NL194922C - Werkwijze voor de bepaling van nucleïnezuren, alsmede set daarvoor. - Google Patents

Werkwijze voor de bepaling van nucleïnezuren, alsmede set daarvoor. Download PDF

Info

Publication number
NL194922C
NL194922C NL8800594A NL8800594A NL194922C NL 194922 C NL194922 C NL 194922C NL 8800594 A NL8800594 A NL 8800594A NL 8800594 A NL8800594 A NL 8800594A NL 194922 C NL194922 C NL 194922C
Authority
NL
Netherlands
Prior art keywords
nucleic acid
target nucleic
primers
copies
probe
Prior art date
Application number
NL8800594A
Other languages
English (en)
Other versions
NL8800594A (nl
NL194922B (nl
Original Assignee
Sangtec Molecular Diagnostics
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sangtec Molecular Diagnostics filed Critical Sangtec Molecular Diagnostics
Publication of NL8800594A publication Critical patent/NL8800594A/nl
Publication of NL194922B publication Critical patent/NL194922B/nl
Application granted granted Critical
Publication of NL194922C publication Critical patent/NL194922C/nl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

1 194922
Werkwijze voor de bepaling van nucleïnezuren, alsmede set daarvoor
De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bepalen van de aanwezigheid of hoeveelheid van een doelwitnucleïnezuur door hybridisatie van een enkelstrengsvorm daarvan, waarbij ten minste één 5 niet-geïmmobiliseerde vangsonde die de helft van een affiniteitspaar bevat, en ten minste één detectiesonde worden toegepast, het gevormde hybride uit de oplossing wordt afgescheiden met behulp van de geïmmobiliseerde andere helft van het affiniteitspaar en wordt aangetoond met behulp van een als hybride gebonden detectiesonde.
Een dergelijke werkwijze is bekend uit In NL8503597 (GB 2169403). In de beschreven werkwijze 10 hybridiseren een detectiesonde en een vangsonde met naburige gedeelten van dezelfde streng vein dezelfde doelwitsequentie. Vergeleken met de toepassing van geïmmobiliseerde vangsonde zoals bekend uit US-A-4.486.539 bezit deze methode het voordeel dat de hybridisatiereactie in oplossing wordt uitgevoerd, en de hybriden snel en gemakkelijk kunnen worden afgescheiden na de hybridisatiereactie. De gevoeligheid van een dergelijke werkwijze is echter een beperkende factor. Zeker voor klinische toepassin-15 gen en andere toepassingen waarbij de beschikbare hoeveelheid monster beperkt is, is een gevoeligere methode gewenst.
Het is een doel van de onderhavige uitvinding te voorzien in een gevoelige detectiemethode voor het bepalen van de aanwezigheid of hoeveelheid van een doelwitnucleïnezuur.
Er is gevonden dat dit doel kan worden bereikt door hybridisatie van doelwitnucleïnezuur na het 20 vermenigvuldigen ervan met behulp van een vangsonde of een detectiesonde, die als een gemodificeerde primer fungeert.
Derhalve wordt een werkwijze volgens de uitvinding gekenmerkt, doordat men kopieën vormt van het doelwitnucleïnezuur door polymerisatie in vitro onder toepassing van ten minste één gemodificeerde primer, waarbij de vangsonde als gemodificeerde primer fungeert die wordt opgenomen in de kopieën van het 25 doelwitnucleïnezuur, alvorens de kopieën te hybridiseren met ten minste één detectiesonde en uit de oplossing af te scheiden.
Een andere werkwijze volgens de uitvinding wordt gekenmerkt, doordat men kopieën vormt van het doelwitnucleïnezuur door polymerisatie onder toepassing van ten minste één gemodificeerde primer, waarbij de detectiesonde als gemodificeerde primer fungeert die wordt opgenomen in de kopieën van het doelwitnu-30 cleïnezuur, alvorens de kopieën te hybridiseren met ten minste één vangsonde, en uit de oplossing af te scheiden.
Door het toepassen van de detector- of vangsondes als primers in een polymerisatiereactie is het mogelijk de hoeveelheid van het doelwitnucleïne belangrijk te vergroten en daardoor de gevoeligheid met enkele grootteorden te verhogen, ten opzichte van werkwijzen waarbij het doelwitnucleïnezuur rechtstreeks 35 wordt gemeten.
Een werkwijze volgens de uitvinding is geschikt voor de diagnoses van bepaalde ziekten die moeilijk vast te stellen zijn met conventionele methoden. Zo is een werkwijze volgens de uitvinding bijzonder geschikt voor het identificeren van cytomegalovirus en HIV- of AIDS-virus.
De enzym-gekatalyseerde polymerisatie van DNA in vitro waarbij de nucleotidesequentie van een eerder 40 bestaande nucleïnezuurstreng, dat wil zeggen de sjabloon, nauwkeurig wordt gekopieerd in de complementaire streng daarvan, is bijvoorbeeld bekend uit de Europese octrooiaanvrage 201184. Hierbij wordt de werkwijze als volgt uitgevoerd. Dubbelstrengs DNA wordt in oplossing tot ongeveer 100°C verwarmd, waardoor het DNA wordt gesplitst in twee enkelvoudige strengen.
Men gebruikt twee primer DNA’s, waarvan de één door hydridisatie past op één van de afzonderlijke 45 DNA-strengen en de andere op de complimentaire streng, waarbij gezien vanaf het dubbelstrengs DNA de hechtingsplaatsen van de beide primers zich op enige afstand van elkaar bevinden. Na afkoelen van het enkelstrengs DNA tot kamertemperatuur laat men beide strengen met de passende primer DNA’s hybridiseren, waarna bij aanwezigheid van d-ATP, d-GTP, d-GTP, d-TTP en een DNA-polymerase, een polymerisatie optreedt, waarbij beide strengen in de 5 -» 3 richting vanaf de primer door de polymerisatie worden 50 aangevuld met een geheel passende complimentaire streng. Op die manier worden uit iedere dubbelstrengs DNA, twee dubbelstrengs DNA’s verkregen, die weer door verhitting tot ongeveer 100°C kunnen worden gesplitst in 4 enkelvoudige DNA-strengen, die door herhaling van de polymerisatie met de primers kunnen worden omgezet in 4 dubbelstrengs DNA-moleculen.
Op deze wijze wordt na iedere cyclus het aantal DNA-moleculen verdubbeld, waardoor na enige cycli 55 een zeer groot aantal DNA-moleculen kan zijn gevormd, waarvan het grootste gedeelte overeenkomt met het gedeelte van het uitgangs-DNA tussen het begin van beide primers.
Deze bewerking is bekend geworden als Polymerase-Chain-Reaction (P.C.R.).
194922 2
Het uitgangsnucleTnezuur kan ook een RNA zijn zoals messenger RNA die dan door reverse transcriptase wordt omgezet in een dubbelstrengs nucleïnezuur bestaande uit de RNA-keten en een complementaire DNA-keten, waarna de hoeveelheid DNA kan worden vermenigvuldigd met behulp van P.C.R.
In de Europese octrooiaanvrage 200362 wordt beschreven hoe de methode volgens de Europese 5 octrooiaanvrage 201184, namelijk P.C.R. kan worden gebruikt voor het aantonen van een bepaald nucleïnezuur. Indien een nucleïnezuur aanwezig is waarvan de afzonderlijke strengen kunnen hybridiseren met de toegépaste primers dan wordt door P.C.R. de hoeveelheid van dit nucleïnezuur sterk vermenigvuldigd en kan het daarna gemakkelijk worden aangetoond, bijvoorbeeld door het te laten reageren met een gemerkte sonde.
10 Men kan ook de P.C.R. uitvoeren waarbij met 32P gemerkte nucleosidetrifosfaten worden toegepast waarbij een radioactief nucleïnezuur wordt verkregen en de radioactiviteit wordt toegepast voor de bepaling. Ook kunnen met bioline gelabelde nucleosidetrifosfaten worden toegepast.
Volgens de Europese octrooiaanvrage 200362 kan een primer worden gemodificeerd bijvoorbeeld door de nucleotidevolgorde enigszins te wijzigen waarbij de hybridisatie mogelijk blijft om op die manier in vitro 15 verkregen mutanten van het oorspronkelijke nucleïnezuur te verkrijgen.
Ook kan een primer worden gemodifeerd door aan het 5' einde een deoxyribonucleotidegroep te hechten die na P.C.R. de eindgroep vormt van verkregen nucleïnezuren.
De toepassing van een gemodificeerde primer die als vangsonde of detectiesonde fungeert wordt echter in de europese octrooiaanvrage 200362 niet vermeld.
20 In de Europese octrooiaanvrage 200362 worden ook rechten gevraagd voor een set voor het bepalen van de aanwezigheid of hoeveelheid van een doelwitnucleïnezuur die in verpakte vorm een eenheid met een aantal houders omvat, met a) een paar primers die kunnen hybridiseren met de beide strengen van het doelwitnucleïnezuur en geschikt zijn voor het maken van kopieën van het doelwitnucleïnezuur, 25 b) een agens voor sjabloon-afhankelijke polymerisatie, c) een vier deoxynucleosidetrifosfaten, d) een detectiesonde die in staat is tot selectieve hybridisatie met het doelwitnucleïnezuur en die voorzien is van een detecteerbaar label, e) een middel om de aanwezigheid van een hoeveelheid van het label aan te tonen.
30 In de Europese octrooiaanvrage 200362 is geen sprake van de toepassing van een vangsonde. De nucleïnezuren werden bijvoorbeeld onderzocht na elektroforese op een polyacrylamidegel.
De toepassing van P.C.R. voor het aantonen van de aanwezigheid van een bepaald nucleïnezuur wordt ook besproken in de Europese octrooiaanvrage 237362, A1, die niet tijdig is gepubliceerd maar wel oudere rechten bezit. Op de bladzijden 5 en 25 van deze octrooiaanvrage wordt een methode vermeld, die een 35 grote gelijkenis vertoont met de methode volgens de onderhavige uitvinding. Hierbij is namelijk ten minste een van de primers die bij de P.C.R. wordt toegepast gelabeld, zodat indien het aan te tonen nucleïnezuur aanwezig is, dit in gelabelde vorm wordt vermenigvuldigd.
Daarna wordt dit gelabelde nucleïnezuur uit de oplossing afgescheiden, door een streng daarvan te hybridiseren met een oligonucleotide dat een daartoe passende structuur bezit en aan een vast membraan 40 is gehecht.
Deze methode verschilt van die volgens de onderhavige uitvinding hierin dat men een geïmmobiliseerde vangsonde toepast, terwijl men volgens de onderhavige uitvinding het gevormde nucleïnezuur in eerste instantie in oplossing bindt aan een niet-geïmmobiliseerde vangsonde.
In de hybridisatiemethode volgens de uitvinding werken hetzij de detectorsondes hetzij de vangsondes 45 als gemodificeerde primers die worden opgenomen in de kopieën van het doelwitnucleïnezuur in een sjabloon-afhankelijk polymerisatieproces voorafgaand aan de hybridisatiereactie.
In de werkwijze volgens de uitvinding is ten minste één primer noodzakelijk en is ten minste de primers gemodificeerd. Indien de detectorsondes als primers fungeren in de polymerisatiereactie wordt ten minste één van de primers voorzien van ten minste één geschikt, detecteerbaar label.
50 Alternatief kunnen de vangsondes als primers worden gebruikt in de polymerisatiereactie, in welk geval de primers worden voorzien van ten minste één geschikte helft van een affiniteitspaar.
De uitvinding verschaft tevens een reagenscombinatie en een set die in verpakte vorm een eenheid met een aantal houders omvat waarin de reagenscombinatie die vereist is voor het uitvoeren van de test aanwezig is.
Korte beschrijving van de tekeningen.
Figuur 1 geeft de base-sequentie van de gemodificeerde primers, Pa en Pb, en van de selectieve sondes, 55 3 194922 S1 en S2l gebruikt in de Voorbeelden I, II en III, alsmede de relatieve plaatsen van de gemodificeerde primers, Pa en Pb, en van de selectieve sondes, S, en S2, op het doelwitnucleïnezuur in kwestie weer. De lange lijnen, A en B, geven de beide doelstrengen aan die zich in beide richtingen voortzetten. De pijlpunten op de primers, Pa en Pb, geven de richting aan waarin ze worden verlengd in het polymerisatieproces.
5 Figuur 2 geeft de base-sequentie van de gemodificeerde primers, Pa en Pb, en van de selectieve sonde, S, gebruikt in Voorbeeld IV, alsmede de relatieve plaatsen van de gemodificeerde primers, Pa en pb. en van de selectieve sonde, S, op het doelwitnucleïnezuur in kwestie weer. Lijn A geeft het RNA en de identieke DNA-kopieën daarvan aan en lijn B toont de complementaire DNA-kopieën. De pijlpunten op de primers Pa en Pb geven de richting aan waarin ze worden verlengd in het polymerisatieproces.
10
Gedetailleerde beschrijving van de uitvinding Bereiding van testmateriaal
De in de werkwijze toegepaste sondes zijn oligo- of polynucleotiden. De sondes kunnen synthetisch of 15 semisynthetisch worden bereid, hetgeen de voorkeurswijzen zijn voor de bereiding van sondes, die tevens als primers zullen fungeren. Het is ook heel goed mogelijk de sondes te bereiden door recombinant-technieken, of uit nucleïnezuren die rechtstreeks uit de natuur geïsoleerd zijn. Een sonde kan gebonden zijn aan een geschikte vector. Hij kan vectordelen bevatten of geheel vrij zijn van vectordelen. Er is op het ogenblik een veelheid aan geschikte primers en sondes die toegepast kunnen worden in de handel 20 verkrijgbaar.
De detectorsondes als gemodificeerde primers
In één van de werkwijzen volgens de uitvinding zijn de detectorsondes oligonucleotiden of polynucleotiden, die aan het doelwitnucleïnezuur kunnen worden gebonden door base-paring en die als primers voor een 25 sjabloon-afhankelijk nucleïnezuur synthetiserend enzym kunnen fungeren. Het is wezenlijk dat de detector-primers zijn voorzien van ten minste één geschikt detecteerbaar label.
Diverse radioactieve isotopen of radioactief gelabelde verbindingen kunnen als labels worden gebruikt.
De labelsubstantie kan ook fluorescerend, luminescerend, licht-emitterend, enzymatisch of immunologisch aantoonbaar zijn. Labels gebaseerd op de affiniteit van biotine en avidine of streptavidine, lanthanide-30 chelaten, ferritine en heme-verbindingen, en immunologisch aantoonbare haptenen, zoals AAF
(2-acetylaminofluoreen) kunnen als voorbeelden worden genoemd. Identificatie met behulp van mediatoren, bijvoorbeeld eiwitten, is ook mogelijk.
De werkwijze volgens de uitvinding is niet afhankelijk van het gebruikte label. Het is echter wezenlijk dat indien de detectorsondes als primers werken het label wordt gekozen uit een groep van labels die de functie 35 van de primer niet zullen verstoren. Het label moet op zodanige wijze aan de detectorprimer worden bevestigd dat het nucleïnezuurpolymeriserende enzym deze nog als primer kan herkennen.
De vangsondes als gemodificeerde primers
In de andere werkwijze volgens de uitvinding zijn de vangsondes oligonucleotiden of polynucleotiden, die 40 aan het doelwitnucleïnezuur kunnen worden gebonden door base-paring en die als primers voor een sjabloonafhankelijk nucleïnezuursynthetiserend enzym kunnen fungeren. Het is wezenlijk dat de vang-primers zijn voorzien van ten minste één geschikte helft van een affiniteitspaar. Het is mogelijk de helft of helften van het affiniteitspaar via een mediator aan de vangprimer te bevestigen. De enige voorwaarden zijn dat het mogelijk is de hybride uit de hybridisatieoplossing af te scheiden met behulp van het affiniteitspaar 45 en dat de primerfunctie geen schade leidt
De helft van het affiniteitspaar is een component met affiniteit voor een andere component. Voorbeelden van zulke affiniteitsparen zijn biotine/avidine of streptavidine, een zwaar-metaal-derivaat/een thiogroep, diverse homopolynucleotiden, zoals poly-dG/poly-dC, poly-dA/poly-dT en poly-dA/poly-U. Maar ook andere componentparen kunnen worden toegepast, mits deze een voldoende sterke affiniteit hebben om de 50 specifieke binding van de gemodificeerde vangprimers die zijn opgenomen in de kopieën van het doelwitnucleïnezuur aan de vaste drager mogelijk te maken. Geschikte affiniteitsparen worden aangetroffen onder liganden en conjugaten die in immunologische methoden worden toegepast.
De selectieve vangsonde 55 In die werkwijze volgens de uitvinding, waarbij de detectorsondes als primers fungeren, is een selectieve vangsonde vereist om de selectieve afscheiding van de kopieën van he doelwitnucleïnezuur waarin de gemodificeerde primers zijn opgenomen mogelijk te maken. Het is wezenlijk dat de vangsondes voldoende 194922 4 homoloog aan het doelnucleïnezuur zijn om de specifieke hybridisatie daarvan met de kopieën van het doelwitnucleïnezuur en daardoor selectieve afscheiding en detectie van de detectorprimers die zijn opgenomen in de kopieën van het doelwitnucleïnezuur mogelijk te maken.
5 De selectieve detectorsonde
In de andere werkwijze volgens de uitvinding, waarbij de vangsondes als gemodificeerde primers fungeren, is een selectieve detectorsonde vereist om de detectie van de kopieën van het doelwitnucleïnezuur waarin de gemodificeerde primers zijn opgenomen mogelijk te maken. Het is wezenlijk dat de detectorsonde voldoende homoloog aan het doelwitnucleïnezuur is om het doelwitnucleïnezuur specifiek te hybridiseren en 10 het daardoor selectief te identificeren. De detectorsondes kunnen worden voorzien van alle geschikte, detecteerbare labels.
Reagenscombinaties
De detectorsonde als gemodificeerde primer 15 De uitvinding heeft betrekking op een reagenscombinatie omvattende ten minste één gemodificeerde primer, voorzien van ten minste één geschikt detecteerbaar label en ten minste één selectieve vangsonde, voorzien van ten minste één helft van een affiniteitspaar.
De vangsonde als gemodificeerde primer 20 De uitvinding heeft tevens betrekking op een reagenscombinatie omvattende ten minste één gemodificeerde primer, voorzien van ten minste één geschikte helft van een affiniteitspaar en ten minste één selectieve detectorsonde, voorzien van ten minste één geschikt, detecteerbaar label.
Sets 25 De uitvinding heeft tevens betrekking op een geschikte set voor het bepalen van de aanwezigheid of hoeveelheid van een doelwitnucleïnezuur. Een set omvat in verpakte vorm een eenheid met meerdere houders met ten minste a) een paar primers geschikt voor het maken van kopieën van het doelwitnucleïnezuur, b) ten minste één detectiesonde die in staat is tot selectieve hybridisatie met het doelwitnucleïnezuur, 30 voorzien van ten minste één decteerbare label, c) ten minste één agens voor sjabloonafhankelijke polymerisatie, d) de vier deoxynucleosidetrifosfaten.
Voor toepassing bij één vorm van de onderhavige uitvinding wordt zo’n set gekenmerkt doordat ten minste één van de primers een gemodificeerde primer is, die is voorzien van ten minste één helft van een 35 affiniteitspaar dat kan functioneren als vangsonde.
Voor toepassing bij een andere vorm van de onderhavige uitvinding wordt zo’n set gekenmerkt doordat ten minste één van de primers een gemodificeerde primer is, voorzien van ten minste één detecteerbare label, zodat de onder b) genoemde detectiesonde overeenkomt met tén minste één van de primers genoemd onder a) en de set tevens een houder bevat met 40 e) ten minste één vangsonde, die in staat is tot selectieve hybridisatie in oplossing met het doelwitnucleïnezuur en die is voorzien van ten minste één helft van een affiniteitspaar.
De voorkeursfaciliteiten en -reagentia worden in het volgende deel van de beschrijving in meer detail beschreven. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
De werkwijze volgens de uitvinding 2
De voorkeurswerkwijze volgens de uitvinding begint met het toevoegen van twee gemodificeerde primers, 3 welke beide primers hetzij detector- hetzij vangprimers zijn, aan een gedenatureerde monsteroplossing. De 4 gemodificeerde primers zullen elk ’’hybridiseren” aan hun complementaire streng van het doelwitnucleïne 5 zuur, dat wil zeggen de sjabloon, en na toevoegen van een sjabloonafhankelijk nucleïnezuur-synthetiserend 6 enzym zullen de primers worden verlengd. De werkwijze verloopt doeltreffend in vitro onder vorming van 7 nieuwe nucleïnezuurstrengen die verscheidene duizenden basen lang kunnen zijn, mits de omstandigheden 8 geschikt zijn.
9
Door toepassing van een overmaat aan gemodificeerde primers kan de werkwijze worden herhaald om 10 complementaire kopieën te vormen bij e pas gesynthetiseerde strengen, hetgeen derhalve identieke kopieën 11 van de eerste sjabloon zijn. Door herhaling van deze werkwijze wordt een cascadereactie op gang gebracht waardoor het doelwitnucleïnezuur wordt vermenigvuldigd. De werkwijze kan zo vaak als gewenst worden herhaald, om de gewenste detectiegevoeligheid te verkrijgen. In gevallen waarin de doelwitnucleïnezuurcon- 5 194922 centratie niet extreem laag is is één vermenigvuldiging voldoende om het doelwitnucleTnezuur detecteerbaar te maken.
Men kan ook een gemodificeerde primer en een ongemodificeerde andere primer toepassen.
Het is ook mogelijk slechts één gemodificeerde primer toe te passen in de werkwijze volgens de 5 uitvinding. In dit geval is de vermenigvuldiging echter niet zo doeltreffend als bij toepassing van twee primers doordat de reactie niet van het cascadetype is, terwijl slechts één streng wordt vermenigvuldigd.
Zowel DNA als RNA kunnen worden bepaald door de werkwijze volgens de uitvinding. Indien het doelwitnucleTnezuur RNA is is het echter het handigst het RNA eerst te kopiëren naar het overeenkomstige cDNA door reverse transcriptase enzym, waarna de werkwijze verloopt als hierboven beschreven.
10 Nadat de gemodificeerde primers zijn opgenomen in de kopieën van de doelwitnucleïnezuren wordt een geschikte selectieve sonde die de doelwitsequentie en de kopieën daarvan herkent aan het reactiemengsel toegevoegd en wordt de hybridisatiereactie uitgevoerd onder geschikte omstandigheden.
In de hybridisatiereactie wordt, afhankelijk van de keuze van de gemodificeerde primers, hetzij een selectieve vangsonde hetzij een selectieve detectorsonde in de gelegenheid gesteld te hybridiseren met de 15 kopieën van het doelwitnucleTnezuur die nu aanwezig zijn in de hoeveelheden die een veelvoud zijn in vergelijking met de hoeveelheid doelwitnucleTnezuur in de oorspronkelijke toestand.
Indien het oorspronkelijke monster de doelwitsequentie bevatte zal de toegevoegde selectieve sonde hybridiseren tot nieuw gesynthetiseerde kopieën van het doelwitnucleTnezuur. Een hybride wordt gevormd tussen het kopiemolecuul waarin de gemodificeerde primer is opgenomen en de selectieve sonde. De 20 gevormde hybriden worden votgens de uitvinding op geschikte wijze uit de hybridisatieoplossing afgescheiden met behulp van de helft van het affiniteitspaar die hetzij aan de vangprimer hetzij aan de selectieve vangsonde is bevestigd. Tijdens deze afscheiding hechten deze vanggroep-bevattende hybriden aan een vaste drager door middel van de andere helft van het affiniteitspaar en de hoeveelheid selectieve detectorsonde of detectorprimer die aan de drager hecht kan worden gemeten door conventionele methoden 25 rechtstreeks vanaf de drager of na elutie vanuit het eluaat. De hoeveelheid label is een maat voor de hoeveelheid doelwitnucleTnezuur.
Voorafgaand aan de afscheiding wordt de oplossing zonodig verdund, om de omstandigheden gunstig te maken voor de binding van het affiniteitspaar. Daarna wordt de oplossing in contact gebracht met de vaste drager. De drager in kwestie kan bijvoorbeeld een affiniteitschromatografiekolom, een filter, een kunststof-30 oppervlak of een glasoppervlak zijn. Geschikte faciliteiten voor het uitvoeren van de scheiding zijn verschillende types microtiterplaten, ”dipstick”systemen of magnetische deeltjes, maar het is heel goed mogelijk de scheiding uit te voeren in reageerbuizen en op kralen.
Het dragermateriaal van de affiniteitskolom kan een natuurlijk of synthetisch polymeer zijn, bijvoorbeeld cellulose, polyacrylamide, polystyreen, dextran of agarose. Deze materialen kunnen ook als suspensies in 35 een reageerbuis worden gebruikt. Het is ook gunstig reageerbuizen te gebruiken waarin de andere helft van een affiniteitspaar is gefixeerd op het binnenoppervlak daarvan. Het is een vereiste voor het gekozen materiaal dat het mogelijk is daaraan een component te fixeren met affiniteit voor de helft van het affiniteitspaar die bevestigd is aan de vangprimer of de selectieve vangsonde.
Het principe van de rest wordt toegelicht in de volgende voorbeelden.
40
Voorbeeld I
Detectie van cytomegalovirus-DNA onder toepassing van detectorsondes als gemodificeerde primers
In dit modelexperiment was het doelwitnucleTnezuur een recombinant-plasmide (pBR322/CMV Hindlll L) met daarin ondergebracht een 12,3 kb fragment van het cytomegalovirus (CMV, AD 169, ATCC 45 VR-538)genoom. De twee detectorprimers die werden toegepast (Pa, Pb, figuur 1) waren 20 nucleotiden lang en gesynthetiseerd volgens standaardmethoden in een geautomatiseerde synthese-inrichting. Zij komen overeen met twee gebieden op de CMV-specifieke inlas die zich 111 nucleotiden van elkaar bevonden. Twee selectieve vangsondes (S1( S2, figuur 1) herkenden gebieden op elk van de beide strengen tussen de beide detectorprimers. De detectorprimers Pa en Pb waren gelabeld met32P aan de 5'-uiteinden 50 daarvan tot een specifieke activiteit van 4x10® CPM/microgram onder toepassing van de algemeen bekende reactie met polynucleotide-kinase en gamma-32P-ATP (Maniatis e.a., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).
Gebiotinyleerde nucleotiden werden geaddeerd aan de 3'-uiteinden van de vangsondes onder toepassing van biotine-11-dUTP (Bethesda Research Laboratories, BRL) en terminaal transferase (Promega Biotech.) 55 als beschreven door L.K. Riley e.a., DNA, 5 (4), biz. 333-337,1986. De doel-plasmide was gelineariseerd door klieven met het restrictie-enzym EcoRI. DNA-Polymerase, Klenow-fragment, werd gekocht van Boehringer-Mannheim en streptavidine-agarose van BRL.
194922 6
Onder toepassing van deze reagentia werd het volgende experiment uitgevoerd.
Vier verschillende reactiemengsels van 50 microliter werden aangemaakt, die respectievelijk 0, 104, 10 en 10® moleculen (overeenkomend met 0, 2x10'20, 2x10'18 en 2x10‘16 mol) van de doelplasmide bevatten. Voorts bevatten alle vier de reactiemengsels: 2 pmol van elk van de beide primers, 0,5 mM van elk van de 5 vier deoxynucleosidetrifosfaten (dat wil zeggen dATP, dCTP, dGTP en dTTP), 10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 10 mM MgCI2, 50 mM NaCI en 10 mM dithiothreïtol. Het mengsel werd 2 min. tot 100°C verwarmd, vervolgens 5 min. op 37°C gehouden, waarna 1 microliter (gelijk aan 1 eenheid) DNA-polymerase werd toegevoegd. Vervolgens werd het mengsel opnieuw 10 min. op 37°C gehouden. Het koken, gevolgd door hybridiseren van de detectorprimers en een reactieduur met toegevoegde DNA*polymerase bij 37°C vormt een 10 DNA-synthesecyclus.
In dit experiment werd de cyclus hetzij eenmaal uitgevoerd, hetzij 5 of 15 maal herhaald. Na de laatste cyclus werd het monster opnieuw tot 100°C verwarmd, waarna 10 pmol van de selectieve vangsondes werden toegevoegd, tezamen met NaCI (0,9 M), EDTA (20 mM), natriumfosfaat (pH 7,5; 20 mM) en natriumdodecylsulfaat (0,1%). Het volume nam toe tot 100 microliter en de gegeven concentraties zijn als 15 eindconcentraties. Het mengsel werd vervolgens 1 uur op 50°C gehouden. Na deze hybridisatiereactie werd 200 microliter van een 25%’ige suspensie van streptavidine-agarose in 1M NaCI, 20 mM natriumfosfaat (pH 7,5) en 1 mM EDTA toegevoegd. Gebiotinyleerde moleculen werden gedurende 15 min. bij 37°C in een roterende menginrichting in de gelegenheid gesteld te binden aan de streptavidine-agarose. De agarose werd verzameld door een korte tijd te centrifugeren en de bovenstaande vloeistof werd verwijderd door 20 afzuiging. De agarose werd vervolgens eenmaal gewassen in gebuffer 1M NaCI <1M NaCI + 20 mM
natriumfosfaat (pH 7,5, +1 mmol EDTA) en tweemaal in een oplossing die 150 mM NaCI, 15 mM natriumcit-raat en 0,2% natriumdodecylsulfaat bevatte (pH 8) bij 37°C. De radioactiviteit van de agarose waaraan de gevormde hybriden waren gebonden werd vervolgens bepaald in een radioactiviteitsteller. Het hybridiseren van een radioactief gemerkt DNA met een DNA dat gebonden is aan biotine, dit hybride af te scheiden door 25 het te binden aan streptavidine-agarose en het meten van de radioactiviteit van de agarose die het DNA hybride bevat, behoort tot de stand van de techniek en is bijvoorbeeld beschreven in voorbeeld 2 van de Britse octrooipublicatie 2 169 403.
De resultaten van het experiment worden weergegeven in Tabel A. Men ziet dat in één cyclus van DNA-synthese slechts dan voldoende radioactiviteit voor detectie inbouwt indien hoge doelwitnucleïnezuur-30 concentraties aanwezig zijn, maar dat zelfs de zeer lage doelhoeveelheid detecteerbaar is na 15 cycli. Bij grotere hoeveelheden doelwitnucleïnezuur en 15 cycli werd de hoeveelheid detectorprimer beperkend.
TABEL A
35 Hoeveelheid doelwitnucleïnezuur 32P-activiteit in verzamelde hybriden a) (mol) (CPM boven achtergrond) b) 1 5 15 cycli 40 0 0 0 0 2x1020 ND ND 650 2x1018 ND 300 11000 2x10‘18 700 13000 36000 45 a) Gemiddelde van twee bepalingen.
b) ND - niet detecteerbaar (minder radioactiviteit dan tweemaal de gemiddelde achtergrondactiviteit). Voorbeeld II
Bepaling van cytomegalovirus-DNA onder toepassing van vangsondes als gemodificeerde primers 50 In dit voorbeeld fungeren de vangsondes als primers. De gebruikte reagentia waren dezelfde als in
Voorbeeld I, met de volgende uitzonderingen: De vangprimers (Pa, P„, figuur 1) werden niet gelabeld met p maar de 5'-uiteinden ervan werden in plaats daarvan zodanig gemodificeerd dat deze een biotinerest bevatten. Deze chemische modificatie werd uitgevoerd onder toepassing van bekende methoden, beschreven door A. Chollet en E.H. Kawashima, Nucleic Acids Research, 13, blz. 1529-1541, (1985). De twee 55 selectieve sondes (S1t S2, figuur 1) werden in dit geval aan de 5'-uiteinden daarvan met 32P gelabeld om als detectorsondes te fungeren. De specifieke activiteiten ervan waren resp. ongeveer 2x109 en 2,5x1ο9 cpm/microgram.
7 194922
De reactiemengsels werden aangemaakt als beschreven in Voorbeeld I. De gebiotinyleerde vangprimers werden echter toegevoegd in 10-voudige hoeveelheden, dat wil zeggen 20 pmol van elk per reactie. Er werden 1,5 of 15 cycli uitgevoerd als beschreven, waarna de monsters werden verwarmd tot 100°C, en 0,5 pmol van elk van de 32P-gelabelde sondes S, en S2 werd toegevoegd. De hybridisatie werd uitgevoerd 5 onder dezelfde omstandigheden als beschreven in Voorbeeld I.
De hybriden werden vervolgens verzameld op streptavidine-agarose, gewassen en geteld op 32P-activiteit, als in Voorbeeld I. Het resultaat wordt weergegeven in Tabel B.
TABEL B
T0 --
Hoeveelheid doelwitnucleïnezuur 32P-activiteit in verzamelde hybriden a) (mol) (CPM boven achtergrond) b) 1 5 15 cycli 15 - 0 0 0 0 2x10"20 ND ND 800 2x10'18 ND 400 13000 2x1O18 700 11000 54000 20 -- a) Gemiddelde van twee bepalingen.
b) ND - niet detecteerbaar (vergelijk Voorbeeld I).
Voorbeeld III
25 Detectie van cytomegalovirus-DNA uit klinische monsters onder toepassing van vangsondes als gemodificeerde primers
In dit voorbeeld wordt de toepasbaarheid van de werkwijze voor het bestuderen van klinische monsters aangetoond door detecteren van CMV uit de urine van een zuigeling waarvan bekend was dat deze leed aan cytomegalovirusbesmetting. De urine van een gezond kind werd meegenomen als controle. De beide 30 monsters bestonden uit 10 ml urine waaruit het totale DNA werd geïsoleerd als beschreven in M. Virtanen e.a., J. Clin. Microbiol., 20 (6), blz. 1083-1088, (1984). De DNA’s, opgelost in 20 microliter H20, werden als doel gebruikt in reacties die overigens werden uitgevoerd als beschreven in Voorbeeld II. Na 10 cycli van DNA-synthese werd de gelabelde selectieve sonde aan het monster toegevoegd, in de gelegenheid gesteld te hybridiseren, en de hybriden verzameld. Het DNA uit de urine van de patiënt vertoonde een duidelijk 35 hogere radioactiviteit in hybriden, terwijl het DNA afkomstig van de gezonde persoon slechts achtergrond-radioactiviteit vertoonde. De feitelijke cpm-waarden waren respectievelijk 2300 en 240.
Voorbeeld IV
Detectie van Semliki Forest virus RNA onder toepassing van vangsondes als gemodificeerde primers 40 Voorbeeld IV is bedoeld om te laten zien dat de beschreven werkwijze ook kan worden toegepast voor de detectie van RNA. Het gebruikte model was het RNA uit Semliki Forest virus (SFV).
De gebruikte reagentia waren twee 5'-gebiotinyleerde vangprimers (figuur 2) (bereid als beschreven in Voorbeeld II), een enkele 5'-32P-gelabelde selectieve detectorsonde (bereid als beschreven in Voorbeeld I), reverse transcriptase (Promega Biotech) en DNA-polymerase, Klenow-fragment (Boehringer Mannheim).
45 De eerste stap in de detectie van het SFV-RNA was het synthetiseren van een cDNA-kopie. Het reactiemengsel van 20 microliter bevatte 10 mM tris-CI (pH 8,3), 50 mM KCI, 10 mM MgCI2, 10 mM dithiothreïtol, 0,5 mM van elk van de vier deoxynucleosidetrifosfaten, 0,5 microgram t-RNA, 10 pg SFV-RNA, 10 pmol vangprimer Pa en 100 U reverse transcriptase. Dit mengsel werd 15 min. op 37°C gehouden. Vervolgens werd het mengsel 5 min. bij 100°C verwarmd en daarna tot omgevingstemperatuur gekoeld.
50 Daarna werd 50 microliter van een oplossing die 10 mM Tris-CI (pH 7,4), 50 mM NaCI, 10 mM MgCJ2, 10 mM dithiothreïtol, 10 pmol van de vangprimer Pb en 0,5 mM van elk van de vier deoxynucleosidetrifosfaten toegevoegd. De temperatuur werd verhoogd tot 37°C en na 5 min. werd 1 U DNA-polymerase toegevoegd. Na nog 10 min. bij 37°C werd het reactiemengsel 5 min. op 100°C gehouden, het mengsel werd tot 37°C gekoeld en 5 cycli van DNA-synthese werden uitgevoerd. Na een afsluitende denaturatiestap bij 100°C werd 55 0,1 pmol (1,2x106 cpm) van de selectieve detectorsonde 5, volgens figuur 2 toegevoegd in 80 microliter 1M NaCI, 50 mM EDTA, 50 mM natriumfosfaat (pH 7,5) en 0,1% natriumdodecylsulfaat. De oplossing werd vervolgens 2 uur bij 55°C geïncubeerd, waarna de hybriden werden verzameld en gewassen als beschreven 194922 8 in Voorbeeld I.
Als negatieve controle voor de reacties werd een identiek monster onderworpen aan dezelfde behandeling, uitgezonderd dat er geen reverse transcriptase werd toegevoegd. Het monster waarin het RNA met reverse transcriptase in cDNA werd omgezet verschafte 420 cpm 32P-activiteit in gevangen hybriden, terwijl 5 de negatieve controle 50 cpm opleverde.
Voorbeeld V
Vergelijking van verschillende wijzen van detecteren van vermenigvuldigd DNA
In dit voorbeeld werden drie verschillende wijzen van detecteren van vermenigvuldigd DNA vergeleken. 10 De reagentia en het vermenigvuldigingsproces waren als beschreven in de Voorbeelden I en II, uitgezonderd dat de selectieve vang- of detectorsondes bestonden uit M13-klonen die ongeveer 100 nucleotiden tussen de primers herkenden.
De M13-klonen werden verkregen door subkloneren van een Haelll-restrictiefragment van de recombinantplasmide pBR322/CMV Hindlll L in de faagvector M13mp10 onder toepassing van standaard-15 technieken. De als selectieve vangsondes toe te voegen M13-klonen werden gemodificeerd met biotine onder toepassing .van photoprobe (merknaam) biotine (Vector Laboratories). De als selectieve detectorsondes te gebruiken M13-klonen werden gelabeld met 32P-dCTP onder toepassing van DNA-polymerase I (het Klenow-fragment) en primeruitbreiding (N-t Nu de J. Messing, Gene 17, blz. 271-277,1982) tot een specifieke activiteit van 2x108 cpm/microgram.
20 De vermenigvuldiging van 3x105 moleculen (0,5x10'18 mol) van de gelineariseerde pBR322/CMV Hindlll L plasmide in 50 microliter werd uitgevoerd met 10 cycli. Voor detectie volgens de Wijzen 1 en 2 werd 2 pmol van elk van de 32P-gelabelde detectorprimers Pa en Pb toegepast en het vermenigvuldigingsproces werd uitgevoerd als beschreven in Voorbeeld I. Voor detectie volgens Wijze 3 werd 25 pmol van de gebiotinyleerde vangprimers toegepast in de vermenigvuldigingsprocedure en de reactie werd uitgevoerd als 25 beschreven in Voorbeeld II.
Detectiewijze 1 - Toepassing van een selectieve vangsonde voor het verzamelen van hybriden die in oplossing zijn gevormd met de kopieën van het doelwitnucleïnezuur
In deze detectiewijze werden gebiotinyleerde selectieve M13 vangsondes gebruikt voor het verzamelen 30 van de vermenigvuldigde DNA-fragmenten. Na de laatste vermenigvuldigingscyclus werd het monster-mengsel tot 100°C verwarmd en werden 2x109 moleculen van elk van de gebiotinyleerde selectieve vangprimers toegevoegd, tezamen met NaCI (0,6 M), EDTA (5 mM), natriumfosfaat (20 mM) en SDS (0,1%). Het volume nam toe tot 100 microliter en de eindconcentraties werden gegeven. Het mengsel werd 2 uur op 65°C gehouden. De gevormde hybriden werden uit de oplossing afgescheiden op streptavidine-35 agarose als beschreven in Voorbeeld I, uitgezonderd dat er twee extra wassingen van 1 min. bij 50°C werden uitgevoerd met 15 mM NaCI, 1,5 mM natriumcitraat en 0,2% SDS. De radioactiviteit van de afgescheiden hybriden werd gemeten.
Detectiewijze 2 (niet volgens de uitvinding) - Selectieve vangsonde geïmmobiliseerd voorafgaand aan de 40 hybridisatie daarvan met de kopieën van de doelwitnucleïnezuur
Een dergelijke methode wordt vermeld in de Europese octrooiaanvrage 237362.
In dit geval werden geïmmobiliseerde selectieve M13 sondes toegepast om het vermenigvuldigde DNA te vangen. Na de laatste vermenigvuldigingscyclus werden de monsters verwarmd tot 100°C. NaCI (0,6 M), natriumcitraat (60 mM), Ficoll (een niet ionogeen polymeer van saccharose merknaam van Pharmacia Ine.) 45 (0,02%), polyvinylpyrrolidon (0,02%) runderserumalbumine (0,02%) en gedenatureerd haringsperma-DNA (0,2 mg/ml) werden toegevoegd waarbij de aangegeven concentraties betrekking hebben op een eind-volume van 100 microliter. Een nitrocellulosefiltërschijf, waarop 5x1010 moleculen van elk van de selectieve sondes waren geïmmobiliseerd volgens een eerder beschreven procedure (US-A-4.486.539) werd aan elk monster toegevoegd. Het mengsel werd met de filters in contact gehouden bij 65°C gedurende 2 uur of 18 50 uur. Na de hybridisatiereactie werden de filters tweemaal gewassen gedurende 20 min. bij 50°C met 15 mM NaCI, 1,5 mM natriumcitraat en 0,2% SDS en de aan de filters gebonden radioactiviteit werd gemeten.
Detectiewijze 3 - Toepassing van selectieve detedorsonde voor detectie
Hier werden 32P-gelabelde selectieve M13 detectorsondes gebruikt voor de detectie van het vermenigvul-55 digde DNA en werden de hybriden afgescheiden uit de oplossing met behulp van de vangprimers, gebiotinyleerd aan de 5'-uiteinden als beschreven in Voorbeeld II. De vermenigvuldigde monsters werden verwarmd tot 100°C en 2x108 moleculen (2x10s cpm) van elk van de 32P-gelabelde selectieve sondes
V
9 194922 werden toegevoegd tezamen met zouten als beschreven voor Wijze 1. Hybridisatie en afscheiding van de gevormde hybriden werd uitgevoerd als voor Wijze 1.
Een vergelijking van de resultaten verkregen door de drie detectiewijzen wordt getoond in Tabel C.
De Wijzen 1 en 3 hebben het voordeel van de hogere hybridisatiesnelheid in oplossing in vergelijking 5 met de filterhybridisatie in Wijze 2. De hoogste 32P-activiteit wordt verkregen door Wijze 3 omdat de selectieve detectorsonde meerdere 32P-atomen per molecuul bevat.
TABEL C
10 Wijze Primers Selectieve Hybridisatietijd 32P-activiteit in M13-sonde (uren) hybriden (cpm) a) 1 32P-gelabelde Gebiotinyleerde 2 870 detector vanging 15 2 32P-gelabelde Geïmmobiliseerde 2 43 detector vanging 18 920 3 Gebiotinyleerde 32P-gelabelde 2 7800 vanging detector 20 a) Gemiddelde van drie bepalingen (cpm boven de achtergrond).
Voorbeeld VI
Vermenigvuldiging van cytomegalovirus-DNA onder toepassing van gebiotinyleerde detectorprimers en indirecte detectie met streptavidine-mierikswortelperoxidase 25 In dit Voorbeeld werd de vermenigvuldiging van de CMV-specifieke plasmide (pBR322/CMV Hindlll L) uitgevoerd onder toepassing van de in Voorbeeld II beschreven gebiotinyleerde primers Pa en Pb (figuur 1) als detectorprimers. De in Voorbeeld V beschreven M13-klonen, gemodificeerd met sulfongroepen, werden toegepast als selectieve vangsondes. De gevormde hybriden werden verzameld in microtitratieputjes bekleed met antilichamen die zich binden aan de DNA dat met sulfongroepen was gemodificeerd. De 30 uiteindelijke detectie van de gevormde hybriden werd uitgevoerd met een streptavidine-mierikswortelperoxidaseconjugaat, dat zich aan de biotinegroepen van de primers hecht.
De M13-klonen werden gemodificeerd door een sulfoneringsreactie onder toepassing van reagentia en de werkwijze aanbevolen door Orgenics Ltd (Yavne, Israël). Polystyreen-microtitratieputjes (Nunc, Denemarken) werden bekleed met 10 microgram/ml IgG, afkomstig van een gezuiverd monoklonaal antilichaam 35 tegen sulfon-gemodificeerd DNA, (Orgenics Ltd) in 10 mM natriumcarbonaatbuffer (pH 9,6) gedurende een nacht bij 4°C.
Een reactiemengsel van 50 microliter dat 3x105 moleculen van de met EcoRI gelineariseerde pBR322/ CMV Hindlll L plasmiden of controles zonder de plasmide en 25 pmol van elk van de gebiotinyleerde primers Pa en Pb bevatte werd gedurende 10 vermenigvuldigingscycli behandeld bij de in Voorbeeld I 40 beschreven omstandigheden. De monsters werden vervolgens verwarmd tot 100°C, waarna 2x109 moleculen van elk van de gesulfoneerde selectieve vangsondes werden toegevoegd, tezamen met reagentia als beschreven voor Detectiewijze 1 in Voorbeeld V.
Het mengsel werd 2 uur op 65°C gehouden, verdund met 100 microliter 0,2% Tween 20 en overgebracht in de beklede microtitratieputjes. De hybriden werden gedurende 2 uur bij 37°C in de gelegenheid gesteld te 45 binden aan de antilichamen in putjes. Het reactiemengsel werd weggegooid en de putjes werden driemaal gewassen met 0,1% Tween 20 in 0,15 M natriumchloride en 20 mM natriumfosfaat (pH 7,5) (PBS). 200 microliter van een streptavidine-mierikswortelperoxidaseconjugaat (Amersham, UK), 1:2000 verdund in een oplossing van 1% runderserumalbumine met 0,1% Tween 20 in PBS werd toegevoegd en de putjes werden gedurende 45 min. bij 37°C met rust gelaten. Na vier wassingen als hierboven werd 200 microliter van een 50 substraatoplossing bestaande uit 0,46 mg/ml O-fenyleendiamine en 0,01% H202 in 0,1 M natriumacetaat-buffer (pH 5,0) toegevoegd. Na 15 min. bij 22°C werd de reactie beëindigd door de toevoeging van 50 microliter 2N H2S04 en het absorberende vermogen van het gekleurde product werd gemeten met een spectrofotometer bij 492 nm. De verzamel- en de detectieprocedure zijn eerder beschreven door A.C. Syvanen e.a. [Nucleic Acids Res, 14, biz. 5037-5048, (1986), zie biz. 5040].
55 De resultaten van het experiment worden aangegeven in Tabel D.
3x105 Moleculen (0,5x10*18 mol) van de doelwitplasmide werden duidelijk gedetecteerd na 10 vermenigvuldigingscycli.

Claims (4)

1. Werkwijze voor het bepalen van de aanwezigheid of hoeveelheid van een doelwitnucleïnezuur door hybridisatie van een enkelstrengsvorm daarvan, waarbij ten minste één niet-geïmmobiliseerde vangsonde, 15 die de helft van een affiniteitspaar bevat en ten minste één detectiesonde worden toegepast, het gevormde hybride uit de oplossing wordt afgescheiden met behulp van de geïmmobiliseerde andere helft van het affiniteitspaar en wordt aangetoond met behulp van een als hybride gebonden detectiesonde, met het kenmerk, dat men kopieën vormt van het doelwitnucleïnezuur door polymerisatie in vitro onder toepassing van ten minste één gemodificeerde primer, waarbij de vangsonde als gemodificeerde primer fungeert, die 20 wordt opgenomen in de kopieën van het doelwitnucleïnezuur, alvorens de kopieën te hybridiseren met ten minste één detectiesonde en uit de oplossing af te scheiden.
2. Werkwijze voor het bepalen van de aanwezigheid of hoeveelheid van een doelwitnucleïnezuur door hybridisatie van een enkelstrengsvorm daarvan waarbij ten minste één detectiesonde en ten minste één niet-geïmmobiliseerde vangsonde, die de helft van een affiniteitspaar bevat, wordt toegepast het gevormde 25 hybride uit de oplossing wordt afgescheiden met behulp van de geïmmobiliseerde andere helft van het affiniteitspaar en wordt aangetoond met behulp van de als hybride gebonden detectiesonde, met het kenmerk, dat men kopieën vormt van het doelwitnucleïnezuur door polymerisatie in vitro onder toepassing van ten minste één gemodificeerde primer, waarbij de detectiesonde als gemodificeerde primer fungeert, die wordt opgenomen in de kopieën van het doelwitnucleïnezuur, alvorens de kopieën te hybridiseren met ten 30 minste één vangsonde, en uit de oplossing af te scheiden.
3. Set voor het bepalen van de aanwezigheid of hoeveelheid van een doelwitnucleïnezuur door een werkwijze volgens conclusie 1, die in verpakte vorm een eenheid met meerdere houders bevat met ten minste a) een paar primers geschikt voor het maken van kopieën van het doelwitnucleïnezuur 35 b) ten minste één detectiesonde die in staat is tot selectieve hybridisatie met het doelwitnucleïnezuur voorzien van ten minste één detecteerbare label c) ten minste één agens voor sjabloonafhankelijke polymerisatie d) de vier deoxynucleosidetrifosfaten met het kenmerk dat ten minste één van de primers een gemodificeerde primer is, die is voorzien van ten minste één helft van een affiniteitspaar dat kan gaan functione- 40 ren als vangsonde.
4. Set voor het bepalen van de aanwezigheid of hoeveelheid van een doelwitnucleïnezuur door een werkwijze volgens conclusie 2, die in verpakte vorm een eenheid met meerdere houders bevat met ten minste a) een paar primers geschikt voor het maken van kopieën van het doelwitnucleïnezuur 45 b) ten minste één detectiesonde die in staat is tot selectieve hybridisatie met het doelwitnucleïnezuur, voorzien van ten minste één detecteerbare label c) ten minste één agens voor sjabloonafhankelijke polymerisatie d) de vier deoxynucleosidetrifosfaten met het kenmerk, dat ten minste één van de primers een gemodificeerde primer is, voorzien van ten minste één detecteerbare label, zodat de onder b) genoemde 50 detectiesonde overeenkomt met ten minste één van de primers genoemd onder a) en de set tevens ten minste één houder bevat met e) ten minste één vangsonde, die in staat is tot selectieve hybridisatie van oplossing met doelwitnucleïnezuur en die is voorzien van ten minste één helft van een affiniteitspaar. 11 194922 Hierbij 1 blad tekening
NL8800594A 1987-03-11 1988-03-10 Werkwijze voor de bepaling van nucleïnezuren, alsmede set daarvoor. NL194922C (nl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US2460487A 1987-03-11 1987-03-11
US2460487 1987-03-11

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NL8800594A NL8800594A (nl) 1988-10-03
NL194922B NL194922B (nl) 2003-03-03
NL194922C true NL194922C (nl) 2003-07-04

Family

ID=21821443

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NL8800594A NL194922C (nl) 1987-03-11 1988-03-10 Werkwijze voor de bepaling van nucleïnezuren, alsmede set daarvoor.

Country Status (25)

Country Link
US (2) US5476769A (nl)
JP (1) JP3244500B2 (nl)
AT (1) AT395434B (nl)
AU (1) AU622104B2 (nl)
BE (1) BE1003990A5 (nl)
CA (1) CA1338207C (nl)
CH (1) CH677285A5 (nl)
DD (1) DD272664A5 (nl)
DE (1) DE3807994C2 (nl)
DK (1) DK175384B1 (nl)
ES (1) ES2006377A6 (nl)
FI (1) FI94429C (nl)
FR (1) FR2613077A1 (nl)
GB (1) GB2202328B (nl)
GR (1) GR1000315B (nl)
HU (1) HU202583B (nl)
IE (1) IE61664B1 (nl)
IL (3) IL85480A0 (nl)
IT (1) IT1216048B (nl)
LU (1) LU87153A1 (nl)
NL (1) NL194922C (nl)
NO (1) NO172909C (nl)
NZ (1) NZ223700A (nl)
PT (1) PT86937B (nl)
SE (1) SE500262C2 (nl)

Families Citing this family (172)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4038804A1 (de) * 1990-10-09 1992-04-16 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur genus- oder/und spezies-spezifischen detektion von bakterien in einer probenfluessigkeit
US5753433A (en) * 1909-12-05 1998-05-19 Boehringer Mannheim Gmbh Method for the sensitive detection of nucleic acids
US5714380A (en) 1986-10-23 1998-02-03 Amoco Corporation Closed vessel for isolating target molecules and for performing amplification
FI80476C (fi) * 1987-10-09 1990-06-11 Orion Yhtymae Oy Foerbaettrat hybridisationsfoerfarande, vid foerfarandet anvaent redskap och reagensfoerpackning.
JPH0775560B2 (ja) * 1987-12-25 1995-08-16 湧永製薬株式会社 検体中の目的核酸の検出法
CA1325761C (en) * 1987-12-25 1994-01-04 Takanori Oka Method of detecting an intended nucleic acid in a sample
WO1989009281A1 (en) * 1988-03-25 1989-10-05 Akzo N.V. Method for amplifying and detecting nucleic acid in a test liquid
US5817797A (en) * 1988-06-01 1998-10-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Sequencing DNA; a modification of the polymerase chain reaction
AU629845B2 (en) * 1988-08-30 1992-10-15 Abbott Laboratories Detection and amplification of target nucleic acid sequences
US5858652A (en) * 1988-08-30 1999-01-12 Abbott Laboratories Detection and amplification of target nucleic acid sequences
GB8827160D0 (en) * 1988-11-21 1988-12-29 Apothekernes Lab Detection & quantitative determination of rna & dna
CA2002076A1 (en) * 1988-11-21 1990-05-21 Brent A. Burdick Diagnostic kit and method using a solid phase capture means for detecting nucleic acids
DK175170B1 (da) * 1988-11-29 2004-06-21 Sangtec Molecular Diagnostics Fremgangsmåde og reagenskombination til bestemmmelse af nukleotidsekvenser
WO1990006374A1 (en) * 1988-12-09 1990-06-14 Amrad Corporation Limited Amplified dna assay
US5536648A (en) * 1988-12-09 1996-07-16 Amrad Corporation Limited Amplified DNA assay using a double stranded DNA binding protein
CA2004326A1 (en) * 1988-12-23 1990-06-23 Nanibushan Dattagupta Assay of sequences using amplified genes
DE69028325T2 (de) * 1989-01-19 1997-04-17 Behringwerke Ag Nukleinsäure-Amplifikation unter Verwendung eines Einzelprimers
ES2136059T5 (es) * 1989-02-13 2005-02-16 Geneco Pty. Ltd. Deteccion de una secuencia de acidos nucleicos o de un cambio en la misma.
US5856092A (en) * 1989-02-13 1999-01-05 Geneco Pty Ltd Detection of a nucleic acid sequence or a change therein
CA2011818A1 (en) * 1989-03-17 1990-09-17 Fred T. Oakes Methods for purification, amplification and detection of a nucleic acid
CA2013317A1 (en) * 1989-04-17 1990-10-17 Fred T. Oakes Diagnostic kit, primer composition and their use for replication or detection of nucleic acids
DE69003104T2 (de) * 1989-06-12 1994-03-17 Cis Bio International Saclay Verfahren zum nachweis von spezifischen sequenzen von nukleinsäuren und ihre verwendungen.
GB8920097D0 (en) * 1989-09-06 1989-10-18 Ici Plc Amplification processes
US5196305A (en) * 1989-09-12 1993-03-23 Eastman Kodak Company Diagnostic and amplification methods using primers having thymine at 3' end to overcome primer-target mismatch at the 3' end
US5232829A (en) * 1989-09-29 1993-08-03 Hoffmann-La Roche Inc. Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes
IL97222A (en) * 1990-02-16 1995-08-31 Orion Yhtymae Oy Method and Responder for Determining Special Changes to Nucleotide
US6013431A (en) 1990-02-16 2000-01-11 Molecular Tool, Inc. Method for determining specific nucleotide variations by primer extension in the presence of mixture of labeled nucleotides and terminators
US5387505A (en) * 1990-05-04 1995-02-07 Eastman Kodak Company Preparation and isolation of single-stranded biotinylated nucleic acids by heat avidin-biotin cleavage
NZ240079A (en) * 1990-10-09 1993-07-27 Boehringer Mannheim Gmbh Method for the detection of a nucleic acid or part thereof
WO1992011390A1 (en) * 1990-12-17 1992-07-09 Idexx Laboratories, Inc. Nucleic acid sequence detection by triple helix formation
DE4106251A1 (de) * 1991-02-28 1992-09-03 Boehringer Mannheim Gmbh Nachweis von bakterien mit hilfe einer nukleinsaeureamplifikation
US6004744A (en) 1991-03-05 1999-12-21 Molecular Tool, Inc. Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer
US5888819A (en) * 1991-03-05 1999-03-30 Molecular Tool, Inc. Method for determining nucleotide identity through primer extension
CA2065719A1 (en) 1991-04-30 1992-10-31 John B. Findlay Nucleic acid amplification and detection methods using rapid polymerase chain reaction cycle
US5387510A (en) * 1991-10-02 1995-02-07 Eastman Kodak Company Detection of amplified nucleic acid using secondary capture oligonucleotides and test kit
IT1252295B (it) * 1991-11-15 1995-06-08 Schiapparelli Diagnostici Ismu Metodo per rivelare acidi nucleici e relativo kit diagnostico
WO1993013227A1 (en) * 1991-12-23 1993-07-08 Chiron Corporation Cmv probes for use in solution phase sandwich hybridization assays
US5863724A (en) * 1994-04-13 1999-01-26 Baylor College Of Medicine Methods of screening for persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancy
US5658729A (en) 1994-10-11 1997-08-19 The University Of British Columbia Method, reagent and kit for evaluating susceptibility to premature atherosclerosis
DE4421901A1 (de) * 1994-06-23 1996-01-04 Bayer Ag Ein DNA-Schnelltest zum Nachweis von chinolonresistenten Staphylococcus aureus Erregern in klinischem Probenmaterial
US5705366A (en) * 1994-09-15 1998-01-06 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Coamplification of target nucleic acids using volume exclusion agent in reaction composition, test kit and test device useful therefor
US5654141A (en) * 1994-11-18 1997-08-05 Thomas Jefferson University Amplification based detection of bacterial infection
US5856096A (en) * 1995-09-20 1999-01-05 Ctrc Research Foundation Rapid and sensitive assays for detecting and distinguishing between processive and non-processive telomerase activities
WO1997035033A1 (en) 1996-03-19 1997-09-25 Molecular Tool, Inc. Method for determining the nucleotide sequence of a polynucleotide
US6132954A (en) * 1996-08-20 2000-10-17 Baylor College Of Medicine Methods of screening for agents that delay a cell cycle and compositions comprising era and an analogue of wild-type era
US6071493A (en) * 1996-09-20 2000-06-06 Baylor College Of Medicine Method of screening for an agent that inhibits mononuclear phagocyte-plaque component complex formation
US6043283A (en) * 1996-09-20 2000-03-28 Baylor College Of Medicine Tyramine compounds and their neuronal effects
US6262242B1 (en) 1997-01-30 2001-07-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Tumor suppressor designated TS10Q23.3
US6482795B1 (en) 1997-01-30 2002-11-19 Myriad Genetics, Inc. Tumor suppressor designated TS10q23.3
US6713300B1 (en) 1997-02-27 2004-03-30 University Of Utah Research Foundation Nucleic acid and amino acid sequences for ATP-binding cassette transporter and methods of screening for agents that modify ATP-binding cassette transporter
IL122147A0 (en) * 1997-11-10 1998-04-05 Technion Res & Dev Foundation Method for labeling polynucleotides
EP1749834B1 (en) 1997-12-18 2012-04-25 Monsanto Technology LLC Insect-resistant transgenic plants and methods for improving delta-endotoxin activity against target insects
US6673914B1 (en) 1998-01-22 2004-01-06 John Wayne Cancer Institute Human tumor-associated gene
US20020147143A1 (en) 1998-03-18 2002-10-10 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
DE19824900B4 (de) 1998-06-04 2006-05-04 Roche Diagnostics Gmbh DNA-Nachweis über einen Strangreassoziationskomplex
US6743906B1 (en) 1998-10-02 2004-06-01 Board Of Regents, The University Of Texas PPP2R1B is a tumor suppressor
US6468523B1 (en) 1998-11-02 2002-10-22 Monsanto Technology Llc Polypeptide compositions toxic to diabrotic insects, and methods of use
WO2000029008A2 (en) 1998-11-16 2000-05-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Hiv-specific t-cell induction
US6432642B1 (en) * 1999-01-15 2002-08-13 Pe Corporation (Ny) Binary probe and clamp composition and methods for a target hybridization detection
US6156515A (en) 1999-02-09 2000-12-05 Urocor, Inc. Prostate-specific gene for diagnosis, prognosis and management of prostate cancer
CA2368194A1 (en) 1999-04-30 2000-11-09 University Of Florida Adeno-associated virus-delivered ribozyme compositions and methods of use
PT1471926E (pt) 1999-06-01 2011-03-11 Baylor College Medicine Composições e métodos para a utilização terapêutica de uma sequência associada a atonal
US20040002068A1 (en) 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
EP2192128A3 (en) 2000-04-21 2010-09-22 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
JP2004513615A (ja) 2000-06-28 2004-05-13 コリクサ　コーポレイション 肺癌の治療および診断のための組成物および方法
US20020164715A1 (en) 2000-07-10 2002-11-07 Lin Ji Chromosome 3p21.3 genes are tumor suppressors
CA2446788A1 (en) 2001-05-09 2002-11-14 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer
EP1399541A4 (en) 2001-05-22 2005-04-13 Univ Chicago RNA POLYMERASE DEPENDENT ON SINGLE VIBRATION N4 DNA
EP2135960A1 (en) 2001-09-19 2009-12-23 Intergenetics Incorporated Genetic analysis for stratification of cancer risk by determining the allelic profile of the VDR-ApaI and CYP11B2 genes
EP1908851A3 (en) 2001-09-19 2008-06-25 Intergenetics Incorporated Genetic analysis for stratification of cancer risk
ES2205998B1 (es) * 2001-12-14 2005-08-16 Consejo Sup. Investig. Cientificas. Procedimiento para la deteccion del virus del amarilleo de las venas del pepino (cvyv).
DK2224012T3 (da) 2001-12-17 2013-05-13 Corixa Corp Sammensætninger og fremgangsmåder til terapi og diagnose af inflammatoriske tarmsygdomme
US20060009409A1 (en) 2002-02-01 2006-01-12 Woolf Tod M Double-stranded oligonucleotides
CA2474910A1 (en) 2002-02-01 2003-08-07 Sequitur, Inc. Oligonucleotide compositions with enhanced efficiency
CA2501188C (en) 2002-07-15 2012-05-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Combinatorial protein library screening by periplasmic expression
AU2003258168B2 (en) 2002-08-12 2009-10-29 Sillajen Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions concerning poxviruses and cancer
AU2002951411A0 (en) 2002-09-16 2002-09-26 The University Of Sydney Genotype screen
US8349276B2 (en) 2002-09-24 2013-01-08 Duke University Apparatuses and methods for manipulating droplets on a printed circuit board
US7960522B2 (en) 2003-01-06 2011-06-14 Corixa Corporation Certain aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use
EP2940028B8 (en) 2003-01-06 2017-09-27 Corixa Corporation Certain aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use
DK2374900T3 (en) 2003-03-07 2016-10-17 Rubicon Genomics Inc Polynucleotides for amplification and analysis of the total genomic and total transcription libraries generated by a DNA polymerization
EP1654361B2 (en) 2003-07-25 2023-01-18 Life Technologies Corporation Methods and compositions for preparing rna from a fixed sample
US20050059024A1 (en) 2003-07-25 2005-03-17 Ambion, Inc. Methods and compositions for isolating small RNA molecules
CN101133157A (zh) 2004-06-03 2008-02-27 阿什洛米克斯控股有限公司 诊断应激的药物和方法
WO2006017724A1 (en) * 2004-08-06 2006-02-16 Becton, Dickinson And Company Sequences and methods for detection of cytomegalovirus
WO2006031955A2 (en) 2004-09-14 2006-03-23 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Method for treatment with bucindolol based on genetic targeting
CA2584230C (en) 2005-05-06 2012-11-27 Gen-Probe Incorporated Methods of nucleic acid target capture
EP2476761A3 (en) 2005-07-07 2012-10-17 Athlomics Pty Ltd Polynucleotide marker genes and their expression, for diagnosis of endotoxemia
US7494788B2 (en) 2005-07-11 2009-02-24 Molecular Kinetics, Inc. Entropic bristle domain sequences and their use in recombinant protein production
US8980246B2 (en) 2005-09-07 2015-03-17 Sillajen Biotherapeutics, Inc. Oncolytic vaccinia virus cancer therapy
US8249814B2 (en) 2005-10-21 2012-08-21 Genenews Inc. Method, computer readable medium, and system for determining a probability of colorectal cancer in a test subject
EP2368569A3 (en) 2006-01-18 2012-05-02 University Of Chicago Compositions and methods related to staphylococcal bacterium proteins
WO2007106580A2 (en) 2006-03-15 2007-09-20 Micronics, Inc. Rapid magnetic flow assays
ES2551892T3 (es) 2006-09-15 2015-11-24 Ottawa Health Research Institute Rhabdovirus oncolítico
DK2102239T3 (da) 2006-11-30 2012-05-29 Res Dev Foundation Forbedrede immunoglobulin-biblioteker
US9938641B2 (en) * 2006-12-18 2018-04-10 Fluidigm Corporation Selection of aptamers based on geometry
US8445267B2 (en) 2007-04-09 2013-05-21 University Of Florida Research Foundation, Inc. Tyrosine-modified recombinant rAAV vector compositions and methods for use
EP2155789B1 (en) 2007-05-01 2013-07-24 Research Development Foundation Immunoglobulin fc libraries
BRPI0920041A2 (pt) 2008-10-06 2017-06-27 Univ Chicago composições e processos relacionados às proteínas eap, emp e/ou adsa bacterianas
SI3281947T1 (sl) 2009-04-03 2020-07-31 The University Of Chicago Sestave in metode v zvezi z variantami proteina A (SPA)
ES2618881T3 (es) 2009-04-22 2017-06-22 Indiana University Research And Technology Corporation Colágeno V para su uso en el tratamiento del asma
JP5785942B2 (ja) 2009-06-29 2015-09-30 ルミネックス コーポレーション ヘアピンコンフォメーションを有するキメラプライマーおよびその使用法
EP2272979A1 (en) 2009-06-30 2011-01-12 Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) Method for testing a subject thought to be predisposed to having cancer
ES2652340T3 (es) 2009-07-17 2018-02-01 Bioatla Llc Selección y evolución simultáneas e integradas de rendimiento y expresión de proteínas humanas en huéspedes de producción
US9409983B2 (en) 2009-07-23 2016-08-09 The Board Of Trustess Of The University Of Illinois Methods and compositions involving PBEF inhibitors for lung inflammation conditions and diseases
WO2011032088A1 (en) 2009-09-11 2011-03-17 Arca Biopharma, Inc. Polymorphisms in the pde3a gene
JP5879266B2 (ja) 2009-09-14 2016-03-08 シラジェン バイオセラピューティクス インコーポレイテッド 腫瘍崩壊性ワクシニアウイルスの併用癌療法
CA2836117C (en) 2009-12-10 2017-08-15 Ottawa Hospital Research Institute Oncolytic rhabdovirus
EP2515899B1 (en) 2009-12-23 2016-05-25 ARCA biopharma, Inc. Methods and compositions for cardiovascular diseases and conditions
JP5791634B2 (ja) 2010-01-29 2015-10-07 マイクロニクス， インコーポレイテッド サンプル−回答型のマイクロ流体カートリッジ
EP2555794A4 (en) 2010-04-05 2014-01-15 Univ Chicago PROTEIN A (SPA) ANTIBODY COMPOSITIONS AND METHODS AS AN IMMUNE RESPONSE AMPLIFIER
NZ602897A (en) 2010-04-23 2014-09-26 Univ Florida Raav-guanylate cyclase compositions and methods for treating leber’s congenital amaurosis-1 (lca1)
US8821894B2 (en) 2010-07-02 2014-09-02 The University Of Chicago Compositions and methods related to protein A (SpA) variants
CN105924499B (zh) 2010-07-16 2020-09-15 生物蛋白有限公司 蛋白演化的新方法
US9095540B2 (en) 2010-09-09 2015-08-04 The University Of Chicago Methods and compositions involving protective staphylococcal antigens
EP2455485A1 (de) 2010-11-19 2012-05-23 Anagnostics Bioanalysis GmbH Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren
JP6121910B2 (ja) 2011-01-04 2017-04-26 シラジェン バイオセラピューティクス インコーポレイテッド 腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与による腫瘍抗原に対する抗体の生成および腫瘍特異的補体依存性細胞傷害の生成
JP6228014B2 (ja) 2011-02-07 2017-11-08 リサーチ ディベロップメント ファウンデーション 操作された免疫グロブリンＦｃポリペプチド
WO2012158238A2 (en) 2011-02-28 2012-11-22 University Of Iowa Research Foundation Anti-müllerian hormone changes in pregnancy and prediction ofadverse pregnancy outcomes and gender
WO2012120377A2 (en) 2011-03-08 2012-09-13 King Abdullah University Of Science And Technology Molecular biomarker set for early detection of ovarian cancer
EP2694534B1 (en) 2011-04-08 2018-06-20 Evaxion Biotech ApS Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting staphylococcus aureus
US8945588B2 (en) 2011-05-06 2015-02-03 The University Of Chicago Methods and compositions involving protective staphylococcal antigens, such as EBH polypeptides
US9364532B2 (en) 2011-06-08 2016-06-14 Children's Hospital Of Eastern Ontario Research Institute Inc. Compositions and methods for glioblastoma treatment
EP2723365A1 (en) 2011-06-21 2014-04-30 Oncofactor Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of cancer
WO2013036799A2 (en) 2011-09-09 2013-03-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions involving nkg2d inhibitors and cancer
EP2766388A1 (en) 2011-10-12 2014-08-20 Møller, Niels Iversen Peptides derived from campylobacter jejuni and their use in vaccination
US20140349858A1 (en) 2011-12-22 2014-11-27 Ibis Bioscience, Inc. Amplification of a sequence from a ribonucleic acid
EP2809783A2 (en) 2012-02-02 2014-12-10 Invenra, Inc. High throughput screen for biologically active polypeptides
EP3805395A1 (en) 2012-04-26 2021-04-14 University Of Chicago Staphylococcal coagulase antigens and methods of their use
CA2883499C (en) * 2012-08-31 2020-07-14 Toray Industries, Inc. Method for detecting target nucleic acid
ES2730690T3 (es) 2012-12-07 2019-11-12 Suppremol Gmbh Estratificación y tratamiento de pacientes que padecen púrpura trombocitopénica idiopática
KR20150097764A (ko) 2012-12-21 2015-08-26 마이크로닉스 인코포레이티드. 휴대형 형광 검출 시스템 및 미량분석 카트리지
KR20150096788A (ko) 2012-12-21 2015-08-25 마이크로닉스 인코포레이티드. 마이크로 유체공학 용도를 위한 저탄성 막
JP6498125B2 (ja) 2012-12-21 2019-04-10 マイクロニクス， インコーポレイテッド 流体回路および関連する製造方法
WO2014116721A1 (en) 2013-01-22 2014-07-31 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Geminiviral vector for expression of rituximab
EP2958994B1 (en) 2013-02-21 2019-05-29 Turnstone Limited Partnership Vaccine composition
CA2911303C (en) 2013-05-07 2021-02-16 Micronics, Inc. Methods for preparation of nucleic acid-containing samples using clay minerals and alkaline solutions
WO2014182844A1 (en) 2013-05-07 2014-11-13 Micronics, Inc. Microfluidic devices and methods for performing serum separation and blood cross-matching
JP6484222B2 (ja) 2013-05-07 2019-03-13 マイクロニクス， インコーポレイテッド 核酸の調製および分析のためのデバイス
AU2014329535B2 (en) 2013-10-03 2017-09-07 Oklahoma Medical Research Foundation Biomarkers for systemic lupus erythematosus disease activity, and intensity and flare
US20160368952A1 (en) 2013-12-03 2016-12-22 Evaxion Biotech Aps Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting staphylococcus aureus
AU2015204840B2 (en) 2014-01-07 2020-01-30 Bioatla, Llc Proteins targeting orthologs
EP3154693B1 (en) 2014-06-11 2021-11-03 PerkinElmer Health Sciences, Inc. Method for performing a sample assay with a microfluidic cartridges with integrated assay controls
EP3777883A1 (en) 2014-11-13 2021-02-17 Evaxion Biotech ApS Peptides derived from acinetobacter baumannii and their use in vaccination
SG10202012249YA (en) 2014-12-08 2021-01-28 Berg Llc Use of markers including filamin a in the diagnosis and treatment of prostate cancer
WO2016113252A2 (en) 2015-01-12 2016-07-21 Evaxion Biotech Aps Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting klebsiella pneumoniae
EP3256490A1 (en) 2015-02-09 2017-12-20 Research Development Foundation Engineered immunoglobulin fc polypeptides displaying improved complement activation
EP3070178B1 (en) 2015-03-20 2020-02-12 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Method for diagnosing breast cancer
EP4116316A1 (en) 2015-07-04 2023-01-11 Evaxion Biotech A/S Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting pseudomonas aeruginosa
CN108026575B (zh) 2015-07-17 2022-08-19 哈佛学院董事及会员团体 扩增核酸序列的方法
WO2017040380A2 (en) 2015-08-28 2017-03-09 Research Development Foundation Engineered antibody fc variants
US10946084B2 (en) 2016-02-22 2021-03-16 Evaxion Biotech Aps Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting Staphylococcus aureus
AU2017278261A1 (en) 2016-06-05 2019-01-31 Berg Llc Systems and methods for patient stratification and identification of potential biomarkers
WO2018127545A1 (en) 2017-01-05 2018-07-12 Evaxion Biotech Aps Vaccines targeting pseudomonas aeruginosa
AU2018213315A1 (en) 2017-01-26 2019-07-25 Oklahoma Medical Research Foundation Biomarkers for systemic lupus erythematosus disease activity, and intensity and flare
AU2019360758B2 (en) 2018-10-18 2024-08-08 Oklahoma Medical Research Foundation Biomarkers for a Systemic Lupus Erythematosus (SLE) disease activity immune index that characterizes disease activity
EP3870207A1 (en) 2018-10-22 2021-09-01 Evaxion Biotech ApS Vaccines targeting m. catharrhalis
US20220143168A1 (en) 2019-02-27 2022-05-12 Evaxion Biotech A/S Vaccines targeting H. influenzae
CA3138566A1 (en) 2019-04-30 2020-11-05 Larimar Therapeutics, Inc. Frataxin-sensitive markers for determining effectiveness of frataxin replacement therapy
ES2960366T3 (es) 2019-08-09 2024-03-04 Univ Freiburg Albert Ludwigs Método para diagnosticar cáncer de mama
JP7489455B2 (ja) 2019-10-25 2024-05-23 チャンピン ナショナル ラボラトリー 哺乳類ｄｎａのメチル化の検出及び分析
WO2021140123A1 (en) 2020-01-06 2021-07-15 Evaxion Biotech Aps Vaccines targeting neisseria gonorrhoeae
WO2022006286A1 (en) 2020-06-30 2022-01-06 Lunglife Ai Methods for detecting lung cancer
WO2022047359A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Berg Llc Protein biomarkers for pancreatic cancer
CA3214819A1 (en) 2021-04-06 2022-10-13 Guisong WANG Protein markers for estrogen receptor (er)-positive luminal a(la)-like and luminal b1 (lb1)-like breast cancer
CA3214833A1 (en) 2021-04-06 2022-10-13 Bpgbio, Inc. Protein markers for the prognosis of breast cancer progression
WO2022216846A1 (en) 2021-04-06 2022-10-13 Berg Llc Protein markers for estrogen receptor (er)-positive-like and estrogen receptor (er)-negative-like breast cancer
JP2024526293A (ja) 2021-07-05 2024-07-17 エヴァクシオン・バイオテック・アクティエセルスカブ 淋菌を標的とするワクチン
US20230357851A1 (en) 2022-04-06 2023-11-09 Larimar Therapeutics, Inc. Frataxin-sensitive markers for monitoring frataxin-replacement therapy
WO2023230531A1 (en) 2022-05-24 2023-11-30 Lunglife Ai, Inc. Methods for detecting circulating genetically abnormal cells
WO2023240201A1 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Larimar Therapeutics, Inc. Frataxin-sensitive markers for monitoring progression and treatment of leigh syndrome
WO2023239940A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Research Development Foundation Engineered fcriib selective igg1 fc variants and uses thereof

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2422956A1 (fr) * 1978-04-13 1979-11-09 Pasteur Institut Procede de detection et de caracterisation d'un acide nucleique ou d'une sequence de celui-ci, et reactif enzymatique pour la mise en oeuvre de ce procede
US4302204A (en) * 1979-07-02 1981-11-24 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Transfer and detection of nucleic acids
FI63596C (fi) * 1981-10-16 1983-07-11 Orion Yhtymae Oy Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser
BG36086A1 (en) * 1982-01-19 1984-09-14 Glbov Method for inducing interferon
CA1223831A (en) * 1982-06-23 1987-07-07 Dean Engelhardt Modified nucleotides, methods of preparing and utilizing and compositions containing the same
US4605735A (en) * 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
CA1256005A (en) * 1983-09-26 1989-06-20 W. Peter Hansen Sandwich hybridization method for nucleic acid detection
US4749647A (en) * 1984-06-22 1988-06-07 Genetic Systems Corporation Polymerization-induced separation assay using recognition pairs
US4743562A (en) * 1984-08-21 1988-05-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Purified human cytomegalovirus protein
US4563417A (en) * 1984-08-31 1986-01-07 Miles Laboratories, Inc. Nucleic acid hybridization assay employing antibodies to intercalation complexes
US4883750A (en) * 1984-12-13 1989-11-28 Applied Biosystems, Inc. Detection of specific sequences in nucleic acids
FI72146C (fi) * 1985-01-02 1987-04-13 Orion Yhtymae Oy Foerfarande foer identifiering av nukleinsyror.
CA1272443A (en) * 1985-02-22 1990-08-07 Nanibhushan Dattagupta Solution-phase dual hybridization assay for detecting polynucleotide sequences
CA1278755C (en) * 1985-03-15 1991-01-08 William J. Knowles Labelling of oligonucleotides
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
DK171161B1 (da) * 1985-03-28 1996-07-08 Hoffmann La Roche Fremgangsmåde til påvisning af forekomst eller fravær af mindst én specifik nukleinsyresekvens i en prøve eller til skelnen mellem to forskellige nukleinsyresekvenser i denne prøve
GB8509367D0 (en) * 1985-04-12 1985-05-15 Amersham Int Plc Nucleic acid hybridisation
US4751177A (en) * 1985-06-13 1988-06-14 Amgen Methods and kits for performing nucleic acid hybridization assays
GB8515276D0 (en) * 1985-06-17 1985-07-17 Amersham Int Plc Nucleic acid sequencing
CA1284931C (en) * 1986-03-13 1991-06-18 Henry A. Erlich Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids
EP0238332A2 (en) * 1986-03-19 1987-09-23 Cetus Corporation Liquid hybridization method and kit for detecting the presence of nucleic acid sequences in samples
US4851331A (en) * 1986-05-16 1989-07-25 Allied Corporation Method and kit for polynucleotide assay including primer-dependant DNA polymerase

Also Published As

Publication number Publication date
CA1338207C (en) 1996-04-02
CH677285A5 (nl) 1991-04-30
FR2613077B1 (nl) 1994-11-10
NO172909B (no) 1993-06-14
GR1000315B (el) 1992-06-25
US5476769A (en) 1995-12-19
DK129588D0 (da) 1988-03-10
SE500262C2 (sv) 1994-05-24
NO881064D0 (no) 1988-03-10
AT395434B (de) 1992-12-28
NL8800594A (nl) 1988-10-03
SE8800864D0 (sv) 1988-03-10
NZ223700A (en) 1990-04-26
FI94429C (fi) 1995-09-11
PT86937A (pt) 1989-03-30
JP3244500B2 (ja) 2002-01-07
IE880697L (en) 1988-09-11
NO881064L (no) 1988-09-12
GB2202328A (en) 1988-09-21
IT1216048B (it) 1990-02-22
DE3807994C2 (de) 1998-08-27
FI94429B (fi) 1995-05-31
HU202583B (en) 1991-03-28
HUT50868A (en) 1990-03-28
DK129588A (da) 1988-09-12
AU622104B2 (en) 1992-04-02
US5989817A (en) 1999-11-23
LU87153A1 (fr) 1988-08-23
BE1003990A5 (fr) 1992-07-28
IL102154A0 (en) 1993-01-14
JPS63243875A (ja) 1988-10-11
DK175384B1 (da) 2004-09-20
FI880994A0 (fi) 1988-03-03
DD272664A5 (de) 1989-10-18
GB2202328B (en) 1991-07-03
ES2006377A6 (es) 1989-04-16
FR2613077A1 (fr) 1988-09-30
FI880994A (fi) 1988-09-12
PT86937B (pt) 1995-03-01
IL102154A (en) 1994-04-12
IT8819722A0 (it) 1988-03-10
NL194922B (nl) 2003-03-03
GR880100139A (en) 1989-01-31
IL85480A0 (en) 1988-07-31
IE61664B1 (en) 1994-11-16
GB8805681D0 (en) 1988-04-07
AU1193788A (en) 1988-09-15
ATA64388A (de) 1992-05-15
SE8800864L (sv) 1988-09-12
NO172909C (no) 1993-09-22
DE3807994A1 (de) 1988-09-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NL194922C (nl) Werkwijze voor de bepaling van nucleïnezuren, alsmede set daarvoor.
EP0370694A2 (en) Diagnostic kit and method using a solid phase capture means for detecting nucleic acids
EP0408738B1 (en) Nucleic acid test article and its use to detect a predetermined nucleic acid
EP0504278B1 (en) A new method for detecting a specific nucleic acid sequence in a sample of cells
JPH05508074A (ja) インビトロにおける増幅を用いたポリヌクレオチド捕捉アッセイ
JPH11506613A (ja) 競合増幅を用いる核酸配列検出方法
WO2006083925A2 (en) Highly orthogonal universal sequences for use in nucleic acid assays
JPH0398586A (ja) プライマー３′末端におけるプライマーと標的のミスマッチを克服する診断および増幅方法
Gudibande et al. Rapid, non-separation electrochemiluminescent DNA hybridization assays for PCR products, using 3′-labelled oligonucleotide probes
JP2644419B2 (ja) 核酸の固定化
US5616465A (en) Detection and isolation of nucleic acid sequences using competitive hybridization probes
US5827648A (en) Differential hybridization for relative quantification of variant populations
KR920007664B1 (ko) 핵산의 정제, 증폭 및 검사방법
US6187538B1 (en) Differential hybridization for relative quantification of variant populations
JPH0850130A (ja) 標的核酸の半定量的検出方法、試験要素および試験キット
EP0406280A1 (en) Method for amplifying and detecting nucleic acid in a test liquid
JPH074275B2 (ja) 核酸を増幅して検出するための方法及び診断試験キット
EP0543222A1 (en) Method for detecting nucleic acids and relative diagnostic kit

Legal Events

Date Code Title Description
BA A request for search or an international-type search has been filed
BB A search report has been drawn up
BC A request for examination has been filed
CNR Transfer of rights (patent application after its laying open for public inspection)

Free format text: SANGTEC MEDICAL AB

CNR Transfer of rights (patent application after its laying open for public inspection)

Owner name: SANGTEC MOLECULAR DIAGNOSTICS AB

V4 Discontinued because of reaching the maximum lifetime of a patent

Effective date: 20080310