ES2618881T3 - Colágeno V para su uso en el tratamiento del asma - Google Patents

Colágeno V para su uso en el tratamiento del asma Download PDF

Info

Publication number
ES2618881T3
ES2618881T3 ES10716439.4T ES10716439T ES2618881T3 ES 2618881 T3 ES2618881 T3 ES 2618881T3 ES 10716439 T ES10716439 T ES 10716439T ES 2618881 T3 ES2618881 T3 ES 2618881T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
sequence
polypeptide
sequences
tolerogenic
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES10716439.4T
Other languages
English (en)
Inventor
David S. Wilkes
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Indiana University Research and Technology Corp
Original Assignee
Indiana University Research and Technology Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Indiana University Research and Technology Corp filed Critical Indiana University Research and Technology Corp
Application granted granted Critical
Publication of ES2618881T3 publication Critical patent/ES2618881T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/39—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0008—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/007—Pulmonary tract; Aromatherapy
    • A61K9/0073—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/08—Bronchodilators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/12—Pulmonary diseases
    • G01N2800/122—Chronic or obstructive airway disorders, e.g. asthma COPD
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)

Abstract

Una composición para su uso en el tratamiento del asma en un paciente, o para su uso en la prevención del desarrollo o el empeoramiento del asma en un sujeto que está en riesgo de desarrollar asma, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de colágeno de tipo V, o uno de sus fragmentos tolerogénicos.

Description

imagen1
imagen2
imagen3
imagen4
imagen5
15
25
35
45
55
65
Cuando se comparan secuencias de polipéptidos, se dice que dos secuencias son "idénticas" si la secuencia de aminoácidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinean para la correspondencia máxima, según se describe a continuación. Las comparaciones entre dos secuencias se realizan generalmente comparando las secuencias a través de una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación", tal como se emplea en el presente documento, se refiere a un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, habitualmente de 30 a aproximadamente 75, de 40 a aproximadamente 50, en el cual una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia con el mismo número de posiciones contiguas después de haber alineado óptimamente las dos secuencias.
El alineamiento óptimo de las secuencias para su comparación puede realizarse empleando el programa Megalign del paquete Lasergene de software bioinformático (DNASTAR, Inc., Madison, WI), empleando los parámetros por defecto. Este programa incluye varios esquemas de alineamiento descritos en las siguientes referencias: Dayhoff,
M.O.
(1978), A model of evolutionary change in proteins -Matrices for detecting distant relationships, en Dayhoff,
M.O.
(ed.), Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC, vol. 5, supl. 3, pp. 345-358; Hein J. (1990), Unified Approach to Alignment and Phylogenes, pp. 626-645, Methods in Enzymology, vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. y Sharp, P.M., CABIOS, 5:151-153 (1989); Myers, E.W. y Muller W., CABIOS, 4:11-17 (1988); Robinson, E.D., Comb. Theor., 11:105 (1971); Saitou, N. Nei, M., Mol. Biol., Evol., 4:406-425 (1987); Sneath, P.H.A. y Sokal, R.R., Numerical Taxonomy -the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA (1973); Wilbur, W.J. y Lipman, D.J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:726-730 (1983).
Como alternativa, el alineamiento óptimo de las secuencias para su comparación puede realizarse por medio del algoritmo de identidad local de Smith y Waterman, Add. APL. Math., 2:482 (1981), por medio del algoritmo de alineamiento de identidad de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970), por medio de los métodos de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 2444 (1988), por medio de aplicaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección.
Un ejemplo preferido de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y de similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25:3389-3402 (1977), y Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990), respectivamente. BLAST y BLAST 2.0 pueden utilizarse, por ejemplo, con los parámetros descritos en el presente documento para determinar el porcentaje de identidad de secuencia para los polinucleótidos y los polipéptidos de la invención. Está disponible al público software para realizar los análisis BLAST a través de the National Center for Biotechnology Information. Para las secuencias de aminoácidos puede emplearse una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulada. La extensión de aciertos de palabras en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineamiento acumulada disminuye en la cantidad X desde su máximo valor logrado; la puntuación acumulada llega a cero o por debajo, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de restos de puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento.
En una estrategia preferida, el "porcentaje de identidad de secuencia" se determina comparando dos secuencias óptimamente alineadas a lo largo de una ventana de comparación de al menos 20 posiciones, en la que la porción de la secuencia del polipéptido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) de 20 % o menor, habitualmente del 5 al 15 %, o del 10 % al 12 %, comparado con las secuencias de referencia (que no comprenden adiciones ni deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que aparece el resto aminoácido idéntico en ambas secuencias, para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la secuencia de referencia (es decir, el tamaño de ventana), y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia.
Dentro de otras realizaciones ilustrativas, un polipéptido puede ser un polipéptido de fusión que comprende múltiples polipéptidos, tal como se describe en el presente documento, o que comprende al menos un polipéptido, tal como se describe en el presente documento, y una secuencia no relacionada, tal como un marcador de His para la purificación, o un péptido de transporte dirigido. Un compañero de fusión, por ejemplo, puede ayudar a la expresión de la proteína (un potenciador de la expresión) a unos rendimientos mayores que la proteína recombinante nativa. Pueden seleccionarse otros compañeros de fusión para aumentar la solubilidad del polipéptido o para permitir que el polipéptido pueda dirigirse a los compartimentos intracelulares deseados. Otros compañeros de fusión incluyen marcadores de afinidad, que facilitan la purificación del polipéptido. En ciertas realizaciones, un compañero de fusión aumenta la tolerogenicidad del polipéptido o aumenta su captación por las células. En otras realizaciones, un compañero de fusión comprende un potenciador de la respuesta inmunológica.
Los polipéptidos de fusión pueden prepararse, en general, empleando técnicas convencionales, que incluyen la conjugación química. Preferiblemente, un polipéptido de fusión se expresa como un polipéptido recombinante, lo cual permite la producción de niveles más altos, con relación a un polipéptido no fusionado, en un sistema de expresión. Brevemente, las secuencias de ADN que codifican los componentes del polipéptido pueden ensamblarse
15
25
35
45
55
65
por separado y acoplarse en un vector de expresión apropiado. El extremo 3’ de la secuencia de ADN que codifica un componente del polipéptido se acopla, con o sin un conector peptídico, con el extremo 5’ de una secuencia de ADN que codifica el segundo componente del polipéptido de modo que las fases de lectura de las secuencias quedan en fase. Esto permite la traducción en un único polipéptido de fusión que conserva la actividad biológica de ambos polipéptidos componentes.
Puede emplearse una secuencia conectora peptídica para separar el primer y el segundo componente del polipéptido a una distancia suficiente para asegurar que cada polipéptido se pliegue en su estructura secundaria y terciaria. Esta secuencia de conector peptídico se incorpora en el polipéptido de fusión empleando técnicas convencionales muy conocidas en la técnica. Las secuencias de conectores peptídicos adecuadas pueden elegirse basándose en los siguientes factores: (1) su capacidad para adoptar una conformación extendida flexible; (2) su incapacidad para adoptar una estructura secundaria que pueda interaccionar con los epítopos funcionales en el primer y el segundo polipéptido; y (3) la falta de restos hidrófobos o cargados que puedan reaccionar con los epítopos funcionales del polipéptido. Las secuencias de conectores peptídicos preferidos contienen restos Gly, Asn y Ser. También pueden emplearse otros aminoácidos casi neutros, tales como Thr y Ala, en la secuencia del conector. Las secuencias de aminoácidos que pueden emplearse de modo útil como conectores incluyen las descritas en Maratea et al., Gene, 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83:8258-8262, 1986; patente de EEUU n.º 4.935.233 y patente de EEUU n.º 4.751.180. La secuencia del conector puede tener una longitud, en general, de 1 a aproximadamente 50 aminoácidos. No son necesarias secuencias de conectores cuando el primer y el segundo polipéptido contengan regiones N-terminales de aminoácidos no esenciales que puedan emplearse para separar los dominios funcionales y evitar la interferencia estérica.
Las secuencias de ADN acopladas están unidas operablemente a elementos reguladores de la transcripción o de la traducción adecuados. Los elementos reguladores responsables de la expresión del ADN están localizados solo en la dirección 5’ con respecto a la secuencia de ADN que codifica los primeros polipéptidos. De modo similar, los codones de terminación requeridos para terminar la traducción y las señales de terminación de la transcripción solo están presentes en la dirección 3’ con respecto a la secuencia de ADN que codifica el segundo polipéptido.
Una realización de la invención implica polipéptidos de fusión y los polinucleótidos que los codifican, en los que el compañero de fusión comprende una señal de dirección capaz de dirigir un polipéptido al compartimento endosómico/lisosómico, tal como se describe en la patente de EEUU n.º 5.633.234. Un polipéptido tolerogénico de la invención, cuando está acoplado con esta señal de dirección, se asociará con más eficacia a las moléculas de MHC de clase II y, con ello, proporcionará una estimulación in vivo potenciada de las células T CD4+ apropiadas específicas para el polipéptido.
Los polipéptidos de la invención se preparan empleando cualquiera de una diversidad de técnicas sintéticas y/o recombinantes conocidas, y estas últimas se describen con más detalle a continuación. Los polipéptidos, las porciones y otros variantes que presenten, en general, menos de aproximadamente 150 aminoácidos pueden generarse por medios sintéticos, empleando técnicas muy conocidas por los expertos en la técnica. En un ejemplo ilustrativo, estos polipéptidos se sintetizan empleando cualquiera de las técnicas en fase sólida disponibles en el mercado, tales como el método de síntesis en fase sólida de Merrifield, en el que los aminoácidos son añadidos secuencialmente a una cadena de aminoácidos en crecimiento. Véase Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2146, 1963. El equipo para la síntesis automática de polipéptidos está disponible en el mercado en distribuidores tales como Perkin Elmer/Applied BioSystems Division (Foster City, CA), y puede aplicarse según las instrucciones del fabricante.
En general, las composiciones de polipéptidos (incluyendo polipéptidos de fusión) de la invención están aisladas. Un polipéptido "aislado" es un polipéptido que se retira de su entorno original. Por ejemplo, una proteína o un polipéptido natural está aislado si está separado de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural. Preferiblemente, estos polipéptidos también están purificados, por ejemplo, son al menos aproximadamente 90 % puros, más preferiblemente al menos aproximadamente 95 % puros, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 99 % puros.
La proteína de ColV puede purificarse a partir de una diversidad de fuentes o puede obtenerse de una fuente comercial (Collaborative Biomedical Products/Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, EEUU). Para practicar algunas de las realizaciones, puede ser necesario obtener un colágeno puro o parcialmente puro, o uno de sus fragmentos tolerogénicos, epítopos o porciones antigénicas. Estos materiales, por ejemplo, el colágeno de tipo V, o sus fragmentos, pueden obtenerse con facilidad a través de una diversidad de medios, incluyendo, pero sin limitación fuentes animales, cadáveres humanos o medios recombinantes. Otros métodos incluyen digestiones parciales del colágeno, tal como el colágeno de tipo V. A este respecto, el colágeno de tipo V humano puede extraerse de placenta humana u otras fuentes y purificarse por medio de precipitación diferencial con NaCl (Seyer y Kang, 1989). Por ejemplo, los tejidos placentarios se pican, se lavan y se suspenden en ácido acético 0,5 M que contiene NaCl 0,2 M, y se digieren con pepsina a 4 °C. Los sobrenadantes se aspiran de las muestras de ensayo centrifugados, el sedimento se recoge y se repite el procedimiento de extracción. Se combinan los sobrenadantes de las dos digestiones y se purifica el col(V) de los sobrenadantes mediante una precipitación diferencial con NaCl en ácido acético 0,5 M (Smith et al., 1985; Seyer y Kang, 1989). El colágeno de tipo V en general es soluble en NaCl
15
25
35
45
55
65
0,7 M y precipita en NaCl 1,2 M.
En las realizaciones en que sea necesario purificar las cadenas α(V), el ciclo de solubilización en ácido acético y precipitación con NaCl puede repetirse hasta que se obtenga una preparación de colágeno de tipo V con una proporción de cadena α α1(V)/α2(V) de aproximadamente 2, según se determina mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (Smith et al., 1985), u otro método apropiado conocido por los expertos en la técnica. La separación de α1(V) de α2(V) puede lograrse por medio de cromatografía en DEAE-celulosa (Seyer y Kang, 1989) u otros métodos conocidos por los expertos en la técnica, tales como los descritos en Protein Purification Protocols, ed. Shawn Doonan, Humana Press, 1996. Las cadenas α1(V) y α2(V) pueden eluirse de la columna y la pureza puede confirmarse mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS, tal como se ha indicado previamente (Smith, Jr. et al., 1985). El col(V) intacto, o las cadenas α1(V) y α2(V) pueden diluirse en PBS (0,5 mg/ml) u otro tampón apropiado hasta que se empleen.
La presente invención, en ciertas realizaciones, proporciona polinucleótidos que codifican las proteínas de colágeno de la presente invención. Se indican ejemplos de polinucleótidos en SEQ ID NO: 1, 3 y 5, y sus fragmentos, que codifican un fragmento tolerogénico de una proteína de colágeno, tal como se describe en el presente documento.
Los términos "ADN" y "polinucleótido" se emplean fundamentalmente de modo intercambiable en el presente documento para indicar una molécula de ADN que se ha aislado y separado totalmente del ADN genómico total de una especie concreta. "Aislado", tal como se emplea en el presente documento, significa que un polinucleótido está sustancialmente separado de otras secuencias codificantes, y que la molécula de ADN ya no contiene porciones grandes de ADN codificador no relacionado, tales como fragmentos cromosómicos grandes u otros genes funcionales o regiones codificantes de polipéptidos. Por supuesto, esto se refiere a la molécula de ADN tal como se aísla originariamente, y no excluye genes o regiones codificantes que hayan sido posteriormente añadidas al segmento por el ser humano.
Tal como entenderán los expertos en la técnica, las composiciones de polinucleótidos de esta invención pueden incluir secuencias genómicas, secuencias extragenómicas y codificadas por plásmidos, y segmentos de genes modificados más pequeños que expresan, o pueden adaptarse para que expresen, proteínas, polipéptidos, péptidos y similares. Estos segmentos pueden estar aislados en la naturaleza o modificarse de modo sintético por el ser humano.
Las composiciones de polinucleótidos de la presente invención pueden identificarse, prepararse y/o manipularse empleando cualquiera de una diversidad de técnicas bien establecidas (véase, en general, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel et al. (2001, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., NY, NY) y otras referencias bibliográficas similares).
Están disponibles muchos procesos dependientes de moldes para amplificar una secuencia diana de interés presente en una muestra. Uno de los métodos de amplificación más conocidos es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR™), que se describe en detalle en las patentes de EEUU nos. 4.683.195, 4.683.202 y 4.800.159.
Cualquiera de una serie de otros procesos dependientes de moldes, muchos de los cuales son variaciones de la técnica de amplificación de PCR™, son conocidos y están disponibles en la técnica. Por ejemplo, algunos de estos métodos incluyen la reacción en cadena de la ligasa (denominada LCR), descrita, por ejemplo, en la solicitud de patente europea publicada n.º 320.308 y en la patente de EEUU n.º 4.883.750; Qbeta replicasa, descrita en la solicitud de patente internacional PCT publicada n.º PCT/US87/00880; la amplificación por desplazamiento de hebra (SDA) y la reacción de reparación de cadenas (RCR). Otros métodos de amplificación se describen en la solicitud de patente del Reino Unido n.º 2.202.328, y en la solicitud de patente internacional PCT publicada n.º PCT/US89/01025. Otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos incluyen sistemas de amplificación basados en la transcripción (TAS) (solicitud de patente internacional PCT publicada n.º WO 88/10315), que incluyen la amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA) y 3SR. La solicitud de patente europea publicada n.º 329.822 describe un proceso de amplificación de ácidos nucleicos que implica la síntesis cíclica de ARN monocatenario ("ARNmc"), ADNmc, y ADN bicatenario (ADNbc). La solicitud de patente internacional PCT publicada n.º WO 89/06700 describe un esquema de amplificación de secuencias de ácidos nucleicos basado en la hibridación de una secuencia de promotor/cebador con un ADN monocatenario ("ADNmc") diana, seguido de la transcripción de muchas copias de ARN de la secuencia. Los expertos en la técnica también conocen otros métodos de amplificación, tales como "RACE" (Frohman, 1990), y "PCR anclada" (Ohara, 1989).
Una porción amplificada de un polinucleótido de la presente invención puede emplearse para aislar un gen de longitud completa a partir de una biblioteca adecuada (por ejemplo, una biblioteca de ADNc de tumor) empleando técnicas muy conocidas.
Tal como reconocerán los expertos en la técnica, los polinucleótidos de la invención pueden ser monocatenarios (codificantes o antisentido) o bicatenarios, y pueden ser moléculas de ADN (genómico, ADNc o sintético) o de ARN. Las moléculas de ARN pueden incluir moléculas de ARNnh, que contienen intrones y se corresponden con una
15
25
35
45
55
65
molécula de ADN uno a uno, y moléculas de ARNm, que no contienen intrones. Otras secuencias codificantes o no codificantes pueden estar presentes, aunque no es necesario, dentro de un polinucleótido de la presente invención, y un polinucleótido puede estar unido, aunque no es necesario, a otras moléculas y/o materiales de soporte.
Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifica un polipéptido/proteína de la invención, o una de sus porciones) o pueden comprender una secuencia que codifica una variante o derivado, preferiblemente, una variante o derivado tolerogénicos, de dicha secuencia.
En otras realizaciones relacionadas, la presente invención proporciona variantes de polinucleótidos que poseen una identidad sustancial con las secuencias descritas en el presente documento en SEQ ID NO: 1, 3 y 5, por ejemplo, las que comprenden al menos 70 % de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o mayor de identidad de secuencia, comparado con una secuencia polinucleotídica de esta invención, empleando los métodos descritos en el presente documento (por ejemplo, análisis BLAST empleando parámetros convencionales, tal como se describe a continuación). Los expertos en la técnica reconocerán que estos valores pueden ajustarse de modo apropiado para determinar la correspondiente identidad de las proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos tomando en cuenta la degeneración de los codones, la similitud de los aminoácidos, la colocación de la fase de lectura y similares.
Generalmente, los variantes de polinucleótidos contendrán una o más sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones, preferiblemente de modo que la actividad tolerogénica del polipéptido codificado por la variante del polinucleótido no disminuya sustancialmente, con relación a un polipéptido codificado por una secuencia polinucleotídica específicamente indicada en el presente documento. También debe entenderse que el término "variantes" incluye genes homólogos de origen xenogénico.
En otras realizaciones, la presente invención proporciona fragmentos polinucleotídicos que comprenden o consisten en diversas longitudes de tramos contiguos de secuencia idénticos o complementarios con una o más de las secuencias descritas en el presente documento. Por ejemplo, en esta invención se proporcionan polinucleótidos que comprenden o consisten en al menos aproximadamente 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 o 1000 o más nucleótidos contiguos de una o más de las secuencias descritas en el presente documento, así como todas las longitudes intermedias incluidas. Se entenderá con facilidad que las "longitudes intermedias", en este contexto, significa cualquier longitud entre los valores indicados, tales como 16, 17, 18, 19, etc.; 21, 22, 23, etc.; 30, 31, 32, etc.; 50, 51, 52, 53, etc.; 100, 101, 102, 103, etc.; 150, 151, 152, 153, etc.; incluyendo todos los números enteros entre 200-500; 500-1.000, y similares. Una secuencia polinucleotídica, tal como se describe en el presente documento, puede ser extendida en uno o ambos extremos por nucleótidos adicionales que no se encuentran en la secuencia nativa. Esta secuencia adicional puede consistir en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos en cada extremo de la secuencia descrita o en ambos extremos de la secuencia descrita.
En otra realización de la invención, se proporcionan composiciones de polinucleótidos que pueden hibridarse en condiciones de rigurosidad moderada a alta con una secuencia polinucleotídica proporcionada en el presente documento, o uno de sus fragmentos, o una de sus secuencias complementarias. Las técnicas de hibridación son muy conocidas en la técnica de la biología molecular. Como ejemplo, unas condiciones de rigurosidad moderada adecuadas para ensayar la hibridación de un polinucleótido de esta invención con otros polinucleótidos incluyen un prelavado en una disolución de SSC 5X, SDS al 0,5 %, EDTA 1,0 mM (pH 8,0); una hibridación a 50 °C-60 °C, SSC 5X, durante la noche; seguido de dos lavados a 65 °C durante 20 minutos con cada uno de SSC 2X, 0,5X y 0,2X que contiene SDS al 0,1 %. Los expertos en la técnica entenderán que la rigurosidad de la hibridación puede manipularse con facilidad, tal como alterando el contenido en sales de la disolución de hibridación y/o la temperatura a la cual se realiza la hibridación. Por ejemplo, en otra realización, unas condiciones de alta rigurosidad adecuadas incluyen las descritas anteriormente, con la excepción de que la temperatura de hibridación aumenta, por ejemplo, hasta 60-65 °C o 65-70 °C.
En una realización, estas variantes de polinucleótidos codifican polipéptidos que presentan un nivel de actividad tolerogénica de al menos aproximadamente 50 %, preferiblemente al menos aproximadamente 70 %, y más preferiblemente al menos aproximadamente 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o más, de la de una secuencia de polipéptido específicamente indicada en el presente documento.
Los polinucleótidos de la presente invención, o sus fragmentos, independientemente de la longitud de la propia secuencia codificante, pueden combinarse con otras secuencias de ADN, tales como promotores, señales de poliadenilación, otros sitios de enzimas de restricción, sitios de clonación múltiple, otros segmentos codificantes y similares, de modo que su longitud global puede variar considerablemente. Por tanto, se contempla que puede emplearse un fragmento de ácido nucleico de casi cualquier longitud, estando la longitud total preferiblemente limitada por la facilidad de preparación y uso del protocolo de ADN recombinante previsto. Por ejemplo, se contemplan unos ejemplos de segmentos polinucleotídicos con unas longitudes totales de aproximadamente 10.000, aproximadamente 5000, aproximadamente 3000, aproximadamente 2.000, aproximadamente 1.000, aproximadamente 500, aproximadamente 200, aproximadamente 100, aproximadamente 50 pares de bases de longitud y similares (incluyendo todas las longitudes intermedias) como útiles en muchas aplicaciones de esta invención.
15
25
35
45
55
65
Cuando se comparan secuencias polinucleotídicas, se dice que dos secuencias son "idénticas" si la secuencia de nucleótidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinean para la correspondencia máxima, según se describe a continuación. Las comparaciones entre dos secuencias se realizan generalmente comparando las secuencias a través de una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación", tal como se emplea en el presente documento, se refiere a un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, habitualmente de 30 a aproximadamente 75, de 40 a aproximadamente 50, en el cual una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia con el mismo número de posiciones contiguas después de haber alineado óptimamente las dos secuencias.
El alineamiento óptimo de las secuencias para su comparación puede realizarse empleando el programa Megalign del paquete Lasergene de software bioinformático (DNASTAR, Inc., Madison, WI), empleando los parámetros por defecto. Este programa incluye varios esquemas de alineamiento descritos en las siguientes referencias: Dayhoff,
M.O.
(1978), A model of evolutionary change in proteins -Matrices for detecting distant relationships, en Dayhoff,
M.O.
(ed.), Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC, vol. 5, supl. 3, pp. 345-358; Hein J., Unified Approach to Alignment and Phylogenes, pp. 626-645 (1990); Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. y Sharp, P.M., CABIOS, 5:151-153 (1989); Myers, E.W. and Muller W., CABIOS 4:11-17 (1988); Robinson, E.D., Comb. Theor., 11:105 (1971); Saitou,
N.
Nei, M., Mol. Biol., Evol., 4:406-425 (1987); Sneath, P.H.A. y Sokal, R.R., Numerical Taxonomy -the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA (1973); Wilbur, W.J. y Lipman, D.J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:726-730 (1983).
Como alternativa, el alineamiento óptimo de las secuencias para su comparación puede realizarse por medio del algoritmo de identidad local de Smith y Waterman, Add. APL. Math., 2:482 (1981), por medio del algoritmo de alineamiento de identidad de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970), por medio de los métodos de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 2444 (1988), por medio de aplicaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección.
Un ejemplo preferido de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y de similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25:3389-3402 (1977), y Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990), respectivamente. BLAST y BLAST 2.0 pueden utilizarse, por ejemplo, con los parámetros descritos en el presente documento para determinar el porcentaje de identidad de secuencia para los polinucleótidos de la invención. El software para realizar los análisis BLAST está disponible al público a través de the National Center for Biotechnology Information. En un ejemplo ilustrativo, las puntuaciones acumuladas pueden calcularse empleando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de restos apareados; siempre >0) y N (puntuación de penalización para restos desapareados; siempre <0). La extensión de aciertos de palabras en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineamiento acumulada disminuye en la cantidad X desde su máximo valor logrado; la puntuación acumulada llega a cero o por debajo, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de puntuación negativa;
o se alcanza el final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) emplea, por defecto, una longitud de palabra (W) de 11, y una esperanza (E) de 10, y los alineamientos de la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:10915 (1989)) emplean (B) de 50, una esperanza (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas hebras.
Preferiblemente, el "porcentaje de identidad de secuencia" se determina comparando dos secuencias óptimamente alineadas a lo largo de una ventana de comparación de al menos 20 posiciones, en la que la porción de la secuencia polinucleotídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) de 20 %
o menor, habitualmente del 5 al 15 %, o del 10 % al 12 %, comparado con las secuencias de referencia (que no comprenden adiciones ni deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que aparecen bases de ácido nucleico idénticas en ambas secuencias, para producir el número de posiciones apareadas, dividiendo el número de posiciones apareadas entre el número total de posiciones en la secuencia de referencia (es decir, el tamaño de ventana), y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia.
Los expertos en la técnica apreciarán que, como resultado de la degeneración del código genético, existen muchas secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido, tal como se describe en el presente documento. Algunos de estos polinucleótidos presentan una homología mínima con la secuencia de nucleótidos de cualquier gen nativo. No obstante, los polinucleótidos que varían debido a las diferencias en el uso de los codones son contemplados específicamente por la presente invención. Además, los alelos de los genes que comprenden las secuencias polinucleotídicas proporcionadas en el presente documento se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Los alelos son genes endógenos que están alterados como resultado de una o más mutaciones, tales como deleciones, adiciones y/o sustituciones de nucleótidos. El ARNm y la proteína resultantes pueden tener una estructura o una función alteradas, aunque no necesariamente. Los alelos pueden identificarse empleando técnicas convencionales (tales como hibridación, amplificación y/o comparaciones con secuencias de bases de datos).
15
25
35
45
55
65
Por tanto, en otra realización de la invención, se emplea una estrategia de mutagénesis, tal como la mutagénesis específica de sitio, para la preparación de variantes y/o derivados tolerogénicos de los polipéptidos descritos en el presente documento. Mediante esta estrategia pueden realizarse modificaciones específicas en una secuencia polipeptídica a través de la mutagénesis de los polinucleótidos subyacentes que la codifican. Estas técnicas proporcionan una estrategia sencilla para preparar y ensayar variantes de secuencia, por ejemplo, incorporando una
o más de las anteriores consideraciones, mediante la introducción de uno o más cambios en la secuencia de nucleótidos del polinucleótido.
La mutagénesis específica de sitio permite la producción de mutantes mediante el uso de secuencias oligonucleotídicas específicas que codifican la secuencia de ADN de la mutación deseada, así como un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proporcionar una secuencia de cebador con el suficiente tamaño y complejidad de secuencia como para formar un dúplex estable a ambos lados de la zona de unión de la deleción que se está atravesando. Las mutaciones pueden emplearse en una secuencia polinucleotídica seleccionada para mejorar, alterar, disminuir, modificar o cambiar de otro modo las propiedades del propio polinucleótido y/o para alterar las propiedades, la actividad, la composición, la estabilidad o la secuencia primaria del polipéptido codificado.
En ciertas realizaciones de la presente invención, los inventores contemplan la mutagénesis de las secuencias polinucleotídicas descritas para alterar una o más propiedades del polipéptido codificado, tales como la tolerogenicidad de un polipéptido. Las técnicas de mutagénesis específica de sitio son muy conocidas en la técnica y se emplean mucho para crear variantes de polipéptidos y de polinucleótidos. Por ejemplo, la mutagénesis específica de sitio a menudo se emplea para alterar una porción específica de una molécula de ADN. En estas realizaciones, se emplea un cebador que generalmente comprende de aproximadamente 14 a aproximadamente 25 nucleótidos de longitud, y con aproximadamente 5 a aproximadamente 10 restos a ambos lados de la zona de unión de la secuencia que se está alterando.
Como apreciarán los expertos en la técnica, las técnicas de mutagénesis específica de sitio a menudo han empleado un vector de fago, que existe en forma monocatenaria y bicatenaria. Los vectores típicos útiles en la mutagénesis dirigida incluyen vectores tales como el fago M13. Estos fagos pueden obtenerse en el mercado con facilidad y su uso es muy conocido, en general, por los expertos en la técnica. En la mutagénesis dirigida también se emplean habitualmente plásmidos bicatenarios, con lo que se elimina la etapa de transferir el gen de interés desde un plásmido a un fago.
En general, la mutagénesis dirigida según la presente se realiza obteniendo, en primer lugar, un vector monocatenario o separando las dos hebras de un vector bicatenario que incluye, dentro de su secuencia, una secuencia de ADN que codifica el péptido deseado. Se prepara un cebador oligonucleotídico que porta la secuencia mutada deseada, en general de modo sintético. Después, este cebador se acopla con el vector monocatenario y se somete a enzimas de polimerización del ADN, tales como el fragmento Klenow de la polimerasa I de E. coli, para completar la síntesis de la hebra que porta la mutación. Así, se forma un heterodúplex en el que una hebra codifica la secuencia no mutada original y la segunda hebra porta la mutación deseada. Después, este vector de heterodúplex se emplea para transformar las células apropiadas, tales como células de E. coli, y se seleccionan los clones que incluyen los vectores recombinantes que portan la disposición de secuencia mutada.
La preparación de variantes de secuencia de los segmentos de ADN que codifican un péptido seleccionados empleando la mutagénesis dirigida proporciona un medio para producir especies potencialmente útiles y no se pretende que sea limitante, puesto que existen otras formas en las que pueden obtenerse variantes de péptidos y las secuencias de ADN que los codifican. Por ejemplo, pueden tratarse vectores recombinantes que codifican la secuencia del péptido deseada con agentes mutagénicos, tales como hidroxilamina, para obtener variantes de secuencia. Los detalles específicos con respecto a estos métodos y protocolos se encuentran en las indicaciones de Maloy et al., 1994; Segal, 1976; Prokop y Bajpai, 1991; Kuby, 1994; y Maniatis et al., 1982.
Tal como se emplea en el presente documento, la expresión "procedimiento de mutagénesis dirigida a oligonucleótido" se refiere a procesos dependientes de moldes y la propagación mediada por vectores que producen un aumento en la concentración de una molécula de ácido nucleico específica con relación a su concentración inicial, o que producen un aumento en la concentración de una señal detectable, tal como una amplificación. Tal como se emplea en el presente documento, la expresión "procedimiento de mutagénesis dirigida a oligonucleótido" pretende indicar un proceso que implica la extensión dependiente de molde de una molécula de cebador. La expresión proceso dependiente de molde se refiere a la síntesis de ácido nucleico de una molécula de ARN o ADN, en la que la secuencia de la hebra recién sintetizada del ácido nucleico viene dictada por las reglas, muy conocidas, del apareamiento de bases complementarias (véase, por ejemplo, Watson, 1987). Generalmente, las metodologías mediadas por vectores implican la introducción del fragmento de ácido nucleico en un vector de ADN o ARN, la amplificación clonal del vector, y la recuperación del fragmento de ácido nucleico amplificado. Se proporcionan ejemplos de dichas metodologías en la patente de EEUU n.º 4.237.224.
En otra estrategia para la producción de variantes de polipéptidos de la presente invención, puede emplearse la recombinación de secuencia recursiva, tal como se describe en la patente de EEUU n.º 5.37.458. En esta estrategia, se realizan ciclos iterativos de recombinación y exploración o selección para que "evolucionen" variantes de
imagen6
15
25
35
45
55
65
Los "elementos de control" o "secuencias reguladoras" presentes en un vector de expresión son las regiones no traducidas del vector (potenciadores, promotores, regiones no traducidas 5’ y 3’) que interaccionan con las proteínas celulares del hospedador para realizar la transcripción y la traducción. Estos elementos varían en potencia y especificidad. Dependiendo del sistema de vector y hospedador utilizado, puede emplearse cualquiera de una serie de elementos de la transcripción y la traducción adecuados, que incluyen promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, pueden emplearse promotores inducibles, tales como el promotor híbrido lacZ del fagémido pBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, Calif.) o el plásmido pSPORT1 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) y similares. En sistemas de células de mamífero, en general se prefieren promotores de genes de mamífero o de virus de mamífero. Si resulta necesario generar una línea celular que contenga múltiples copias de la secuencia que codifica un polipéptido, pueden emplearse ventajosamente vectores basados en SV40 o EBV, empleados con un marcador seleccionable apropiado.
En sistemas bacterianos, puede seleccionarse cualquiera de una serie de vectores de expresión dependiendo del uso previsto para el polipéptido expresado. Por ejemplo, cuando sean necesarias grandes cantidades, por ejemplo, para la inducción de anticuerpos, pueden utilizarse vectores que dirijan un alto nivel de expresión de las proteínas de fusión que se purifiquen con facilidad. Estos vectores incluyen, pero sin limitación los vectores de clonación y expresión multifuncionales de E. coli, tales como pBLUESCRIPT (Stratagene), en los que la secuencia que codifica el polipéptido de interés puede acoplarse al vector en fase con secuencias para el amino-terminal Met y los 7 restos siguientes de β-galactosidasa, de modo que se produce una proteína híbrida; vectores pIN (Van Heeke, G. y S. M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509); y similares. También pueden emplearse los vectores pGEX (Promega, Madison, Wis.) para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST). En general, estas proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse con facilidad a partir de células lisadas mediante la adsorción a perlas de glutatión-agarosa, seguido de una elución en presencia de glutatión libre. Las proteínas preparadas en estos sistemas pueden diseñarse para que incluyan sitios de escisión de proteasas de heparina, trombina, o factor XA para que el polipéptido clonado de interés pueda ser liberado del resto GST a voluntad.
En la levadura Saccharomyces cerevisiae pueden emplearse una serie de vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles, tales como factor alfa, alcohol oxidasa, y PGH. Para un análisis, véase Ausubel et al. (mencionado anteriormente) y Grant et al. (1987), Methods Enzymol., 153:516-544.
En los casos en que se emplean vectores de expresión en plantas, la expresión de las secuencias que codifican los polipéptidos puede ser dirigida por cualquiera de una serie de promotores. Por ejemplo, pueden emplearse promotores víricos, tales como los promotores 35S y 19S de CaMV, solos o en combinación con la secuencia líder omega de TMV (Takamatsu, N. (1987), EMBO J., 6:307-311. Como alternativa, pueden utilizarse promotores vegetales, tales como la subunidad pequeña de RUBISCO o promotores de choque térmico (Coruzzi, G. et al. (1984), EMBO J., 3:1671-1680; Broglie, R. et al. (1984), Science, 224:838-843; y Winter, J. et al. (1991), Results Probl. Cell Differ., 17:85-105). Estas construcciones pueden introducirse en células vegetales por medio de una transformación de ADN directa o una transfección mediada por patógenos. Estas técnicas se describen en una serie de artículos que pueden consultarse (véase, por ejemplo, Hobbs, S. o Murry, L. E. en McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992), McGraw Hill, Nueva York, N.Y.; pp. 191-196).
También puede utilizarse un sistema de insecto para expresar un polipéptido de interés. Por ejemplo, en uno de estos sistemas se emplea el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar genes extraños en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. Las secuencias que codifican el polipéptido pueden clonarse en una región no fundamental del virus, tal como el gen de polihedrina, y colocarse bajo el control del promotor de polihedrina. La inserción correcta de la secuencia que codifica el polipéptido hará que el gen de polihedrina se inactive y se produzcan virus recombinantes que carecen de proteína de la envoltura. Después, los virus recombinantes pueden emplearse para infectar, por ejemplo, células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia, en las que el polipéptido de interés puede expresarse (Engelhard, E. K. et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci., 91:3224-3227).
En células hospedadoras de mamífero, están disponibles, en general, una serie de sistemas de expresión basados en virus. Por ejemplo, en los casos en que se emplee un adenovirus como vector de expresión, las secuencias que codifican un polipéptido de interés pueden acoplarse en un complejo de transcripción/traducción de adenovirus que consiste en el promotor tardío y una secuencia líder tripartita. Puede emplearse la inserción en una región no fundamental E1 o E3 del genoma vírico para obtener un virus viable que sea capaz de expresar el polipéptido en células hospedadoras infectadas (Logan, J. y Shenk, T. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci., 81:3655-3659). Además, pueden utilizarse potenciadores de la transcripción, tales como el potenciador del virus del sarcoma de Rous (RSV), para aumentar la expresión en células hospedadoras de mamífero.
También pueden utilizarse señales de inicio específicas para lograr una traducción más eficaz de las secuencias que codifican un polipéptido de interés. Estas señales incluyen el codón de inicio ATG y las secuencias adyacentes. En los casos en que se insertan secuencias que codifican el polipéptido, su codón de inicio y secuencias cadena arriba en el vector de expresión adecuado, puede que no sean necesarias otras señales de control de la transcripción o traducción. Sin embargo, en los casos en que solo se inserta una secuencia codificante, o una de sus porciones,
15
25
35
45
55
65
deben proporcionarse señales de control de la traducción exógenas incluyendo el codón de inicio ATG. Además, el codón de inicio debe estar en la fase de lectura correcta para asegurar la traducción de la inserción completa. Los elementos traduccionales y los codones de inicio exógenos pueden proceder de diversas fuentes, tanto naturales como sintéticas. La eficacia de la expresión puede potenciarse mediante la inclusión de potenciadores que son apropiados para el sistema celular concreto que se está usando, tales como los descritos en la bibliografía (Scharf,
D. et al. (1994), Results Probl. Cell Differ., 20:125-162).
Además, puede elegirse una cepa de célula hospedadora por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar la proteína expresada de la manera deseada. Estas modificaciones del polipéptido incluyen, pero sin limitación acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación y acilación. También puede utilizarse el procesamiento postraduccional que escinde una forma "prepro" de la proteína para facilitar la inserción, el plegamiento y/o la función correctos. Pueden elegirse diferentes células hospedadoras, tales como CHO, COS, HeLa, MDCK, HEK293 y WI38, que tienen una maquinaria celular específica y mecanismos característicos para estas actividades postraduccionales, para asegurar la correcta modificación y procesamiento de la proteína extraña.
Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, en general se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, líneas celulares que expresan de forma estable un polinucleótido de interés pueden transformarse empleando vectores de expresión que pueden contener orígenes de la replicación víricos y/o elementos de expresión endógenos y un gen de un marcador seleccionable en el mismo vector o en otro vector distinto. Después de la introducción del vector, las células pueden dejarse crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de cambiarlas a un medio selectivo. El objetivo del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y la recuperación de las células que expresan con éxito las secuencias introducidas. Los clones resistentes de las células transformadas de modo estable pueden hacerse proliferar empleando técnicas de cultivo de tejidos apropiadas para el tipo de célula.
Puede utilizarse cualquiera de una serie de sistemas de selección para recuperar las líneas celulares transformadas. Estos incluyen, pero sin limitación los genes de timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler, M. et al. (1977), Cell, 11:223-32) y de adenina fosforribosiltransferasa (Lowy, I. et al. (1990), Cell, 22:817-23), que pueden emplearse en células tk-o aprt -, respectivamente. También puede emplearse la resistencia a antimetabolitos, antibióticos o herbicidas como base para la selección; por ejemplo, dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler, M. et al. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci., 77:3567-70); npt, que confiere resistencia a los aminoglicósidos, neomicina y G-418 (Colbere-Garapin, F. et al. (1981), J. Mol. Biol., 150:1-14); y als o pat, que confieren resistencia a la clorsulfurona y la fosfinotricina acetiltransferasa, respectivamente (Murry, mencionado anteriormente). Se han descrito otros genes seleccionables, por ejemplo, trpB, que permite a las células utilizar el indol en lugar del triptófano, o hisD, que permite a las células utilizar el histinol en lugar de la histidina (Hartman, S. C. y R. C. Mulligan (1988), Proc. Natl. Acad. Sci., 85:8047-51). El uso de marcadores visibles ha ganado popularidad, con marcadores tales como las antocianinas, la beta-glucuronidasa y su sustrato GUS, y la luciferasa y su sustrato luciferina, y se emplean mucho no solo para identificar transformantes, sino también para cuantificar la cantidad de expresión transitoria o estable de la proteína atribuible a un sistema de vector específico (Rhodes, C. A. et al. (1995), Methods Mol. Biol., 55:121-131).
Aunque la presencia/ausencia de la expresión de un gen de marcador sugiere que el gen de interés también está presente, es posible que su presencia y expresión deban confirmarse. Por ejemplo, si la secuencia que codifica un polipéptido se inserta dentro de una secuencia de un gen de marcador, las células recombinantes que contienen las secuencias pueden ser identificadas por la ausencia de la función del gen del marcador. Como alternativa, un gen marcador puede ser colocado en tándem con una secuencia que codifica un polipéptido bajo el control de un único promotor. La expresión del gen del marcador en respuesta a la inducción o la selección habitualmente indica la expresión del gen en tándem también.
Como alternativa, las células hospedadoras que contiene y expresan una secuencia polinucleotídica deseada pueden ser identificadas por medio de una diversidad de procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero sin limitación hibridaciones de ADN-ADN o ADN-ARN y técnicas de bioensayos de proteínas o inmunoensayos que incluyen, por ejemplo, tecnologías con una base de membranas, disoluciones o chips para la detección y/o la cuantificación del ácido nucleico o la proteína.
En la técnica se conocen una diversidad de protocolos para detectar y medir la expresión de productos codificados por polinucleótidos empleando anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para el producto. Los ejemplos incluyen el ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA), el radioinmunoensayo (RIA), y la clasificación de células activada por fluorescencia (FACS). En algunas aplicaciones puede preferirse emplear un inmunoensayo de dos sitios basado en anticuerpos monoclonales que emplea anticuerpos monoclonales reactivos con dos epítopos no interferentes sobre un polipéptido concreto, pero también puede emplearse un ensayo de unión competitiva. Estos y otros ensayos se describen, entre otros textos, en Hampton, R. et al. (1990, Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul. Minn.) y Maddox, D. E. et al. (1983, J. Exp. Med., 158:1211-1216).
Los expertos en la técnica conocen una amplia diversidad de marcadores y técnicas de conjugación, y estos pueden utilizarse en diversos ensayos de ácidos nucleicos y aminoácidos. Los medios para producir sondas de hibridación o
15
25
35
45
55
65
de PCR marcadas para detectar secuencias relacionadas con polinucleótidos incluyen el oligomarcaje, la traslación por muesca, el marcaje en los extremos o la amplificación con PCR empleando un nucleótido marcado. Como alternativa, las secuencias, o cualquiera de sus porciones, pueden clonarse en un vector para la producción de una sonda de ARNm. Estos vectores son conocidos en la técnica, están disponibles en el mercado y pueden utilizarse para sintetizar sondas de ARN in vitro mediante la adición de una ARN polimerasa apropiada, tal como T7, T3, o SP6 y nucleótidos marcados. Estos procedimientos pueden llevarse a cabo empleando una diversidad de kits disponibles en el mercado. Las moléculas indicadoras o marcadores adecuados que pueden utilizarse incluyen radionúclidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogénicos, así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares.
Las células hospedadoras transformadas con una secuencia polinucleotídica de interés pueden cultivarse en condiciones adecuadas para la expresión y la recuperación de la proteína a partir del cultivo celular. La proteína producida por una célula recombinante puede segregarse o quedar contenida dentro de la célula, dependiendo de la secuencia y/o el vector empleado. Tal como entenderán los expertos en la técnica, pueden diseñarse vectores de expresión que contengan los polinucleótidos de la invención para que contengan secuencias señal que dirijan la secreción del polipéptido codificado a través de la membrana de la célula procariota o eucariota. Pueden emplearse otras construcciones recombinantes para unir secuencias que codifican un polipéptido de interés a una secuencia de nucleótidos que codifique un dominio de polipéptido que facilite la purificación de las proteínas solubles. Estos dominios que facilitan la purificación incluyen, pero sin limitación, péptidos quelantes de metales, tales como módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación sobre metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de purificación de extensión/afinidad FLAGS (Immunex Corp., Seattle, Wash.). Puede utilizarse la inclusión de secuencias de conectores que pueden escindirse, tales como las específicas para el factor XA o la enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, Calif.) entre el dominio de purificación y el polipéptido codificado para facilitar la purificación. Uno de estos vectores de expresión proporciona la expresión de una proteína de fusión que contiene un polipéptido de interés y un ácido nucleico que codifica 6 restos histidina que preceden a una tiorredoxina o a un sitio de escisión de enteroquinasa. Los restos histidina facilitan la purificación en una IMIAC (cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados), tal como se describe en Porath, J. et al. (1992, Prot. Exp. Purif., 3:263-281), mientras que el sitio de escisión de enteroquinasa proporciona un medio para purificar el polipéptido deseado de la proteína de fusión. Se proporciona un análisis de los vectores que contienen proteínas de fusión en Kroll, D. J. et al. (1993, DNA Cell Biol., 12:441-453).
Además de los métodos de producción recombinantes, los polipéptidos de la invención, y sus fragmentos, pueden producirse por medio de la síntesis peptídica directa empleando técnicas en fase sólida (Merrifield J. (1963), J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154). La síntesis de proteínas puede realizarse utilizando técnicas manuales o automáticas. Puede conseguirse una síntesis automática, por ejemplo, empleando el sintetizador de péptidos Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer). Como alternativa, diversos fragmentos pueden sintetizarse por separado de modo químico y combinarse empleando métodos químicos para producir la molécula de longitud completa.
Tolerancia
La tolerancia inmunológica se define como la falta de respuesta inmunológica a un antígeno, habitualmente un antígeno implicado en provocar una enfermedad. Aunque la tolerancia puede inducirse mediante la administración de antígenos por diferentes vías, la tolerancia oral se refiere a la administración oral del antígeno, que provoca la supresión de la actividad de la enfermedad en varios modelos animales, que incluyen la encefalomielitis autoinmunológica experimental, un modelo de roedor de la esclerosis múltiple, miastenia grave, uveítis, diabetes dependiente de insulina, y artritis inducida por colágeno (Faria y Weiner 1999). Los resultados tempranos de ensayos clínicos en seres humanos sugieren que la tolerancia oral es eficaz en la uveítis autoinmunológica, la diabetes, la alergia al níquel y, probablemente, la esclerosis múltiple (Faria y Weiner 1999; Duda et al., 2000). Hay pocos estudios que indiquen la inducción de tolerancia oral en el trasplante de órganos (Sayegh et al., 1996; Hancock et al., 1993; Ishido et al., 1999; Sayegh et al., 1992a; Sayegh et al., 1992b). En cada informe, se indujo tolerancia con una alimentación con péptidos derivados de MHC de donante o con una alimentación de células alogénicas antes del trasplante (Sayegh et al., 1996; Hancock et al., 1993; Ishido et al., 1999; Sayegh et al., 1992a; Sayegh et al., 1992b). Estas técnicas resultaron eficaces para prevenir el rechazo de aloinjertos cardíacos y corneales (Sayegh et al., 1996; Hancock et al., 1993; Ishido et al., 1999; Sayegh et al., 1992a; Sayegh et al., 1992b; Faria y Weiner, 1999). Además de disminuir la actividad de la enfermedad, la supresión inmunológica inducida por la tolerancia oral en estos estudios también se cuantificó por medio de la regulación negativa de respuestas de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) a antígenos diana, así como una disminución en la inmunidad celular y humoral (Faria y Weiner, 1999; Mayer, 2000; Garside y Mowat, 1997).
Existen tres mecanismos por medio de los cuales la tolerancia oral (y otras vías de administración) regulan negativamente las respuestas inmunológicas específicas de antígeno: 1. la supresión activa de células específicas de antígeno, 2. la anergia clonal de células específicas de antígeno, y 3. la deleción clonal de células específicas de antígeno (Faria y Weiner, 1999, Miller et al., 1991; Chen et al., 1994; Chen et al., 1995). Aunque estos tres mecanismos pueden funcionar simultáneamente en respuesta a la tolerancia oral, la supresión activa y la anergia clonal son los mecanismos clave de la supresión inmunológica inducida por la tolerancia oral (Faria y Weiner, 1999).
imagen7
imagen8
15
25
35
45
55
65
Así, un fragmento tolerogénico es un fragmento de un polipéptido tolerogénico, tal como el colágeno de tipo V, o una cualquiera o más de sus cadenas alfa, que, en sí mismo, sea inmunológicamente tolerogénico (es decir, induce tolerancia) con respecto a las células B y/o células T específicas que reconocen el polipéptido a través de los receptores en su superficie (por ejemplo, receptor de anticuerpos de células B o receptor de células T). En general, los fragmentos tolerogénicos pueden identificarse empleando técnicas muy conocidas, tales como las que se resumen en Paul, Fundamental Immunology, 3ª ed., (Raven Press, 1993) y las referencias citadas en dicho documento. Estas técnicas incluyen seleccionar polipéptidos por su capacidad para reducir la reactividad de células T y/o células B. Tal como se emplean en el presente documento, los antisueros y los anticuerpos son "específicos de antígeno" si se unen específicamente a un antígeno (es decir, reaccionan específicamente con la proteína en un ensayo ELISA u otro inmunoensayo, y no reaccionan de modo detectable con proteínas no relacionadas). Dichos antisueros y anticuerpos pueden prepararse como se describe en el presente documento y empleando técnicas muy conocidas.
En una realización, un fragmento tolerogénico de un polipéptido de la presente invención es una porción que induce tolerancia de células B y/o células T a un nivel que no es sustancialmente menor que la actividad tolerogénica del polipéptido de longitud completa (por ejemplo, en un ensayo apropiado, tal como de producción de anticuerpos, que puede medirse con ELISA y/o un ensayo de reactividad de células T (ensayo de proliferación de células T o de producción de citocinas)). Preferiblemente, el nivel de actividad tolerogénica de la porción tolerogénica es al menos aproximadamente 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, o mayor que aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de la actividad tolerogénica del polipéptido de longitud completa. En algunos casos, se identificarán fragmentos tolerogénicos que presenten un nivel de actividad tolerogénica mayor que el del correspondiente polipéptido de longitud completa, por ejemplo, tendrán más de aproximadamente 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 % o 150 % o más de actividad tolerogénica.
En ciertas realizaciones, los fragmentos tolerogénicos pueden identificarse empleando un análisis por ordenador, tal como el programa Tsites (véase Rothbard y Taylor, EMBO J., 7:93-100, 1988; Deavin et al., Mol. Immunol., 33:145155, 1996), que busca motivos peptídicos que tengan el potencial de suscitar respuestas Th. Pueden identificarse los péptidos de CTL con motivos apropiados para la unión a MHC de clase I o de clase II murino y humano según BIMAS (Parker et al., J. Immunol., 152:163, 1994) y otros análisis de predicción de la unión de péptidos HLA. Como alternativa, pueden identificarse las porciones que se unen a una molécula de MHC concreta empleando motivos de unión peptídicos definidos, tales como los descritos en Rammensee et al., Immunogenetics, 41:178-228, 1995. Para confirmar la unión del péptido a las moléculas de MHC de clase I o de clase II murinas y humanas, pueden emplearse ensayos de unión de péptidos conocidos en la técnica. Para confirmar la inmunogenicidad o la tolerogenicidad, un péptido puede ensayarse empleando un HLA A2 u otro modelo de ratón transgénico y/o un ensayo de estimulación in vitro empleando células dendríticas, fibroblastos o células de sangre periférica.
Debe advertirse que, en ciertas realizaciones, un fragmento tolerogénico de la invención también es un fragmento inmunogénico. A este respecto, tal como reconocerán los expertos en la técnica, los fragmentos altamente inmunogénicos, tales como los epítopos inmunodominantes de proteínas tales como colV, pueden ser tolerogénicos cuando se administran correctamente, por ejemplo, en general a dosis bajas durante un periodo largo de tiempo. Así, la presente invención también contempla la identificación y el uso de fragmentos inmunogénicos de colV, en los que dichos fragmentos inmunogénicos pueden utilizarse para inducir tolerancia. A este respecto, el nivel de actividad inmunogénica de una porción inmunogénica es de al menos aproximadamente 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, o mayor que aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de la actividad inmunogénica del polipéptido de longitud completa. En algunos casos, se identificarán fragmentos inmunogénicos que presenten un nivel de actividad inmunogénica mayor que el del correspondiente polipéptido de longitud completa, por ejemplo, tendrán más de aproximadamente 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 % o 150 % o más de actividad inmunogénica.
Los mismos análisis pueden emplearse para identificar fragmentos inmunogénicos que se emplean para identificar fragmentos tolerogénicos, que incluyen el empleo de un análisis con ordenador, tal como el programa Tsites (véase Rothbard y Taylor, EMBO J., 7:93-100, 1988; Deavin et al., Mol. Immunol., 33:145-155, 1996), que busca motivos peptídicos que tengan el potencial de suscitar respuestas Th. Pueden identificarse los péptidos de CTL con motivos apropiados para la unión a MHC de clase I o de clase II murino y humano según BIMAS (Parker et al., J. Immunol., 152:163, 1994) y otros análisis de predicción de la unión de péptidos HLA. Como alternativa, pueden identificarse las porciones que se unen a una molécula de MHC concreta empleando motivos de unión peptídicos definidos, tales como los descritos en Rammensee et al., Immunogenetics 41:178-228, 1995. Para confirmar la unión del péptido a las moléculas de MHC de clase I o de clase II murinas y humanas, pueden emplearse ensayos de unión a péptidos conocidos en la técnica. Para confirmar la inmunogenicidad o la tolerogenicidad, un péptido puede ensayarse empleando un HLA A2 u otro modelo de ratón transgénico y/o un ensayo de estimulación in vitro empleando células dendríticas, fibroblastos o células de sangre periférica.
El colágeno de tipo V intacto o uno cualquiera o más de sus componentes de cadenas alfa que tengan actividad tolerogénica o inmunogénica se contemplan para su uso en los métodos de la presente invención. Como tales, un fragmento tolerogénico o un fragmento inmunogénico del colágeno V pueden indicar un fragmento del colágeno de tipo V intacto o pueden indicar un fragmento tolerogénico o inmunogénico de uno cualquiera de los componentes de
15
25
35
45
55
65
cadenas alfa. En ciertas realizaciones, el colV, tal como se emplea en el presente documento, puede comprender la molécula de colágeno compuesta de las tres cadenas alfa. En otra realización, el colV puede comprender una cualquiera o más de las cadenas alfa, tales como las indicadas en SEQ ID NO:2, 4 o 6, codificadas por los polinucleótidos indicados en SEQ ID NO:1, 3 o 5, o uno de sus fragmentos tolerogénicos o fragmentos inmunogénicos.
En ciertas realizaciones, dos o más fragmentos tolerogénicos o inmunogénicos pueden emplearse al mismo tiempo, administrados por separado, mezclados en una composición o como una proteína de fusión. A este respecto, puede emplearse cualquier número de fragmentos tolerogénicos o fragmentos inmunogénicos para inducir una tolerancia al colV, tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más fragmentos tolerogénicos o inmunogénicos, en una composición como fragmentos separados o como una proteína de fusión, con o sin conectores. En ciertas realizaciones, pueden emplearse 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más fragmentos en los métodos de la presente invención.
La detección de la presencia de anticuerpos contra el colágeno según algunas realizaciones puede realizarse empleando cualquiera de una serie de procedimientos de inmunoensayo, tal como por medio de procedimientos de ELISA. Están disponibles una amplia gama de técnicas de inmunoensayo, tal como se observa remitiéndose a los manuales de inmunoensayos convencionales y estas incluyen, pero sin limitación ensayos de sitio único y de dos sitios o de "sándwich" de tipo no competitivo, así como los ensayos de unión competitiva tradicionales.
Los ensayos de "sándwich" se encuentran entre los métodos de ensayos basados en anticuerpos más útiles y habitualmente empleados y pueden utilizarse para llevar a cabo diversas realizaciones. Existen una serie de variaciones de la técnica del ensayo de "sándwich" y se pretende que todas se incluyan en diversas realizaciones. Brevemente, en un ensayo típico para detectar anticuerpos en una muestra, un antígeno no marcado se inmoviliza sobre un sustrato sólido y la muestra que se va a ensayar se pone en contacto con la molécula de antígeno unida. Después de un periodo de incubación adecuado, es decir, durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la formación de un complejo de anticuerpo-antígeno, se añade un segundo anticuerpo, tal como una anti-IgG humana, marcado con una molécula indicadora capaz de producir una señal detectable, y se incuba, dejando que pase el tiempo suficiente para que se forme un anticuerpo marcado con el anticuerpo-antígeno. Cualquier material sin reacción se lava y se determina la presencia del anticuerpo que se va a detectar en la muestra por medio de la observación de una señal producida por la molécula indicadora. Los resultados pueden ser cualitativos, por ejemplo, por la simple observación de la señal visible, o pueden cuantificarse comparando la señal generada por una muestra de interés con una muestra control que contenga cantidades conocidas del anticuerpo que se va a detectar. Las variaciones de este ensayo incluyen un ensayo simultáneo, en el que tanto la muestra como el anticuerpo marcado se añaden simultáneamente al antígeno unido. Estas técnicas son muy conocidas, incluyendo cualquier pequeña variación, tal como será evidente para los expertos en la técnica. En el ensayo de "sándwich" típico, el antígeno se inmoviliza, por ejemplo, uniéndose de modo covalente o de modo pasivo a una superficie sólida. En algunas realizaciones, la superficie sólida generalmente es vidrio o un polímero, y los polímeros que se emplean más habitualmente son celulosa, poliacrilamida, nailon, poliestireno, poli(cloruro de vinilo) o polipropileno. Los soportes sólidos pueden estar en forma de tubos, perlas, discos o microplacas, o cualquier otra superficie adecuada para realizar un inmunoensayo. En la técnica se conocen diversos procesos de unión y estos consisten, en general, en la reticulación, la unión covalente o la adsorción física del antígeno a una superficie concreta. El antígeno inmovilizado después se lava en preparación para la adición de la muestra de ensayo. Después se pone en contacto una alícuota de la muestra que se va a ensayar con el antígeno inmovilizado y se incuba durante un periodo de tiempo suficiente (por ejemplo, 2-40 minutos) y en condiciones adecuadas (por ejemplo, 25 °C) para permitir la unión de cualquier anticuerpo al colágeno presente en la muestra. La duración real del tiempo de contacto, las condiciones de tampón, las temperaturas y similares son parámetros que pueden ajustarse con facilidad y generalmente se determinan con facilidad en un ensayo concreto. Después del periodo de incubación, el antígeno inmovilizado que incluya cualquier anticuerpo unido se lava y se seca, y se incuba con un segundo anticuerpo específico para el anticuerpo unido, por ejemplo, anti-IgG humana. El segundo anticuerpo se une a una molécula indicadora, que se emplea para indicar la unión del segundo anticuerpo al complejo de anticuerpo-antígeno inmovilizado.
Un método concreto para medir anticuerpos contra colV se describe en el documento WO 2007/120947. De modo específico, este ensayo de perlas detecta anticuerpos contra el colágeno de tipo V, tal como pueden estar presentes en suero y/o fluido de lavado pulmonar procedente de pacientes que presentan una respuesta autoinmunológica al colágeno de tipo V. Las perlas revestidas con colágeno de tipo V, junto con otros reactivos necesarios, se proporcionan para este ensayo. Brevemente, un ensayo típico es el siguiente: 1) Perlas revestidas con estreptavidina (por ejemplo, tales como las de Polyscience, Warrington, PA) se lavan con PBS estéril. Las perlas se suspenden en un volumen apropiado de PBS con colágeno de tipo V humano. 2) Se genera un control positivo siguiendo el mismo procedimiento de 1 anterior, empleando anticuerpo de conejo contra anticuerpos de colágeno V humano (Bioten) (Abeam, Cambridge, MA). 3) Para cada ensayo, las perlas conjugadas se lavan en PBS, y se incuban en PBS más suero de fluido de lavado pulmonar. Las perlas después se lavan con PBS que contiene FCS al 10 %. 4) Las perlas después se suspenden en PBS + FBS al 10 % estéril y se incuban a temperatura ambiente con anticuerpo secundario. Generalmente, se emplea un anticuerpo anti-IgG humana conjugado con R-PE (Sigma, Saint Louis), aunque los expertos en la técnica entenderán que están disponibles otros anticuerpos adecuados. A este respecto, pueden emplearse anticuerpos específicos anti-IgG1, -IgG2, -IgG3 o -IgG4 humanas en ciertas
imagen9
imagen10
15
25
35
45
55
65
La composición farmacéutica de la invención puede estar prevista para la administración tópica, en cuyo caso, el vehículo puede comprender, de modo adecuado, una disolución, una emulsión, un ungüento o una base de gel. La base, por ejemplo, puede comprender uno o más de los siguientes: vaselina, lanolina, polietilenglicoles, cera de abeja, aceite mineral, diluyentes, tales como agua y alcohol, y emulsionantes y estabilizantes. Pueden estar presentes agentes espesantes en una composición farmacéutica para la administración tópica. Si está prevista para la administración transdérmica, la composición puede incluir un parche transdérmico o un dispositivo de iontoforesis. Las formulaciones tópicas pueden contener una concentración del compuesto de la invención desde aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 % en p/v (peso por unidad de volumen).
La composición farmacéutica de la invención puede estar prevista para la administración rectal, en forma, por ejemplo, de un supositorio, que se fundirá en el recto y liberará el fármaco. La composición para la administración rectal puede contener una base oleaginosa como excipiente no irritante adecuado. Estas bases incluyen, sin limitación, lanolina, manteca de cacao y polietilenglicol.
La composición farmacéutica de la invención puede incluir diversos materiales, que modifican la forma física de una unidad de dosificación sólida o líquida. Por ejemplo, la composición puede incluir materiales que formen una cubierta de revestimiento alrededor de los principios activos. Los materiales que forman la cubierta de revestimiento generalmente son inertes y pueden seleccionarse, por ejemplo, de azúcar, goma laca y otros agentes de revestimiento entérico. Como alternativa, los principios activos pueden estar recluidos en una cápsula de gelatina.
La composición farmacéutica de la invención en forma sólida o líquida puede incluir un agente que se une al compuesto de la invención y, con ello, ayuda al transporte del compuesto. Los agentes adecuados que pueden actuar en esta capacidad incluyen un anticuerpo monoclonal o policlonal, una proteína o un liposoma.
La composición farmacéutica de la invención puede consistir en unidades de dosificación que pueden administrarse como un aerosol. El término aerosol se emplea para indicar una diversidad de sistemas que varían de los sistemas de naturaleza coloidal a los sistemas que consisten en envases presurizados. La administración puede realizarse por medio de un gas licuado o comprimido, o por medio de un sistema de bomba adecuado que dispense los principios activos. Los aerosoles de los compuestos de la invención pueden administrarse en sistemas de una sola fase, bifásicos o trifásicos para administrar el principio o principios activos. La administración del aerosol incluye el recipiente, activador, válvula, subrecipiente y similares necesarios, que juntos pueden formar un kit. Los expertos en la técnica pueden determinar, sin experimentación innecesaria, los aerosoles preferidos.
Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse mediante metodologías muy conocidas en la técnica farmacéutica. Por ejemplo, una composición farmacéutica prevista para ser administrada mediante inyección puede prepararse combinando un compuesto de la invención con agua estéril destilada para formar una disolución. Puede añadirse un tensioactivo para facilitar la formación de una suspensión o una disolución homogénea. Los tensioactivos son compuestos que interaccionan de modo no covalente con el compuesto de la invención para facilitar la disolución o la suspensión homogénea del compuesto en el sistema de administración acuoso.
Los compuestos de la invención, o sus sales farmacéuticamente aceptable, se administran en una cantidad terapéuticamente eficaz, que variará dependiendo de una diversidad de factores, que incluyen la actividad del compuesto específico empleado; la estabilidad metabólica y longitud de acción del compuesto; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; la vía y el momento de la administración; la velocidad de excreción; la combinación de fármacos; la gravedad del trastorno o la afección concretos; y el sujeto que se está sometiendo a terapia. En general, una dosis diaria terapéuticamente eficaz es (para un mamífero de 70 kg) de aproximadamente 0,001 mg/kg (es decir, 0,07 mg) a aproximadamente 100 mg/kg (es decir, 7,0 g); preferiblemente, una dosis terapéuticamente eficaz es (para un mamífero de 70 kg) de aproximadamente 0,01 mg/kg (es decir, 0,7 mg) a aproximadamente 50 mg/kg (es decir, 3,5 g); más preferiblemente, una dosis terapéuticamente eficaz es (para un mamífero de 70 kg) de aproximadamente 1 mg/kg (es decir, 70 mg) a aproximadamente 25 mg/kg (es decir, 1,75 g).
En ciertas realizaciones, la dosis de colV administrada por vía oral es desde 0,001 mg a 500 mg diarios. En una realización concreta, la dosis oral de colV, tal como se describe en el presente documento, es de 0,01 mg a 50 mg diarios. En otra realización, la dosis oral de colV, tal como se describe en el presente documento, es de 0,1 mg a 0,5 mg diarios. En una realización, la dosis oral de colV es de 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, o 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9 o 5,0 mg diarios. En otra realización, la dosis oral de colV puede ser de 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 o 8,0 mg diarios. En ciertas realizaciones, la dosis puede administrarse en una única dosis o puede administrarse en múltiples dosis a lo largo del día, por ejemplo, en 2, 3 o 4 dosis diarias para un total de una dosis en mg/día concreta.
Tal como se describe en otro punto en el presente documento, en ciertas realizaciones, una dosis terapéuticamente eficaz de colV, tal como se emplea en el presente documento, es una dosis suficiente para inducir tolerancia a colV medida según cualquiera de una diversidad de métodos, tal como se describe en el presente documento. En ciertas
15
25
35
45
55
65
realizaciones, la inducción de tolerancia a colV provoca una disminución en los anticuerpos anti-colV séricos, según se mide empleando los métodos descritos en el presente documento, tales como un ELISA. En otra realización, una dosis terapéuticamente eficaz de colV, tal como se emplea en el presente documento, es una dosis suficiente para inducir tolerancia en células T a colV medida según cualquiera de una diversidad de métodos, tal como se describe en el presente documento, tales como ensayos de liberación de citocinas, tinción de citocinas intracelulares y citometría de flujo, ELISPOT, y similares. También pueden emplearse ensayos de células T funcionales, tales como ensayos de proliferación de citotoxicidad.
Los compuestos de la invención, o sus sales farmacéuticamente aceptables, también pueden administrarse simultáneamente, antes o después de la administración de uno o más agentes terapéuticos diferentes. Dicha terapia de combinación incluye la administración de una única formulación de dosificación farmacéutica que contiene un compuesto de la invención y uno o más agentes activos adicionales, así como la administración del compuesto de la invención y cada agente activo en su propia formulación de dosificación farmacéutica separada. Por ejemplo, un compuesto de la invención y otro agente activo pueden administrarse al paciente juntos en una única composición de dosificación oral, tal como un comprimido o una cápsula, o cada agente se administra en formulaciones de dosificación oral separadas. Cuando se emplean formulaciones de dosificación separadas, los compuestos de la invención y uno o más agentes activos adicionales pueden administrarse fundamentalmente al mismo tiempo, es decir, simultáneamente, o en diferentes momentos escalonados, es decir, secuencialmente; se entiende que la terapia de combinación incluye todos estos regímenes.
Los compuestos de la presente invención pueden administrarse a un individuo que padece una enfermedad o trastorno, según se describe en el presente documento, tal como asma grave y persistente. Para el uso in vivo para el tratamiento de una enfermedad humana, los compuestos descritos en el presente documento en general se incorporan en una composición farmacéutica antes de la administración. Una composición farmacéutica comprende uno o más de los compuestos descritos en el presente documento, en combinación con un vehículo o excipiente fisiológicamente aceptable, tal como se describió en otro punto en el presente documento. Para preparar una composición farmacéutica, una cantidad eficaz de uno o más de los compuestos se mezcla con cualquier vehículo o vehículos o excipiente farmacéutico conocidos por los expertos en la técnica por ser adecuados para la vía de administración concreta. Un vehículo farmacéutico puede ser líquido, semilíquido o sólido. Las disoluciones o suspensiones empleadas para la aplicación parenteral, intradérmica, subcutánea o tópica pueden incluir, por ejemplo, un diluyente estéril (tal como agua), solución salina, aceites no volátiles, polietilenglicol, glicerina, propilenglicol u otro disolvente sintético; agentes antibacterianos (tales como alcohol bencílico o metilparabenos); antioxidantes (tales como ácido ascórbico y bisulfito de sodio) y agentes quelantes (tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)); tampones (tales como acetatos, citratos y fosfatos). Si se administran por vía intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica o solución salina tamponada con fosfato (PBS), y disoluciones que contengan agentes espesantes y solubilizantes, tales como glucosa, polietilenglicol, polipropilenglicol y sus mezclas.
Los compuestos descritos en el presente documento pueden prepararse con vehículos que los protejan contra la eliminación rápida del cuerpo, tales como revestimientos o formulaciones de liberación a lo largo del tiempo. Estos vehículos incluyen formulaciones de liberación controlada, tales como, pero sin limitarse a implantes y sistemas de administración microencapsulados, y polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, poli(ácido glicólico), poliortoésteres, poli(ácido láctico) y otros conocidos por los expertos en la técnica.
En ciertas realizaciones, los adyuvantes que ayuden a inducir tolerancia incluyen dexametasona (véase, por ejemplo, Y. Kang, et al., J. Immunol., 2008, 180:5172-5176), lipopolisacáridos (LPS) y la subunidad β de la toxina del cólera, y pueden añadirse a las formulaciones. También se contemplan ciertos otros vehículos tolerogénicos para su uso con la composición de colV de la presente invención. Estos vehículos incluyen vehículos de aceites minerales, tales como adyuvante de Freund incompleto (IFA) o adyuvante de Freund completo (CFA). El IFA es una emulsión de un aceite mineral. El CFA es una preparación de un aceite mineral que contiene diversas cantidades de organismos muertos de micobacterias. Sin embargo, IFA y CFA no están permitidos para un uso en seres humanos, porque el aceite mineral no es metabolizable y no puede ser degradado por el cuerpo.
En ciertas realizaciones, las emulsiones de grasas, que se han empleado durante muchos años para nutrición intravenosa de pacientes humanos, también pueden actuar como vehículo para la terapia de polipéptidos tolerogénicos que emplea los polipéptidos de la presente invención. Dos ejemplos de dichas emulsiones son las emulsiones de grasas disponibles en el mercado conocidas como Intralipid y Lipofundin. "Intralipid" es una marca registrada de Kabi Pharmacia, Suecia, para una emulsión de grasas para la nutrición intravenosa, descrita en la patente de EEUU n.º 3.169.094. "Lipofundin" es una marca registrada de B. Braun Melsungen, Alemania. Ambos contienen aceite de soja como grasa (100 o 200 g en 1.000 ml de agua destilada: al 10 % o al 20 %, respectivamente). Se emplean fosfolípidos de yema de huevo como emulsionantes en Intralipid (12 g/l de agua destilada) y lecitina de yema de huevo en Lipofundin (12 g/l de agua destilada). La isotonicidad se logra añadiendo glicerol (25 g/l) en Intralipid y en Lipofundin. Se cree que estos vehículos son realmente vehículos biológicamente activos que, cuando forman complejos con el autoantígeno sospechoso, estimulan un cambio de TH1 a TH2 de las células T autoinmunológicas. En ciertas realizaciones, este vehículo es una emulsión de grasas que comprende 10
imagen11
imagen12
imagen13
imagen14

Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
ES10716439.4T 2009-04-22 2010-04-22 Colágeno V para su uso en el tratamiento del asma Active ES2618881T3 (es)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17170509P 2009-04-22 2009-04-22
US171705P 2009-04-22
US26604809P 2009-12-02 2009-12-02
US266048P 2009-12-02
PCT/US2010/032007 WO2010124058A1 (en) 2009-04-22 2010-04-22 Compositions for use in the treatment of chronic obstructive pulmonary diseases and asthma

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2618881T3 true ES2618881T3 (es) 2017-06-22

Family

ID=42751787

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10716439.4T Active ES2618881T3 (es) 2009-04-22 2010-04-22 Colágeno V para su uso en el tratamiento del asma

Country Status (8)

Country Link
US (3) US8568730B2 (es)
EP (1) EP2421552B8 (es)
JP (1) JP5642769B2 (es)
KR (2) KR101833701B1 (es)
CN (2) CN107243076A (es)
CA (1) CA2759611C (es)
ES (1) ES2618881T3 (es)
WO (1) WO2010124058A1 (es)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107243076A (zh) 2009-04-22 2017-10-13 印第安那大学科技研究公司 用于治疗慢性阻塞性肺病和哮喘的组合物和方法
US10035821B2 (en) * 2016-10-21 2018-07-31 Gunnar C. Hansson Calcium binding compounds based on gamma-carboxy glutamate
US10768461B2 (en) 2017-04-28 2020-09-08 Lg Chem, Ltd. Light modulation device

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA725596A (en) 1960-08-26 1966-01-11 J. Wretlind Arvid Method of preparing intravenously injectable fat emulsions free from side reactions or complications
US4237224A (en) 1974-11-04 1980-12-02 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Process for producing biologically functional molecular chimeras
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
US4957858A (en) 1986-04-16 1990-09-18 The Salk Instute For Biological Studies Replicative RNA reporter systems
US4883750A (en) 1984-12-13 1989-11-28 Applied Biosystems, Inc. Detection of specific sequences in nucleic acids
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
AU622104B2 (en) 1987-03-11 1992-04-02 Sangtec Molecular Diagnostics Ab Method of assaying of nucleic acids, a reagent combination and kit therefore
IL86724A (en) 1987-06-19 1995-01-24 Siska Diagnostics Inc Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences
AU622426B2 (en) 1987-12-11 1992-04-09 Abbott Laboratories Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization
EP0359789B1 (en) 1988-01-21 1993-08-04 Genentech, Inc. Amplification and detection of nucleic acid sequences
CA1340807C (en) 1988-02-24 1999-11-02 Lawrence T. Malek Nucleic acid amplification process
WO1989009284A1 (en) 1988-03-24 1989-10-05 University Of Iowa Research Foundation Catalytic hybridization systems for the detection of nucleic acid sequences based on their activity as cofactors in catalytic reactions in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved
US5633234A (en) 1993-01-22 1997-05-27 The Johns Hopkins University Lysosomal targeting of immunogens
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
EP1107747A4 (en) * 1998-08-26 2003-04-23 Smithkline Beecham Corp COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF PULMONARY DISEASES
US7348005B2 (en) 2000-03-15 2008-03-25 Advanced Research And Technology Institute Oral tolerance induction by collagen to prevent allograft rejection
EP1355664A4 (en) * 2001-01-04 2005-10-26 Vascular Biogenics Ltd METHODS INVOLVING MOLECULES ASSOCIATED WITH ATHEROSCLEROSIS PLATES AND COMPOSITIONS CONTAINING THESE MOLECULES FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF ATHEROSCLEROSIS
US7250496B2 (en) * 2002-11-14 2007-07-31 Rosetta Genomics Ltd. Bioinformatically detectable group of novel regulatory genes and uses thereof
CN1867348B (zh) * 2003-08-11 2011-08-17 加利福尼亚大学董事会 口服施用的小肽协同增强抑制素活性
ES2415890T3 (es) * 2005-09-09 2013-07-29 Zymogenetics, Inc. Procedimiento de preparación de proteínas triméricas
BRPI0706575B8 (pt) * 2006-01-13 2021-05-25 Univ Indiana Res & Tech Corp uso colágeno de tipo v ou um componente antigênico do mesmo, e, método para identificar um paciente em espera de transplante de pulmão para um risco aumentado de rejeição de tecido de órgão transplantado.
US20100063258A1 (en) * 2006-06-28 2010-03-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fusion protein constructs
CN107243076A (zh) 2009-04-22 2017-10-13 印第安那大学科技研究公司 用于治疗慢性阻塞性肺病和哮喘的组合物和方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP2421552A1 (en) 2012-02-29
KR101815716B1 (ko) 2018-01-05
US20170340716A1 (en) 2017-11-30
US8568730B2 (en) 2013-10-29
CA2759611C (en) 2018-11-13
KR20120014156A (ko) 2012-02-16
CA2759611A1 (en) 2010-10-28
KR20180004305A (ko) 2018-01-10
CN107243076A (zh) 2017-10-13
US20130195903A1 (en) 2013-08-01
WO2010124058A1 (en) 2010-10-28
EP2421552B1 (en) 2016-12-14
CN102458446B (zh) 2017-06-13
US20120052081A1 (en) 2012-03-01
EP2421552B8 (en) 2017-01-25
JP5642769B2 (ja) 2014-12-17
KR101833701B1 (ko) 2018-02-28
JP2012524799A (ja) 2012-10-18
CN102458446A (zh) 2012-05-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2308976T3 (es) Compuestos y metodos para la terapia y el diagnostico del cancer de pulmon.
ES2405405T3 (es) Composiciones y procedimientos para la terapia y el diagnóstico de enfermedad inflamatoria del intestino
ES2528928T3 (es) Vacunas de poliproteína recombinante para el tratamiento y diagnóstico de leishmaniosis
ES2859673T3 (es) Vacunas que comprenden polipéptidos de nucleósido hidrolasa no específica y esterol 24-c-metiltransferasa (SMT) para el tratamiento y el diagnóstico de la leishmaniasis
ES2271449T3 (es) Compuestos para inmunoterapia y diagnostico de la tuberculosis.
ES2303525T3 (es) Compuestos y metodos para el tratamiento y diagnostico de infeccion por chlamydia.
BRPI0913972B1 (pt) Polipeptídeo de fusão compreendendo antígenos de leishmania, polinucleotídeo, composição farmacêutica, bem como métodos para detecção de infecção e para identificação de leishmaniose e kit diagnóstico para detecção e identificação de leishmaniose
BRPI0809926B1 (pt) Composição que compreende antígenos de mycobacterium tuberculosis, polipeptídeo de fusão isolado, polinucleotídeo isolado que codifica o dito polipeptídeo e uso da dita composição para estimular uma resposta imune protetora
JP2007528422A (ja) 自己免疫疾患に関与する自己抗原および非自己抗原の同定
ES2728865T3 (es) Vacunas que comprenden polipéptidos de Leishmania para el tratamiento y el diagnóstico de la leishmaniasis
EA022213B1 (ru) Новые конструкции белка вируса папилломы человека (hpv) и их применение в предупреждении заболевания, вызываемого hpv
PT2197900E (pt) Péptidos receptores duplamente cíclicos mutados que inibem anticorpos anti-receptor adrenérgico β1
BR112019004913B1 (pt) Vacinas que compreendem polipeptídeos de mycobacterium leprae para a prevenção, tratamento e diagnóstico de lepra
ES2618881T3 (es) Colágeno V para su uso en el tratamiento del asma
ES2368899T3 (es) Composiciones para el tratamiento y el diagnóstico de cáncer de mama y métodos para el uso de las mismas.
WO2014089061A1 (en) Ehrlichial invasin for immunization, diagnosis, and cell delivery
US20160158329A1 (en) Vaccines comprising leishmania polypeptides for the treatment and diagnosis of leishmaniasis
ES2329444T3 (es) Composiciones y metodos para la terapia y el diagnostico del cancer de pulmon.
JP2021524485A (ja) パラ結核症のための免疫原性組成物
JP4686710B2 (ja) スギ花粉由来の新規アレルゲンおよびその利用
WO1998059051A1 (es) Adn recombinante que codifica para epitopos del alergeno mayor de olea europaea ole e 1 util para el diagnostico y tratamiento de alergias
JP5196364B2 (ja) スギ花粉由来の新規ポリペプチドおよび当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにそれらの利用
CN115724940A (zh) 靶向STAT3蛋白Tyr705磷酸化的肽及其应用
BRPI0712421A2 (pt) proteìna hipoalergênica, molécula de ácido nucleico, vetor, hospedeiro, anticorpo, formulação de vacina, usos de uma proteìna hipoalergênica, de um complexo hipoalergênica e de uma proteìna de capsìdeo viral de um vìrus da famìlia picornaviridade, molécula hipoalergênica, e, uso de uma molécula hipoalergênica, uma proteìna de fusão, uma molécula de ácido nucleico, um vetor ou um anticorpo.