KR101833701B1 - 만성 폐쇄성 폐질환 및 천식의 치료에 사용하기 위한 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 COPD 및 천식을 비롯한 폐질환의 치료 또는 예방을 위한 화합물 및 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 COPD 및 천식의 치료를 위한 V형 콜라겐 또는 그의 관용원성(tolerogenic) 단편에 관한 것이다.

Description

만성 폐쇄성 폐질환 및 천식의 치료에 사용하기 위한 조성물{COMPOSITIONS FOR USE IN THE TREATMENT OF CHRONIC OBSTRUCTIVE PULMONARY DISEASES AND ASTHMA}

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 35 U.S.C. 119(e)하에서 2009년 4월 22일자로 출원된 미국 특허 가출원 제61/171,705호 및 2009년 12월 2일자로 출원된 미국 특허 가출원 제61/266,048호를 우선권 주장으로 하며, 이들 출원의 개시 내용은 그 전문이 본 출원에 참고로 포함된다.

서열 목록에 관한 설명

본 출원과 관련된 서열 목록은 서면 대신에 텍스트 포맷으로 제출하며, 그 내용은 본 출원에 참고로 포함된다. 서열 목록을 포함하는 텍스트 파일의 명칭은 480266_404PC_SEQUENCE_LISTING.txt이다. 텍스트 파일은 67 KB이며, 2010년 4월 22일자로 작성하였으며, 본 명세서 제출과 동시에 EFS-Web로 전자 제출하였다.

발명의 분야

본 발명은 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 및 천식의 치료 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 V형 콜라겐(colV) 또는 그의 관용원성 단편의 투여에 의한 COPD 및 천식의 치료에 관한 것이다.

관련 분야의 설명

만성 폐쇄성 폐질환(COPD)은 기도가 좁아지는 폐질환의 한 군이다. 이는 폐로 유입되고 이로부터 배출되는 공기의 흐름을 제한하여 호흡곤란을 야기한다. 천식과는 반대로, 기류의 제한은 가역성이 불량하며, 일반적으로 시간 경과에 따라 점진적으로 악화된다. COPD는 또한 만성 폐쇄성 폐질환(COLD), 만성 폐쇄성 기도 질환(COAD), 만성 기류 제한(CAL) 및 만성 폐쇄성 호흡기 질환으로서 알려져 있다. 용어 "COPD"에는 2종의 주요 상태인 폐기종 및 만성 폐쇄성 기관지염을 들 수 있다.

폐기종에서, 다수의 기낭 사이의 벽이 손상되어 형상을 상실하며 처지게 된다. 이러한 손상은 또한 기낭의 벽을 파괴하여 다수의 작은 기낭 대신에 더 적고 그리고 더 커다란 기낭을 초래한다.

만성 폐쇄성 기관지염에서, 기도의 내층은 항상 자극되어 염증을 일으킨다. 이는 내층을 두껍게 한다. 두꺼운 점액이 기도에 많이 형성되며, 호흡이 곤란하게 된다.

COPD를 갖고 있는 대부분의 사람들은 폐기종 및 만성 폐쇄성 기관지염을 모두 갖는다. 그래서, 일반적인 용어 "COPD"가 더 정확하다.

만성 기관지염 및 폐기종은 가장 흔하게는 흡연에 의하여 야기되며, COPD를 갖는 환자의 약 90%가 흡연자이거나 또는 흡연자이었다. 흡연자의 약 50%가 만성 기관지염을 발생시키기는 하나, 흡연자의 15%만이 무능력 기류 폐쇄가 발생된다. 특정한 기타의 포유동물, 특히 말도 마찬가지로 COPD를 앓는다.

COPD와 관련된 기류 폐쇄는 진행성이며, 기도 반응항진을 수반할 수 있으며, 부분적으로 가역성일 수 있다. 비-특이성 기도 과민성은 또한 COPD의 발생에 기여할 수 있으며, 흡연자에서의 폐 기능에서의 가속된 저하 속도를 예측할 수 있다.

COPD는 사망 및 장애의 중요한 원인이다. 이는 미국 및 유럽에서 4번째의 주요 사망 원인이다. 치료 지침은 질환으로 인한 이환률 및 사망률을 감소시키는 것을 돕기 위하여 조기 발견 및 금연 프로그램의 실시를 주장한다. 그러나, 조기 발견 및 진단은 여러 가지 이유로 인하여 곤란하였다.

COPD는 발생하는데 수년이 걸리며, 흡연자들은 종종 흡연으로부터의 임의의 악영향을 부인하며, 증가된 호흡곤란의 조기 경고 징후를 노화의 신호로 간주한다. 유사하게, 기관지염의 급성 에피소드는 종종 일반의가 COPD의 조기 신호로서 분간하지 못한다. 다수의 환자는 특히 초기 질환에서 정확한 진단을 힘들게 하는 1종보다 많은 질환(예, 만성 기관지염 또는 천식성 기관지염)의 특징을 나타낸다. 또한, 다수의 환자는 호흡곤란, 지속성 기침 및 가래 생성과 같은 저하된 폐 기능과 관련된 더욱 심한 징후를 겪을 때까지는 병원을 찾지 않는다. 그 결과, 대다수의 환자들은 질병이 많이 진행된 단계가 될 때까지 진단 또는 치료받지 못한다.

천식은 수백만명의 사람들을 괴롭히는 기도의 이질적인 질환이다. 기도 염증, 과민성 및 폐쇄가 상태의 특징이 된다. 질환은 종종 기관지 평활근계의 경련을 야기하며, 상기도 및 하기도 모두에 영향을 미친다. 천식에는 중증도의 정도를 달리하는 것을 특징으로 하는 여러 가지 유형이 존재한다. 예를 들어 경증 천식은 호흡곤란 또는 기침이 있거나 또는 없는 천명의 간단한 에피소드로서 정의된다. 중등도 천식은 천명 및 호흡곤란으로 정의되며, 기침 및 가래배출이 있거나 또는 없을 수 있으나, 일반적으로 일상 활동 및/또는 수면을 방해한다. 중증 천식은 호흡곤란으로 인한 무능력을 특징으로 하며, 고통 받는 환자는 통상적으로 정상적으로 먹거나 또는 잠을 잘 수 없으며, 매우 불안하며, 종종 탈진된다. 천식 지속증으로서 공지된 상태는 천식의 가장 중증인 형태이며, 일반적으로 집중적인 입원 치료를 필요로 하며, 심지어 사망을 초래할 수 있다. 이러한 질환은 알러지성 및 비알러지성 기전 모두의 결과로서 발생할 수 있다.

천식과 관련된 징후 및 불편을 경감시키는데 이용할 수 있는 치료에는 여러 가지가 있으나, 치유는 없다. 게다가, 종래의 치료는 불편을 악화시키는 부작용을 야기하며, 기타의 심신을 약화시킨다. 경증 천식은 일반적으로 산발성 에피소드를 예방 또는 중단시키기 위하여 특히 어린이의 경우 항히스타민뿐 아니라 베타-아드레날린 약물을 사용하여 치료된다. 중등도 및 중증 천식은 일반적으로 아드레날린제 및 기관지확장제뿐 아니라, 코르티코스테로이드를 사용하여 치료된다. 광범위한 사용을 제한하는 항천식제에 의하여 야기되는 기타의 작용으로는 두통, 피로, 구내 건조, 신경질 및 일부의 경우에서는 상습성 중독 및 약물 남용을 들 수 있다. 천식의 발병기전 및 치료의 이해에 대한 최근의 발전은 문헌[Am. J. Respir . Crit . Care Med. 2008 May 15; 177(10): 1068-73]에서 더욱 상세하게 논의되어 있다.

천식은 어린이 및 성인 모두에서 만연하므로, 바람직하지 못한 부작용을 야기하지 않으면서 질병을 치료하고 그리고 적어도 질병을 수반하는 징후를 경감시킬 수 있는 제제에 대한 지속적인 수요가 존재한다. 마찬가지로, COPD를 치료하기 위한 조성물 및 방법에 대한 지속적인 수요가 존재한다. 본 발명은 COPD 및 천식의 치료를 위한 조성물 및 방법 및 본 명세서에 기재한 바와 같은 기타의 잇점을 제공한다.

하기의 참고 문헌은 예시의 절차 또는 본 명세서에 기재된 것에 보충하는 기타의 세부사항을 제공하는 정도로 본 출원에 참고로 인용한다. Chen, Inobe, Marks, Gonnella, Kuchroo, Weiner, "Peripheral deletion of antigen-reactive T cells in oral tolerance," Nature, 376:177-180, 1995. Chen, Kuchroo, Inobe, Hafler, Weiner, "Regulatory T-cell clones induced by oral tolerance: suppression of autoimmune encephalomyelitis," Science, 265:1237-1240, 1994. Chiang, Mainardi, Seyer, "Type V(A-B) collagen induces platelet aggregation," J. Lab. Clin. Med., 95:99-107, 1980. Cremer, Ye, Terato, Owens, Seyer, Kang, "Type XI collagen-induced arthritis in the Lewis rat: characterization of cellular and humoral immune responses to native types XI, V, and II collagen and constituent a-chains," J. Immunol. 153:824-832, 1994. Danzer, Kirchner, Rink, "Cytokine interactions in human mixed lymphocyte culture," Transplantation, 57(11):1638-1642, 1994. 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본 발명의 한 측면은 COPD 환자에게 치료적 유효량의 V형 콜라겐 또는 그의 면역원성 단편을 투여하는 것을 포함하는, 만성 폐쇄성 폐질환의 치료 방법을 제공한다. 본 명세서에 기재된 방법의 한 실시양태에서, COPD 환자는 폐기종 및/또는 만성 폐쇄성 기관지염을 갖는다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, V형 콜라겐 또는 그의 면역원성 단편은 경구 투여되며, 0.1 ㎎ 내지 0.5 ㎎의 투약량으로 투여된다. 추가의 실시양태에서, V형 콜라겐 또는 그의 면역원성 단편은 정맥내, 폐내 점적주입, 흡입 또는 근육내 투여된다. 특정 실시양태에서, 상이한 경로의 조합도 또한 사용할 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 이러한 방법은 COPD 환자에게 기관지확장제, 코르티코스테로이드 또는 COPD에 대하여 공지된 기타의 치료제를 투여하는 것을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 천식 환자에게 치료적 유효량의 V형 콜라겐 또는 그의 면역원성 단편을 투여하는 것을 포함하는 천식의 치료 방법을 제공한다. 이러한 방법의 한 실시양태에서, V형 콜라겐 또는 그의 면역원성 단편은 경구 투여되며, 0.1 내지 0.5 ㎎의 투약량으로 투여된다. 추가의 실시양태에서, V형 콜라겐 또는 그의 면역원성 단편은 정맥내, 폐내 점적주입, 흡입 또는 근육내 투여된다. 추가의 실시양태에서, 이러한 방법은 천식 환자에게 코르티코스테로이드, 기관지확장제 및/또는 류코트리엔 조절제 또는 천식에 대하여 공지된 기타의 공지된 치료제를 투여하는 것을 더 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면은 만성 폐쇄성 폐질환이 발생할 위험이 있는 개체에게 치료적 유효량의 V형 콜라겐 또는 그의 면역원성 단편을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 만성 폐쇄성 폐질환의 발생을 예방하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, V형 콜라겐 또는 그의 면역원성 단편을 경구 투여하며, 0.1 ㎎ 내지 0.5 ㎎의 투약량으로 투여할 수 있다. 추가의 실시양태에서, V형 콜라겐 또는 그의 면역원성 단편은 정맥내, 폐내 점적주입, 흡입 또는 근육내 투여되며, 이들 경로와 조합하여 투여될 수도 있다.

본 발명의 추가의 측면은 천식이 발생할 위험이 있는 개체에게 치료적 유효량의 V형 콜라겐 또는 그의 면역원성 단편을 투여하는 것을 포함하는 개체에서 천식의 발생 또는 악화를 예방하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, V형 콜라겐 또는 그의 면역원성 단편을 경구 투여하며, 특정 실시양태에서, 0.1 ㎎ 내지 0.5 ㎎의 투약량으로 투여할 수 있다. 추가의 실시양태에서, V형 콜라겐 또는 그의 면역원성 단편을 정맥내, 폐내 점적주입, 흡입, 근육내 또는 이들 경로중 1종 이상의 조합에 의하여 투여된다.

본 발명의 한 측면은 환자로부터의 혈액 샘플의 적어도 일부분을 콜라겐 V 또는 그의 항원성 단편과 접촉시키고; 콜라겐 V 또는 그의 항원성 단편에 결합하는 항체의 레벨을 측정(즉, V형 콜라겐-특이성 항체의 레벨을 측정)하는 것을 포함하며; 여기서 콜라겐 V에 결합하는 항체의 존재는 COPD 또는 천식을 나타내는, 콜라겐 V 내성 요법을 위한 지원자로서 COPD 또는 천식 환자를 확인하는 방법을 제공한다. 이와 관련하여, 콜라겐 V-특이성 항체 레벨은 COPD 또는 천식을 진단하는데 있어서 본 명세서에 기재된 바와 같은 기타의 임상적 요인과 함께 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 콜라겐 V 또는 그의 항원성 단편은 비이드에 결합된다. 추가의 실시양태에서, 측정은 콜라겐 V 또는 그의 항원성 단편에 결합하는 항체를 형광 표지된 항-IgG 항체와 접촉시키고; 유속 세포분석법에 의하여 콜라겐 V에 결합하는 항체에 결합된 형광 표지된 항-IgG 항체의 양을 검출하는 것을 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면은 개체로부터의 혈액 샘플의 적어도 일부분을 콜라겐 V 또는 그의 항원성 단편과 접촉시키고; 콜라겐 V 또는 그의 항원성 단편에 결합하는 항체의 레벨을 측정(즉, V형 콜라겐-특이성 항체의 레벨을 측정)하는 것을 포함하며, 여기서 콜라겐 V에 결합하는 항체의 존재는 콜라겐 V에 결합하는 항체가 없는 개체에서 예상되는 것보다 더 큰 위험과 관련되어 있는, COPD 또는 천식을 발생시킬 위험이 있는 개체를 확인하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 콜라겐 V 또는 그의 항원성 단편은 비이드에 접합된다. 또 다른 실시양태에서, 측정은 콜라겐 V 또는 그의 항원성 단편에 결합하는 항체를 형광 표지된 항-IgG 항체와 접촉시키고; 유세포분석기(flow cytometry)에 의하여 콜라겐 V에 결합하는 항체에 결합된 형광 표지된 항-IgG 항체의 양을 측정하는 것을 포함한다.

COPD 또는 천식이 발생한 위험을 진단 또는 측정하는 방법의 특정 실시양태에서, 이러한 방법에 사용된 항-IgG 항체는 모든 IgG 서브타입을 검출한다. 추가의 실시양태에서, 항-IgG 항체는 IgG1 서브타입 또는 IgG2 서브타입 또는 IgG3 서브타입 또는 IgG4 서브타입을 특이적으로 검출한다. 이와 관련하여, 하나의 서브타입으로부터 또 다른 서브타입으로의 교체는 질환의 진행중에 발생할 수 있으며, 질환의 악화를 나타낼 수 있다. 그러므로, 시간 경과에 따른 하나의 서브타입의 증가는 질환의 악화를 나타낼 수 있다.

본 발명의 추가의 측면은 개체로부터의 1차 혈액 샘플의 적어도 일부분을 콜라겐 V 또는 그의 항원성 단편과 접촉시키고; 1차 혈액 샘플 중의 콜라겐 V 또는 그의 항원성 단편에 결합하는 항체의 레벨을 측정하고; 차후의 시점에서 채취한 개체로부터의 2차 혈액 샘플의 적어도 일부분을 콜라겐 V 또는 그의 항원성 단편과 결합시키고; 2차 혈액 샘플 중의 콜라겐 V 또는 그의 항원성 단편에 결합하는 항체의 레벨을 측정하고; 2차 혈액 샘플 중의 콜라겐 V 또는 그의 항원성 단편에 결합하는 항체의 레벨을 1차 혈액 샘플 중의 콜라겐 V 또는 그의 항원성 단편에 결합하는 항체의 레벨과 비교하는 것을 포함하며, 여기서 1차 샘플에 비하여 2차 샘플 중의 콜라겐 V에 결합하는 항체의 레벨의 증가는 COPD 또는 천식의 악화를 나타내며, 1차 샘플에 비하여 2차 샘플 중의 콜라겐 V에 결합하는 항체의 레벨의 감소는 COPD 또는 천식의 향상을 나타내는, 개체에서의 COPD 또는 천식의 진행을 모니터하는 방법을 제공한다. COPD 및 천식의 기타 임상적 지시제는 본 명세서에서 제공된 방법과 함께 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 특정한 IgG 서브타입(예, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 항-콜라겐 V 항체의 증가는 COPD 또는 천식의 진행을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 콜라겐 V 또는 그의 항원성 단편은 비이드에 접합되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 측정은 콜라겐 V 또는 그의 항원성 단편에 결합하는 항체를 형광 표지된 항-IgG 항체와 접촉시키고; 유속 세포분석법에 의하여 콜라겐 V에 결합하는 항체에 결합된 형광 표지된 항-IgG 항체의 양을 검출하는 것을 포함한다. 진행을 모니터링하는 방법의 특정 실시양태에서, 항-IgG 항체는 모든 IgG 서브타입을 검출한다. 기타의 실시양태에서, 항-IgG 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브타입을 특이적으로 검출한다.

이와 같은 본 발명의 측면 및 기타의 측면은 하기의 상세한 설명 및 첨부한 도면을 참조하면 명백할 것이다.

V형 콜라겐

콜라겐 단백질은 주로 히드록시프롤린(Hyp), 글리신(Gly) 및 프롤린(Pro)으로 이루어진 아미노산의 반복된 서열로 이루어진 폴리펩티드 사슬로 생성된다. 콜라겐은 사람 신체에서 발견되는 가장 지배적인 단백질중 하나로서 정상의 (상처가 없는) 피부 조직의 진피층에서 약 80 내지 85%의 세포외 기질(ECM)을 포함한다.

콜라겐은 서열 동일성 및 작용에 기초하여 여러 가지 유형으로 분류된다. I형, II형 및 III형 콜라겐 분자는 대부분의 동물 세포외 구조의 주요 섬유를 생성한다. I형은 신체의 콜라겐의 약 90%를 형성하며, 뼈, 피부 및 힘줄의 주요 성분이다. II형은 연골의 주요 섬유를 생성한다. 콜라겐 섬유는 뼈에서 단단한 판으로 정렬되고, 힘줄에서는 평행다발로 정렬되며, 연골에서는 밀집한 망상구조로 정렬되어 있다. I형 및 더 적은 양의 III형은 힘줄 및 피부를 생성한다. IV형 콜라겐 분자는 기저 판에 존재하는 매우 미세한 줄무늬가 없는 섬유를 생성한다. V형 콜라겐(colV)은 폐에 존재하는 소수의 콜라겐이며[Madri and Furthmayr, Human Pathology, 11:353-366, 1980], 세기관지주위 결합 조직[Madri and Furthmayr, Am. J. Pathol ., 94:323-332, 1979], 폐포 간질[Konomi et al., 1984] 및 모세혈관 기저막[Madri and Furthmayr, 1979, 상동]에 위치한다. 12종 이상의 기타 콜라겐 유형이 알려져 있으나, 그리 특성화되지는 않았다.

콜라겐 폴리펩티드 사슬은 반복 글리신-X-Y 삼중자 및 구상 N-말단 및 C-말단 도메인으로 생성된 코어 나선형 도메인을 특징으로 한다. 이와 같은 3종의 사슬은 각각의 로프형 콜라겐 분자를 생성하기 위하여 초나선형으로 서로 감겨 있다.

종래의 연구는 colV에 대한 자가면역이 만성 동종이식 기능이상(폐색성 세기관지염, 폐쇄 세기관지염 증후군(BOS) 포함), 폐 동종이식 거부 및 IPF가 발생할 위험과 관련되어 있다는 것을 입증하였다(예를 들면 미국 특허 제7,348,005호 및 WO2007/120947 참조).

게다가, 이러한 연구는 colV의 투여가 동종항원 및 colV에 대한 내성을 유도한다는 것을 밝혀냈다(예를 들면 WO2007/120947; 도 10 참조). 그러나, 본 발명 이전에, colV에 대한 자가면역과의 연관성은 천식 또는 COPD에서도 나타나지 않았다. 사실상, 종래의 발견은 COPD 환자가 알려진 폐질환을 갖고 있지 않은 정상의 개체에게서 나타나는 것과는 크게 상이한 항-col(V) DTH 반응을 갖지 않는다는 것을 나타냈다(WO2007/120947, 실시예 2; 도 3 참조). 그러므로, 본 발명은 놀랍게도, COPD 환자가 정상의 대조군에 비하여 증가된 항-colV DTH 반응을 갖지 않는다는 종래의 관찰에도 불구하고, COPD 환자가 증가된 항-colV 항체를 갖는다는 것을 밝혀냈다(예를 들면 실시예 1, 도 1 참조).

그래서, 본 발명은 COPD 및 천식 환자에게서 또는 이들 질환이 발생할 위험이 있는 개체에게서 colV에 대한 내성을 유발하는 것에 관한 것이다.

CoIV 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열은 당업자에게 공지되어 있으며, 공용 데이타베이스에서 얻을 수 있다. 본 발명의 colV 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 예로는 호모 사피엔 콜라겐, V형, 알파 1(COL5A1), mRNA NCBI 참고 서열: NM_000093.3 버전 GI:89276750(서열 번호 1); 알파 1 V형 콜라겐 프레프로단백질[호모 사피엔스]: 수탁 번호 NP_000084, 버전 GI:89276751(서열 번호 2); 호모 사피엔 콜라겐, V형, 알파 2(COL5A2), mRNA; 수탁 번호 NM_000393, 버전 GI:89363016(서열 번호 3); 알파 2 V형 콜라겐 프레프로단백질[호모 사피엔스]; 수탁 번호 NP_000384, 버전 GI:89363017(서열 번호 4); 호모 사피엔 콜라겐, V형, 알파 3(COL5A3), mRNA; 수탁 번호 NM_015719, NM_015719.3, GI:110735434(서열 번호 5); 콜라겐, V형, 알파 3 프레프로단백질[호모 사피엔]; 수탁 번호 NP_056534, 버전 NP_056534.2, GI:110735435(서열 번호 6)를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

당업자가 인식하고 있는 바와 같이, 프레프로콜라겐은 세포중에서 세포로부터 배출되는 프로콜라겐으로 처리되며, 최종적으로 콜라겐 피브릴 및 섬유로 형성된다. 그래서, 본 발명은 구체적으로 프로콜라겐 및 본 명세서에 기재된 콜라겐 단백질의 기타의 처리되거나 또는 성숙한 형태에 관한 것이다. 이와 관련하여, 예를 들면 서열 번호 4의 아미노산 1- 26은 처리중 분할되는 시그날 펩티드에 해당하며, 아미노산 27-1229는 콜라겐 알파-2(V) 사슬이며, 아미노산 1230-1499는 c-말단 프로펩티드에 해당한다. 본 명세서에서 구체적으로 개시된 서열내에서의 위치는 당업자가 인지하고 있으며, 서열의 주석이 제공된 각종 공용 데이타베이스를 통하여 입수할 수 있다. 또한, 콜라겐 단백질의 특정 아미노산은 수식에 (예, 프롤린으로부터 히드록시프롤린으로) 변형되는 것에 유의하여야 한다. V형 콜라겐 쇄, 특히 알파-2 쇄의 성숙한 변형된 형태가 본 명세서에서 구체적으로 고려되고 있다. 보고한 바와 같이, 본 발명에서 사용하기 위한 V형 콜라겐 및 그의 알파 쇄는 각종 공급처로부터 정제될 수 있거나 또는 재조합 생성될 수 있다.

본 명세서에서 사용한 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 그의 통상의 의미내에서, 즉 아미노산의 서열로서 사용된다. 폴리펩티드는 생성물의 특정의 길이로 한정되지 않으며, 그래서 펩티드, 올리고펩티드 및 단백질이 폴리펩티드의 정의에 포함되며, 이러한 용어는 반대의 의미로 구체적으로 나타내지 않는 한 본 명세서에서 번갈아 사용할 수 있다. 이와 같은 용어는 또한 천연 발생 및 비-천연 발생 모두인, 폴리펩티드의 후-발현 변형, 예를 들면 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등 뿐 아니라, 당업계에서 공지된 기타의 변형을 지칭하거나 또는 배제시키지 않는다. 폴리펩티드는 전체 단백질 또는 그의 부서열이 될 수 있다. 본 발명에서 중요한 특정 폴리펩티드는 관용원성 단편을 포함하는 아미노산 부서열이다.

본 발명은 또 다른 측면에서 본 명세서에서 설명한 콜라겐 폴리펩티드 조성의 모든 중간 길이, 예컨대 서열 번호 2, 4 또는 6으로 설명한 것 또는 서열 번호 1, 3 또는 5의 서열로 설명한 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 인코딩된 것을 비롯한 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 50 또는 100개의 인접 아미노산 또는 그보다 많이 포함하는 폴리펩티드 단편을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 조성물의 변이체를 제공한다. 본 발명에 의하여 일반적으로 포함되는 폴리펩티드 변이체는 통상적으로 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 서열에 대하여 이의 길이를 따라 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 또는 그보다 높은 동일성(이하에서 설명한 바와 같이 측정함)을 나타낸다.

한 실시양태에서, 본 발명에 의하여 제공된 폴리펩티드 단편 및 변이체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역학적 면역허용원이다.

본 명세서에서 사용한 용어인 폴리펩티드 "변이체"는 1종 이상의 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입에서 본 명세서에서 구체적으로 개시한 폴리펩티드와는 통상적으로 상이한 폴리펩티드이다. 이와 같은 변이체는 천연 발생일 수 있거나 또는 예를 들면 본 발명의 상기 폴리펩티드 서열의 1종 이상을 변형시키고, 본 명세서에 기재된 바와 같은 그의 면역허용원 활성을 평가하고 및/또는 당업자에게 공지된 임의의 다수의 기법을 사용하여 인공 생성될 수 있다.

다수의 경우에서, 변이체는 보존성 치환을 포함한다. "보존성 치환"은 하나의 아미노산이 유사한 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환되어 펩티드 화학 분야의 당업자가 실질적으로 변경되지 않을 폴리펩티드의 2차 구조 및 수치요법적 성질을 예상하게 되는 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 구조에서 변형이 이루어지며, 여전히 바람직한 특징, 예를 들면 면역허용원 성질을 갖는 변이체 또는 유도체 폴리펩티드를 인코딩하는 기능성 분자를 얻을 수 있다. 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변경시켜 본 발명의 등가의 또는 심지어 개선된 면역허용원 변이체 또는 부분을 생성하는 것을 원할 경우, 당업자는 통상적으로 하기 표 1에 의한 인코딩 DNA 서열의 코돈중 1종 이상을 변경시킬 것이다.

예를 들면, 특정의 아미노산은 예를 들면 항체의 항원-결합 부위 또는 기질 분자상의 결합 부위와 같은 구조와의 상호작용 결합 능력을 상당하게 손실하지 않으면서 단백질 구조에서의 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 단백질의 생물학적 작용성 활성을 정의하는 것은 단백질의 상호작용 능력 및 성질이므로, 특정의 아미노산 서열 치환은 단백질 서열 및 물론 그의 근본적인 DNA 코딩 서열에서 이루어질 수 있으며, 그럼에도 불구하고, 유사한 성질을 갖는 단백질을 얻게 된다. 그래서, 그의 면역허용원의 유용성 또는 활성을 상당히 손실하지 않으면서 상기 펩티드를 인코딩하는 개시된 조성물의 펩티드 서열 또는 해당 DNA 서열에서 다양한 변경이 이루어질 수 있는 것으로 이해된다.

이와 같은 변화를 생성할 때, 아미노산의 수치요법적 지수를 고려할 수 있다. 단백질상에서 상호작용 생물학적 작용을 부여하는데 있어서의 수치요법적 아미노산 지수의 중요성이 일반적으로 당업계에서 이해되고 있다. 문헌[Kyte and Doolittle, 1982, 본 출원에 참고로 인용함]. 아미노산의 상대적 수치요법적 특성은 생성된 단배질의 2차 구조에 기여하게 되며, 이는 다시 단백질과 다른 분자, 예를 들면 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등과의 상호작용을 정의한다. 각각의 아미노산은 그의 소수성 및 하전 특성에 기초하여 수치요법적 지수를 할당한다[Kyte and Doolittle, 1982]. 이들 값은 이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5)이다.

특정 아미노산이 유사한 수치요법적 지수 또는 스코어를 갖는 기타의 아미노산으로 치환될 수 있으며, 그리고 여전히 유사한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 생성하며, 즉 생물학적 작용성 등가 단백질을 얻을 수 있다는 것은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 변화를 생성할 때, 수치요법적 지수가 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하며, ±1 이내가 특히 바람직하며, ±0.5 이내가 훨씬 더 바람직하다. 또한, 유사 아미노산의 치환은 친수성에 기초하여 효과적으로 생성될 수 있는 것으로 당업계에서 이해된다. 미국 특허 제4,554,101호(구체적으로 그 전문이 본 출원에 참고로 포함됨)에는 그의 이웃하는 아미노산의 친수성이 단백질의 생물학적 성질과 상관관계를 갖는다는 것에 의하여 결정되는 바와 같이 최대 국소 평균 친수화도가 기재되어 있다.

미국 특허 제4,554,101호에 기재된 바와 같이, 하기와 같은 친수화도 수치가 아미노산 잔기에 할당된다: 아르기닌(+3.0); 리신(+3.0); 아스파르테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 이소류신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 아미노산은 유사한 친수화도 수치를 갖는 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있으며, 여전히 생물학적 등가물 및, 특히 면역학적 등가인 단백질을 얻을 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 변화에서, 친수화도 수치가 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하며, ±1 이내인 것이 특히 바람직하며, ±0.5 이내인 것이 더더욱 바람직하다.

그러므로, 상기 설명한 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측사슬 치환기의 상대적 유사성, 예를 들면 그의 소수화도, 친수화도, 하전, 크기 등에 기초한다. 상기의 다양한 성질을 고려한 예시의 치환은 당업자에게 공지되어 있으며, 그 예로는 아르기닌 및 리신; 글루타메이트 및 아스파르테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신을 들 수 있다.

게다가, 임의의 폴리뉴클레오티드는 생체내 안정성을 증가시키기 위하여 추가로 개질될 수 있다. 가능한 변형으로는 5' 및/또는 3' 말단에서의 인접 서열의 첨가; 주사슬에서 포스포디에스테라제 결합보다는 포스포로티오에이트 또는 2' O-메틸의 사용; 및/또는 비통상적인 염기, 예컨대 이노신, 케노신 및 위부토신뿐 아니라, 아세틸- 메틸-, 티오- 및, 아데닌, 시티딘, 구아닌, 티민 및 우리딘의 기타 변형된 형태의 포함을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

아미노산 치환은 잔기의 극성, 하전, 용해도, 소수화도, 친수화도 및/또는 양친매성 성질에 기초하여 추가로 이루어질 수 있다. 예를 들면, 음으로 하전된 아미노산으로는 아스파르트산 및 글루탐산을 들 수 있으며; 양으로 하전된 아미노산으로는 리신 및 아르기닌을 들 수 있으며; 유사한 친수화도 값을 갖는 비하전된 극성 헤드 기를 갖는 아미노산으로는 류신, 이소류신 및 발린; 글리신 및 알라닌; 아스파라긴 및 글루타민; 및 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신을 들 수 있다. 보존성 변경을 나타낼 수 있는 아미노산의 기타의 기로는 (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; 및 (5) phe, tyr, trp, his를 들 수 있다. 변이체은 또한 또는 대안으로 비보존성 변경을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 변이체 폴리펩티드는 5종의 아미노산 또는 그보다 더 적은 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의하여 본래의 서열과는 상이하다. 변이체은 또한(또는 대안으로) 예를 들면 폴리펩티드의 면역허용원성, 2차 구조 및 수치요법적 성질에 최소의 영향을 갖는 아미노산의 결실 또는 첨가에 의하여 변형될 수 있다.

상기에서 논의한 바와 같이, 폴리펩티드는 단백질의 전이를 번역동시이동 또는 번역후 직접전이 지시하는 단백질의 N-말단에서 시그날(또는 리더) 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 또한 폴리펩티드(예, 폴리-His)의 합성, 정제 또는 확인의 용이성을 위하여 또는 폴리펩티드를 고체 지지체에 결합시키는 것을 향상시키기 위하여 링커 또는 기타의 서열에 결합될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 면역글로불린 Fc 영역에 접합될 수 있다.

폴리펩티드 서열을 비교할 때, 하기에 기재된 바와 같이 최대 대응을 위하여 정렬될 때 2개의 서열에서의 아미노산의 서열이 동일한 경우를 "동일하다"라고 한다. 2개의 서열 사이의 비교는 통상적으로 서열 유사성의 국소 영역을 확인 및 비교하기 위하여 비교 윈도우에 대하여 서열을 비교하여 실시된다. 본 명세서에서 사용한 바와 같이 "비교 윈도우"는 적어도 약 20개, 일반적으로 30 내지 약 75개, 40 내지 약 50개의 인접 위치의 분절을 지칭하며, 여기서 서열은 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후 동일 수의 인접 위치의 참조 서열과 비교할 수 있다.

비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 생물정보학 소프트웨어의 Lasergene 스위트에서의 Megalign 프로그램(DNASTAR, 인코포레이티드, 미국 위스컨신주 매디슨 소재)을 사용하고, 디폴트 변수를 사용하여 실시할 수 있다. 이러한 프로그램은 하기와 같은 참고 문헌에 기재된 여러 가지의 정렬 방식을 구체화하였다: 문헌[Dayhoff, M.O., (1978) A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M. O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes, pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; HIgG1ns, D. G. and Sharp, P.M., CABIOS 5:151-153 (1989); Myers, E.W. and Muller W., CABIOS 4:11-17 (1988); Robinson, E. D., Comb. Theor 11:105 (1971); Saitou, N. Nei, M., Mol . Biol . Evol. 4:406-425 (1987); Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., Numerical Taxonomy-the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA (1973); Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., Proc . Natl . Acad ., Sci . USA 80:726-730 (1983)].

대안으로, 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 문헌[Smith and Waterman, Add. APL . Math 2:482 (1981)]의 국소 확인 알고리즘에 의하여, 문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol . Biol. 48:443 (1970)]의 확인 정렬 알고리즘에 의하여, 문헌[Pearson and Lipman, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85: 2444 (1988)]의 유사성 방법에 대한 조사에 의하여, 이들 알고리즘의 컴퓨터를 사용한 실행[GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., 미국 위스컨신주 매디슨 소재]에 의하여 또는 검사에 의하여 실시할 수 있다.

퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하는데 적절한 알고리즘의 바람직한 예로는 문헌[Altschul et al., Nucl . Acids Res. 25:3389-3402 (1977)] 및 [Altschul et al., J. Mol . Biol. 215:403-410 (1990)] 각각에 기재되어 있는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 및 BLAST 2.0은 예를 들면 본 명세서에 기재된 변수를 사용하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드에 대한 퍼센트 서열 동일성을 측정하는데 사용할 수 있다. BLAST 분석을 실시하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생물 정보 센터를 통하여 공개적으로 입수 가능하다. 아미노산 서열의 경우, 점수 행렬을 사용하여 누적 점수를 계산하였다. 이의 최대 달성 수치로부터 양 X에 의하여 누적 정렬 점수가 떨어질 경우 각각의 방향에서의 단어 맞춤의 확대를 중단하고; 누적 점수는 1종 이상의 음의 점수 잔여 정렬의 누적으로 인하여 0 또는 0 미만이 되거나; 또는 서열의 말단에 도달한다. BLAST 알고리즘 변수 W, T 및 X는 정렬의 민감도 및 속도를 결정한다.

하나의 바람직한 접근법에서, "서열 동일성의 퍼센트"는 적어도 20개의 위치의 비교 윈도우에 대하여 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하여 결정하며, 여기서 비교 윈도우에서의 폴리펩티드 서열의 일부는 2개 서열의 최적 정렬에 대하여 참고 서열(첨가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 20 퍼센트 이하, 일반적으로 5 내지 15 퍼센트 또는 10 내지 12 퍼센트의 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 퍼센트는 동일한 아미노산 잔기가 서열 모두에서 발생하여 부합되는 위치의 수를 산출하는 위치의 수를 결정하고, 부합된 위치의 수를 참고 서열에서의 위치의 총수(즉, 윈도우 크기)로 나누고, 그 값에 100을 곱하여 서열 동일성의 퍼센트를 얻어서 계산한다.

기타 예시의 실시양태에서, 폴리펩티드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 복수의 폴리펩티드를 포함하거나 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 1개 이상의 폴리펩티드 및 관련이 없는 서열, 예컨대 정제를 위한 His 태그를 포함하는 융합 폴리펩티드 또는 표적 펩티드가 될 수 있다. 융합 파트너는 예를 들면 천연의 재조합 단백질보다 더 높은 수율로 단백질(발현 인핸서)을 발현시키는 것을 도울 수 있다. 기타의 융합 파트너는 폴리펩티드의 용해도를 증가시키거나 또는 폴리펩티드를 목적하는 세포내 구획으로 표적화시킬 수 있도록 선택될 수 있다. 여전히 추가의 융합 파트너로는 폴리펩티드의 정제를 촉진시키는 친화도 태그를 포함한다. 특정 실시양태에서, 융합 파트너는 폴리펩티드의 면역허용원성을 증가시키거나 또는 세포에 의한 흡수를 증가시킨다. 추가의 실시양태에서, 융합 파트너는 면역 반응 인핸서를 포함한다.

융합 폴리펩티드는 일반적으로 화학적 결합을 비롯한 표준 기법을 사용하여 생성될 수 있다. 바람직하게는, 융합 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드로서 발현되어 발현계에서 비-융합된 폴리펩티드에 비하여 증가된 레벨로 생성되도록 한다. 간략하게, 폴리펩티드 성분을 인코딩하는 DNA 서열은 별도로 조합되고 적절한 발현 벡터로 연결될 수 있다. 하나의 폴리펩티드 성분을 인코딩하는 DNA 서열의 3' 말단은 펩티드 링커를 사용하거나 또는 사용하지 않고 제2의 폴리펩티드 성분을 인코딩하는 DNA 서열의 5' 말단으로 연결되어 서열의 리딩 프레임이 작동하게 된다. 이는 성분 폴리펩티드 모두의 생물학적 활성을 보유하는 단일의 융합 폴리펩티드로 번역되도록 한다.

펩티드 링커 서열은 각각의 폴리펩티드가 그의 2차 및 3차 구조로 폴딩되도록 하기에 충분한 거리로 제1의 및 제2의 폴리펩티드 성분을 분리하는데 사용될 수 있다. 이와 같은 펩티드 링커 서열은 당업계에 공지된 표준 기법을 사용하여 융합 폴리펩티드에 투입된다. 적절한 펩티드 링커 서열은 (1) 가요성 확장된 입체형태를 채택하는 능력; (2) 제1의 및 제2의 폴리펩티드상에서 작용성 에피토프와 상호작용할 수 있는 2차 구조를 선택하는 불능; 및 (3) 폴리펩티드 작용성 에피토프와 반응할 수 있는 소수성 또는 하전된 잔기의 결여와 같은 요인에 기초하여 선택될 수 있다. 바람직한 펩티드 링커 서열은 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함한다. 기타의 거의 중성인 아미노산, 예컨대 Thr 및 Ala는 또한 링커 서열에 사용될 수 있다. 링커로서 유용하게 사용될 수 있는 아미노산 서열로는 문헌[Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 83:8258-8262, 1986], 미국 특허 제4,935,233호 및 미국 특허 제4,751,180호에 기재된 것을 들 수 있다. 링커 서열은 길이가 일반적으로 1 내지 약 50개의 아미노산이 될 수 있다. 링커 서열은 제1의 및 제2의 폴리펩티드가 작용성 도메인을 분리하고 그리고 입체 간섭을 방해하는데 사용될 수 있는 비필수 N-말단 아미노산 영역을 가질 경우에는 필요하지 않다.

연결된 DNA 서열은 적절한 전사 또는 번역 조절 요소에 작동 가능하게 연결된다. DNA의 발현에 참여하는 조절 요소는 제1의 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 서열에 대하여 5'에만 위치한다. 유사하게, 번역 및 전사 종결 시그날을 종료하는데 필요한 정지 코돈은 제2의 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 서열에 대하여 3'에만 존재한다.

본 발명의 하나의 실시양태는 이를 인코딩하는 융합 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 융합 파트너는 미국 특허 제5,633,234호에 기재된 바와 같이 폴리펩티드를 엔도좀/리소좀 구획으로 지시할 수 있는 표적 시그날을 포함한다. 본 발명의 면역허용원 폴리펩티드는 표적 시그날과 함께 융합될 때 MHC 유형 II 분자와 더 높은 효율로 결합되어 폴리펩티드에 대하여 특이적인 적절한 CD4⁺ T 세포의 향상된 생체내 자극을 제공한다.

본 발명의 폴리펩티드는 각종 공지된 합성 및/또는 재조합 기법중 임의의 것을 사용하여 생성되며, 후자의 기법은 하기에 추가로 기재된다. 일반적으로 약 150개 미만의 아미노산의 폴리펩티드, 부분 및 기타의 변이체는 당업자에게 공지된 기법을 사용하여 합성 수단에 의하여 생성될 수 있다. 한 예시의 예에서, 이와 같은 폴리펩티드는 통상적으로 입수 가능한 고체-상 기법중 임의의 것, 예컨대 Merrifield 고체-상 합성 방법을 사용하여 합성되며, 여기서 아미노산은 성장하는 아미노산 사슬에 순차적으로 첨가된다. 문헌[Merrifield, J. Am. Chem . Soc . 85:2149-2146, 1963] 참조. 폴리펩티드의 자동 합성을 위한 기기는 퍼킨 엘머/애플라이드 바이오시스템즈 디비젼(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)과 같은 공급처로부터 통상적으로 입수 가능하며, 제조업자의 지시내용에 따라 작동될 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 폴리펩티드 조성물(융합 폴리펩티드 포함)을 분리한다. "분리된" 폴리펩티드는 이의 본래의 환경으로부터 제거된 것이다. 예를 들어, 자연계에서 공존하는 물질의 일부 또는 전부로부터 분리될 경우 천연 발생 단백질 또는 폴리펩티드가 분리된다. 바람직하게는 이러한 폴리펩티드는 또한 약 90% 이상의 순도, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상의 순도, 가장 바람직하게는 약 99% 이상의 순도로 정제된다.

ColV 단백질은 다양한 공급처로부터 정제될 수 있거나 또는 시판 공급처(콜래보러티브 바이오메디칼 프로덕츠/벡톤, 디킨슨 앤 컴파니, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재)로부터 판매될 수 있다. 일부 실시양태를 실시하기 위하여, 순수하거나 또는 부분적으로 순수한 콜라겐 또는 관용원성 단편, 에피토프 또는 그의 항원성 부분을 얻는 것이 필요할 수 있다. 이러한 물질, 예를 들면 V형 콜라겐 또는 그의 단편은 동물원성, 사람 사체 또는 재조합 수단을 비롯한 다양한 수단에 의하여 용이하게 얻을 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 추가의 방법은 콜라겐, 예컨대 V형 콜라겐의 부분 소화를 포함한다. 이와 관련하여, 사람 V형 콜라겐은 사람 태반 또는 기타의 공급원으로부터 추출될 수 있으며, 분별 NaCl 침전에 의하여 정제될 수 있다[Seyer and Kang, 1989]. 예를 들어, 태반 조직을 갈고, 세정하고, 0.2 M NaCl을 포함하는 0.5 M 아세트산에 현탁시키고, 펩신에 의하여 4℃에서 소화시킨다. 원심분리된 시료로부터 상청액을 흡인시키고, 펠릿을 수집하고, 추출 절차를 반복하였다. 상청액을 2개의 소화물로부터 합하고, col(V)를 0.5 M 아세트산으로부터의 분별 NaCl 침전에 의하여 상청액으로부터 정제하였다. 문헌[Smith et al., 1985; Seyer and Kang, 1989]. V형 콜라겐은 일반적으로 0.7 M NaCl에 가용성이며. 1.2 M NaCl중에 침전된다.

α(V) 사슬을 정제하는데 필요한 실시양태의 경우, 아세트산에서의 가용화 및 NaCl 침전의 사이클은, 약 2의 α-사슬 비율 α1(V)/α2(V)를 이용한 V형 제조가 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Smith et al., 1985) 또는 당업자에게 공지된 기타의 적절한 방법에 의하여 측정하여 얻을 때까지 반복할 수 있다. α1(V)를 α2(V)로부터 분리하는 것은 DEAE-셀룰로스상에서의 크로마토그래피(Seyer and Kang, 1989) 또는 당업자에게 공지된 기타의 방법, 예컨대 문헌[Protein Purification Protocols, Ed. Shawn Doonan, Humana Press, 1996]에 기재된 방법에 의하여 달성될 수 있다. α1(V) 및 α2(V) 사슬을 컬럼으로부터 용출시키고, 이전에 보고된 바와 같은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동[Smith, Jr. et al., 1985]에 의하여 순도를 확인할 수 있다. 무상해 col(V) 또는 α1(V) 및 α2(V) 사슬은 사용할 때까지 PBS(0.5 ㎎/㎖) 또는 기타의 적절한 완충액에 희석시킬 수 있다.

본 발명은 특정 실시양태에서, 본 발명의 콜라겐 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 폴리뉴클레오티드의 예는 본 명세서에 기재된 바와 같은 콜라겐 단백질의 관용원성 단편을 인코딩하는 서열 번호 1, 3 및 5 및 그의 단편에서 설명되는 것이다.

용어 "DNA" 및 "폴리뉴클레오티드"는 특정 종의 전체 게놈 DNA가 없는 분리된 DNA 분자를 지칭하기 위하여 실질적으로 번갈아 사용한다. 본 명세서에서 사용한 바와 같이 "분리된"이라는 것은 폴리뉴클레오티드가 기타의 코딩 서열로부터 실질적으로 떨어져 있으며, DNA 분자가 관련이 없는 코딩 DNA의 커다란 부분, 예컨대 커다란 염색체 단편 또는 기타의 기능성 유전자 또는 폴리펩티드 코딩 영역을 포함하지 않는다는 것을 의미한다. 물론, 이는 초기에 분리되고 그리고 사람의 손에 의하여 분절에 차후에 첨가되는 유전자 또는 코딩 영역을 배제하지 않은 DNA 분자를 지칭한다.

당업자에 의하여 이해되는 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 조성물은 게놈 서열, 게놈외 및 플라스미드-인코딩 서열 및 발현되거나 또는 발현되도록 변형될 수 있는 더 작은 조작된 유전자 분절, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 등을 포함할 수 있다. 이러한 분절은 자연적으로 분리되거나 또는 사람의 손에 의하여 인공적으로 변형될 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 조성물은 각종 설정된 기법중 임의의 것을 사용하여 확인, 제조 및/또는 조작될 수 있다. (일반적으로 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel et al., (2001 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., NY, NY] 및 기타의 유사 문헌을 참조한다).

다수의 템플레이트 의존성 방법은 샘플에 존재하는 중요 표적 서열을 증폭시키는데 이용된다. 가장 잘 알려진 증폭 방법중 하나는 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 구체적으로 기재된 폴리머라제 연쇄 반응(PCR™)이며, 이들 특허의 개시 내용은 그 전문이 본 출원에 참고로 포함된다.

임의의 다수의 기타 템플레이트 의존성 방법에서 다수의 방법은 PCR™ 증폭 기법의 변형이며, 이는 당업계에서 잘 알려져 있으며, 입수 가능하다. 일부의 이와 같은 방법의 예로는 유럽 특허 출원 공개 공보 제320,308호 및 미국 특허 제4,883,750호에 기재된 리가제 연쇄 반응(LCR로 지칭함); PCT 국제 특허 출원 공개 공보 제PCT/US87/00880호에 기재된 Q베타 복제효소; 가닥 배치 증폭(SDA) 및 복구 연쇄 반응(RCR)을 들 수 있다. 여전히 기타의 증폭 방법은 영국 특허 출원 공개 공보 제2,202,328호 및 PCT 국제 특허 출원 공개 공보 제PCT/US89/01025호에 기재되어 있다. 기타의 핵산 증폭 절차는 핵산 서열에 기초한 증폭(NASBA) 및 3SR를 비롯한 전사에 기초한 증폭 시스템(TAS)(PCT 국제 특허 출원 공개 공보 WO88/10315)을 들 수 있다. 유럽 특허 출원 공개 공보 제329,822호에는 단일 가닥 RNA("ssRNA"), ssDNA 및 이중 가닥 DNA(dsDNA)를 주기적으로 합성하는 것을 포함하는 핵산 증폭 방법이 기재되어 있다. PCT 국제 특허 출원 공개 공보 WO89/06700에는 프로모터/프라이머 서열을 표적 단일 가닥 DNA("ssDNA")로 하이브리드화시킨 후, 서열의 다수의 RNA 복제의 전사에 기초한 핵산 서열 증폭 방식이 기재되어 있다. 기타의 증폭 방법, 예컨대 "RACE"(Frohman, 1990) 및 "일측 PCR"(Ohara, 1989)은 또한 당업자에게 공지되어 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드의 증폭된 부분은 적절한 라이브러리(예를 들면 종양 cDNA 라이브러리)로부터 전장 유전자를 공지의 기법을 사용하여 분리하는데 사용될 수 있다.

또한, 당업자가 인식하고 있는 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥(코딩 또는 안티센스) 또는 이중 가닥이 될 수 있으며, DNA(게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는, 인트론을 포함하며 그리고, 일-대-일 방식으로 DNA 분자에 해당하는 HnRNA 분자 및, 인트론을 포함하지 않는 mRNA 분자를 포함할 수 있다. 추가의 코딩 또는 비-코딩 서열은 본 발명의 폴리뉴클레오티드내에 존재할 수 있으나, 반드시 그러할 필요는 없으며, 폴리뉴클레오티드는 기타의 분자 및/또는 지지 물질에 결합될 수 있으나, 반드시 그러할 필요는 없다.

폴리뉴클레오티드는 천연 서열(즉, 본 발명의 폴리펩티드/단백질 또는 그의 일부분을 인코딩하는 내인성 서열)을 포함할 수 있거나 또는 변이체 또는 유도체, 바람직하게는 이러한 서열의 면역허용원 변이체 또는 유도체를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다.

기타의 관련된 실시양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 서열 번호 1, 3 및 5에 개시된 서열, 예를 들면 본 명세서에 기재된 방법(예, 하기 기재된 바와 같은 표준 변수를 사용한 BLAST 분석)을 사용하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열에 비하여 적어도 70% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 또는 그보다 높은 서열 동일성을 포함하는 것과 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드 변이체를 제공한다. 당업자는 이러한 수치들이 코돈 변성, 아미노산 유사성, 리딩 프레임 위치 등을 고려하여 2개의 뉴클레오티드 서열에 의하여 인코딩된 단백질의 해당 동일성을 측정하도록 적절하게 조절될 수 있다는 것을 인식할 것이다.

통상적으로, 폴리뉴클레오티드 변이체는 바람직하게는 변이체 폴리뉴클레오티드에 의하여 인코딩된 폴리펩티드의 면역허용원 활성이 본 명세서에 구체적으로 기재된 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 인코딩된 폴리펩티드에 비하여 실질적으로 약화되지 않도록 1종 이상의 치환, 첨가, 결실 및/또는 삽입을 포함한다. 용어 "변이체"는 또한 이종 기원을 갖는 동종 유전자를 포함하는 것으로 이해하여야 한다.

추가의 실시양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 서열 중 1종 이상과 동일하거나 또는 이에 보충하는 서열의 인접 신장의 다양한 길이를 포함하거나 또는 이루어진 폴리뉴클레오티드 단편을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 본 명세서에 개시된 서열 중 1종 이상의 적어도 약 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 또는 1,000개 또는 그보다 많은 인접 뉴클레오티드뿐 아니라, 이들 사이의 모든 중간 길이의 인접 뉴클레오티드를 포함하거나 또는 이루어진 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 명세서에서 "중간 길이"라는 것은 언급한 수치 사이의 임의의 길이, 예컨대 16, 17, 18, 19 등; 21, 22, 23 등; 30, 31, 32 등; 50, 51, 52, 53 등; 100, 101, 102, 103 등; 150, 151, 152, 153 등; 200-500; 500-1,000 사이의 모든 정수 등을 비롯한 임의의 길이를 의미하는 것으로 용이하게 이해될 것이다. 본 명세서에 기재한 바와 같이 폴리뉴클레오티드 서열은 고유 서열에서 존재하지 않는 추가의 뉴클레오티드에 의하여 한 말단에서 또는 두 말단 모두에서 연장될 수 있다. 이와 같은 추가의 서열은 개시된 서열의 한 말단에서 또는 개시된 서열의 두 말단 모두에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드로 이루어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 명세서에서 제공된 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 단편 또는 그의 보충 서열에 중간 내지는 높은 엄중도 조건하에서 하이브리드화 가능한 폴리뉴클레오티드 조성물이 제공된다. 하이브리드화 기법은 분자 생물학 분야에서 공지되어 있다. 예시를 위하여, 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 기타의 폴리뉴클레오티드의 하이브리드화를 테스트하기에 적절한 중간 정도의 엄중도 조건은 5×SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA의 용액(pH 8.0)중에서의 예비세정; 밤새 50℃ 내지 60℃, 5×SSC에서의 하이브리드화; 그 후 65℃에서 20 분 동안 0.1% SDS를 포함하는 각각의 2×, O.5× 및 0.2×SSC를 사용한 2회 세정을 포함한다. 당업자는 하이브리드화의 엄중도가 예를 들면 하이브리드화 용액의 염 함유량 및/또는 하이브리드화를 실시하는 온도를 변경시켜 용이하게 조작할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 또 다른 실시양태에서, 적절한 높은 엄중도의 하이브리드화 조건은 예를 들면 60℃ 내지 65℃ 또는 65℃ 내지 7O℃로 증가시킨 것을 제외한 상기 기재한 것을 포함한다.

한 실시양태에서, 이와 같은 폴리뉴클레오티드 변이체은 면역허용원 활성의 레벨이 본 명세서에 구체적으로 제시한 폴리펩티드 서열의 적어도 약 50% 이상, 바람직하게는 적어도 약 70% 및 더욱 바람직하게는 적어도 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그보다 높은 폴리펩티드를 인코딩한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편은 그의 코딩 서열의 길이와는 상관 없이 기타의 DNA 서열, 예컨대 프로모터, 폴리아데닐화 시그날, 추가의 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 기타의 코딩 분절 등과 조합될 수 있으며, 그리하여 그의 전체 길이는 상당하게 변경될 수 있다. 그러므로, 거의 임의의 길이를 갖는 핵산 단편을 사용할 수 있으며, 총 길이는 제조의 용이성 및 의도하는 재조합 DNA 프로토콜에서의 사용에 의하여 제한되는 것이 바람직한 것으로 판단된다. 예를 들어, 총 길이가 약 10,000, 약 5,000, 약 3,000, 약 2,000, 약 1,000, 약 500, 약 200, 약 100, 약 50개 등의 염기쌍인 예시의 폴리뉴클레오티드 분절(모든 중간 길이 포함)는 본 발명의 다수의 실시에 유용한 것으로 판단된다.

폴리뉴클레오티드 서열을 비교시, 2개의 서열에서의 뉴클레오티드의 서열이 하기에 기재한 바와 같은 최대 대응에 대하여 정렬시 동일한 경우를 "동일하다"라고 한다. 2개의 서열 사이의 비교는 통상적으로 비교 윈도우에 대한 서열을 비교하여 서열 유사성을 갖는 국소 영역을 확인 및 비교하여 실시한다. 본 명세서에서 사용한 바와 같이, "비교 윈도우"는 적어도 약 20개, 일반적으로 30 내지 약 75개, 40 내지 약 50개의 인접 위치를 갖는 분절을 지칭하며, 여기서 서열은 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후 동일한 수의 인접 위치를 갖는 참고 서열과 비교할 수 있다.

비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 생물정보학 소프트웨어의 Lasergene 스위트에서의 Megalign 프로그램(DNASTAR, 인코포레이티드, 미국 위스컨신주 매디슨 소재)을 사용하고, 디폴트 변수를 사용하여 실시할 수 있다. 이러한 프로그램은 하기와 같은 참고 문헌에 기재된 여러 가지의 정렬 방식을 구체화하였다: 문헌[Dayhoff, M.O., (1978) A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M. O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes, pp. 626-645 (1990); Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D. G. and Sharp, P.M., CABIOS 5:151-153 (1989); Myers, E.W. and Muller W., CABIOS 4:11-17 (1988); Robinson, E. D., Comb. Theor 77:105 (1971); Saitou, N. Nei, M., Mol . Biol . Evol. 4:406-425 (1987); Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., Numerical Taxonomy-the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA (1973); Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., Proc . Natl . Acad ., Sci . USA 80:726-730 (1983)].

대안으로, 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 문헌[Smith and Waterman, Add. APL . Math 2:482 (1981)]의 국소 확인 알고리즘에 의하여, 문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol . Biol. 48:443 (1970)]의 확인 정렬 알고리즘에 의하여, 문헌[Pearson and Lipman, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85: 2444 (1988)]의 유사성 방법에 대한 조사에 의하여, 이들 알고리즘의 컴퓨터를 사용한 실행[GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., 미국 위스컨신주 매디슨 소재]에 의하여 또는 검사에 의하여 실시할 수 있다.

퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하는데 적절한 알고리즘의 바람직한 예로는 문헌[Altschul et al., Nucl . Acids Res. 25:3389-3402 (1977)] 및 [Altschul et al., J. Mol . Biol. 215:403-410 (1990)] 각각에 기재되어 있는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 및 BLAST 2.0은 예를 들면 본 명세서에 기재된 변수를 사용하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 대한 퍼센트 서열 동일성을 측정하는데 사용할 수 있다. BLAST 분석을 실시하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생물 정보 센터를 통하여 공개적으로 입수 가능하다. 하나의 예시 예에서, 누적 점수는 뉴클레오티드 서열의 경우 변수 M(부합하는 잔기의 한쌍에 대한 보상 점수; 항상 >0) 및 N(부합되지 않는 잔기에 대한 벌점; 항상 <0)을 사용하여 계산할 수 있다. 이의 최대 달성 수치로부터 양 X에 의하여 누적 정렬 점수가 떨어질 경우 각각의 방향에서의 단어 맞춤의 확대를 중단하고; 누적 점수는 1종 이상의 음의 점수 잔여 정렬의 누적으로 인하여 0 또는 0 미만이 되거나; 또는 서열의 말단에 도달한다. BLAST 알고리즘 변수 W, T 및 X는 정렬의 민감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열의 경우)은 디폴트로서 11의 단어길이(W) 및 10의 기대치(E)를 사용하며, BLOSUM62 점수 행렬(문헌[Henikoff and Henikoff, Proc . Natl. Acad . Sci . USA 89:10915 (1989)] 참고) 정렬은 50의 (B), 10의 기대치(E), M=5, N=-4 및 두 가닥의 비교를 사용한다.

바람직하게는, "서열 동일성의 퍼센트"는 적어도 20개의 위치의 비교 윈도우에 대하여 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하여 결정하며, 여기서 비교 윈도우에서의 폴리펩티드 서열의 일부는 2개의 서열의 최적의 정렬에 대하여 참고 서열(첨가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 20 퍼센트 이하, 일반적으로 5 내지 15 퍼센트 또는 10 내지 12 퍼센트의 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 퍼센트는 동일한 핵산 염기가 2개의 서열에서 발생하여 부합되는 위치의 수를 산출하는 위치의 수를 결정하고, 부합된 위치의 수를 참고 서열에서의 위치의 총수(즉, 윈도우 크기)로 나누고, 그 값에 100을 곱하여 서열 동일성의 퍼센트를 얻어서 계산한다.

유전자 코드의 변성의 결과로서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 인코딩하는 다수의 뉴클레오티드 서열이 존재한다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 이들 폴리뉴클레오티드의 일부는 임의의 천연 유전자를 갖는 뉴클레오티드 서열에 대한 최소의 상동성을 갖는다. 그럼에도 불구하고, 코돈 사용에서의 차이로 인하여 변경되는 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 의하여 구체적으로 판단된다. 추가로, 본 명세서에서 제공된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 대립유전자는 본 발명의 범위에 포함된다. 대립유전자는 뉴클레오티드의 1종 이상의 변이, 예컨대 결실, 첨가 및/또는 치환의 결과로서 변경되는 내인성 유전자이다. 생성된 mRNA 및 단백질은 변경된 구조 또는 작용을 가질 수 있으나, 반드시 그럴 필요는 없다. 대립유전자는 표준 기법(예컨대 하이브리드화, 증폭 및/또는 데이타베이스 서열 비교)을 사용하여 확인할 수 있다.

그러므로, 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 돌연변이유발 접근법, 예컨대 부위-특이성 돌연변이유발은 본 명세서에 기재된 폴리펩티드의 면역허용원 변이체 및/또는 유도체의 제조에 사용된다. 이러한 접근법에 의하여, 폴리펩티드 서열에서의 특이적 변형은 이들을 인코딩하는 근본적인 폴리뉴클레오티드의 돌연변이유발을 통하여 실시될 수 있다. 이러한 기법은 예를 들면 1종 이상의 뉴클레오티드 서열 변경을 폴리뉴클레오티드에 투입하여 상기 사항중 1 이상을 투입하여 서열 변이체을 제조 및 테스트하는 간단한 접근법을 제공한다.

부위-특이성 돌연변이유발은 횡단시키고자 하는 결실 접합부의 양면에서 안정한 이중가닥을 형성하기 위하여 충분한 크기 및 서열 복잡성을 갖는 프라이머 서열을 제공하기 위하여 충분한 수의 이웃하는 뉴클레오티드뿐 아니라, 목적하는 변이의 DNA 서열을 인코딩하는 특이적 올리고뉴클레오티드 서열의 사용을 통하여 변이가 생성되도록 한다. 변이는 폴리뉴클레오티드 자체의 성질의 개선, 변경, 감소, 변형 또는 변화시키고 및/또는 인코딩된 폴리펩티드의 성질, 활성, 조성, 안정성 또는 1차 서열을 변경시키기 위하여 선택된 폴리뉴클레오티드 서열에 사용될 수 있다.

본 발명의 특정의 실시양태에서, 본 발명자들은 인코딩된 폴리펩티드의 1종 이상의 성질, 예컨대 폴리펩티드의 면역허용원성을 변경시키기 위하여 개시된 폴리뉴클레오티드 서열의 돌연변이유발을 판단하였다. 부위-특이성 돌연변이유발의 기법은 당업계에 공지되어 있으며, 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 모두의 변이체을 생성하기 위하여 널리 사용된다. 예를 들어, 부위-특이성 돌연변이유발은 종종 DNA 분자의 특이성 부분을 변경시키는데 사용된다. 이와 같은 실시양태에서, 통상적으로 길이가 약 14 내지 약 25개의 뉴클레오티드 정도를 포함하는 프라이머를 사용하며, 서열의 연결부의 양면에서 약 5 내지 약 10개의 잔기가 변경된다.

당업자가 이해하고 있는 바와 같이, 부위-특이성 돌연변이유발 기법은 종종 단일 가닥 및 이중 가닥 형태 모두에 존재하는 파지 벡터를 사용하였다. 부위-지정 돌연변이유발에 유용한 통상의 벡터는 벡터, 예컨대 M13 파지를 포함한다. 이들 파지는 통상적으로 입수 가능하며, 이의 사용은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 이중 가닥 벡터는 또한 통상적으로 중요 유전자를 플라스미드로부터 파지로 전달하는 단계를 배제시킨 부위 지향 돌연변이유발을 사용한다.

일반적으로, 본 발명에 따른 부위-지향 돌연변이유발은 우선 단일 가닥 벡터를 얻거나 또는 그의 서열내에서 목적하는 펩티드를 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 이중 가닥 벡터의 2개의 가닥으로부터 용융 분리되어 실시된다. 목적하는 변이된 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 일반적으로 합성으로 생성하였다. 이러한 프라이머는 단일 가닥 벡터로 어닐링 처리하고, DNA 중합 효소, 예컨대 이. 콜리(E. coli) 폴리머라제 I Klenow 단편로 처리하여 변이를 갖는 가닥의 합성을 완료하였다. 그래서, 하나의 가닥이 본래의 비-변이된 서열을 인코딩하고, 제2의 가닥이 목적하는 변이를 갖는 이질이중가닥이 형성되었다. 그 후, 이러한 이질이중가닥 벡터를 사용하여 적절한 세포, 예컨대 이. 콜리(E. coli) 세포를 전환시키며, 변이된 서열 정렬을 갖는 재조합 벡터를 포함하는 클론을 선택하였다.

부위-지향 돌연변이유발을 사용한 선택된 펩티드-인코딩 DNA 분절의 서열 변이체의 제조는 잠재적으로 유용한 종을 생성하는 수단을 제공하며, 이는 펩티드의 서열 변형 및 이를 인코딩하는 DNA 서열을 얻을 수 있는 다른 방법이 존재하므로 제한을 의미하는 것은 아니다. 예를 들어, 목적하는 펩티드 서열을 인코딩하는 재조합 벡터는 돌연변이원 제제, 예컨대 히드록실아민으로 처리하여 서열 변형을 얻을 수 있다. 이러한 방법 및 프로토콜에 관한 구체적인 세부사항은 문헌[Maloy et al., 1994; Segal, 1976; Prokop and Bajpai, 1991; Kuby, 1994; 및 Maniatis et al., 1982]의 개시 내용에서 찾아볼 수 있으며, 이들 각각의 개시 내용은 상기의 목적에 대하여 참고로 본 출원에 포함된다.

본 명세서에서 사용한 바와 같이, 용어 "올리고뉴클레오티드 지향 돌연변이유발 절차"는 초기 농도에 대한 특이성 핵산 분자의 농도의 증가 또는, 검출 가능한 시그날, 예컨대 증폭의 농도 증가를 초래하는 템플레이트 의존성 과정 및 벡터-매개 전파를 지칭한다. 본 명세서에서 사용한 바와 같이, 용어 "올리고뉴클레오티드 지향 돌연변이유발 절차"는 프라이머 분자의 템플레이트-의존성 확대를 포함하는 과정을 지칭한다. 용어 템플레이트 의존성 과정은 RNA 또는 DNA 분자의 핵산 합성을 지칭하며, 여기서 핵산의 새로이 합성된 가닥의 서열은 보충 염기 쌍의 공지된 규칙에 의하여 지시된다(예를 들면 Watson, 1987 참조). 통상적으로, 벡터 매개 방법론은 핵산 단편을 DNA 또는 RNA 벡터로 투입, 벡터의 클론 증폭 및 증폭된 핵산 단편의 회복을 포함한다. 이러한 방법론의 예는 미국 특허 제4,237,224호에 제공되어 있으며, 구체적으로 이의 개시 내용은 그 전문이 본 출원에 참고로 포함된다.

본 발명의 폴리펩티드 변이체의 생성을 위한 또 다른 접근법에서, 미국 특허 제5,837,458호에 기재된 바와 같은 반복된 서열 재조합을 사용할 수 있다. 이와 같은 접근법에서, 재조합 및 스크리닝 또는 선택의 반복된 사이클은 예를 들면 향상된 면역허용원 활성을 갖는 본 발명의 개개의 폴리뉴클레오티드 변이체를 "전개시키기" 위하여 실시한다.

본 발명의 기타의 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 융합 단백질 또는 그의 작용성 등가물을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 단편을 재조합 DNA 분자에 사용하여 적절한 숙주 세포중의 폴리펩티드의 발현을 지시할 수 있다. 유전자 코드의 고유 변성으로 인하여, 실질적으로 동일하거나 또는 작용적으로 등가인 아미노산 서열을 인코딩하는 기타의 DNA 서열이 생성될 수 있으며, 이들 서열을 사용하여 소정 폴리펩티드를 클로닝 및 발현시킬 수 있다.

당업자가 이해하고 있는 바와 같이, 특정한 경우에서는 비-천연 발생 코돈을 갖는 폴리펩티드-인코딩 뉴클레오티드 서열을 생성하는 것이 이로울 수 있다. 예를 들어, 특정한 원핵생물 또는 진핵생물 숙주에 의하여 선호되는 코돈은 단백질 발현 비율을 증가시키거나 또는 바람직한 성질을 갖는 재조합 RNA 전사, 예컨대 천연 발생 서열로부터 생성된 전사보다 더 긴 반감기를 생성하기 위하여 선택될 수 있다.

게다가, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 유전자 생성물의 클로닝, 처리 및/또는 발현을 변형시키는 변경을 비롯한(이에 한정되지 않음) 다양한 이유로 폴리펩티드 인코딩 서열을 변경시키기 위하여 당업계에서 일반적으로 공지된 방법을 사용하여 조작할 수 있다. 예를 들어, 유전자 단편 및 합성 올리고뉴클레오티드의 랜덤 단편화 및 PCR 재결합에 의한 DNA 셔플링은 뉴클레오티드 서열을 조작하는데 사용될 수 있다. 게다가, 부위-지시 돌연변이유발은 새로운 제한 부위를 삽입하고, 글리코실화 패턴을 변경시키고, 코돈 선호를 변경시키고, 스플라이스 변이체를 생성하거나 또는 변이를 투입하는 등에 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 천연, 변형 또는 재조합 핵산 서열은 이종 서열에 결찰시켜 융합 단백질을 인코딩시킬 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 활성의 억제제를 위한 펩티드 라이브러리를 스크리닝하기 위하여, 통상적으로 입수 가능한 항체에 의하여 인식될 수 있는 키메라 단백질을 인코딩시키는데 유용할 수 있다. 융합 단백질은 또한 폴리펩티드-인코딩 서열 및 이종 단백질 서열 사이에 위치하는 분열 부위를 포함하도록 조작될 수 있으며, 그리하여 폴리펩티드는 이종 부분으로부터 분할 및 정제될 수 있다.

소정의 폴리펩티드를 인코딩하는 서열은 전체적으로 또는 부분적으로 당업계에서 공지된 화학적 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 문헌[Caruthers, M. H. et al., (1980) Nucl . Acids Res. Symp . Ser. 215-223; Horn, T. et al., (1980) Nucl. Acids Res. Symp . Ser . 225-232]. 대안으로, 단백질 그 자체는 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 그 일부분을 합성하기 위하여 화학적 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 합성은 각종 고체-상 기법을 사용하여 실시될 수 있으며[Roberge, J. Y. et al., (1995) Science 269:202-204], 자동화된 합성은 예를 들면 ABI 431A 펩티드 합성기(미국 캘리포니아주 팔로 알토에 소재하는 퍼킨 엘머)를 사용하여 달성될 수 있다.

새로이 합성된 펩티드는 분취용 고 성능 액체 크로마토그래피[예, Creighton, T. (1983) Proteins, Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, N.Y.] 또는 당업계에서 입수 가능한 기타의 필적하는 기법에 의하여 실질적으로 정제될 수 있다. 합성 펩티드의 조성은 아미노산 분석 또는 스크리닝(예를 들면 Edman 분해 절차)에 의하여 확인할 수 있다. 추가로, 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 그의 임의의 일부분은 직접 합성중에 변경될 수 있거나 및/또는 화학적 방법을 사용하여 기타의 단백질 또는 그의 임의의 일부분으로부터의 서열과 조합되어 변이체 폴리펩티드를 생성할 수 있다.

목적하는 폴리펩티드를 발현시키기 위하여, 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 작용성 등가물은 적절한 발현 벡터, 즉 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역을 위한 필수 요인을 포함하는 벡터에 삽입시킬 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 방법은 중요 폴리펩티드를 인코딩하는 서열 및 적절한 전사 및 번역 조절 요소를 포함하는 발현 벡터를 구성하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법으로는 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 유전자 재조합을 들 수 있다. 이와 같은 기법은 예를 들면 문헌[Sambrook, J. et al., (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.] 및 [Ausubel et al., 2001-2008 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., NY, NY]에 기재되어 있다.

다양한 발현 벡터/숙주계는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함 및 발현시키는데 사용될 수 있다. 이의 예로는 미생물, 예컨대 재조합 박테리오파지, 플라스미드 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 전환된 박테리아; 효모 발현 벡터로 전환된 효모; 바이러스 발현 벡터(예, 바쿨로바이러스)로 감염된 곤충 세포계; 바이러스 발현 벡터(예, 코울리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV) 또는 박테리아성 발현 벡터(예, Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 전환된 식물 세포계; 또는 동물 세포계를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

발현 벡터에 존재하는 "조절 요소" 또는 "조절 서열"은 전사 및 번역을 실시하기 위하여 숙주 세포성 단백질과 상호작용하는 벡터-인핸서, 프로모터의 비-번역 영역, 5' 및 3' 비-번역 영역이다. 이러한 요인은 그의 강도 및 특이성이 변경될 수 있다. 사용한 벡터계 및 숙주에 따라서, 구성 및 유발성 프로모터를 비롯한 임의의 수의 적절한 전사 및 번역 요인을 사용할 수 있다. 예를 들어, 박테리아계에서의 클로닝시, 유발성 프로모터, 예컨대 pBLUESCRIPT 파지미드(미국 캘리포니아주 라 졸라에 소재하는 스트라타젠) 또는 pSPORTI 플라스미드(미국 매릴랜드주 게이터스버그에 소재하는 깁코 BRL)의 하이브리드 lacZ 프로모터 등을 사용할 수 있다. 포유동물 세포계에서, 포유동물 유전자 또는 포유동물 바이러스로부터의 프로모터가 일반적으로 바람직하다. 폴리펩티드를 인코딩하는 서열의 복수의 복제를 포함하는 세포주를 생성하는 것이 요구될 경우, SV40 또는 EBV에 기초한 벡터를 적절한 선택 가능한 마커와 함께 사용할 수 있는 것이 이롭다.

박테리아계에서, 임의의 다수의 발현 벡터는 발현된 폴리펩티드에 대하여 의도한 용도에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 항체 투여를 위하여 다량이 필요할 경우, 용이하게 정제되는 융합 단백질의 높은 레벨의 발현을 지시하는 벡터를 사용할 수 있다. 이러한 벡터의 예로는 다중작용성 이. 콜리(E·coli) 클로닝 및 발현 벡터, 예컨대 pBLUESCRIPT(스트라타젠)을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 여기서 중요한 폴리펩티드를 인코딩하는 서열은 하이브리드 단백질이 생성되도록 아미노-말단 Met 및 β-갈락토시다제의 차후의 7 잔기를 위한 서열을 갖는 프레임내의 벡터; pIN 벡터[Van Heeke, G. and S. M. Schuster (1989) J. Biol . Chem. 264:5503-5509] 등으로 연결될 수 있다. pGEX 벡터(미국 위스컨신주 매디슨에 소재하는 프로메가)는 또한 융합 단백질로서 이종 폴리펩티드를 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)로 발현시키는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 이와 같은 융합 단백질은 가용성이며, 글루타티온-아가로스 비이드로의 흡착에 이어서 유리 글루타티온의 존재하에서의 용출에 의하여 용해된 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다. 이러한 계에서 생성된 단백질은 중요 클로닝된 폴리펩티드가 GST 부분으로부터 마음대로 방출될 수 있도록 헤파린, 트롬빈 또는 인자 XA 프로테아제 분해 부위를 포함하도록 설계될 수 있다.

효모, 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)에서, 구성 또는 유발성 프로모터, 예컨대 알파 인자, 알콜 옥시다제 및 PGH를 포함하는 다수의 벡터를 사용할 수 있다. 검토를 위하여, 문헌[Ausubel et al., (상동) 및 Grant et al., (1987) Methods Enzymol. 153:516-544]을 참조한다.

식물 발현 벡터를 사용하는 경우에서, 폴리펩티드를 인코딩하는 서열의 발현은 임의의 다수의 프로모터에 의하여 구동될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 프로모터, 예컨대 CaMV의 35S 및 19S 프로모터는 단독으로 사용될 수 있거나 또는, TMV로부터 오메가 리더 서열과 함께 사용될 수 있다. 문헌[Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311]. 대안으로, 식물 프로모터, 예컨대 RUBISCO의 작은 서브유니트 또는 열 충격 프로모터를 사용할 수 있다. 문헌[Coruzzi, G. et al., (1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R. et al., (1984) Science 224:838-843; and Winter, J. et al., (1991) Results Probl . Cell Differ. 17:85-105]. 이러한 작제물은 직접 DNA 전환 또는 병원체-매개 전달감염에 의하여 식물 세포에 투입될 수 있다. 이러한 기법은 다수의 일반적으로 입수 가능한 보고에 기재되어 있다. 문헌[예를 들면 Hobbs, S. or Murry, L. E. in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York, N.Y.; pp. 191-196].

곤충계는 또한 중요 폴리펩티드를 발현시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 한 계에서, 아우토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 핵 다각면체 바이러스(AcNPV)를 스포돕테라 푸르기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포에서 또는 트리코플루시아 라르바에(Trichoplusia larvae)에서 외래 유전자를 발현시키는 벡터로서 사용된다. 폴리펩티드를 인코딩하는 서열은 바이러스, 예컨대 폴리히드린 유전자의 비-필수 영역으로 클로닝시키고, 폴리헤드린 프로모터의 조절하에 배치될 수 있다. 폴리펩티드-인코딩 서열의 성공적인 삽입은 폴리헤드린 유전자가 불활성이 되도록 하고, 외피 단백질이 결여된 재조합 바이러스를 생성한다. 그 후, 재조합 바이러스는 예를 들면 중요 폴리펩티드가 발현될 수 있는 에스. 푸르기페르다(S. frugiperda) 세포 또는 트리코플루시아 라르바에를 감염시키는데 사용될 수 있다. 문헌[Engelhard, E. K. et al., (1994) Proc . Natl . Acad . Sci. 91:3224-3227].

포유동물 숙주 세포에서, 다수의 바이러스계 발현계를 일반적으로 이용할 수 있다. 예를 들어 아데노바이러스를 발현 벡터로서 사용하는 경우 중요 폴리펩티드를 인코딩하는 서열은 후기 프로모터 및 3부 리더 서열로 이루어진 아데노바이러스 전사/번역 복합체에 연결될 수 있다. 바이러스 게놈의 비-필수 E1 또는 E3 영역에서의 삽입은 감염된 숙주 세포에서 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 생육성 바이러스를 얻는데 사용될 수 있다. 문헌[Logan, J. and Shenk, T. (1984) Proc . Natl . Acad. Sci . 81:3655-3659]. 게다가, 전사 인핸서, 예컨대 라우스 육종 바이러스(RSV) 인핸서는 포유동물 숙주 세포에서 발현을 증가시키는데 사용될 수 있다.

특정의 개시 시그날은 또한 중요한 폴리펩티드를 인코딩하는 서열의 더욱 효율적인 번역을 달성하는데 사용될 수 있다. 이러한 시그날은 ATG 개시 코돈 및 이웃하는 서열을 포함한다. 폴리펩티드를 인코딩하는 서열, 그의 개시 코돈 및 상류 서열이 적절한 발현 벡터에 삽입되는 경우, 추가의 전사 또는 번역 제어 시그날이 필요하지 않을 수 있다. 그러나, 코딩 서열 또는 그의 일부분만이 삽입되는 경우, ATG 개시 코돈을 포함하는 외인성 번역 제어 시그날이 제공되어야만 한다. 게다가, 개시 코돈은 정확한 리딩 프레임에서 전체 삽입물의 번역을 확실히 하여야만 한다. 외인성 번역 요소 및 개시 코돈은 천연 및 합성 모두의 다양한 기원을 가질 수 있다. 발현의 효율은 사용되는 특정 세포계에 적절한 인핸서, 예컨대 문헌[Scharf, D. et al., (1994) Results Probl . Cell Differ. 20:125-162]에 기재되어 있는 것의 포함에 의하여 향상될 수 있다.

또한, 숙주 세포 균주는 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 또는 발현된 단백질을 목적하는 방식으로 처리하는 능력에 대하여 선택될 수 있다. 이러한 폴리펩티드의 변형의 예로는 아세틸화, 카르복실화, 글리코실화, 인산화, 지질화 및 아실화를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 단백질의 "프레프로" 형태를 분할하는 후-번역 처리는 또한 정확한 삽입, 폴딩 및/또는 작용을 촉진하는데 사용될 수 있다. 이와 같은 후-번역 활성에 대하여 특이적인 세포성 기계 및 특징적 기전을 갖는 다양한 숙주 세포, 예컨대 CHO, COS, HeLa, MDCK, HEK293 및 WI38은 이종 단백질의 정확한 변형 및 처리를 확실히 하기 위하여 선택될 수 있다.

재조합 단백질의 장시간의 고 수율의 제조를 위하여, 안정한 발현이 일반적으로 바람직하다. 예를 들어, 중요한 폴리뉴클레오티드를 안정하게 발현시키는 세포주는 동일한 또는 별개의 벡터상에서 선택 가능한 마커 유전자 및 내인성 발현 요소 및/또는 복제의 바이러스 기원을 포함할 수 있는 발현 벡터를 사용하여 전환될 수 있다. 벡터의 투입에 이어서, 세포를 1 내지 2일 동안 풍부한 배지중에서 성장되도록 한 후, 선택적 배지로 교체한다. 선택 가능한 마커의 목적은 선택에 대한 내성을 부여하기 위한 것이며, 그의 존재는 투입된 서열을 성공적으로 발현시키는 세포의 성장 및 회복을 가능케 한다. 안정하게 전환된 세포의 내성 클론은 세포 유형에 적절한 조직 배양 기법을 사용하여 증식될 수 있다.

임의의 수의 선택계는 전환된 세포주를 회복시키는데 사용될 수 있다. 이의 예로는 tk^- 또는 aprt^- 세포 각각에 사용될 수 있는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제[Wigler, M. et al., (1977) Cell 77:223-32] 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제[Lowy, I. et al., (1990) Cell 22:817-23] 유전자를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 항대사물질, 항생제 또는 제초제 내성은 선택을 위한 기준으로서 예를 들면 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr[Wigler, M. et al., (1980) Proc . Natl . Acad . Sci. 77:3567-70]; 아미노글리코시드, 네오마이신 및 G-418에 대한 내성을 부여하는 npt[Colbere-Garapin, F. et al., (1981) J. Mol. Biol . 750:1-14]; 및 클로르설푸론 및 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 각각에 대한 내성을 부여하는 als 또는 pat(Murry, 상동)를 사용할 수 있다. 추가의 선택 가능한 유전자, 예를 들면 세포가 트립토판 대신에 인돌을 사용하도록 하는 trpB 또는, 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀을 사용하도록 하는 hisD가 기재되어 있다. 문헌[Hartman, S. C. and R. C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51]. 가시 마커의 사용은 형질전환주를 확인할 뿐 아니라, 특이성 벡터계에 기인할 수 있는 일과성 또는 안정한 단백질 발현의 양을 정량화하는데 널리 사용되는, 안토시아닌, 베타-글루쿠로니다제 및 이의 기질 GUS 및 루시페라제 및 그의 기질 루시페린과 같은 마커를 사용하여 인기를 얻었다. 문헌[Rhodes, C. A. et al., (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131]

마커 유전자 발현의 존재/부재가, 중요한 유전자가 또한 존재한다는 것을 시사할지라도, 그의 존재 및 발현은 확인되어야만 할 것이다. 예를 들어, 폴리펩티드를 인코딩하는 서열이 마커 유전자 서열내에서 삽입되면, 서열을 포함하는 재조합 세포는 마커 유전자 작용의 부재에 의하여 확인될 수 있다. 대안으로, 마커 유전자는 단일 프로모터의 조절하에 폴리펩티드-인코딩 서열과 함께 일렬 배치될 수 있다. 유발 또는 선택에 반응하는 마커 유전자의 발현은 일반적으로 마찬가지로 탠덤 유전자의 발현을 나타낸다.

대안으로, 소정의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함 및 발현시키는 숙주 세포는 당업자에게 공지된 다양한 절차에 의하여 확인될 수 있다. 이러한 절차는 예를 들면 핵산 또는 단백질의 검출 및/또는 정량화를 위한 막, 용액 또는 칩에 기초한 기술을 포함하는, DNA-DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드화 및 단백질 생물학적분석 또는 면역분석 기법을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

생성물에 대하여 특이적인 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 사용하는, 폴리뉴클레오티드-인코딩된 생성물의 발현을 검출 및 측정하기 위한 각종 프로토콜 은 당업계에 공지되어 있다. 이의 예로는 효소 면역 측정법(ELISA), 방사 면역 측정법(RIA) 및 형광 활성화된 세포 분류(FACS)를 들 수 있다. 소정 폴리펩티드상에서 2개의 비-간섭 에피토프에 반응성인 모노클로날 항체를 사용하는 2-부위 모노클로날계 면역분석은 일부 적용예에 대하여 바람직할 수 있으나, 경쟁적 결합 분석도 또한 사용될 수 있다. 이와 같은 분석 및 기타의 분석은 특히 문헌[Hampton, R. et al., 1990, Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul. Minn.] 및 [Maddox, D. E. et al., 1983, J. Exp . Med . 758:1211-1216]에 기재되어 있다.

다양한 표지 및 접합 기법은 당업자에게 공지되어 있으며, 다양한 핵산 및 아미노산 분석에 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드와 관련된 서열을 검출하기 위한 표지된 하이브리드화 또는 PCR 프로브를 생성하기 위한 수단은 표지된 뉴클레오티드를 사용한 올리고라벨링, 새김눈(nick) 번역, 말단-라벨링 또는 PCR 증폭을 포함한다. 대안으로, 서열 또는 그의 임의의 부분은 mRNA 프로브의 생성을 위하여 벡터로 클로닝될 수 있다. 이와 같은 벡터는 당업게에 공지되어 있으며, 시판중이며, 적절한 RNA 폴리머라제, 예컨대 T7, T3 또는 SP6 및 표지된 뉴클레오티드의 첨가에 의한 RNA 프로브를 시험관내 합성하는데 사용될 수 있다. 이러한 절차는 다양한 시판중인 키트를 사용하여 실시될 수 있다. 사용할 수 있는 적절한 리포터 분자 또는 표지는 방사성핵종, 효소, 형광, 화학적발광 또는 크로모제닉제뿐 아니라, 기질, 보조인자, 억제제, 자기 입자 등을 포함한다.

중요한 폴리뉴클레오티드 서열로 전환된 숙주 세포는 세포 배양으로부터 단백질의 발현 및 회수에 적절한 조건하에서 배양될 수 있다. 재조합 세포에 의하여 생성된 단백질은 사용한 서열 및/또는 벡터에 의존하여 세포내 분비 또는 포함될 수 있다. 당업자가 이해하고 있는 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터는 원핵생물 또는 진핵생물 세포막을 통하여 인코딩된 폴리펩티드의 분비를 지시하는 시그날 서열을 포함하도록 설계될 수 있다. 기타의 재조합 구성은 중요한 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을, 가용성 단백질의 정제를 촉진하는 폴리펩티드 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 연결시키는데 사용될 수 있다. 이와 같은 정제 촉진 도메인으로는 금속 킬레이팅 펩티드, 예컨대 고정 금속상의 정제를 가능케 하는 히스티딘-트립토판 모듈, 고정 면역글로불린상에서 정제를 가능케 하는 단백질 A 도메인 및 FLAGS 신장/친화도 정제계(미국 워싱턴주 시애틀에 소재하는 이뮤넥스 코포레이션)에 사용되는 도메인을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 분할성 링커 서열의 포함, 예컨대 정제 도메인 및 인코딩된 폴리펩티드 사이의 인자 XA 또는 엔테로키나제(미국 캘리포니아주 샌 디에고에 소재하는 인비트로겐)에 대하여 특이성인 것은 정제를 촉진하는데 사용될 수 있다. 이와 같은 하나의 발현 벡터는 티오레독신 또는 엔테로키나제 분할 부위에 선행하는 6 히스티딘 잔기를 인코딩하는 핵산 및 중요한 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질의 발현을 제공한다. 히스티딘 잔기는 문헌[Porath, J. et al., 1992, Prot . Exp . Purif. 3:263-281]에 기재된 바와 같이 IMIAC(고정 금속 이온 친화도 크로마토그래피)상에서 정제를 촉진하는 반면, 엔테로키나제 분할 부위는 융합 단백질로부터 목적하는 폴리펩티드를 정제하는 수단을 제공한다. 융합 단백질을 포함하는 벡터에 대한 논의는 문헌[Kroll, D. J. et al., 1993, DNA Cell Biol. 72:441-453]에 제공된다.

재조합 생성 방법 이외에, 본 발명의 폴리펩티드 및 그의 단편은 고체-상 기법을 사용한 직접 펩티드 합성에 의하여 생성될 수 있다. 문헌[Merrifield J., 1963, J. Am. Chem . Soc. 85:2149-2154]. 단백질 합성은 수동 기법을 사용하거나 또는 자동화에 의하여 실시될 수 있다. 자동화된 합성은 예를 들면 바이오시스템즈 431A 펩티드 합성기(퍼킨 엘머)를 사용하여 달성될 수 있다. 대안으로, 각종 단편은 화학적 방법을 사용하여 별도로 화학적으로 합성 및 조합하여 전장 분자를 생성할 수 있다.

내성

면역학적 내성은 항원, 일반적으로 질환을 야기하는 것에 관련되어 있는 항원에 대한 면역 무반응으로 정의된다. 내성이 다양한 경로에 의하여 항원을 투여하여 유발될 수 있기는 하나, 경구 내성은 항원의 경구 투여를 지칭하며, 중증 근무력증, 포도막염, 인슐린 의존성 당뇨병 및 콜라겐-유도된 관절염, 다발성 경화증의 설치류 모델-실험 자가면역 뇌척수염을 비롯한 여러 동물 모델에서의 질환 활성의 억제를 초래하는 항원의 경구 투여를 지칭한다(Faria and Weiner 1999). 사람의 임상 실험으로부터의 조기 결과는 경구 내성이 자가면역 포도막염, 당뇨병, 니켈 알러지 및 가능하게는 다발성 경화증에 효과적이라는 것을 시사한다. 문헌[Faria and Weiner 1999; Duda et al., 2000]. 장기 이식에서 경구 내성 유발을 보고하는 몇몇의 보고가 있다[Sayegh et al., 1996; Hancock et al., 1993; Ishido et al., 1999; Sayegh et al., 1992a; Sayegh et al., 1992b]. 각각의 보고에서, 내성은 공여체 MHC-유도된 펩티드를 공급하거나 또는 이식 이전에 동종이형 세포를 공급하여 유발된다. 문헌[Sayegh et al., 1996; Hancock et al., 1993; Ishido et al., 1999; Sayegh et al., 1992a; Sayegh et al., 1992b]. 이러한 기법은 심장 및 각막 동종이식의 거부를 방지하는데 효과적이다. 문헌[Sayegh et al., 1996; Hancock et al., 1993; lshido et al., 1999; Sayegh et al., 1992a; Sayegh et al., 1992b; Faria and Weiner 1999]. 감소된 질환 활성 이외에, 이들 연구에서의 경구 내성에 의하여 유발되는 면역 억제는 또한 감소된 세포성 및 체액 면역뿐 아니라, 표적 항원에 대한 지연된 유형의 과민성(DTH) 반응의 하향 조절에 의하여 정량화된다. 문헌[Faria and Weiner 1999; Mayer 2000; Garside 및 Mowat 1997].

경구(및 기타의 투여 경로) 내성은 1. 항원 특이성 세포의 활성 억제, 2. 항원 특이성 세포의 클로날 무반응 및 3. 항원 특이성 세포의 클로날 결손인 항원-특이성 면역 반응을 하향 조절하는 3가지의 기전이 있다. 문헌[Faria and Weiner 1999, Miller et al., 1991; Chen et al., 1994; Chen et al., 1995]. 이러한 3가지 기전 모두가 경구 내성에 대한 반응에서 동시에 유효할 수 있기는 하나, 활성 억제 및 클로날 무반응은 경구 내성에 의하여 유발되는 면역 억제의 핵심 기전이다. 문헌[Faria and Weiner 1999].

활성 억제는 항원-특이성 방식에서 다른 것에 의한 하나의 림프구 서브세트의 조절을 설명한다. 항원 및 질환 상태에 따라서, 억제인자 세포는 말초 림프구 조직, 예컨대 비장 및 말초 림프절로부터 질환 활성의 부위로 이동하는 CD4+ 및/또는 CD8+ T-림프구가 될 수 있다. 세포의 치료받은 적이 없는 수용체로의 입양 전달은 난알부민-유도된 과민성 및 다발성 경화증의 설치류 모델에서 활성 억제에서의 세포의 역할을 확인하였다. 활성 억제의 시험관내 증거는 동물로부터의 내성유발된 림프구가 트랜스웰 세포 배양계를 통한 다른 항원-특이성 T-림프구의 증식을 억제한다는 것을 입증하였다. 문헌[Faria and Weiner 1999; Miller et al., 1991].

클로날 무반응은 항원에 대한 노출후 감소된 증식을 특징으로 하며, 여러 동물 모델에서 경구 내성에 관여하는 항원-특이성 T-림프구의 무반응성을 지칭한다. 무반응은 국소 환경내에서 CD4+ 또는 CD8+ T-림프구 그 자체, 기타의 T-림프구 또는 세포에 의한 가용성 억제 인자의 생성의 결과이거나 또는 적절한 동시자극 분자의 감소된 발현의 결과일 수 있다. 문헌[Faria and Weiner 1999]. 클로날 결손은 항원-특이성 T-림프구의 제거를 지칭하나, 항원에 대한 경구 내성의 기전으로서는 거의 보고되지 않았다. 문헌[Chen et al., 1995].

경구 내성중에 면역 반응을 억제하는 가용성 매개체는 주로 조절 또는 억제인자 T-림프구로부터 유도된다. 문헌[Faria and Weiner 1999]. 이들이 생성되는 시토킨에 의하여 기재된 T-림프구 5종의 유형은 하기와 같다: 인터류킨-2(IL-2) 및 감마 인터페론(γIFN)을 생성하는 Th1-타입; IL-4 및 IL-10을 생성하는 Th2-타입; 높은 레벨 또는 전환 성장 인자 베타(TGF-β)를 단독 또는 매우 낮은 레벨의 IL-4, IL-10 또는 γIFN과 함께 생성하는 Th3-타입; 낮은 레벨의 TGF-β와 함께 높은 레벨의 IL-10을 생성하는 Tr1 세포[Faria and Weiner et al., 1999; Mayer 2000; Garside and Mowat 1997; Groux et al., 1997]; 및 IL-17을 생성하는 Th17 세포[예를 들면 Immunol Rev. 2008, 226:87-102; Nature. 2006 May 11; 441 (7090): 235-8 참조]. Th3, Th2 및 Tr1-T-림프구는 경구 내성에 의하여 유발되는 활성 억제의 주요한 매개체인 것으로 밝혀졌으므로, TGF-β, IL-4 및 IL-10은 이러한 과정에서 핵심 시토킨인 것으로 밝혀졌다. 문헌[Teng et al., 1998; Shi et al., 1999b]. 경구 내성 유발이 이들 시토킨의 부재하에 발생한다는 것을 나타내는 Barone et al., 외다수의 문헌으로부터의 보고는 기타의 매개체 또는 세포가 면역 반응을 억제할 수 있다는 것을 시사한다. 문헌[Barone et al., 1998; Shi et al., 1999a].

경구 내성의 연구가 면역 반응을 억제하는 T-림프구-유도된 시토킨에 촛점이 맞춰져 있기는 하나, T-림프구에 의하여서는 생성되지 않는 산화질소는 동종면역 반응의 잠재적 억제인자인 것으로 알려져 있다. 문헌[Garside and Mowat 1997]. 산화질소가 거부 반응에 관여하는 아포프토시스를 조절하는 것을 나타내는 이러한 데이타 등[Meyer et al., 1998; Kallio et al., 1997; Shiraishi et al., 1997; Shiraishi et al., 1995; Medot-Pirenne et al., 1999]은 산화질소가 경구 내성의 매개체가 될 수 있으며, 거부 반응을 방지할 수 있다는 것을 시사한다. TGF-β는 산화질소 합성의 잠재적인 유도인자이며, 경구 내성에서 활성 억제의 핵심 매개체이다. 문헌[Faria and Weiner 1999; Meyer et al., 1998; Vodovotz et al., 1998; Vodovitz et al., 1999]. 그러므로, 내성유발된 숙주에서의 TGF-β에 의하여 유발되는 면역억제는 부분적으로는 산화질소에 의하여 매개될 수 있다. 그러나, 경구 내성에 대한 반응에서 산화질소의 생성은 알려져 있지 않다.

APC에 의하여 유발된 항원-특이성 T-림프구 활성화는 T-림프구 및 APC 사이에서 쌍방향 상호작용을 필요로 한다. 초기에는, APC는 T-림프구상에서 CD40-리간드(CD40L)의 상향조절된 발현을 자극하는 T-세포-수용체에 결합되는 MHC 분자를 제시한다. CD40L은 다시 APC상에서 그의 수용체 CD40에 결합된다. CD40을 통한 시그날링은 APC상에서 CD80 및 CD86의 발현을 유발하며, T-림프구상에서 이의 수용체 CD28에 결합시 동시자극 및 차후의 T-림프구 활성화를 초래한다. 문헌[Liu et al., 1999; Li et al., 1999; Lederman and Siciu-Foca 1999]. 경구 내성 유발의 연구가 T-림프구 작용에 촛점이 맞춰지긴 하였으나, 문헌[Taams et al., (1998)]으로부터의 최근의 연구는 내성 유발이 다른 연구자들로부터의 유사한 데이타로 APC의 작용에 영향을 미칠 수 있다고 보고하였다. 문헌[Wu et al., 1998; Finkelman et al., 1996; Viney et al., 1998]. 예를 들어, 경구 내성유발된 마우스의 림프절 및 비장으로부터의 APC상에서 CD80의 발현이 감소되는 것을 나타낸 문헌[Wu. et al., (1998)]으로부터의 보고는 무효한 APC가 내성유발된 수용체에서 손상된 T-림프구 활성화에 기여할 수 있다는 것을 시사한다. 게다가, 억제인자 T-림프구가 APC에서 CD86의 발현을 억제시킨다는 것을 나타내는 시험관내 연구는 내성이 손상된 APC 작용을 유발하는 방법의 또 다른 기전을 강조한다. 문헌[Liu et al., 1999; Li et al., 1999; Lederman and Siciu-Foca 1999].

col(V)의 투여는 그 자신에 대한 증식성 반응을 방지하는 것 이외에, 동종항원에 대한 증식성 반응을 방지하며, 수용체 폐에서의 급성 거부 병리학의 발생을 방지한다. (예를 들면 미국 특허 제7,348,005호; WO2007/120947 참조). 그래서, col(V)은 공여체 동종항원 및 그 자신에 대한 무반응을 유발할 수 있거나; 또는 대안으로 공여체 항원 및 colV에 대한 증식성 반응의 결여는 동종항원-특이성 폐 림프구의 클로날 결손으로 인할 수 있거나; 또는 대안으로 억제인자 세포 활성으로부터 야기될 수 있다.

특정 이론으로 한정하고자 하는 것은 아니나, colV에 의한 내성 유발은 결합된 억제를 통하여 유발될 수 있다. 예를 들면 문헌[Hum Immunol. 2008 Nov; 69(11):715-20]을 참고한다. 또한, 림프구상에서의 콜라겐 수용체로의 colV의 분별 결합으로 분별 활성화 시그날을 초래하는 것이 관련되어 있다고 판단된다. 예를 들면 문헌[Cell Signal. 2006 Aug; 18(8):1108-16]. 예를 들어, 콜라겐 V만이 T 세포에서 IL-17 시그날링을 유발한다.

항원의 경구 투여는 말초 T-세포 내성을 유발하는 효과적인 방법이다. 이러한 현상은 종종 경구 내성으로 지칭되는데, 뇌척수염, 포도막염, 당뇨병, 중증 근무력증 및 관절염을 비롯한 동물에서의 자가면역 질환의 다양한 모델에서 연구되어 왔다. 그러나, 내성을 유발하는 기전은 아직 완전하게 규명되지는 않았다. IL-4, IL-10 또는 TGF-베타-매개 활성 억제에 의한 클로날 무반응, 클로날 결손 및 조절을 비롯한 내성 유발에 대한 공지된 기전 모두는 경구 내성에서 역할을 할 수 있다[Faria and Weiner, 1999]. 일반적으로, 더 높은 투약량의 항원은 무반응 또는 클로날 결손을 유발하는 것으로 보고되어 있는 반면[Chen et al., 1995; Whitacre et al., 1991], 낮은 투약량은 시토킨 조절 및 활성 억제를 유발한다. 문헌[Faria and Weiner, 1999; Chen et al., 1994]. 심장 이식의 동물 모델에서, 동종이형 비장세포의 경구 투여는 Th1 활성화를 우회하고, Th-2 유래한 억제 시토킨, 예컨대 IL-4의 유발을 선택적으로 자극하여 내성 유발에서 효과적인 것으로 나타났다. 문헌[Hancock et al., 1993; Ishido et al., 1999].

그래서, 경구 내성은 개체에게 항원을 경구 투여(즉, 공급)하여 개체에서의 면역 반응을 하향조절하는 방법이다. 경구 내성은 감소된 레벨의 전신 항체 생성뿐 아니라, 지연된 유형의 과민성 반응(DTH), T 세포 증식, 세포독성 반응 및 이식편 거부를 특징으로 한다. 문헌[Alpan et al., 2001. J. Immunol . 166:4843-52; Chen et al., 1995. Nature 376:177-80; Weiner. 1997. Imm . Today. 7:335-44; Sayegh et al., 1992. Transplantation. 53:163-6].

내성을 유발하는 기타의 경로는 또한 본 명세서에서 특히 근육내, 피하, 피내 및 정맥내 주사로 고려된다. 낮은 투약량이 내성을 유발하는 경향이 있으며, 높은 투약량이 면역 반응을 유발하는 경향이 있는 피내 주사가 고려된다.

내성 연구는 주로 T-림프구 작용에 대한 내성유발되는 항원의 효과 및, 면역 활성화를 억제하는데 있어서 T-림프구의 역할에 촛점이 맞춰져 있다. 문헌[Faria and Weiner 1999; Mayer 2000; Garside and Mowat 1997]. 그러나, 임의의 항원에 대한 면역 반응은 APC 및 T-림프구 사이의 상호작용을 필요로 하며, T-림프구는 APC 작용에 영향을 미칠 수 있다. 문헌[Liu et al., 1999; Li et al., 1999; Lederman and Siciu-Foca 1999]. 그러므로, 항원유발된 숙주로부터 APC에 의한 하향조절된 항원 제시는 억제인자 T-림프구와의 상호작용의 결과로서 간접적으로 또는, 가능하게는 APC에 대한 내성유발된 항원의 직접적인 영향의 결과로서 내성 유발에 기여할 수 있다.

그래서, 본 발명의 특정의 측면에서, 본 발명은 COPD 및 천식 환자에서 colV에 대한 자가-내성을 저장 또는 보강하는 방법을 제공한다. 한 실시태양은 폐에 근접하게 경구 요법[Yasufuku et al, 2001; Yasufuku, et al, 2002]에 의하여 또는 colV 및 항원성 성분 및 그의 변이체를 비롯한(이에 한정되지 않음) 콜라겐에 대한 환자 내성을 증가시키도록 설계된 투약 요법에 대한 기타의 탈민감화 전략에 의하여 colV를 투여하여 COPD 또는 천식을 치료하는 방법이다.

"관용원성 단편"이라는 것은 단편(예를 들면 전장 V형 콜라겐 및 그의 관용원성 단편)인 전장 단백질에 대한 내성을 유발할 수 있는 단편을 의미한다. 특정 실시양태에서, 관용원성 단편은 적어도 전장 V형 콜라겐에 대한 내성을 유발할 수 있을 뿐 아니라, 전장 V형 콜라겐 단백질은 내성 유발에서 전장 콜라겐 단백질보다 더욱 효과적인 것이 가능할 수 있거나 특정의 경우에는 더욱 효과적일 수 있다. 그러나, 특정 실시양태에서, 관용원성 단편은 전장 V형 콜라겐에 대한 내성을 유발하나, 전장 V형 콜라겐 단백질과 같이 효과적으로 내성을 유발할 수는 없다. 이와 같은 관용원성 단편은 본 발명에서 특히 상기 관용원성 단편이 기타의 이로운 성질, 예컨대 전장 당백질에 비하여 제조 및 정제의 용이성을 갖는 것이 유용할 수 있다. 당업자가 인지하고 있는 바와 같이, 각종 공지의 분석은 지연된 유형의 과민성(DTH) 반응의 측정, ELISA 또는 기타의 방법에 의한 시토킨 생성의 측정, T 세포 증식 또는 세포독성 분석, B 세포 증식 분석, 항체 생성 등을 비롯한 내성의 유발을 평가하는데 사용될 수 있다. 이와 같은 분석은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 문헌[Current Protocols in Immunology, Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober (2001 John Wiley & Sons, NY, NY); Ausubel et al., (2001 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., NY, NY]; 미국 특허 제7,348,005호 등에 기재되어 있다.

그래서, 관용원성 단편은 면역허용원 폴리펩티드, 예컨대 V형 콜라겐의 단편 또는 그의 알파 쇄 임의의 1종 이상이며, 그 자체는 그의 표면 수용체(예, B 세포 항체 수용체 또는 T 세포 수용체)를 경유하여 폴리펩티드를 인식하는 특이성 B-세포 및/또는 T-세포에 대한 면역학적 면역허용원이 된다(즉 내성을 유발함). 관용원성 단편은 일반적으로 공지의 기법, 예컨대 문헌[Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., (Raven Press, 1993)] 및 이에 인용된 참조 문헌에 요약되어 있는 것을 사용하여 확인될 수 있다. 이러한 기법은 T 세포 및/또는 B 세포 반응성을 감소시키는 능력에 대하여 폴리펩티드를 스크리닝하는 것을 포함한다. 본 명세서에서 사용한 바와 같이, 항혈청 및 항체는 이들이 항원에 특이적으로 결합하는 경우 "항원-특이성"이 된다(즉, 이들은 ELISA 또는 기타의 면역분석에서 단백질과 특이적으로 반응하며, 관련되지 않은 단백질과는 검출 가능하게 반응하지 않는다). 이러한 항혈청 및 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같이 그리고 공지된 기법을 사용하여 생성될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드의 관용원성 단편은 전장 폴리펩티드의 면역허용원 활성보다 실질적으로 더 낮지 않은 레벨에서 B 세포 및/또는 T 세포 내성을 유발하는 부분이다(예를 들면, 적절한 분석, 예컨대 ELISA에 의하여 측정될 수 있는 항체 생성 및/또는 T 세포 반응성 분석(T 세포 증식 또는 시토킨 생성 분석)에서). 바람직하게는, 면역허용원 부분의 면역허용원 활성의 레벨은 전장 폴리펩티드의 면역허용원 활성의 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%이거나 또는 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%보다 크다. 특정한 경우에서, 관용원성 단편은 해당 전장 폴리펩티드보다 더 높은 면역허용원 활성의 레벨을 갖는, 예를 들면 약 100%, 110%, 120%, 130%, 140% 또는 150% 또는 그보다 높은 면역허용원 활성을 갖는 것으로 확인되었다.

특정 실시양태에서, 관용원성 단편은 Th 반응을 규명하는 잠재성을 갖는 펩티드 모티브에 대하여 조사하는 컴퓨터 분석, 예컨대 Tsites 프로그램(문헌[Rothbard and Taylor, EMBO J. 7:93-100, 1988; Deavin et al., Mol . Immunol . 33:145-155, 1996]을 참조함)을 사용하여 확인할 수 있다. 설치류 및 사람 유형 I 또는 유형 II MHC에 대한 결합에 적절한 모티브를 갖는 CTL 펩티드는 BIMAS(Parker et al., J. Immunol. 152:163, 1994) 및 기타의 HLA 펩티드 결합 예측 분석에 의하여 확인할 수 있다. 대안으로, 특정의 MHC 분자에 결합하는 부분은 규정된 펩티드 결합 모티브, 예컨대 문헌[Rammensee et al., Immunogenetics 41 :178-228, 1995]에 기재된 것을 사용하여 확인할 수 있다. 설치류 및 사람 유형 I 또는 유형 II MHC 분자에 대한 펩티드 결합을 확인하기 위하여, 당업계에 공지된 펩티드 결합 분석을 사용할 수 있다. 면역원성 또는 면역허용원성을 확인하기 위하여, HLA A2 또는 기타의 유전자이전 마우스 모델 및/또는 수지상 세포, 섬유모세포 또는 말초 혈액 세포를 사용한 시험관내 자극 분석을 사용하여 펩티드를 테스트할 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 관용원성 단편은 또한 관용원성 단편이 될 수 있다는 것에 유의하여야 한다. 이와 관련하여, 당업자가 인식하고 있는 바와 같이, 고 관용원성 단편, 예컨대 단백질 유사 colV의 면역우세 항원결정인자는 정확하게 투여시, 예를 들면 일반적으로 연장된 기간에 걸쳐 낮은 투약량으로 투여시 면역허용원이 될 수 있다. 그래서, 본 발명은 또한 관용원성 단편이 내성을 유발하는데 사용될 수 있는 colV의 관용원성 단편의 확인 및 사용에 관한 것이다. 이와 관련하여, 면역원성 부분의 면역원성 활성의 레벨은 전장 폴리펩티드의 면역원성 활성의 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는, 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%보다 클 수 있다. 특정한 경우에서, 관용원성 단편은 해당 전장 폴리펩티드보다 더 큰 면역원성 활성의 레벨을 갖는, 예를 들면 약 100%, 110%, 120%, 130%, 140% 또는 150% 또는 그보다 더 높은 면역원성 활성을 갖는 것으로 확인된다.

동일한 분석을 사용하여 Th 반응을 규명하는 잠재성을 갖는 펩티드 모티브에 대하여 조사하는 컴퓨터 분석, 예컨대 Tsites 프로그램(문헌[Rothbard and Taylor, EMBO J. 7:93-100, 1988; Deavin et al., Mol . Immunol . 33:145-155, 1996]을 참조함)을 사용하는 것을 비롯한 관용원성 단편을 확인하는데 사용되는 관용원성 단편을 확인한다. 설치류 및 사람 유형 I 또는 유형 II MHC에 대한 결합에 적절한 모티브를 갖는 CTL 펩티드는 BIMAS(Parker et al., J. Immunol. 152:163, 1994) 및 기타의 HLA 펩티드 결합 예측 분석에 의하여 확인할 수 있다. 대안으로, 특정의 MHC 분자에 결합하는 부분은 규정된 펩티드 결합 모티브, 예컨대 문헌[Rammensee et al., Immunogenetics 41:178-228, 1995]에 기재된 것을 사용하여 확인할 수 있다. 설치류 및 사람 유형 I 또는 유형 II MHC 분자에 대한 펩티드 결합을 확인하기 위하여, 당업계에 공지된 펩티드 결합 분석을 사용할 수 있다. 면역원성 또는 면역허용원성을 확인하기 위하여, 수지상 세포, 섬유모세포 또는 말초 혈액 세포를 사용하여 HLA A2 또는 기타의 유전자이전 마우스 모델 및/또는 시험관내 자극 분석을 사용하여 펩티드를 테스트할 수 있다.

면역허용원 또는 면역원성 활성을 갖는 무손해 V형 콜라겐 또는 그의 성분 알파 쇄의 임의의 1종 이상은 본 발명의 방법에서 사용하는 것이 고려된다. 그리하여, 콜라겐 V의 관용원성 단편 또는 관용원성 단편은 무손해 V형 콜라겐의 단편을 지칭할 수 있거나 또는 성분 알파 사슬중 임의의 하나의 면역허용원 또는 관용원성 단편을 지칭할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 명세서에서 사용한 바와 같은 colV는 알파 사슬로 이루어진 콜라겐 분자를 포함할 수 있다. 추가의 실시양태에서, colV는 알파 사슬, 예컨대 서열 번호 1, 3 또는 5에서 설명한 폴리뉴클레오티드에 의하여 인코딩된 서열 번호 2, 4 또는 6에서 설명된 것 또는 관용원성 단편 또는 그의 면역원성 단편 중 임의의 1종 이상을 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 2종 이상의 면역허용원 또는 관용원성 단편은 동시에 사용될 수 있거나, 별도로 투여되거나, 조성물에 혼합되거나 또는 융합 단백질로서 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 임의의 수의 관용원성 단편 또는 관용원성 단편은 별도의 단편로서 또는 융합 단백질로서 조성물중에서 링커를 사용하거나 또는 링커를 사용하지 않고, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그보다 많은 면역허용원 또는 관용원성 단편에 대하여 colV에 대한 내성을 유발하는데 사용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 또는 그보다 많은 단편을 본 발명의 방법에 사용할 수 있다.

일부 실시양태에 의하여 콜라겐에 대한 항체의 존재를 검출하는 것은 임의의 다수의 면역분석 절차, 예컨대 ELISA 절차에 의하여 달성될 수 있다. 광범위한 면역분석 기법은 표준 면역분석 교과서를 참조하여 알 수 있는 바와 같이 이용 가능하며, 이의 예로는 비-경쟁적 유형의 단일부위 및 2-부위 또는 "샌드위치" 분석 뿐 아니라, 통상의 경쟁적 결합 분석을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

샌드위치 분석이 가장 유용하며 그리고 통상적으로 사용되는 항체에 기초한 분석 방법이며, 다양한 실시양태를 실시하는데 사용될 수 있다. 샌드위치 분석 기법의 다수의 변형이 존재하며, 모두를 다양한 실시양태에 의하여 포함시키고자 한다. 간략하게, 샘플 중의 항체를 검출하는 통상의 분석에서, 표지되지 않은 항원은 고체 기질상에서 고정되며, 테스트하고자 하는 샘플을 결합된 항원 분자와 접촉시킨다. 적절한 배양 기간후, 즉 항체-항원 복합체를 형성하도록 하기에 충분한 시간 동안, 검출 가능한 시그날을 생성할 수 있는 리포터 분자로 표지된 제2의 항체, 예컨대 항-사람 IgG를 첨가하고, 항체-항원-표지된 항체의 형성에 충분한 시간 동안 배양한다. 임의의 미반응 물질은 세정하여 버리고, 샘플 중의 검출하고자 하는 항체의 존재를 리포터 분자에 의하여 생성된 시그날의 관찰에 의하여 측정하였다. 결과는 예를 들면 가시 시그날의 단순 관찰에 의하여 정성적일 수 있거나 또는 중요한 샘플에 의하여 생성된 시그날을, 검출하고자 하는 공지의 양의 항체를 포함하는 대조 샘플과 비교하여 정량화할 수 있다. 이러한 분석에서의 변형은 동시 분석을 포함하며, 여기서 샘플 및 표지된 항체 모두를 결합된 항원에 동시에 첨가한다. 당업자에게 자명한 바와 같이, 임의의 적은 변형을 포함하는 이와 같은 기법은 공지되어 있다. 통상의 샌드위치 분석에서, 항원은 예를 들면 고체 표면에 공유 또는 수동 결합되어 고정된다. 특정의 실시양태에서, 고체 표면은 통상적으로 유리 또는 중합체이며, 가장 통상적으로 사용되는 중합체는 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리염화비닐 또는 폴리프로필렌이다. 고체 지지체는 튜브, 비이드, 디스크 또는 마이크로플레이트 또는 면역분석을 실시하기에 적절한 임의의 기타 표면의 형태가 될 수 있다. 각종 결합 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 일반적으로 소정 표면에 대한 항원의 가교, 공유 결합 또는 물리적 흡착으로 이루어진다. 그 후, 고정된 항원은 테스트 샘플의 첨가를 위하여 제제중에서 세정된다. 테스트하고자 하는 샘플의 분액을 고정된 항원과 접촉시키고, 충분한 시간(예, 2 내지 40 분)의 시간 동안 샘플 중에 존재하는 콜라겐에 대한 임의의 항체의 결합을 가능케 하는 적절한 조건(예, 25℃)하에서 배양한다. 실제의 접촉 시간 길이, 완충액 조건, 온도 등은 용이하게 조절 가능한 변수이며, 통상적으로 소정 테스트 동안 용이하게 도달된다. 배양 시간 이후, 임의의 결합하는 항체를 포함하는 고정 항원을 세정, 건조시키고, 결합하는 항체, 예를 들면 항-사람 IgG에 대하여 특이성이 있는 제2의 항체와 함께 배양한다. 제2의 항체는 항체-고정된 항원 복합체에 대한 제2의 항체의 결합을 나타내는데 사용되는 리포터 분자에 결합된다.

colV에 대한 항체를 측정하기 위한 특정한 한 방법은 WO2007/120947에 기재되어 있다. 구체적으로, 이러한 비이드 분석은 자가면역 반응 V형 콜라겐을 갖는 환자로부터의 혈청 및/또는 폐 세척액 중에 존재할 수 있는 바와 같은 V형 콜라겐에 대한 항체를 검출한다. 기타의 필수 제제와 함께 V형 콜라겐-코팅된 비이드가 이러한 분석에 제공된다. 간략하게, 통상의 분석은 하기와 같다: 1) 스트렙타비딘-코팅된 비이드(예, 미국 펜실베이니아주 워링턴에 소재하는 폴리사이언스로부터의 것)를 무균 PBS로 세정한다. 적절한 부피의 PBS 중에서 사람 V형 콜라겐을 사용하여 비이드를 현탁시킨다. 2) 상기 1)에서의 절차와 동일한 절차를 실시한 후 사람 콜라겐 V 항체에 대한 토끼 항체(비오텐)(미국 매사추세츠주 캐임브리지에 소재하는 에이비임)를 사용하여 양성 대조군을 생성하였다. 3) 각각의 분석의 경우, 접합된 비이드를 PBS 중에서 세정하고, PBS와 폐 세척액의 혈청중에서 배양하였다. 비이드를 10% FCS를 포함하는 PBS로 세정하였다. 4) 그 후, 비이드를 무균 PBS+10% FBS에 현탁시키고, 실온에서 2차 항체와 함께 배양하였다. 통상적으로, 당업자가 이해하고 있는 바와 같이 기타의 적절한 항체를 입수할 수 있기는 하나, R-PE로 접합된 항-사람 IgG 항체(미국 세인트에 소재하는 시그마)를 사용하였다. 이와 관련하여, 항-사람 IgG1-, IgG2-, IgG3- 또는 IgG4-특이성 항체를 특정한 실시양태에 사용하여 질환의 과정 중에 하나의 서브타입으로부터 또 다른 서브타입으로의 교체를 검출할 수 있다. 비이드를 10% FCS를 포함하는 PBS 중에서 세정하고, PBS/FCS 용액 중에 현탁시키고, 유세포분석기를 사용하여 분석하였다. 양성 대조군의 경우, 공지의 양의 항-colV 항혈청 또는 항체를 비이드 분석에 첨가할 수 있다.

통상적으로, COPD 및 천식 환자중에서 발견되는 colV에 대한 항체는 IgG이지만, 또 다른 유형의 항체, 예컨대 IgM도 또한 존재할 수 있다. 추가로, 본 발명의 특정의 실시양태에서, V형 콜라겐에 대한 IgG 항체의 서브타입은 질환의 과정을 통한 환자 변경으로부터 혈청 및/또는 폐 세척액 중에 존재할 수 있다. 이와 관련하여, IgG 서브타입 교체는 질환의 과정 중에 발생할 수 있으며, 특정의 서브타입은 질환의 악화를 나타낼 수 있다. 그래서, IgG 서브타입의 임의의 1종 이상, 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 또는 이의 임의의 조합은 질환의 과정 중에 존재할 수 있다. 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 비이드 분석을 사용하여 V형 콜라겐-특이성 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 서브타입 항체를 검출하기 위한 방법을 제공한다. 당업자가 인식하고 있는 바와 같이, IgG 서브타입-특이성 항체는 통상적으로 입수 가능하며, 본 명세서에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, IgG1의 증가는 질환의 악화를 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, IgG2 서브타입으로의 교체는 질환의 악화를 나타낸다. 추가의 실시양태에서, IgG3 서브타입으로의 교체는 질환의 악화를 나타낸다. 또 다른 추가의 실시양태에서, IgG4 서브타입으로의 교체는 질환의 악화를 나타낸다.

조성, 약학적 조성물 및 사용 방법

본 발명의 면역허용원 화합물 또는 조성물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 순수한 형태로 또는 적절한 약학적 조성물의 형태로 투여하는 것은 유사한 용도를 제공하기 위한 제제의 투여의 임의의 허용되는 유형에 의하여 실시될 수 있다. 본 명세서에서 나타낸 바와 같이, 내성을 유발하기 위하여 고려되는 한 경로는 경구 투여이다. 그러나, 특히 정맥내, 근육내, 피내, 피하 주사 및 기타의 경로를 비롯한 임의의 다양한 기타 경로를 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 화합물을 적절한 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 생성될 수 있으며, 고체, 반고체, 액체 또는 기체 제형, 예컨대 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 액제, 좌제, 주사제, 흡입제, 겔, 미세구 및 에어로졸로 제제에 배합할 수 있다. 또한, 기타의 약학적 활성 성분(기타의 면역억제제 포함) 및/또는 적절한 부형제, 예컨대 염, 완충액 및 안정화제가 조성물에 존재할 수 있으나, 반드시 그러할 필요는 없다.

투여는 경구, 비경구, 비강, 정맥내, 피내, 피하 또는 국소를 비롯한 각종 상이한 경로에 의하여 달성될 수 있다. 투여의 바람직한 유형은 치료 또는 예방하고자 하는 상태의 성질에 의존한다. 투여 후 항-colV 면역 반응 또는 그러한 반응의 임상적 징후의 개시를 감소, 억제, 예방 또는 지연시키는 양이 효과적인 것으로 간주한다.

특정 실시양태에서, 투여된 양은 본 명세서에 기재된 바와 같은 감소된 면역 활성(예, T 세포 반응, B 세포 반응, 항-colV 항체 레벨 등)을 일으키기에 충분하다. 정확한 투약량 및 치료 기간은 치료하는 질환에 따르며, 공지된 테스트 프로토콜을 사용하여 또는 당업계에 공지된 모델계에서 조성물을 테스트하고, 이로부터 추론하여 실험에 의하여 결정될 수 있다. 조절된 임상 시험도 또한 실시할 수 있다. 투약량은 또한 경감시키고자 하는 상태의 경중도에 따라 달라질 수 있다. 약학적 조성물은 일반적으로 바람직하지 못한 부작용을 최소로 하면서 치료적으로 유용한 효과를 나타내도록 배합 및 투여된다. 조성물은 1회로 투여될 수 있거나 또는 시간 간격을 두어 투여하고자 하는 다수의 더 적은 투약량으로 나눌 수 있다. 임의의 특정 개체의 경우, 특이적 투약 요법은 개체 요구에 따라 시간에 걸쳐 조절될 수 있다.

본 발명의 조성물은 단독으로 또는 기타의 공지의 치료법, 예컨대 면역억제 요법, 방사선 요법, 화학요법, 이식, 경구 콜라겐 요법, 면역요법, 호르몬 요법, 광역학 요법 등과 조합하여 투여될 수 있다.

이들 및 관련 약학적 조성물을 투여하는 통상의 경로는 경구, 국소, 경피, 흡입, 폐내 점적주입, 비경구, 설하, 협측, 질내 및 비강내를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에서 사용한 바와 같이 용어 비경구로는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 복장내 주사 또는 주입 기법을 들 수 있다. 본 발명의 조성물은 환자에게 조성물의 투여시 포함된 활성 성분이 생체이용 가능하도록 배합된다. 개체 또는 환자에게 투여되는 조성물은 1종 이상의 투약 단위의 형태를 취하며, 여기서 예를 들면 정제는 단일 투약 단위가 될 수 있거나 또는 에어로졸 형태의 본 발명의 화합물의 용기는 복수의 투약 단위를 취할 수 있다. 이와 같은 투약 제형을 생성하기 위한 실제의 방법은 공지되어 있거나 또는 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들면 문헌[Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000]을 참조한다. 투여하고자 하는 조성물은 어떠한 경우에서는 본 발명의 교시에 의하여 중요한 질환 또는 상태의 치료를 위하여 치료적 유효량의 본 발명의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물은 고체 또는 액체의 제형이 될 수 있다. 한 측면에서, 담체(들)는 조성물이 예를 들면 정제 또는 분말의 형태가 되도록 하는 미립자이다. 담체(들)는 액체일 수 있으며, 조성물은 예를 들면 경구 오일, 주사액 또는, 예를 들면 흡입 투여에 유용한 에어로졸이 될 수 있다.

특정 실시양태에서, 치료적 화합물(들)은 가압된 에어로졸 또는 분무된 배합물로서 환자의 폐에 흡입을 통하여 직접 투여된다. 이러한 배합물은 폐내 및/또는 비강내 흡입 투여에 유용한 임의의 각종 공지의 에어로졸 추진제를 포함할 수 있다. 또한, 물은 임의의 각종 공용매, 계면활성제, 안정화제(예, 항산화제, 킬레이트화제, 불활성 기체 및 완충제)와 함께 또는 없이 존재할 수 있다. 복수의 투약 용기로부터 투여하고자 하는 조성물의 경우, 항균제가 통상적으로 첨가된다. 이와 같은 조성물은 또한 일반적으로 여과 및 살균되며, 동결건조되어 향상된 안정성을 제공하며 그리고 용해도를 증가시킨다.

경구 투여하고자 하는 경우, 약학적 조성물은 고체 또는 액체 형태인 것이 바람직하며, 여기서 반-고체, 반-액체, 현탁액 및 겔 제형도 고체 또는 액체로서 본 명세서에서 간주하는 형태내에 포함된다.

경구 투여를 위한 고체 조성물의 경우, 약학적 조성물은 분말, 과립, 압축 정제, 환약, 캡슐, 츄잉껌, 웨이퍼 또는 유사 형태로 배합될 수 있다. 이러한 고체 조성물은 통상적으로 1종 이상의 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 또한, 결합제, 예컨대 카르복시메틸셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 트라가간트 껌 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 전분, 락토스 또는 덱스트린, 붕해제, 예컨대 알긴산, 알긴산나트륨, 프리모겔, 옥수수 전분 등; 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘 또는 스테로텍스; 활택제, 예컨대 콜로이드성 이산화규소; 감미제, 예컨대 수크로스 또는 사카린; 풍미제, 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 풍미제; 및 착색제 중 1종 이상이 존재할 수 있다.

약학적 조성물이 캡슐, 예를 들면 젤라틴 캡슐의 형태인 경우, 상기 유형의 물질 이외에 액체 담체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 또는 오일을 포함할 수 있다.

약학적 조성물은 액체, 예를 들면 엘릭시르, 시럽, 액제, 에멀젼 또는 현탁액의 형태가 될 수 있다. 액체는 2가지 예로서 경구 투여 또는 주사에 의한 전달을 위한 것일 수 있다. 경구 투여하고자 하는 경우, 바람직한 조성물은 본 발명의 화합물 이외에, 1종 이상의 감미제, 방부제, 염료/착색제 및 풍미 향상제를 포함한다. 주사에 의하여 투여하고자 하는 조성물에서, 계면활성제, 방부제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 완충제, 안정화제 및 등장화제 중 1종 이상을 포함할 수 있다.

본 발명의 액체 약학적 조성물은 액제, 현탁액 또는 기타의 유사 형태이건 간에, 이들은 무균 희석제, 예컨대 주사용수, 염수 용액, 바람직하게는 생리적 염수, 링거 액제, 등장성 염화나트륨, 용매 또는 현탁 매체로서 작용할 수 있는 고정유, 예컨대 합성 모노 또는 디글리세리드, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타의 용매; 항박테리아제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 아황산나트륨; 킬레이트화제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 예컨대 아세트산염, 구연산염 또는 인산염 및 긴장성을 조절하기 위한 제제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 아주번트 1종 이상을 포함할 수 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 생성된 앰풀, 1회용 주사기 또는 복수 투약 바이알에 수용될 수 있다. 생리적 염수가 바람직한 아주번트이다. 주사 가능한 약학적 조성물은 무균인 것이 바람직하다.

비경구 또는 경구 투여하고자 하는 본 발명의 액체 약학적 조성물은 적절한 투약량을 얻도록 소정량의 본 발명의 화합물을 포함하여야 한다. 통상적으로, 이러한 양은 조성물중에서 본 발명의 화합물 0.01% 이상이다. 경구 투여하고자 하는 경우, 양은 조성물 중량의 0.1 내지 70 중량%로 변경될 수 있다. 특정의 경구 약학적 조성물은 약 4% 내지 약 75%의 본 발명의 화합물을 포함한다. 본 발명에 의한 특정의 약학적 조성물 및 제제는 비경구 투약 단위가 본 발명의 희석 이전에 0.01 내지 10 중량%의 화합물을 포함하도록 생성된다.

본 발명의 약학적 조성물은 국소 투여하고자 할 수 있으며, 이 경우 담체는 적절하게는 액제, 에멀젼, 연고 또는 겔 베이스를 포함할 수 있다. 베이스는 예를 들면 바셀린, 라놀린, 폴리에틸렌 글리콜, 밀납, 광유, 희석제, 예컨대 물 및 알콜 및 유화제 및 안정화제 중 1종 이상을 포함할 수 있다. 농조화제가 국소 투여를 위한 약학적 조성물에 존재할 수 있다. 경피 투여하고자 할 경우, 조성물은 경피 패치 또는 이온이동 장치를 포함할 수 있다. 국소 배합물은 약 0.1 내지 10% w/v(단위 부피당 중량)의 본 발명의 화합물의 농도를 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 예를 들면 직장에서 용해되어 약물을 방출하는 좌제의 형태로 직장 투여할 수 있다. 직장 투여를 위한 조성물은 적절한 비자극성 부형제로서 유성 베이스를 포함할 수 있다. 이와 같은 베이스로는 라놀린, 코코어 버터 및 폴리에틸렌 글리콜을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 고체 또는 액체 투약 단위의 물리적 형태를 변형시키는 각종 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 활성 성분 주위에 코팅 외피를 형성하는 물질을 포함할 수 있다. 코팅 외피를 형성하는 물질은 통상적으로 불활성이며, 예를 들면 설탕, 셸락 및 기타의 장용 코팅제로부터 선택될 수 있다. 대안으로, 활성 성분은 젤라틴 캡슐에 둘러싸일 수 있다.

고체 또는 액체 형태의 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 화합물에 결합되어 화합물의 전달을 도울 수 있는 제제를 포함할 수 있다. 이와 같은 투약량으로 작용할 수 있는 적절한 제제로는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 단백질 또는 리포좀을 들 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 에어로졸로서 투여될 수 있는 투약 단위로 이루어질 수 있다. 용어 에어로졸은 콜로이드 성질을 갖는 것으로부터 가압된 패키지로 이루어진 계까지의 범위를 갖는 각종 계를 지칭하는데 사용된다. 전달은 액화 또는 압축된 기체에 의하여 또는, 활성 성분을 분배하는 적절한 펌프계에 의하여 이루어질 수 있다. 본 발명의 화합물의 에어로졸은 단일상, 2상 또는 3상 계에 전달되어 활성 성분(들)을 전달할 수 있다. 에어로졸의 전달은 함께 키트를 형성할 수 있는 필수 용기, 활성화기, 밸브, 서브용기 등을 포함한다. 당업자는 과도한 실험 없이도 바람직한 에어로졸을 결정할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학 분야에서 공지된 방법에 의하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 주사에 의하여 투여하고자 하는 약학적 조성물은 본 발명의 화합물을 무균 증류수와 혼합하여 액제를 생성할 수 있다. 계면활성제는 균질한 액제 또는 현탁액의 형성을 촉진하기 위하여 첨가될 수 있다. 계면활성제는 수성 전달계에서 화합물의 용해 또는 균질한 현탁을 촉진하기 위하여 본 발명의 화합물과 함께 비공유 상호작용하는 화합물이다.

본 발명의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염은 사용한 특정 화합물의 활성을 비롯한 각종 요인; 화합물의 대사 안정성 및 작용 길이; 환자의 연령, 체중, 신체 건강, 성별 및 식이; 투여의 유형 및 시간; 배설 속도; 약물 병합; 특정 질환 또는 상태의 경중도; 및 개체가 겪고 있는 요법에 따라 결정되는 치료적 유효량으로 투여된다. 일반적으로, 치료적으로 유효한 1일 투약량은 (70 ㎏ 포유동물의 경우) 약 0.001 ㎎/㎏(즉, 0.07 ㎎) 내지 약 100 ㎎/㎏(즉, 7.0 g)이며; 바람직하게는 치료적으로 유효한 투약량은 (70 ㎏ 포유동물의 경우) 약 0.01 ㎎/㎏(즉, 0.7 ㎎) 내지 약 50 ㎎/㎏(즉, 3.5 g)이며; 더욱 바람직하게는 치료적으로 유효한 투약량은 (70 ㎏ 포유동물의 경우) 약 1 ㎎/㎏(즉, 70 ㎎) 내지 약 25 ㎎/㎏(즉, 1.75 g)이다.

특정 실시양태에서, 경구 투여되는 colV의 투약량은 1일 0.001 ㎎ 내지 500 ㎎이다. 특정의 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 colV의 경구 투약량은 1일 0.01 ㎎ 내지 50 ㎎이다. 추가의 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 colV의 경구 투약량은 1일 0.1 ㎎ 내지 0.5 ㎎이다. 한 실시양태에서, colV의 경구 투약량은 1일 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09 또는 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9 또는 5.0 ㎎이다. 또 다른 실시양태에서, colV의 경구 투약량은 1일 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 또는 8.0 ㎎일 수 있다. 특정 실시양태에서, 투약량은 단일 투약으로 제시되거나 또는 1일에 걸쳐 복수회 투약으로, 예를 들면 1일 총 특정의 ㎎ 투약량에 대하여 1일 2, 3 또는 4회 투약으로 제시될 수 있다.

본 명세서에서 기재된 바와 같이, 특정 실시양태에서, colV의 치료적으로 유효한 투약량은 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 각종 방법을 사용하여 측정한 colV에 대한 내성을 유발하기에 충분한 투약량이다. 특정 실시양태에서, colV에 대한 내성의 유발은 본 명세서에 기재된 방법, 예컨대 ELISA를 사용하여 측정시 혈청 항-colV 항체에서의 감소를 초래한다. 추가의 실시양태에서, 본 명세서에서 사용한 바와 같은 치료적으로 유효한 투약량의 colV는 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 각종 방법, 예컨대 시토킨 방출 분석, 세포내 시토킨 염색 및 유속 세포분석법, ELISPOT 등을 사용하여 측정시 colV에 대한 T 세포 내성을 유발하기에 충분한 투약량이다. 작용성 T 세포 분석, 예컨대 세포독성 분석의 증식도 또한 사용할 수 있다.

본 발명의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염도 또한 1종 이상의 기타의 치료제의 투여와 동시에, 이전에 또는 이후에 투여될 수 있다. 이와 같은 병행 요법은 본 발명의 화합물 및 1종 이상의 추가의 활성제를 포함하는 단일 약학적 투약 배합물의 투여뿐 아니라, 이의 별도의 약학적 투약 배합물중의 본 발명의 화합물 및 각각의 활성제의 투여를 들 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물 및 기타의 활성제는 단일 경구 투약 조성물, 예컨대 정제 또는 캡슐로 함께 환자에게 투여될 수 있거나 또는 각각의 제제는 별도의 경구 투약 배합물로 투여된다. 별도의 투약 배합물을 사용하는 경우, 본 발명의 화합물 및 1종 이상의 추가의 활성제는 실질적으로 동시에, 즉 함께 또는 별도로 시차를 둔 시간으로, 즉 순차적으로 투여될 수 있으며, 병행 요법은 이들 요법 모두를 포함하는 것으로 이해한다.

본 발명의 화합물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 질환 또는 질병, 예컨대 COPD 및 중증 및 지속 천식을 앓고 있는 개체에게 투여될 수 있다. 사람 질환의 치료를 위한 생체내 사용의 경우, 본 명세서에 기재된 화합물은 일반적으로 투여 이전에 약학적 조성물에 혼입된다. 약학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 생리적 허용 가능한 담체 또는 부형제와 조합하여 본 명세서에 기재된 화합물 중 1종 이상을 포함한다. 약학적 조성물을 생성하기 위하여, 화합물중 1종 이상의 유효량을 특정 유형의 투여에 적절한 당업자에게 공지된 임의의 약학적 담체(들) 또는 부형제와 혼합된다. 약학적 담체는 액체, 반-액체 또는 고체일 수 있다. 비경구, 피내, 피하 또는 국소 적용에 사용되는 액제 또는 현탁액은 예를 들면 무균 희석제(예컨대 물), 염수액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타의 합성 용매; 항균제(예컨대 벤질 알콜 및 메틸 파라벤); 항산화제(예컨대 아스코르브산 및 아황산나트륨) 및 킬레이트화제(예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)); 완충제(예컨대 아세트산염, 구연산염 및 인산염)을 들 수 있다. 정맥내 투여의 경우, 적절한 담체로는 생리적 염수 또는 인산염 완충 염수(PBS) 및, 농조화제와 가용화제, 예컨대 글루코스, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 그의 혼합물을 포함하는 용액을 들 수 있다.

본 명세서에 기재된 화합물은 신체로부터의 신속한 제거를 방지하는 담체, 예컨대 지연 방출 제제 또는 코팅을 사용하여 생성될 수 있다. 이와 같은 담체로는 조절 방출 제제, 예컨대 이식물 및 마이크로캡슐화된 전달계 및 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 다가무수물, 폴리글리콜산, 폴리오르토에스테르, 폴리락트산 및 당업자에게 공지된 기타의 물질을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

특정 실시양태에서, 내성을 유발하는 것을 돕는 아주번트로는 덱사메타손(예를 들면 문헌[Y. Kang, et al., J. Immunol. 2008, 180: 5172-5176] 참조), 리포다당질(LPS) 및 콜레라 독소 β-서브유니트를 들 수 있으며, 배합물에 첨가할 수 있다. 특정의 기타 면역허용원 담체는 또한 본 발명의 colV 조성물과 함께 사용하는 것을 고려한다. 이러한 담체로는 광유 담체, 예컨대 불완전 프로인드 아주번트(IFA) 또는 완전 프로인드 아주번트(CFA)를 들 수 있다. IFA는 광유의 에멀젼이다. CFA는 다양한 양의 사멸된 미코박테륨 유기체를 포함하는 광유의 제제이다. 그러나, IFA 및 CFA는 신체에 의하여 광유가 대사되지 않으며 그리고 분해될 수 없으므로 사람에게는 허용되지 않는다.

특정 실시양태에서, 사람 환자의 정맥내 영양을 위하여 수년간 사용되어 온 지방 에멀젼은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 사용하는 면역허용원 폴리펩티드 요법을 위한 비이클로서 작용할 수 있다. 이와 같은 에멀젼의 2가지 예는 인트라피드(Intralipid) 및 리포푼딘(Lipofundin)으로 공지된 시판중인 지방 에멀젼이다. "인트라피드"는 미국 특허 제3,169,094호에 기재된 정맥내 영양을 위한 지방 에멀젼에 대한 스웨덴에 소재하는 카비 파마시아의 등록상표이다. "리포푼딘"은 독일에 소재하는 비. 브라운 멜순겐의 등록상표이다. 이들 모두는 지방으로서 대두유를 포함한다(1,000 ㎖ 증류수중의 100 또는 200 g: 10% 또는 20% 각각). 난황 인지질(12 g/ℓ 증류수)은 인트라리피드중의 유화제로서 사용되며, 난황 레시틴(12 g/ℓ 증류수)은 리포푼딘에 사용된다. 등장성은 인트라리피드 및 리포푼딘 모두에서 글리세롤의 첨가(25 g/ℓ)로 발생한다. 이들 비이클은 실질적으로 의심되는 자가 항원과 착체를 형성할 때 자가면역 T 세포의 TH1을 TH2로의 이동을 촉진시키는 생물학적 활성 담체인 것으로 밝혀졌다. 특정 실시양태에서, 이러한 비이클은 10-20% 식물성 및/또는 동물성 기원의 트리글리세리드, 1.2-2.4% 식물성 및/또는 동물성 기원의 인지질, 2.25-4.5% 삼투압조절제, 0-0.05% 항산화제 및 100%까지의 무균수를 포함하는 지방 에멀젼이다.

특정 실시양태에서, colV 또는 그의 관용원성 단편은 GI 섭취를 향상시키기 위하여 디프테리아 독소 수용체에 결합될 수 있다.

본 발명의 면역허용원 조성물은 colV에 대한 자가면역과 관련된 천식 및 COPD 및 기타의 폐질환을 치료하는데 사용할 수 있다. 그래서, 한 실시양태에서, 본 발명은 COPD 환자에게 내성을 유발하는데 효과적인 투약량으로 투여된 치료적 유효량의 V형 콜라겐 또는 그의 관용원성 단편 또는 그의 관용원성 단편을 투여하는 것을 포함하는, 만성 폐쇄성 폐질환의 치료 방법을 제공한다. 이와 관련하여, COPD 환자는 폐기종 또는 만성 폐쇄성 기관지염을 가질 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 천식 환자에게 내성을 유발하는데 효과적인 투약량으로 투여된 치료적 유효량의 V형 콜라겐 또는 그의 관용원성 단편 또는 그의 관용원성 단편을 투여하는 것을 포함하는 천식의 치료 방법을 제공한다. 이와 관련하여, 천식 환자는 중증, 지속 천식을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 천식 환자에서의 천식의 경중도를 감소시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 개체에게 치료적 유효량의 V형 콜라겐 또는 그의 관용원성 단편을 투여하는 것을 포함하는, 만성 폐쇄성 폐질환을 발생시킬 위험이 있는 개체에서 만성 폐쇄성 폐질환의 발생을 예방하는 방법을 제공한다.

본 명세서에서 보고한 바와 같이, 무손상 colV 또는 그의 성분 α 사슬중 임의의 1종 이상을 투여할 수 있거나 또는 임의의 전술한 분자의 관용원성 단편을 투여한다. 추가로, 또한 본 명세서에서 보고한 바와 같이, 무손상 colV의 관용원성 단편관용원성 단편 사슬의 임의의 1종 이상을 본 명세서에 기재된 임의의 방법에서 colV에 대한 내성을 유발하기에 효과적인 투약량을 사용하여 투여할 수 있다. 이와 같은 투약량은 사용한 특이성 단백질 또는 단편의 활성; 화합물의 대사 안정성 및 작용 길이; 환자의 연령, 체중, 신체 건강, 성별 및 식이; 투여의 유형 및 시간; 배설 속도; 약물 병합; 특정 질환 또는 상태의 경중도; 및 개체가 겪고 있는 요법을 비롯한 각종 요인에 따라 결정된다. 그래서, 이와 같은 면역허용원 투약량은 공지된 테스트 프로토콜을 사용하여 또는 당업계에 공지된 모델계에서 조성물을 테스트하고, 이로부터 추론하여 실험에 의하여 결정될 수 있다. 조절된 임상 시험도 또한 실시할 수 있다. 투약량은 또한 경감시키고자 하는 상태의 경중도에 따라 달라질 수 있다.

당업자가 용이하게 이해하는 바와 같이, 각종 요인은 COPD 또는 천식의 경중도를 치료, 예방 또는 감소시키기 위하여 본 발명의 화합물 및 방법의 유효성을 결정하기 위하여 평가할 수 있다. 이와 같은 요인의 예로는 임상의에 의하여 평가될 수 있는 천식 또는 COPD의 통상의 임상적 징후를 포함한다. 이러한 징후의 비제한적인 예로는 천식: 천명; 가슴 통증 또는 흉통; 빠른 심박수; 발한; 최고 유량계에 의하여 측정한 바와 같은 최고 유속; 특히 심야의 잦은 기침; 용이한 호흡 손실 또는 호흡곤란; 운동시 매우 피곤하거나 또는 쇠약함을 느낌; 운동후 천명 또는 기침; 피곤하거나, 쉽게 화를 내거나, 시무룩하거나 또는 변덕스러운 느낌; 최고 유량계로 측정시 폐 기능의 감소 또는 변화; 저온 또는 알러지의 징후(재채기, 콧물, 기침, 코 충혈, 인후통 및 두통); 수면 장애를 들 수 있다. 이와 같은 요인은 생성된 가래의 양; 가래의 농밀도 또는 끈적거림; 가래의 색깔 또는 가래중의 혈액의 존재; 호흡곤란, 기침 및/또는 천명의 경중도; 발목 부기; 건망증, 착란, 언어 차질 및 졸림; 수면 장애; 호흡곤란을 피하기 위하여 침대 대신에 의자에서 자거나 또는 더 많은 베개를 사용함; 설명되지 않는 체중의 증가 또는 감소; 지속적인 에너지 결여 및 피로; 성적 충독 결여; 아침 두통, 현기증 발작, 안절부절증과 같은 COPD의 통상의 임상적 징후를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물 및 방법은 코르티코스테로이드(예를 들면 프레드니손, 플루티카손, 메틸프레드니솔론), 기관지확장제(예를 들면 단기 작용 및 장기 작용 β2-작용제, 테오필린, 피르부테롤, 에페드린, 알부테롤, 살메테롤, 레발부테롤, 클렌부테롤 이프라트로피움 브로마이드) 및 류코트리엔 조절제(예를 들면 몬테루카스트, 자피르루카스트, 질류턴)을 비롯한(이에 한정되지 않음) COPD 및 천식의 기타 공지된 치료와 병행하여 사용될 수 있다.

본 발명은 COPD 및 천식을 비롯한 폐질환의 치료 또는 예방에 효과적인 화합물 및 방법을 제공한다.

도 1은 COPD 환자에서의 증가된 항-V형 콜라겐 항체를 나타내는 막대 그래프를 도시한다.
도 2는 천식 환자에서의 증가된 항-V형 콜라겐 항체를 나타내는 막대 그래프를 도시한다.
도 3은 콜라겐 V의 정맥내 투여 후 마우스에서의 난알부민-유도된 기도 과민성의 예방을 도시한다. n은 colV를 제외한 모든 군에서 5이고, 여기서 n은 각각의 데이타 지점에 대하여 2-5이다.
도 4A 내지 도 4E는 Col(V)의 정맥내 투여에 의한 폐 단핵세포에서의 IFN-γ 전사의 유도를 나타내는 막대 그래프를 도시한다. 정량적 PCR은 도시한 IL-4, IL-5, IL-13, IFN-γ 및 IL-10 시토킨에 대하여 실시하였다. Col(V) IV만이 폐 단핵 세포에서의 IFN-γ 전사를 유도하였다. 데이타는 각각의 군에서 5 마리의 마우스로부터 푸울링 처리한 RNA의 단핵 세포를 나타낸다.

실시예

실시예 1: 항-콜라겐 V 항체는 COPD 환자에게서 증가함

정상의 지원자(비흡연 성인, 연령 18-55) 및 폐기종이 보고된 지원자로부터 혈장을 얻었다. COPD 환자 및 대조군의 건강한 개체에서 항-colV 항체의 레벨은 WO2007/120947에 기재된 바와 같은 유속 세포분석법 비이드 분석에 의하여 검출하였다.

간략히, 1) 스트렙타비딘-코팅된 비이드(5 ㎛, 결합 투약량 10-20 ㎍/1×10⁷ 비이드(미국 펜실베이니아주 워링턴에 소재하는 폴리사이언스))를 무균 PBS로 2회 세정하였다. 비이드(1×10⁷)를 100 ㎕의 PBS 중에 40 ㎍의 사람 V형 콜라겐과 함께 현탁시키고, 60 분 동안 4℃에서 배양하였다. 2) 상기 1)에서의 절차와 동일한 절차를 실시한 후 사람 콜라겐 V 항체에 대한 토끼 항체(비오텐)(미국 매사추세츠주 캐임브리지에 소재하는 에이비임) 20 ㎛를 사용하여 양성 대조군을 생성하였다. 3) 각각의 분석의 경우, 1×10⁶ 접합된 비이드를 PBS 중에서 2회 세정하고, 100 ㎕ PBS와 50 ㎕ 혈청중에서 배양하였다. 30 분 동안 실온에서 배양한 후, 비이드를 10% FCS를 포함하는 PBS로 3회 세정하였다. 4) 그 후, 비이드를 100 ㎕의 무균 PBS+10% FBS에 현탁시키고, 약 30 분 동안 실온에서 2차 항체와 함께 배양하였다. 통상적으로, R-PE로 접합된 항-사람 IgG 항체(미국 세인트에 소재하는 시그마) 5 ㎕를 사용하였다. 비이드를 10% FCS를 포함하는 PBS 중에서 3회 세정하고, 300 ㎕의 PBS/FCS 용액 중에 현탁시키고, 유세포분석기를 사용하여 분석하였다.

도 1에 도시한 바와 같이, 항-V형 콜라겐 항체는 대조군(N=42)에 비하여 COPD 환자(N=16)에서 크게 증가되었다.

실시예 2: 항-콜라겐 V 항체는 천식 환자에게서 증가함

정상의 지원자(비흡연 성인, 연령 18-55) 및 만성 천식이 보고된 지원자로부터 혈장을 얻었다. 천식 환자 및 대조군의 지원자 개체에서 항-colV 항체의 레벨은 실시예 1에 기재된 바와 같은 비이드 분석을 사용하여 측정하였다.

도 2에 도시한 바와 같이, 항-V형 콜라겐 항체의 증가된 레벨은 20명의 천식 환자중 8명에게서 보고되었다.

실시예 3: 정맥내 콜라겐 V는 마우스에서 난알부민 -유도된 기도 과민성을 예방함

본 실시예는 콜라겐 V의 정맥내 투여가 설정된 설치류 천식 모델에서 난알부민-유도된 기도 과민성을 예방한다는 것을 입증한다.

Balb/c 마우스에게 100 ㎍ col(V) 단독으로 또는 프로인드 완전면역보강제(CFA)와 혼합된 col(V) 또는 PBS 또는 CFA 단독으로 꼬리를 통하여 주사하였다. 7일 경과 후, 마우스에게 백반중의 난알부민을 IP 주사하고, 이를 7일후 반복하였다. 최종 난알부민/백반 주사 7일후, 각각의 군에서의 마우스에게 에어로졸로 된 난알부민의 투약량을 증가시켜 시험감염시킨 후, 기도 내성(PenH)을 측정하였다.

결과에 의하면, col(V) 단독이 ova-유도된 기도 과민성을 방지한다는 것을 알 수 있다(도 3 참조). 추가의 실험을 실시하여 이러한 결과를 확인하였다. 이들 결과를 하기 표 2에 요약하였다.

실시예 4: 정맥내 col(V)은 폐 단핵 세포에서 IFN -γ 전사를 유발함

본 실시예는 col(V) 단독의 정맥내 주사가 IFN-γ 전사의 유발을 특징으로 하는 폐 단핵 세포에서 TH1 반응을 유발한다는 것을 나타낸다. Balb/c 마우스에게 100 ug의 col(V) 단독을 꼬리 정맥을 통하여 주사하고, CFA 단독을 꼬리 바닥에서, colV와 CFA를 꼬리 바닥에서 또는 PBS 정맥내 단독으로 주사하였다. 7일 경과 후, 마우스에게 백반중의 난알부민을 IP 주사하고, 7일 경과 후 이를 반복하였다. 최종 난알부민/백반 주사 7일후, 각각의 군에서의 마우스에게 에어로졸로 된 메타콜린의 투약량을 증가시켜 시험감염시킨 후, 메타콜린 시험감염에 대한 반응에서의 기도 내성(PenH)을 측정하였다. 각각의 처치군에서의 마우스의 폐 실질로부터 분리시킨 단핵 세포로부터 RNA를 추출하고, IL-4, IL-5, IL-13, IFN-γ 및 IL-10의 발현 레벨을 결정하기 위하여 정량적 PCR을 실시하였다(도 4 참조; 데이타는 각각의 군에서 5마리의 마우스로부터 푸울링 처리한 RNA의 폐 단핵 세포를 도시한다).

실험 결과에 의하면, 정맥내 투여한 Col(V) 단독은 폐 단핵 세포에서 IFN-γ 전사를 유발한다는 것을 알 수 있다. IFN-γ는 천식 발병기전에서 중요한 역할을 하는 것으로 판단되는 2종의 시토킨 IL-13 및 IL4에 대하여 길항성을 갖는다. 그러므로, 특정 이론으로 한정하지는 않지만, 이러한 IL4/IL13의 효과를 길항시키는 TH1 반응의 유발은 난알부민-유도된 천식에서 colV-매개 보호 효과에 부분적으로 참여할 수 있다.

본 명세서에서 인용하고 출원 데이타 시이트에 제시한 상기의 모든 미국 특허, 미국 특허 출원 공보, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비-특허 문헌의 개시 내용은 그 전문이 본 출원에 참고로 포함된다.

상기로부터 본 발명의 구체적인 실시양태가 예시를 위하여 본원에 기재하기는 하였으나, 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있는 것으로 이해한다. 따라서, 본 발명은 하기 첨부한 특허청구범위에 의한 것을 제외하고는 한정되지 않는다.

<110> INDIANA UNIVERSITY RESEARCH AND TECHNOLOGY CORPORATION <120> COMPOSITIONS FOR USE IN THE TREATMENT OF CHRONIC OBSTRUCTIVE PULMONARY DISEASE AND ASTHMA <130> IPA110757-US-D1 <150> 61/171,705 <151> 2009-04-22 <150> 61/266,048 <151> 2009-12-02 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 8439 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cgcactctcc gtccccgcgg ctggcgcagg acctcactcg agcggagcgc ccacggggag 60 cgggtcgcgg ggcggcggcg gcgaggagga ggcgagaagg agttggagga ggaggaggag 120 gaggcgaggg cgagctagcc cagcggggtc ccggccgccc cgcgggccaa agtcgagccc 180 tcccgcccgt gggcgagcgc gccagccgcc ccttccagaa cagccgccgc cacaaagaag 240 aacggggggt gccgaggtcc ccatgacctc ctaaagtggt gcggtccctg ctgagtgcgc 300 tgcccgggcc gtgacccgcg cccctgtgcg tccccgcgcg cctccgagcg cccctgtgcg 360 ccccggcccg cgccccgccg gcatggacgt ccatacccgc tggaaagcgc gcagcgcgct 420 ccgcccgggc gccccgctgc tgcccccgct gctgctgctg ctgctgtggg cgccgcctcc 480 gagccgcgca gctcagccag cagatctcct gaaggttcta gattttcaca acttgcctga 540 tggaataaca aagacaacag gcttttgcgc cacgcggcga tcttccaaag gcccggatgt 600 cgcttacaga gtcaccaaag acgcgcagct cagcgcaccc accaagcagc tgtaccctgc 660 gtctgcattt cccgaggact tctccatcct aacaactgtg aaagccaaga aaggcagcca 720 ggccttcctg gtctccatct acaacgagca gggtatccag cagattgggc tggagctggg 780 ccgctctccc gtcttcctct acgaggacca cacggggaag cctggcccgg aagactaccc 840 cctcttccgg ggcatcaacc tgtcagatgg caagtggcac agaattgctc tcagcgtcca 900 caagaaaaat gtcaccttga tcctcgactg taaaaagaag accaccaaat tcctcgaccg 960 cagcgaccac cccatgatcg acatcaatgg catcatcgtg tttggcaccc ggatcctgga 1020 tgaggaggtg tttgagggtg acatccagca gctgctcttt gtctcggacc accgggcagc 1080 ttatgattac tgtgagcact acagccctga ctgtgacacc gcagtacctg acaccccaca 1140 gtcgcaggac cccaatccag atgaatatta cacggaagga gacggcgagg gtgagaccta 1200 ttactacgaa tacccctact acgaagaccc cgaagaccta gggaaggagc ccacccccag 1260 caagaagccc gtggaagctg ccaaagaaac cacagaggtc cccgaggagc tgaccccgac 1320 ccccacggaa gctgctccca tgcctgaaac cagtgaaggg gctgggaagg aagaggacgt 1380 cggcatcggg gactatgact acgtgcccag tgaggactac tacacgccct caccgtatga 1440 tgacctcacc tatggcgagg gggaggagaa ccccgaccag cccacagacc caggcgctgg 1500 ggccgaaatt cccaccagca ccgccgacac ctccaactcc tccaatccag ctccgcctcc 1560 aggggaaggt gcggatgact tggaggggga gttcactgag gaaacgatcc ggaaccttga 1620 cgagaactac tacgacccct actacgaccc caccagctcc ccgtcggaga tcgggccggg 1680 aatgccggcg aaccaggata ccatctatga agggattgga ggacctcggg gcgagaaagg 1740 ccaaaaggga gaaccagcga ttatcgagcc gggcatgctc atcgagggcc cgcctggccc 1800 agaaggcccc gcgggtcttc ccggacctcc aggaaccatg ggtcccactg gccaagtcgg 1860 ggaccctgga gaaaggggcc cccctggacg cccaggcctt cctggggccg atggcctgcc 1920 cggtcctcca ggaaccatgc tcatgctgcc cttccggttt ggaggtggcg gcgatgcggg 1980 ctccaaaggc cccatggtct cagcccagga gtcccaggcg caagccattc tccagcaggc 2040 caggttggca ctgaggggac cagctggccc gatgggtctc acagggagac ctggccctgt 2100 gggtccccct gggagcggag gtttgaaggg cgagccggga gacgtggggc ctcagggtcc 2160 tcgaggtgtg caaggcccgc ctggtccggc cgggaagccc ggaagacggg gtcgggctgg 2220 gagtgatgga gccagaggaa tgcctggaca aactggcccc 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Asp Asp Leu Lys Leu Cys His Ser Ala Lys Gln Ser Gly Glu Tyr Trp 1300 1305 1310 Ile Asp Pro Asn Gln Gly Ser Val Glu Asp Ala Ile Lys Val Tyr Cys 1315 1320 1325 Asn Met Glu Thr Gly Glu Thr Cys Ile Ser Ala Asn Pro Ser Ser Val 1330 1335 1340 Pro Arg Lys Thr Trp Trp Ala Ser Lys Ser Pro Asp Asn Lys Pro Val 1345 1350 1355 1360 Trp Tyr Gly Leu Asp Met Asn Arg Gly Ser Gln Phe Ala Tyr Gly Asp 1365 1370 1375 His Gln Ser Pro Asn Thr Ala Ile Thr Gln Met Thr Phe Leu Arg Leu 1380 1385 1390 Leu Ser Lys Glu Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr Ile Cys Lys Asn Ser 1395 1400 1405 Val Gly Tyr Met Asp Asp Gln Ala Lys Asn Leu Lys Lys Ala Val Val 1410 1415 1420 Leu Lys Gly Ala Asn Asp Leu Asp Ile Lys Ala Glu Gly Asn Ile Arg 1425 1430 1435 1440 Phe Arg Tyr Ile Val Leu Gln Asp Thr Cys Ser Lys Arg Asn Gly Asn 1445 1450 1455 Val Gly Lys Thr Val Phe Glu Tyr Arg Thr Gln Asn Val Ala Arg Leu 1460 1465 1470 Pro Ile Ile Asp Leu Ala Pro Val Asp Val Gly Gly Thr Asp Gln Glu 1475 1480 1485 Phe Gly Val Glu Ile Gly Pro Val Cys Phe Val 1490 1495 <210> 5 <211> 6192 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gcgagtgact gcaccgagcc cgagaagtcg ccgcgccccg cagccgcccc gactggttcc 60 ccgccttgcc cgtgggcccc gccgggatgg ggaaccgccg ggacctgggc cagccgcggg 120 ccggtctctg cctgctcctg gccgcgctgc agcttctgcc ggggacgcag gccgatcctg 180 tggatgtcct gaaggccctg ggtgtgcagg gaggccaggc tggggtcccc gaggggcctg 240 gcttctgtcc ccagaggact ccagagggtg accgggcatt cagaattggc caggccagca 300 cgctcggcat ccccacgtgg gaactctttc cagaaggcca ctttcctgag aacttctcct 360 tgctgatcac cttgcgggga cagccagcca atcagtctgt cctgctgtcc atttatgatg 420 aaaggggtgc ccggcagttg ggcctggcac tggggccagc gctgggtctc ctaggtgacc 480 ccttccgccc cctcccccag caggtcaacc tcacagatgg caggtggcac cgtgtggccg 540 tcagcataga tggtgagatg gtgaccctgg tagctgactg tgaagctcag ccccctgttt 600 tgggccatgg cccccgcttc atcagcatag ctggactcac tgtgctgggg acccaggacc 660 ttggggaaaa gactttcgag ggagacattc aggagctgct gataagccca gatcctcagg 720 ctgccttcca ggcttgtgag cggtacctcc ccgactgtga caacctggca ccggcagcca 780 cagtggctcc ccagggtgaa ccagaaaccc ctcgtcctcg gcggaagggg aagggaaaag 840 ggaggaagaa agggcgaggt cgcaagggga agggcaggaa aaagaacaag gaaatttgga 900 cctcaagtcc acctcctgac tccgcagaga accagacctc cactgacatc cccaagacag 960 agactccagc tccaaatctg cctccgaccc ccacgccttt ggtcgtcacc tccactgtga 1020 ctactggact caatgccacg atcctagaga ggagcttgga ccctgacagt ggaaccgagc 1080 tggggaccct ggagaccaag gcagccaggg aggatgaaga aggagatgat tccaccatgg 1140 gccctgactt ccgggcagca gaatatccat ctcggactca gttccagatc tttcctggtg 1200 ctggagagaa aggagcaaaa ggagagcccg cagtgattga aaaggggcag cagtttgagg 1260 gacctccagg agccccagga ccccaagggg tggttggccc ctcaggccct cccggccccc 1320 caggattccc tggcgaccct ggtccaccgg gccctgctgg cctcccagga atccccggca 1380 ttgatgggat ccgaggccca ccgggcactg tgatcatgat gccgttccag tttgcaggcg 1440 gctcctttaa aggcccccca gtctcattcc agcaggccca ggctcaggca gttctgcagc 1500 agactcagct ctctatgaaa ggcccccctg gtccagtggg gctcactggg cgcccaggcc 1560 ctgtgggtct ccccgggcat ccaggtctga aaggagagga gggagcagaa gggccacagg 1620 gtccccgagg cctgcaggga cctcatggac cccctggccg agtgggcaag atgggccgcc 1680 ctggagcaga tggagctcgg ggcctcccag gggacactgg acctaagggt gatcgtggct 1740 tcgatggcct ccctgggctg cctggtgaga agggccaaag gggtgacttt ggccatgtgg 1800 ggcaacccgg tcccccagga gaggatggtg agaggggagc agagggacct ccagggccca 1860 ctggccaggc tggggagccg ggtccacgag gactgcttgg ccccagaggc tctcctggcc 1920 ccacgggtcg cccgggtgtg actggaattg atggtgctcc tggtgccaaa ggcaatgtgg 1980 gtcctccagg agaaccaggc cctccgggac agcagggaaa ccatgggtcc cagggactcc 2040 ccggtcccca gggactcatt ggcactcctg gggagaaggg tccccctgga aacccaggaa 2100 ttccaggcct cccaggatcc gatggccctc tgggtcaccc aggacatgag ggccccacgg 2160 gagagaaagg ggctcagggt ccaccagggt cggcaggccc tccgggctat cctggacctc 2220 ggggagtgaa gggcacttca ggcaaccggg gcctccaggg ggagaaaggc gagaagggag 2280 aggacggctt cccaggcttc aagggcgatg tggggctcaa aggtgatcag gggaaacccg 2340 gagctccagg tccccgggga gaggatggtc ctgaggggcc gaaggggcag gcggggcagg 2400 ctggcgagga ggggccccca ggctcagctg gggagaaggg caagcttggg gtgccaggcc 2460 tcccaggtta tccaggacgc cctggaccta agggatctat tggatttccc ggtcccctgg 2520 gacccatagg agagaaaggg aagtcgggaa agacagggca gccaggcctg gaaggagagc 2580 ggggaccacc aggttcccgt ggagagaggg ggcaaccggg tgccacaggg caaccaggcc 2640 ccaagggcga tgtgggccag gatggagccc ctgggatccc tggagaaaag ggcctccctg 2700 gtctgcaagg ccctccagga ttccctgggc caaagggccc ccctggtcac caaggtaaag 2760 atgggcgacc agggcaccct ggacagagag gagaactggg cttccaaggt cagacaggcc 2820 cgcctggacc agctggtgtc ttaggccctc agggaaagac aggagaagtg ggacctctag 2880 gtgaaagggg gcctccaggc ccccctggac ctcctggtga acaaggtctt cctggcctgg 2940 aaggcagaga gggggccaag ggggaactgg gaccaccagg accccttggg aaagaagggc 3000 cagctggact caggggcttt cccggcccca aagggggccc tggggacccg ggacctactg 3060 gcttaaaggg tgataagggc cccccagggc ccgtgggggc caatggctcc cctggtgagc 3120 gcggtccttt gggcccagca ggaggcattg gacttcctgg ccaaagtggc agcgaaggcc 3180 ccgttggccc tgcaggcaag aaggggtccc ggggagaacg tggcccccct ggccccactg 3240 gcaaagatgg gatcccaggg cccctggggc ctctgggacc ccctggagct gctgggcctt 3300 ctggcgagga aggggacaag ggggatgtgg gtgcccccgg acacaagggg agtaaaggcg 3360 ataaaggaga cgcgggccca cctggacaac cagggatacg gggtcctgca ggacacccag 3420 gtcccccggg agcagacggg gctcaggggc gccggggacc cccaggcctc tttgggcaga 3480 aaggagatga cggagtcaga ggctttgtgg gggtgattgg ccctcctgga ctgcaggggc 3540 tgccaggccc tccgggagag aaaggggagg tcggagacgt cgggtccatg ggtccccatg 3600 gagctccagg tcctcggggt ccccaaggcc ccactggatc agagggcact ccagggctgc 3660 ctggaggagt tggtcagcca ggcgccgtgg gtgagaaggg tgagcgaggg gacgctggag 3720 acccagggcc tccaggagcc ccaggcatcc cggggcccaa gggagacatt ggtgaaaagg 3780 gggactcagg cccatctgga gctgctggac ccccaggcaa gaaaggtccc cctggagagg 3840 atggagccaa agggagcgtg ggccccacgg ggctgcccgg agatctaggg cccccaggag 3900 accctggagt ttcaggcata gatggttccc caggggagaa gggagaccct ggtgatgttg 3960 ggggaccggg tccgcctgga gcttctgggg agcccggcgc ccccgggccc cccggcaaga 4020 ggggtccttc aggccacatg ggtcgagaag gcagagaagg ggagaaaggt gccaaggggg 4080 agccaggtcc tgatgggccc ccagggagga cgggtccaat gggggctaga gggccccctg 4140 gacgtgtggg gcctgagggt cttcgaggga tccctggccc tgtgggtgaa ccaggcctcc 4200 tgggagcccc tggacagatg ggccctcctg gccccctggg gccctctggc ctcccagggc 4260 tgaagggaga cactggcccc aagggggaaa agggccacat tggattgatc ggtctcattg 4320 gccccccggg agaagctggt gagaaaggag atcaggggtt gccaggcgtg cagggacccc 4380 ctggtcccaa gggagaccct ggtccccctg gtcccattgg ctctctgggc caccctgggc 4440 ccccaggtgt ggcgggccct ctaggacaga aaggctcaaa agggtctccg gggtccatgg 4500 gcccccgtgg agacactgga cctgcaggcc caccaggccc cccgggtgcc cctgccgagc 4560 tgcatgggct gcgcaggcgc cggcgcttcg tcccagtccc gcttccagtc gtggagggcg 4620 gcctggagga ggtgctggcc tcgctcacat cgctgagctt ggagctggag cagctgcggc 4680 gtcctcccgg cactgcggag cgcccgggcc tcgtgtgcca cgagctgcac cgcaaccacc 4740 cgcacctgcc tgatggggaa tactggattg accccaacca gggctgcgcg cgggactcgt 4800 tcagggtttt ttgcaacttc acggcgggag gagagacctg cctctatccc gacaagaagt 4860 ttgagatcgt gaaattggcc tcctggtcca aggaaaagcc tggaggctgg tatagcacat 4920 tccgtcgagg gaagaagttc tcctacgtgg acgccgacgg gtccccagtg aatgtcgtgc 4980 agctgaactt cctgaaactg ctgagtgcca cagctcgcca gaacttcacc tactcctgcc 5040 agaatgcagc tgcctggctg gacgaagcca cgggtgacta cagccactcc gcccgcttcc 5100 ttggcaccaa tggagaggag ctgtctttca accagacgac agcagccact gtcagcgtcc 5160 cccaggatgg ctgccggctc cggaaaggac agacgaagac ccttttcgaa ttcagctctt 5220 ctcgagcggg atttctgccc ctgtgggatg tggcggccac tgactttggc cagacgaacc 5280 aaaagtttgg gtttgaactg ggccccgtct gcttcagcag ctgagagtgt ccggggtggg 5340 agggaccatg agggagcccc agaatggggt gcatttggtg ctgaggcttt gaagccaccg 5400 tatttttcgt tacctgtgac tatggagcca atgggatgtg acttcgctca tcacggacag 5460 tcattccttc tcctttccag ggtgctgggg gctggggttc cctggcccaa gggtccagcc 5520 tcctctcacc ccattccagg tggcatactg cagtctggct ctttctcccc tccctcccca 5580 cccaagcctc acctccccac cccttgaacc cccatgcaat gagcttctaa ctcagagctg 5640 atgaacaaaa gcccccccac ccccaatgcc tgcctcctca ctcctccgtc gctgcccttc 5700 acaccttttg gtgctacccc tccccagagt taagcactgg atgtctcctg atcccaggct 5760 gggaccccta cccccacccc ctttgatcct ttctacttcc acggtgaaag gactgaggtc 5820 ggactacaga gggaagaggg acttcccttg actgggttgt gtttcttttc ctgcctcagc 5880 ccagctctgc aaatcccctc cccctgcccc ccacctcccc aggctcacct tgccatgcca 5940 ggtggtttgg ggaccaagat gttggggggg tgaatcagga tcctaatggt gctgccctat 6000 ttatacctgg gtctgtatta aaagggaaag tcccccctgt tgtagatttc atctgcttcc 6060 tccttaggga aggctgggat atgatgagag attccagccc aagcctggcc ccccaccgcc 6120 aggccatagg gcataatttg catctcaaat ctgagaataa actgatgaac tgtgaaaaaa 6180 aaaaaaaaaa aa 6192 <210> 6 <211> 1745 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Gly Asn Arg Arg Asp Leu Gly Gln Pro Arg Ala Gly Leu Cys Leu 1 5 10 15 Leu Leu Ala Ala Leu Gln Leu Leu Pro Gly Thr Gln Ala Asp Pro Val 20 25 30 Asp Val Leu Lys Ala Leu Gly Val Gln Gly Gly Gln Ala Gly Val Pro 35 40 45 Glu Gly Pro Gly Phe Cys Pro Gln Arg Thr Pro Glu Gly Asp Arg Ala 50 55 60 Phe Arg Ile Gly Gln Ala Ser Thr Leu Gly Ile Pro Thr Trp Glu Leu 65 70 75 80 Phe Pro Glu Gly His Phe Pro Glu Asn Phe Ser Leu Leu Ile Thr Leu 85 90 95 Arg Gly Gln Pro Ala Asn Gln Ser Val Leu Leu Ser Ile Tyr Asp Glu 100 105 110 Arg Gly Ala Arg Gln Leu Gly Leu Ala Leu Gly Pro Ala Leu Gly Leu 115 120 125 Leu Gly Asp Pro Phe Arg Pro Leu Pro Gln Gln Val Asn Leu Thr Asp 130 135 140 Gly Arg Trp His Arg Val Ala Val Ser Ile Asp Gly Glu Met Val Thr 145 150 155 160 Leu Val Ala Asp Cys Glu Ala Gln Pro Pro Val Leu Gly His Gly Pro 165 170 175 Arg Phe Ile Ser Ile Ala Gly Leu Thr Val Leu Gly Thr Gln Asp Leu 180 185 190 Gly Glu Lys Thr Phe Glu Gly Asp Ile Gln Glu Leu Leu Ile Ser Pro 195 200 205 Asp Pro Gln Ala Ala Phe Gln Ala Cys Glu Arg Tyr Leu Pro Asp Cys 210 215 220 Asp Asn Leu Ala Pro Ala Ala Thr Val Ala Pro Gln Gly Glu Pro Glu 225 230 235 240 Thr Pro Arg Pro Arg Arg Lys Gly Lys Gly Lys Gly Arg Lys Lys Gly 245 250 255 Arg Gly Arg Lys Gly Lys Gly Arg Lys Lys Asn Lys Glu Ile Trp Thr 260 265 270 Ser Ser Pro Pro Pro Asp Ser Ala Glu Asn Gln Thr Ser Thr Asp Ile 275 280 285 Pro Lys Thr Glu Thr Pro Ala Pro Asn Leu Pro Pro Thr Pro Thr Pro 290 295 300 Leu Val Val Thr Ser Thr Val Thr Thr Gly Leu Asn Ala Thr Ile Leu 305 310 315 320 Glu Arg Ser Leu Asp Pro Asp Ser Gly Thr Glu Leu Gly Thr Leu Glu 325 330 335 Thr Lys Ala Ala Arg Glu Asp Glu Glu Gly Asp Asp Ser Thr Met Gly 340 345 350 Pro Asp Phe Arg Ala Ala Glu Tyr Pro Ser Arg Thr Gln Phe Gln Ile 355 360 365 Phe Pro Gly Ala Gly Glu Lys Gly Ala Lys Gly Glu Pro Ala Val Ile 370 375 380 Glu Lys Gly Gln Gln Phe Glu Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Gln 385 390 395 400 Gly Val Val Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Phe Pro Gly 405 410 415 Asp Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Leu Pro Gly Ile Pro Gly Ile 420 425 430 Asp Gly Ile Arg Gly Pro Pro Gly Thr Val Ile Met Met Pro Phe Gln 435 440 445 Phe Ala Gly Gly Ser Phe Lys Gly Pro Pro Val Ser Phe Gln Gln Ala 450 455 460 Gln Ala Gln Ala Val Leu Gln Gln Thr Gln Leu Ser Met Lys Gly Pro 465 470 475 480 Pro Gly Pro Val Gly Leu Thr Gly Arg Pro Gly Pro Val Gly Leu Pro 485 490 495 Gly His Pro Gly Leu Lys Gly Glu Glu Gly Ala Glu Gly Pro Gln Gly 500 505 510 Pro Arg Gly Leu Gln Gly Pro His Gly Pro Pro Gly Arg Val Gly Lys 515 520 525 Met Gly Arg Pro Gly Ala Asp Gly Ala Arg Gly Leu Pro Gly Asp Thr 530 535 540 Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Phe Asp Gly Leu Pro Gly Leu Pro Gly 545 550 555 560 Glu Lys Gly Gln Arg Gly Asp Phe Gly His Val Gly Gln Pro Gly Pro 565 570 575 Pro Gly Glu Asp Gly Glu Arg Gly Ala Glu Gly Pro Pro Gly Pro Thr 580 585 590 Gly Gln Ala Gly Glu Pro Gly Pro Arg Gly Leu Leu Gly Pro Arg Gly 595 600 605 Ser Pro Gly Pro Thr Gly Arg Pro Gly Val Thr Gly Ile Asp Gly Ala 610 615 620 Pro Gly Ala Lys Gly Asn Val Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly Pro Pro 625 630 635 640 Gly Gln Gln Gly Asn His Gly Ser Gln Gly Leu Pro Gly Pro Gln Gly 645 650 655 Leu Ile Gly Thr Pro Gly Glu Lys Gly Pro Pro Gly Asn Pro Gly Ile 660 665 670 Pro Gly Leu Pro Gly Ser Asp Gly Pro Leu Gly His Pro Gly His Glu 675 680 685 Gly Pro Thr Gly Glu Lys Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly 690 695 700 Pro Pro Gly Tyr Pro Gly Pro Arg Gly Val Lys Gly Thr Ser Gly Asn 705 710 715 720 Arg Gly Leu Gln Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Asp Gly Phe Pro 725 730 735 Gly Phe Lys Gly Asp Val Gly Leu Lys Gly Asp Gln Gly Lys Pro Gly 740 745 750 Ala Pro Gly Pro Arg Gly Glu Asp Gly Pro Glu Gly Pro Lys Gly Gln 755 760 765 Ala Gly Gln Ala Gly Glu Glu Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Glu Lys 770 775 780 Gly Lys Leu Gly Val Pro Gly Leu Pro Gly Tyr Pro Gly Arg Pro Gly 785 790 795 800 Pro Lys Gly Ser Ile Gly Phe Pro Gly Pro Leu Gly Pro Ile Gly Glu 805 810 815 Lys Gly Lys Ser Gly Lys Thr Gly Gln Pro Gly Leu Glu Gly Glu Arg 820 825 830 Gly Pro Pro Gly Ser Arg Gly Glu Arg Gly Gln Pro Gly Ala Thr Gly 835 840 845 Gln Pro Gly Pro Lys Gly Asp Val Gly Gln Asp Gly Ala Pro Gly Ile 850 855 860 Pro Gly Glu Lys Gly Leu Pro Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Phe Pro 865 870 875 880 Gly Pro Lys Gly Pro Pro Gly His Gln Gly Lys Asp Gly Arg Pro Gly 885 890 895 His Pro Gly Gln Arg Gly Glu Leu Gly Phe Gln Gly Gln Thr Gly Pro 900 905 910 Pro Gly Pro Ala Gly Val Leu Gly Pro Gln Gly Lys Thr Gly Glu Val 915 920 925 Gly Pro Leu Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly 930 935 940 Glu Gln Gly Leu Pro Gly Leu Glu Gly Arg Glu Gly Ala Lys Gly Glu 945 950 955 960 Leu Gly Pro Pro Gly Pro Leu Gly Lys Glu Gly Pro Ala Gly Leu Arg 965 970 975 Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Gly Pro Gly Asp Pro Gly Pro Thr Gly 980 985 990 Leu Lys Gly Asp Lys Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly Ala Asn Gly Ser 995 1000 1005 Pro Gly Glu Arg Gly Pro Leu Gly Pro Ala Gly Gly Ile Gly Leu Pro 1010 1015 1020 Gly Gln Ser Gly Ser Glu Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Lys Lys Gly 1025 1030 1035 1040 Ser Arg Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Lys Asp Gly Ile 1045 1050 1055 Pro Gly Pro Leu Gly Pro Leu Gly Pro Pro Gly Ala Ala Gly Pro Ser 1060 1065 1070 Gly Glu Glu Gly Asp Lys Gly Asp Val Gly Ala Pro Gly His Lys Gly 1075 1080 1085 Ser Lys Gly Asp Lys Gly Asp Ala Gly Pro Pro Gly Gln Pro Gly Ile 1090 1095 1100 Arg Gly Pro Ala Gly His Pro Gly Pro Pro Gly Ala Asp Gly Ala Gln 1105 1110 1115 1120 Gly Arg Arg Gly Pro Pro Gly Leu Phe Gly Gln Lys Gly Asp Asp Gly 1125 1130 1135 Val Arg Gly Phe Val Gly Val Ile Gly Pro Pro Gly Leu Gln Gly Leu 1140 1145 1150 Pro Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly Glu Val Gly Asp Val Gly Ser Met 1155 1160 1165 Gly Pro His Gly Ala Pro Gly Pro Arg Gly Pro Gln Gly Pro Thr Gly 1170 1175 1180 Ser Glu Gly Thr Pro Gly Leu Pro Gly Gly Val Gly Gln Pro Gly Ala 1185 1190 1195 1200 Val Gly Glu Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Asp Pro Gly Pro Pro 1205 1210 1215 Gly Ala Pro Gly Ile Pro Gly Pro Lys Gly Asp Ile Gly Glu Lys Gly 1220 1225 1230 Asp Ser Gly Pro Ser Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Lys Lys Gly Pro 1235 1240 1245 Pro Gly Glu Asp Gly Ala Lys Gly Ser Val Gly Pro Thr Gly Leu Pro 1250 1255 1260 Gly Asp Leu Gly Pro Pro Gly Asp Pro Gly Val Ser Gly Ile Asp Gly 1265 1270 1275 1280 Ser Pro Gly Glu Lys Gly Asp Pro Gly Asp Val Gly Gly Pro Gly Pro 1285 1290 1295 Pro Gly Ala Ser Gly Glu Pro Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Lys Arg 1300 1305 1310 Gly Pro Ser Gly His Met Gly Arg Glu Gly Arg Glu Gly Glu Lys Gly 1315 1320 1325 Ala Lys Gly Glu Pro Gly Pro Asp Gly Pro Pro Gly Arg Thr Gly Pro 1330 1335 1340 Met Gly Ala Arg Gly Pro Pro Gly Arg Val Gly Pro Glu Gly Leu Arg 1345 1350 1355 1360 Gly Ile Pro Gly Pro Val Gly Glu Pro Gly Leu Leu Gly Ala Pro Gly 1365 1370 1375 Gln Met Gly Pro Pro Gly Pro Leu Gly Pro Ser Gly Leu Pro Gly Leu 1380 1385 1390 Lys Gly Asp Thr Gly Pro Lys Gly Glu Lys Gly His Ile Gly Leu Ile 1395 1400 1405 Gly Leu Ile Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly Glu Lys Gly Asp Gln Gly 1410 1415 1420 Leu Pro Gly Val Gln Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asp Pro Gly Pro 1425 1430 1435 1440 Pro Gly Pro Ile Gly Ser Leu Gly His Pro Gly Pro Pro Gly Val Ala 1445 1450 1455 Gly Pro Leu Gly Gln Lys Gly Ser Lys Gly Ser Pro Gly Ser Met Gly 1460 1465 1470 Pro Arg Gly Asp Thr Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala 1475 1480 1485 Pro Ala Glu Leu His Gly Leu Arg Arg Arg Arg Arg Phe Val Pro Val 1490 1495 1500 Pro Leu Pro Val Val Glu Gly Gly Leu Glu Glu Val Leu Ala Ser Leu 1505 1510 1515 1520 Thr Ser Leu Ser Leu Glu Leu Glu Gln Leu Arg Arg Pro Pro Gly Thr 1525 1530 1535 Ala Glu Arg Pro Gly Leu Val Cys His Glu Leu His Arg Asn His Pro 1540 1545 1550 His Leu Pro Asp Gly Glu Tyr Trp Ile Asp Pro Asn Gln Gly Cys Ala 1555 1560 1565 Arg Asp Ser Phe Arg Val Phe Cys Asn Phe Thr Ala Gly Gly Glu Thr 1570 1575 1580 Cys Leu Tyr Pro Asp Lys Lys Phe Glu Ile Val Lys Leu Ala Ser Trp 1585 1590 1595 1600 Ser Lys Glu Lys Pro Gly Gly Trp Tyr Ser Thr Phe Arg Arg Gly Lys 1605 1610 1615 Lys Phe Ser Tyr Val Asp Ala Asp Gly Ser Pro Val Asn Val Val Gln 1620 1625 1630 Leu Asn Phe Leu Lys Leu Leu Ser Ala Thr Ala Arg Gln Asn Phe Thr 1635 1640 1645 Tyr Ser Cys Gln Asn Ala Ala Ala Trp Leu Asp Glu Ala Thr Gly Asp 1650 1655 1660 Tyr Ser His Ser Ala Arg Phe Leu Gly Thr Asn Gly Glu Glu Leu Ser 1665 1670 1675 1680 Phe Asn Gln Thr Thr Ala Ala Thr Val Ser Val Pro Gln Asp Gly Cys 1685 1690 1695 Arg Leu Arg Lys Gly Gln Thr Lys Thr Leu Phe Glu Phe Ser Ser Ser 1700 1705 1710 Arg Ala Gly Phe Leu Pro Leu Trp Asp Val Ala Ala Thr Asp Phe Gly 1715 1720 1725 Gln Thr Asn Gln Lys Phe Gly Phe Glu Leu Gly Pro Val Cys Phe Ser 1730 1735 1740 Ser 174

Claims (11)

1. 환자로부터의 혈액 샘플의 적어도 일부분을 콜라겐 V 또는 그의 항원성 단편과 접촉시키고;
   콜라겐 V 또는 그의 항원성 단편에 결합하는 항체의 레벨을 측정하는 단계를 포함하며,
   여기서 콜라겐 V에 특이적으로 결합하는 항체의 존재는 COPD 또는 천식 환자가 콜라겐 V 관용 요법으로부터 효과가 있다는 것을 나타내는, COPD 또는 천식 환자를 콜라겐 V 관용 요법을 위한 지원자로서 확인하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 콜라겐 V 또는 그의 항원성 단편이 비이드(bead)에 접합되는 것인, 방법.
3. 제1항에 있어서, 측정이
   콜라겐 V 또는 그의 항원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 형광 표지된 항-IgG 항체와 접촉시키고; 및
   흐름 세포측정기(flow cytometry)에 의하여 콜라겐 V에 결합하는 항체에 결합된 형광 표지된 항-IgG 항체의 양을 검출하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
4. 개체로부터의 혈액 샘플의 적어도 일부분을 콜라겐 V 또는 그의 항원성 단편과 접촉시키고; 및
   콜라겐 V 또는 그의 항원성 단편에 결합하는 항체의 레벨을 측정하는 단계를 포함하며,
   여기서 콜라겐 V에 특이적으로 결합하는 항체의 존재가, 콜라겐 V에 결합하는 항체를 갖지 않는 개체에 예상되는 것보다 위험이 더 큰 것과 관련되어 있는, COPD 또는 천식이 발병할 위험이 있는 개체를 확인하는 방법.
5. 제4항에 있어서, 콜라겐 V 또는 그의 항원성 단편이 비이드(bead)에 접합되는 것인, 방법.
6. 제4항에 있어서, 측정이
   콜라겐 V 또는 그의 항원성 단편에 결합하는 항체를 형광 표지된 항-IgG 항체와 접촉시키고;
   흐름세포측정기(flow cytometry)에 의하여 콜라겐 V에 결합하는 항체에 결합된 형광 표지된 항-IgG 항체의 양을 검출하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
7. 제3항 또는 제6항에 있어서, 항-IgG 항체가 모든 IgG 서브타입을 검출하는 것인, 방법.
8. 제3항 또는 제6항에 있어서, 항-IgG 항체가 IgG1 서브타입을 특이적으로 검출하는 것인, 방법.
9. 제3항 또는 제6항에 있어서, 항-IgG 항체가 IgG2 서브타입을 특이적으로 검출하는 것인, 방법.
10. 제3항 또는 제6항에 있어서, 항-IgG 항체가 IgG3 서브타입을 특이적으로 검출하는 것인, 방법.
11. 제3항 또는 제6항에 있어서, 항-IgG 항체가 IgG4 서브타입을 특이적으로 검출하는 것인, 방법.
    

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