) 등으로 대표되지만, 이에 한정되지 않음.)에서는, 상술한 본 발명의 실시양태 1 ~ 23과 마찬가지로, 표적 핵산 N의 모든 영역 R1에, L1 표지 올리고뉴클레오티드 프로브 R1’(“L1 표지 올리고뉴클레오티드 R1’”)의 혼성화에 의한 표적 핵산 N의 포착 (capture)를 포함한다.
게다가 이러한 예에서, 후술하는 핵산의 크로마토그래피에 사용되는 "전개 요소(development element)"의 "감지 구역(detection zone)”에, 상기 표식 L2에 결합할 수 있는 물질을 고정화하여 둠으로써, 상기 표식 L2와 해당 고정화 된 물질과의 결합을 통해 표적 핵산 N을 포함하는 핵산 하이브리드 (표적 핵산 N에 하나 이상의 마스크 올리고뉴클레오티드 및 표식 L1으로 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브 R1’이 혼성화하여 형성된 핵산 하이브리드)를 포착하여 표적 핵산을 검출, 정량할 수 있다.
여기서 표식 L2로는 예를 들면, 형광 염료 (FITC (fluorescein isothiocyanate), 6-FAM (6-carboxyfluorescein), TET, VIC, HEX, NED, PET, ROX, Cy5, Cy3, Texas Red, JOE, TAMRA 등), 비타민 B 복합체, 디곡시게닌 (DIG), 항체, 효소 (예를 들어, 효소가 퍼옥시다아제, 포도당 산화 효소, 알칼리 포스파타제 또는 β-galactosidase 등) 등을 들 수 있다. 또한 상기 항체는 상기 형광 염료, 비오틴, 디곡시게닌 (DIG) 등으로 표시되어 있을 수 있다.
표적 핵산 N의 이러한 표식 L2 의한 표식은 예를 들어, 표적 핵산이 PCR 등에 의해 증폭된 핵산에 유래하는 경우에는 통상적인 방법에 따라, 상기 PCR 과정에서 표식을 첨부할 수 있다.
여기서 표식 L2에 결합하는 물질로는 예를 들면, 표식 L2에 결합하는 항체 또는 효소로 표지한 항체를 들 수 있고, 또한 표식 L2가 비오틴의 경우에는 상기 물질은 아비딘 또는 스트렙타비딘을 들 수 있다.
또한 상기 효소로서, 알칼리 포스파타제, 퍼옥시다아제, 포도당 산화 효소 또는 β-galactosidase 등을 들 수 있다.
본 발명의 표적 핵산의 검출, 정량의 하나의 형태 (예를 들어, 상기에 예시한 본 발명의 실시양태 46, 47; 도 2의 예 (5), (6); 표 1의 형태 (q) ( r) 등으로 대표되지만, 이에 한정되지 않음.)에서는 후술하는 핵산의 크로마토그래피에 사용하는 "전개 요소"의 "감지 구역"에 표적 핵산 N의 모든 영역 R2로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 R2’를 고정화하여 둠으로써 상기 영역 R2 및 상기 올리고뉴클레오티드 R2'와 혼성화를 통해 표적 핵산 N을 포착하여 라벨 L2를 지표로 표적 핵산을 검출, 정량할 수 있다.
표식 L2를 지표로 한 상기 표적 핵산 N의 검출, 정량은 예를 들어, 표식 L2에, 상기 표식 L2에 결합하는 항체 또는 효소로 표지한 항체의 결합을 통해 실시할 수 있다.
본 발명의 표적 핵산의 검출, 정량의 하나의 형태 (예를 들어, 상기에 예시한 본 발명의 실시양태 48 ~ 51 등으로 대표되지만, 이에 한정되지 않음.)에서는 표적 핵산 N에, 그 말단에 임의의 앵커 (이하, "앵커 A"라 칭함)을 가지고 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 R2’(“올리고뉴클레오티드 R2’”)의 혼성화를 포함한다. 한편, 후술하는 핵산의 크로마토그래피에 사용 "전개 요소"의 "감지 구역” 또는 핵산의 면역 측정법에 사용되는 마이크로 플레이트 등의 고체 지지체에 상기 앵커 A에 결합할 수 있는 앵커 A는 다른 "수용체 A’”를 고정화하여 둠으로써, 상기 앵커 A와 수용체 A’의 결합을 통해, L2 표지 표적 핵산 N을 포함한 핵산 하이브리드 (L2 표지 표적 핵산 N에 하나 이상의 마스크 올리고뉴클레오티드 및 상기 앵커 A를 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브 R2’가 혼성화하여 형성된 핵산 하이브리드)를 포착하여 표적 핵산을 검출, 정량할 수 있다.
상기 앵커 A로는 올리고뉴클레오티드, 비오틴, 디곡시게닌 (DIG) 등의 저분자 화합물, 항체, 단백질 또는 당쇄 등을 들 수 있으며, 상기 수용체 A’로, 올리고뉴클레오티드, 아비딘, 스트렙타비딘, 항체 또는 단백질을 들 수 있다.
바람직한 실시양태의 하나로서, 상기 앵커 A가 비오틴이며, 및 상기 수용체 A’가 아비딘 또는 스트렙타비딘의 조합이다.
본 발명의 표적 핵산의 검출, 정량에서는 어느 측면에서도 표적 핵산 N (또는 L2 표지 표적 핵산 N) 중 영역 R1을 끼고 있는 (영역 R1의 양단에 인접 또는 양쪽의 근연) "영역 M1" 및 "영역 M2"(문자 M은 후술하는 mask oligonucleotide (마스크 올리고뉴클레오티드)의 머리 글자 M) 및 표적 핵산 N 중 영역 R2를 끼고 있는 (영역 R2의 양쪽에 인접한 또는 양쪽의 근연) "영역 M3” 및 “영역 M4"의 적어도 하나의 영역에 마스크 올리고뉴클레오티드 M1’, 마스크 올리고뉴클레오티드 M2', 마스크 올리고뉴클레오티드 M3’ 및 마스크 올리고뉴클레오티드 M4’의 적어도 하나의 혼성화를 포함한다.
즉, 표적 핵산 N에 마스크 올리고 뉴클레오타이드의 혼성화는 다음의 형태를 포함한다.
·영역 M1 만에서의 마스크 올리고뉴클레오티드 M1’을 혼성화시키는 형태.
·영역 M2 만에서의 마스크 올리고뉴클레오티드 M2’를 혼성화시키는 형태.
·영역 M3 만에서의 마스크 올리고뉴클레오티드 M3’를 혼성화시키는 형태.
·영역 M4 만에서의 마스크 올리고뉴클레오티드 M4’를 혼성화시키는 형태.
·영역 M1 및 영역 M2 모두에 마스크 올리고뉴클레오티드 M1’ 및 마스크 올리고뉴클레오티드 M2'를 각각 혼성화시키는 형태.
·영역 M3 및 영역 M4 모두에 마스크 올리고뉴클레오티드 M3’ 및 마스크 올리고뉴클레오티드 M4'를 각각 혼성화시키는 형태.
·영역 M1 및 영역 M3 모두에 마스크 올리고뉴클레오티드 M1’ 및 마스크 올리고뉴클레오티드 M3'를 각각 혼성화시키는 형태.
·영역 M1 및 영역 M4 모두에 마스크 올리고뉴클레오티드 M1’ 및 마스크 올리고뉴클레오티드 M4'를 각각 혼성화시키는 형태.
·영역 M2 및 영역 M3 모두에 마스크 올리고뉴클레오티드 M2’ 및 마스크 올리고뉴클레오티드 M3'를 각각 혼성화시키는 형태.
·영역 M2 및 영역 M4 모두에 마스크 올리고뉴클레오티드 M2’ 및 마스크 올리고뉴클레오티드 M4'를 각각 혼성화시키는 형태.
·영역 M1, 영역 M2 및 영역 M3에 마스크 올리고뉴클레오티드 M1’, 마스크 올리고뉴클레오티드 M2' 및 마스크 올리고뉴클레오티드 M3’를 각각 혼성화시키는 형태.
·영역 M1, 영역 M2 및 영역 M4에 마스크 올리고뉴클레오티드 M1’, 마스크 올리고뉴클레오티드 M2' 및 마스크 올리고뉴클레오티드 M4’를 각각 혼성화시키는 형태.
·영역 M1, 영역 M3 및 영역 M4에 마스크 올리고뉴클레오티드 M1’, 마스크 올리고뉴클레오티드 M3' 및 마스크 올리고뉴클레오티드 M4’를 각각 혼성화시키는 형태.
·영역 M2, 영역 M3 및 영역 M4에 마스크 올리고뉴클레오티드 M2’, 마스크 올리고뉴클레오티드 M3' 및 마스크 올리고뉴클레오티드 M4’를 각각 혼성화시키는 형태.
·영역 M1, 영역 M2, 영역 M3 및 영역 M4에 마스크 올리고뉴클레오티드 M1’, 마스크 올리고뉴클레오티드 M2', 마스크 올리고뉴클레오티드 M3’ 및 마스크 올리고뉴클레오티드 M4'를 각각 혼성화시키는 형태.
또한, 본 발명에서는 필요에 따라 또한 표적 핵산 N 중 영역 M1, 영역 M2, 영역 M3 및 영역 M4 이외의 다른 하나 이상의 영역 (영역 M5, M6, M7, M8, 등) 각각의 영역에 혼성화할 수 있는 상기 영역에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 마스크 올리고뉴클레오티드를 혼성화시키는 형태가 포함된다.
본 발명에서는 영역 M1 및 영역 M2 모두에 마스크 올리고뉴클레오티드 M1’ 및 마스크 올리고뉴클레오티드 M2'를 각각 혼성화하는 형태 또는 영역 M3 및 영역 M4 모두에 마스크 올리고뉴클레오티드 M3’ 및 마스크 올리고뉴클레오티드 M4’를 각각 혼성화하는 형태가 바람직하다.
여기에서 표적 핵산 N 중 영역 R1을 끼고 있는 (영역 R1의 양단에 인접 또는 양쪽의 근연) "영역 M1" 및 "영역 M2"는 예를 들어, 표적 핵산 N의 5’ 말단에서 3' 말단 방향으로 각 영역이 영역 M1- 영역 R1- 영역 M2 (또는 영역 M2- 영역 R1- 영역 M1)의 순서로 존재하는 것을 의미한다.
또한 아울러 영역 M1과 영역 R1이 그 사이에 하나의 염기 차이 없이 인접해 있는지, 또는 영역 M1과 영역 R1이 1～30mer, 1～29mer, 1～28mer, 1～27mer, 1～26mer, 1～25mer, 1～24mer, 1～23mer, 1～22mer, 1～21mer, 1～20mer, 1～19mer, 1～18mer, 1～17mer, 1～16mer, 1～15mer, 1～14mer, 1～13mer, 1～12mer, 1～11mer, 1～10mer, 1～9mer, 1～8mer, 1～7mer, 1～6mer, 1～5mer, 1～4mer, 1～3mer, 2mer 또는 1mer 떨어져 존재하는 것을 의미한다.
영역 M1과 영역 R1이 그 사이에 하나의 염기 차이 없이 인접하거나 1 ~ 20mer까지 떨어져 존재하는 형태가 바람직하다.
바람직하게는, 영역 M1과 영역 R1이 그 사이에 하나의 염기 차이 없이 인접하거나 1 ~ 15mer까지 떨어져 존재한다.
보다 바람직하게는, 영역 M1과 영역 R1이 그 사이에 하나의 염기 차이 없이 인접하거나 1 ~ 10mer까지 떨어져 존재한다.
더욱 바람직하게는, 영역 M1과 영역 R1이 그 사이에 하나의 염기 차이 없이 인접하거나 1 ~ 5mer까지 떨어져 존재한다.
영역 M2와 영역 R1, 영역 M3와 영역 R2 및 영역 R4와 영역 R2와의 위치 관계도 위의 영역 M1과 영역 R1과의 위치 관계와 동일하다.
상기 한 바와 같이, 본 발명의 마스크 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 N 또는 L2 표지 표적 핵산 N 중 영역 M1, 영역 M2, 영역 M3 및 영역 M4 (필요에 따라, 새로운 영역 M5, M6, M7, M8, 등)의 각각의 핵산 서열과 상보적인 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드다.
마스크 올리고뉴클레오티드의 길이는 영역 M1, 영역 M2, 영역 M3 및 영역 M4의 각각의 길이에 대응하고, 각각 예를 들어, 약 5～약 300mer, 약 5～약 200mer, 약 5～약 150mer, 약 5～약 100mer, 약 5～약 90mer, 약 5～약 80mer, 약 5～약 70mer, 약 5～약 60mer, 약 5～약 50mer, 약 5～약 40mer, 약 5～약 30mer, 약 5～약 20mer, 약 10～약 300mer, 약 10～약 200mer, 약 10～약 150mer, 약 10～약 100mer, 약 10～약 90mer, 약 10～약 80mer, 약 10～약 70mer, 약 10～약 60mer, 약 10～약 50mer, 약 10～약 40mer, 약 10～약 30mer, 약 10～약 20mer, 약 15～약 300mer, 약 15～약 200mer, 약 15～약 150mer, 약 15～약 100mer, 약 15～약 90mer, 약 15～약 80mer, 약 15～약 70mer, 약 15～약 60mer, 약 15～약 50mer, 약 15～약 40mer, 약 15～약 30mer, 약 15～약 20mer, 약 20～약 300mer, 약 20～약 200mer, 약 20～약 250mer, 약 20～약 100mer, 약 20～약 90mer, 약 20～약 80mer, 약 20～약 70mer, 약 20～약 60mer, 약 20～약 50mer, 약 20～약 40mer, 약 20～약 30mer, 약 25～약 300mer, 약 25～약 200mer, 약 25～약 150mer, 약 25～약 100mer, 약 25～약 90mer, 약 25～약 80mer, 약 25～약 70mer, 약 25～약 60mer, 약 25～약 50mer, 약 25～약 40mer, 약 25～약 30mer일 수 있다.
또한 각 마스크 올리고뉴클레오티드(M1’, M2', M3’, M4')는 각 영역 (M1, M2, M3, M4)에 혼성화하는 한 필요에 의해 각 영역 (M1, M2, M3, M4)의 염기 서열에 대해 1 이상의 불일치 또는 팽창을 가지고 있을 수 있다.
본 발명의 핵산의 검출, 정량은 시료 중에 2 이상의 표적 핵산 (예를 들어, 다른 종류의 세균에서 유래하는 여러 표적 핵산, 특정 박테리아의 여러 변종에 유래하는 여러 표적 핵산, 특정 유전자의 여러 변이형에서 유래하는 여러 표적 핵산, 멀티 플렉스 PCR에 의해 증폭된 복수의 PCR 산물에서 유래하는 여러 표적 핵산 등)가 포함된 경우에도 적용할 수 있다. 즉, 본 발명을 이용하면 한 번의 분석으로 이러한 여러 표적 핵산을 동시에 검출, 정량할 수 있다.
본 발명은 시료 중에 포함되거나 포함되는 것으로 예측되는 1 표적 핵산을 검출, 정량 또는 2 개 이상의 서로 다른 표적 핵산을 동시에 검출 및 정량은, 상기 하나의 표적 핵산 또는 상기 2 이상의 각기 다른 표적 핵산에 대해 상기 하나 이상의 마스크 올리고뉴클레오티드 (M1’, M2', M3’, M4'), 올리고뉴클레오티드 프로브 R1’(올리고뉴클레오티드 R1') 및 필요에 따라, 올리고뉴클레오티드 프로브 R2’(올리고뉴클레오티드 R2')를 설계, 제조하여, 이러한 각종의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 후술하는 예를 들어, 측면 흐름형((lateral flow) 혹은 흐름형(flow through)의 핵산 크로마토그래피(nucleic acid chromatography) 또는 혼성화-ELISA(hybridization-ELISA)을 적용하여 실시할 수 있다.
즉, 예를 들어, 검출, 정량할 표적 핵산이 3 종류 (표적 핵산 N1, N2 및 N3)의 경우에는 표적 핵산 N1의 검출을 위해 필요한 상기 표적 핵산 N1에 혼성화할 수 있는 1 하나 이상의 마스크 올리고뉴클레오티드 (M1’, M2,'M3’, M4'), 올리고뉴클레오티드 프로브 R1’(올리고뉴클레오티드 R1') 및 필요에 따라, 올리고뉴클레오티드 프로브 R2’(올리고뉴클레오티드 R2')를 설계 조제한다. 또한 표적 핵산 N2의 검출을 위해 필요한 상기 표적 핵산 N2에 혼성화할 수 있는 하나 이상의 마스크 올리고뉴클레오티드 (M1’, M2', M3’, M4'), 올리고뉴클레오티드 프로브 R1’(올리 뉴클레오티드 R1’) 및 필요에 따라, 올리고뉴클레오티드 프로브 R2'(올리고뉴클레오티드 R2’)를 설계, 제조한다. 또한 표적 핵산 N3의 검출을 위해 필요한 상기 표적 핵산 N3에 혼성화할 수 있는 하나 이상의 마스크 올리고뉴클레오티드 (M1’, M2', M3’, M4'), 올리고뉴클레오티드 프로브 R1’(올리고뉴클레오티드 R1’) 및 필요에 따라, 올리고뉴클레오티드 프로브 R2'(올리고뉴클레오티드 R2’)를 설계, 제조한다.
본 발명의 핵산 검출, 정량, 예를 들어 면역 크로마토그래피(immunochromatography)의 원리를 응용한 핵산 크로마토그래피 (lateral flow 또는 flow through) 또는 면역 측정법을 이용한 혼성화 -ELISA을 사용할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
핵산 크로마토그래피에 의한 실시양태로서, 예를 들어 도 2 (실시양태 (1) ~ (7)), 도 4-1 ~ 도 4-7, 도 4-9 ~ 도 4-12에 모식적으로 표시하는 장치 및 원리를 이용한 실시양태를 예시적으로 보여줄 수 있지만, 이러한 예에 한정되지 않는다.
또한 이러한 본 발명의 핵산 크로마토그래피는 후술하는 본 발명의 장치 “적용 영역(application zone)”, “봉입 영역(enclosing zone)"및 "감지 영역(detection zone)"의 각각 상술한 표적 핵산 (표식 L2로 분류되어 있을 수 있음), 올리고뉴클레오티드 R1’(표식 L1으로 표시되어 있을 수 있음), 올리고뉴클레오티드 R2'(앵커 A를 가지고 있을 수 있음), 각 마스크 올리고뉴클레오티드, 수용체 A’ 및/또는 표식 L2 에 결합하는 물질을 상기 표 1에 예시적으로 나타낸 것과 같은 조합에 적용, 봉입 및 고정화하는 실시양태를 예시적으로 보여줄 수 있지만, 이러한 예에 한정되지 않는 것은 아니다.
또한 이러한 본 발명의 핵산 크로마토그래피는 선택적으로 하나 이상의 "감지 구역”만을 갖춘 “전개 요소"(후술)의 일부를 용적을 가지는 고체 지지체 (예를 들어, 튜브, 유리병, 접시, 비커 등) 중의 표적 핵산과 상술한 각종 올리고뉴클레오티드를 포함하는 액체 시료에 적용하는 (접촉시키는) 형태 또는 상기 고체 지지체의 일부에 상기 액체 시료를 적용하는 형태에 따라 실시할 수 있다.
혼성화-ELISA 의한 실시양태로서, 예를 들어 도 2 (실시양태 (5), (6)), 도 4-8에 모식적으로 나타나는 형태를 예시적으로 보여줄 수 있지만, 이러한 예에 한정되는 것은 아니다.
이하에 이러한 방법을 개략적으로 설명하지만, 이하에 개략적 설명 사항 각각에 대해서도, 본 발명에 포함되는 다양한 실시양태를 실시의 필요에 따라 원하는 수정, 변경, 추가 등을 할 수 있는 것은 물론이다.
또한, 다음에 예시적으로 나타내는 각 측면을 포함, 본원 발명에서는 상기 표적 핵산 (표식 L2로 분류되어 있을 수 있음), 올리고뉴클레오티드 R1’(표식 L1으로 표시되어 있을 수 있음), 올리고뉴클레오티드 R2’(앵커 A를 가지고 있을 수 있음), 각 마스크 올리고뉴클레오티드, 및 각종 핵산 하이브리드 사이의 상호 혼성화, 앵커 A와 수용체 A', 및 표식 L2 및 표식 L2에 결합하는 물질 사이의 결합은, 분석의 시작부터 종료까지의 전 과정을 통해 생기는 것들을 모두 포함하고 특정 위치 부위 또는 시점에서만 발생하는 혼성화 또는 결합만을 의미하는 것은 아니다.
또한, 본원 발명에서는 상기 표적 핵산 (표식 L2로 분류되어 있을 수 있음), 올리고뉴클레오티드 R1’(표식 L1으로 표시되어 있을 수 있음), 올리고뉴클레오티드 R2'(앵커 A를 가지고 있을 수 있음), 각 마스크 올리고뉴클레오티드, 및 각종 핵산 하이브리드 사이의 상호 혼성화는 특정 하나의 혼성화와, 그것과 다른 하나 또는 둘 이상의 혼성화의 각각이 경시적으로 서서히 완성된 형태, 별도로 일어나는 형태, 및 동시에 일어나는 형태 등 임의의 형태가 포함된다.
1. 측방 유동형 핵산 크로마토그래피(Lateral-flow nucleic acid chromatography)
예를 들어, 도 4-1 ~ 도 4-7, 도 4-9 ~ 도 4-12에 모식적 나타낸 실시양태를 예시적으로 설명할 수 있지만, 이러한 실시양태에서 사용되는 기본 원리의 평이한 이해의 목적만으로 같은 원리를 설명하면 대체로 다음과 같다.
그러나 다음에 개략적으로 설명하는 이 원리에 대한 설명을 포함하여 본원 발명은 표적 핵산 (표식 L2로 분류되어 있을 수 있음), 올리고뉴클레오티드 R1’(표식 L1으로 표시되어 있을 수 있음), 올리고뉴클레오티드 R2’(앵커 A를 가지고 있을 수 있음), 각 마스크 올리고뉴클레오티드, 및 각 핵산 하이브리드 사이의 상호 혼성화, 및 앵커 A와 수용체 A'사이의 결합 및 표식 L2 및 표식 L2 결합 물질과의 결합은 분석의 시작부터 종료까지의 전 과정 생기는 것들을 모두 포함하고, 특정 위치 부위 또는 시점에서만 발생하는 혼성화 또는 결합만을 의미하는 것은 아니다.
또한, 본원 발명은 표적 핵산 (표식 L2로 분류되어 있을 수 있음), 올리고뉴클레오티드 R1’(표식 L1으로 표시되어 있을 수 있음), 올리고뉴클레오티드 R2'(앵커 A를 가지고 있을 수 있음), 각 마스크 올리고뉴클레오티드, 및 각 핵산 하이브리드 사이의 상호 혼성화는 특정 하나의 혼성화와 그것과 다른 하나 또는 둘 이상의 혼성화의 각각 경시적으로 서서히 완성된 실시양태, 별도로 일어나는 형태, 및 동시에 일어나는 형태 등 임의의 형태가 포함된다. 앵커 A와 수용체 A’ 사이의 결합에 대해서도 마찬가지이다.
도 4-1 및 도 4-2에 모식적으로 나타나는 원리 및 장치 (또는 키트)를 사용하는 측방 유동형 핵산 크로마토그래피에서는, 모세관 현상과 확산에 의해 전개 요소를 이동하여 감지 영역에 도달한 핵산 하이브리드 (표적 핵산 N, 하나 이상의 마스크 올리고뉴클레오티드 및 표식 L1으로 표지된 올리고뉴클레오티드 R1’이 혼성화하여 생성되는 핵산 하이브리드)를 감지 영역에 고정화한 올리고뉴클레오티드 R2'에 의해 포착하여, 표식 L1을 지표로 검출하여 액체 시료 중에 포함되는 표적 핵산 N의 존재 및 양을 측정할 수 있다.
도 4-3 및 도 4-4에 모식적으로 나타나는 원리 및 장치 (또는 키트)를 사용하는 측방 유동형 핵산 크로마토그래피에서는, 모세관 현상과 확산에 의해 전개 요소를 이동하여 감지 영역에 도달한 핵산 하이브리드 (표적 핵산 N, 하나 이상의 마스크 올리고뉴클레오티드 표식 L1로 표지된 올리고뉴클레오티드 R1’ 및 말단에 앵커 A를 갖는 올리고뉴클레오티드 R2'가 혼성화하여 생성되는 핵산 하이브리드)를 감지 구역에 고정된 앵커 A에 결합하는 수용체 A’에 의해 포착하여, 표식 L1을 지표로 검출하여 액체 시료 중에 포함되는 표적 핵산 N의 존재 및 양을 측정할 수 있다.
도 4-5 및 도 4-6에 모식적으로 나타나는 원리 및 장치 (또는 키트)를 사용하는 측방 유동형 핵산 크로마토그래피에서는, 모세관 현상과 확산에 의해 전개 요소를 이동하여 감지 영역에 도달한 핵산 하이브리드 (표식 L2로 표지된 표적 핵산 N, 하나 이상의 마스크 올리고뉴클레오티드 및 표식 L1으로 표지된 올리고뉴클레오티드 R1’이 혼성화하여 생성되는 핵산 하이브리드)를 감지 영역에 고정화한 표식 L2에 결합하는 물질에 의해 포착하여, 표식 L1을 지표로 검출하여 액체 시료 중에 포함되는 표적 핵산 N의 존재 및 양을 측정할 수 있다.
도 4-7에 모식적으로 나타나는 원리 및 장치 (또는 키트)를 사용하는 측방 유동형 핵산 크로마토그래피에서는, 모세관 현상과 확산에 의해 전개 요소를 이동하여 감지 영역에 도달한 핵산 하이브리드 (표식 L2로 표지된 표적 핵산 N, 하나 이상의 마스크 올리고뉴클레오티드 및 말단에 앵커 A를 갖는 올리고뉴클레오티드 R2’가 혼성화하여 생성되는 핵산 하이브리드)를 감지 영역에 고정된 앵커 A에 결합하는 수용체 A’에 의해 포착하고 표식 L2를 지표로 검출하여 액체 시료 중에 포함되는 표적 핵산 N의 존재 및 양을 측정할 수 있다.
도 4-9에 모식적으로 나타나는 원리 및 장치 (또는 키트)를 사용한 측방 유동형 핵산 크로마토그래피는, 여러 표적 핵산 N (예를 들어, 표적 핵산 N1, N2)를 동시에 검출 및 정량 형태의 예시이며, 이 예에서는 모세관 현상과 확산에 의해 전개 요소를 이동하여 감지 영역에 도달한 핵산 하이브리드 1 (표적 핵산 N1, 표적 핵산 N1 용으로 제조된 하나 이상의 마스크 올리고뉴클레오티드, 표적 핵산 N1 용으로 제조된 라벨 L1로 표지된 올리고뉴클레오티드 R1’ 및 표적 핵산 N1 용으로 제조된 말단에 앵커 A1을 갖는 올리고뉴클레오티드 R2'가 혼성화하여 생성되는 핵산 하이브리드 1) 및 핵산 하이브리드 2 (표적 핵산 N2, 표적 핵산 N2 용으로 제조된 하나 이상의 마스크 올리고뉴클레오티드, 표적 핵산 N2 용으로 제조된 표식 L1로 표지된 올리고뉴클레오티드 R1’ 및 표적 핵산 N2 용에 제조된 말단에 앵커 A2를 갖는 올리고뉴클레오티드 R2’가 혼성화하여 생성되는 핵산 하이브리드 2)를 감지 영역에 각각 고정된 앵커 A1에 결합하는 수용체 A1' 및 앵커 A2에 결합하는 수용체 A2'에 의해 각각 포착하고, 표식 L1을 지표로 검출하여 액체 시료 중에 포함되는 표적 핵산 N1과 N2의 존재와 양을 동시에 측정할 수 있다.
도 4-10에 모식적으로 나타나는 원리 및 장치 (또는 키트)를 사용하는 측방 유동형 핵산 크로마토그래피는, 여러 표적 핵산 N (예를 들어, 표적 핵산 N1, N2)를 동시에 검출 및 정량 형태의 예시이며, 이 예에서는 모세관 현상과 확산에 의해 전개 요소를 이동하여 감지 영역에 도달한 핵산 하이브리드 1 (표식 L2a (예를 들면, FITC)로 표지된 표적 핵산 N1, 표적 핵산 N1 용으로 제조된 하나 이상의 마스크 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산 N1 용으로 제조된 라벨 L1로 표지된 올리고뉴클레오티드 R1’이 혼성화하여 생성되는 핵산 하이브리드 1) 및 핵산 하이브리드 2 (표식 L2b (예를 들어, Texas Red)로 표지된 표적 핵산 N2, 표적 핵산 N2 용으로 제조된 하나 이상의 마스크 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산 N2 용으로 제조된 표식 L1로 표지된 올리고뉴클레오티드 R1’이 혼성화하여 생성되는 핵산 하이브리드 2)를 감지 영역에 각각 고정된 표식 L2a에 결합하는 물질 1 (예를 들어, 항 FITC 항체) 및 표식 L2b에 결합하는 물질 2 (예를 들어, 항 Texas Red 항체)에 의해 각각 포착하고, 표식 L1을 지표로 검출하여 액체 시료 중에 포함되는 표적 핵산 N1과 N2의 존재와 양을 동시에 측정할 수 있다.
도 4-11에 모식적으로 나타나는 원리 및 장치 (또는 키트)를 사용하는 측방 유동형 핵산 크로마토그래피는 여러 표적 핵산 N (예를 들어, 표적 핵산 N1, N2)를 동시에 검출 및 정량하는 형태의 예시이며, 이 실시양태에서는 모세관 현상과 확산에 의해 전개 요소를 이동하여 감지 영역에 도달한 핵산 하이브리드 1 (표식 L2로 표지된 표적 핵산, N1 표적 핵산 N1 용으로 제조된 하나 이상의 마스크 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산 N1 용으로 제조된 말단에 앵커 A1을 갖는 올리고뉴클레오티드 R2’가 혼성화하여 생성되는 핵산 하이브리드 1) 및 핵산 하이브리드 2 (표식 L2로 표지된 표적 핵산 N2, 표적 핵산 N2 용으로 제조된 하나 이상의 마스크 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산 N2 용으로 제조된 말단에 앵커 A2를 갖는 올리고뉴클레오티드 R2’가 혼성화하여 생성되는 핵산 하이브리드 2)를 감지 영역에 고정된 앵커 A1에 결합하는 수용체 A1'및 앵커 A2에 각각 결합하는 수용체 A2'에 의해 각각 포착하고 표식 L2를 지표로 검출하여 액체 시료 중에 포함되는 표적 핵산 N1 및 N2의 존재와 양을 동시에 측정할 수 있다.
도 4-12에 모식적으로 나타나는 원리 및 장치 (또는 키트)를 사용하는 측방 유동형 핵산 크로마토그래피는, 여러 표적 핵산 N (예를 들어, 표적 핵산 N1, N2)를 동시에 검출 및 정량하는 형태의 예시이며, 이 실시양태에서는 모세관 현상과 확산에 의해 전개 요소를 이동하여 감지 영역에 도달한 핵산 하이브리드 1 (표식 L2a (예를 들면, FITC)로 표지된 표적 핵산 N1, 표적 핵산 N1 용으로 제조된 하나 이상의 마스크 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산 N1 용으로 제조된 말단에 앵커 A를 갖는 올리고뉴클레오티드 R2’가 혼성화하여 생성되는 핵산 하이브리드 1) 및 핵산 하이브리드 2 (표식 L2b ( 예를 들어, Texas Red)로 표지한 표적 핵산 N2, 표적 핵산 N2 용으로 제조된 하나 이상의 마스크 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산 N2 용으로 제조된 말단에 앵커 A를 갖는 올리고뉴클레오티드 R2’가 혼성화 하여 생성되는 핵산 하이브리드 2)를 감지 영역에 각각 고정된 앵커 A에 결합하는 수용체 A’에 의해 각각 포착하여 서로 다른 표식 L2a 및 표식 L2b를 지표로 검출하여 액체 시료 중 포함하는 표적 핵산 N1과 N2의 존재와 양을 동시에 측정할 수 있다.
본 발명에서 "전개 요소(development element)"라 함은 바람직한 실시양태에서, 시트상(sheet) 또는 스트립상(strip)의 지지체(멤브레인)이며, 모세관 현상에 의해 각종 핵산 (예를 들어, 표적 핵산 (표지되어 있을 수 있음), 올리고뉴클레오티드 R1’(표지되어 있을 수 있음), 올리고뉴클레오티드 R1', 올리고뉴클레오티드 R2’(앵커 A를 가지고 있을 수 있음), 각 마스크 올리고뉴클레오티드, 및 이들 중 하나 이상이 상호 혼성화를 통해 형성되는 각종 핵산 하이브리드)를 포함하는 액체 시료가 크로마토그래피로 전개하는 기능이 있다.
전개 요소로는 예를 들면, 다공성 불용성 지지체 (멤브레인)을 사용할 수 있으며, 예를 들면, 플라스틱 다공성 지지체 (멤브레인), 셀룰로오스 계 다공성 지지체 (멤브레인), 무기계 다공성 지지체 (멤브레인)를 들 수 있다. 보다 구체적으로는 다공성 셀룰로오스(porous cellulose), 니트로 셀룰로오스(nitrocellulose), 셀룰로오스 아세테이트(cellulose acetate), 나일론(nylon), 실리카(silica), 유리 섬유(glass fiber) 또는 이들의 유도체 등의 준비가 되어있는 지지체 (멤브레인)을들 수 있다. 또한, 본 발명 놓고 배포 요소가 위와 같은 기능을 갖는 한, 시판되는 중의 다공질 불용성 지지체 (멤브레인)을도 전개 요소로 사용될 수 있다.
본 발명에서 "적용 영역(application zone)"은, 전개 요소에 접해 배치되는 상기 전개 요소와 동일 또는 다른 재질로 이루어진 시트상 또는 스트립상의 지지체이다. 재질로는 상기 전개 요소와 같은 것을 들 수 있지만, 목적에 따라 전개 요소와는 다른 재질을 선택할 수 있다.
이 적용 영역은 그 기능면에서 샘플 패드라고 칭할 수 있고, 예를 들어 다음과 같은 기능을 갖추는 것이 있지만 이에 한정되지 않는다.
(i) 액체 시료를 받는다.
(ii) 액체 시료를 지지체 중에 균일하게 분배한다.
(iii) 필요에 따라 액체 시료의 조성을 바꾸기 위한 시약을 포함할 수 있다.
(iv) 필터 역할을 하기도 한다.
(v) 임의의 올리고뉴클레오티드 등의 물질을 봉입할 수 있다.
본 발명에서 "봉입 영역(enclosing zone)”은 적용 영역과 인접한 전개 요소에 배치되는 상기 전개 요소와 동일 또는 다른 재질로 이루어진 시트 상 또는 스트립상의 지지체이다. 재질로는 상기 전개 요소와 같은 것을 들 수 있지만, 목적에 따라 전개 요소와는 다른 재질을 선택할 수 있다.
이 봉입 영역은 그 기능면에서 컨쥬게이트 패드(conjugate pad)라고 칭할 수 있으며 예를 들어, 다음과 같은 기능을 갖추는 것이지만 이에 한정되지 않는다.
(i) 임의의 올리고뉴클레오티드 등의 물질을 봉입할 수 있다. 분석이 되지 않을 때, 상기 봉입된 올리고뉴클레오티드 등은 일반적으로 건조하여 존재한다.
(ii) 상기 각종의 올리고뉴클레오티드를 빠르고 균일하게 정량적으로 방출한다.
(iii) 전개 요소에 상기 각종의 올리고뉴클레오티드를 균일하게 이동시킨다.
본 발명에서 "감지 구역(detection zone)"에는, 전개 요소 중을 모세관 현상에 의해 이동해온 각종 핵산을 포함하는 시료에 포함된 핵산 하이브리드 (상기 표적 핵산 N으로 다른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드가 혼성화하여 형성된 핵산 하이브리드)를 포착하고, 감지하기 위한 물질 (예를 들어, 상기 올리고뉴클레오티드 R2’, 앵커 A에 결합하는 수용체 A' 또는 표식 L2에 결합하는 물질)을 고정화할 수 있다.
본 발명은 감지 구역의 올리고뉴클레오티드 프로브 R2’(올리고뉴클레오티드 R2')의 고정화는, 상기 올리고뉴클레오티드 R2’에 도입할 수 있는 아미노기 (아미노 링커 (예, 급 아미노기가 결합된 직쇄 탄소 사슬)), 카르복실기, 티올기, 수산기 등을 통해 감지 영역에 고정화될 수 있다.
예를 들어, 상기 올리고뉴클레오티드 R2’가 갖는 아미노 링커 단백질 (예를 들어, 혈청 알부민, 면역 글로불린 등)을 통해 고상에 고정됨으로써, 상기 올리고뉴클레오티드 R2'가 고상에 고정화된다.
본 발명은 상기 감지 영역은 올리고뉴클레오티드 프로브 R2’(올리고뉴클레오티드 R2')가 갖는 앵커 A에 결합할 수 있는, 수용체 A’를 고정화할 수 있다.
상기 앵커 A로는 올리고뉴클레오티드, 비오틴, 디곡시게닌 (DIG) 등의 저분자 화합물, 항체, 단백질 (예를 들어 렉틴) 또는 당쇄 등을 들 수 있으며, 상기 수용체 A’로, 올리고뉴클레오티드, 아비딘, 스트렙타비딘, 항체 또는 단백질 (예를 들어 렉틴)을 들 수 있다. 상기 수용체 A’가 올리고뉴클레오티드인 경우에는 상기와 같이 아미노기 (아미노 링커 (예, 급 아미노기가 결합된 직쇄 탄소 사슬)), 카르복실기, 티올기, 수산기 등을 통해 감지 영역에 고정화될 수 있다.
예를 들어, 상기 앵커 A가 비오틴인 경우에는 감지 구역에는 아비딘 또는 스트렙타비딘이 수용체 A’로 고정화될 수 있다.
또한 상기와 같이, 시료 중에 포함되는 여러 가지 표적 핵산 N을 인식하기 위해 각각의 표적 핵산에 대한 올리고뉴클레오티드 프로브 R2’에 각각 다른 앵커 A를 결합시키는 경우에는 각각의 표적 핵산 N을 개별적으로 검출하기 위한 개별 감지 구역에 각각의 앵커 A에 특이적으로 결합하는 별개의 물질 (항원, 항체 등)가 수용체 A’로 고정화될 수 있다.
본 발명은 상기 감지 영역은 표적 핵산 N이 갖는 표적 L2 (예를 들어, 형광 색소, 비오틴)에 결합하는 물질 (예를 들어, 항체, 스트렙타비딘)을 고정화할 수 있다.
예를 들어, 표적 L2가 형광 색소인 경우에는 감지 영역은 형광 색소에 특이적으로 결합하는 항체가 고정화되어 있다. 또한 표적 L2가 비오틴인 경우에는 감지 구역에는 아비딘 또는 스트렙타비딘이 고정화될 수 있다.
이 감지 구역에서 시료 중에 포함되는 목적으로 하는 표식 표적 핵산 N을 표식 L1, 표식 L2를 지표로 감지하기 때문에 테스트 라인(test line)이라고 칭할 수 있다.
본 발명은 상술한 표식 L1이 예를 들어, 금 콜로이드 입자 등의 금속 콜로이드 입자와 라텍스 입자 등인 경우, 감지 구역에 고정된 물질 (상기 올리고뉴클레오티드 R2’, 앵커 A에 결합하는 수용체 A’ 또는 표식 L2에 결합하는 물질)에 의해 표적 핵산 N을 포함하는 핵산 하이브리드 (상기 표적 핵산 N으로 다른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드가 혼성화하여 형성된 핵산 하이브리드)가 포착됨에 따라 감지 영역에 상기 입자가 갖는 적색과 청색 등이 선(라인)이 나타난다. 이 착색 라인의 착색의 정도를 지표로 표적 핵산 N의 유무, 양을 측정할 수 있다.
또한 상술한 표식 L2가 예를 들어, 상술한 다양한 형광 염료 (FITC, Texas Red, 등) 인 경우에는, 상기 표식 L2에 감지 가능하도록 처리된 상기 형광 색소에 특이적으로 결합하는 항체를 결합시킴으로써 표적 핵산 N의 유무, 양을 측정할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명에서는 상기의 측방 유동형 핵산 크로마토그래피를 이용하여 시료 중에 포함되거나 포함된 것으로 예상되는 2 개 이상의 서로 다른 표적 핵산을 동시에 검출, 정량할 있다(예를 들어, 도 4-9 ~ 도 4-12 실시양태 등). 예를 들어, 이하에 요약된 대로 실시할 수 있다.
·해당하는 2 이상의 각기 다른 표적 핵산 N (즉, 표적 핵산 N1, 표적 핵산 N2, 표적 핵산 N3, 표적 핵산 N4, ... , 표적 핵산 NX (X는 임의의 수))마다 각각의 표적 핵산 NX에 혼성화할 수 있는 표식 L1로 표지한 올리고뉴클레오티드 프로브 R1’(올리고뉴클레오티드 R1'), 즉 표적 핵산 N1에 혼성화할 수 있는 L1 표지 올리고뉴클레오티드 R1’, 표적 핵산 N2에 혼성화 할 수 있는 L1 표지 올리고뉴클레오티드 R1’, 표적 핵산 N3에 혼성화할 수 있는 L1 표지 올리고뉴클레오티드 R1', 표적 핵산 N4에 혼성화할 수 있는 L1 표지 올리고뉴클레오티드 R1’, ..., 표적 핵산 NX에 혼성화할 수 있는 L1 표지 올리고뉴클레오티드 R1’을 설계, 제조한다. 여기서 상기 각 표적 핵산은 선택적으로 동일하거나 서로 다른 표식 L2로 분류되어 있을 수 있다. 또한 표식 L1은 선택적으로 표적 핵산 N마다 다른 표지 물질도 사용할 수 있다.
·해당하는 2 이상의 각기 다른 표적 핵산 N (즉, 표적 핵산 N1, 표적 핵산 N2, 표적 핵산 N3, 표적 핵산 N4, ..., 표적 핵산 NX (X는 임의의 수))마다 각각의 표적 핵산 N에 혼성화할 수 있는 검출용의 올리고뉴클레오티드 프로브 R2 (올리고뉴클레오티드 R2’), 즉 표적 핵산 N1에 혼성화할 수 있는 표지 올리고뉴클레오티드 R2', 표적 핵산 N2에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 R2’, 표적 핵산 N3에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 R2’, 표적 핵산 N4에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 R2'-4, ..., 표적 핵산 NX에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 R2'를 설계, 제조 한다. 여기서 상기 각 표적 핵산은 선택적으로 동일하거나 서로 다른 표식 L2로 분류되어 있을 수 있다. 또한, 상기 올리고뉴클레오티드 R2’는 동일하거나 서로 다른 앵커 A를 가지고 있을 수 있다.
·각기 다른 표적 핵산 N (즉, 표적 핵산 N1, 표적 핵산 N2, 표적 핵산 N3, 표적 핵산 N4, ..., 표적 핵산 NX (X는 임의의 숫자))에 대해 상기 표적 핵산 N 중 영역 R1을 사이에 두고 위치하는 영역 M1 및 영역 M2에 각각 혼성화할 수 있는 마스크 올리고뉴클레오티드, 즉 올리고뉴클레오티드 M1’ 및 올리고뉴클레오티드 M2'의 적어도 하나 또는 모두를 설계, 제조한다. 즉, 표적 핵산 N1 중 영역 R1을 사이에 두고 위치하는 영역 M1 및 영역 M2에 각각 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 M1’ 및 올리고뉴클레오티드 M2'의 적어도 하나 또는 둘 다; 표적 핵산 N2 중 영역 R1을 끼고 위치하는 영역 M1 및 영역 M2에 각각 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 M1’ 및 올리고뉴클레오티드 M2'의 적어도 하나 또는 둘 다; 표적 핵산 N3 중 영역 R1을 사이에 두고 위치하는 영역 M1 및 영역 M2에 각각 혼성화할 수있는 올리고뉴클레오티드 M1’ 및 올리고뉴클레오티드 M2'의 적어도 하나 또는 둘 다; 표적 핵산 N4 중 영역 R1을 사이에 두고 위치하는 영역 M1 및 영역 M2에 각각 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 M1’ 및 올리고뉴클레오티드 M2’의 적어도 하나 또는 둘 다; ..., 표적 핵산 Nx 중 영역 R1을 사이에 두고 위치하는 영역 M1 및 영역 M2에 각각 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 M1' 및 올리고뉴클레오티드 M2’의 적어도 하나 또는 둘, 을 설계, 제조한다. 여기서 상기 각 표적 핵산은 선택적으로 동일하거나 서로 다른 표식 L2로 분류되어 있어도 좋다.
·필요에 따라 각각 다른 표적 핵산 N (즉, 표적 핵산 N1, 표적 핵산 N2, 표적 핵산 N3, 표적 핵산 N4, ..., 표적 핵산 NX (X는 임의의 숫자))에 대해 상기 표적 핵산 N 중 영역 R2를 사이에 두고 위치하는 영역 M3 및 영역 M4에 각각 혼성화 마스크 올리고뉴클레오티드, 즉 올리고뉴클레오티드 M3’ 및 올리고뉴클레오티드 M4'의 적어도 하나 또는 모두를 설계, 제조한다. 즉, 표적 핵산 N1 중 영역 R2를 사이에 두고 위치하는 영역 M3 및 영역 M4에 각각 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 M3’ 및 올리고뉴클레오티드 M4'의 적어도 하나 또는 둘 다; 표적 핵산 N2 중 영역 R2를 끼고 위치하는 영역 M3 및 영역 M4에 각각 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 M3’ 및 올리고뉴클레오티드 M4'의 적어도 하나 또는 둘 다; 표적 핵산 N3 중 영역 R2를 사이에 두고 위치하는 영역 M3 및 영역 M4에 각각 혼성화할 수있는 올리고뉴클레오티드 M3’ 및 올리고뉴클레오티드 M4'의 적어도 하나 또는 둘 다; 표적 핵산 N4 중 영역 R2를 사이에 두고 위치하는 영역 M3 및 영역 M4에 각각 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 M3’ 및 올리고뉴클레오티드 M4’의 적어도 하나 또는 둘 다; ..., 표적 핵산 Nx 중 영역 R2를 사이에 두고 위치하는 영역 M3 및 영역 M4에 각각 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 M3' 및 올리고뉴클레오티드 M4’의 적어도 하나 또는 둘, 을 설계, 제조한다. 여기서 상기 각 표적 핵산은 선택적으로 동일하거나 서로 다른 표식 L2로 분류되어 있어도 좋다.
·시료 중의 상기 복수의 표적 핵산 NX에, 각각의 표적 핵산 NX 용으로 조제한 상기의 다양한 올리고뉴클레오티드를 혼성화시켜 핵산 하이브리드를 형성시킨다.
·장치의 전개 요소 안을 모세관 현상에 의해 이동한 여러 종류의 핵산 하이브리드 각각을 상기 장치의 각각 다른 위치에 설치된 여러 표적 핵산 N 당 감지 구역 중 고정화된 물질 (상기 올리고뉴클레오티드 R2’, 앵커 A에 결합하는 수용체 A' 또는 표식 L2에 결합하는 물질)에 의해 포착한다.
·표식 L1이 예를 들어, 금 콜로이드 입자 등의 금속 콜로이드 입자와 라텍스 입자 등의 경우 각각의 감지 구역 (테스트 라인)마다 나타나는 착색의 정도를 지표로 각각의 표적 핵산 N의 유무, 양을 측정할 수 있다.
본 발명의 측면형 핵산 크로마토그래피(lateral-type nucleic acid chromatography)에서는 도 5-2에 개략적으로 설명한 것처럼, 상술한 "전개 요소"가 상술한 표적 핵산 N을 인식하기 위한 테스트 라인으로 감지 영역에 추가하여, 인터널 컨트롤 (내부 대조)로 핵산을 검출하기 위한 1 또는 2 이상의 컨트롤 라인으로 감지 영역을 함께 구비할 수 있다. 상기 1 또는 2 이상의 컨트롤 라인으로써의 감지 영역은 표적 핵산 N을 인식하기 위한 테스트 라인으로 감지 구역과 후술하는 "흡수 영역"의 사이에 배치되는 것이 바람직하다.
인터널 컨트롤(internal control)은, 검출될 표적 핵산 N과는 별도로 제공되는 별도의 핵산이며, 표적 핵산 N과 마찬가지로 모세관 현상에 의해 전개 요소 안을 이동하지만, 상술한 표지 핵산 N이 발견된 테스트 라인으로 감지 구역에서 포착되지 않고, 상기 테스트 라인을 통과하고 컨트롤 라인으로 감지 구역에서 포착, 감지된다.
컨트롤 라인으로써, 감지 구역의 인터널 컨트롤 포착, 검출은 상술한 테스트 라인으로 감지 구역의 표적 핵산 N 포착, 검출을 위한 다양한 방법과 동일한 방법으로, 인터널 컨트롤에 혼성화 캡처 올리고뉴클레오티드, 마스크 올리고뉴클레오티드 및 디텍션 올리고뉴클레오티드를 이용하여 실시할 수 있다.
상기 컨트롤 라인으로 감지 구역의 인터널 컨트롤의 보충, 검출은 상술한 본 발명의 측면형 핵산 크로마토그래피를 실시하기 위한 각종 장치를 사용하여 원하는 표적 핵산 N의 검사, 감지할 즈음 표적 핵산 N의 전개 요소 안의 이동과 함께, 인터널 컨트롤로 핵산 전개 요소 안을 이동시켜, 인터널 컨트롤을 컨트롤 라인으로 감지 구역에서 포착, 감지하여 해당 장치가 제대로 작동하는지 여부를 확인하는 것을 목적으로 한다.
상술한 바와 같이, 표적 핵산 N 및 인터널 컨트롤의 각 감지 영역에서의 검출을 금 콜로이드 입자 등의 금속 콜로이드 입자나 라텍스 입자가 갖는 적색과 청색의 색채를 이용하여 실시하는 경우에는 테스트 라인 착색의 유무에 관계없이 컨트롤 라인에서 착색 라인이 나타날 경우에는 장치가 제대로 작동하는 것으로 확인된다. 한편, 테스트 라인의 착색의 유무에 관계없이 컨트롤 라인에서 착색 라인이 나오지 않으면 장치가 제대로 작동하지 않는 것으로 확인된다.
본 발명에서 "흡수 영역(absorption zone)"은 전개 요소 중 모세관 현상에 의해 이동하여 나오는 액체 시료를 흡수하기 위해 전개 요소에 접해 배치할 수 있다(예를 들어, 적용 영역이 배치된 측과 반대측 위치). 상기 흡수 영역은 상기 전개 요소와 동일 또는 다른 재질로 이루어진 시트 상 또는 스트립상의 지지체일 수 있다.
이 흡수 영역은 그 기능면에서 흡수 패드이라 칭하기도 한다.
상기 어떤 실시양태를 포함하여 본 발명에서는 상술한 각종 핵산(표적 핵산, 각종 올리고뉴클레오티드, 핵산 하이브리드 등)을 포함한 액체 시료를 상기 전개 요소 중 전개시키기 위한 버퍼 중 적어도 하나의 변성제 또는 카오트로픽시약을 존재시킬 수 있다. 상기 버퍼 중 더욱 핵산의 혼성화에서 일반적으로 사용되는 적어도 하나의 무기 염을 존재시킬 수 있다. 즉, 본 발명의 핵산 크로마토그래피에서는 변성제 또는 카오트로픽시약을 존재시킴으로써 표적 핵산의 단일 가닥 영역의 적당한 형성 및 표적 핵산과 각종 올리고뉴클레오티드의 특이적 결합이 촉진되고, 또한 표적 핵산과 각종 올리고뉴클레오티드의 비특이적 반응에 의한 결합이 감소하고 특이적 반응의 촉진에 의해 해상도가 강화되고, 검출 한계가 저하하여 표적 핵산의 검출, 정량 감도, 정확성 및 신속성을 증대시킬 수 있다.
본 발명에서는 상기 중 실시양태의 장치도 불침습성 고체 재료로 이루어지는 케이스 (하우징) 중에 배치시켜 둘 수 있다.
이 케이스 (하우징) 중으로 배치된 본 발명의 장치의 하나의 실시양태로서, 도 5-1 및 도 5-2에 모식적으로 나타나는 양상을 예시할 수 있다.
도 5-2에 개략적으로 기재되는 형태는, 도 5-1에 개략적으로 기재되는 양태에 포함되는 각종 양태 중 바람직한 실시양태의 일례로서 해당 장치의 "전개 요소"가 상술한 표적 핵산을 검출하기 위한 테스트 라인으로 감지 구역 이외에 상술과의 상기 장치가 제대로 작동하는지 여부를 확인하기 위한 인터널 컨트롤 (대조)로 핵산을 검출하기 위한 컨트롤 라인으로 감지 영역을 함께 갖추는 형태이다.
상기 케이스 (하우징)는 상술한 본 발명의 장치 (키트)가 구비된 적용 영역에 시료를 적용하기 위한 시료 적용입구 및 감지 영역에서의 표적 핵산의 포착에 의해 생기는 변화 (예를 들면, 표식 L1 발생 색상의 변화)를 관찰하기 위한 감지 창을 갖추고 있다.
또한, 본 발명의 장치를 상기 케이스 (하우징) 중에 배치함으로써 장치에 포함된 시약 등이 건조 상태로 유지하고 상온에서 장기 보존이 가능해진다.
불침습성 고체 재료로 이루어지는 케이스 (하우징)으로는 공지 또는 시판 제품이 채택하고 있는 임의의 케이스 (하우징)을 사용할 수 있다. 예를 들어, 다음과 같은 공지의 기술 및 양태를 선택적으로 변경하면서 조제, 사용할 수 있다(예를 들면, 특허 제 2705768 호 공보, 특허 제 2825349 호 공보, 특 개평 6-230009 호 공보, 특 개평 9-145712 호 공보, 특 개평 2000-356638 호 공보 등을 참조할 수 있음).
본 발명은 상기 장치는 시료 중의 원하는 특정 표적 핵산 N의 검출 및 정량을 위한 장치 (이 경우 키트도 칭함)로 조제, 제공할 수 있다.
즉, 예를 들어, 상기에 예시되는 것과 같은 형태의 장치에 더 상기 특정 표적 핵산 N의 검출 및 정량에 필요한 하나 이상의 마스크 올리고뉴클레오티드 (M1’, M2', M3’ 및/또는 M4’), 올리고뉴클레오티드 프로브 R1'(표식 L1으로 표시되어 있을 수 있음) 및 올리고뉴클레오티드 프로브 R2’(앵커 A를 가지고 있을 수 있음)를 배치시킴으로써 키트로 할 수 있다.
또한 예를 들어, 시료 중에 포함되는 표적 핵산 N을 PCR에 등에 의해 증폭한 후 검출, 정량하는 경우에는 상기 키트에 상기 표적 핵산 N의 PCR 등에 의한 증폭에 필요한 쌍의 증폭용 프라이머 (예를 들면 PCR 프라이머)를 더 배치한 키트를 제공할 수 있다.
2. 흐름형 핵산 크로마토그래피(Flow-through nucleic acid chromatography)
흐름형 핵산 크로마토그래피의 원리는, 기본적으로 상기 측방 유동형 핵산 크로마토그래피의 원리와 유사하지만, 측방 유동형 핵산 크로마토그래피에서는 표적 핵산 N과 올리고뉴클레오티드 R1’ 및/또는 올리고뉴클레오티드 R2'와 혼성화를 지지체 (멤브레인) 중에서 수평 (가로 방향) 진행하는 반면 흐름형 핵산 크로마토그래피에서는 이러한 각 혼성화가 수직 방향으로 (위에서 아래로) 이동하는 점에서 차이가 있다.
본 발명은 이러한 흐름형 핵산 크로마토그래피는 예를 들어, 다음 구성 요소를 수직 방향으로 (위에서 아래로)에 배치하고 대비 장치를 이용하여 상기 측방 유동형 핵산 크로마토그래피와 같은 조작으로 할 수 있다.
·적어도 1 또는 2 이상의 서로 다른 표적 핵산 N (표식 L2로 분류되어 있을 수 있음)을 포함한 액체 시료를 적용하기 위한 샘플 패드.
·표적 핵산 N마다 설계, 제조된 하나 이상의 마스크 올리고뉴클레오티드 (M1, M2, M3 및/또는 M4; 1 종류 이상의 올리고뉴클레오티드 R1’(표식 L1으로 표시되어 있을 수 있음) 및/또는 올리고뉴클레오티드 R2’(앵커 A를 가지고 있을 수 있음) 중 하나 이상을 선택적으로 포함할 수 있는 컨쥬게이트 패드(conjugate pad)(시약 종이(detection paper 또는 testing paper)라고도 함).
·컨쥬게이트 패드 (시약 종이라고도 함)를 통과한 핵산 하이브리드 (상기 표적 핵산 N과 상기 하나 이상의 각종 올리고 뉴클레오타이드와 혼성화에 의해 생성되는 핵산 하이브리드)를 포착하고 감지하기 위해, 상기 핵산 하이브리드를 포착할 수 있는 물질 (올리고뉴클레오티드 R2’, 앵커 A에 결합하는 수용체 A' 또는 표식 L2에 결합하는 물질)이 고정화되어 있는 검출 패드 (감지 종이, 판정 종이로 칭함).
·선택적으로 검출 패드 (감지 종이, 판정 종이)를 통과한 액체를 흡수하는 흡수 패드를 제공할 수 있다.
상기 장치를 이용한 흐름형 핵산 크로마토그래피에서 표식 L1이 예를들어 금 콜로이드 입자 등의 금속 콜로이드 입자와 라텍스 입자 등의 경우 검출 패드 (감지 종이, 판별 종이라고도 함)에 고정된 상기 핵산 하이브리드를 포착할 수 있는 물질 (올리고뉴클레오티드 R2’, 앵커 A에 결합하는 수용체 A' 또는 표식 L2에 결합하는 물질)에 의해, L1 표지 올리고뉴클레오티드 R1’이 혼성화한 표적 핵산 N을 포착함으로써 검출 패드 (감지 종이, 판정 종이라 칭함)가 상기 입자가 갖는 적색과 청색 의해 착색한다. 이 착색의 정도를 지표로 표적 핵산 N의 유무, 양을 측정할 수 있다.
위에 예시한 흐름형 핵산 크로마토그래피용 장치 및 상기 장치를 이용하는 핵산 크로마토그래피 기법의 설명에서 각 용어는 상기의 측방 유동형 핵산 크로마토그래피에서 각 용어와 같은 의미를 가진다.
3. 혼성화 -ELISA(Hybridization-ELISA)
이 방법을 이용한 본 발명의 핵산의 검출 및 정량 방법은 전술한 대로 예를 들어, 도 2 (실시양태 (5), (6), (7)) 및 도 4-8에 개략적으로 예시된 대로의 실시양태를 들 수 있다.
이러한 양태에서는 표적 핵산 N에 하나 이상의 마스크 올리고뉴클레오티드 (예를 들면, 올리고뉴클레오티드 M1’, 올리고뉴클레오티드 M2', 올리고뉴클레오티드 M3’ 및/또는 올리고뉴클레오티드 M4') 및 앵커 A를 갖는 올리고뉴클레오티드 R2’의 혼성화를 포함하는, 핵산과 핵산에 의한 혼성화와, 표적 핵산 N에 결합한 표식 L2 (예를 들어, 형광 색소, 비오틴, DIG, 항체, 효소 등)과 상기 표식 L2에 결합하는 항체 (예를 들어, 효소 표지 항체)과 반응 (즉, ELISA; 효소 표지 면역 측정법)를 조합하여 원하는 표적 핵산을 검출, 정량할 수 있다.
본 발명에서는 이러한 혼성화 -ELISA을 이용하여 시료 중의 표적 핵산, 예를 들면 다음과 같이 검출, 정량할 수 있다.
또한, 이하에서 표적 핵산 N 영역 R2, 올리고뉴클레오티드 프로브 R1’, 표식 L2, 표식 L2로 표지된 표적 핵산 N, 영역 M1, 영역 M2, 마스크 올리고뉴클레오티드 (올리고뉴클레오티드 M1', 올리고뉴클레오티드 M2’ ) 핵산 하이브리드 앵커 A, 수용체 A’ 등의 용어의 의미는 위에서 정의한 바와 같다.
또한 다음 각 작업은 동시에 또는 임의의 순서로 실시될 수 있다.
·시료 중에 포함되거나 유래하는 표적 핵산 N을 표지 물질 (이하 "표식 L2”라고 칭함. 예를 들어, 형광 염료 (FITC (fluorescein isothiocyanate), 6-FAM (6-Carboxyfluorescein), TET, VIC, HEX, NED, PET, ROX, Cy5, Cy3, Texas Red, JOE, TAMRA 등), 비타민 비오틴, 디곡시게닌 (DIG) 등)로 분류하고 L2 표지 표적 핵산 N으로 한다. 예를 들어, 표적 핵산이 PCR 등에 의해 증폭된 핵산에 유래하는 경우에는 통상적인 방법에 따라, 상기 PCR 등에 의한 유전자 증폭 과정에서 증폭 산물에 표식 L2를 부가함으로써 L2 표지 표적 핵산 N을 얻을 수 있다.
·표적 핵산 N 중 영역 R1을 사이에 두고 위치하는 영역 M1 및 영역 M2에 각각 혼성화 마스크 올리고뉴클레오티드, 즉 올리고뉴클레오티드 M1’ 및 올리고뉴클레오티드 M2'의 적어도 하나 또는 모두를 설계, 제조하여, 올리고뉴클레오티드 M1’ 및 올리고뉴클레오티드 M2'의 적어도 하나 또는 둘 다 L2 표지 표적 핵산 N에 혼성화시킨다.
·또한, L2 표지 표적 핵산 N에 앵커 A를 갖는 올리고뉴클레오티드 올리고뉴클레오티드 R2’를 혼성화시킨다.
·상기의 혼성화를 동시에 또는 임의의 순서로 실시하는 것으로, L2 표지 핵산에 하나 이상의 마스크 올리고뉴클레오티드 및 앵커 A를 갖는 올리고뉴클레오티드 R2’가 혼성화함으로써 핵산 하이브리드가 형성된다.
·한편, 용적을 갖는 고체 지지체 (예를 들어, 튜브, 튜브, 플레이트, 비커, 하나 이상의 웰 (well)을 갖는 마이크로 플레이트 등)의 표면에 해당 앵커 A에 결합할 수 있는 물질인 수용체 A’(예를 들어, 상기 앵커 A가 비오틴의 경우에는 아비딘 또는 스트렙타비딘)을 고정화한다.
·전술한 표적 핵산 N을 포함한 시료와 각 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 마이크로 플레이트의 웰 플러스 상기의 혼성화를 통해 생성 된 상기 핵산 하이브리드가 상기 앵커 A와 지지체에 고정화되어 있는 수용체 A’의 결합을 통해 포착된다.
·다음, 상기 반응 용액에 표식 L2를 감지할 수 있는 물질 (예를 들면, 표식 L2에 결합하는 효소 등으로 표지된 항체)를 더해 표식 L2에 상기 물질 결합에 의하여 발하는 색상과 신호를 검출함으로써 상기 색상이나 신호의 정도를 지표로 표적 핵산 N의 유무, 양을 측정한다.
여기서, 예를 들면, 표식 L2가 FITC인 경우에는 상기 물질은 효소 (예를 들어, horseradish peroxidase (HRP))로 표지된 항 FITC 항체를 사용할 수 있다.
각종 세균 게놈 DNA의 PCR 산물의 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용한 핵산 크로마토그래피에 의한 검출
1. PCR 용 주형 DNA의 조제
PCR 용 주형 DNA는 ISOPLANT (NIPPON GENE)를 이용하여 게놈 DNA로써 준비했다.
즉, 황색 포도상 구균 (Staphylococcus aureus, "SA"로 약칭; 균주 ATCC12600), 표피 포도상 구균 (Staphylococcus epidermidis, "SE"로 약칭; 균주 ATCC14990), 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa, "PA"로 약칭; 균주 JCM5962), 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis, "EF"로 약칭; 균주 JCM5803), 대장균 (Escherichia coli, "EC"로 약칭; 균주 JCM1649), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae, "ET"로 약칭; 균주 JCM1232) 및 폐렴 간균 (Klebsiella pneumoniae, "KP"로 약칭; 균주 JCM 1662)의 각각을 3 mL의 LB 액체 배지 (Becton Dickinson)에서 하룻밤 배양하여 얻은 피검 균액 1 mL를 6,000 × g에서 5 분간 원심 후 침전물(residue)를 300 μL의 Extraction Buffer로 현탁한 후 150 μL의 Lysis Buffer를 첨가하여 혼합한 후 50℃에서 15 분간 반응시켰다.
다음으로, 각 반응액 150 μL의 Sodium Acetate (pH 5.2)를 첨가하여 혼합한 후 얼음에 15 분간 방치하고 12,000 × g, 4℃, 15 분간 원심 분리하여 상층액을 회수했다. 각 상청에 2.5 배량의 100% Ethanol을 첨가하여 혼합한 후 12,000 × g, 4℃, 15 분간 원심 분리하여 침사를 70% Ethanol로 세정한 후 바람에 건조시켰다. 바람 건조시킨 침전물에 TE buffer [10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) 100 μL 첨가하여 용해 후 RNase A를 1 μL (최종 농도 10 μg/mL) 이외에 37℃ 30 분간 반응시키고, 100 μL의 TE buffer 포화 phenol을 첨가하여 혼합하고 12,000 × g, 15 분간 원심 한 후 상층 액을 회수했다. 10 μL 3 M sodium sacetate buffer (pH 6.0)와 2.5 배량의 100% Ethanol을 첨가하여 혼합한 후 12,000 × g, 10 분간 원심한 후 상층액을 버리고 100 μL의 얼음처럼 차가운 70% Ethanol을 가하여 다시 12,000 × g, 10 분간 원심분리하였다. 침전물을 바람 건조시킨 후 50 μL의 TE buffer에 용해하여 주형 DNA로 했다.
2. PCR에 의한 핵산 증폭
PCR은 TAKARA 사 PrimeSTAR HS DNA Polymerase를 이용하였다. 먼저 PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μL) 0.2 μL, 5 × PrimeSTAR Buffer (Mg2 + plus) 4 μL, dNTP Mixture (각 2.5 mM) 1.6 μL, 주형 DNA 1 μL 및 각각의 세균 유래의 주형 게놈 DNA 에 특이적인 한쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 (10 pmol/μL) 각 0.4μL를 멸균수 20 μL 메스업했다.
SA 용 PCR 프라이머로서 다음과 같은 SA1F 및 SA1R을 사용했다.
·SA1F : 5'- GGATTCAATGTCACATGAGCGTGATAAAAT -3'[서열번호 1]
·SA1R : 5'- AAAGCTCAAGGATATGCGATTACTGAAGCAG -3'[서열번호 2]
SE 용 PCR 프라이머로서 다음과 같은 SE1F 및 SE1R을 사용했다.
·SE1F : 5'- TCAGAGGTCATGGAAAATCTTCACGAAC -3'[서열번호 3]
·SE1R : 5'- ATTGCCTCAGATTTATTAAAGCCTGCTAATTCTTC -3'[서열번호 4]
PA의 PCR 프라이머로서 다음과 같은 PA1F 및 PA1R을 사용했다.
·PA1F : 5'- AAGATCGGCGTATTCATCGGCGTC -3'[서열번호 5]
·PA1R : 5'- CCCAGGTCCTGATAGACCAGTTGATACCC -3'[서열번호 6]
EF 용 PCR 프라이머로서 다음과 같은 EF1F 및 EF1R을 사용했다.
·EF1F : 5'- GAAGACAACGATTTATGTTTACGCTTTGGCA -3'[서열번호 7]
·EF1R : 5'- AATTCGGCGTATCAGCCATTTTCATTT -3'[서열번호 8]
EC위한 PCR 프라이머로 다음과 같은 EC1F 및 EC1R을 사용했다.
·EC1F : 5'- GTCAGGTAAGGCTAATTTCATTACCAGCAAAGG -3'[서열번호 9] (서열번호 41의 올리고뉴클레오티드 EFA1와 동일한 배열)
·EC1R : 5'- CGGTCAGCCATAGGGTAAATGACCAC -3'[서열번호 10]
ET위한 PCR 프라이머로 다음과 같은 ET1F 및 ET1R을 사용했다.
·ET1F : 5'- GTTTCTGGCACGGCGTCAGC -3'[서열번호 11]
·ET1R : 5'- TGTGTGTCTAATCAGTTCCGCAGGG -3'[서열번호 12]
KP위한 PCR 프라이머로 다음과 같은 KP1F 및 KP1R을 사용했다.
·KP1F : 5'- CAGCCATCAGGTTGAGCATCATTAATCTT -3'[서열번호 13]
·KP1R : 5'- CAGCCGGAGAAATAGAGAAATCTTATGAATCAT -3'[서열번호 14]
PCR은 Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems)를 이용하여 94℃에서 3 분간 유지 한 후 98℃에서 10 초, 68℃에서 1 분의 반응을 40 사이클 반복, 68℃에서 5 분간 유지의 조건으로 반응시켜 했다.
3. PCR 산물의 agarose gel 전기 영동에 의한 판정
증폭한 PCR 산물은 Mupid (Advance)를 이용한 아가로스 겔 전기 영동하여 2 % 아가 로스 (Agarose I, AMRESCO), 1 × TAE 버퍼 [40 mM Tris-HCl (pH 8.0), 40 mM Acetic acid, 1.0 mM EDTA]를 이용하여 분리하였다. 전기 영동 후, 1 μg/mL 에틸 디움 브로마이드(ethidium bromide) 용액으로 염색하고 염색 후의 DNA는 documentation analysis system ChemiDoc XRS (Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 이용하여 자외선(260 nm) 아래에서 촬영되었다.
4. 금 콜로이드 입자 표지 캡처 올리고뉴클레오티드(capture oligonucleotides)의 준비
핵산 크로마토그래피에 의한 EC 유래 핵산의 검출에 사용하는 금 콜로이드 입자 표지 캡처 올리고뉴클레오티드를 다음과 같이 제조 하였다.
합성할 때, 비오틴화된 비오틴화 올리고뉴클레오티드 (비오틴- CGGTCAACGAGATGTGGTCT - 3') [서열번호 15]을 무게를 재고, 1 mM EDTA를 더해 0.1 M MOPS (3-Morpholinopropanesulfonic acid) 완충액 (pH 7.8)을 이용하여 희석하고 0.15 nmol 비오틴화 올리고뉴클레오티드 용액을 제조하였다.
비오틴화 올리고뉴클레오티드 용액에 스트렙타비딘 결합 금 콜로이드 입자 (BBI 사제)를 동량 넣고 잘 교반 한 후 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 다음으로 용액에 최종 농도 0.1 %가 되도록 비오틴 용액을 추가하여 더욱 37℃, 15 분간 인큐베이션했다. 얻어진 혼합 용액을 15,000 × g, 5 분간 원심한 후 상층 액을 버리고 1 mM EDTA, 0.5 % BSA 가압 20 mM Tris-HCl (8.0) 5 ml를 가하여 다시 15,000 × g, 5 분간 원심을 실시한 후, 상층 액을 제거하고, 1 mM EDTA, 0.5 % BSA 가압 20 mM Tris-HCl (8.0)를 첨가하여 교반하였다. 이 용액을 EC 유래 핵산의 검출에 이용되는 금 콜로이드 입자 표지 캡처 올리고뉴클레오티드의 용액으로 하였다.
이하, 상기와 같은 방법으로 각종 세균 (SA, SE, PA, EF, ET, KP) 유래 핵산의 핵산 크로마토그래피에 의한 검출에 사용되는 금 콜로이드 입자 표지 캡처 올리고뉴클레오티드를 제조하였다.
상기 캡처 올리고뉴클레오티드의 배열은 다음과 같다.
·SA 핵산 검출용 (SAB) : 5'- GGCTCATCTTCTAGTGGTGC - 3'[서열번호 16]
·SE 핵산 검출용 (SEB) : 5'- GGCCAAAAGTGAAGACATTG - 3'[서열번호 17]
·PA 핵산 검출용 (PAB) : 5'- CCATCTTTTCCAGGCGATGC - 3'[서열번호 18]
·EF 핵산 검출용 (EFB) : 5'- ACAAATGGGGCTGGAGGTTC - 3'[서열번호 19]
·ET 핵산 검출용 (ETB) : 5'- CAACCCTCAGGACACCACTT - 3'[서열번호 20]
·KP 핵산 검출용 (KPB) : 5'- CAACTCGGGATCGGCAAACA - 3'[서열번호 21]
5. BSA 결합 디텍션 올리고뉴클레오티드(detection oligonucleotides )의 준비
핵산 크로마토그래피에 의한 EC 유래 핵산 검출에 사용되는 멤브레인에 고정화하는 BSA 결합 디텍션 올리고뉴클레오티드를 다음과 같이 제조 하였다. Sigma 사의 소혈청 알부민 (BSA) 150 mg을 5 mM EDTA를 더한 0.1 M 인산 완충액 (pH 6.7) 2 ml에 용해시켰다.
다음으로, Thermo Scientific 사의 SATA (N-succinimidyl-S -acetylthioacetate)을 BSA의 4 배의 몰이되도록 조제하고, 37℃, 90 분간 인큐베이션했다. 그 후, 혼합액에 최종 농도 0.5 M이 되도록 히드록시아민(hydroxyamine) 용액을 첨가하여 더욱 37℃, 60 분 배양하였다. 이 혼합액에 2 M 인산 완충액을 가하여 pH 6.0로 조제하여 말레이미드화된 BSA 용액(maleimide-modified BSA solutions)으로 하였다.
합성된 올리고뉴클레오티드 (5'-CGACAGTACGCAGCCACGAT-3') [서열번호 22]를 무게를 재고 5 mM EDTA를 첨가한 0.1 M 인산 완충액 (pH 6.0)을 이용하여 희석하고 650 nmol/ml의 올리고 염기 용액을 제조하였다. 도진 화학 사제 EMCS (N- [6-Maleimidocaproyloxy] succinimide)를 올리고뉴클레오티드의 50 배 몰이 되도록 조제하고, 올리고뉴클레오티드 용액과 혼합하여 37℃에서 30 분간 배양했다. 그 후, 통상적인 방법에 따라 에탄올 침전을 실시했다.
침전물에 5 mM EDTA 첨가 0.1 M 인산 완충액 (pH 6.0)을 가하여 용해하고, 동량의 말레이미드화 BSA 용액을 첨가하여 37℃, 60 분간 인큐베이션했다. 그 후, N-에틸말레이미드(, N-ethylmaleimide)를 최종 농도 0.1 %가 되도록 첨가하였다. 말레이미드화 BSA와 올리고뉴클레오티드의 혼합물의 전량을 Bio Sepra 사제 ACA44 충전 컬럼 (내경 : 1.5cm x 60 cm)를 사용하여 5 mM EDTA를 첨가 한 0.1 M 인산 완충액 (pH 6.0) 완충액으로 용출시켜 정제하였다.
이하, 상기와 같은 방법으로 각종 세균 (SA, SE, PA, EF, ET, KP) 유래 핵산의 핵산 크로마토그래피에 의한 검출에서 막에 고정되는 BSA 결합 디텍션 올리고뉴클레오티드를 제조하였다.
BSA와 결합시키는 디텍션 올리고뉴클레오티드의 배열은 다음과 같다.
·SA 핵산 검출용 (SAA) : 5'- GCCGTGCTCAATACAGCTCC - 3'[서열번호 23]
·SE 핵산 검출용 (SEA) : 5'- GGACATGATATGGGGGGCAT - 3'[서열번호 24]
·PA 핵산 검출용 (PAA) : 5'- CGAGACGGCCCCAGACCTAT - 3'[서열번호 25]
·EF 핵산 검출용 (EFA) : 5'- AAGCAGGCTATCGGATTCTC - 3'[서열번호 26]
·ET 핵산 검출용 (ETA) : 5'- GTGGCTGACCTTAATGAACC - 3'[서열번호 27]
·KP 핵산 검출용 (KPA) : 5'- ATCACTGGCTGGCAAGGCAC - 3'[서열번호 28]
6. 핵산 크로마토그래피에 사용되는 테스트 스트립(test strip)의 준비
BioDot 사제 XYXZ300 도포기를 이용하여 Advanced Microdevice 사제 니트로 셀룰로오스 멤브레인에 BSA 결합 디텍션 올리고뉴클레오티드를 1.1 μg/테스트 (1 테스트는 1 mmx5 mm 폭의 라인을 의미)가 되도록 도포하여, 실온에서 하룻밤 건조하여 디텍션 올리고뉴클레오티드를 BSA를 통해 멤브레인 테스트 라인에 고정했다.
다음으로, 2 % BSA를 더한 0.1 M 인산 완충액 (pH 6.0)에 디텍션 올리고뉴클레오티드를 고정화 한 멤브레인을 4℃, 하룻밤 침지시켜 차단을 실시했다. 그 후, 멤브레인을 실온에서 충분히 건조시켰다. 디텍션 올리고뉴클레오티드가 고정화된 건조된 멤브레인에 Advanced Microdevice 사의 샘플 패드, 흡수 패드 및 일본 폴 사(Nihon Pall Ltd.)의 컨쥬게이트 패드를 붙여 맞췄다. 접착 시트를 BioDot 사 길로틴 커터(BioDot guillotine cutter)를 이용하여 5 mm 폭으로 절단하여 핵산 크로마토그래피에 사용되는 테스트 스트립으로 하였다(도 5-1).
상기에서 세균마다 조제한 BSA 결합 디텍션 올리고뉴클레오티드를 이용하여 세균마다 테스트 스트립을 제조하였다.
7. 마스크 올리고뉴클레오티드(mask oligonucleotides )의 준비
상기에서 조제한 캡처 올리고뉴클레오티드가 혼성화하는 세균 게놈 핵산의 영역을 사이에 두고 위치한 5' 측 및 3' 측의 각각의 영역에 혼성화한 한 쌍의 마스크 올리고뉴클레오티드를 박테리아마다 준비했다.
마찬가지로, 상기에서 조제한 디텍션 올리고뉴클레오티드가 혼성화한 세균 게놈 핵산의 영역을 사이에 두고 위치한 5' 측 및 3' 측의 각각의 영역에 혼성화한 한 쌍의 마스크 올리고뉴클레오티드를 박테리아마다 준비했다.
조제한 마스크 올리고뉴클레오티드의 배열은 다음과 같다.
·SA 핵산 검출용 (SAA1) : 5'- CAGTAATATAATAGTCTTTATCTACACTTTCTAAT -3'[서열번호 29]
·SA 핵산 검출용 (SAA2) : 5'- ACTTGTAGAGACACCCGTTAATACT -3'[서열번호 30]
·SA 핵산 검출용 (SAB1) : 5'- TAAAGCGTCGCTTAGAAATAATC -3'[서열번호 31]
·SA 핵산 검출용 (SAB2) : 5'- TAAATCTTCAAGTATTCGTGTAGATG -3'[서열번호 32]
·SE 핵산 검출용 (SEA1) : 5'- TAAATATCGATTCTGCACATATTTTA -3'[서열번호 33]
·SE 핵산 검출용 (SEA2) : 5'- CATTGCGAGTGAATTTACTG -3'[서열번호 34]
·SE 핵산 검출용 (SEB1) : 5'- GTGATTACATTGACAATTGTTTC -3'[서열번호 35]
·SE 핵산 검출용 (SEB2) : 5'- CAAATGGTTTCAACAAATTAATG -3'[서열번호 36]
·PA 핵산 검출용 (PAA1) : 5'- AGCCTAGTCCAGCGGG -3'[서열번호 37]
·PA 핵산 검출용 (PAA2) : 5'- TTGTCATTACGGGGCGT -3'[서열번호 38]
·PA 핵산 검출용 (PAB1) : 5'- GACCTCAGGCCGTTAACAT -3'[서열번호 39]
·PA 핵산 검출용 (PAB2) : 5'- CGTGCATCGGGCTGTG -3'[서열번호 40]
·EF 핵산 검출용 (EFA1) : 5'- GAAGACAACGATTTATGTTTACGCTTTGGCA -3'[서열번호 41] (서열번호 9의 올리고뉴클레오티드 EC1F와 동일한 배열)
·EF 핵산 검출용 (EFA2) : 5'- TATACGCCTTTTGAAACGGT -3'[서열번호 42]
·EF 핵산 검출용 (EFB1) : 5'- AATCAATGGGGAAATTTTTTA -3'[서열번호 43]
·EF 핵산 검출용 (EFB2) : 5'- TTTTAATGAGTCAAAGATTAGCGG -3'[서열번호 44]
·EC 핵산 검출용 (ECC1) : 5'- TAACAGTAAGCTGGTCATGG -3'[서열번호 45]
·EC 핵산 검출용 (ECC2) : 5'- CAGTACAACACGACGATTTATG -3'[서열번호 46]
·EC 핵산 검출용 (ECD1) : 5'- GATCGCTATCGAGGGGTATT -3'[서열번호 47]
·EC 핵산 검출용 (ECD2) : 5'- TTATGAGTGCTAAACAAGCTAAA -3'[서열번호 48]
·ET 핵산 검출용 (ETA1) : 5'- GGTCAACACCCCACAGGA -3'[서열번호 49]
·ET 핵산 검출용 (ETA2) : 5'- AAATCATTCAAAAGAATGCTGAAC -3'[서열번호 50]
·ET 핵산 검출용 (ETB1) : 5'- TGGCGGTATGGATGGG -3'[서열번호 51]
·ET 핵산 검출용 (ETB2) : 5'- TGCTGCATACGCTCTCTGA -3'[서열번호 52]
·KP 핵산 검출용 (KPA1) : 5'- CGCGGCCCTTTTTT -3'[서열번호 53]
·KP 핵산 검출용 (KPA2) : 5'- ATATTGCCATTGTTTATTTTTC -3'[서열번호 54]
·KP 핵산 검출용 (KPB1) : 5'- CTATTTTTAGCAGCTTGTTCAA -3'[서열번호 55]
·KP 핵산 검출용 (KPB2) : 5'- CTCATTTACCAGGAATAATCTTAC -3'[서열번호 56]
8. 핵산 크로마토그래피에 의한 핵산의 검출
핵산 크로마토그래피는 상기 세균마다 조제한 테스트 스트립을 이용한다(도 5-1). 테스트 라인은 상기에서 조제한 디텍션 올리고뉴클레오티드가 BSA를 통해 고정화되어 있다.
상기에서 제조한 각 세균에서 유래하는 게놈 핵산의 PCR 산물의 용액 10 μL를 각각 4 μM의 마스크용 올리고뉴클레오티드를 1 μL 첨가하여 핵산 크로마토그래피용 전개 버퍼 (28.6% Formamide 1.43 × SSC, 0.143 % BSA, 1.43 mM EDTA, 0.143 % Dextran Sulfate)를 49 μL 첨가하여 95℃에서 5 분간 처리한 후 4℃에서 급냉했다. 그 후, 용액에 상기에서 제조된 금 콜로이드 입자 표지 캡처 올리고뉴클레오티드를 10 μL 첨가하여 전량을 멤브레인 (테스트 스트립) 샘플 패드 (도 5-1)에 적하하였다.
또한 대조 시험으로서 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용하지 않고 동일하게 핵산 크로마토그래피를 실시했다.
9. 결과
각 세균의 각각의 게놈 DNA를 주형으로 하는 PCR 산물의 agarose gel 전기 영동으로 검출 결과를 도 6에 나타내었다.
그 결과, PCR에 의해 각각의 세균에 대해 목적으로 하는 게놈 DNA가 증폭된 것으로 나타났다.
각 세균의 PCR에 의한 증폭된 게놈 DNA의 핵산 크로마토그래피의 결과를 도 7에 나타내었다.
이 결과, 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용함으로써 발색 감도가 현저하게 상승했다.
세균 게놈 DNA의 제한 효소 처리 단편의 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용한 핵산 크로마토그래피에 의한 검출
1. 세균 게놈 DNA의 조제
대장균 (Escherichia coli, 이하 "EC"로 약칭; 균주 JCM1649) 및 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae, 이하 "ET"로 약칭; 균주 JCM1232)을 5 mL의 BHI 액체 배지 (Becton Dickinson)에서 하룻밤 배양하였다. 피검 균액을 1,870 × g (Allegra 6KR Centrifuge, Becton Dickinson)에서 10 분간 원심 분리하여 상층액을 버린 후 TE 버퍼 [10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)]로 세척하고 다시 1,870 × g에서 10 분간 원심 분리하여 상층액을 버리고 900 μL의 TE 버퍼에 현탁했다. 다음 현탁액에 5 mg/mL 라이소자임 (SEIKAGAKU CORPORATION)을 300 μL 첨가하여 37℃에서 30 분 후 10 mg/mL Protease K (Roche Diagnostics) 150 μL를 첨가하여 37℃에서 30 분 처리하고, 10 % SDS 150 μL를 첨가 하였다.
그 액에 동량의 TE 포화 페놀을 첨가하여 혼합한 후 1,870 × g에서 10 분간 원심 분리하여 상층액을 회수하고, 상기 조작을 다시 반복하여 상층액을 회수하였다. 다음으로 회수한 상층액에 4 mL의 냉 에탄올을 첨가하여 혼합한후 게놈 DNA를 석출시켜 백금에 의해 게놈 DNA를 감아 회수한 후, 냉 70 % 에탄올로 세척하고, 바람 건조시킨 후 500 μL의 TE에 용해시켰다. 다음으러 용액에 0.5 mg/mL RNase A (Roche Diagnostics)을 20 μL 첨가하고 37℃에서 2 시간 후 10 mg/mL Protease K (Roche Diagnostics) 20 μL를 가하여 55℃에서 1 시간 처리했다.
그 액에 동량의 TE 포화 페놀/클로로포름 액을 첨가하여 혼합한 후 1,870 × g에서 10 분간 원심 분리하여 상층액을 회수하고, 상기 조작을 2 회 반복하여 상층액을 얻었다. 그 후, 얻어진 상층액에 1 mL의 에테르를 첨가하여 혼합한 후 1,870 × g에서 10 분간 원심 분리하여 상층액을 버리고 다시 동일한 작업을 반복한 후 바람에 건조하여 에테르를 증발시켜 2 mL의 냉 에탄올을 첨가하여 혼합한 게놈 DNA를 석출시켜 백금에 의해 게놈 DNA를 감아 회수한 후, 냉 70 % 에탄올로 세척하고, 바람 건조시킨 후 200 μL의 TE에 용해하고 세균 게놈 DNA 용액을 얻었다.
2. 세균 게놈 DAN의 제한 효소에 의한 처리
제한 효소 Bgl II (다카라)를 사용하였다. 상기에서 얻은 150 μg의 세균 게놈 및 H 버퍼 250 μL, Bgl II (10 U/μL) 100 μL를 멸균수 2.5 mL로 메스업하고 37℃에서 16 시간 반응시켰다. 이어서, 반응액에 5 mL의 냉 에탄올을 첨가하여 혼합하고 20,000 × g에서 10 분간 원심 분리하여 DNA를 침전시킨 상층액을 버린 후 차가운 70 % 에탄올로 세척하고, 바람 건조시킨 후 50 μL 의 TE에 용해하여 제한 효소 처리된 세균 게놈 DNA 단편을 얻었다.
3. 금 콜로이드 입자 표지 캡처 올리고뉴클레오티드의 준비
5’ 말단 티올화 올리고뉴클레오티드를 멸균 증류수로 200 μM이 되도록 용해하고 그 200 μL에 0.08 M DTT (dithiothreitol)을 200 μL 첨가하여 실온에서 16 시간 방치하였다. 그 후, 멸균 증류수로 용매 치환을 실시했다. 10 μM의 5' 말단 티올화 올리고뉴클레오티드 200 μL를 금 콜로이드 입자 용액 (Wine Red Chemical Co., or British BioCell International) 200 μL와 혼합하여 50℃에서 22 시간 방치하였다. 다음으로 200 μM의 dATP을 200 μL 첨가하여 6 시간 방치한 후 최종 농도가 0.1 M NaCl, 10 mM 인산 완충액 (pH 7.0)으로하고, 더욱 12 시간 방치하였다. 그 후 5,000 × g, 15 분간 원심한 후, 동일한 완충액으로 세척하여 다시 분산시켜 핵산 크로마토그래피로 사용하는 금 콜로이드 입자 표지 캡처 올리고뉴클레오티드를 얻었다. 필요에 따라 0.1 % PEG (polyethylene glycol; 분자량 20,000)을 함유한 완충액을 사용하였다.
또한, 상기 캡쳐 올리고뉴클레오티드의 배열은 다음과 같다.
·ET 핵산 검출용 (ETB2-2) : 5'- GTGCCGCTCACCACACCATT -3'[서열번호 57]
4. BSA 결합 디텍션 올리고뉴클레오티드의 준비
실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
디텍션 올리고뉴클레오티드의 배열은 다음과 같다.
·ET 핵산 검출용 (ETA2-2) : 5'- TCACGACGACGAACGTACGC -3'[서열번호 58]
5. 핵산 크로마토그래피에 사용되는 테스트 스트립(test strips)의 준비
BioDot 사제 XYXZ300 도포기를 이용하여 Advanced Microdevice 사제 니트로 셀룰로오스 멤브레인에 BSA 결합 디텍션 올리고뉴클레오티드를 1.1 μg/테스트 (1 테스트는 1 mmx5 mm 폭의 라인을 의미)가 되도록 도포하여 실온에서 하룻밤 건조하여 디텍션 올리고뉴클레오티드를 BSA를 통해 멤브레인 테스트 라인에 고정했다.
다음으로 2 % BSA를 더한 0.1 M 인산 완충액 (pH 6.0)에 디텍션 올리고뉴클레오티드를 고정화한 멤브레인을 4℃, 하룻밤 침지시켜 차단을 실시했다. 그 후, 멤브레인을 실온에서 충분히 건조시켰다. 디텍션 올리고뉴클레오티드가 고정화된 건조 멤브레인에 Advanced Microdevice 사의 샘플 패드, 흡수 패드 및 일본 폴 사의 컨쥬게이트 패드를 붙여 맞췄다. 접착 시트를 BioDot 사 길로틴 커터를 이용하여 5mm 폭으로 절단하여 핵산 크로마토그래피에 사용되는 테스트 스트립으로 하였다 (도 1).
6. 마스크 올리고뉴클레오티드(mask oligonucleotides )의 준비
상기에서 조제한 캡처 올리고뉴클레오티드가 혼성화하는 세균 게놈 DNA 핵산의 영역을 사이에 두고 위치한 5' 측 및 3' 측의 각각의 영역에 혼성화한 한 쌍의 마스크 올리고뉴클레오티드를 박테리아마다 준비했다.
마찬가지로, 상기에서 조제한 디텍션 올리고뉴클레오티드가 혼성화한 세균 게놈 핵산의 영역을 사이에 두고 위치한 5' 측 및 3' 측의 각각의 영역에 혼성화한 한 쌍의 마스크 올리고뉴클레오티드를 박테리아마다 준비했다.
조제한 마스크 올리고뉴클레오티드의 배열은 다음과 같았다.
·ET 핵산 검출용 (ETA3) : 5'- ACCAGTGGGGAGATCACG -3'[서열번호 59]
·ET 핵산 검출용 (ETA4) : 5'- GATAAACTCGTTACCGGTCA -3'[서열번호 60]
·ET 핵산 검출용 (ETB3) : 5'- AGAACAGCCTGCAGGAGA -3'[서열번호 61]
·ET 핵산 검출용 (ETB4) : 5'- AACTACGTATGGCTGAGCC -3'[서열번호 62]
7. 핵산 크로마토그래피에 의한 핵산의 검출
핵산 크로마토그래피는 상기에서 조제한 테스트 스트립을 이용한다(도 5-1). 테스트 라인은 상기에서 조제한 디텍션 올리고뉴클레오티드가 BSA를 통해 고정화되어 있다.
상기 제한 효소 처리에 의해 제조된 세균 (ET, EC)의 게놈 DNA 단편의 용액 10 μL를 각각 4 μM의 마스크용 올리고뉴클레오티드를 1 μL 첨가하여 핵산 크로마토그래피용 전개 버퍼 (28.6 % Formamide 1.43 × SSC, 0.143 % BSA, 1.43 mM EDTA, 0.143 % Dextran Sulfate)를 49 μL 첨가하여 95℃에서 5 분간 처리한 후 4℃에서 급냉했다. 그 후, 용액에 상기에서 제조된 금 콜로이드 입자 표지 캡처 올리고뉴클레오티드를 10 μL 첨가하여 전량을 멤브레인 (테스트 스트립) 샘플 패드 (도 5-1)에 적하했다.
또한 대조 시험으로서 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용하지 않고 동일한 핵산 크로마토그래피를 실시했다.
8. 결과
제한 효소 처리한 세균의 게놈 DNA 단편의 핵산 크로마토그래피의 결과를 도 8에 나타냈다.
이 결과, 검출해야 할 핵산이 세균의 게놈 DNA (PCR 산물이 아님) 임에도 마스크용 올리고뉴클레오티드를 이용하여 표적 핵산을 고감도로 검출되었다.
세균 게놈 DNA의 멀티 플렉스(multiplex) PCR에 의한 PCR 산물의 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용한 핵산 크로마토그래피에 의한 표적 핵산의 특이적인 검출
1. 멀티 플렉스 PCR 용 주형 게놈 DNA의 조제
혈액 한천 배지에서 Campylobacter jejuni (균주 ATCC700819), Campylobacter jejuni (균주 81-176), Campylobacter coli (균주 ATCC33559), Campylobacter coli (균주 ATCC43478), Campylobacter fetus (균주 ATCC27374), Campylobacter fetus (균주 ATCC19438), Campylobacter hyointestinalis (균주 ATCC35217), Campylobacter lari (균주 ATCC43675) 및 Campylobacter upsaliensis (균주 ATCC43956 주)를 37℃에서 3 일간 미생물 호기성 조건에서 배양하였다. 얻어진 각 균주의 콜로니를 TE에 현탁하여 보일 법(boiling method)을 이용하여 주형 genomic DNA를 추출했다. 즉 현탁액을 boiling water bath에서 10 분간 끓여 얼음물에 급냉한 후 12,000 × g, 10 분간 원심한 후 상층액을 취하여 주형 게놈 DNA를 얻었다.
또한 E . coli (균주 C600)를 BHI 액체 배지 (Becton Dickinson)에서 하룻밤 배양한 후, TE로 10 배 희석하여 얻어진 희석액에서 보일 방법을 사용하여 동일한 방법으로 주형 게놈 DNA를 추출했다.
2. 멀티 플렉스 PCR에 의한 핵산 증폭
PCR은 TAKARA 사 Ex Taq DNA Polymerase를 이용하였다. 먼저 Ex Taq DNA Polymerase (2.5 U/μL) 0.2 μL, 10 × Ex Taq Buffer 4 μL, dNTP Mixture (각 2.5 mM) 3.2 μL, 주형 게놈 DNA 1 μL, 및 다음의 세 균 (Campylobacter jejuni , Campylobacter coli 및 Campylobacter fetus)의 각각의 주형 게놈 DNA 중 cdtC 유전자에 특이적인 한쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 (10 pmol/μL 각 2 μL 총 12 μL)을 멸균수 40 μL 메스업 한 멀티 플렉스 PCR을 실시했다. PCR은 Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems)를 이용하여 반응계를 94℃에서 3 분간 유지한 후 94℃에서 30 초, 55℃에서 30 초, 72℃에서 30 초간의 반응을 30 사이클 반복 72℃에서 3 분간 유지의 조건으로 반응시켰다.
Campylobacter jejuni 용 PCR 프라이머로 다음과 같은 CjcdtCU1 및 CjcdtCR2을 사용했다.
·CjcdtCU1 : 5'- TTTAGCCTTTGCAACTCCTA-3'[서열번호 63]
·CjcdtCR2 : 5'- AAGGGGTAGCAGCTGTTAA -3'[서열번호 64]
Campylobacter coli 용 프라이머로 다음과 같은 CccdtCU1 및 CccdtCR1을 사용했다.
·CccdtCU1 : 5'- TAGGGATATGCACGCAAAAG -3'[서열번호 65]
·CccdtCR1 : 5'- GCTTAATACAGTTACGATAG -3'[서열번호 66]
Campylobacter fetus 용 프라이머로 다음과 같은 CfcdtCU2 및 CfcdtCR1을 사용했다.
·CfcdtCU2 : 5'- AAGCATAAGTTTTGCAAACG -3'[서열번호 67]
·CfcdtCR1 : 5'- GTTTGGATTTTCAAATGTTCC -3'[서열번호 68]
3. PCR 산물의 agarose gel 전기 영동에 의한 판정
멀티 플렉스 PCR로 증폭한 PCR 산물은 Mupid (Advance) 를 이용한 아가로스 겔 전기 영동하여 2 % 아가로스 (Agarose I, AMRESCO) 1 × TAE 버퍼 [40 mM Tris-HCl (pH 8.0), 40 mM Acetic acid, 1.0 mM EDTA]를 이용하여 분리하였다. 전기 영동 후, 1 μg/mL 에틸디움 브로마이드 용액으로 염색하고 염색 후의 DNA는 gel documentation analysis system ChemiDoc XRS (Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 이용하여 자외선 아래 (260 nm)에서 촬영분석하였다.
4. 금 콜로이드 입자 표지 캡처 올리고뉴클레오티드의 준비
핵산 크로마토그래피에 의한 각 세균 게놈 DNA의 검출에 사용하는 금 콜로이드 입자 표지 올리고뉴클레오티드를 실시예 2와 동일한 방법으로 제조하였다.
각 세균의 검출용 캡쳐 올리고뉴클레오티드의 배열은 다음과 같다.
·Cj 핵산 검출용 (Cj-SH) : 5'- CCTTGCACCCTAGATCCTAT-3'[서열번호 69]
·Cc 핵산 검출용 (Cc-SH) : 5'- TCCTGACTCTAGTATCGCCA -3'[서열번호 70]
·Cf 핵산 검출용 (Cf-SH) : 5'- TCAGATCGCTCCTAGCGGAT -3'[서열번호 71]
5. BSA 결합 디텍션 올리고뉴클레오티드의 준비
100 nmol의 5’ 말단 아미노화 올리고뉴클레오티드(aminated oligonucleotide)를 포함하는 0.1 M MOPS (3-Morpholinopropanesulfonic acid) 완충액 400 μL에 3.5 mg/50 μL의 EMCS (N- [6-Maleimidocaproyloxy] succinimide)을 첨가하여 37℃ 에서 30 분간 반응시켰다. 반응 후, 에탄올 침전법에 의해 정제하여 5 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0.1 mM 인산 완충액 (pH 6.0)에 용해시켰다. 말레이미드기가 도입된 올리고뉴클레오티드의 양을 260 nm에서의 흡광도로부터 구했다.
Sulfhydryl Addition Kit (Thermo scientific)를 이용하여 BSA (Bovine Serum Albumin)에 SATA (N-succinimidyl-S-acetylthioacetate)를 도입했다. 즉, 2 mg의 BSA를 용해한 1 mL의 PBS (Phosphate buffered saline)에 17.3 mM의 SATA 용액을 16 μL 첨가하고 실온에서 30 분간 반응시켰다. 다음으로 5 mg의 Hydroxylamine·HCl을 용해시킨 Conjugation Buffer Stock (10 X) 100 μL를 첨가하여 실온에서 2 시간 동안 반응시켰다. 그 후, Maleimide Conjugation Buffer 용매 교환했다. 회수한 용출액의 280 nm에서의 흡광도에서 SH기 도입 BSA의 양을 구하여 다음 반응에 사용하였다.
상기에서 제조한 말레이미드기 도입 올리고뉴클레오티드와 SH기 도입 BSA를 혼합하여 37℃에서 1 시간 반응시켜 BSA 결합 디텍션 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 반응 후 Amicon Ultra 30K (Millipore)를 이용하여 BSA 결합 디텍션 올리고뉴클레오티드를 농축하고, Quick Start Bradford 1 X Dye Reagent (Bio-Rad)를 이용하여 양을 측정했다.
각 세균의 검출용 디텍션 올리고뉴클레오티드의 배열은 다음과 같았다.
·Cj 핵산 검출용 (Cj-NH) : 5'- AGCGCCTTTAGGGATACCTC -3'[서열번호 72]
·Cc 핵산 검출용 (Cc-NH) : 5'- TAAGCCCTAGGGGCGATGAT -3'[서열번호 73]
·Cf 핵산 검출용 (Cf-NH) : 5'- ACGCAATGCAAACACCGGAA -3'[서열번호 74]
6. 마스크 올리고뉴클레오티드의 준비
상기에서 조제한 캡처 올리고뉴클레오티드가 혼성화하는 세균 게놈 DNA 핵산의 영역을 사이에 두고 위치한 5' 측 및 3' 측의 각각의 영역에 혼성화한 한 쌍의 마스크 올리고뉴클레오티드를 박테리아마다 준비했다.
마찬가지로, 상기에서 조제한 디텍션 올리고뉴클레오티드가 혼성화하는 세균 게놈 핵산의 영역을 사이에 두고 위치한 5' 측 및 3' 측의 각각의 영역에 혼성화한 한 쌍의 마스크 올리고뉴클레오티드를 박테리아마다 준비했다.
조제한 마스크 올리고뉴클레오티드의 배열은 다음과 같다.
·Cj 핵산 검출용 (Cjf1) : 5'- GCTTAGAAACGGGAATTTTTTTA -3'[서열번호 75]
·Cj 핵산 검출용 (Cjf2) : 5'- AAAAGATCCTATTGATCAAAATTGG -3'[서열번호 76]
·Cj 핵산 검출용 (Cjg1) : 5'- AAAACGCTTTGGAATAGCC-3'[서열번호 77]
·Cj 핵산 검출용 (Cjg2) : 5'- TTTTTTTGCTGAAGTAAATGAAC-3'[서열번호 78]
·Cc 핵산 검출용 (Ccf1) : 5'- GCCTTTTGGCTATGTTCAGTTTA -3'[서열번호 79]
·Cc 핵산 검출용 (Ccf2) : 5'- ATATGCCTAGCTGTTTTAAGTGAA -3'[서열번호 80]
·Cc 핵산 검출용 (Ccg1) : 5'- CAATCAATGCATGAGCACTTT -3'[서열번호 81]
·Cc 핵산 검출용 (Ccg2) : 5'- TAGAAAATCGCTTTGGTTTAGG -3'[서열번호 82]
·Cf 핵산 검출용 (Cff1) : 5'- CATAACCGACGCTTTTCAAAT -3'[서열번호 83]
·Cf 핵산 검출용 (Cff2) : 5'- TTCCTATAAATATAAAGCGATTTTCAG -3'[서열번호 84]
·Cf 핵산 검출용 (Cfg1) : 5'- CCGACGTAAAAATGTGCCT -3'[서열번호 85]
·Cf 핵산 검출용 (Cfg2) : 5'- TTTTAGCACTAAAAAACTGCAAG -3'[서열번호 86]
7. 핵산 크로마토그래피에 사용되는 테스트 스트립의 준비
흡수 패드로 Cellulose Fiber Sample Pad (Millipore)를 장착한 니트로 셀룰로오스 멤브레인인 Hi Flow Plus 180 Membrane Card (Millipore)를 약 5 mm 폭으로 절단했다. 니트로 셀룰로오스의 일부 (테스트 라인)에 상기에서 제조한 1 mg/mL의 BSA 결합 디텍션 올리고뉴클레오티드를 1 μL 스팟하고 바람에 건조하여, 디텍션 올리고뉴클레오티드를 BSA를 통해 고정화하고 세균 당 핵산 크로마토그래피용 멤브레인 (테스트 스트립)를 제작하였다(도 5-1).
8. 핵산 크로마토그래피에 의한 핵산의 검출
핵산 크로마토그래피는 상기에서 제조한 각 세균 용 멤브레인 (테스트 스트립)을 사용하였다. 테스트 라인은 상기에서 조제한 디텍션 올리고뉴클레오티드가 BSA를 통해 고정화되어 있다.
상기에서 제조한 각 세균에서 유래한 게놈 핵산의 멀티 플렉스 PCR에 의한 PCR 산물의 용액 10 μL를 각각 4 μM의 마스크용 올리고뉴클레오티드를 1 μL 첨가하여 핵산 크로마토그래피용 전개 버퍼 (28.6 % Formamide 1.43 × SSC, 0.143 % BSA, 1.43 mM EDTA, 0.143 % Dextran Sulfate)를 49 μL 첨가하여 95℃에서 5 분간 처리 한 후 4℃에서 급냉했다. 그 후, 용액에 상기에서 제조된 금 콜로이드 입자 표지 캡처 올리고뉴클레오티드를 10 μL 첨가하여 전량을 멤브레인 (테스트 스트립) 샘플 패드(도 5-1)에 적하했다.
9. 결과
C. jejuni , C. coli와 C. fetus의 cdtC 유전자를 주형으로 멀티 플렉스 PCR에 의한 PCR 산물의 agarose gel 전기 영동에 의한 검출의 결과를 도 9에 나타내었다.
그 결과, 멀티 플렉스 PCR로 3 균종 각각에 대해 목적으로 하는 cdtC 유전자가 증폭된 것으로 나타났다.
한편, 근연 종인 다른 캄필로박터 속균 및 대장균에서 증폭 밴드가 검출되지 않았다.
각 세균 각각의 PCR 산물을 상기에서 제작한 C. jejuni의 핵산 크로마토그래피, C. coli의 핵산 크로마토그래피 및 C. fetus의 핵산 크로마토그래피에 제공하였으며, 각각의 PCR 산물이 선명하게 검출되었다(도 10).
핵산 크로마토그래피의 마스크 올리고뉴클레오티드의 효과
1. PCR 용 주형 DNA의 조제
EC에 대한 PCR 용 주형 DNA는 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
2. PCR에 의한 핵산 증폭
PCR은 TAKARA 사 Takara LA Taq을 사용하였다. 먼저 Takara LA Taq (5 U/μL) 0.2 μL, 10 × LA PCR BufferII (Mg2 + free) 2 μL, 25 mM MgCl2 2 μL, dNTP Mixture (각 2.5 mM) 1.6 μL, 주형 DNA 1 μL 및 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 (10 pmol/μL) 각 0.4 μL를 멸균 수 20 μL 메스업했다.
EC위한 PCR 프라이머로 다음과 같은 EC2F 및 EC2R을 사용했다.
·EC2F : 5'- CGCATTTTTATTAATGCTTTCG -3'[서열번호 87]
·EC2R : 5'- GGGCTGGCAGAGAGAGTG -3'[서열번호 88]
PCR은 Veriti 96 well Thermal Cycler (Applied Biosystems)를 이용하여 94℃에서 3 분간 유지한 후 94℃에서 30 초, 60℃에서 1 분, 72℃에서 1 분의 반응을 40 사이클 반복 72℃에서 5 분간 유지의 조건으로 반응시켰다.
3. 금 콜로이드 입자 표지 캡처 올리고뉴클레오티드의 준비
실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
캡처 올리고뉴클레오티드의 배열은 다음과 같다.
·EC 핵산 검출용 (ECB2) : 5'- TCGTGGGAACACAACCAGTC - 3'[서열번호 89]
4. BSA 결합 디텍션 올리고뉴클레오티드의 준비
실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
디텍션 올리고뉴클레오티드의 배열은 다음과 같다.
·EC 핵산 검출용 (ECA2) : 5'- GCCTGATAAACTTCCGCCTC - 3'[서열번호 90]
5. 마스크 올리고뉴클레오티드의 준비
상기에서 조제한 디텍션 올리고뉴클레오티드가 혼성화하는 세균 유래 PCR 산물의 영역을 사이에 두고 위치한 5' 측 및 3' 측의 각각의 영역에 혼성화한 한 쌍의 마스크 올리고뉴클레오티드 (ECC3, ECC4)를 준비했다.
또한, 대조군 시험에 상기에서 제조된 EC 유전자 증폭 용의 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 (EC2F 및 EC2R)를 이용한 PCR에 의해 증폭된 PCR 산물의 핵산 서열에 포함되지 않은 핵산 서열을 갖는 2 개의 컨트롤 올리고뉴클레오티드 (CT7, CT8)를 제조하였다.
조제한 디텍션 올리고뉴클레오티드 마스크 올리고뉴클레오티드의 배열은 다음과 같다.
·ECC3 : 5'- CAACCAGTTGATGATGGATC -3'[서열번호 91]
·ECC4 : 5'- GCCACTCTCTCTGCCAGC -3'[서열번호 92]
·CT7 : 5'- CGTGAAGATTTTCCATGACC -3'[서열번호 93]
·CT8 : 5'- CATAAACCCGAGGAATAACG -3'[서열번호 94]
6. 핵산 크로마토그래피에 사용되는 테스트 스트립의 준비
실시예 1과 동일한 방법으로 제조 하였다.
7. 핵산 크로마토그래피에 의한 핵산의 검출
핵산 크로마토그래피는 상기 세균마다 조제한 테스트 스트립을 이용하였다(도 5-1). 테스트 라인은 상기에서 조제한 디텍션 올리고뉴클레오티드가 BSA를 통해 고정화되어 있다.
상기에서 제조한 각 세균에서 유래한 게놈 핵산의 PCR 산물의 용액 10 μL를 각각 4 μM의 마스크용 올리고뉴클레오티드를 1 μL 첨가하여 핵산 크로마토그래피 용 전개 버퍼 (20 % Formamide 1 × SSC, 0.1 % BSA, 1 mM EDTA)를 90 μL 첨가하여 95℃에서 5 분간 처리한 후 4℃에서 급냉했다. 그 후, 용액에 상기에서 제조된 금 콜로이드 입자 표지 캡처 올리고뉴클레오티드를 10 μL 첨가하여 전량을 멤브레인 (테스트 스트립) 샘플 패드 (도 5-1)에 적하했다.
또한 대조 시험으로서 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용하지 않는 핵산 크로마토그래피를 실시했다.
8. 결과
각 마스크 올리고뉴클레오티드를 함께 첨가했을 때의 핵산 크로마토그래피의 결과를 도 11에 나타냈다.
마스크 올리고뉴클레오티드 2 종 (ECC3 + ECC4) 또는 1 종 (ECC4)만 첨가로 핵산 크로마토그래피의 발색 감도가 높아졌다.
핵산 크로마토그래피의 적정 마스크 올리고뉴클레오티드 검토
1. PCR 용 주형 DNA의 조제
SA, SE 및 EF에 대한 PCR 용 주형 DNA는 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
2. PCR에 의한 핵산 증폭
SA, SE 및 EF에 대한 PCR 산물은 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
3. 금 콜로이드 입자 표지 캡처 올리고뉴클레오티드의 준비
실시예 2와 동일한 방법으로 제조하였다.
캡처 올리고뉴클레오티드의 배열은 다음과 같다.
·SA 핵산 검출용 (SAB) : 5'- GGCTCATCTTCTAGTGGTGC - 3'[서열번호 16]
·SE 핵산 검출용 (SEB) : 5'- GGCCAAAAGTGAAGACATTG - 3'[서열번호 17]
·EF 핵산 검출용 (EFB) : 5'- ACAAATGGGGCTGGAGGTTC - 3'[서열번호 19]
4. BSA 결합 디텍션 올리고뉴클레오티드의 준비
실시예 3과 동일한 방법으로 제조하였다.
디텍션 올리고뉴클레오티드의 배열은 다음과 같다.
·SA 핵산 검출용 (SAA) : 5'- GCCGTGCTCAATACAGCTCC - 3'[서열번호 23]
·SE 핵산 검출용 (SEA) : 5'- GGACATGATATGGGGGGCAT - 3'[서열번호 24]
·EF 핵산 검출용 (EFA) : 5'- AAGCAGGCTATCGGATTCTC - 3'[서열번호 26]
5. 마스크 올리고뉴클레오티드의 준비
상기에서 조제한 캡처 올리고뉴클레오티드가 혼성화하는 세균 유래 PCR 산물의 공간을 사이에 두고 위치한 5' 측 및 3' 측의 각각의 영역에 혼성화한 한 쌍의 마스크 올리고뉴클레오티드를 박테리아마다 준비했다.
조제한 캡처 올리고뉴클레오티드 마스크 올리고뉴클레오티드의 배열은 다음과 같다.
·SA 핵산 검출용 (SAB1) : 5'- TAAAGCGTCGCTTAGAAATAATC -3'[서열번호 31]
·SA 핵산 검출용 (SAB2) : 5'- TAAATCTTCAAGTATTCGTGTAGATG -3'[서열번호 32]
·SE 핵산 검출용 (SEB1) : 5'- GTGATTACATTGACAATTGTTTC -3'[서열번호 35]
·SE 핵산 검출용 (SEB2) : 5'- CAAATGGTTTCAACAAATTAATG -3'[서열번호 36]
·EF 핵산 검출용 (EFB1) : 5'- AATCAATGGGGAAATTTTTTA -3'[서열번호 43]
·EF 핵산 검출용 (EFB2) : 5'- TTTTAATGAGTCAAAGATTAGCGG -3'[서열번호 44]
마찬가지로, 상기에서 조제한 디텍션 올리고뉴클레오티드가 혼성화하는 세균 유래 PCR 산물의 공간을 사이에 두고 위치한 5' 측 및 3' 측의 각각의 영역에 혼성화한 한 쌍의 마스크 올리고뉴클레오티드를 박테리아마다 준비했다.
조제한 디텍션 올리고뉴클레오티드 마스크 올리고뉴클레오티드의 배열은 다음과 같다.
·SA 핵산 검출용 (SAA1) : 5'- CAGTAATATAATAGTCTTTATCTACACTTTCTAAT -3'[서열번호 29]
·SA 핵산 검출용 (SAA2) : 5'- ACTTGTAGAGACACCCGTTAATACT -3'[서열번호 30]
·SE 핵산 검출용 (SEA1) : 5'- TAAATATCGATTCTGCACATATTTTA -3'[서열번호 33]
·SE 핵산 검출용 (SEA2) : 5'- CATTGCGAGTGAATTTACTG -3'[서열번호 34]
·EF 핵산 검출용 (EFA1) : 5'- GAAGACAACGATTTATGTTTACGCTTTGGCA -3'[서열번호 41]
·EF 핵산 검출용 (EFA2) : 5'- TATACGCCTTTTGAAACGGT -3'[서열번호 42]
6. 핵산 크로마토그래피에 사용되는 테스트 스트립의 준비
실시예 3과 동일한 방법으로 제조하였다.
7. 핵산 크로마토그래피에 의한 핵산의 검출
실시예 3과 동일한 방법으로 제조하였다.
8. 결과
각 세균의 PCR에 의한 증폭된 게놈 DNA의 핵산 크로마토그래피의 결과를 도 12에 나타내었다.
그 결과, 캡처 올리고뉴클레오티드용 마스크 올리고뉴클레오티드, 디텍션 올리고뉴클레오티드용 마스크 올리고뉴클레오티드의 어느 것이 더 효과적인지는 PCR 산물의 배열에 의존하지만 어떤 세균에서도 쌍방의 마스크 올리고뉴클레오티드 첨가에 의해 가장 발색 감도가 높아졌다.
핵산 크로마토그래피의 적정 마스크 올리고뉴클레오티드 검토(본원 발명의 핵산 크로마토그래피에 의한 표적 핵산의 정량 검토, 및 마스크 올리고뉴클레오티 드의 조건 검토)
1. PCR 용 주형 DNA의 조제
SA 용의 주형 DNA는 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
2. PCR에 의한 핵산 증폭
SA에 대한 PCR 산물은 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
3. 금 콜로이드 입자 표지 캡처 올리고뉴클레오티드의 준비
실시예 2와 동일한 방법으로 제조하였다.
캡처 올리고뉴클레오티드의 배열은 다음과 같다.
·SA 핵산 검출용 (SAB) : 5'- GGCTCATCTTCTAGTGGTGC - 3'[서열번호 16]
4. BSA 결합 디텍션 올리고뉴클레오티드의 준비
실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
디텍션 올리고뉴클레오티드의 배열은 다음과 같다.
·SA 핵산 검출용 (SAA) : 5'- GCCGTGCTCAATACAGCTCC - 3'[서열번호 23]
5. 마스크 올리고뉴클레오티드의 준비
상기에서 조제한 캡처 올리고뉴클레오티드가 혼성화하는 세균 유래 PCR 산물의 공간을 사이에 두고 위치한 5’ 측 및 3’ 측의 각각의 영역에 혼성화하는 하기와 같은 세 쌍의 마스크 올리고뉴클레오티드를 제조하였다 .
조제한 캡처 올리고뉴클레오티드에 하나의 염기 차이 없이 인접한 마스크 올리고뉴클레오티드의 배열은 다음과 같다.
·SAB1 : 5'- TAAAGCGTCGCTTAGAAATAATC -3'[서열번호 31]
·SAB2 : 5'- TAAATCTTCAAGTATTCGTGTAGATG -3'[서열번호 32]
조제한 캡처 올리고뉴클레오티드에서 5mer 떨어진 마스크 올리고뉴클레오티드의 배열은 다음과 같다.
·SAB3 : 5'- CTAAAGCGTCGCTTAGAAA -3'[서열번호 95]
·SAB4 : 5'- CTTCAAGTATTCGTGTAGATGC -3'[서열번호 96]
조제한 캡처 올리고뉴클레오티드에서 10 mer 떨어진 마스크 올리고뉴클레오티드의 배열은 다음과 같다.
·SAB5 : 5'- CGCTAAAGCGTCGCTT -3'[서열번호 97]
·SAB6 : 5'- AGTATTCGTGTAGATGCAT -3'[서열번호 98]
마찬가지로, 상기에서 조제한 디텍션 올리고뉴클레오티드가 혼성화하는 세균 유래 PCR 산물의 공간을 사이에 두고 위치한 5’ 측 및 3’ 측의 각각의 영역에 혼성화하는 세 대 마스크 올리고뉴클레오티드를 박테리아 마다 제조하였다.
조제한 디텍션 올리고뉴클레오티드에 하나의 염기 차이 없이 인접한 마스크 올리고뉴클레오티드의 배열은 다음과 같다.
·SAA1 : 5'- CAGTAATATAATAGTCTTTATCTACACTTTCTAAT -3'[서열번호 29]
·SAA2 : 5'- ACTTGTAGAGACACCCGTTAATACT -3'[서열번호 30]
조제한 디텍션 올리고뉴클레오티드에서 5mer 떨어진 마스크 올리고뉴클레오티드의 배열은 다음과 같다.
·SAA3 : 5'- AAACAGTAATATAATAGTCTTTATCTACACTTT -3'[서열번호 99]
·SAA4 : 5'- TAGAGACACCCGTTAATACTAAATG -3'[서열번호 100]
조제한 디텍션 올리고뉴클레오티드에서 10 mer 떨어진 마스크 올리고뉴클레오티드의 배열은 다음과 같다.
·SAA5 : 5'- TCTTCTAAAACAGTAATATAATAGTCTTTATCTAC -3'[서열번호 101]
·SAA6 : 5'- ACACCCGTTAATACTAAATGATT -3'[서열번호 102]
6. 핵산 크로마토그래피에 사용되는 테스트 스트립의 준비
실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
7. 핵산 크로마토그래피에 의한 핵산의 검출
실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
검출에는 C10066-10 Immunochromato-Reader (Hamamatsu Photonics)을 이용하여 발색 강도를 측정했다. 인접한 마스크 올리고뉴클레오티드를 첨가한 상태에서 X 축에 PCR 산물 농도, Y 축에 발색 강도를 지표로 검량선을 작성했다. 또한 발색 강도의 비교를 위해 일정 농도의 PCR 산물을 이용하여 5mer 또는 10 mer 떨어진 마스크 올리고뉴클레오티드를 첨가한 군 및 대조군 시험으로 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용하지 않는 핵산 크로마토그래피로 발색 강도를 측정하고 상기 검량선에서 인접한 마스크 올리고뉴클레오티드 첨가시의 PCR 산물의 양으로 환산했다. 대조 시험에서의 발색 강도에 해당하는 PCR 산물의 양을 1 배로 각 마스크 올리고뉴클레오티드 첨가시의 발색 강도에 해당하는 PCR 산물의 양에서 발색 감도를 산출했다.
8. 결과
인접한 마스크 올리고뉴클레오티드 첨가시의 검량선을 도 13에 나타냈다.
도에서와 같이 농도 의존적으로 발색 강도가 증가하여 정량할 수 있음이 확인되었다.
또한 각 마스크 올리고뉴클레오티드 첨가시의 발색 강도의 비교 검토를 표 2에 나타내었다.
각 마스크 올리고뉴클레오티드 첨가시의 핵산 크로마토그래피의 발색 감도의 비교
마스크 올리고뉴클레오티드 변환 농도 발색 감도(-fold)
없음 4.24 ± 1.20 1
인접 (no gap) 145 34.22
5-mer gap 140.38 ± 179.58 33.13
10-mer gap 28.28 ± 31.90 6.67
표에서 보는 바와 같이, 인접한 마스크 올리고뉴클레오티드가 가장 발색 강도가 높았지만, 캡처 및 디텍션 올리고뉴클레오티드에서 5mer 떨어진 마스크 올리고뉴클레오티드 첨가에서도 동일한 발색 강도가 얻어졌다. 캡처 및 디텍션 올리고뉴클레오티드에서 10 mer 떨어진 마스크 올리고뉴클레오티드 첨가는 인접한 마스크 올리고뉴클레오티드 첨가시의 발색 강도보다는 감소했지만, 마스크 올리고뉴클레오티드 무첨가시보다 발색 강도가 높았다.
핵산 크로마토그래피의 적정 마스크 올리고뉴클레오티드의 검토(마스크 올리고뉴클레오티드의 표적 핵산에 접촉 타이밍 검토)
1. PCR 용 주형 DNA 의 조제
SA 및 SE 용의 주형 DNA는 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
2. PCR 에 의한 핵산 증폭
SA 및 SE에 대한 PCR 산물은 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
3. 금 콜로이드 입자 표지 캡처 올리고뉴클레오티드의 준비
실시예 2와 동일한 방법으로 제조하였다.
캡처 올리고뉴클레오티드의 배열은 다음과 같았다.
·SA 핵산 검출용 (SAB) : 5'- GGCTCATCTTCTAGTGGTGC - 3'[서열번호 16]
·SE 핵산 검출용 (SEB) : 5'- GGCCAAAAGTGAAGACATTG - 3'[서열번호 17]
4. BSA 결합 디텍션 올리고뉴클레오티드의 준비
실시예 3과 동일한 방법으로 제조하였다.
디텍션 올리고뉴클레오티드의 배열은 다음과 같았다.
·SA 핵산 검출용 (SAA) : 5'- GCCGTGCTCAATACAGCTCC - 3'[서열번호 23]
·SE 핵산 검출용 (SEA) : 5'- GGACATGATATGGGGGGCAT - 3'[서열번호 24]
5. 컨쥬게이트 패드의 제조
5.0 % 자당(sucrose)을 포함하는 2 mM 인산 완충액 (pH 7.2)을 이용하여 마스크 올리고뉴클레오티드를 4 μM가 되도록 희석했다. 그 용액을 10 mm × 150 mm의 크기로 재단된 유리 섬유 (Millipore)에 도포한 후 건조된 것을 컨쥬게이트 패드로 하였다. 또한 대조군으로 마스크 올리고뉴클레오티드를 포함하지 않는 5.0 % 자당을 포함하는 2 mM 인산 완충액 (pH 7.2)을 도포하고 건조한 컨쥬게이트 패드를 제조하였다.
조제한 마스크 올리고뉴클레오티드의 배열은 다음과 같다.
·SA 핵산 검출용 (SAA1) : 5'- CAGTAATATAATAGTCTTTATCTACACTTTCTAAT -3'[서열번호 29]
·SA 핵산 검출용 (SAA2) : 5'- ACTTGTAGAGACACCCGTTAATACT -3'[서열번호 30]
·SA 핵산 검출용 (SAB1) : 5'- TAAAGCGTCGCTTAGAAATAATC -3'[서열번호 31]
·SA 핵산 검출용 (SAB2) : 5'- TAAATCTTCAAGTATTCGTGTAGATG -3'[서열번호 32]
·SE 핵산 검출용 (SEA1) : 5'- TAAATATCGATTCTGCACATATTTTA -3'[서열번호 33]
·SE 핵산 검출용 (SEA2) : 5'- CATTGCGAGTGAATTTACTG -3'[서열번호 34]
·SE 핵산 검출용 (SEB1) : 5'- GTGATTACATTGACAATTGTTTC -3'[서열번호 35]
·SE 핵산 검출용 (SEB2) : 5'- CAAATGGTTTCAACAAATTAATG -3'[서열번호 36]
6. 핵산 크로마토그래피에 사용되는 테스트 스트립의 준비
흡수 패드로써 Cellulose Fiber Sample Pad (Millipore)를 장착한 니트로 셀룰로오스 멤브레인인 Hi Flow Plus 180 Membrane Card (Millipore)에 상기 제조된 컨쥬게이트 패드 및 Cellulose Fiber Sample Pad (Millipore)를 붙여서 약 5 mm 폭으로 절단했다. 이에, 상기에서 제조한 1 mg/mL의 BSA 결합 디텍션 올리고뉴클레오티드를 1 μL 스팟하고 바람에 건조시켜, 디텍션 올리고뉴클레오티드를 BSA를 통해 고정화하여 핵산 크로마토그래피 용 멤브레인 (테스트 스트립)을 제작하였다.
7. 핵산 크로마토그래피에 의한 핵산의 검출
상기에서 제조된 PCR 산물 또는 TE 용액 10 μL에 4 μM의 마스크 용 올리고뉴클레오티드 또는 TE를 1 μL 첨가하여 핵산 크로마토그래피 용 전개 버퍼(28.6 % Formamide, 1.43 × SSC, 0.143 % BSA, 1.43 mM EDTA)를 49 μL 첨가하여 95℃에서 5 분간 처리한 후 4℃에서 급냉했다. 그 후, 용액에 상기에서 제조된 금 콜로이드 입자 표지 캡처 올리고뉴클레오티드를 10 μL 첨가하여 전량을 멤브레인 (테스트 스트립) 샘플 패드에 적하했다.
8. 결과
도 14와 같이 표적 PCR 산물과 금 콜로이드 표식 프로브를 적용하고 컨쥬게이트 패드에서 마스크 올리고뉴클레오티드를 반응시킨 경우에도 마스크 올리고뉴클리오티드의 효과가 발휘되어 강한 발색이 보였다.
혼성화 - ELISA 에 따르면, 올리고뉴클레오티드 프로브의 표적 핵산에 혼성화 마스크 올리고뉴클레오티드에 의한 촉진 효과( promoting effects ) 검토
1. PCR 용 주형 DNA 의 조제
QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN)을 이용하여 인간 혈액에서 인간 β-globin 유전자를 포함하는 genomic DNA를 추출했다.
또한 보일 법을 이용하여 대장균 (Escherichia coli, 이하 EC)에서 주형 genomic DNA를 추출했다.
즉, 대장균 (Escherichia coli, 이하 "EC"로 약칭; 균주 JCM1649)를 3 mL의 LB 액체 배지 (Becton Dickinson)에서 하룻밤 배양한 후 피검균액(test bacterial solution) 50 μL를 TE 버퍼 [10 mM Tris- HCl (pH 8.0), 1mM Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)] 450 μL를 넣고 10 분간 100℃ 처리했다. 100℃ 처리 후 12,000 × g (MX-160, TOMY) 10 분간 원심 분리하여 상층액을 회수하여 주형 DNA로 얻었다.
2. PCR 에 의한 핵산 증폭
우선, 인간 β-globin 유전자에 대한 PCR에서 Takara Taq (5 U/μL) 0.25 μL, 10 × PCR Buffer (Mg2 + plus) 5 μL, dNTP Mixture (각 2.5 mM) 4 μL, 주형 DNA 1 μL 및 하기 나타내는 인간 β-globin 유전자 증폭용의 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 (GM1F 및 GM1R; 각각 10 pmol/μL) 각 5 μL를 멸균수 50 μL에 메스업 했다.
또한, 프라이머 GM1R는 5' 말단이 fluorescein isothiocyanate (FITC)로 표지되어 있다.
·GM1F : 5'- GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG -3 '[서열번호 103]
·GM1R : 5'- FITC-TGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG -3 '[서열번호 104]
PCR은 Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems)를 이용하여 94℃에서 3 분간 유지한 후 94℃에서 30 초, 55℃에서 1 분, 72℃에서 1 분의 반응을 35 사이클 반복 72℃에서 5 분간 유지의 조건으로 반응시켰다.
다음으로, EC의 게놈 DNA에 대한 PCR에서 Takara LA Taq (5 U/μL) 0.5 μL, 10 × LA PCR Buffer II (Mg2 + free) 5 μL, 25 mM MgCl2 용액 5 μL, dNTP Mixture (각 2.5 mM) 4 μL, 주형 DNA 1 μL 및 하기와 같은 EC의 게놈 DNA 증폭 용의 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 (EC2R 및 EC2F; 각각 10 pmol/μL) 각 5 μL를 멸균 수 50 μL에 메스업 했다.
또한, 프라이머 EC2F는 5’ 말단이 fluorescein isothiocyanate (FITC)로 표지되어 있다.
·EC2F : 5'- FITC-GTCAGGTAAGGCTAATTTCATTACCAGCAAAGG-3’[서열번호 105]
·EC2R : 5'- CGGTCAGCCATAGGGTAAATGACCAC-3’[서열번호 106]
PCR은 Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems)를 이용하여 94℃에서 3 분간 유지한 후 98℃에서 10 초, 68℃에서 1 분 30 초간의 반응을 40 사이클 반복 68℃에서 5 분간 유지 조건으로 반응시켰다.
3. PCR 산물의 agarose gel 전기 영동에 의한 판정
증폭한 PCR 산물은 QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN)을 이용하여 정제한 후 Mupid (Advance)를 이용한 아가로스 겔 전기 영동하여 2 % 아가로스 (Agarose I, AMRESCO), 1 × TAE 버퍼를 이용하여 분리했다.
전기 영동 후, 1 μg/mL 에틸디움 브로마이드(ethidium bromide) 용액으로 염색하고 염색 후의 DNA는 gel documentation analysis system ChemiDoc XRS (Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 이용하여 자외선 아래 (260 nm)에서 촬영하였다.
4. 혼성화 - ELISA 에 이용하는 마이크로 플레이트의 제작
인간 β-globin 유전자의 핵산에 혼성화하는 비오틴으로 표지된 캡쳐 올리고뉴클레오티드 (GMA)를 제조하였다.
·GMA : 5'-Biotin- ATGGTGCACCTGACTCCTGA -3’[서열번호 107]
도 4-8에 개략적으로 나타낸 바와 같이, 상기 비오틴 표지 캡처 올리고뉴클레오티드 (GMA)를 스트렙타비딘으로 코팅된 마이크로 플레이트 (NUNC IMMOBILIZER STREPTAVIDIN F96, NUNC)에 추가하여 접시에 고상화했다.
5. 마스크 올리고뉴클레오티드의 준비
상기에서 조제한 캡처 올리고뉴클레오티드(GMA)가 혼성화하는 인간 β-globin 유전자의 핵산의 영역을 사이에 두고 위치한 5’ 측 및 3’ 측의 각각의 영역에 혼성화한 한 쌍의 마스크 올리고뉴클레오티드 ( GMA1, GMA2)를 제조하였다.
또한 대조군 시험용에 상기에서 제조한 인간 β-globin 유전자 증폭 용의 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 (GM1F 및 GM1R)를 이용한 PCR에 의해 증폭된 PCR 산물의 핵산 서열에 포함되지 않은 핵산 서열을 갖는 2 개의 컨트롤 올리고뉴클레오티드 (CT5, CT6)를 제조하였다.
·GMA1 : 5'- AGCAACCTCAAACAGACACC-3’[서열번호 108]
·GMA2 : 5'- GGAGAAGTCTGCCGTTACTG-3’[서열번호 109]
·CT5 : 5'- GGTCAGCCATAGGGTAAATGAC-3’[서열번호 110]
·CT6 : 5'- TTATGATGTCAGAGGTCATGG-3’[서열번호 111]
6. 혼성화 - ELISA 의한 핵산의 검출
우선 TE 버퍼 또는 QIAquick PCR Purification Kit에 의해 정제한 PCR 산물 2.5 μL (0.4 μM)에 5 μM의 한 쌍의 마스크 올리고뉴클레오티드 또는 5 μM의 컨트롤 올리고뉴클레오티드를 각각 1 μL 또는 대조군으로 TE 버퍼 2 μL를 첨가하여 10 μL의 125 mM NaOH를 넣고 5 분간 변성시켰다.
다음으로 50 mM 인산 버퍼 (pH 7.0)을 100 μL 첨가하여 혼합한 후 전량을 마이크로 플레이트에 첨가하여 37℃에서 1 시간 반응시켰다. 다음 37℃로 따뜻한 300 μL의 2 x SSCT (300 mM NaCl, 30 mM 구연산 나트륨, 0.05 % Tween20)에 의한 세정을 3 회 반복하여, PBST (0.05 % Tween20를 포함하는 PBS)에서 50,000 배 희석한 HRP 표지 안티 FITC 항체 (Rockland)을 100 μL 첨가하고 실온에서 30 분간 반응시켰다. 반응 후 300 μL의 PBST에 의한 세정을 3 회 반복하여 100 μL의 TMB 용액 (KPL)를 첨가하여 실온에서 10 분간 반응 후 100 μL의 1 M 인산 반응을 정지시키고 플레이트 리더 680XR (Bio-Rad)를 이용하여 450 nm의 흡광도를 측정했다.
7. 결과
각각의 PCR 산물의 agarose gel 전기 영동으로 검출 결과를 도 15에 나타내었다.
인간 β-globin 유전자 증폭용 프라이머를 이용한 PCR에서는 목적으로 하는 262 bp의 PCR 산물이 검출되었다. 또한 EC 게놈 DNA 증폭용 프라이머를 이용한 PCR에서는 목적으로 하는 309 bp의 PCR 산물이 검출되었다.
각각의 PCR 산물의 혼성화-ELISA에 의한 검출 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
마스크 올리고뉴클레오티드를 이용하지 않는 경우 인간 β-globin 유전자의 PCR 산물의 흡광도는 0.473 ± 0.036 인 반면, PCR 산물의 변성시에 마스크 올리고뉴클레오티드를 첨가하여 두는 것으로, 흡광도는 약 1.5 배의 0.739 ± 0.037로 상승했다.
또한 마스크 올리고뉴클레오티드만으로 분석 및 인간 β-globin 유전자의 PCR 산물 대신 E. coli 유래의 게놈 DNA의 PCR 산물에 마스크 올리고뉴클레오티드를 더해 수행한 분석에서는 흡광도는 모두 낮은 값을 보여 주었다.
또한 인간 β-globin 유전자의 PCR 산물의 핵산 서열에 포함되지 않은 핵산 서열을 갖는 컨트롤 올리고뉴클레오티드 (CT5, CT6)를 첨가한 분석에서의 흡광도는 마스크 올리고뉴클레오티드를 첨가하여 수행한 분석의 흡광도와 동일하게 낮은 값을 보였다.
그 결과, 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용함으로써 혼성 -ELISA의 표적 핵산의 검출 감도가 증가하는 것으로 밝혀졌다.
혼성화-ELISA에 따른 마스크 올리고뉴클레오티드의 효과
PCR 생성물1 ) β-glo β-glo β-glo EC 없음
첨가 올리고 없음 GMA1 & GMA2 CT5 & CT6 GMA1 & GMA2 GMA1 & GMA2
OD 450 nm (Mean ± SD) 0.473 ± 0.036 0.739 ± 0.037 0.508 ± 0.011 0.104 ± 0.01 0.110 ± 0.021
1) β-glo: 인간 β-globin 유래 PCR 산물, EC: E. coli 유래 PCR 산물
각종 세균의 rRNA 유전자의 16S 서브 유닛을 표적으로 한 PCR 산물의 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용한 핵산 크로마토그래피에 의한 검출
1. PCR 용 주형 DNA 의 조제
각종 세균의 PCR 용 주형 DNA는 세균의 침전물을 제작하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다. 또한 대조군 시험으로 각종 곰팡이에 대해서도 동일하게, PCR 용 주형 DNA를 제조하였다.
사용한 균주의 배양 방법은 하기와 같다.
(1) BHI 액체 배지에서 일반 대기 하의 37℃에서 배양
Staphylococcus aureus (균주 ATCC 12600);
Staphylococcus epidermidis (균주 ATCC 14990);
Pseudomonas aeruginosa (균주 ATCC 10145);
Enterococcus faecalis (균주 ATCC 19433);
Escherichia coli (균주 ATCC 11775);
Enterobacter cloacae (균주 JCM 1232);
Klebsiella pneumoniae (균주 JCM 1662);
Burkholderia cepacia (균주 JCM 5507);
Stenotrophomonas maltophilia (균주 JCM 1975);
Acinetobacter baumannii (균주 ATCC 17978);
Pseudomonas fluorescens (균주 JCM 5963);
Pseudomonas putida (균주 JCM 6157);
Pseudomonas stutzeri (균주 JCM 5965);
Citrobacter freundii (균주 JCM 1657);
Citrobacter koseri (균주 JCM 1659);
Edwardsiella tarda (균주 JCM 1656);
Enterobacter aerogenes (균주 JCM 1235);
Enterobacter amnigenus (균주 JCM 1237);
Hafnia alvei (균주 JCM 1666);
Klebsiella oxytoca (균주 JCM 1665);
Kluyvera intermedia (균주 JCM 1238);
Morganella morganii (균주 JCM 1672);
Pantoea agglomerans (균주 JCM 1236);
Proteus mirabilis (균주 JCM 1669);
Proteus vulgaris (균주 JCM 20339);
Providencia rettgeri (균주 JCM 1675);
Serratia liquefaciens (균주 JCM 1245);
Serratia marcescens (균주 ATCC 274);
Staphylococcus haemolyticus (균주 JCM 2416);
Staphylococcus hominis (균주 ATCC 27844);
Staphylococcus saprophyticus (변형 JCM 2427);
Enterococcus avium (균주 JCM 8722);
Enterococcus durans (균주 IFO 13131);
Enterococcus faecium (균주 JCM 5804);
Corynebacterium diphtheriae (균주 JCM 1310); 및
Micrococcus luteus (균주 JCM 1464)
(2) BHI 액체 배지에서 일반 대기 하의 30℃에서 배양
Sphingobacterium multivorum (균주 IFO 14947);
Brevundimonas diminuta (균주 IFO 14213);
Achromobacter xylosoxidans (균주 IFO 15126);
Alcaligenes faecalis (균주 JCM 20522);
Chromobacterium violaceum (균주 IFO 12614);
Acinetobacter calcoaceticus (균주 JCM 6842);
Vibrio vulnificus (균주 JCM 3725);
Aeromonas hydrophila (균주 JCM 1027);
Aeromonas sobria (균주 JCM 2139);
Salmonella enterica (균주 IFO 3313);
Bacillus cereus (균주 IFO 15305); 및
Bacillus subtilis (균주 JCM 1465)
(3) BHI 한천 배지에서 혐기성 하의 37℃에서 배양
Bacteroides fragilis (균주 JCM 11019);
Bacteroides thetaiotaomicron (균주 JCM 5827);
Bacteroides vulgatus (균주 JCM 5826);
Porphyromonas asaccharolytica (균주 JCM 6326);
Porphyromonas gingivalis (균주 JCM 8525);
Prevotella intermedia (균주 JCM 12248);
Fusobacterium necrophorum subsp funduliforme (균주 JCM 3724);
Lactobacillus acidophilus (균주 JCM 1132);
Lactobacillus fermentum (균주 JCM 1173);
Clostridium difficile (균주 JCM 1296);
Clostridium perfringens (균주 JCM 1290);
Peptoniphilus asaccharolyticus (균주 JCM 1765);
Eggerthella lenta (균주 JCM 9979); 및
Propionibacterium acnes (균주 JCM 6425)
(4) 혈액 한천 배지에서 5 % CO2 하의 37℃에서 배양
Capnocytophaga canimorsus (균주 ATCC 35979);
Streptococcus agalactiae (균주 JCM 5671);
Streptococcus pneumoniae (균주 ATCC 33400);
Streptococcus pyogenes (균주 JCM 5674); 및
Streptococcus sanguinis (균주 JCM 5708)
(5) 초콜릿 한천 배지(chocolate agar medium)에서 5% CO2 하의 37℃에서 배양
Neisseria lactamica (균주 ATCC 23970);
Neisseria meningitidis (균주 ATCC 13077); 및
Haemophilus influenzae (균주 ATCC 33391)
(6) BCYE 한천 배지에서 5 % CO2 하의 37℃에서 배양
Legionella pneumophila (균주 JCM 7571)
(7) 혈액 한천 배지에서 미세 호기성 하의 37℃에서 배양
Campylobacter jejuni (균주 ATCC700819)
(8) 혈액 한천 배지에서 일반 대기 하의 37℃에서 배양
Corynebacterium jeikeium (균주 JCM 9384)
(9) BHI 한천 배지에서 5 % CO2 하의 37℃에서 배양
Gardnerella vaginalis (균주 JCM 11026)
(10) YPD 액체 배지에서 일반 대기 하의 30℃에서 배양 (음성대조군 시험 균류)
Candida albicans (균주 IFO 1385);
Candida glabrata (균주 NBRC 0622);
Candida krusei (균주 IFO 1395);
Candida parapsilosis (균주 IFO 1396);
Candida tropicalis (균주 IFO 1400);
Aspergillus fumigatus (균주 TIMM 0063); 및
Cryptococcus neoformans (균주 TIMM 0354)
(11) BHI 한천 배지에서 일반 대기 하의 30℃에서 배양 (음성대조군 시험 균류)
Trichosporon cutaneum (균주 JCM 1462)
2. PCR 에 의한 핵산 증폭
PCR은 TAKARA 사 PrimeSTAR HS DNA Polymerase를 이용하였다. 먼저 PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μL) 0.2 μL, 5 × PrimeSTAR Buffer (Mg2 + plus) 4 μL, dNTP Mixture (각 2.5 mM) 1.6 μL, 주형 DNA 0.1ng, 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 (10 pmol/μL) 각 0.4μL를 멸균수 20 μL에 메스업했다.
하기의 PCR 프라이머를 준비, 사용했다.
·16S-10F : 5'- GTTTGATCCTGGCTCA -3’[서열번호 112]
·16S-800R : 5'- TACCAGGGTATCTAATCC -3’[서열번호 113]
PCR 반응은 "유전자 분석에 의한 미생물의 신속 동정 법”(일본 약전 참고 자료)에 준하여 실시했다.
PCR은 Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems)를 이용하여 94℃에서 1 분간 유지한 후 94℃에서 30 초, 55℃에서 1 분, 72℃에서 1 분의 반응을 30 사이클 반복 72℃에서 5 분간 유지의 조건으로 반응시켰다.
3. PCR 산물의 agarose gel 전기 영동에 의한 판정
실시예 1과 동일한 방법으로 실시했다.
4. 금 콜로이드 입자 표지 캡처 올리고뉴클레오티드의 준비
실시예 2와 동일한 방법으로 실시했다.
조제한 캡처 올리고뉴클레오티드의 배열은 다음과 같았다.
·16S rDNA 검출용: 5'- GCAGCAGTAGGGAATCTTCG-3’[서열번호 114]
5. BSA 결합 디텍션 올리고뉴클레오티드의 준비
실시예 3과 동일한 방법으로 제조하였다.
BSA와 결합시키는 디텍션 올리고뉴클레오티드의 배열은 다음과 같았다.
·16S rDNA 검출용: 5'- CACACTGGAACTGAGACACG -3’[서열번호 115]
6. 핵산 크로마토그래피에 사용되는 테스트 스트립의 준비
실시예 3과 동일한 방법으로 제조하였다.
상기에서 BSA 결합 디텍션 올리고뉴클레오티드를 막에 고정화하여 5mm 폭으로 절단하여 핵산 크로마토그래피에 사용되는 테스트 스트립으로 하였다(도 5-1).
7. 마스크 올리고뉴클레오티드의 준비
상기에서 조제한 캡처 올리고뉴클레오티드가 혼성화하는 세균 게놈 핵산의 영역을 사이에 두고 위치한 5’ 측 및 3’ 측의 각각의 영역에 혼성화한 한 쌍의 마스크 올리고뉴클레오티드를 제조하였다.
마찬가지로, 상기에서 조제한 디텍션 올리고뉴클레오티드가 혼성화하는 세균 게놈 핵산의 영역을 사이에 두고 위치한 5’ 측 및 3’ 측의 각각의 영역에 혼성화한 한 쌍의 마스크 올리고뉴클레오티드를 제조하였다.
조제한 마스크 올리고뉴클레오티드의 배열은 다음과 같았다.
디텍션 올리고뉴클레오티드 용 마스크 올리고뉴클레오티드 (M1’)
·16S rDNA 검출용 : 5'- TGGTCTGAGAGGATGATCAGT -3’[서열번호 116]
디텍션 올리고뉴클레오티드 용 또는 캡처 올리고뉴클레오티드 용 마스크 올리고뉴클레오티드 (M2’와 M3')
·16S rDNA 검출용 : 5'- GTCCAGACTCCTACGGGAG-3’[서열번호 117]
캡처 올리고뉴클레오티드 용 마스크 올리고뉴클레오티드 (M4’)
·16S rDNA 검출용 : 5'- ACAATGGGCGAAAGCCT -3’[서열번호 118]
8. 핵산 크로마토그래피에 의한 핵산의 검출
핵산 크로마토그래피는 상기 세균 당, 및 곰팡이 당 조제한 테스트 스트립을 이용하였다. 테스트 라인은 상기에서 조제한 디텍션 올리고뉴클레오티드가 BSA를 통해 고정화되어 있다.
상기에서 제조한 각 세균 및 각 곰팡이에서 유래한 게놈 핵산의 PCR 산물의 용액 1.25 μL에 각각 4 μM의 마스크 용 올리고뉴클레오티드를 1 μL 첨가하여 핵산 크로마토그래피 용 전개 버퍼 (24 % Formamide 1 × SSC, 0.1 % BSA, 1 mM EDTA, 0.5M 구아니딘 염산염)을 30 μL, TE를 추가하여 전량을 70μL하고, 95℃에서 5 분간 처리한 후 4℃에서 급냉했다. 그 후, 용액에 상기에서 제조된 금 콜로이드 입자 표지 캡처 올리고뉴클레오티드를 5 μL 첨가하였다. 이 용액에 테스트 스트립을 적셔 핵산 크로마토그래피를 실시했다.
9. 결과
각 세균 및 각 곰팡이 각각의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR 산물을 핵산 크로마토그래피로 검출한 결과를 표 4 및 도 16 (표 4에 나타낸 각종 균종의 일부)에 나타내었다.
그 결과, 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용한 핵산 크로마토그래피에 의해 시험한 모든 세균에 대해 감지 해야하는 표적 핵산 (rRNA 유전자의 16S 서브 유닛)이 고감도로 검출되었다. 한편, 대조군 시험으로 실시한 어떠한 곰팡이에 대해서도 시험 결과는 음성이었다.
Figure pct00002
각종 곰팡이 게놈 DNA 의 PCR 산물의 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용한 핵산 크로마토그래피에 의한 검출
1. PCR 용 주형 DNA 의 조제
PCR 용 주형 DNA는 ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep (ZYMO RESARCH)를 이용하여 게놈 DNA로 준비했다.
즉, 하기의 각 곰팡이를 각각 3 mL의 YPD 액체 배지 (Q-Biogene)에서 30℃ 하룻밤 배양하여 얻은 피검 균액 1 mL를 6,000 × g에서 3 분간 원심 후 침전물을 500 μL의 PBS에 현탁한 후 6,000 × g에서 3 분간 원심 분리하여 침전물을 회수했다.
Candida albicans ("CA"로 약칭; 균주 NBRC1385);
Candida glabrata ("CG"로 약칭; 균주 NBRC0005);
Candida krusei ("CK"로 약칭; 균주 NBRC0011);
Candida parapsilosis ("CP"로 약칭; 균주 NBRC1396);
Candida tropicalis ("CT"로 약칭; 균주 NBRC1400);
Candida guilliermondii ("CGu"로 약칭; 균주 NBRC0566);
Candida kefyr ("CKf"로 약칭; 균주 NBRC0586);
Candida lusitaniae ("CL"로 약칭; 균주 ATCC66035); 및
Candida metapsilosis ("CM"으로 약칭; 균주 NBRC0640)
각 시료에 효소 시약 (Zymolyase 20T (SEIKAGAKU) 5 mg을 포함하는 PBS 1 mL) 300 μL 추가하여 녹인 후 37℃에서 1 시간 반응시켰다.
450 μL의 Lysis Buffer를 첨가하여 혼합한 후, ZR BashingBead Lysis Tube에 옮겨 Vortex에 의해 5 분간 혼합하여 10,000 × g, 4℃, 1 분간 원심분리하였다. 뜨는 400 μL를 Zymo Spin IV spin filter로 옮겨 7,000 × g에서 1 분간 원심분리하였다.
여액에 1200 μL의 Fungal/Bacterial DNA Binding Buffer를 첨가하여 혼합하여 혼합액 800 μL를 Zymospin IIC Column에 옮기고, 10,000 × g에서 1 분간 원심분리하였다. 남은 혼합액 800 μL를 Zymospin IIC Column에 옮기고, 10,000 × g에서 1 분간 원심분리하였다. Zymospin IIC Column을 새로운 Collection tube에 옮기고 200 μL의 DNA Pre wash Bffer을 추가하여 10,000 × g에서 1 분간 원심분리하였다. 500 μL의 Fungal/Bacterial DNA wash Bffer을 추가하여 10,000 × g에서 1 분간 원심분리하였다. Zymospin IIC Column을 새로운 에펜 튜브에 옮겨 80 μL의 DNA Elution Bffer을 추가하여 1 분 방치하고 10,000 × g에서 30 초간 원심 분리하여 여과액을 주형 DNA로 하였다.
2. PCR 에 의한 핵산 증폭
PCR은 TAKARA 사 PrimeSTAR HS DNA Polymerase를 이용하였다. 먼저 PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μL) 0.2 μL, 5 × PrimeSTAR Buffer (Mg2 + plus) 4 μL, dNTP Mixture (각 2.5 mM) 1.6 μL, 주형 DNA 0.1ng, 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 (10 pmol/μL) 각 0.4 μL를 멸균 수 20 μL에 메스업했다.
하기 PCR 프라이머를 준비, 사용했다.
·ITS1F : 5'- GTAACAAGGT (T/C) TCCGT -3’[서열번호 119]
·ITS1R : 5'- CGTTCTTCATCGATG -3’[서열번호 120]
PCR 반응은 "유전자 분석에 의한 미생물의 신속 동정 법”(일본 약전 참고 자료)에 준하여 실시했다.
PCR은 Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems)를 이용하여 94℃에서 1 분간 유지한 후 94℃에서 30 초, 55℃에서 1 분, 72℃에서 1 분의 반응을 30 사이클 반복 72℃에서 5 분간 유지의 조건으로 반응시켰다.
3. PCR 산물의 agarose gel 전기 영동에 의한 판정
실시예 1과 동일한 방법으로 실시했다.
4. 금 콜로이드 입자 표지 캡처 올리고뉴클레오티드의 준비
실시예 2와 동일한 방법으로 실시했다.
조제한 캡처 올리고뉴클레오티드의 배열은 다음과 같았다.
·ITS1 검출용 : 5'- AGGTGAACCTGCGGAAGGAT -3’[서열번호 121]
5. BSA 결합 디텍션 올리고뉴클레오티드의 준비
실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
조제한 BSA와 결합시키는 디텍션 올리고뉴클레오티드의 배열은 다음과 같았다.
·CA 핵산 검출용 : 5'- TTGGCGGTGGGCCCAGCCTG -3’[서열번호 122]
·CG 핵산 검출용 : 5'- CACACGACTCGACACTTTCT -3’[서열번호 123]
·CK 핵산 검출용 : 5'- CTACACTGCGTGAGCGGAAC -3’[서열번호 124]
·CP 핵산 검출용 : 5'- TGGTAGGCCTTCTATATGGG -3’[서열번호 125]
·CT 핵산 검출용 : 5'- TCTTTGGTGGCGGGAGCAAT -3’[서열번호 126]
6. 핵산 크로마토그래피에 사용되는 테스트 스트립의 준비
실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
상기에서 곰팡이마다 조제한 BSA 결합 디텍션 올리고뉴클레오티드를 막에 고정화, 5mm 폭으로 절단하여 핵산 크로마토그래피에 사용되는 테스트 스트립으로 하였다(도 5-1).
7. 마스크 올리고뉴클레오티드의 준비
상기에서 조제한 캡처 올리고뉴클레오티드가 혼성화하는 곰팡이 게놈 핵산의 영역을 사이에 두고 위치한 5’ 측 및 3’ 측의 각각의 영역에 혼성화한 한 쌍의 마스크 올리고뉴클레오티드를 곰팡이마다 준비했다.
마찬가지로, 상기에서 조제한 디텍션 올리고뉴클레오티드가 혼성화하는 곰팡이 게놈 핵산의 영역을 사이에 두고 위치한 5’ 측 및 3’ 측의 각각의 영역에 혼성화한 한 쌍의 마스크 올리고뉴클레오티드를 곰팡이 당 준비했다.
조제한 마스크 올리고뉴클레오티드의 배열은 다음과 같다.
·CA 핵산 검출용 : 5'- GTAACAAGGT (T/C) TCCG -3’[서열번호 119]
(상기 올리고뉴클레오티드 ITS1F와 동일한 배열)
·CA 핵산 검출용 (CAA2) : 5'- CATTACTGATTTGCTTAATTGCAC -3’[서열번호 127]
·CA 핵산 검출용 : 5'- GTTTTTCTTTGAAACAAACTTGCT -3’[서열번호 128]
·CA 핵산 검출용 : 5'- CCGCCAGAGGTCTAAACTTAC -3’[서열번호 129]
·CG 핵산 검출용 : 5'- GTAACAAGGT (T/C) TCCG -3’[서열번호 119]
(상기 올리고뉴클레오티드 ITS1F와 동일한 배열)
·CG 핵산 검출용 : 5'- CATTACTGATTTGCTTAATTGCAC -3’[서열번호 127]
(상기 올리고뉴클레오티드 CAA2와 동일한 배열)
·CG 핵산 검출용 : 5'- TTCCAAAGGAGGTGTTTTAT -3’[서열번호 130]
·CG 핵산 검출용 : 5'- AATTACTACACACAGTGGAGTTTAC -3’[서열번호 131]
·CK 핵산 검출용 : 5'- GTAACAAGGT (T/C) TCCG -3’[서열번호 119]
(상기 올리고뉴클레오티드 ITS1F와 동일한 배열)
·CK 핵산 검출용 : 5'- CATTACTGATTTGCTTAATTGCAC -3’[서열번호 127]
(상기 올리고뉴클레오티드 CAA2와 동일한 배열)
·CK 핵산 검출용 : 5'- GAAAACAACAACACCTAAAATG -3’[서열번호 132]
·CP 핵산 검출용 : 5'- GTAACAAGGT (T/C) TCCG -3 [서열번호 119]
(상기 올리고뉴클레오티드 ITS1F와 동일한 배열)
·CP 핵산 검출용 : 5'- CATTACAGAATGAAAAGTGCTTAAC -3 [서열번호 133]
·CP 핵산 검출용 : 5'- TCTTTTTTTGAAAACTTTGCTT -3’[서열번호 134]
·CP 핵산 검출용 : 5'- GCCTGCCAGAGATTAAACTC -3’[서열번호 135]
·CT 핵산 검출용 : 5'- GTAACAAGGT (T/C) TCCG -3 [서열번호 119]
(상기 올리고뉴클레오티드 ITS1F와 동일한 배열)
·CT 핵산 검출용 : 5'- CATTACTGATTTGCTTAATTGCAC -3’[서열번호 127]
(상기 올리고뉴클레오티드 CAA2와 동일한 배열)
·CT 핵산 검출용 : 5'- CACATGTGTTTTTTATTGAACAAATT -3’[서열번호 136]
·CT 핵산 검출용 : 5'- CCTACCGCCAGAGGTTATAA -3’[서열번호 137]
8. 핵산 크로마토그래피에 의한 핵산의 검출
핵산 크로마토그래피는 상기에서 곰팡이마다 조제한 테스트 스트립을 사용하였다. 테스트 라인은 상기에서 조제한 디텍션 올리고뉴클레오티드가 BSA를 통해 고정화되어 있다.
상기에서 제조한 각 곰팡이에서 유래한 게놈 핵산의 PCR 산물의 용액 1.25 μL에 각각 4 μM의 마스크 용 올리고뉴클레오티드를 1 μL 첨가하여 핵산 크로마토그래피 용 전개 버퍼 (20 % Formamide, 1 × SSC, 0.1 % BSA, 1 mM EDTA, 0.5M 구아니딘 염산염)을 30 μL, TE를 추가 전량을 65 μL로 하고 95℃에서 5 분간 처리한 후 4℃에서 급냉했다. 그 후, 용액에 상기에서 제조된 금 콜로이드 입자 표지 캡처 올리고뉴클레오티드를 5 μL 첨가하였다. 이 용액에 테스트 스트립을 적셔 핵산 크로마토그래피를 실시했다.
9. 결과
각 곰팡이 각각의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR 산물의 agarose gel 전기 영동에 의한 검출 결과를 도 17에, 또한 핵산 크로마토그래피의 결과를 도 18에 나타내었다.
그 결과, 모든 곰팡이에 대해 목적하는 게놈 DNA가 PCR로 증폭되어 그 PCR 산물 (표적 핵산)을 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용한 핵산 크로마토그래피에 의해 고감도에서 특이적으로 검출이 가능했다.
본 발명의 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용한 핵산 크로마토그래피에 따른 핵산을 검출, 정량하는 방법 및 상기 방법에 이용하기 위한 장치 및 키트는 진핵 생물, 원핵 생물, 바이러스, 세균 및 미생물을 비롯한 다양한 생물에서 유래하는 모든 핵산(예를 들어, 천연 핵산, 게놈 DNA, cDNA, RNA, PCR 등으로 증폭된 핵산 등)을 간편, 또한 고감도로 검출, 정량할 수 있다.
그 결과, 본 발명의 방법, 장치 및/또는 키트를 이용하면, 인간을 비롯한 포유 동물, 숙주 생물, 식물, 식품 혹은 음료 등의 세균이나 바이러스에 의한 감염의 유무와 정도, 바이러스나 세균에 의한 감염 또는 유전자의 돌연변이가 원인으로 의심되는 다양한 질환 (감염, 암, 대사성 질환, 유전 질환 등)의 원인 및 유전자 다양성에 의한 다양한 유전적 특성을 간편하면서도 단시간에 높은 정밀도를 가지고 특정할 수 있게 된다.
<110> FUSO PHARMACEUTICAL INDUSTRIES, LTD. <120> Method for detecting or quantifying nucleic acids using mask oligonucleotides and devices therefor <130> 2016FPI-07-005_JP <150> JP 2014-020183 <151> 2014-02-05 <150> PCT/JP 2015/052501 <151> 2015-01-29 <160> 137 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 1 ggattcaatg tcacatgagc gtgataaaat 30 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 2 aaagctcaag gatatgcgat tactgaagca g 31 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 3 tcagaggtca tggaaaatct tcacgaac 28 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 4 attgcctcag atttattaaa gcctgctaat tcttc 35 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 5 aagatcggcg tattcatcgg cgtc 24 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 6 cccaggtcct gatagaccag ttgataccc 29 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 7 gaagacaacg atttatgttt acgctttggc a 31 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 8 aattcggcgt atcagccatt ttcattt 27 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 9 gtcaggtaag gctaatttca ttaccagcaa agg 33 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 10 cggtcagcca tagggtaaat gaccac 26 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 11 gtttctggca cggcgtcagc 20 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 12 tgtgtgtcta atcagttccg caggg 25 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 13 cagccatcag gttgagcatc attaatctt 29 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 14 cagccggaga aatagagaaa tcttatgaat cat 33 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 15 cggtcaacga gatgtggtct 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 16 ggctcatctt ctagtggtgc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 17 ggccaaaagt gaagacattg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 18 ccatcttttc caggcgatgc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 19 acaaatgggg ctggaggttc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 20 caaccctcag gacaccactt 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 21 caactcggga tcggcaaaca 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 22 cgacagtacg cagccacgat 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 23 gccgtgctca atacagctcc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 24 ggacatgata tggggggcat 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 25 cgagacggcc ccagacctat 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 26 aagcaggcta tcggattctc 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 27 gtggctgacc ttaatgaacc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 28 atcactggct ggcaaggcac 20 <210> 29 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 29 cagtaatata atagtcttta tctacacttt ctaat 35 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 30 acttgtagag acacccgtta atact 25 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 31 taaagcgtcg cttagaaata atc 23 <210> 32 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 32 taaatcttca agtattcgtg tagatg 26 <210> 33 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 33 taaatatcga ttctgcacat atttta 26 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 34 cattgcgagt gaatttactg 20 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 35 gtgattacat tgacaattgt ttc 23 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 36 caaatggttt caacaaatta atg 23 <210> 37 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 37 agcctagtcc agcggg 16 <210> 38 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 38 ttgtcattac ggggcgt 17 <210> 39 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 39 gacctcaggc cgttaacat 19 <210> 40 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 40 cgtgcatcgg gctgtg 16 <210> 41 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 41 gaagacaacg atttatgttt acgctttggc a 31 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 42 tatacgcctt ttgaaacggt 20 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 43 aatcaatggg gaaatttttt a 21 <210> 44 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 44 ttttaatgag tcaaagatta gcgg 24 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 45 taacagtaag ctggtcatgg 20 <210> 46 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 46 cagtacaaca cgacgattta tg 22 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 47 gatcgctatc gaggggtatt 20 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 48 ttatgagtgc taaacaagct aaa 23 <210> 49 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 49 ggtcaacacc ccacagga 18 <210> 50 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 50 aaatcattca aaagaatgct gaac 24 <210> 51 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 51 tggcggtatg gatggg 16 <210> 52 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 52 tgctgcatac gctctctga 19 <210> 53 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 53 cgcggccctt tttt 14 <210> 54 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 54 atattgccat tgtttatttt tc 22 <210> 55 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 55 ctatttttag cagcttgttc aa 22 <210> 56 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 56 ctcatttacc aggaataatc ttac 24 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 57 gtgccgctca ccacaccatt 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 58 tcacgacgac gaacgtacgc 20 <210> 59 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 59 accagtgggg agatcacg 18 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 60 gataaactcg ttaccggtca 20 <210> 61 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 61 agaacagcct gcaggaga 18 <210> 62 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 62 aactacgtat ggctgagcc 19 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 63 tttagccttt gcaactccta 20 <210> 64 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 64 aaggggtagc agctgttaa 19 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 65 tagggatatg cacgcaaaag 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 66 gcttaataca gttacgatag 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 67 aagcataagt tttgcaaacg 20 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 68 gtttggattt tcaaatgttc c 21 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 69 ccttgcaccc tagatcctat 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 70 tcctgactct agtatcgcca 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 71 tcagatcgct cctagcggat 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 72 agcgccttta gggatacctc 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 73 taagccctag gggcgatgat 20 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 74 acgcaatgca aacaccggaa 20 <210> 75 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 75 gcttagaaac gggaattttt tta 23 <210> 76 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 76 aaaagatcct attgatcaaa attgg 25 <210> 77 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 77 aaaacgcttt ggaatagcc 19 <210> 78 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 78 tttttttgct gaagtaaatg aac 23 <210> 79 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 79 gccttttggc tatgttcagt tta 23 <210> 80 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 80 atatgcctag ctgttttaag tgaa 24 <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 81 caatcaatgc atgagcactt t 21 <210> 82 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 82 tagaaaatcg ctttggttta gg 22 <210> 83 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 83 cataaccgac gcttttcaaa t 21 <210> 84 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 84 ttcctataaa tataaagcga ttttcag 27 <210> 85 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 85 ccgacgtaaa aatgtgcct 19 <210> 86 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 86 ttttagcact aaaaaactgc aag 23 <210> 87 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 87 cgcattttta ttaatgcttt cg 22 <210> 88 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 88 gggctggcag agagagtg 18 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 89 tcgtgggaac acaaccagtc 20 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 90 gcctgataaa cttccgcctc 20 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 91 caaccagttg atgatggatc 20 <210> 92 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 92 gccactctct ctgccagc 18 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 93 cgtgaagatt ttccatgacc 20 <210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 94 cataaacccg aggaataacg 20 <210> 95 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 95 ctaaagcgtc gcttagaaa 19 <210> 96 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 96 cttcaagtat tcgtgtagat gc 22 <210> 97 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 97 cgctaaagcg tcgctt 16 <210> 98 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 98 agtattcgtg tagatgcat 19 <210> 99 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 99 aaacagtaat ataatagtct ttatctacac ttt 33 <210> 100 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 100 tagagacacc cgttaatact aaatg 25 <210> 101 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 101 tcttctaaaa cagtaatata atagtcttta tctac 35 <210> 102 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 102 acacccgtta atactaaatg att 23 <210> 103 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 103 ggttggccaa tctactccca gg 22 <210> 104 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 104 tggtctcctt aaacctgtct tg 22 <210> 105 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 105 gtcaggtaag gctaatttca ttaccagcaa agg 33 <210> 106 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 106 cggtcagcca tagggtaaat gaccac 26 <210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 107 atggtgcacc tgactcctga 20 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 108 agcaacctca aacagacacc 20 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 109 ggagaagtct gccgttactg 20 <210> 110 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 110 ggtcagccat agggtaaatg ac 22 <210> 111 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 111 ttatgatgtc agaggtcatg g 21 <210> 112 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 112 gtttgatcct ggctca 16 <210> 113 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 113 taccagggta tctaatcc 18 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 114 gcagcagtag ggaatcttcg 20 <210> 115 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 115 cacactggaa ctgagacacg 20 <210> 116 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 116 tggtctgaga ggatgatcag t 21 <210> 117 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 117 gtccagactc ctacgggag 19 <210> 118 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 118 acaatgggcg aaagcct 17 <210> 119 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 119 gtaacaaggt ytccgt 16 <210> 120 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 120 cgttcttcat cgatg 15 <210> 121 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 121 aggtgaacct gcggaaggat 20 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 122 ttggcggtgg gcccagcctg 20 <210> 123 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 123 cacacgactc gacactttct 20 <210> 124 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 124 ctacactgcg tgagcggaac 20 <210> 125 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 125 tggtaggcct tctatatggg 20 <210> 126 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 126 tctttggtgg cgggagcaat 20 <210> 127 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 127 cattactgat ttgcttaatt gcac 24 <210> 128 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 128 gtttttcttt gaaacaaact tgct 24 <210> 129 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 129 ccgccagagg tctaaactta c 21 <210> 130 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 130 ttccaaagga ggtgttttat 20 <210> 131 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 131 aattactaca cacagtggag tttac 25 <210> 132 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 132 gaaaacaaca acacctaaaa tg 22 <210> 133 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 133 cattacagaa tgaaaagtgc ttaac 25 <210> 134 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 134 tctttttttg aaaactttgc tt 22 <210> 135 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 135 gcctgccaga gattaaactc 20 <210> 136 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 136 cacatgtgtt ttttattgaa caaatt 26 <210> 137 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 137 cctaccgcca gaggttataa 20

Claims (68)

  1. 하기의 단계를 포함하는, 시료 중에 포함되는 1 종류 또는 서로 다른 2 개 이상의 표적 핵산을 크로마토그래피로 검출 또는 정량하는 방법:
    (a) 영역 R1, 영역 R1을 사이에 두고 위치하는 각각의 영역 M1 및 영역 M2, 영역 R1과는 다른 영역 R2, 그리고 영역 R2를 사이에 두고 위치하는 각각의 영역 M3 및 영역 M4를 포함하는 표적 핵산 N의 단일 가닥 영역(single-stranded region) 중, 영역 M1, 영역 M2, 영역 M3 및 영역 M4의 적어도 하나의 영역에 대한 각각의 영역에 상보적인 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 M1', 올리고뉴클레오티드 M2', 올리고뉴클레오티드 M3' 및 올리고뉴클레오티드 M4'의 적어도 하나의 혼성화(hybridizing) 단계;
    (b) 영역 R1에 표식(label) L1로 표지화된 상기 영역에 상보적인 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 R1'의 혼성화 단계;
    (c) 영역 R2에, 상기 영역에 상보적인 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 R2' 또는 이의 말단에 앵커(anchor) A를 갖는 올리고뉴클레오티드 R2'의 혼성화 단계; 및
    (d) 상기 (a) 내지 (c)를 거친 핵산 혼성 형성의 표식 L1을 지표로 하는 검출 또는 정량하는 단계; 및
    (e) 필요에 따라, 시료 중 서로 다른 2 종류 이상의 표적 핵산 N이 포함된 경우에는 각각의 표적 핵산 N의 검출 또는 정량을 위해, 각각의 표적 핵산 N에 대한 상기의 (a) 내지 (d)를 수행하는 단계.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 (a)의 혼성화는 하기 중 어느 하나를 포함하는 것인 방법:
    (i) 영역 M1 및 영역 M2는 적어도 하나의 영역에 대한, 올리고뉴클레오티드 M1' 및 올리고뉴클레오티드 M2' 각각의 적어도 하나의 혼성화;
    (ii) 영역 M3 및 영역 M4의 적어도 하나의 영역에 대한, 올리고뉴클레오티드 M3' 및 올리고뉴클레오티드 M4' 각각의 적어도 하나의 혼성화;
    (iii) 영역 M1 및 영역 M2는 적어도 하나의 영역에 대한, 올리고뉴클레오티드 M1' 및 올리고뉴클레오티드 M2' 각각의 적어도 하나의 혼성화, 및 영역 M3 및 영역 M4의 적어도 하나의 영역에 대한, 올리고뉴클레오티드 M3' 및 올리고뉴클레오티드 M4' 각각의 적어도 하나의 혼성화;
    (iv) 영역 M1 및 영역 M2의 두 영역에 대한, 올리고뉴클레오티드 M1' 및 올리고뉴클레오티드 M2' 각각의 혼성화;
    (v) 영역 M3 및 영역 M4의 두 영역에 대한, 올리고뉴클레오티드 M3' 및 올리고뉴클레오티드 M4' 각각의 혼성화;
    (vi) 영역 M1 및 영역 M3의 두 영역에 대한, 올리고뉴클레오티드 M1' 및 올리고뉴클레오티드 M3' 각각의 혼성화;
    (vii) 영역 M1 및 영역 M4의 두 영역에 대한, 올리고뉴클레오티드 M1' 및 올리고뉴클레오티드 M4' 각각의 혼성화;
    (viii) 영역 M2 및 영역 M3의 두 영역에 대한, 올리고뉴클레오티드 M2' 및 올리고뉴클레오티드 M3' 각각의 혼성화;
    (ix) 영역 M2 및 영역 M4의 두 영역에 대한, 올리고뉴클레오티드 M2' 및 올리고뉴클레오티드 M4' 각각의 혼성화; 또는
    (x) 영역 M1 및 영역 M2의 두 영역에 대한, 올리고뉴클레오티드 M1' 및 올리고뉴클레오티드 M2' 각각의 혼성화, 및 영역 M3 및 영역 M4의 두 영역에 대한, 올리고뉴클레오티드 M3' 및 올리고뉴클레오티드 M4' 각각의 혼성화.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 크로마토그래피는 상기 (a) 및 (b), 또는 (a) 내지 (c)를 거쳐 형성된 핵산 하이브리드를 포착하여, 검출 또는 정량하기 위한 적어도 하나의 감지 영역(detection zone)을 구비하는 전개 요소(development element)에 있어서, 상기 전개 요소의 모세관 현상에 따라 실시되는 것인 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 올리고뉴클레오티드 R2'가 고정화되고, 또한,
    상기 전개 요소의 일부에 하기 혼합물을 적용하는 것인 방법:
    (i) 표적 핵산(target nucleic acid) N을 포함한 시료;
    (ii) 상기 올리고뉴클레오티드 M1', 상기 올리고뉴클레오티드 M2', 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4'의 적어도 하나; 및
    (iii) 표식 L1으로 표지된 상기 올리고뉴클레오티드 R1' .
  5. 제 3항에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 앵커 A와 결합할 수 있는 수용체(acceptor) A'가 고정화되고, 또한,
    상기 전개 요소의 일부에 하기의 혼합물을 적용하는 것인 방법:
    (i) 표적 핵산 N을 포함한 시료;
    (ii) 상기 올리고뉴클레오티드 M1', 상기 올리고뉴클레오티드 M2', 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나;
    (iii) 표식 L1으로 표지된 상기 올리고뉴클레오티드 R1'; 및
    (iv) 말단에 앵커 A를 포함하는 상기 올리고뉴클레오티드 R2'.
  6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 크로마토그래피는 하기를 갖추는 장치를 이용하여 전개 요소의 모세관 현상에 따라 실시되는 것인 방법:
    (i) 상기 (a) 및 (b), 또는 (a) 내지 (c)를 거쳐 형성된 핵산 하이브리드를 포착하여, 검출 또는 정량하기 위한 적어도 하나의 감지 영역을 구비한 전개 요소; 및
    (ii) 상기 전개 요소에 접촉하여 구비된 적어도 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료를 적용하는 적용 영역(application zone).
  7. 제 6항에 있어서, 상기 장치에
    (iii) 상기 적용 영역 및 상기 전개 요소 모두에 접촉하여 제공되는 목표로 하는 올리고뉴클레오티드를 봉입하는 봉입 영역(enclosing zone),
    을 추가적으로 갖춘 것인 방법.
  8. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 올리고뉴클레오티드 R2' 가 고정화되어 있으며,
    상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에
    (i) 상기 올리고뉴클레오티드 M1', 상기 올리고뉴클레오티드 M2', 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나; 및
    (ii) 상기 표식 L1으로 표지된 올리고뉴클레오티드 R1',
    이 봉입되어 있으며, 또한,
    상기 적용 영역에 상기 목표 핵산 N을 포함한 시료를 적용하는 것인 방법.
  9. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 올리고뉴클레오티드 R2'가 고정화되어 있고,
    상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에 상기 표식 L1으로 표지된 올리고뉴클레오티드 R1'이 봉입되어 있으며, 또한,
    상기 적용 영역에
    (i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료; 및
    (ii) 상기 올리고뉴클레오티드 M1', 상기 올리고뉴클레오티드 M2', 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나,
    의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
  10. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 올리고뉴클레오티드 R2' 가 고정화되어 있고,
    상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에 상기 올리고뉴클레오티드 M1' , 상기 올리고뉴클레오티드 M2', 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나가 봉입되어 있으며, 또한,
    상기 적용 영역에
    (i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료; 및
    (ii) 상기 표식 L1로 표지된 올리고뉴클레오티드 R1'
    의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
  11. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 올리고뉴클레오티드 R2' 가 고정화되고, 또한
    상기 적용 영역에
    (i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료;
    (ii) 상기 올리고뉴클레오티드 M1' , 상기 올리고뉴클레오티드 M2', 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나; 및
    (iii) 상기 표식 L1으로 표지된 올리고뉴클레오티드 R1' ,
    의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
  12. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 앵커 A와 결합할 수 있는 수용체 A' 가 고정화되어있고,
    상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에
    (i) 상기 올리고뉴클레오티드 M1', 상기 올리고뉴클레오티드 M2', 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나;
    (ii) 표식 L1으로 표지된 상기 올리고뉴클레오티드 R1'; 및
    (iii) 말단에 앵커 A를 갖는 상기 올리고뉴클레오티드 R2',
    이 봉입되어 있으며, 또한,
    상기 적용 영역에 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료를 적용하는 것인 방법.
  13. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 앵커 A와 결합할 수 있는 수용체 A'가 고정화되어 있고,
    상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에
    (i) 표식 L1으로 표지된 상기 올리고뉴클레오티드 R1' ; 및
    (ii) 말단에 앵커 A를 갖는 상기 올리고뉴클레오티드 R2' ,
    이 봉입되어 있으며, 또한
    상기 적용 영역에
    (i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료; 및
    (ii) 상기 올리고뉴클레오티드 M1', 상기 올리고뉴클레오티드 M2', 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나;
    의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
  14. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 앵커 A와 결합할 수 있는 수용체 A'가 고정화되어 있고,
    상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에 말단에 앵커 A를 갖는 상기 올리고뉴클레오티드 R2'가 봉입되어 있으며, 또한
    상기 적용 영역에
    (i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료;
    (ii) 상기 올리고뉴클레오티드 M1', 상기 올리고뉴클레오티드 M2', 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나; 및
    (iii) 표식 L1으로 표지된 상기 올리고뉴클레오티드 R1',
    의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
  15. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 앵커 A와 결합할 수 있는 수용체 A'가 고정화되어 있고,
    상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에
    (i) 상기 올리고뉴클레오티드 M1', 상기 올리고뉴클레오티드 M2', 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나; 및
    (ii) 말단에 앵커 A를 갖는 상기 올리고뉴클레오티드 R2',
    이 봉입되어 있으며, 또한
    상기 적용 영역에
    (i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료; 및
    (ii) 표식 L1으로 표지된 상기 올리고뉴클레오티드 R1',
    의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
  16. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 앵커 A와 결합할 수 있는 수용체 A'가 고정화되어 있고,
    상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에 상기 올리고뉴클레오티드 M1’, 상기 올리고뉴클레오티드 M2', 상기 올리고뉴클레오티드 M3’ 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나가 봉입되어 있으며, 또한
    상기 적용 영역에
    (i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료;
    (ii) 표식 L1으로 표지된 상기 올리고뉴클레오티드 R1’; 및
    (iii) 말단에 앵커 A를 갖는 상기 올리고뉴클레오티드 R2’
    의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
  17. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 앵커 A와 결합할 수 있는 수용체 A'가 고정화되어 있고,
    상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에
    (i) 상기 올리고뉴클레오티드 M1', 상기 올리고뉴클레오티드 M2', 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나; 및
    (ii) 표식 L1으로 표지된 상기 올리고뉴클레오티드 R1'
    이 봉입되어 있으며, 또한
    상기 적용 영역에
    (i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료; 및
    (ii) 말단에 앵커 A를 갖는 상기 올리고뉴클레오티드 R2',
    의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
  18. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 앵커 A와 결합할 수 있는 수용체 A'가 고정화되어 있고
    상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에 상기 표식 L1으로 표지된 올리고뉴클레오티드 R1'가 봉입되어 있으며, 또한
    상기 적용 영역에
    (i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료;
    (ii) 상기 올리고뉴클레오티드 M1', 상기 올리고뉴클레오티드 M2', 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나; 및
    (iii) 말단에 앵커 A를 갖는 상기 올리고뉴클레오티드 R2',
    의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
  19. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 앵커 A와 결합할 수 있는 수용체 A'가 고정화되어 있고, 또한
    상기 적용 영역에
    (i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료;
    (ii) 상기 올리고뉴클레오티드 M1', 상기 올리고뉴클레오티드 M2', 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나;
    (iii) 표식 L1으로 표지된 상기 올리고뉴클레오티드 R1', 및
    (iv) 말단에 앵커 A를 갖는 상기 올리고뉴클레오티드 R2',
    의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
  20. 제 1항 내지 제 3항, 제 5항 내지 제 7항 및 제 12항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 앵커 A가 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide), 비오틴(biotin), 항체(antibody), 단백질(protein) 또는 당쇄(sugar chain)이며, 상기 수용체 A’가 올리고뉴클레오티드, 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 항체 또는 단백질인 것인 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 앵커 A가 비오틴이며, 상기 수용체 A’가 아비딘 또는 스트렙타비딘인 방법.
  22. 제 20항에 있어서, 상기 수용체 A'가 항체인 방법.
  23. 제 3항 내지 22항 중 어느 한 항에 있어서, 시료 중에 다른 2 종류 이상의 표적 핵산 N이 포함된 경우, 상기 전개 요소가 (i) 각각의 표적 핵산 N에 혼성화하는 상기 올리고뉴클레오티드 R2’의 각각이 고정화된 2 개 이상의 감지 영역, 또는 (ii) 각각의 표적 핵산 N에 혼성화하는 각각 다른 앵커 A를 그 말단에 갖는 올리고뉴클레오티드 R2’와 각각 결합할 수 있는 각각 다른 수용체 A'가 고정화된 2 개 이상의 감지 영역을 구비하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  24. 제 6항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장치가 상기 전개 요소와 접촉하여 갖추어진, 상기 감지 영역을 넘어 확장된 시료를 흡수하는 흡수 영역(absorption zone)을 추가적으로 구비한 것인 방법.
  25. 제 1항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 표식 L1은 금속 콜로이드 입자(colloidal metal particle), 라텍스 입자(latex particle), 착색 리포좀(pigmented liposome) 또는 효소(enzyme)인 방법.
  26. 제 25항에 있어서, 금속 콜로이드 입자는 금 콜로이드 입자(colloidal gold particle), 백금 콜로이드 입자(colloidal platinum particle), 백금-금 콜로이드 입자(colloidal platinum-gold particle), 팔라듐 입자(palladium particle), 은 콜로이드 입자(colloidal silver particle), 로듐 콜로이드 입자(colloidal rhodium particle), 루테늄 콜로이드 입자(colloidal ruthenium particle) 또는 이리듐 콜로이드 입자(colloidal iridium particle)인 방법.
  27. 제 25항에 있어서, 효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 포도당 산화 효소(glucose oxidase), 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase) 또는 베타-갈라토시다아제(β-galactosidase)인 방법.
  28. 제 3항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전개 요소 또는 상기 장치가 불침습성 고체 재료(moisture-impermeable solid material)인 케이스 내부에 배치된 것인 방법.
  29. 하기를 포함하는, 시료 중에 포함되는 1 종류 또는 서로 다른 2 개 이상의 표적 핵산을 크로마토그래피에 의해 검출 또는 정량하는 방법:
    (a) 영역 R1, 및 영역 R1을 사이에 두고 위치하는 각각 영역 M1 및 영역 M2를 포함하는 표식 L2로 표지된 표적 핵산 N의 단일 가닥 영역 중 영역 M1 및 영역 M2는 적어도 하나에 대한, 각각의 영역에 상보적인 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 M1' 및 올리고뉴클레오티드 M2' 중 적어도 하나의 혼성화 단계;
    (b) 영역 R1에 표식 L1로 표지된, 상기 영역에 상보적인 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 R1'의 혼성화 단계; 및
    (c) 상기 (a) 및 (b)를 거쳐 형성된 핵산 하이브리드의, 상기 표식 L2 및 상기 표식 L2에 결합하는 물질과의 결합을 통해 포착하는 단계, 및 상기 표식 L1을 지표로 하는 검출 또는 정량 단계; 및
    (d) 필요에 따라서, 시료 중 다른 2 종류 이상의 표적 핵산 N이 포함된 경우에는 각각의 표적 핵산 N의 검출 또는 정량을 위하여, 각각의 표적 핵산 N에 대한 상기의 (a) 내지 (c)를 수행하는 단계.
  30. 제 29항에 있어서, 상기 (a)의 혼성화는 영역 M1 및 영역 M2의 두 영역에 대하여 올리고뉴클레오티드 M1' 및 올리고뉴클레오티드 M2' 각각의 혼성화를 포함하는 것인 방법.
  31. 제 29항 또는 제 30항에 있어서, 상기 크로마토그래피는 전개 요소의 모세관 현상에 따라 실시되는 것으로, 상기 전개요소는 상기 (a) 및 (b)를 거쳐 형성된 핵산 하이브리드를 포착하여, 검출 또는 정량하기 위한 적어도 하나의 감지 영역을 갖춘 것인 방법.
  32. 제 31항에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 표식 L2에 결합하는 물질이 고정화되고, 또한
    상기 전개 요소의 일부에 하기의 혼합물을 적용하는 것인 방법:
    (i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료;
    (ii) 상기 올리고뉴클레오티드 M1' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M2' 중 적어도 하나; 및
    (iii) 상기 표식 L1으로 표지된 올리고뉴클레오티드 R1'.
  33. 제 29항 또는 제 30항에 있어서, 상기 크로마토그래피가 하기를 갖춘 장치를 이용하여 전개 요소의 모세관 현상에 따라 실시되는 것인 방법:
    (i) 상기 (a) 및 (b)를 거쳐 형성된 핵산 하이브리드를 포착하여, 검출 또는 정량하기 위한 적어도 하나의 감지 영역을 갖춘 전개 요소; 및
    (ii) 상기 전개 요소에 접촉하여 구비된 적어도 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료를 적용하는 적용 영역.
  34. 제 33항에 있어서, 상기 장치에
    (iii) 상기 적용 영역 및 상기 전개 요소 모두에 접촉하여 구비된, 목표로 하는 올리고뉴클레오티드를 봉입하기 위한 봉입 영역,
    을 추가적으로 갖춘 방법.
  35. 제 33항 또는 제 34항에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 표식 L2에 결합하는 물질이 고정화되어있고,
    상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에
    (i) 상기 올리고뉴클레오티드 M1' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M2' 중 적어도 하나; 및
    (ii) 상기 표식 L1으로 표지된 올리고뉴클레오티드 R1',
    이 봉입되어 있으며, 또한
    상기 적용 영역에 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료를 적용하는 것인 방법.
  36. 제 33항 또는 제 34항에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 표식 L2에 결합하는 물질이 고정화되어있고,
    상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에 상기 표식 L1으로 표지된 올리고뉴클레오티드 R1'가 봉입되어 있으며, 또한
    상기 적용 영역에
    (i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료; 및
    (ii) 상기 올리고뉴클레오티드 M1' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M2' 중 적어도 하나,
    의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
  37. 제 33항 또는 제 34항에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 표식 L2에 결합하는 물질이 고정화되어있고,
    상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에 상기 올리고뉴클레오티드 M1' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M2' 중 적어도 하나가 봉입되어 있으며, 또한
    상기 적용 영역에
    (i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료; 및
    (ii) 상기 표식 L1으로 표지된 올리고뉴클레오티드 R1',
    의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
  38. 제 33항 또는 제 34항에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 표식 L2에 결합하는 물질이 고정화되어있고, 또한
    상기 적용 영역에
    (i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료;
    (ii) 상기 올리고뉴클레오티드 M1' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M2' 중 적어도 하나; 및
    (iii) 상기 표식 L1으로 표지된 올리고뉴클레오티드 R1',
    의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
  39. 제 31항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 있어서, 시료 중에 서로 다른 2 종류 이상의 표적 핵산 N이 포함된 경우, 각각의 표적 핵산 N은 각각 서로 다른 표식 L2로 표지되며, 상기 전개 요소가 상기 각각의 표식 L2에 결합하는 서로 다른 물질이 각각 고정된 2 개 이상의 감지 영역을 구비하는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 하기를 포함하는, 시료 중에 포함되는 1 종류 또는 서로 다른 2 개 이상의 표적 핵산을 검출 또는 정량하는 방법:
    (a) 영역 R2, 및 영역 R2를 사이에 두고 위치하는 영역 M3 및 영역 M4 각각을 포함하는 표식 L2로 표지된 표적 핵산 N의 단일 가닥 영역 중 영역 M3 및 영역 M4 중 적어도 하나에 대한, 각각의 영역에 상보적인 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 M3' 및 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나의 혼성화 단계;
    (b) 영역 R2에, 상기 영역에 상보적인 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 R2' 또는 말단에 앵커 A를 갖는 올리고뉴클레오티드 R2'의 혼성화 단계; 및
    (c) 상기 (a) 및 (b)를 거쳐 형성된 핵산 하이브리드의, 상기 표식 L2를 지표로 하는 검출 또는 정량 단계; 및
    (d) 필요에 따라 시료 중 서로 다른 2 종류 이상의 표적 핵산 N이 포함된 경우, 각각의 표적 핵산 N의 검출 또는 정량을 위하여 각각의 표적 핵산 N에 대한 상기의 (a) 내지 (c)를 수행하는 단계.
  41. 제 40항에 있어서, 상기 (a)의 혼성화는 영역 M3 및 영역 M4의 두 영역에 대하여 올리고뉴클레오티드 M3' 및 올리고뉴클레오티드 M4' 각각의 혼성화를 포함하는 것인 방법.
  42. 제 40항 또는 제 41항에 있어서, 상기 검출 또는 정량이
    (A) 상기 (a) 및 (b)를 거쳐 형성된 핵산 하이브리드를 포착하여, 검출 또는 정량하기 위한 적어도 하나의 감지 영역을 갖춘 전개 요소에서 모세관 현상을 이용하는 크로마토그래피; 또는
    (B)
    (i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료;
    (ii) 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나; 및
    (iii) 상기 말단에 앵커 A를 갖는 올리고뉴클레오티드 R2',
    의 혼합물을, 그 표면에 상기 앵커 A와 결합할 수 있는 수용체 A'가 고정된 양을 갖는 고체 지지체에 적용하는 단계, 및
    상기 앵커 A와 상기 수용체 A'의 결합을 통해 포착된 상기 (a) 및 (b)를 거쳐 형성된 핵산 하이브리드의 검출 또는 정량하는 단계,
    에 의해 수행되는 것인 방법.
  43. 제 42항에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 올리고뉴클레오티드 R2’가 고정화되고, 또한
    상기 전개 요소의 일부에 하기 혼합물을 적용하는 방법:
    (i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료; 및
    (ii) 상기 올리고뉴클레오티드 M3’ 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나.
  44. 제 40항 또는 제 41항에 있어서, 상기 검출 또는 정량이 하기를 갖추는 장치를 이용하여, 전개 요소의 모세관 현상을 이용하는 크로마토그래피에 의해 수행되는 방법:
    (i) 상기 (a)와 (b)를 거쳐 형성된 핵산 하이브리드를 포착하여, 검출 또는 정량하기 위한 적어도 하나의 감지 영역을 갖춘 전개 요소; 및
    (ii) 상기 전개 요소에 접촉하여 구비된 적어도 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료를 적용하기 위한 적용 영역.
  45. 제 44항에 있어서, 상기 장치가
    (iii) 상기 적용 영역 및 상기 전개 요소 모두에 접하여 구비된 목표로 하는 올리고뉴클레오티드를 봉입하는 봉입 영역,
    을 추가적으로 갖춘 방법.
  46. 제 44항 또는 제 45항에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 올리고뉴클레오티드 R2'가 고정화되어있고,
    상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나가 봉입되어 있으며, 또한
    상기 적용 영역에 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료를 적용하는 방법.
  47. 제 44항 또는 제 45항에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 올리고뉴클레오티드 R2’가 고정화되고, 또한
    상기 적용 영역에
    (i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료; 및
    (ii) 상기 올리고뉴클레오티드 M3’ 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나,
    의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
  48. 제 44항 또는 제 45항에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 앵커 A와 결합할 수 있는 수용체 A'가 고정화되어 있고,
    상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에
    (i) 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나; 및
    (ii) 말단에 앵커 A를 갖는 상기 올리고뉴클레오티드 R2',
    이 봉입되어 있으며, 또한
    상기 적용 영역에 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료를 적용하는 것인 방법.
  49. 제 44항 또는 제 45항에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 앵커 A와 결합할 수 있는 수용체 A'가 고정화되어 있고
    상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에 말단에 앵커 A를 갖는 상기 올리고뉴클레오티드 R2'가 봉입되어 있으며, 또한
    상기 적용 영역에
    (i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료; 및
    (ii) 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나,
    의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
  50. 제 44항 또는 제 45항에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 앵커 A와 결합할 수 있는 수용체 A'가 고정화되어 있고,
    상기 적용 영역 또는 상기 봉입 영역에 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4' 중 적어도 하나가 봉입되어 있으며, 또한
    상기 적용 영역에
    (i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료; 및
    (ii) 말단에 앵커 A를 갖는 상기 올리고뉴클레오티드 R2',
    의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
  51. 제 44항 또는 제 45항에 있어서, 상기 감지 영역에 상기 앵커 A와 결합할 수 있는 수용체 A'가 고정화되어 있고,
    상기 적용 영역에
    (i) 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료;
    (ii) 상기 올리고뉴클레오티드 M3' 및 상기 올리고뉴클레오티드 M4'의 하나; 및
    (iii) 말단에 앵커 A를 갖는 상기 올리고뉴클레오티드 R2',
    의 혼합물을 적용하는 것인 방법.
  52. 제 48항 내지 제 51항 중 어느 한 항에 있어서, 시료 중에 서로 다른 2 종류 이상의 표적 핵산 N이 포함된 경우, 각각의 표적 핵산 N이 동일한 표식 L2로 표지되며, 상기 전개 요소가 각각의 표적 핵산 N에 혼성화하는 각각 다른 앵커 A를 그 말단에 갖는 올리고뉴클레오티드 R2’와 각각 결합할 수 있는 각각 다른 수용체 A'가 고정된 2 개 이상의 감지 영역을 갖춘 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 48항 내지 제 51항 중 어느 한 항에 있어서, 시료 중에 서로 다른 2 종류 이상의 표적 핵산 N이 포함된 경우에는 각각의 표적 핵산 N은 각각 다른 표식 L2로 표지되는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 29항 내지 제 53항에 있어서, 상기 표식 L2는, 비오틴(biotin), 형광 색소(fluorescent dye), 디곡시게닌(digoxigenin ; DIG), 항체 또는 효소인 것인 방법.
  55. 제 54항에 있어서, 상기 표식 L2가 비오틴이며, 또한 상기 표식 L2에 결합하는 물질은 아비딘 또는 스트렙타비딘인 것인 방법.
  56. 제 29항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표식 L2에 결합하는 물질이 항체 또는 효소로 표지된 항체인 방법.
  57. 제 33항 내지 제 39항 및 제 44항 내지 제 56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장치가, 상기 전개 요소와 접촉하여 구비된, 상기 감지 영역을 넘어 확장된 시료를 흡수하는 흡수 영역을 추가적으로 갖춘 것인 방법.
  58. 제 29항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, 표식 L1은 금속 콜로이드 입자, 라텍스 입자, 착색 리포좀(pigmented liposome) 또는 효소인 것인 방법.
  59. 제 58항에 있어서, 금속 콜로이드 입자가 금 콜로이드 입자, 백금 콜로이드 입자, 백금-금 콜로이드 입자, 팔라듐 입자, 은 콜로이드 입자, 로듐 콜로이드 입자(colloidal rhodium particle), 루테늄 콜로이드 입자(colloidal ruthenium particle) 또는 이리듐 콜로이드 입자(colloidal iridium particle)인 것인 방법.
  60. 제 58항에 있어서, 효소는 퍼옥시다아제, 포도당 산화 효소, 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase) 또는 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase)인 것인 방법.
  61. 제 31항 내지 제 39항 및 제 41항 내지 제 60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전개 요소 또는 상기 장치가 불침습성 고체 재료인 케이스 내부에 배치되어 있는 것인 방법.
  62. 제 1항 내지 제 61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산 N의 단일 가닥 영역이 이중 가닥 핵산(double-stranded nucleic acid)의 변성(denaturing)에 의해 생성되는 것인 방법.
  63. 제 1항 내지 제 62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산 N이 DNA 또는 RNA인 것인 방법.
  64. 제 1항 내지 제 63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산 N은 진핵 생물(eukaryote), 원핵 생물(prokaryote), 세균(bacterium) 또는 바이러스(virus)의 게놈에서 유래한 핵산; 상기 게놈을 제한 효소로 절단하여 생기는 게놈 단편에서 유래하는 핵산; 또는 인위적으로 증폭된 핵산인 것인 방법.
  65. 제 64항에 있어서, 세균의 게놈 유래의 핵산이 하기 중 어느 하나인 것인 방법:
    1) GenBank Accession No. FR714927로 식별되는 황색 포도상 구균 (Staphylococcus aureus, 이하 SA)의 게놈 DNA 중 2653499 ~ 2662118 번째 영역, 2656232 ~ 2657658 번째 영역 또는 2656470 ~ 2656799 번째 영역의 일부 또는 모든 핵산 서열을 포함하는 황색 포도상 구균의 게놈 핵산;
    2) GenBank Accession No. AE015929로 식별되는 표피 포도상 구균 (Staphylococcus epidermidis, 이하 SE)의 게놈 DNA 중 384731 ~ 393399 번째 영역, 385337 ~ 388504 번째 영역 또는 385517 ~ 385796 번째 영역의 일부 또는 모든 핵산 서열을 포함하는 표피 포도상 구균의 게놈 핵산;
    3) GenBank Accession No. CP004061로 식별되는 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa, 이하 PA)의 게놈 DNA 중 2386558 ~ 2391818 번째 영역, 2386678 ~ 2388735 번째 영역 또는 2387395 ~ 2387664 번째 영역의 일부 또는 모든 핵산 서열을 포함하는 녹농균의 게놈 핵산;
    4) GenBank Accession No. HF558530로 식별되는 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis, 이하 EF)의 게놈 DNA 중 1837695 ~ 1841178 번째 영역, 1838789 ~ 1839704 번째 영역 또는 1839147 ~ 1839386 번째 영역의 일부 또는 모든 핵산 서열을 포함하는 엔테로코커스 패칼리스의 게놈 핵산;
    5) GenBank Accession No. AP012306로 식별되는 대장균 (Escherichia coli, 이하 EC)의 게놈 DNA 중 1286884 ~ 1291840 번째 영역, 1290625 ~ 1291839 번째 영역 또는 1291152 ~ 1291460 번째 영역의 일부 또는 모든 핵산 서열을 포함하는 대장균의 게놈 핵산;
    6) GenBank Accession No. CP001918로 식별되는 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae)의 게놈 DNA 중 1566239 ~ 1568859 번째 영역 또는 1566732 ~ 1566956 번째 영역의 일부 또는 모든 핵산 서열을 포함하는 엔테로박터 클로아케의 게놈 핵산; 또는
    7) GenBank Accession No. CP003785로 식별되는 폐렴 간균 (Klebsiella pneumoniae, 이하 KP)의 게놈 DNA 중 4082686 ~ 4083937 번째 영역, 4082686 ~ 4083380 번째 영역 또는 4082799 ~ 4083096 번째 영역의 일부 또는 모든 핵산 서열을 포함하는 폐렴 간균 게놈 핵산.
  66. 제 1항 내지 제 65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전개 요소를 사용하는 크로마토그래피가 적어도 하나의 변성제(denaturant) 또는 카오트로픽 시약(chaotropic agent), 또는 적어도 하나의 변성제 또는 카오트로픽 시약 및 적어도 하나의 무기염(inorganic salt)을 포함하는 버퍼 내에서 실시되는 것인 방법.
  67. 제 24항 내지 제 28항 및 제 57항 내지 제 66항 중 어느 한 항의 방법에 사용하기 위한, 하기를 갖춘 장치:
    (i) 상기 형성된 핵산 하이브리드를 포착하여, 검출 또는 정량하기 위한 적어도 하나의 감지 영역을 구비한 전개 요소;
    (ii) 상기 전개 요소에 접촉하여 구비된 적어도 상기 표적 핵산 N을 포함한 시료를 적용하기 위한 적용 영역;
    (iii) 상기 적용 영역 및 상기 전개 요소 모두에 접촉하여 구비된, 목표로 하는 올리고뉴클레오티드를 봉입하는 봉입 영역; 및
    (iv) 상기 전개 요소와 접촉하고 구비된, 상기 감지 영역을 넘어 확장된 시료를 흡수하기 위한 흡수 영역.
  68. 제 67항에 있어서, 상기 전개 요소가 불침습성 고체 재료인 케이스 내부에 배치되어 있는 것인 장치.
KR1020167024485A 2014-02-05 2015-01-29 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용한 핵산의 검출, 정량 방법 및 그 장치 KR20160127753A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014020183 2014-02-05
JPJP-P-2014-020183 2014-02-05
PCT/JP2015/052501 WO2015119035A1 (ja) 2014-02-05 2015-01-29 マスクオリゴヌクレオチドを用いた核酸の検出、定量方法及びそのデバイス

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20160127753A true KR20160127753A (ko) 2016-11-04

Family

ID=53777842

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167024485A KR20160127753A (ko) 2014-02-05 2015-01-29 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용한 핵산의 검출, 정량 방법 및 그 장치

Country Status (8)

Country Link
US (1) US11193162B2 (ko)
EP (1) EP3103884B1 (ko)
JP (1) JP2015164416A (ko)
KR (1) KR20160127753A (ko)
CN (1) CN106164294A (ko)
AU (1) AU2015215750B2 (ko)
CA (1) CA2938817A1 (ko)
WO (1) WO2015119035A1 (ko)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108441569B (zh) * 2018-04-12 2021-10-29 华南农业大学 桑源阴沟肠杆菌特异序列和引物组Yt4及其在检测阴沟肠杆菌方面的应用
CN109295181B (zh) * 2018-08-08 2019-10-15 西安市中心血站 一种用于检测细菌的杂交干扰实时pcr方法
CN111235132A (zh) * 2019-12-23 2020-06-05 浙江工业大学 一种β-半乳糖苷酶、基因、工程菌及其应用
CN113278710B (zh) * 2021-07-13 2022-02-22 南宁海关技术中心 用于检测深海鱼油中掺杂异源油脂的引物探针、试剂盒及方法
CN114231401B (zh) * 2022-02-21 2022-05-03 北京芯迈微生物技术有限公司 一种核酸检测试剂盒及检测方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10253632A (ja) 1997-03-10 1998-09-25 Nissui Pharm Co Ltd 分析方法、キット及び装置
JP2820749B2 (ja) 1987-11-24 1998-11-05 ジェン―プローブ・インコーポレイテッド 核酸ハイブリダイゼーションの増進手段および方法
JP3001906B2 (ja) 1988-08-30 2000-01-24 アボット・ラボラトリーズ 核酸配列の増幅および検出方法
JP3197277B2 (ja) 1993-05-10 2001-08-13 日水製薬株式会社 一種類以上の免疫学的配位子の分析方法，その分析試薬およびそのキット
JP2006201062A (ja) 2005-01-21 2006-08-03 Kainosu:Kk 核酸の検出あるいは定量方法
WO2012070618A1 (ja) 2010-11-24 2012-05-31 株式会社カネカ 増幅核酸検出方法及び検出デバイス

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57147721A (en) 1981-03-09 1982-09-11 Atsuo Kobayashi Controlling method for waveform of alternating current power source
JP3489102B2 (ja) 1993-09-07 2004-01-19 Ｊｓｒ株式会社 標的核酸の検出方法およびそのためのキット
US6037127A (en) * 1994-03-31 2000-03-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for detection of non-denatured nucleic acid fragments
US20040110167A1 (en) * 1995-07-13 2004-06-10 Gerdes John C. Lateral flow system for nucleic acid detection
GB0016814D0 (en) * 2000-07-07 2000-08-30 Lee Helen Improved dipstick assays (3)
TWI286159B (en) * 2000-07-07 2007-09-01 Diagnostics For The Real World Improved stability of hybridisation interactions in dipstick assays
US6720160B2 (en) * 2001-10-11 2004-04-13 Helica Biosystems, Inc. Method for simultaneous detection of multiple microbial antigens in biological specimens from mastitic animals
US20050136412A1 (en) * 2003-12-22 2005-06-23 Affymetrix, Inc. Light-based detection and manipulation of single molecules
US20090047673A1 (en) 2006-08-22 2009-02-19 Cary Robert B Miniaturized lateral flow device for rapid and sensitive detection of proteins or nucleic acids
WO2008084888A1 (en) * 2007-01-08 2008-07-17 Medigenes Co., Ltd Dna chip for detection of escherichia coli

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2820749B2 (ja) 1987-11-24 1998-11-05 ジェン―プローブ・インコーポレイテッド 核酸ハイブリダイゼーションの増進手段および方法
JP3001906B2 (ja) 1988-08-30 2000-01-24 アボット・ラボラトリーズ 核酸配列の増幅および検出方法
JP3197277B2 (ja) 1993-05-10 2001-08-13 日水製薬株式会社 一種類以上の免疫学的配位子の分析方法，その分析試薬およびそのキット
JPH10253632A (ja) 1997-03-10 1998-09-25 Nissui Pharm Co Ltd 分析方法、キット及び装置
JP2006201062A (ja) 2005-01-21 2006-08-03 Kainosu:Kk 核酸の検出あるいは定量方法
WO2012070618A1 (ja) 2010-11-24 2012-05-31 株式会社カネカ 増幅核酸検出方法及び検出デバイス

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
[비특허문헌 1] Applied and Environmental Microbiology, Vol.66, No.8, p.3603-3607, 2000
[비특허문헌 2] BioTechniques, Vol.36, No.1, p.124-132, 2004

Also Published As

Publication number Publication date
EP3103884A1 (en) 2016-12-14
JP2015164416A (ja) 2015-09-17
WO2015119035A1 (ja) 2015-08-13
EP3103884B1 (en) 2021-06-09
AU2015215750A1 (en) 2016-09-01
CN106164294A (zh) 2016-11-23
US11193162B2 (en) 2021-12-07
US20170037457A1 (en) 2017-02-09
AU2015215750A2 (en) 2016-09-15
CA2938817A1 (en) 2015-08-13
AU2015215750B2 (en) 2021-02-25
EP3103884A4 (en) 2017-08-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6783590B2 (ja) 増幅核酸検出方法及び検出デバイス
US5627030A (en) Method of amplification for increasing the sensitivity of detecting nucleic acid-probe target hybrids
US5869252A (en) Method of multiplex ligase chain reaction
JP5196867B2 (ja) プローブセット、プローブ担体及び検査方法
KR20160127753A (ko) 마스크 올리고뉴클레오티드를 이용한 핵산의 검출, 정량 방법 및 그 장치
KR101038519B1 (ko) 인체 감염성질환 병원체 감별진단 및 이의 항생제 내성 유무 판별방법, 멀티플렉스 키트 그리고 이를 포함하는 칩
JP2008278857A (ja) プローブ、プローブセット、プローブ担体及び検査方法
JP2008278845A (ja) プローブ、プローブセット、プローブ担体及び検査方法
JP2008278869A (ja) プローブ、プローブセット、プローブ担体及び検査方法
JP2008278866A (ja) プローブ、プローブセット、プローブ担体及び検査方法
JP2008278868A (ja) プローブ、プローブセット、プローブ担体及び検査方法
JP2008278864A (ja) プローブ、プローブセット、プローブ担体及び検査方法
JP2008278855A (ja) プローブ、プローブセット、プローブ担体及び検査方法
WO1999040224A9 (en) Direct detection of rna mediated by reverse transcriptase lacking rnase h function
KR102259445B1 (ko) 클라미디아 트라코마티스 검출용 프라이머 세트 및 이것을 사용한 클라미디아 트라코마티스 검출 방법, 그리고 그것을 위한 시약 키트
JP2016515827A (ja) ナノ粒子支援シグナル増幅を使用するｒｎａマイクロチップ検出
EP1164201A1 (en) Reverse detection for identification and/or quantification of nucleotide target sequences on biochips
WO2017006859A1 (ja) 標的核酸の検出法
US6306657B1 (en) Polynucleotide probe and kit for amplifying signal detection in hybridization assays
EP2843047A1 (en) Nucleic acid detection method
KR101355918B1 (ko) 유전자 변형 옥수수 ｍｏｎ８６３ 및 ｍｏｎ８１０ 검출용 키트
CN101487047B (zh) 一种应用悬浮芯片技术检测霍乱弧菌o1方法
WO2007108378A1 (ja) シグナルプローブポリマーの形成方法
Guesdon In vivo labeling of DNA probes with 5-BrdU
KR101208732B1 (ko) 유전자 변형 옥수수 ｍｏｎ８６３ 및 ｍｏｎ８１０ 검출용 키트

Legal Events

Date Code Title Description
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
X091 Application refused [patent]
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)