CN107243076A - 用于治疗慢性阻塞性肺病和哮喘的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于治疗或预防包括COPD和哮喘在内的肺病的化合物和方法。具体而言，本发明提供了用于治疗COPD和哮喘的包含V型胶原或其耐受片段的化合物。

Description

用于治疗慢性阻塞性肺病和哮喘的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.119(e)要求于2009年4月22日提交的美国临时专利申请第61/171,705号和于2009年12月2日提交的美国临时专利申请第61/266,048号的权益，通过引用将两篇专利申请全文并入本文。
关于序列表的声明
以文本格式代替纸质版提供本申请相关的序列表，并且在此通过引用并入本说明书。包含序列表的文本文件命名为480266_404PC_SEQUENCE_LISTING.txt。该文本文件为67KB，创建于2010年4月22日，并且在提交本说明书同时，通过EFS-Web以电子方式提交了该文本文件。
发明背景
发明领域
本发明涉及用于治疗慢性阻塞性肺病(COPD)和哮喘的方法，具体而言，本发明涉及通过给予V型胶原(colV)或其耐受原性片段来治疗COPD和哮喘。
相关技术的描述
慢性阻塞性肺病(COPD)是一类其中气道变窄的肺部疾病。这导致进出肺部的气流受限，引起气短。与哮喘不同，气流受限可逆性较差，并通常随时间持续恶化。COPD也被称为慢性阻塞性肺部疾病(COLD)、慢性阻塞性气道疾病(COAD)、慢性气流通气受限(CAL)和慢性阻塞性呼吸道疾病。术语“COPD”包括两种主要的疾病状态—肺气肿和慢性阻塞性支气管炎。
肺气肿中，很多肺泡之间的壁被损伤，导致它们丧失其形状并变得松软。这种损伤还能破坏肺泡壁，导致更少和更大的肺泡替代很多微小的肺泡。
慢性阻塞性支气管炎中，气道内壁时常发炎和红肿。这导致内壁增厚。在气道中形成很多厚的黏液，使其呼吸艰难。
大多数患有COPD的人既患肺气肿又患慢性阻塞性支气管炎。因此，通用术语“COPD”是更精确的。
慢性支气管炎和肺气肿最常由吸烟引起；大约90％患有COPD的患者目前或者过去是吸烟者。尽管大约50％的吸烟者发展为慢性支气管炎，但是仅有15％的吸烟者发展为不可逆的气道阻塞。某些其它哺乳动物，尤其是马同样会患COPD。
与COPD相关的气道阻塞是进行性的，可以伴随气道高反应性，并且可以是部分可逆的。非特异的气道高反应还可能在COPD的发展中起作用，并且可以预示吸烟者肺部功能的衰退速率加速。
COPD是死亡和伤残的主要原因。当前其是美国和欧洲的第四大死亡原因。治疗方针倡导早期检测并执行戒烟行动以帮助降低由该疾病导致的发病率和死亡率。然而，由于诸多原因，早期检测和诊断很难。
COPD的发展需要花费数年，并且吸烟者通常否认由吸烟引起的任何有害效应，将呼吸困难增强的早期警告信号归因于年龄信号。同样，支气管炎的急性发作通常不被全科医生认为是COPD的早期信号。很多患者表现出多于一种疾病(例如，慢性支气管炎或哮喘性支气管炎)的特征，使得精确诊断成为一种挑战，尤其是在早期疾病时。同样，很多患者并不寻求医疗帮助，直到他们遭受更严重的与肺功能减弱相关的症状时，例如呼吸困难、持续咳嗽和产生痰。因此，绝大多数患者没有被诊断或治疗直到他们处于更晚期的疾病阶段时。
哮喘是折磨数百万人群的气道异质性障碍。气道炎症、高反应性和梗阻可以表征该疾病状态。该疾病通常引起支气管平滑肌系统的痉挛，并且影响上呼吸道和下呼吸道。有数种形式的哮喘，特征为严重程度不同。例如，轻度哮喘被界定为哮鸣的短暂发作，具有或不具有呼吸困难或咳嗽。中度哮喘被界定为哮鸣和呼吸困难，并且可以具有或不具有咳嗽和咳痰，但是通常会干扰日常活动和/或睡眠。重度哮喘的特征为由于呼吸困难导致能力丧失，并且受影响的患者通常无法正常进食或睡眠，极其焦虑并且经常会疲惫不堪。被称为哮喘持续状态的疾病状态是最严重的哮喘形式，通常需要加强住院治疗，并且甚至会致命。该疾病的发生可能是由于过敏性和非过敏性两种机制。
尽管有数种可用来缓解与哮喘相关的症状和不适的治疗，但是都没有治愈。此外，目前的治疗通常会引起副作用，使不适加重并发生其他致人虚弱的疾病状态。轻度哮喘通常用β-肾上腺素药以及抗组胺药来治疗，尤其对于儿童而言，从而预防或抑制间歇性发作。中度和重度哮喘通常用肾上腺素药剂和支气管扩张药以及皮质类固醇来治疗。由抗哮喘性药剂导致的其它作用限制了它们的广泛应用，所述其它影响包括头痛、疲劳、口干、神经质以及某些情况下的成瘾和物质滥用。理解哮喘的发病机理和治疗的最新进展在Am JRespir Crit Care Med.2008May 15；177(10):1068-73中更全面地讨论。
由于哮喘在儿童和成年人中如此普遍，因此一直需要能治疗这种疾病或至少能缓解这种疾病所伴随的症状而不会引起不需要的副作用的药剂。同样，一直需要用于治疗COPD的组合物和方法。本发明提供了用于治疗COPD和哮喘的组合物和方法以及详细描述中所描述的其它优势。
发明概述
本发明一方面提供了治疗慢性阻塞性肺病的方法，包括给予COPD患者治疗有效量的V型胶原或其耐受原性片段。在本文所述方法的一个实施方案中，COPD患者患有肺气肿和/或慢性阻塞性支气管炎。在本发明的另一实施方案中，V型胶原或其耐受原性片段通过口服给药，并且可以以0.1mg-0.5mg的剂量给药。在另一实施方案中，V型胶原或其耐受原性片段通过静脉内给药、通过肺内灌注给药、通过吸入给药或通过肌内给药。在某些实施方案中，还可以使用不同途径的组合。在本发明的另一实施方案中，所述方法还包括给予COPD患者支气管扩张药、皮质类固醇或用于COPD的其它已知治疗。
本发明另一方面提供了治疗哮喘的方法，包括给予哮喘患者治疗有效量的V型胶原或其耐受原性片段。在所述方法的一个实施方案中，V型胶原或其耐受原性片段通过口服给药，并且可以以0.1mg-0.5mg的剂量给药。在其它实施方案中，V型胶原或其耐受原性片段通过静脉内给药、通过肺内灌注给药、通过吸入给药或通过肌内给药。在另一实施方案中，所述方法还包括给予哮喘患者皮质类固醇、支气管扩张药和/或白三烯调节剂或用于哮喘的其它已知治疗。
本发明另一方面提供了在有发展成慢性阻塞性肺病风险的个体中预防慢性阻塞性肺病的发展的方法，包括给予所述个体治疗有效量的V型胶原或其耐受原性片段。在一个实施方案中，V型胶原或其耐受原性片段通过口服给药，并且可以以0.1mg-0.5mg的剂量给药。在其它实施方案中，V型胶原或其耐受原性片段通过静脉内给药、通过肺内灌注给药、通过吸入给药或通过肌内给药，并且可以通过这些途径的组合来给药。
本发明另一方面提供了在有发展成哮喘风险的个体中预防哮喘的发展和恶化的方法，包括给予所述个体治疗有效量的V型胶原或其耐受原性片段。在一个实施方案中，V型胶原或其耐受原性片段通过口服给药，并且在某些实施方案中，可以以0.1mg-0.5mg的剂量给药。在另一实施方案中，V型胶原或其耐受原性片段通过静脉内给药、通过肺内灌注给药、通过吸入给药、通过肌内给药或通过这些途径中一种或多种的组合来给药。
本发明一方面提供了将COPD或哮喘患者鉴定为用于V型胶原耐受疗法的候选者的方法，包括将来自所述患者的血液样品的至少一部分与V型胶原或其抗原性片段接触；以及测量与V型胶原或其抗原性片段结合的抗体的水平(即测量V型胶原特异性抗体的水平)；其中与V型胶原结合的抗体的存在指示COPD或哮喘。在这方面中，V型胶原特异性抗体的水平可以与本文所述的其它临床因素联合用于诊断COPD和哮喘。在一个实施方案中，将V型胶原或其抗原性片段结合于珠子上。在另一实施方案中，所述测量包括将与V型胶原或其抗原性片段结合的抗体与荧光标记的抗IgG抗体接触；以及通过流式细胞术检测与结合于V型胶原上的抗体结合的荧光标记的抗IgG抗体的量。
本发明另一方面提供了鉴定有发展成COPD或哮喘风险的个体的方法，包括：将来自所述个体的血液样品的至少一部分与V型胶原或其抗原性片段接触；以及测量与V型胶原或其抗原性片段结合的抗体的水平(即测量V型胶原特异性抗体的水平)；其中与V型胶原结合的抗体的存在与更高的风险相关，所述更高的风险比在没有与V型胶原结合的抗体的个体中所预期的风险更高。在一个实施方案中，将V型胶原或其抗原性片段结合于珠子上。在另一实施方案中，所述测量包括将与V型胶原或其抗原性片段结合的抗体与荧光标记的抗IgG抗体接触；以及通过流式细胞术检测与结合于V型胶原上的抗体结合的荧光标记的抗IgG抗体的量。
在诊断或测量发展成COPD或哮喘的风险的方法的某些实施方案中，所述方法中所用的抗IgG抗体检测所有IgG亚型。在其它实施方案中，所述抗IgG抗体特异性地检测IgG1亚型、或IgG2亚型、或IgG3亚型或IgG4亚型。在这方面中，在疾病进展中可能发生一种亚型至另一种亚型的转变，并且这可能指示疾病的恶化。因此，一种亚型随时间增加可能指示疾病的恶化。
本发明另一方面提供了监测个体中COPD或哮喘进展的方法，包括将来自所述个体的第一血液样品的至少一部分与V型胶原或其抗原性片段接触；测量第一血液样品中与V型胶原或其抗原性片段结合的抗体的水平；将在较晚时间点采自所述个体的第二血液样品的至少一部分与V型胶原或其抗原性片段接触；测量第二血液样品中与V型胶原或其抗原性片段结合的抗体的水平；以及将第二血液样品中与V型胶原或其抗原性片段结合的抗体的水平与第一血液样品中与V型胶原或其抗原性片段结合的抗体的水平进行比较；其中与第一样品相比，第二样品中与V型胶原结合的抗体的水平增加指示COPD或哮喘在恶化，并且与第一样品相比，第二样品中与V型胶原结合的抗体的水平降低指示COPD或哮喘的改善。COPD和哮喘的其它临床指征可以与本文所提供的方法联合使用。在某些实施方案中，特定IgG亚型(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的抗V型胶原抗体的增加指示COPD或哮喘的进展。在某些实施方案中，将V型胶原或其抗原性片段结合于珠子上。在另一实施方案中，所述测量包括将与V型胶原或其抗原性片段结合的抗体与荧光标记的抗IgG抗体接触；以及通过流式细胞术检测与结合于V型胶原上的抗体结合的荧光标记的抗IgG抗体的量。在用于监测进展的方法的某些实施方案中，所述抗IgG抗体检测所有IgG亚型。在其它实施方案中，所述抗IgG抗体特异性地检测IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型。
结合以下详细描述和附图，本发明的这些方面和其它方面将变得明显。
附图简要说明
图1是显示COPD患者中抗V型胶原抗体升高的柱形图。
图2是显示哮喘患者中抗V型胶原抗体升高的柱形图。
图3显示在静脉内给予V型胶原之后，对小鼠中卵白蛋白诱导的气道高反应的预防。除了col V(每个数据点n＝2-5)之外所有组中的n＝5。
图4A-4E是显示通过静脉内给予col(v)而在肺单核细胞中诱导IFN-γ转录本的柱形图。进行定量PCR来显示IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ和IL-10细胞因子。只有Col(V)IV在肺单核细胞中诱导IFN-γ转录本。数据表示从每组5只小鼠合并的肺单核细胞的RNA。
发明的详细描述
V型胶原
胶原蛋白是主要由羟脯氨酸(Hyp)、甘氨酸(Gly)和脯氨酸(Pro)组成的重复氨基酸序列所形成的多肽链。胶原是人体中所见的最丰富的蛋白之一，在正常(非受伤)皮肤组织的真皮层中包含约80-85％的细胞外基质(ECM)。
基于序列同一性和功能，将胶原分成数种类型。I型、II型和III型胶原分子构成大多数动物细胞外结构的主要纤维。I型形成约90％的身体胶原，并且是骨、皮肤和腱的主要成分。II型构成软骨的主要纤维。胶原纤维以刚性板状排列于骨中，以平行束状排列于腱中，并以致密网状排列于软骨中。I型和较少量的III型构成腱和皮肤。IV型胶原分子构成存在于基膜中的非常纤细、平滑的纤维。V型胶原(colV)是存在于肺中的小胶原(Madri andFurthmayr,Human Pathology,11:353-366,1980)，并且位于细支气管周的结缔组织(Madriand Furthmayr,Am.J.Pathol.,94:323-332,1979)、肺泡间质组织(Konomi et al.,1984)和毛细血管基膜(Madri and Furthmayr,1979,同上)中。已知的其它胶原类型超过12种，但是还没有得到很好的表征。
胶原多肽链的特征为由重复甘氨酸-X-Y三联体和球状N-末端和C-末端结构域构成核心螺旋结构域。三条这样的链以超螺旋彼此环绕，从而产生单个绳子样的胶原分子。
以前的工作已经表明，对colV的自身免疫性与慢性同种移植异常(包括闭塞性细支气管炎、闭塞性细支气管炎综合征(BOS))、肺同种移植排斥和具有患IPF的风险相关(参见例如，美国专利7,348,005和WO 2007/120947)。此外，这项工作表明colV的给予能诱导对同种抗原和colV的耐受(参见例如，WO 2007/120947；图10)。然而，在本发明之前，在哮喘或COPD中没有表明colV与自身免疫性的关联。事实上，以前的发现表明，患COPD的患者没有抗col(V)的DTH应答，这显著不同于没有患已知肺病的正常个体中所见的情况(参见WO 2007/120947,实施例2；图3)。因此，本发明是意料不到的，在于尽管以前观察到患COPD的患者与正常对照相比没有升高的抗colV的DTH应答，但是目前已经发现，COPD患者具有升高的抗colV抗体(参见例如，实施例1、图1)。
因此，本发明涉及在COPD和哮喘患者中或有发展成这些疾病风险的个体中诱导对colV的耐受。
ColV多核苷酸和多肽序列是本领域技术人员已知的，且可在公共数据库获得。本发明的示例性colV多核苷酸和多肽包括但不限于，智人胶原，V型，α1(COL5A1)，mRNA NCBI参照序列：NM_000093.3GI:89276750版本(SEQ ID NO:1)；α1V型胶原前蛋白原[智人]：登录号NP_000084，GI:89276751版本(SEQ ID NO:2)；智人胶原，V型，α2(COL5A2)，mRNA，登录号NM_000393，GI:89363016版本(SEQ ID NO:3)；α2V型胶原前蛋白原[智人]，登录号NP_000384，GI:89363017版本(SEQ ID NO:4)；智人胶原，V型，α3(COL5A3)，mRNA，登录号NM_015719、NM_015719.3，GI:110735434(SEQ ID NO:5)；胶原，V型，α3前蛋白原[智人]，登录号NP_056534，NP_056534.2版本，GI:110735435(SEQ ID NO:6)。
如本领域技术人员所认识到的，前原胶原在细胞中被加工成原胶原，该原胶原从细胞输出并最终形成胶原原纤维和纤维。因此，本发明明确考虑原胶原和本文所述的已加工的或成熟形式的胶原蛋白。在这方面中，例如，SEQ ID NO:4的氨基酸1-26对应于信号肽，其在加工期间被切割，氨基酸27-1229是胶原α-2(V)链，且氨基酸1230-1499对应于c-末端前肽。本文具体公开的序列中的这些位置可被本领域技术人员识别，并且可通过其中提供序列批注的各种公共数据库获取。还应当注意，胶原蛋白的某些氨基酸在加工期间被修饰(例如，脯氨酸成为羟脯氨酸)。成熟的、修饰形式的V型胶原链，尤其是α-2链是本文明确考虑的。如其它地方所指出的，本发明中所用的V型胶原及其α链可以从多种来源纯化或重组产生。
本文所用的术语“多肽”以其常规含义使用，即作为氨基酸的序列。多肽并不限制于特定长度的产物，因此，多肽定义包括肽、寡肽和蛋白，并且这类术语本文可互换使用，除非明确指出不是这样。该术语还不指或排除多肽的表达后修饰，例如，天然存在的或非天然存在的糖基化、乙酰化、磷酸化等以及领域内已知的其它修饰。多肽可以是整个蛋白或其子序列。本发明背景下的特定目的多肽是包含耐受原性片段的氨基酸子序列。
另一方面，本发明提供了这样的多肽片段，该多肽片段包含本文所示的胶原多肽组合物的至少约5、10、15、20、25、50或100个连续氨基酸或更多，包括所有中间长度，所述胶原多肽组合物例如SEQ ID NO:2、4或6所示的那些或SEQ ID NO:1、3或5序列中所示的多核苷酸序列所编码的那些。
另一方面，本发明提供了本文所述的多肽组合物的变体。本发明通常包括的多肽变体沿其长度与本文所示的多肽序列通常表现出至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的同一性(按下述确定)。
在一个实施方案中，本发明提供的多肽片段和变体是本文所述的免疫学上耐受原性的。
本文所用的术语多肽“变体”是通过一个或多个取代、缺失、添加和/或插入而通常不同于本文具体公开的多肽的多肽。这类变体可以是天然存在的或可以是合成产生的，例如通过修饰一个或多个本发明的上述多肽序列，并按本文所述评价它们的耐受原活性和/或利用领域内公知的任何技术。
在很多情况下，变体含有保守型取代。“保守型取代”是指氨基酸被具有相似性质的另一个氨基酸所取代，使得肽化学领域内的技术人员可预料到该多肽的二级结构和亲水性基本未改变。可以在本发明的多核苷酸和多肽结构中进行修饰，并仍能获得编码具有期望特性(例如，具有耐受原性特性)的变体或衍生多肽的功能性分子。当希望改变多肽的氨基酸序列来产生等同的甚至改进的本发明多肽的耐受原性变体或部分时，本领域技术人员通常按照表1改变编码DNA序列的一个或多个密码子。
例如，在蛋白结构中，某些氨基酸可以被其他的氨基酸取代，而不会造成与诸如抗体的抗原结合区或基底分子的结合位点的结构的相互结合能力的明显损失。由于是蛋白的相互作用能力和性质限定了该蛋白的生物学功能活性，因此可以在蛋白序列中进行某些氨基酸序列的取代，以及当然也可在其基础DNA编码序列中进行取代，并仍可获得具有相似性质的蛋白。因而已考虑到，可以在所公开的组合物的肽序列或编码所述肽的相应DNA序列中进行各种改变，而不会造成它们的耐受原性功效或活性的明显损失。
表1
在进行这些改变时，应当考虑氨基酸的亲水指数。本领域内普遍理解亲水氨基酸指数在赋予蛋白相互作用的生物学功能中的重要性(Kyte and Doolittle,1982，通过引用并入本文)。已接受氨基酸的相对亲水特性与得到的蛋白的二级结构有关，而该二级结构随之限定了该蛋白与诸如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等其它分子的相互作用。基于氨基酸的疏水性和电荷特性，每种氨基酸具有指定的亲水指数(Kyte and Doolittle,1982)。这些值是：异亮氨酸(+4.5)、缬氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、蛋氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、苏氨酸(-0.7)、丝氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、组氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。
本领域内已知，某些氨基酸可以被具有相似亲水指数或评分的其它氨基酸取代，而仍产生具有相似生物学活性的蛋白，即仍获得生物学功能等同的蛋白。在进行这些改变时，亲水指数在±2以内的氨基酸的取代是优选的，特别优选的是在±1以内的氨基酸的取代，并且更特别优选的是在±0.5以内的那些氨基酸的取代。美国专利4,554,101(具体通过引用全文并入本文)陈述，蛋白最局部的平均亲水性(由其邻近氨基酸的亲水性导致)与该蛋白的生物学性质相关。
如美国专利第4,554,101号详述，已将下述亲水性值指定给氨基酸残基：精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)、天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、苏氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)、组氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、蛋氨酸(-1.3)、缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)、色氨酸(-3.4)。应当理解，氨基酸可以被具有相似亲水性值的另一氨基酸取代，且仍获得生物学上等同的，尤其是免疫学上等同的蛋白。在这类改变中，亲水性值在±2以内的氨基酸的取代是优选的，特别优选的是在±1以内的氨基酸的取代，并且更特别优选的是在±0.5以内的那些氨基酸的取代。
如上文所述，氨基酸取代因而通常基于氨基酸侧链取代基的相对的相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。综合考虑了上述各种特性的示例性取代是本领域技术人员所公知的，并且包括：精氨酸与赖氨酸、谷氨酸与天冬氨酸、丝氨酸与苏氨酸、谷氨酰胺与天冬酰胺、以及缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸。
此外，可以进一步修饰任何多核苷酸以增加体内稳定性。可能的修饰包括但不限于，在5'和/或3'末端添加侧翼序列、在主链中使用硫代磷酸或2'O-甲基而不是磷酸二酯酶连接和/或包含诸如肌苷、Q核苷和和怀丁苷的非常规碱基以及乙酰基、甲基、巯基和其它修饰形式的腺嘌呤、把嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。
还可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性性质的相似性进行氨基酸取代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸，带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸，以及带有具有相似亲水性值的不带电荷极性头部基团的氨基酸包括：亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸，甘氨酸和丙氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺，以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可以代表保守型改变的其他氨基酸组包括：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。变体还可以含有非保守型改变或可选择地含有非保守型改变。在优选的实施方案中，变体多肽与天然序列的区别在于5个或更少的氨基酸的取代、缺失或添加。还可以(或可选择地)通过例如对多肽的耐受原性、二级结构和亲水性具有最小影响的氨基酸的缺失或添加来修饰变体。
如上文所述，多肽在蛋白的N末端可以包含信号(或前导)序列，其在翻译的同时或在翻译后指导蛋白的转移。多肽还可以与连接物或其他序列缀合，以便于多肽的合成、纯化或鉴定(例如，多聚组氨酸)，或用于增强多肽与固相载体的结合。例如，多肽可以与免疫球蛋白Fc区缀合。
当比较多肽序列时，如果两个序列中的氨基酸序列在如下文所述进行最大对应比对时是相同的，则可以认为所述两个序列是“同一的”。通常通过在比较窗中比较序列来进行两个序列间的比较，从而鉴定和比较序列相似性的局部区域。本文所用的“比较窗”是指至少约20个连续位置、通常30-约75个、40-约50个连续位置的节段，其中在将序列与具有相同数量连续位置的参考序列最佳比对后，可以将所述序列与参考序列进行比较。
可以使用Lasergene生物信息学软件套装中的Megalign程序(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)，使用默认参数，进行用于比较的序列的最佳比对。该程序包括以下参考文献中描述的数种比对方案：Dayhoff,M.O.(1978)A model of evolutionary change inProteins-Matrices for detecting distant relationships(蛋白质的进化改变模型-用于检验远距离关系的矩阵)；In Dayhoff,M.O.(ed.)Atlas of蛋白Sequence andStructure(蛋白质序列和结构图谱),National Biomedical Research Foundation,Washington DC Vol.5,Suppl.3,pp.345-358；Hein J.(1990)Unified Approach toAlignment and Phylogenes(比对和系统发生的标准方法)pp.626-645；Methods inEnzymology(酶学方法)vol.183,Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Higgins,D.G.andSharp,P.M.,CABIOS 5:151-153(1989)；Myers,E.W.and Muller W.,CABIOS 4:11-17(1988)；Robinson,E.D.,Comb.Theor 11:105(1971)；Saitou,N.Nei,M.,Mol.Biol.Evol.4:406-425(1987)；Sneath,P.H.A.and Sokal,R.R.,Numerical Taxonomy–the Principlesand Practice of Numerical Taxonomy(数值分类法-数值分类法的原理和实践),FreemanPress,San Francisco,CA(1973)；Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.,Proc.Natl.Acad.,Sci.USA 80:726-730(1983)。
可选择地，可以通过以下来进行用于比较的序列的最佳比对：Smith andWaterman Add.APL.Math 2:482(1981)的局部同一性算法、Needleman and WunschJ.Mol.Biol.48:443(1970)的同一性比对算法、Pearson and Lipman Proc.NatlAcad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性方法搜索、这些算法的计算机执行(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group(GCG),575Science Dr.,Madison,WI)、或检查。
适于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一个优选实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul et al.Nucl.Acids Res.25:3389-3402(1977)和Altschul et al.J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中。例如，可以按照本文所述的参数使用BLAST和BLAST 2.0，从而确定本发明多核苷酸和多肽的序列同一性百分比。通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)可以公开获得进行BLAST分析的软件。对于氨基酸序列而言，可以将评分矩阵用于计算累积评分。在以下情况时停止每个方向的字符命中延伸：当累积比对评分从其最大达到的值下降量X时；由于一个或多个负评分残基比对的累积而使累积评分达到0或低于0时；或达到任一序列的末端时。BLAST算法参数W、T和X决定了所述比对的灵敏度和速度。
在一个优选的方法中，通过在至少20个位置的比较窗中比较两个最佳比对的序列来确定“序列同一性百分比”，其中，与用于两个序列最佳比对的参考序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗中的多肽序列的一部分可以包含20％或更少的、通常为5％-15％、或10％-12％的添加或缺失(即，空位)。通过以下来计算百分比：确定两个序列中都存在的相同氨基酸残基的位置数量来产生配对位置数，将配对位置数除以参考序列中(即窗的大小)的位置总数，并且将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。
在其它示例性的实施方案中，多肽可以是包含多个本文所述的多肽的融合多肽，或者可以是包含至少一个本文所述的多肽和一段无关序列(例如用于纯化的组氨酸标签或导向肽)的融合多肽。例如，融合伴侣可以有助于以高于天然重组蛋白的产量表达蛋白(表达增强子)。可以选择其它的融合伴侣，以增加多肽的溶解性或使多肽能靶向于所需的细胞内区域。其它融合伴侣包括促进多肽纯化的亲和性标签。在某些实施方案中，融合伴侣能增加多肽的耐受原性或提高其通过细胞的摄入。在其它实施方案中，融合伴侣包含免疫应答增强子。
通常可以用标准技术制备融合蛋白，包括化学缀合。优选地，在表达系统中，融合多肽作为重组多肽表达，允许以高于非融合多肽的水平产生。简单而言，可以分别组装编码多肽组分的DNA序列，并将其连入合适的表达载体中。使用或不使用肽连接物将编码一种多肽组分的DNA序列的3'端与编码第二多肽组分的DNA序列的5'端连接，这样序列的读码框是同相的。这允许翻译为同时保留两个组分多肽的生物活性的单一融合多肽。
可以用肽连接物序列将第一和第二多肽组分隔开足以确保每种多肽折叠成其二级和三级结构的距离。用本领域内公知的标准技术将这类肽连接物序列并入融合多肽。可以基于下列因素选择合适的肽连接物序列：(1)它们采取柔韧的、伸展的构象的能力；(2)它们不会采取与第一和第二多肽上的功能表位相互作用的二级结构的能力；和(3)可以与所述多肽功能表位反应的疏水或带电残基的缺乏。优选的肽连接物序列包含Gly、Asn和Ser残基。诸如Thr和Ala的其它接近中性的氨基酸也可以用于连接物序列中。可以有效地用作连接物的氨基酸序列包括公开于Maratea et al.,Gene 40:39-46 1985；Murphy et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8258-8262 1986；美国专利第4,935,233号和第4,751,180号中的那些氨基酸序列。通常，连接物序列的长度可以为1-约50个氨基酸。当第一和第二多肽具有可以用来隔开功能结构域和防止空间干扰的非必需N末端氨基酸区时，不需要连接物序列。
将连接的DNA序列可操纵地连接于合适的转录或翻译调节元件。负责DNA表达的调节元件仅位于编码第一多肽的DNA序列的5'。同样，终止翻译所需的终止密码子和转录终止信号仅位于编码第二多肽的DNA序列的3'。
本发明的一个实施方案涉及融合多肽和编码它们的多核苷酸。其中所述融合伴侣包含能引导多肽进入内体/溶酶体区域的导向信号，如美国专利第5,633,234号中所描述。当与该导向信号融合时，本发明的耐受原性多肽会更有效地联合MHC II类分子，从而为该多肽特异的合适的CD4+T细胞提供增强的体内刺激。
可以利用各种公知的合成和/或重组技术制备本发明的多肽，后者将在下文进一步描述。利用本领域技术人员公知的技术通过合成方法产生的多肽、一部分或其它变体通常小于约150个氨基酸。在一个示例性的实例中，利用任何商业上可获得的固相技术来合成这类多肽，例如Merrifield固相合成方法，其中氨基酸被相继添加到生长的氨基酸链上。参见Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2146,1963。用于多肽自动合成的设备可购自诸如Perkin Elmer/Applied BioSystems Division(Foster City,CA)的供应商，并且可以按照厂商的说明书进行操纵。
通常，本发明的多肽组合物(包括融合多肽)是分离的。“分离的”多肽是从其原来的环境中移出的多肽。例如，如果将天然存在的蛋白或多肽与天然系统中的部分或所有的共存物质分开，则该天然存在的蛋白或多肽是分离的。优选地，这类多肽还被纯化，例如是至少约90％纯的，更优选为至少约95％纯的和最优选为至少约99％纯的。
ColV蛋白可以从多种来源纯化或可以从商业来源(Collaborative BiomedicalProducts/Becton,Dickinson and Company,Franklin Lakes,NJ USA)购买。为了实施一些实施方案，可能必须获得纯的或基本纯的胶原或其耐受原性片段、表位或抗原部分。通过多种途径可易于获取这些材料例如V型胶原或其片段，包括但不限于动物来源、人尸体或重组方式。其它方法包括部分消化诸如V型胶原的胶原。在这方面中，人类V型胶原可从人尸体或其它来源提取，并通过差别NaCl沉淀来纯化(Seyer and Kang,1989)。例如，将胎盘组织切碎、洗涤并悬浮于含有0.2M NaCl的0.5M乙酸中，并于4℃用胃蛋白酶消化。从离心的样本吸出上清，收集沉淀并重复提取方案。将两次消化的上清混合，并通过差别NaCl沉淀从0.5M乙酸上清中纯化col(V)(Smith et al.,1985；Seyer and Kang,1989)。V型胶原通常可溶于0.7M NaCl中，并在1.2M NaCl中沉淀。
对于这些需要纯化α(V)链的实施方案而言，可以重复乙酸溶解和NaCl沉淀的循环，直到获得具有α-链比值、α1(V)/α2(V)大约为2的V型制剂，该比值是通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Smith et al.,1985)或本领域技术人员已知的其它合适的方法来测定的。可以通过DEAE-纤维素层析(Seyer and Kang,1989)或本领域技术人员已知的其它方法，例如Protein Purification Protocols,Ed.Shawn Doonan,Humana Press,1996)中所描述的那些方法实现α1(V)与α2(V)的分离。可从柱洗提α1(V)与α2(V)链，并通过之前所报道的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Smith,Jr.et al,1985)来确认纯度。可以将完整的col(V)或α1(V)与α2(V)链稀释于PBS(0.5mg/ml)或其它合适的缓冲液中直到使用。
在某些实施方案中，本发明提供了编码本发明胶原蛋白的多核苷酸。示例性的多核苷酸是SEQ ID NO:1、3和5中所示的那些和它们编码本文所述的胶原蛋白的耐受原性片段的片段。
术语“DNA”和“多核苷酸”在本文实质上是可交换使用的，是指已从特定物种的总基因组DNA分离出的DNA分子。本文所用的“分离的”表示多核苷酸基本上远离其它编码序列，以及该DNA分子不含大部分无关的编码DNA，例如大量的染色体片段或其它功能基因或多肽编码区。当然，这是指最初分离的DNA分子，并且不排除后来通过人工添加到该节段上的基因或编码区。
如本领域技术人员所理解的，本发明的多核苷酸组合物包括基因组序列、基因组外序列和质粒编码的序列以及表达或被改造来表达蛋白、多肽、肽等的较小的工程基因节段。这类区段可以是天然分离的，或人工合成修饰的。
可以利用任何成熟的技术来鉴定、制备和/或操纵本发明的多核苷酸组合物(通常参见，Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验手册),Cold Spring Harbor Laboratories,Cold Spring Harbor,NY,1989；Ausubel et al.(2001Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学技术),GreenePubl.Assoc.Inc.&John Wiley&Sons,Inc.,NY,NY)及其它类似的参考文献)。
可利用多种模板依赖性的方法来扩增样品中所存在目的靶序列。公知的扩增方法之一是聚合酶链式反应(PCRTM)，这在美国专利第4,683,195号、第4,683,202号和第4,800,159号中有详细描述，通过引用将每一篇全文并入本文。
任何其它模板依赖性的方法，其中多数是PCRTM扩增技术的衍化是领域内已知且易于利用的。举例来说，一些这类方法包括例如描述于欧洲专利申请公开号320,308和美国专利第4,883,750号中的连接酶链式反应(称为LCR)、描述于PCT国际专利申请公开号PCT/US87/00880中的Qβ复制酶、链置换扩增(SDA)和修复链反应(RCR)。其它扩增方法描述于英国专利申请号2 202 328和PCT国际专利申请公开号PCT/US89/01025中。其它核酸扩增方法包括基于转录的扩增系统(TAS)(PCT国际专利申请公开号WO 88/10315)，包括基于核酸序列的扩增(NASBA)和3SR。欧洲专利申请公开号329,822描述了涉及循环合成单链RNA(“ssRNA”)、ssDNA和双链DNA(dsDNA)的核酸扩增方法。PCT国际专利申请公开号WO 89/06700描述了基于启动子/引物序列与靶单链DNA(“ssDNA”)杂交，随后转录出该序列的很多RNA拷贝的核酸序列扩增方案。诸如“RACE”(Frohman,1990)和“单侧PCR”(Ohara,1989)的其它扩增方法也是本领域技术人员公知的。
利用公知技术可以使用本发明多核苷酸的扩增部分从合适的文库(例如，肿瘤cDNA文库)分离出全长基因。
还如本领域技术人员所公认的，本发明的多核苷酸可以是单链的(编码或反义)或双链的，并且可以是DNA(基因组、cDNA或合成物)或RNA分子。RNA分子可以包括HnRNA分子和mRNA分子，所述HnRNA分子包含内含子并且以一对一的方式对应于DNA分子，而所述mRNA分子不含内含子。其它编码或非编码序列可以，但不需要，存在于本发明的多核苷酸中，并且多核苷酸可以，但不需要，与其他的分子和/或支持物质连接。
多核苷酸可以包含天然序列(即，编码本发明的多肽/蛋白或其一部分的内源序列)，或可以包含编码这类序列的变体或衍生物，优选耐受原性变体或衍生物的序列。
在其它相关的实施方案中，本发明提供了与本文在SEQ ID NO:1、3和5中所提供的序列具有大量同一性的多核苷酸变体，例如，利用本文所述的方法(例如，如下文讨论的，使用标准参数的BLAST分析)，包含与本发明的多核苷酸序列相比具有至少70％的序列同一性，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性的那些序列。本领域技术人员应当认识到，通过考虑密码简并性、氨基酸相似性、读码框定位等，这些值可以被适当调整以确定两个核苷酸序列所编码的蛋白的对应的同一性。
通常，多核苷酸变体可以包含一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，优选使得由该变体多核苷酸所编码的多肽的耐受原活性相对于本文具体展示的多核苷酸序列所编码的多肽没有显著减弱。术语“变体”还应当被理解为包括异种来源的同源基因。
在其它实施方案中，本发明提供了多核苷酸片段，其包含与本文所公开的一个或多个序列相同或互补的序列的不同长度的连续区段，或由这些区段组成。例如，本发明提供的多核苷酸包含至少约10、15、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500或1000或更多个本发明所公开的一个或多个序列的连续核苷酸，以及所有的中间长度，或者由至少约10、15、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500或1000或更多个本发明所公开的一个或多个序列的连续核苷酸，以及所有的中间长度的连续核苷酸组成。应当容易理解，此处的“中间长度”表示所提到的值之间的任何长度，例如16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、32等；50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包括跨越200-500、500-1,000等的所有整数。可以在本文所述的多核苷酸序列的一端或两端延伸天然序列中未见的其它核苷酸。位于所公开序列的任一端或位于所公开序列的两端的这个其它序列可以由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸组成。
在本发明的另一实施方案中，提供能够在中度至高度严紧条件下与本文提供的多核苷酸序列，或该多核苷酸的片段，或该多核苷酸的互补序列杂交的多核苷酸组合物。杂交技术是分子生物学领域内公知的。为了说明的目的，适于测试本发明的多核苷酸与其他多核苷酸杂交的中度严紧条件包括：在5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的溶液中预先洗涤；在5×SSC中、于50℃-60℃过夜杂交；然后，用含有0.1％SDS的2×SSC、0.5×SSC和0.2×SSC中的每一种、于65℃洗涤20分钟，洗涤两次。本领域技术人员应当理解，容易操纵杂交的严紧度，例如通过改变杂交溶液的盐含量和/或改变进行杂交时的温度。例如，在另一实施方案中，合适的高度严紧杂交条件包括上文所讨论的那些条件，除此之外，要将杂交温度提高到例如60-65℃或65-70℃。
在一个实施方案中，这类多核苷酸变体编码这样的多肽，其具有本文具体展示的多肽序列的至少约50％、优选至少约70％，且更优选至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的耐受原活性水平。
不考虑编码序列自身的长度，本发明的多核苷酸或其片段可以与其它DNA序列组合，所述其它DNA序列例如启动子、聚腺苷酸化信号、其它限制性酶切位点、多克隆位点、其它编码节段等，从而它们的总长度可以有相当大的变化。因此，应当考虑到，可以使用几乎任何长度的核酸片段，总长度优选地受在计划的重组DNA流程中制备和使用的便利性的限制。例如，本发明的多种实施中可考虑使用总长度为约10,000、约5000、约3000、约2,000、约1,000、约500、约200、约100、约50个碱基对等(包括所有中间长度)的示例性的多核苷酸节段。
当比较多核苷酸序列时，如果两个序列中的核苷酸序列在如下文所述进行最大对应比对时是相同的，则可以认为所述两个序列是“同一的”。通常通过在比较窗中比较序列来进行两个序列间的比较，从而鉴定和比较序列相似性的局部区域。本文所用的“比较窗”是指至少约20个连续位置、通常30-约75个、40-约50个连续位置的节段，其中在将序列与具有相同数量连续位置的参考序列最佳比对后，可以将所述序列与参考序列进行比较。
可以使用Lasergene生物信息学软件套装中的Megalign程序(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)，使用默认参数，进行用于比较的序列的最佳比对。该程序包括以下参考文献中描述的数种比对方案：Dayhoff,M.O.(1978)A model of evolutionary change inProteins-Matrices for detecting distant relationships(蛋白质的进化改变模型-用于检验远距离关系的矩阵)；In Dayhoff,M.O.(ed.)Atlas of蛋白Sequence andStructure(蛋白质序列和结构图谱),National Biomedical Research Foundation,Washington DC Vol.5,Suppl.3,pp.345-358；Hein J.Unified Approach to Alignmentand Phylogenes(比对和系统发生的标准方法)pp.626-645(1990)；Methods inEnzymology(酶学方法)vol.183,Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Higgins,D.G.andSharp,P.M.,CABIOS 5:151-153(1989)；Myers,E.W.and Muller W.,CABIOS 4:11-17(1988)；Robinson,E.D.,Comb.Theor 11:105(1971)；Saitou,N.Nei,M.,Mol.Biol.Evol.4:406-425(1987)；Sneath,P.H.A.and Sokal,R.R.,Numerical Taxonomy–the Principlesand Practice of Numerical Taxonomy(数值分类法-数值分类法的原理和实践),FreemanPress,San Francisco,CA(1973)；Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.,Proc.Natl.Acad.,Sci.USA 80:726-730(1983)。
可选择地，可以通过以下来进行用于比较的序列的最佳比对：Smith andWaterman Add.APL.Math 2:482(1981)的局部同一性算法、Needleman and WunschJ.Mol.Biol.48:443(1970)的同一性比对算法、Pearson and Lipman Proc.NatlAcad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性方法搜索、这些算法的计算机执行(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group(GCG),575Science Dr.,Madison,WI)、或检查。
适于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一个优选实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul et al.Nucl.Acids Res.25:3389-3402(1977)和Altschul et al.J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中。例如，可以按照本文所述的参数使用BLAST和BLAST 2.0，从而确定本发明多核苷酸的序列同一性百分比。通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)可以公开获得进行BLAST分析的软件。在一示例性的实例中，对于核苷酸序列而言，可以使用参数M(对于一对配对残基的奖励分；总是>0)和N(对于不配对残基的罚分；总是<0)来计算累积评分。在以下情况时停止每个方向的字符命中延伸：当累积比对评分从其最大达到的值下降量X时；由于一个或多个负评分残基比对的累积而使累积评分达到0或低于0时；或达到任一序列的末端时。BLAST算法参数W、T和X决定了所述比对的灵敏度和速度。BLAST程序(对于核苷酸序列而言)使用以下默认值：字长(W)11、期望(E)10、BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff andHenikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))比对、(B)50、期望(E)10、M＝5、N＝-4和双链比较。
优选地，通过在至少20个位置的比较窗中比较两个最佳比对的序列来确定“序列同一性百分比”，其中，与用于两个序列最佳比对的参考序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗中的多核苷酸序列的一部分可以包含20％或更少的、通常为5％-15％、或10％-12％的添加或缺失(即，空位)。通过以下来计算百分比：确定两个序列中都存在的相同核酸碱基的位置数量来产生配对位置数，将配对位置数除以参考序列中(即窗的大小)的位置总数，并且将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。
本领域技术人员应当理解，由于遗传密码的简并性，有很多核苷酸序列编码本文所述的多肽。这些多核苷酸中的某些与任何天然基因的核苷酸序列具有低的同源性。虽然如此，本发明特别考虑到由于密码子使用中的差异而不同的多核苷酸。此外，包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因包括在本发明范围内。等位基因是由于一个或多个诸如核苷酸的缺失、添加和/或取代的突变而改变的内源基因。所得到的mRNA和蛋白可以，但不需要，具有改变的结构或功能。可以用标准技术鉴定等位基因(例如杂交、扩增和/或数据库序列比较)。
因此，在本发明的另一实施方案中，使用诸如定点诱变的诱变方法来制备本文所述的多肽的耐受原性变体和/或衍生物。通过该方法，可以通过对编码多肽序列的基础多核苷酸进行诱变而在该多肽序列中产生特定的修饰。这些技术为制备并测试序列变体提供了简易的方法，例如通过在多核苷酸中导入一个或多个核苷酸序列改变而并入一个或多个上述的修饰。
定点诱变允许通过使用能编码所需突变的DNA序列的特定寡核苷酸序列以及足够数量的邻近核苷酸来产生突变体，所述邻近核苷酸用于提供大小和序列复杂性足以在待跨越的缺失位点的两侧形成稳定双螺旋的引物序列。可以在所选的多核苷酸序列中利用突变来提高、改变、减低、修饰或以其它方式改变该多核苷酸自身的性质和/或改变所编码的多肽的性质、活性、组成、稳定性或一级序列。
在本发明的某些实施方案中，本发明人考虑对所公开的多核苷酸序列进行诱变，从而改变所编码多肽的一种或多种性质，例如多肽的耐受原性。定点诱变技术是领域内公知的，且广泛用于产生多肽和多核苷酸两者的变体。例如，定点诱变常用来改变DNA分子的特定部分。在这类实施方案中，利用通常包含约14至约25个核苷酸或大约长度的引物，在待改变的序列位点的两侧均具有约5至约10个残基。
如本领域技术人员所理解的，定点诱变技术通常使用既能以单链又能以双链形式存在的噬菌体载体。用于定点诱变中的典型载体包括诸如M13噬菌体的载体。这些噬菌体容易买到，并且其使用通常是本领域技术人员公知的。双链质粒也常用于定点诱变中，其排除了将目的基因从质粒转入噬菌体中的步骤。
通常，首先通过获得单链载体或双链载体的解链的两条链来进行本文的定点诱变，所述载体在其序列中包含编码所需肽的DNA序列。通常通过合成法制备携带所需突变序列的寡核苷酸引物。然后将该引物与单链载体退火，并利用诸如大肠杆菌聚合酶I Klenow片段的酶进行DNA聚合，从而完成突变携带链的合成。因此，形成其中一条链编码原始非突变序列和第二链携带所需突变的异源双螺旋。然后，用该该异源双螺旋载体转化合适的细胞，例如大肠杆菌细胞，并选择包含携带突变序列排列的重组载体的克隆。
利用定点诱变制备编码所选肽的序列变体的DNA节段提供了一种产生具有潜在用途的种类的工具，并且这并不意味着是受限的，因为还有可以获得肽的序列变体和编码该变体的DNA序列的其它方式。例如，可以用诸如羟胺的诱变剂处理编码所需肽序列的重组载体，从而获得序列变体。关于这些方法和方案的具体详述见于Maloy et al.,1994；Segal,1976；Prokop and Bajpai,1991；Kuby,1994；和Maniatis et al.,1982的教导，将每一篇通过引用并入本文，用于该目的。
本文所用的术语“寡核苷酸定点诱变方法”是指模板依赖的过程和载体介导的增殖，该增殖导致特定核酸分子的浓度相对于其初始浓度有所提高，或导致可检测信号浓度的提高，例如扩增。本文所用的术语“寡核苷酸定点诱变方法”意指涉及引物分子的模板依赖性延伸的过程。术语模板依赖的过程是指RNA或DNA分子的核酸合成，其中新合成的核酸链的序列由公知的互补性碱基配对原则决定(参见例如，Watson,1987)。通常，载体介导的方法涉及将核酸片段导入DNA或RNA载体中、载体的克隆扩增和扩增核酸片段的回收。美国专利第4,237,224号提供了这类方法的实例，通过引用将其全文并入本文。
在用于产生本发明多肽变体的另一方法中，可以利用如美国专利第5,837,458号所述的循环序列重组。在该方法中，进行重组和筛选或选择的重复循环，从而“演化出”本发明的具有例如增强的耐受原活性的个体多核苷酸变体。
在本发明的其它实施方案中，编码本发明多肽或其融合蛋白或功能等同物的多核苷酸序列或多核苷酸序列片段可以用于重组DNA分子中，从而指导多肽在合适的宿主细胞中的表达。由于遗传密码内在的简并性，可以产生编码基本上相同的或功能上等同氨基酸序列的其它DNA序列，并且这些序列可以用来克隆和表达给定的多肽。
如本领域技术人员所理解地，在一些情况下，产生具有非天然存在的密码子的编码多肽的核苷酸序列是有利的。例如，可以选择特定原核生物或真核生物宿主所偏好的密码子来增加蛋白表达率或产生具有所需特性的重组RNA转录本，所述所需特性例如比天然存在的序列所产生的转录本更长的半衰期。
此外，可以使用本领域内公知的方法改造本发明的多核苷酸序列，从而为了多种原因改变多肽编码序列，包括但不限于修饰基因产物的克隆、加工和/或表达的改变。例如，通过随机断裂和基因片段和合成寡核苷酸的PCR组装而进行的DNA改组可用来改造核苷酸序列。此外，定点诱变可用来插入新的限制性位点、改变糖基化模式、改变密码子偏好性、产生剪接变体或导入突变等。
在本发明的另一实施方案中，天然的、修饰的或重组的核酸序列可连接至异源序列，从而编码融合蛋白。例如，为了筛查作为多肽活性抑制剂的肽文库，编码能用商购抗体识别的嵌合蛋白可能是有用的。还可以对融合蛋白进行改造使之在多肽编码序列和异源蛋白序列之间含有切割位点，以便该多肽可被切割并从所述异源部分纯化出来。
可以利用领域内公知的化学方法全部或部分合成编码所需多肽的序列(参见Caruthers,M.H.et al.(1980)Nucl.Acids Res.Symp.Ser.215-223,Horn,T.et al.(1980)Nucl.Acids Res.Symp.Ser.225-232)。可选择地，可以利用合成多肽氨基酸序列或其一部分的方法来产生蛋白本身。例如，可以利用多种固相技术进行肽合成(Roberge,J.Y.et al.(1995)Science 269:202-204)，并且例如利用ABI 431A肽合成仪(Perkin Elmer,PaloAlto,CA)可以实现自动化合成。
可以利用制备型高效液相色谱(例如，Creighton,T.(1983)Proteins,Structuresand Molecular Principles,WH Freeman and Co.,New York,N.Y.)或领域内可用的其它类似技术来基本上纯化新合成的肽。可以通过氨基酸分析或测序(例如，Edman降解法)来确认合成肽的组成。此外，在直接合成和/或利用化学方法与来自其它蛋白的序列或序列的任何部分进行组合的过程中，多肽的氨基酸序列或其任何部分可被改变，从而产生变体多肽。
为了表达所需的多肽，可以将编码多肽的核苷酸序列或功能等同物插入合适的表达载体中，即包含插入的编码序列的转录和翻译所必需的元件的载体。可以用本领域技术人员公知的方法构建含有编码目的多肽的序列和合适的转录和翻译控制元件的表达载体。这些方法包括：体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。这些技术例如描述于Sambrook,J.et al.(1989)Molecular Cloning,A Laboratory Manual(分子克隆，实验手册)和Ausubel et al.(2001-2008Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学技术),Greene Publ.Assoc.Inc.&John Wiley&Sons,Inc.,NY,NY)。
多种表达载体/宿主系统可以用来包含和表达多核苷酸序列。这些表达载体/宿主系统包括但不限于，诸如用重组噬菌体、质粒、或粘粒DNA表达载体转化的细菌的微生物；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒TMV)或用细菌表达载体(例如，Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。
表达载体中存在的“控制元件”或“调节序列”是与宿主细胞蛋白相互作用来进行转录和翻译的载体的那些非翻译区(增强子、启动子、5'和3'非翻译区)。这些元件在它们的强度和特异性上可以不同。根据所用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的合适的转录和翻译元件，包括组成型启动子和诱导型启动子。例如，当克隆入细菌系统时，可以使用诱导型启动子，诸如PBLUESCRIPT噬菌粒(Stratagene,La Jolla,Calif.)或PSPORT1质粒(Gibco BRL,Gaithersburg,Md.)的杂合lacZ启动子等。在哺乳动物细胞系统中，通常优选来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子。如果有必要产生含有编码多肽的序列的多拷贝的细胞系，则可以优选地使用基于SV40或EBV的、带有合适的选择标记的载体。
在细菌系统中，根据表达的多肽的希望的用途，可以选择多种表达载体中的任何一种。例如，当大量需要时，例如用于诱导抗体时，可以使用指导容易纯化的融合蛋白的高水平表达的载体。这类载体包括但不限于，诸如pBLUESCRIPT(Stratagene)的多功能大肠杆菌克隆和表达载体，其中将编码目的多肽的序列与载体连接，与氨基末端Met和随后的β-半乳糖苷酶的7个残基在同一读码框中，以便产生杂合蛋白；pIN载体(Van Heeke,G.andS.M.Schuster(1989)J.Biol.Chem.264:5503-5509)等。pGEX载体(Promega,Madison,Wis.)也可以用来将外源多肽表达为具有谷胱甘肽巯基转移酶(GST)的融合蛋白。通常，这类融合蛋白是可溶的，并且可以通过谷胱甘肽琼脂糖珠的吸附并随后在游离谷胱甘肽的存在下洗脱来容易地从裂解的细胞中纯化。这些系统中产生的蛋白可以被设计为包括肝素、凝血酶或因子XA蛋白酶切割位点，以便任意地从GST部分释放克隆的目的多肽。
在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，可以使用多种含有诸如α因子、醇氧化酶和PGH的组成型或诱导型启动子的载体。对于综述而言，可以参见Ausubel et al.(同上)和Grant et al.(1987)Methods Enzymol 153:516-544。
如果使用植物表达载体，编码多肽的序列的表达可以由多种启动子中的任何一种所驱动。例如，诸如CaMV的35S和19S启动子的病毒启动子可以单独使用或与来自TMV的Ω前导序列联合使用(Takamatsu,N.(1987)EMBO J.6:307-311)。可选择地，可以使用诸如RUBISCO的小亚基或热休克启动子的植物启动子(Coruzzi,G.et al.(1984)EMBO J.3:1671-1680；Broglie,R.et al.(1984)Science 224:838-843；以及Winter,J.et al.(1991)Results Probl.Cell Differ.17:85-105)。可以通过直接的DNA转化或病原体介导的转染将这些构建体导入植物细胞。这类技术描述于很多可普遍获得的综述中(参见例如，Hobbs,S.or Murry,L.E.in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology(1992)McGrawHill,New York,N.Y.；pp.191-196)。
还可以用昆虫系统来表达目的多肽。例如，在一种这类系统中，将苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)用作载体在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞或粉纹夜蛾(Trichoplusia)幼虫中表达外来基因。可以将编码多肽的序列克隆入病毒的非必需区，例如多角体蛋白基因，并置于多角体蛋白启动子的控制下。编码多肽的序列的成功插入会使多角体蛋白基因失活，并产生缺少衣壳蛋白的重组病毒。随后，可以将所述重组病毒用于感染例如草地贪夜蛾细胞或粉纹夜蛾幼虫，其中目的多肽可以表达(Engelhard,E.K.et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91:3224-3227)。
在哺乳动物宿主细胞中，通常可以使用多种基于病毒的表达系统。例如，如果将腺病毒用作表达载体，则可以将编码目的多肽的序列连入由晚期启动子和三联前导序列组成的腺病毒转录/翻译复合物中。病毒基因组的非必需E1或E3区中的插入可以用来获得能在感染的宿主细胞中表达多肽的活病毒(Logan,J.and Shenk,T.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.81:3655-3659)。此外，可以使用诸如鲁斯氏肉瘤病毒(RSV)增强子的转录增强子来增强哺乳动物宿主细胞中的表达。
也可以使用特异的起始信号来实现编码目的多肽的序列的更高效的翻译。这些信号包括ATG起始密码子和邻近的序列。如果将编码多肽的序列、其起始密码子和上游序列插入合适的表达载体中，则可以不需要其他的转录或翻译控制信号。然而，如果仅将编码序列或其一部分插入，则应该提供包括ATG起始密码子在内的外源翻译控制信号。此外，起始密码子应该在正确的读码框中以确保全部插入物的翻译。外源翻译元件和起始密码子可以是不同来源的，可以是天然的或合成的。可以通过包含适于所用的特定细胞系统的增强子来增强表达效率，诸如文献中描述的那些增强子(Scharf,D.et al.(1994)ResultsProbl.Cell Differ.20:125-162)。
此外，可以基于宿主细胞株调节插入的序列的表达或以所需的方式加工所表达的蛋白的能力来选择宿主细胞株。多肽的这些修饰包括但不限于，乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂质化和酰基化。切割蛋白的“前原”形式的翻译后加工也可以用来促进正确的插入、折叠和/或功能。可以选择诸如CHO、COS、HeLa、MDCK、HEK293和WI38的、对于这类翻译后活性具有特异性的细胞体系和特征机制的不同宿主细胞，以确保外源蛋白的正确修饰和加工。
为了长期、高产量地产生重组蛋白，通常优选稳定的表达。例如，可以用表达载体转化稳定表达目的多核苷酸的细胞系，所述表达载体可以在同一载体或分别的载体上含有病毒复制起点和/或内源表达元件以及选择标记基因。引入载体后，在将细胞转至选择培养基之前，可以允许细胞在富集培养基中生长1-2天。选择标记的目的是赋予对于选择的抗性，并且选择标记的存在允许成功表达引入的序列的细胞的生长和恢复。可以用适合细胞类型的组织培养技术增殖稳定转化的细胞的抗性克隆。
可以用任何数量的选择系统来恢复转化的细胞系。这些选择系统包括但不限于，可以分别在tk－细胞或aprt－细胞中使用的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler,M.et al.(1977)Cell 11:223-32)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy,I.et al.(1990)Cell 22:817-23)。此外，抗代谢物、抗生素或除草剂抗性可以被用作选择的基础；例如，赋予对氨甲喋呤的抗性的dhfr(Wigler,M.et al.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.77:3567-70)；赋予对氨基糖苷类、新霉素和G-418的抗性的npt(Colbere-Garapin,F.et al(1981)J.Mol.Biol.150:1-14)；以及分别赋予对氯磺隆和草胺磷乙酰转移酶的抗性的als或pat(Murry，同上)。其它选择基因已有描述，例如，允许细胞利用吲哚来代替色氨酸的trpB，或允许细胞利用组胺醇来代替组氨酸的hisD(Hartman,S.C.and R.C.Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:8047-51)。可视标志物已获得普遍应用，这类标志物如花青素、β-葡糖苷酸酶及其底物GUS、以及荧光素酶及其底物荧光素，这类标记不仅广泛用于鉴定转化株，而且用于对归因于特异性载体系统的瞬时或稳定蛋白表达进行定量(Rhodes,C.A.et al.(1995)MethodsMol.Biol.55:121-131)。
尽管标志基因表达的存在与否能提示同时存在目的基因，但是标志基因的存在和表达需要被证实。例如，如果将编码多肽的序列插入标志基因序列中，则可以通过标志基因功能的缺失来鉴定含有序列的重组细胞。可选择地，可以将标志基因与编码多肽的序列串联置于一个启动子的控制下。标志基因响应于诱导或选择的表达通常能同时表明串联基因的表达。
可选择地，可以通过本领域技术人员已知的多种方法来识别含有并表达所需多核苷酸序列的宿主细胞。这些方法包括但不限于，DNA-DNA或DNA-RNA杂交和蛋白生物测定或免疫测定技术，蛋白生物测定或免疫测定技术包括例如，用于对核酸或蛋白进行检测和/或定量的基于膜、溶液或芯片的技术。
使用对产物特异的多克隆或单克隆抗体检测和测量多核苷酸编码的产物的表达的多种方法在领域内是已知的。实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)和荧光活化细胞分选(FACS)。利用与给定多肽上的两个非干扰表位起反应的单克隆抗体的基于双点、单克隆的免疫测定对于某些应用可以是优选的，但是还可以利用竞争性结合测定。这些测定和其他测定描述于Hampton,R.et al.(1990；Serological Methods,aLaboratory Manual(血清学方法：实验手册),APS Press,St Paul.Minn.)和Maddox,D.E.et al.(1983；J.Exp.Med.158:1211-1216)等中。
广泛多种的标记物和缀合技术是本领域技术人员已知的并且可以用于各种核酸和氨基酸测定中。产生用于检测多核苷酸相关序列的标记的杂交或PCR探针的手段包括寡核苷酸标记、缺口平移、末端标记或使用标记的核苷酸的PCR扩增。可选择地，可以将序列或其任何部分克隆入载体中，用于产生mRNA探针。这类载体在本领域内是已知的并且是可商业购得的，并且可以通过添加诸如T7、T3或SP6的合适的RNA聚合酶和标记的核苷酸来体外合成RNA探针。可以使用多种可商业购得的试剂盒进行这些步骤。可以使用的合适的报告分子或标记包括放射性核素、酶、荧光剂、化学发光剂或产色剂以及底物、辅因子、抑制剂、磁性颗粒等。
可以在适合蛋白从细胞培养物中表达和回收的条件下，培养用目的多核苷酸序列转化的宿主细胞。根据序列和/或所用的载体，重组细胞产生的蛋白可以是分泌的或包含在细胞内。如本领域技术人员所理解地，可以将包含本发明多核苷酸的表达载体设计为包含指导编码的多肽通过原核生物或真核生物细胞膜的分泌的信号序列。可以用其它的重组构造，将编码目的多肽的序列与编码有助于可溶蛋白纯化的多肽结构域的核苷酸序列连接起来。这类有助于纯化的结构域包括但不限于，允许对固定化金属进行纯化的诸如组氨酸-色氨酸模块的金属螯合肽、允许对固定化免疫球蛋白进行纯化的蛋白A结构域和在FLAGS延伸/亲和纯化系统中所用的结构域(Immunex Corp.,Seattle,Wash.)。在纯化结构域和所编码的多肽之间包含可切割连接物序列，诸如对因子XA或肠激酶特异的那些序列(Invitrogen.San Diego,Calif.)，可用于促进纯化。一种这类表达载体提供了这样的融合蛋白的表达，该融合蛋白含有目的多肽和编码6个组氨酸残基的核酸，以及位于核酸之后的硫氧还蛋白或肠激酶切割位点。如在Porath,J.et al.(1992,Prot.Exp.Purif.3:263-281)中所述，组氨酸残基有助于在IMIAC(固定化金属离子亲和层析)上进行纯化，而肠激酶切割位点提供了一种从融合蛋白纯化所需多肽的方法。对含有融合蛋白的载体的讨论提供在Kroll,D.J.et al.(1993；DNA Cell Biol.12:441-453)中。
除了重组产生方法，可以通过使用固相技术的直接肽合成来产生本发明的多肽及其片段(Merrifield J.(1963)J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154)。可以用手动技术或通过自动化来进行蛋白合成。例如，可以用Applied Biosystems的431A肽合成仪(Perkin Elmer)实现自动化合成。可选择地，可以分别地化学合成不同片段并使用化学方法将片段组合来产生全长分子。
耐受
免疫耐受被定义为对抗原，通常是参与引起疾病的抗原的免疫无应答。尽管耐受可以通过不同途径给予抗原来诱导，但是口服耐受是指抗原的口服给药，这已经在数种动物模型中导致疾病活动的抑制，包括实验自身免疫性脑脊髓炎——多发性硬化的啮齿动物模型、重症肌无力、葡萄膜炎、胰岛素依赖型糖尿病和胶原诱导的关节炎(Faria andWeiner 1999)。来自人类临床试验的早期结果表明，口服耐受在自身免疫性葡萄膜炎、糖尿病、镍过敏症以及可能在多发性硬化中都是有效的(Faria and Weiner 1999；Duda etal.2000)。有数项研究报道了在器官移植中诱导口服耐受(Sayegh et al.1996；Hancocket al.1993；Ishido et al.1999；Sayegh et al.1992a；Sayegh et al.1992b)。在每篇报道中，通过在移植之前食用供体MHC来源的肽或食用异源细胞来诱导耐受(Sayegh etal.1996；Hancock et al.1993；Ishido et al.1999；Sayegh et al.1992a；Sayegh etal.1992b)。这些技术可有效预防对心脏和角膜同种移植物的排斥(Sayegh et al.1996；Hancock et al.1993；Ishido et al.1999；Sayegh et al.1992a；Sayegh et al.1992b；Faria and Weiner 1999)。在这些研究中，除了降低疾病活动之外，由口服耐受所诱导的免疫抑制还可以通过响应于靶抗原的迟发型超敏反应(DTH)的下调以及细胞免疫和体液免疫的减弱来衡量(Faria and Weiner 1999；Mayer 2000；Garside and Mowat 1997)。
口服(和其它给药途径)耐受通过以下三种机制下调抗原特异的免疫应答：1.抗原特异性细胞的活性抑制、2.抗原特异性细胞的克隆无反应和3.抗原特异性细胞的克隆排除(Faria and Weiner 1999,Miller et al.1991；Chen et al.1994；Chen et al.1995)。尽管所有三种机制可以在响应于口服耐受时同时起作用，但是活性抑制和克隆无反应是口服耐受所诱导的免疫抑制的关键机制(Faria and Weiner 1999)。
活性抑制描述的是一种淋巴细胞亚类以抗原特异的方式受到另一种物质的调节。根据抗原和疾病状态，抑制细胞可以是CD4+和/或CD8+T淋巴细胞，其从诸如脾或周围淋巴结的外周淋巴组织迁移至疾病活动位点。将这些细胞过继转移至天然接受者已经证实这些细胞对卵白蛋白诱导的超敏性和多发性硬化的啮齿动物模型中活性抑制的作用。由以下数据证实活性抑制的体外证据，来自动物的耐受淋巴细胞能跨越transwell细胞培养系统抑制其它抗原特异性T淋巴细胞的增殖(Faria and Weiner 1999；Miller et al.1991)。
克隆无反应是指抗原特异性T淋巴细胞的无应答，其特征为暴露于抗原之后增殖减弱，并且参与数种动物模型的口服耐受。无反应可能是由CD4+或CD8+T淋巴细胞自身、局部环境中其它T淋巴细胞或细胞所产生的可溶性抑制因子的结果，或者是因为合适辅刺激分子的表达降低(Faria and Weiner 1999)。克隆排除是指去除抗原特异性T淋巴细胞，但是很少有报道是作为抗原口服耐受的机制(Chen et al.1995)。
在口服耐受期间抑制免疫应答的可溶性调节物主要来源于调节性或抑制性T淋巴细胞(Faria and Weiner 1999)。有五类T淋巴细胞通过其产生的细胞因子进行描述：产生白细胞介素-2(IL-2)和γ干扰素(γIFN)的Th1型；产生IL-4和IL-10的Th2型；单独产生高水平的转化生长因子β(TGF-β)或联合产生非常低水平的IL-4、IL-10或γIFN的Th3型；产生高水平的IL-10和低水平的TGF-β的Tr1细胞(Faria and Weiner et al.1999；Mayer 2000；Garside and Mowat 1997；Groux et al.1997)；以及产生IL-17的Th17细胞(参见例如，Immunol Rev.2008,226:87-102；Nature.2006May 11；441(7090):235-8)。由于Th3、Th2和Tr1-T淋巴细胞已被证实是口服耐受所诱导的活性抑制的主要调节物，所以TGF-β、IL-4和IL-10被认为是该过程中的关键细胞因子(Teng et al.1998；Shi et al.1999b)。来自Barone et al.等显示在不存在这些细胞因子下所发生的口服耐受诱导的报道提示，其它调节物或细胞也能抑制免疫应答(Barone et al.1998；Shi et al.1999a)。
尽管针对口服耐受的研究集中在抑制免疫应答的T淋巴细胞来源的细胞因子，但是并非由T淋巴细胞产生的一氧化氮已知是同种免疫应答的有效抑制剂(Garside andMowat 1997)。表明一氧化氮调节凋亡(其参与排斥应答)的这些数据和其它数据(Meyer etal.1998；Kallio et al.1997；Shiraishi et al.1997；Shiraishi et al.1995；Medot-Pirenne et al.1999)提示一氧化氮可能是口服耐受的调节物并且阻止排斥应答。TGF-β是一氧化氮合成的有效诱导物，并且是口服耐受中活性抑制的关键调节物(Faria andWeiner 1999；Meyer et al.1998；Vodovotz et al.1998；Vodovitz et al.1999)。因此，在耐受宿主中由TGF-β诱导的免疫抑制在一定程度上可以由一氧化氮调节。然而，一氧化氮响应于口服耐受的产生是未知的。
由APC诱导的抗原特异性T淋巴细胞的激活需要T淋巴细胞和APC之间的双向相互作用。最初，APC呈递与T细胞受体结合的MHC分子，这刺激T淋巴细胞上CD40-配体(CD40L)表达的上调。CD40L转而与其受体，位于APC上的CD40结合。通过CD40的信号转导诱导APC上CD80和CD86的表达，它们一旦与其受体，T淋巴细胞上的CD28结合，就会导致共刺激和随后的T淋巴细胞激活(Liu et al.1999；Li et al.1999；Lederman and Siciu-Foca 1999)。尽管对口服耐受诱导的研究集中在T淋巴细胞功能上，最近来自Taams et al(1998)的研究报道了耐受诱导可以影响APC的功能，这与其他研究者的数据相似(Wu et al.1998；Finkelman et al.1996；Viney et al.1998)。例如，Wu.et al(1998)的报道显示来自口服耐受小鼠淋巴结和脾的APC上CD80的表达降低，这提示无效的APC可有助于耐受接受者中受损T淋巴细胞的激活。此外，体外研究显示抑制性T淋巴细胞能抑制APC中CD86的表达，这突出耐受如何诱导受损APC功能的另一机制(Liu et al.1999；Li et al.1999；Lederman andSiciu-Foca 1999)。
col(V)的给予除了能防止对自身的增殖应答之外，还能防止对同种抗原的增殖应答，并且能防止接受者肺部急性排斥病理的发展(参见例如，美国专利第7,348,005号；WO2007/120947)。因此，col(V)可以诱导对供体同种抗原和对自身的无反应，或可选择地，对供体抗原和对colV的增殖应答的缺乏可能是由于同种抗原特异性肺淋巴细胞的克隆排除；或者可选地，可能是由于抑制细胞的活性。
不希望受理论的束缚，由colV诱导的耐受可以通过相关的抑制进行诱导(参见例如，Hum Immunol.2008Nov；69(11):715-20)。而且，认为colV与淋巴细胞上胶原受体的差异结合导致可以涉及差异激活信号(参见例如，Cell Signal.2006Aug；18(8):1108-16)。例如，只有V型胶原诱导T细胞中的IL-17信号转导。
抗原的口服给药是诱导周围T细胞耐受性的有效方法。这种现象通常被称为口服耐受，已经在多种动物自身免疫疾病模型中进行了良好的研究，包括脑脊髓炎、葡萄膜炎、糖尿病、重症肌无力和关节炎。然而，对诱导耐受的机制还不完全了解。所有已知的耐受诱导机制，包括克隆无反应、克隆排除和受IL-4、IL-10或TGF-β调节介导的活性抑制都可以在口服耐受中发挥作用(Faria and Weiner,1999)。通常，较高剂量的抗原被报道能诱导无反应或克隆排除(Chen et al.,1995；Whitacre et al.,1991)，而低剂量能诱导细胞因子调节和活性抑制(Faria and Weiner,1999；Chen et al.,1994)。在心脏移植的动物模型中，同种脾细胞的口服给药被证实在旁路Th1激活和选择性刺激诱导Th-2来源的抑制性细胞因子(例如IL-4)的耐受诱导中是有效的(Hancock et al.,1993；Ishido et al.,1999)。
因此，口服耐受是通过向个体口服给药抗原(即通过食用)来下调免疫应答的方法。口服耐受的特征为系统性抗体产生的水平降低以及迟发型超敏反应(DTH)、T细胞增殖、细胞毒性反应和移植排斥减弱(Alpan et al.2001.J.Immunol.166:4843-52；Chen etal.1995.Nature 376:177-80；Weiner.1997.Imm.Today.7:335-44；Sayegh etal.1992.Transplantation.53:163-6)。
本文还考虑用于诱导耐受的其它途径，尤其是通过肌肉内注射、皮下注射、皮内注射和静脉内注射。本文在低剂量易于诱导耐受和高剂量能诱导免疫应答的情况下考虑皮内注射。s
对耐受的研究主要集中在耐受性抗原对T淋巴细胞功能的影响和T淋巴细胞在抑制免疫激活中的作用上(Faria and Weiner 1999；Mayer 2000；Garside and Mowat1997)。然而，对任何抗原的免疫应答需要APC和T淋巴细胞之间的相互作用，并且T淋巴细胞可以影响APC的功能(Liu et al.1999；Li et al.1999；Lederman and Siciu-Foca 1999)。因此，由来自耐受宿主的APC所呈递的下调的抗原对于耐受诱导的贡献可以间接地由于与抑制性T淋巴细胞的相互作用，或者可能由于耐受抗原对APC的直接影响。
因此，在本发明的某些方面中，本发明提供了恢复或增强COPD和哮喘患者对colV的自我耐受的方法。一个实施方案是通过口服疗法给予colV(Yasufuku et al,2001；Yasufuku,et al,2002)使其通过间隙进入肺中或通过给药方案上的其它脱敏策略来治疗COPD或哮喘的方法，所述给药方案被设计成用于增强患者对胶原(包括但不必要限制于colV及其抗原性成分和变体)的耐受性。
“耐受原性片段”表示能诱导对全长蛋白的耐受性的片段，该片段是所述全长蛋白的片段(例如，全长V型胶原及其耐受原性片段)。在某些实施方案中，耐受原性片段至少可以诱导对全长V型胶原的耐受性，以及全长V型胶原蛋白可以并且在某些实施方案中在诱导耐受性上可以比全长胶原蛋白更加有效。然而，在某些实施方案中，耐受原性片段诱导对全长V型胶原的耐受性，但是可以不会与全长V型胶原蛋白同样有效地诱导耐受性。这种耐受原性片段仍然可以用在本发明中，尤其当所述耐受原性片段具有其它优势时，例如与全长蛋白相比便制备或纯化。如同本领域技术人员所认识到的，多种已知的测定可用于评价耐受性的诱导，包括检测延迟型超敏反应(DTH)应答、通过ELISA或其它方法检测细胞因子产生、T细胞增殖或细胞毒性测定、B细胞增殖测定、抗体产生等。这类测定是领域内已知的，并且例如描述于Current Protocols in Immunology(现代免疫学技术),Edited by:JohnE.Coligan,Ada M.Kruisbeek,David H.Margulies,Ethan M.Shevach,Warren Strober(2001John Wiley&Sons,NY,NY)；Ausubel et al.(2001Current Protocols in MolecularBiology(现代分子生物学技术),Greene Publ.Assoc.Inc.&John Wiley&Sons,Inc.,NY,NY)；美国专利第7,348,005号中以及其它地方。
因此，耐受原性片段是诸如V型胶原或其任何一种或多种α链的耐受原性多肽的片段，该片段本身对于通过B细胞和/或T细胞的表面受体(例如，B细胞抗体受体或T细胞受体)来识别多肽的特异性B细胞和/或T细胞而言在免疫学上是耐受原性的(即诱导耐受性)。通常利用公知的技术来鉴定耐受原性片段，例如Paul,Fundamental Immunology,3rd ed.,(Raven Press,1993)中以及其中所引用的参考文献中所总结的那些技术。这类技术包括筛查有能力降低T细胞和/或B细胞反应性的多肽。如本文所用，如果抗血清和抗体与抗原特异结合(即它们与ELISA或其它免疫测定中的蛋白特异性地反应并且与不相关的蛋白不发生可检测到的反应)，则它们是“抗原特异性的”。可以按本文所述和利用公知技术来制备这类抗血清和抗体。
在一个实施方案中，本发明多肽的耐受原性片段是以基本上不低于全长多肽的耐受原活性的水平诱导B细胞和/或T细胞耐受性的一部分(例如，在诸如抗体产生的合适的测定中，可以通过ELISA检测和/或T细胞反应性测定(T细胞增殖或细胞因子产生测定)。优选地，耐受原性部分的耐受原活性水平为全长多肽耐受原活性的至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或高于约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实例中，鉴定耐受原活性水平大于对应全长多肽耐受原活性水平的耐受原性片段，例如，具有高于约100％、110％、120％、130％、140％或150％或更高的耐受原活性。
在某些实施方案中，可以利用计算机分析鉴定耐受原性片段，例如Tsites程序(参见Rothbard and Taylor,EMBO J.7:93-100,1988；Deavin et al.,Mol.Immunol.33:145-155,1996)，其搜索具有激发Th应答潜能的肽基序。可以按照BIMAS(Parker et al.,J.Immunol.152:163,1994)和其它HLA肽结合预测分析来鉴定具有适于结合鼠和人I类或II类MHC的基序的CTL肽。可选择地，可以利用确定的肽结合基序来鉴定与特定MHC分子结合的部分，例如Rammensee et al.,Immunogenetics 41:178-228,1995中所描述的那些基序。为了确认与鼠和人I类或II类MHC分子结合的肽，可以使用领域内已知的肽结合测定。为了证实免疫原性或耐受原性，可以利用HLA A2或其它转基因小鼠模型和/或利用树突细胞、成纤维细胞或外周血细胞的体外刺激测定来测试肽。
应当指出，在某些实施方案中，本发明的耐受原性片段还是免疫原性片段。在这方面中，如同本领域技术人员应当认识到的，高免疫原性片段，例如类似于colV的蛋白的优势免疫表位，当正确给予时(例如，通常以低剂量持续一段时间)可以是耐受原性的。因此，本发明还考虑colV的免疫原性片段的鉴定和使用，其中这类免疫原性片段可用来诱导耐受性。在这方面中，免疫原性部分的免疫原活性水平为全长多肽免疫原活性的至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或大于约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实例中，鉴定免疫原活性水平大于对应全长多肽免疫原活性水平的免疫原性片段，例如，具有高于约100％、110％、120％、130％、140％或150％或更高的免疫原活性。
用来鉴定免疫原性片段的分析可以与用来鉴定耐受原性片段的分析一样，包括利用诸如Tsites程序(参见Rothbard and Taylor,EMBO J.7:93-100,1988；Deavin et al.,Mol.Immunol.33:145-155,1996)的计算机分析，所述Tsites程序搜索具有激发Th应答潜能的肽基序。可以按照BIMAS(Parker et al.,J.Immunol.152:163,1994)和其它HLA肽结合预测分析来鉴定具有适于结合鼠和人I类或II类MHC的基序的CTL肽。可选择地，可以利用确定的肽结合基序来鉴定与特定MHC分子结合的部分，例如Rammensee et al.,Immunogenetics41:178-228,1995中所描述的那些基序。为了确认与鼠和人I类或II类MHC分子结合的肽，可以使用领域内已知的肽结合测定。为了证实免疫原性或耐受原性，可以利用HLA A2或其它转基因小鼠模型和/或利用树突细胞、成纤维细胞或外周血细胞的体外刺激测定来测试肽。
本发明的方法中考虑使用完整的V型胶原或其具有耐受原或免疫原活性的成分α链的任何一种或多种。因此，V型胶原的耐受原性片段或免疫原性片段可以指完整V型胶原的片段或可以指任何一种成分α链的耐受原性或免疫原性片段。在某些实施方案中，本文所用的colV可以包含由三种α链组成的胶原分子。在其它实施方案中，colV可以包含α链的任何一种或多种，例如由SEQ ID NO:1、3或5所示的多核苷酸所编码的SEQ ID NO:2、4或6所示的那些α链或这些α链的耐受原性片段或免疫原性片段。
在某些实施方案中，两种或更多种耐受原性或免疫原性片段可以被同时使用、单独给予、混在组合物中或作为融合蛋白。在这方面中，任何数量的耐受原性片段或免疫原性片段可用来诱导对colV的耐受性，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种耐受原性或免疫原性片段作为单独的片段处于组合物中或作为融合蛋白(具有或不具有连接物)。在某些实施方案中，本发明的方法可以使用11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种片段。
按照某些实施方案，可以利用多种免疫测定方法中的任何一种，例如通过ELISA方法来完成对抗胶原抗体存在的检测。如同通过参考标准免疫测定教科书所看到的，可以利用大量的免疫测定技术，这些包括但不限于非竞争类型的单点和双点或“夹心”测定以及传统的竞争结合测定。
夹心测定是最有用且常用的基于抗体的测定方法，并且可用来实施多个实施方案。夹心测定技术存在大量变型，并且所有都意图包括在各实施方案中。简单而言，在用于检测样品中的抗体的典型测定中，将非标记的抗原固定在固相基底上，并将待检验的样品与结合的抗原分子接触。在一段合适的孵育时间，即持续足以允许形成抗体-抗原复合物的时间段之后，添加诸如抗人IgG的二抗(标记有能产生检测信号的报告分子)，并孵育，允许足以形成抗体-抗原-标记抗体的时间。洗掉任何未反应的物质，并通过观察所述报告分子所产生的信号来测定样品中待检测的抗体的存在。例如通过简单观察可视信号结果可以是定性的，或者通过将目的样品所产生的信号与含有已知量的待检测抗体的对照样品进行比较，可以对结果进行定量。这种测定的变型包括同时测定，其中样品和标记抗体被同时添加到结合的抗原上。这些技术是公知的，包括本领域技术人员显而易见的任何微小变型。在典型的夹心测定中，抗原是固定的，例如被共价或被动地连接于固相表面。在一些实施方案中，所述固相表面通常为玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固相支持体可以是管、珠、盘或微型板的形式或适于进行免疫测定的其它任何表面。多种结合方法是领域内已知的，并且通常由抗原与给定表面的交联、共价结合或物理吸附组成。然后在用于添加测验样品的配制液中洗涤固定的抗原。然后将待测验的样品等分与固定的抗原接触，并在合适的条件(例如25℃)下孵育足以允许任何抗体与样品中存在的胶原结合的时间段(例如2-40分钟)。接触时间的实际长度、缓冲液条件、温度等是易于调整的参数，并且对于给定的测验通常是容易获得的。孵育之后，洗涤包含任何结合抗体的固定的抗原并干燥，并与所述结合抗体特异的二抗一起孵育，所述二抗例如抗人IgG。二抗与用来指示二抗与抗体-固定的抗原复合物的结合的报告分子相连。
一种用于检测抗colV抗体的特定方法描述于WO 2007/120947中。具体而言，该珠子测定检测抗V型胶原抗体，所述抗体可以存在于患自身免疫应答V型胶原的患者的血清和/或肺灌洗液中。为该项测定提供V型胶原包被的珠子和其它必需试剂。简单而言，典型测定如下：1)用无菌PBS洗涤链霉亲和素包被的珠子(例如，来自于Polyscience,Warrington,PA的那些)。并将珠子悬浮于合适体积的具有人V型胶原的PBS中。2)用抗人V型胶原抗体的兔抗体(Bioten)(Abeam,Cambridge,MA)，按照上述1中相同的方法产生阳性对照。3)对于每次测定，将偶联的珠子在PBS中洗涤，并在PBS加肺灌洗液浆液中进行孵育。然后用含有10％FCS的PBS洗涤珠子。4)然后将珠子悬浮于无菌PBS+10％FBS中，并在室温下与二抗一起孵育。通常，使用与R-PE偶联的抗人IgG抗体(Sigma,Saint Louis)，但是如同本领域技术人员应当理解的，可以使用其它合适的抗体。在这方面中，在某些实施方案中，为了检测疾病进展中从一种亚型向另一种的转变，可以使用抗人IgG1-、IgG2-、IgG3-或IgG4-特异性抗体。将珠子在含有10％FCS的PBS中洗涤，悬浮于PBS/FCS溶液中，并利用流式细胞仪进行分析。对于阳性对照，可以向珠子测定中添加已知量的抗colV的抗血清或抗体。
通常，见于COPD和哮喘患者中的抗colV抗体是IgG，但是也可以存在其它抗体类型，例如IgM。此外，在本发明的某些实施方案中，抗V型胶原的IgG抗体亚型随疾病进展发生改变，所述V型胶原可以存在于患者的血清和/或肺灌洗液中。在这方面中，IgG亚型在疾病进展中可以发生转变，并且某些亚型可以指示疾病在恶化。因此，在疾病进展中可以存在任何一种或多种IgG亚型，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或以上的任何组合。本发明提供了利用本文所述的珠子测定检测V型胶原特异的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亚型抗体的方法。如同本领域技术人员应当认识到的，IgG亚型特异的抗体是可购买得到的，并且可用于本文所述的方法中。在某些实施方案中，IgG1的增加指示疾病在恶化。在另一实施方案中，转变成IgG2亚型指示疾病在恶化。在另一实施方案中，转变成IgG3亚型指示疾病在恶化。在另一实施方案中，转变成IgG4亚型指示疾病在恶化。
组合物、药物组合物和使用方法
可以通过用于提供相似功效的药剂的任何可接受的给药方式，以纯形式或合适的药物组合物来实施本发明的耐受原性化合物或组合物或其药学可接受的盐的给药。如本文其它地方所指出的，本文所考虑的一种用于诱导耐受性的途径是口服给药。然而，还可以使用多种其它途径中的任何一种，尤其包括静脉内注射、肌肉内注射、皮内注射、皮下注射以及其它途径。可以通过将本发明的化合物与合适的药学可接受的载体、稀释液或赋形剂组合来制备本发明的药物组合物，并且可以配制成固体、半固体、液体或气态形式的制剂，例如片剂、胶囊、粉末、颗粒、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球和气雾剂。此外，其它药学活性组分(包括其它免疫抑制剂)和/或诸如盐、缓冲液和稳定剂的合适的赋形剂可以，但不需要存在于组合物中。
可以通过多种不同的途径来实现给药，包括口服、肠胃外、鼻、静脉内、皮内、皮下或局部。给药的优选方式取决于待治疗或预防的疾病状态的性质。给药后，能降低、抑制、防止或延迟抗colV免疫应答或这类应答的临床适应症的发生的量被认为是有效的。
在某些实施方案中，所给予的量足以导致本文其它地方所述的免疫活性的降低(例如，T细胞应答、B细胞应答、抗colV抗体的水平等)。治疗的精确剂量和持续时间是待治疗疾病的函数，并且可以使用已知的测验方案通过经验来确定或者通过在领域内已知的模型系统中测验组合物并外推来确定。还可以进行可控的临床试验。剂量还可以随待缓解的疾病状态的严重程度而改变。药物组合物通常被配制和给药以发挥治疗有用的效应同时降低不需要的副作用的。组合物可以一次给药，或可以分成多个更小的剂量分多次给药。对于任何具体的患者，可以按照患者需求随时间调整具体的剂量方案。
本发明的组合物可以单独给药或与其它已知的治疗结合，例如免疫抑制方案、放射疗法、化学疗法、移植、口服胶原疗法、免疫疗法、激素疗法、光动力疗法。
给予这些组合物和相关药物组合物的典型途径因而包括但不限于，口服、局部、经皮、吸入、肺内灌注、肠胃外、舌下、口腔、直肠、阴道和鼻内途径。本文所用的术语肠胃外包括皮下注射、静脉内注射、肌肉内注射、胸骨内注射或灌输技术。本发明的组合物被配制成一旦将该组合物给予患者时允许其中所含的活性成分可为生物所利用。被给予个体或患者的组合物采用一或多剂量的形式，其中例如，片剂可以是单剂量单位，且气雾剂形式的本发明化合物的容器可以持有多个剂量单位。制备这类剂量形式的实际方法是已知的，或者对本领域技术人员而言是显而易见的；例如，参见Remington:The Science and Practice ofPharmacy,20th Edition(Philadelphia College of Pharmacy and Science,2000)。在任何情况下，按本发明的教导，待给予的组合物含有治疗有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐，用于治疗感兴趣的疾病或疾病状态。
本发明的药物组合物可以为固体或液体的形式。一方面，载体是微粒，使得组合物例如为片剂或粉末的形式。载体可以是液体，所述组合物例如为口腔油、可注射的液体或气雾剂(其例如可用于吸入给药)。
在某些实施方案中，将治疗化合物作为加压气雾剂或雾状制剂通过吸入直接给予患者的肺。这类制剂可以含有多种已知的气雾剂推进剂中的任何一种，所述气雾剂推进剂可用于肺内和/或鼻内吸入给药。此外，可以存在水，具有或不具有多种助溶剂、表面活性剂、稳定剂(例如，抗氧化剂、螯合剂、惰性气体和缓冲液)中的任何一种。对于待给予的来自多剂量容器的组合物而言，通常添加抗微生物剂。这类组合物还通常被过滤和灭菌，并且可以被冻干以提供增强的稳定性和改善溶解度。
当意图用于口服给药时，药物组合物优选为固体或液体形式，其中本文所认为的固体或液体形式包括半固体、半液体和凝胶形式。
作为用于口服给药的固体组合物，可以将药物组合物配制成粉末、颗粒、压缩片剂、丸剂、胶囊、口香糖、薄脆饼或类似形式。这类固体组合物通常含有一种或多种惰性稀释剂或可食用的载体。此外，可以存在一种或多种以下试剂：粘合剂，例如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；诸如淀粉、乳糖或糊精的赋形剂，诸如海藻酸、海藻酸钠、Primogel、玉米淀粉等的崩解剂；诸如硬脂酸镁或Sterotex的润滑剂；诸如胶态二氧化硅的助流剂；诸如蔗糖或糖精的甜味剂；诸如薄荷、甲基水杨酸或橙香精的调味剂和着色剂。
当药物组合物为胶囊，例如，明胶胶囊的形式时，除了上述类型的材料之外，其还可以含有诸如聚乙二醇或油的液体载体。
药物组合物可以为液体形式，例如，酏剂、糖浆剂、溶液、乳剂或悬浮液。作为两个实例，液体可用于口服给药或用于注射递送。当意图用于口服给药时，优选的组合物除了含有本化合物之外，还含有甜味剂、防腐剂、染料/着色剂和鲜味剂中的一种或多种。在意图通过注射给药的组合物中，可以含有表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲液、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。
本发明的液体药物组合物，无论它们是溶液、悬浮液还是其它类似形式，都可以含有以下佐剂中的一种或多种：诸如注射用水的无菌稀释液、盐水、优选生理盐水、林格氏液、等渗氯化钠、诸如合成的甘油一酯或甘油二脂的固定油(可以充当溶剂或悬浮介质)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯的抗菌剂；诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠的抗氧化剂；诸如乙二胺四乙酸的螯合剂；诸如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐的缓冲液和诸如氯化钠和右旋糖的用于调整渗透压的试剂。可以将肠胃外制剂封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。生理盐水是优选的佐剂。可注射的药物组合物优选是无菌的。
意图用于肠胃外或口服给药的本发明的液体药物组合物含有本发明化合物的量应当使得可以获取合适的剂量。通常，组合物中本发明化合物的量为至少0.01％。当意图用于口服给药时，该量可以在组合物重量的0.1-约70％间变化。某些口服药物组合物含有约4％-约75％的本发明的化合物。按照本发明，某些药物组合物和制剂被制备成一肠胃外剂量单位含有0.01-10％重量比的稀释前的本发明的化合物。
本发明的药物组合物可意图用于局部给药，在这种情况下，载体可适于包含溶液、乳剂、软膏或凝胶基质，所述基质例如可以包含以下的一种或多种：凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、诸如水和酒精的稀释液以及乳化剂和稳定剂。用于局部给药的药物组合物中可以存在增稠剂。如果意图用于经皮给药，则所述组合物可以含有透皮贴剂或离子电渗疗法装置。局部制剂含有本发明化合物的浓度可以为约0.1-约10％w/v(每单位体积的重量)。
本发明的药物组合物可意图用于直肠给药，例如为栓剂的形式，其可以在直肠中溶解并释放药物。用于直肠给药的组合物可以含有油脂性基质作为合适的无刺激性赋形剂。这类基质包括但不限于羊毛脂、可可脂和聚乙二醇。
本发明的药物组合物可以含有多种物质，其调整固体或液体剂量单位的物质形式。例如，组合物可以含有能在活性成分周围形成包被外壳的材料。能形成包被外壳的材料通常是惰性的，并且可以选自例如，糖、虫胶和其它肠衣包被剂。可选择地，可以将活性成分包封在明胶胶囊中。
固体或液体形式的本发明的药物组合物可以含有能与本发明化合物结合并进而促进所述化合物的递送的试剂。具有这种能力的合适的试剂包括单克隆或多克隆抗体、蛋白或脂质体。
本发明的药物组合物可以由可作为气雾剂给药的剂量单位组成。术语气雾剂用来表示从胶体性质的系统到由加压包装组成的系统的多种系统。可以通过液化或压缩的气体或通过能分散活性成分的合适的泵送系统来实现递送。为了递送活性成分，本发明化合物的气雾剂可以以单相、双相或三相系统实现递送。气雾剂的递送包括必需的容器、激活剂、泵、子容器等，它们在一起可以组成试剂盒。无需大量的实验，本领域技术人员就可以确定优选的气雾剂。
可以通过制药领域内公知的方法来制备本发明的药物组合物。例如，可以通过将本发明的化合物与无菌蒸馏水组合以便形成溶液来制备意图通过注射给药的药物组合物。可以添加表面活性剂以促进均匀溶液或悬浮液的形成。表面活性剂是与本发明化合物非共价相互作用的化合物，以便促进化合物在水性递送系统中的溶解或均匀悬浮。
本发明的化合物或其药学可接受的盐以治疗有效量被给药，该量随多种因素变化，包括所用的具体化合物的活性、化合物的代谢稳定性和作用长度、患者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食、给药的方式和时间、排泄速度、药物组成、具体病症或疾病状态的严重程度以及个体经历的治疗。通常，治疗有效的日剂量(对于70kg的哺乳动物而言)为约0.001mg/kg(即0.07mg)至约100mg/kg(即7.0g)；优选地，治疗有效剂量(对于70kg的哺乳动物而言)为约0.01mg/kg(即0.7mg)至约50mg/kg(即3.5g)；更优选地，治疗有效剂量(对于70kg的哺乳动物而言)为约1mg/kg(即70mg)至约25mg/kg(即1.75g)。
在某些实施方案中，口服给予colV的剂量为每天.001mg至500mg。在一个具体的实施方案中，本文所述的colV的口服剂量为每天0.01mg至50mg。在另一实施方案中，本文所述的colV的口服剂量为每天0.1mg至0.5mg。在一个实施方案中，colV的口服剂量为每天0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、or 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0mg。在另一实施方案中，colV的口服剂量可以为每天5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0mg。在某些实施方案中，剂量可以单一剂量给予或可以在一天内分多剂量给予，例如每天2、3或4次剂量，总共为每天具体的mg剂量。
如本文其它地方所描述，在某些实施方案中，本文所用的治疗有效剂量的colV是利用本文所述的各种方法检测到的足以诱导对colV的耐受性的剂量。在某些实施方案中，如通过本文所述的方法例如ELISA所检测的，对colV的耐受性的诱导导致血清抗colV抗体减少。在另一实施方案中，本文所用的治疗有效剂量的colV是利用本文所述的各种方法检测到的足以诱导T细胞对colV的耐受性的剂量，所述方法例如细胞因子释放测定、细胞内细胞因子染色和流式细胞术、ELISPOT等。还可以利用功能性T细胞测定，例如细胞毒性增殖测定。
本发明的化合物或其药学可接受的盐可以与一种或多种其它治疗剂同时给药，在其之前给药或在其之后给药。这种组合疗法包括单一药物剂量制剂的给药以及本发明化合物的给药和每种活性剂在其自身单独的药物剂量制剂中，所述单一药物剂量制剂含有本发明的化合物和一种或多种其它活性剂。例如，本发明的化合物和另一种活性剂可以在单一的口服剂量组合物(例如片剂或胶囊)中一起给予患者，或者每种试剂以单独的口服剂量制剂给药。如果使用单独的剂量制剂，本发明的化合物和一种或多种其它活性剂可以基本上在同一时间即同时给药，或者以单独的错开的时间即相继给药；组合疗法应被理解为包括所有这些方案。
本发明的化合物可以给予遭受本文所述疾病或病症折磨的个体，例如COPD和重度且持续的哮喘。对于体内治疗人类疾病而言，通常在给药之前，将本文所述的化合物并入药物组合物中。药物组合物包含一种或多种本文所述的化合物和本文其它地方所述的药学可接受的载体或赋形剂。为了制备药物组合物，将有效量的一种或多种化合物与本领域技术人员已知的适用于特定给药方式的任何药物载体或赋形剂混合。药物载体可以是液体、半固体或固体。用于肠胃外、皮内、皮下或局部应用的溶液或悬浮液可以包括例如，无菌稀释液(例如水)、盐水、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成的溶剂；抗微生物剂(例如苯甲醇和对羟基苯甲酸甲酯)；抗氧化剂(例如抗坏血酸和亚硫酸氢钠)和螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))；缓冲液(例如醋酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐)。如果静脉内给药，合适的载体包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)和含有增稠剂和加溶剂(例如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇和以上的混合物)的溶液。
本文所述的化合物可以与保护其免于从身体快速排除的载体一起制备，例如时间释放制剂或包被。这类载体包括受控释放制剂，例如但不限于，植入物和装入微胶囊的递送系统，以及生物可降解的、生物兼容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、聚原酸酯、聚乳酸和本领域技术人员已知的其它聚合物。
在某些实施方案中，能促进诱导耐受性的佐剂包括地塞米松(参见例如，Y.Kang,et al.,J.Immunol.2008,180:5172-5176)、脂多糖(LPS)和霍乱毒素亚基，并且可以被添加至制剂。还考虑将某些其它耐受原性载体与本发明的colV组合物一起使用。这类载体包括矿物油载体，例如弗氏不完全佐剂(IFA)或弗氏完全佐剂(CFA)。IFA是矿物油的乳剂。CFA是含有各种量的杀死的分支杆菌有机体的矿物油制剂。然而，IFA和CFA不允许用于人类，因为矿物油是不可代谢的，并且不能被人体降解。
在某些实施方案中，脂肪乳剂，其已用于人患者的静脉营养很多年了，其还可以作为利用本发明多肽的耐受原性多肽疗法的媒介。这类乳剂的两个实例是可购买到的称为Intralipid和Lipofundin的脂肪乳剂。“Intralipid”是Kabi Pharmacia,Sweden的注册商标，是用于静脉营养的脂肪乳剂，描述于美国专利第3,169,094号中。“Lipofundin”是B.Braun Melsungen,Germany的注册商标。两种均含有诸如脂肪的大豆油(1,000ml蒸馏水中100或200g：分别为10％或20％)。蛋黄磷脂是Intralipid中所用的乳化剂(12g/l蒸馏水)，且Lipofundin中是蛋黄卵磷脂(12g/l蒸馏水)。Intralipid和Lipofundin两者中的等渗性均由添加甘油(25g/l)导致。这些媒介被认为是实际的生物活性载体，当其与可疑自体抗原混合时，促进自身免疫T细胞的TH1至TH2的转移。在某些实施方案中，这类媒介是这样的脂肪乳剂，其含有10-20％的植物和/或动物来源的甘油三磷脂、1.2-2.4％的植物和/或动物来源的磷脂、2.25-4.5％渗透压调节剂、0-0.05％抗氧化剂并用无菌水加至100％。
在某些实施方案中，colV或其耐受原性片段可以连接至白喉毒素受体以增强GI摄入。
本发明的耐受原性组合物可用于治疗哮喘和COPD和colV自身免疫相关的其它肺病。因此，在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗慢性阻塞性肺病的方法，包括向所述COPD患者给予治疗有效量的V型胶原、或其耐受原性片段或免疫原性片段，所述免疫原性片段以有效诱导耐受性的剂量给予。在这方面中，COPD患者可以患肺气肿或慢性阻塞性支气管炎。
本发明另一方面提供了用于治疗哮喘的方法，包括向所述哮喘患者给予治疗有效量的V型胶原或其耐受原性片段或免疫原性片段，所述免疫原性片段以有效诱导耐受性的剂量给予。在这方面中，哮喘患者可以患有重度、持续的哮喘。在另一实施方案中，本发明提供了用于降低哮喘患者哮喘严重程度的方法。
本发明还提供了用于预防有发展成慢性阻塞性肺病风险的个体中慢性阻塞性肺病的发展的方法，包括向所述个体给予治疗有效量的V型胶原或其耐受原性片段。
如本文其它地方所指出的，可以给予完整的colV或其成分α链的任何一种或多种或上述任一分子的耐受原性片段。此外，同样如本文其它地方所指出的，可以按本文所述的任何方法，使用有效诱导对colV的耐受性的剂量，给予完整的colV或其成分α链的任何一种或多种的免疫原性片段。这种剂量可以随多种因素变化，包括所用的具体蛋白或片段的活性、这些化合物的代谢稳定性和作用长度、患者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食、给药的方式和时间、排泄速度、药物组成、具体病症或疾病状态的严重程度以及个体经历的治疗。因此，这种耐受原性剂量可以使用已知的测验方案通过经验来确定或者通过在领域内已知的模型系统中测验组合物并外推来确定。还可以进行可控的临床试验。剂量还可以随待缓解的疾病状态的严重程度而改变。
如同本领域技术人员所理解的，多种因素可被评价从而确定用于治疗、预防或降低COPD或哮喘的严重程度的本发明的化合物和方法的有效性。这些因素包括可为临床医生进行评价的哮喘或COPD的典型临床症状。这些症状可以包括但不限于：对于哮喘而言：哮鸣、胸部紧迫感或疼痛、心率加快、发汗、如通过最大流量计所测量的流速最高、咳嗽频繁，尤其在夜间、容易喘不上气或气短、当运动时感到非常疲惫或虚弱、运动后哮鸣或咳嗽、感到疲惫、易烦躁、坏脾气、或情绪多变、如通过最大流量计所测量的肺功能减弱或改变、伤寒或过敏症(打喷嚏、流鼻涕、咳嗽、鼻塞、咽喉痛和头痛)的迹象、失眠。这些因素包括COPD的典型临床症状，例如但不限于，产生的痰的量、痰的密度和粘性、痰的颜色和痰中带血、气短的严重程度、咳嗽和/或哮鸣；脚踝肿胀；健忘、糊涂、言语含糊和瞌睡；失眠；使用更多的枕头或睡在椅子上而不是床上，以避免气短；体重莫名其妙的增加或降低；持续性疲劳和没劲；丧失性冲动；早晨头痛、头晕目眩、心神不定。
本发明的组合物和方法可以与用于COPD和哮喘的其它已知治疗联合使用，例如但不限于皮质类固醇(例如，强的松、氟替卡松、甲基强的松龙)、支气管扩张药(例如，短效和长效的β2-激动剂、茶碱、吡布特罗、麻黄碱、舒喘灵、沙美特罗、左沙丁胺醇、双氯醇胺异丙托溴胺)和白三烯调节剂(例如，孟鲁司特、扎鲁司特、弃白通)。
参考文献
以下参考文献通过引用具体并入本文，它们提供示例性方案或其它详情的程度补充了本文所示的那些实施方案。Chen,Inobe,Marks,Gonnella,Kuchroo,Weiner,“Peripheral deletion of antigen-reactive T cells in oral tolerance(口服耐受性中抗原反应性T细胞的外部删除)”Nature,376:177-180,1995.Chen,Kuchroo,Inobe,Hafler,Weiner,"Regulatory T-cell clones induced by oral tolerance:suppressionof autoimmune encephalomyelitis(由口服耐受性诱导的调节型T细胞克隆：自身免疫性脑脊髓炎的抑制)"Science,265:1237-1240,1994.Chiang,Mainardi,Seyer,"Type V(A-B)collagen induces platelet aggregation(V(A-B)型胶原诱导血小板聚集)"J.Lab.Clin.Med.,95:99-107,1980.Cremer,Ye,Terato,Owens,Seyer,Kang,"Type XIcollagen-induced arthritis in the Lewis rat:characterization of cellular andhumoral immune responses to native types XI,V,and II collagen and constituentα-chains(路易鼠中XI型胶原诱导的关节炎：对天然的XI型、V型和II型胶原和成分α链的细胞和体液免疫应答的表征)"J.Immunol.153:824-832,1994.Danzer,Kirchner,Rink,"Cytokine interactions in human mixed lymphocyte culture(人类混合淋巴细胞混合物中细胞因子的相互作用)"Transplantation,57(11):1638-1642,1994.DeMeester,Rolfe,Kunkel,Swiderski,Lincoln,Deeb,Strieter,"The bimodal 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实施例
实施例1
COPD患者中抗V型胶原抗体增加
血浆获自正常的志愿者(不吸烟的成年人，年龄为18-55)和被证实患有肺气肿的志愿者。按照WO 2007/120947中所描述的流式细胞术珠子测定法检测COPD患者和对照健康个体中抗colV抗体的水平。
简单而言，1)用无菌PBS将链霉亲和素包被的珠子(5μm，结合能力：10-20μg/1×107珠子(Polyscience,Warrington,PA))洗涤两次。将珠子(1×107)悬浮于100μl具有40μg人V型胶原的PBS中，并于4℃孵育60分钟。2)用20μm兔抗人V型胶原抗体的抗体(Bioten)(Abeam,Cambridge,MA)，按照上述1中相同的方法产生阳性对照。3)对于每次测定，将1×106偶联的珠子在PBS中洗涤两次，并在加50μl血清的100μl PBS中进行孵育。室温下孵育30分钟后，用含有10％FCS的PBS将珠子洗涤三次。4)将珠子悬浮于无菌PBS+10％FBS中，并在室温下与二抗孵育大约30分钟。通常，使用与R-PE偶联的5μl抗人IgG抗体(Sigma,SaintLouis)。将珠子在含有10％FCS的PBS中洗涤三次，悬浮于300μl PBS/FCS溶液中，并利用流式细胞仪进行分析。
如图1所示，与对照相比(N＝42)，COPD患者(N＝16)中抗V型胶原抗体显著升高。
实施例2
哮喘患者中抗V型胶原抗体增加
血浆获自正常的志愿者(不吸烟的成年人，年龄为18-55)和被证实患有慢性哮喘的志愿者。用实施例1中概括的珠子测定法检测哮喘患者和对照志愿者个体中抗colV抗体的水平。
如图2所示，在20名哮喘患者中发现8名患者的抗V型胶原抗体的水平提高。
实施例3
小鼠静脉内的V型胶原防止卵白蛋白诱导的气道高反应性
本实施例证实，在该建立良好的鼠哮喘模型中，V型胶原的静脉内给药防止卵白蛋白诱导的气道高反应性。
用100μg单独的col(V)、或混在弗氏完全佐剂(CFA)中的col(V)、或PBS或单独的CFA经尾静脉注射Balb/c小鼠。7天之后，小鼠接受于明矾中的卵白蛋白的IP注射，7天之后重复一次。在最后一次卵白蛋白/明矾注射之后7天，用增加剂量的气雾化卵白蛋白激发每组中的小鼠，随后测量气道阻力(PenH)。
结果显示，单独的col(V)消除了卵白蛋白诱导的气道高反应性(参见图3)。进行其它的实验来证实这些结果。这些结果总结在以下的表2中。
实施例4
静脉内的Col(V)在肺单核细胞中诱导IFN-γ转录本
本实施例显示，单独col(V)的静脉注射在肺单核细胞中诱导TH1应答，特征为诱导出IFN-γ转录本。用100μg单独的col(V)经尾静脉、单独的CFA在尾基部、colV加CFA在尾基部或单独的PBS经静脉对Balb/c小鼠进行注射。7天之后，小鼠接受于明矾中的卵白蛋白的IP注射，7天之后重复一次。在最后一次卵白蛋白/明矾注射之后7天，用增加剂量的气雾化乙酰甲胆碱激发每组中的小鼠，随后测量响应于乙酰甲胆碱激发的气道阻力(PenH)。从每个处理组的小鼠的肺实质分离的单核细胞中提取RNA，并进行定量PCR用于测定IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ和IL-10的表达水平(参见图4；数据代表从每组5只小鼠的肺单核细胞合并的RNA)。
实验结果指示，静脉内单独给予Col(V)在肺单核细胞中诱导出IFN-γ转录本。IFN-γ拮抗IL-13和IL4，IL-13和IL4两种细胞因子被认为在哮喘发病机理中起重要作用。因此，不希望受理论的束缚，对抗IL4/IL13效应的该TH1应答的诱导在卵白蛋白诱导的哮喘中colV介导的保护性效应中起作用。
本说明书中涉及的和/或申请数据表中列举的所有上述美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物都通过引用全文并入本文。
从上述应当理解，尽管为了说明的目的，本文描述了本发明的具体实施方案，但是在不脱离本发明的实质和范围的条件下可以进行多种修改。因此，本发明仅受所附权利要求书的限制。
序列表
<110> 印第安那大学科技研究公司
<120> 用于治疗慢性阻塞性肺病和哮喘的组合物和方法
<130> 480266.404PC
<140> PCT
<141> 2010-04-22
<150> US 61/266,048
<151> 2009-12-02
<150> US 61/171,705
<151> 2009-04-22
<160> 6
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 8439
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
cgcactctcc gtccccgcgg ctggcgcagg acctcactcg agcggagcgc ccacggggag 60
cgggtcgcgg ggcggcggcg gcgaggagga ggcgagaagg agttggagga ggaggaggag 120
gaggcgaggg cgagctagcc cagcggggtc ccggccgccc cgcgggccaa agtcgagccc 180
tcccgcccgt gggcgagcgc gccagccgcc ccttccagaa cagccgccgc cacaaagaag 240
aacggggggt gccgaggtcc ccatgacctc ctaaagtggt gcggtccctg ctgagtgcgc 300
tgcccgggcc gtgacccgcg cccctgtgcg tccccgcgcg cctccgagcg cccctgtgcg 360
ccccggcccg cgccccgccg gcatggacgt ccatacccgc tggaaagcgc gcagcgcgct 420
ccgcccgggc gccccgctgc tgcccccgct gctgctgctg ctgctgtggg cgccgcctcc 480
gagccgcgca gctcagccag cagatctcct gaaggttcta gattttcaca acttgcctga 540
tggaataaca aagacaacag gcttttgcgc cacgcggcga tcttccaaag gcccggatgt 600
cgcttacaga gtcaccaaag acgcgcagct cagcgcaccc accaagcagc tgtaccctgc 660
gtctgcattt cccgaggact tctccatcct aacaactgtg aaagccaaga aaggcagcca 720
ggccttcctg gtctccatct acaacgagca gggtatccag cagattgggc tggagctggg 780
ccgctctccc gtcttcctct acgaggacca cacggggaag cctggcccgg aagactaccc 840
cctcttccgg ggcatcaacc tgtcagatgg caagtggcac agaattgctc tcagcgtcca 900
caagaaaaat gtcaccttga tcctcgactg taaaaagaag accaccaaat tcctcgaccg 960
cagcgaccac cccatgatcg acatcaatgg catcatcgtg tttggcaccc ggatcctgga 1020
tgaggaggtg tttgagggtg acatccagca gctgctcttt gtctcggacc accgggcagc 1080
ttatgattac tgtgagcact acagccctga ctgtgacacc gcagtacctg acaccccaca 1140
gtcgcaggac cccaatccag atgaatatta cacggaagga gacggcgagg gtgagaccta 1200
ttactacgaa tacccctact acgaagaccc cgaagaccta gggaaggagc ccacccccag 1260
caagaagccc gtggaagctg ccaaagaaac cacagaggtc cccgaggagc tgaccccgac 1320
ccccacggaa gctgctccca tgcctgaaac cagtgaaggg gctgggaagg aagaggacgt 1380
cggcatcggg gactatgact acgtgcccag tgaggactac tacacgccct caccgtatga 1440
tgacctcacc tatggcgagg gggaggagaa ccccgaccag cccacagacc caggcgctgg 1500
ggccgaaatt cccaccagca ccgccgacac ctccaactcc tccaatccag ctccgcctcc 1560
aggggaaggt gcggatgact tggaggggga gttcactgag gaaacgatcc ggaaccttga 1620
cgagaactac tacgacccct actacgaccc caccagctcc ccgtcggaga tcgggccggg 1680
aatgccggcg aaccaggata ccatctatga agggattgga ggacctcggg gcgagaaagg 1740
ccaaaaggga gaaccagcga ttatcgagcc gggcatgctc atcgagggcc cgcctggccc 1800
agaaggcccc gcgggtcttc ccggacctcc aggaaccatg ggtcccactg gccaagtcgg 1860
ggaccctgga gaaaggggcc cccctggacg cccaggcctt cctggggccg atggcctgcc 1920
cggtcctcca ggaaccatgc tcatgctgcc cttccggttt ggaggtggcg gcgatgcggg 1980
ctccaaaggc cccatggtct cagcccagga gtcccaggcg caagccattc tccagcaggc 2040
caggttggca ctgaggggac cagctggccc gatgggtctc acagggagac ctggccctgt 2100
gggtccccct gggagcggag gtttgaaggg cgagccggga gacgtggggc ctcagggtcc 2160
tcgaggtgtg caaggcccgc ctggtccggc cgggaagccc ggaagacggg gtcgggctgg 2220
gagtgatgga gccagaggaa tgcctggaca aactggcccc aagggtgacc ggggtttcga 2280
cggcctggct gggttgccag gcgagaaggg ccacaggggt gaccctggtc cttccggccc 2340
accaggacct ccgggagacg atggagaaag gggtgacgac ggagaagttg ggcccagggg 2400
gctgcctggg gagcccgggc cacgtggtct gcttgggccg aaggggcccc caggtcctcc 2460
cggacctccc ggtgtcacgg gtatggacgg ccagccgggg ccaaaaggaa atgtgggtcc 2520
ccagggagag cctggccccc caggacagca gggtaatcca ggcgcccagg gtcttccagg 2580
cccccagggt gcaattggtc ctccaggaga aaagggtccc ttggggaaac caggccttcc 2640
aggaatgccc ggtgctgacg gacccccggg acaccctggc aaagaaggcc ctccaggaga 2700
gaaaggaggt cagggtccac ctggccccca gggtccgatt ggctacccag gtcctcgagg 2760
agtcaagggg gccgatggca tccgtggtct gaagggcaca aagggcgaga agggtgaaga 2820
cggctttcct gggtttaaag gagacatggg catcaagggt gatcgggggg agatcggccc 2880
acccggtccc aggggagaag atggccctga aggcccaaag ggtcgcggag gtcccaatgg 2940
tgaccccggt cctctgggac cccctgggga gaagggaaaa ctcggagtcc cagggttacc 3000
agggtatcca ggaagacaag gaccaaaggg ctctattgga ttccctggat ttcctggcgc 3060
caatggagag aagggcggca gggggacccc tggaaagcca ggaccgcggg ggcagcgagg 3120
cccaacgggt ccgaggggtg aaagaggccc ccggggcatc actgggaagc ctggccccaa 3180
gggcaactcc ggaggtgacg gcccagctgg ccctcctggt gaacggggac ccaatggacc 3240
ccaaggaccc acaggatttc ctggaccaaa gggcccccct ggccctccag gcaaggatgg 3300
actcccagga caccctggac agagaggcga gactggtttc caaggcaaga ccggccctcc 3360
aggccccccc ggcgtggtcg gccctcaggg tcccacggga gaaacgggcc caatgggtga 3420
gcgtggccac cctgggcccc ctggaccccc cggtgaacag gggcttccgg gccttgctgg 3480
aaaagaaggg acgaagggtg acccaggccc tgcaggcctc cctgggaaag atggccctcc 3540
aggattacgt ggtttccctg gggaccgagg gcttcctggt ccagtgggag ctcttggact 3600
gaaaggcaat gaagggcccc ctggcccacc aggccctgcg ggatctccag gggagagagg 3660
tccagctgga gccgctgggc ccatcggaat tccagggaga cctgggcccc agggaccccc 3720
agggccggca ggagagaaag gggctcctgg cgagaaaggc ccacaaggcc cagctggccg 3780
agacggtctc caggggcctg tggggctccc gggtccagct ggccctgtgg gtccccctgg 3840
agaagacgga gataagggag agatcgggga gccggggcag aaaggaagca agggggacaa 3900
aggagaacag ggtcctcctg ggcctacagg tcctcaaggc cccatcggac agccaggccc 3960
ctctggagct gacggcgagc cggggcctcg gggccagcag ggccttttcg ggcagaaagg 4020
tgatgaaggt cccagaggct ttcctggacc ccctgggcca gtggggctgc agggtttgcc 4080
aggacctcca ggcgagaagg gtgagacagg agacgtgggc cagatgggcc ccccgggtcc 4140
ccctggcccc cgaggaccct ccggagctcc aggtgctgat ggcccacaag gtcccccagg 4200
tggaatagga aaccctggtg cagtgggaga gaagggcgag cctggcgaag caggtgagcc 4260
tggccttccg ggagaaggcg gccccccggg acccaaagga gaaaggggag agaagggcga 4320
gtcaggccct tcaggtgctg ccggaccccc tggacccaaa ggccctcccg gagatgatgg 4380
tcccaaaggc agccctggcc cagtgggttt tcctggagat cctggccccc ccggagagcc 4440
tggccccgcg ggtcaagatg gtccccctgg tgacaaagga gatgatggtg aacccgggca 4500
gacgggatcc cccggcccta ctggtgaacc aggtccatcg gggcctccag gaaaaagggg 4560
tcccccaggc cccgcaggcc ccgaaggcag acagggagag aaaggggcca agggagaagc 4620
cggcttggaa ggccctcctg ggaagactgg ccccatcggc ccccaggggg cccctgggaa 4680
gcccggaccg gatggccttc gagggatccc tggccctgtg ggagaacaag gtctcccagg 4740
atccccaggc ccggacggtc cccccggccc catgggtccc ccaggacttc ccggcctcaa 4800
aggagattct ggtcccaaag gtgaaaaggg tcatccaggc ctgatcgggc tcatcggtcc 4860
tccgggtgaa cagggtgaga agggcgaccg tggtctccct ggcccccagg gctcctccgg 4920
tcctaaggga gaacagggta tcactggtcc ttctggcccg attgggcctc ctgggccccc 4980
tggcctgccg ggtccgcctg gtccaaaagg tgctaagggc tcctcgggtc caactggccc 5040
gaagggtgag gcaggccacc caggaccccc aggccccccg ggccccccgg gagaggtcat 5100
ccagcccctg ccaatccagg catccaggac gcggcggaac atcgacgcca gccagctgct 5160
ggacgacggg aatggcgaga actacgtgga ctacgcggac ggcatggaag agatcttcgg 5220
ctctctcaac tctctgaagc tggagattga gcagatgaaa cggcccctgg gcacgcagca 5280
gaaccccgcc cgcacctgca aggacctgca gctctgccac cccgacttcc cagatggtga 5340
atactgggtc gatcctaacc aaggatgctc cagggattcc ttcaaggttt actgcaactt 5400
cacagccggg gggtcgacat gcgtcttccc tgacaagaag tccgaagggg ccagaatcac 5460
ttcttggccc aaagaaaacc cgggctcctg gttcagtgaa ttcaagcgtg ggaaactgct 5520
ctcctatgtg gacgccgagg gcaaccctgt gggtgtggta cagatgacct tcctgcggct 5580
gctgagcgcc tctgcccacc agaacgtcac ctaccactgc taccagtcag tggcctggca 5640
ggacgcagcc acgggcagct acgacaaggc cctccgcttc ctgggctcca acgacgagga 5700
gatgtcctat gacaacaacc cctacatccg cgccctggtg gacggctgtg ctaccaagaa 5760
aggctaccag aagacggttc tggagatcga cacccccaaa gtggagcagg tgcccatcgt 5820
ggacatcatg ttcaatgact tcggtgaagc gtcacagaaa tttggatttg aagtggggcc 5880
ggcttgcttc atgggctagg agccgccgag cccgggctcc cgagagcaac ctcgtgacct 5940
cagcatgcca ttcgttcgtg agtgtcccgt gcacgtcctg accctggaca gtgaaggctt 6000
ctccctcccc tcccacctga cttcatctac gcctcggcac cacggggtgt gggaccccag 6060
cccggagaga acagagggaa ggagccgcgc ccccacctgg agctgaatca catgacctag 6120
ctgcacccca gcgcctgggc ccgccccacg ctctgtccac acccacgcgc cccgggagcg 6180
gggccatgcc tccagccccc cagctcgccc gacccatcct gttcgtgaat aggtctcagg 6240
ggttggggga gggactgcca gatttggaca ctatattttt ttctaaattc aacttgaaga 6300
tgtgtatttc ccctgacctt caaaaaatgt tccaaggtaa gcctcgtaaa ggtcatccca 6360
ccatcaccaa agcctccgtt tttaacaacc tccaacacga tccatttaga ggccaaatgt 6420
cattctgcag gtgccttccc gatggattaa aggtgcttat gtttttgtga gttttaagta 6480
aatatttgta ttgtattgtt ataaatgtta agtgtgcctg gctttcaatc atgcacggaa 6540
acccagtctc agtcccacgg acagaatggg cgaggcatgg attctgggtt gcagtaccgt 6600
tctgattaga aataggaagt ctccccaccc ccgccctggc caagaacgtg caataaattg 6660
gaagtttgcc ccggggcagc aagaatttat gctgccattg aaaagcaggt accagtgccc 6720
cttttcagac agtttttgat tcgctctaga cttttttttt ttttaatagg gaaaaaattt 6780
gataattttc ttttttctac atgcacttaa gactaaaaca caggtttgga ttaattttat 6840
ttgcttcctt tttccgcttt tcttcccgca gagcctgatg ggagaatgtc cagggcaggg 6900
aaaccacatt ttttgtaggt gataactcaa tgaaaattgg tgcttatttt ttacacttct 6960
ctcttgtggc tctcttgtgg tgctatctat ctgttttaag gtctccttga aggcgcactg 7020
gggaccctgg ccatgcctcg ttctccctgc tttctttatc ctgttattgc ctccacagtc 7080
tgttgccaag gactctaaga tcaatgcacg tcactttcct ttccactggg caggatagcc 7140
aagcacactc cctcctgcgc tctcccgccc cggtgcgtcc actcccgagg gctgttatga 7200
ggactgggtt gtgcctactt gatttgaaaa cacacacaag caataaaaag cctcttcctg 7260
cattgtctgt ggtgtgacca tagcagatta tatttggttc ctgaatgttt gtggtgctaa 7320
tttctgtgtt tgttccaagc cgttcagtca tgccatgcgc tgcctcggta gatggagtaa 7380
tgtacaatga actccatgag tctctccagg gctgcctgca gcacgtcttt tccaagtagc 7440
ctatttggat tcccatctca aatgtcctgg atgcgagcgt cagcggctcc agagctcggg 7500
gcgggtgagg tcccctttgg ggaacccttt cctggccatc gaggtcgggg ggctgccgtc 7560
tgtgggcagg aggacccgag gggcagccag gaaaggcgat ctcttcactg tgaaaagttg 7620
cccgggtgca gcgccttttc cttctaccat gggaaatgca ggctgggccc ttggggtgag 7680
cctgcggggc tctggtgctg tccccgaccc ccaccaccac cagaatgcag ttccagctta 7740
ggaagccaca aacaagccac ccaggaggaa caaaacaccg ccagcgtgga ttttccaaat 7800
ttccctggaa agtaagtctc gctcttgcca aagaaaagtc tggcttggag agtctctgga 7860
gcccaggatg ccagcatgtg ccaatgactg tcaccttcat ctcttcaaaa gaaaagccat 7920
agccgaggac tgtcccgcga cccccgtgga ctgcgtctag gtcatgtgat tctgttttca 7980
tttctcatcc catccaattt gtccttttct cctgtcattt tcttcctctg tggtcccttc 8040
aaagttgtta taatttgtac tgaacttcaa aatgtgtccc gttctcccca gaccactcta 8100
gccacagtat attgcaataa aattacttct tatatttgca gaaattcttt tggtgtaatt 8160
ttattttttc ctctcaatat atataattgg acaaacgctg gcaaaaagaa aaaaatggta 8220
agcaaaaaac ccaagataaa gtttcgagga catcaggcct tttgaaatac aatgtcaaat 8280
gacacattgt acggtttcaa aaaatccgct agacatgtca taagttttaa ctgtaatgcc 8340
caggaaagga tatcttaaaa tattctaaac ttgtgtaaca aaggaataat taactgtaat 8400
agtttttcaa taaatcgagt tgggtgtttc caccgtaaa 8439
<210> 2
<211> 1838
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Met Asp Val His Thr Arg Trp Lys Ala Arg Ser Ala Leu Arg Pro Gly
1 5 10 15
Ala Pro Leu Leu Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp Ala Pro Pro
20 25 30
Pro Ser Arg Ala Ala Gln Pro Ala Asp Leu Leu Lys Val Leu Asp Phe
35 40 45
His Asn Leu Pro Asp Gly Ile Thr Lys Thr Thr Gly Phe Cys Ala Thr
50 55 60
Arg Arg Ser Ser Lys Gly Pro Asp Val Ala Tyr Arg Val Thr Lys Asp
65 70 75 80
Ala Gln Leu Ser Ala Pro Thr Lys Gln Leu Tyr Pro Ala Ser Ala Phe
85 90 95
Pro Glu Asp Phe Ser Ile Leu Thr Thr Val Lys Ala Lys Lys Gly Ser
100 105 110
Gln Ala Phe Leu Val Ser Ile Tyr Asn Glu Gln Gly Ile Gln Gln Ile
115 120 125
Gly Leu Glu Leu Gly Arg Ser Pro Val Phe Leu Tyr Glu Asp His Thr
130 135 140
Gly Lys Pro Gly Pro Glu Asp Tyr Pro Leu Phe Arg Gly Ile Asn Leu
145 150 155 160
Ser Asp Gly Lys Trp His Arg Ile Ala Leu Ser Val His Lys Lys Asn
165 170 175
Val Thr Leu Ile Leu Asp Cys Lys Lys Lys Thr Thr Lys Phe Leu Asp
180 185 190
Arg Ser Asp His Pro Met Ile Asp Ile Asn Gly Ile Ile Val Phe Gly
195 200 205
Thr Arg Ile Leu Asp Glu Glu Val Phe Glu Gly Asp Ile Gln Gln Leu
210 215 220
Leu Phe Val Ser Asp His Arg Ala Ala Tyr Asp Tyr Cys Glu His Tyr
225 230 235 240
Ser Pro Asp Cys Asp Thr Ala Val Pro Asp Thr Pro Gln Ser Gln Asp
245 250 255
Pro Asn Pro Asp Glu Tyr Tyr Thr Glu Gly Asp Gly Glu Gly Glu Thr
260 265 270
Tyr Tyr Tyr Glu Tyr Pro Tyr Tyr Glu Asp Pro Glu Asp Leu Gly Lys
275 280 285
Glu Pro Thr Pro Ser Lys Lys Pro Val Glu Ala Ala Lys Glu Thr Thr
290 295 300
Glu Val Pro Glu Glu Leu Thr Pro Thr Pro Thr Glu Ala Ala Pro Met
305 310 315 320
Pro Glu Thr Ser Glu Gly Ala Gly Lys Glu Glu Asp Val Gly Ile Gly
325 330 335
Asp Tyr Asp Tyr Val Pro Ser Glu Asp Tyr Tyr Thr Pro Ser Pro Tyr
340 345 350
Asp Asp Leu Thr Tyr Gly Glu Gly Glu Glu Asn Pro Asp Gln Pro Thr
355 360 365
Asp Pro Gly Ala Gly Ala Glu Ile Pro Thr Ser Thr Ala Asp Thr Ser
370 375 380
Asn Ser Ser Asn Pro Ala Pro Pro Pro Gly Glu Gly Ala Asp Asp Leu
385 390 395 400
Glu Gly Glu Phe Thr Glu Glu Thr Ile Arg Asn Leu Asp Glu Asn Tyr
405 410 415
Tyr Asp Pro Tyr Tyr Asp Pro Thr Ser Ser Pro Ser Glu Ile Gly Pro
420 425 430
Gly Met Pro Ala Asn Gln Asp Thr Ile Tyr Glu Gly Ile Gly Gly Pro
435 440 445
Arg Gly Glu Lys Gly Gln Lys Gly Glu Pro Ala Ile Ile Glu Pro Gly
450 455 460
Met Leu Ile Glu Gly Pro Pro Gly Pro Glu Gly Pro Ala Gly Leu Pro
465 470 475 480
Gly Pro Pro Gly Thr Met Gly Pro Thr Gly Gln Val Gly Asp Pro Gly
485 490 495
Glu Arg Gly Pro Pro Gly Arg Pro Gly Leu Pro Gly Ala Asp Gly Leu
500 505 510
Pro Gly Pro Pro Gly Thr Met Leu Met Leu Pro Phe Arg Phe Gly Gly
515 520 525
Gly Gly Asp Ala Gly Ser Lys Gly Pro Met Val Ser Ala Gln Glu Ser
530 535 540
Gln Ala Gln Ala Ile Leu Gln Gln Ala Arg Leu Ala Leu Arg Gly Pro
545 550 555 560
Ala Gly Pro Met Gly Leu Thr Gly Arg Pro Gly Pro Val Gly Pro Pro
565 570 575
Gly Ser Gly Gly Leu Lys Gly Glu Pro Gly Asp Val Gly Pro Gln Gly
580 585 590
Pro Arg Gly Val Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Lys Pro Gly Arg
595 600 605
Arg Gly Arg Ala Gly Ser Asp Gly Ala Arg Gly Met Pro Gly Gln Thr
610 615 620
Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Phe Asp Gly Leu Ala Gly Leu Pro Gly
625 630 635 640
Glu Lys Gly His Arg Gly Asp Pro Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Pro
645 650 655
Pro Gly Asp Asp Gly Glu Arg Gly Asp Asp Gly Glu Val Gly Pro Arg
660 665 670
Gly Leu Pro Gly Glu Pro Gly Pro Arg Gly Leu Leu Gly Pro Lys Gly
675 680 685
Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Val Thr Gly Met Asp Gly Gln
690 695 700
Pro Gly Pro Lys Gly Asn Val Gly Pro Gln Gly Glu Pro Gly Pro Pro
705 710 715 720
Gly Gln Gln Gly Asn Pro Gly Ala Gln Gly Leu Pro Gly Pro Gln Gly
725 730 735
Ala Ile Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly Pro Leu Gly Lys Pro Gly Leu
740 745 750
Pro Gly Met Pro Gly Ala Asp Gly Pro Pro Gly His Pro Gly Lys Glu
755 760 765
Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly Gly Gln Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly
770 775 780
Pro Ile Gly Tyr Pro Gly Pro Arg Gly Val Lys Gly Ala Asp Gly Ile
785 790 795 800
Arg Gly Leu Lys Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Asp Gly Phe Pro
805 810 815
Gly Phe Lys Gly Asp Met Gly Ile Lys Gly Asp Arg Gly Glu Ile Gly
820 825 830
Pro Pro Gly Pro Arg Gly Glu Asp Gly Pro Glu Gly Pro Lys Gly Arg
835 840 845
Gly Gly Pro Asn Gly Asp Pro Gly Pro Leu Gly Pro Pro Gly Glu Lys
850 855 860
Gly Lys Leu Gly Val Pro Gly Leu Pro Gly Tyr Pro Gly Arg Gln Gly
865 870 875 880
Pro Lys Gly Ser Ile Gly Phe Pro Gly Phe Pro Gly Ala Asn Gly Glu
885 890 895
Lys Gly Gly Arg Gly Thr Pro Gly Lys Pro Gly Pro Arg Gly Gln Arg
900 905 910
Gly Pro Thr Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Arg Gly Ile Thr Gly
915 920 925
Lys Pro Gly Pro Lys Gly Asn Ser Gly Gly Asp Gly Pro Ala Gly Pro
930 935 940
Pro Gly Glu Arg Gly Pro Asn Gly Pro Gln Gly Pro Thr Gly Phe Pro
945 950 955 960
Gly Pro Lys Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Lys Asp Gly Leu Pro Gly
965 970 975
His Pro Gly Gln Arg Gly Glu Thr Gly Phe Gln Gly Lys Thr Gly Pro
980 985 990
Pro Gly Pro Pro Gly Val Val Gly Pro Gln Gly Pro Thr Gly Glu Thr
995 1000 1005
Gly Pro Met Gly Glu Arg Gly His Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
1010 1015 1020
Glu Gln Gly Leu Pro Gly Leu Ala Gly Lys Glu Gly Thr Lys Gly Asp
1025 1030 1035 1040
Pro Gly Pro Ala Gly Leu Pro Gly Lys Asp Gly Pro Pro Gly Leu Arg
1045 1050 1055
Gly Phe Pro Gly Asp Arg Gly Leu Pro Gly Pro Val Gly Ala Leu Gly
1060 1065 1070
Leu Lys Gly Asn Glu Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ser
1075 1080 1085
Pro Gly Glu Arg Gly Pro Ala Gly Ala Ala Gly Pro Ile Gly Ile Pro
1090 1095 1100
Gly Arg Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu Lys Gly
1105 1110 1115 1120
Ala Pro Gly Glu Lys Gly Pro Gln Gly Pro Ala Gly Arg Asp Gly Leu
1125 1130 1135
Gln Gly Pro Val Gly Leu Pro Gly Pro Ala Gly Pro Val Gly Pro Pro
1140 1145 1150
Gly Glu Asp Gly Asp Lys Gly Glu Ile Gly Glu Pro Gly Gln Lys Gly
1155 1160 1165
Ser Lys Gly Asp Lys Gly Glu Gln Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Pro
1170 1175 1180
Gln Gly Pro Ile Gly Gln Pro Gly Pro Ser Gly Ala Asp Gly Glu Pro
1185 1190 1195 1200
Gly Pro Arg Gly Gln Gln Gly Leu Phe Gly Gln Lys Gly Asp Glu Gly
1205 1210 1215
Pro Arg Gly Phe Pro Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly Leu Gln Gly Leu
1220 1225 1230
Pro Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly Glu Thr Gly Asp Val Gly Gln Met
1235 1240 1245
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Pro Ser Gly Ala Pro Gly
1250 1255 1260
Ala Asp Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Gly Ile Gly Asn Pro Gly Ala
1265 1270 1275 1280
Val Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Glu Ala Gly Glu Pro Gly Leu Pro
1285 1290 1295
Gly Glu Gly Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Glu Lys Gly
1300 1305 1310
Glu Ser Gly Pro Ser Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Pro
1315 1320 1325
Pro Gly Asp Asp Gly Pro Lys Gly Ser Pro Gly Pro Val Gly Phe Pro
1330 1335 1340
Gly Asp Pro Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly Pro Ala Gly Gln Asp Gly
1345 1350 1355 1360
Pro Pro Gly Asp Lys Gly Asp Asp Gly Glu Pro Gly Gln Thr Gly Ser
1365 1370 1375
Pro Gly Pro Thr Gly Glu Pro Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Lys Arg
1380 1385 1390
Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Glu Gly Arg Gln Gly Glu Lys Gly
1395 1400 1405
Ala Lys Gly Glu Ala Gly Leu Glu Gly Pro Pro Gly Lys Thr Gly Pro
1410 1415 1420
Ile Gly Pro Gln Gly Ala Pro Gly Lys Pro Gly Pro Asp Gly Leu Arg
1425 1430 1435 1440
Gly Ile Pro Gly Pro Val Gly Glu Gln Gly Leu Pro Gly Ser Pro Gly
1445 1450 1455
Pro Asp Gly Pro Pro Gly Pro Met Gly Pro Pro Gly Leu Pro Gly Leu
1460 1465 1470
Lys Gly Asp Ser Gly Pro Lys Gly Glu Lys Gly His Pro Gly Leu Ile
1475 1480 1485
Gly Leu Ile Gly Pro Pro Gly Glu Gln Gly Glu Lys Gly Asp Arg Gly
1490 1495 1500
Leu Pro Gly Pro Gln Gly Ser Ser Gly Pro Lys Gly Glu Gln Gly Ile
1505 1510 1515 1520
Thr Gly Pro Ser Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu Pro
1525 1530 1535
Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Ala Lys Gly Ser Ser Gly Pro Thr Gly
1540 1545 1550
Pro Lys Gly Glu Ala Gly His Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro
1555 1560 1565
Pro Gly Glu Val Ile Gln Pro Leu Pro Ile Gln Ala Ser Arg Thr Arg
1570 1575 1580
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1585 1590 1595 1600
Tyr Val Asp Tyr Ala Asp Gly Met Glu Glu Ile Phe Gly Ser Leu Asn
1605 1610 1615
Ser Leu Lys Leu Glu Ile Glu Gln Met Lys Arg Pro Leu Gly Thr Gln
1620 1625 1630
Gln Asn Pro Ala Arg Thr Cys Lys Asp Leu Gln Leu Cys His Pro Asp
1635 1640 1645
Phe Pro Asp Gly Glu Tyr Trp Val Asp Pro Asn Gln Gly Cys Ser Arg
1650 1655 1660
Asp Ser Phe Lys Val Tyr Cys Asn Phe Thr Ala Gly Gly Ser Thr Cys
1665 1670 1675 1680
Val Phe Pro Asp Lys Lys Ser Glu Gly Ala Arg Ile Thr Ser Trp Pro
1685 1690 1695
Lys Glu Asn Pro Gly Ser Trp Phe Ser Glu Phe Lys Arg Gly Lys Leu
1700 1705 1710
Leu Ser Tyr Val Asp Ala Glu Gly Asn Pro Val Gly Val Val Gln Met
1715 1720 1725
Thr Phe Leu Arg Leu Leu Ser Ala Ser Ala His Gln Asn Val Thr Tyr
1730 1735 1740
His Cys Tyr Gln Ser Val Ala Trp Gln Asp Ala Ala Thr Gly Ser Tyr
1745 1750 1755 1760
Asp Lys Ala Leu Arg Phe Leu Gly Ser Asn Asp Glu Glu Met Ser Tyr
1765 1770 1775
Asp Asn Asn Pro Tyr Ile Arg Ala Leu Val Asp Gly Cys Ala Thr Lys
1780 1785 1790
Lys Gly Tyr Gln Lys Thr Val Leu Glu Ile Asp Thr Pro Lys Val Glu
1795 1800 1805
Gln Val Pro Ile Val Asp Ile Met Phe Asn Asp Phe Gly Glu Ala Ser
1810 1815 1820
Gln Lys Phe Gly Phe Glu Val Gly Pro Ala Cys Phe Met Gly
1825 1830 1835
<210> 3
<211> 6930
<212> DNA
<213> 智人
<400> 3
gaccgttgct tggcagacac tggatggtta tgagcctgaa caagctgaaa aggggcagga 60
aaagaagtgg aggcagcatt cttcctattt aaagctgcat cgcttgaaaa aagttttcgc 120
agactgtgct ggagctggtg ctgaaaaagg gggtttgcag aggctgccct ggggctggtg 180
ctgaaagaag agcccacagc tgacttcatg gtgctacaat aacctcagaa tctacttttc 240
actctcagga gaacccacat gtctaatatt tagacatgat ggcaaactgg gcggaagcaa 300
gacctctcct cattcttatt gttttattag ggcaatttgt ctcaataaaa gcccaggaag 360
aagacgagga tgaaggatat ggtgaagaaa tagcctgcac tcagaatggc cagatgtact 420
taaacaggga catttggaaa cctgcccctt gtcagatctg tgtctgtgac aatggagcca 480
ttctctgtga caagatagaa tgccaggatg tgctggactg tgccgaccct gtaacgcccc 540
ctggggaatg ctgtcctgtc tgttcacaaa cacctggagg tggcaataca aattttggta 600
gaggaagaaa gggacaaaag ggagaaccag gattagtgcc tgttgtaaca ggcatacgtg 660
gtcgtccagg accggcagga cctccaggat cacagggacc aagaggagag cgagggccaa 720
aaggaagacc tggccctcgt ggacctcagg gaattgatgg agaaccaggt gttcctggtc 780
aacctggtgc tccaggacct cctggacatc cgtcccaccc aggacccgat ggcttgagca 840
ggccgttttc agctcaaatg gctgggttgg atgaaaaatc tggacttggg agtcaagtag 900
gactaatgcc tggctctgtg ggtcctgttg gcccaagggg accacagggt ttacaaggac 960
agcaaggtgg tgcaggacct acaggacctc ctggtgaacc tggtgatcct ggaccaatgg 1020
gtccgattgg ttcacgtgga ccagagggcc ctcctggtaa acctggggaa gatggtgaac 1080
ctggcagaaa tggaaatcct ggtgaagtgg gatttgcagg atctccggga gctcgtggat 1140
ttcctggggc tcctggtctt ccaggtctga agggtcaccg aggacacaaa ggtcttgaag 1200
gccctaaagg tgaagttgga gcacctggtt ccaagggtga agctggcccc actggtccaa 1260
tgggtgccat gggtcctctg ggtccgaggg gaatgccagg agagagaggg agacttgggc 1320
cacagggtgc tcctggacaa cgaggtgcac atggtatgcc tggaaaacct ggaccaatgg 1380
gtcctcttgg gataccaggc tcttctggtt ttccaggaaa tcctggaatg aagggagaag 1440
caggtcctac aggggcgcga ggccctgaag gtcctcaggg gcagagaggt gaaactgggc 1500
ccccaggtcc agttggctct ccaggtcttc ctggtgcaat aggaactgat ggtactcctg 1560
gtgccaaagg cccaacgggc tctccgggta cctctggtcc tcctggctca gcagggcctc 1620
ctggatctcc aggacctcag ggtagcactg gtcctcaggg aattcgaggc caaccgggtg 1680
atccaggagt tccaggtttc aaaggagaag ctggcccaaa aggggaacca gggccacatg 1740
gtattcaggg tccgataggc ccacccggtg aagaaggcaa aagaggtccc agaggtgacc 1800
caggaacagt tggtcctcca gggccagtgg gagaaagggg tgctcctggc aatcgtggtt 1860
ttccaggctc tgatggttta cctgggccaa agggtgctca aggagaacgg ggtcctgtag 1920
gttcttcagg acccaaagga agccaggggg atccaggacg tccaggggaa cctgggcttc 1980
caggtgctcg gggtttgaca ggaaatcctg gtgttcaagg tcctgaagga aaacttggac 2040
ctttgggtgc gccaggggaa gatggccgtc caggtcctcc aggctccata ggaatcagag 2100
ggcagcccgg gagcatgggc cttccaggcc ccaaaggtag cagtggtgac cctgggaaac 2160
ctggagaagc aggaaatgct ggagttcctg ggcagagggg agctcctgga aaagatggtg 2220
aagttggtcc ttctggtcct gtgggcccgc cgggtctagc tggtgaaaga ggagaacaag 2280
gacctccagg ccccacaggt tttcaggggc ttcctggtcc tccagggcct cctggagaag 2340
gtggaaaacc aggtgatcaa ggtgttcctg gagatcccgg agcagttggc ccgttaggac 2400
ctagaggaga acgaggaaat cctggggaaa gaggagaacc tgggataact ggactccctg 2460
gtgagaaggg aatggctgga ggacatggtc ctgatggccc aaaaggcagt ccaggtccat 2520
ctgggacccc tggagataca ggcccaccag gtcttcaagg tatgccggga gaaagaggaa 2580
ttgcaggaac tcctggcccc aagggtgaca gaggtggcat aggagaaaaa ggtgctgaag 2640
gcacagctgg aaatgatggt gcaagaggtc ttccaggtcc tttgggccct ccaggtccgg 2700
caggtcctac tggagaaaag ggtgaacctg gtcctcgagg tttagttggc cctcctggct 2760
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gaccccaggg tcctgacgga cagcctggag taaaaggtga acctggagag ccaggacaga 2880
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ctaatggtgt tcctggacta aaaggtggtc gaggaaccca aggtccgcct ggtgctacag 3000
gatttcctgg ttctgcgggc agagttggac ctccaggccc tgctggagct ccaggacctg 3060
cgggacccct aggggaaccc gggaaggagg gacctccagg tcttcgtggg gaccctggct 3120
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ccgggcagag aggaattgtt ggcatgcctg ggcaacgtgg agagagaggc atgcccggcc 3300
taccaggccc agcgggaaca ccaggaaaag taggaccaac tggtgcaaca ggagataaag 3360
gtccacctgg acctgtgggg cccccaggct ccaatggtcc tgtaggggaa cctggaccag 3420
aaggtccagc tggcaatgat ggtaccccag gacgggatgg tgctgttgga gaacgtggtg 3480
atcgtggaga ccctgggcct gcaggtctgc caggctctca gggtgcccct ggaactcctg 3540
gccctgtggg tgctccagga gatgcaggac aaagaggaga tccgggttct cggggtccta 3600
taggaccacc tggtcgagct gggaaacgtg gattacctgg accccaagga cctcgtggtg 3660
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ctggaccatt tggcccaaga ggtcctccag gcccagttgg tccttcaggt aaagaaggaa 3840
accctgggcc acttgggcca attggacctc caggtgtacg aggcagtgta ggagaagcag 3900
gacctgaggg ccctcctggt gagcctggcc cacctggccc tccgggtccc cctggccacc 3960
ttacagctgc tcttggggat atcatggggc actatgatga aagcatgcca gatccacttc 4020
ctgagtttac tgaagatcag gcggctcctg atgacaaaaa caaaacggac ccaggggttc 4080
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gtgaatactg gattgatcct aaccaaggat ctgttgaaga tgcaatcaaa gtttactgca 4260
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ttttgcgcct tttatcaaaa gaagcctccc agaacatcac ttacatctgt aaaaacagtg 4500
taggatacat ggacgatcaa gctaagaacc tcaaaaaagc tgtggttctc aaaggggcaa 4560
atgacttaga tatcaaagca gagggaaata ttagattccg gtatatcgtt cttcaagaca 4620
cttgctctaa gcggaatgga aatgtgggca agactgtctt tgaatataga acacagaatg 4680
tggcacgctt gcccatcata gatcttgctc ctgtggatgt tggcggcaca gaccaggaat 4740
tcggcgttga aattgggcca gtttgttttg tgtaaagtaa gccaagacac atcgacaatg 4800
agcaccacca tcaatgacca ccgccattca caagaacttt gactgtttga agttgatcct 4860
gagactcttg aagtaatggc tgatcctgca tcagcattgt atatatggtc ttaagtgcct 4920
ggcctcctta tccttcagaa tatttatttt acttacaatc ctcaagtttt aattgatttt 4980
aaatattttt caatacaaca gtttaggttt aagatgacca atgacaatga ccacctttgc 5040
agaaagtaaa ctgattgaat aaataaatct ccgttttctt caatttattt cagtgtaatg 5100
aaaaagttgc ttagtattta tgaggaaatt cttcttcctg gcaggtagct taaagagtgg 5160
ggtatataga gccacaacac atgtttattt tgcttggctg cagttgaaaa atagaaatta 5220
gtgccctttt gtgacctctc attccaagat tgtcaattaa aaatgagttt aaaatgttta 5280
acttgtgatc gagacctaca tgcatgtctt gatattgtgt aactataata gagactcttt 5340
aaggagaatc ttaaaaaaaa aaaaacgttt ctcactgtct taaatagaat ttttaaatag 5400
tatatattca gtggcatttt ggagaacaaa gtgaatttac ttcgacttct taaatttttg 5460
taaaagacta taagtttaga catctttctc attcaaattt aaagatatct ttctcctctt 5520
gatcaatcta tcaatattga tagaagtcac actagtatat accatttaat acatttacac 5580
tttcttattt aagaagatat tgaatgcaaa ataattgaca tatagaactt tacaaacata 5640
tgtccaagga ctctaaattg agactcttcc acatgtacaa tctcatcatc ctgaagccta 5700
taatgaagaa aaagatctag aaactgagtt gtggagctga ctctaatcaa atgtgatgat 5760
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atgagctacc tcatctctag aagctgggat ggacttacta ttcttgttta tattttagat 5880
actgaaaggt gctatgcttc tgttattatt ccaagactgg agataggcag ggctaaaaag 5940
gtattattat ttttccttta atgatggtgc taaaattctt cctataaaat tccttaaaaa 6000
taaagatggt ttaatcacta ccattgtgaa aacataactg ttagacttcc cgtttctgaa 6060
agaaagagca tcgttccaat gcttgttcac tgttcctctg tcatactgta tctggaatgc 6120
tttgtaatac ttgcatgctt cttagaccag aacatgtagg tccccttgtg tctcaatact 6180
ttttttttct taattgcatt tgttggctct attttaattt ttttctttta aaataaacag 6240
ctgggaccat cccaaaagac aagccatgca tacaactttg gtcatgtatc tctgcaaagc 6300
atcaaattaa atgcacgctt ttgtcatgtc agtggttttt gttttgtgaa attcctttga 6360
ccatattaga tctatttcat ttccaatagt gaaaaggaga tgtggtggta tactttgttt 6420
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aaaatctatc tacaacatta cccacaaagg caacatgaca ccaattatca ctgcctctgc 6540
ccttaaaaat gtcagagtag tattattgat aaaaagggca agcaatagat ttttcatgac 6600
tgaataaact gtaataataa aacatatgtc tcaaagtgta tcacatatga atttagccta 6660
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ttgtttgact tccaagtcca aactataaga ttatataagt tcatatagat gaatcagaaa 6840
tatgtggtaa tactattaag tcacaaacac taacaatttc caactataga aataacagtt 6900
cttatttgga ttttgggaat gctaccaata 6930
<210> 4
<211> 1499
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Met Met Ala Asn Trp Ala Glu Ala Arg Pro Leu Leu Ile Leu Ile Val
1 5 10 15
Leu Leu Gly Gln Phe Val Ser Ile Lys Ala Gln Glu Glu Asp Glu Asp
20 25 30
Glu Gly Tyr Gly Glu Glu Ile Ala Cys Thr Gln Asn Gly Gln Met Tyr
35 40 45
Leu Asn Arg Asp Ile Trp Lys Pro Ala Pro Cys Gln Ile Cys Val Cys
50 55 60
Asp Asn Gly Ala Ile Leu Cys Asp Lys Ile Glu Cys Gln Asp Val Leu
65 70 75 80
Asp Cys Ala Asp Pro Val Thr Pro Pro Gly Glu Cys Cys Pro Val Cys
85 90 95
Ser Gln Thr Pro Gly Gly Gly Asn Thr Asn Phe Gly Arg Gly Arg Lys
100 105 110
Gly Gln Lys Gly Glu Pro Gly Leu Val Pro Val Val Thr Gly Ile Arg
115 120 125
Gly Arg Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Gln Gly Pro Arg Gly
130 135 140
Glu Arg Gly Pro Lys Gly Arg Pro Gly Pro Arg Gly Pro Gln Gly Ile
145 150 155 160
Asp Gly Glu Pro Gly Val Pro Gly Gln Pro Gly Ala Pro Gly Pro Pro
165 170 175
Gly His Pro Ser His Pro Gly Pro Asp Gly Leu Ser Arg Pro Phe Ser
180 185 190
Ala Gln Met Ala Gly Leu Asp Glu Lys Ser Gly Leu Gly Ser Gln Val
195 200 205
Gly Leu Met Pro Gly Ser Val Gly Pro Val Gly Pro Arg Gly Pro Gln
210 215 220
Gly Leu Gln Gly Gln Gln Gly Gly Ala Gly Pro Thr Gly Pro Pro Gly
225 230 235 240
Glu Pro Gly Asp Pro Gly Pro Met Gly Pro Ile Gly Ser Arg Gly Pro
245 250 255
Glu Gly Pro Pro Gly Lys Pro Gly Glu Asp Gly Glu Pro Gly Arg Asn
260 265 270
Gly Asn Pro Gly Glu Val Gly Phe Ala Gly Ser Pro Gly Ala Arg Gly
275 280 285
Phe Pro Gly Ala Pro Gly Leu Pro Gly Leu Lys Gly His Arg Gly His
290 295 300
Lys Gly Leu Glu Gly Pro Lys Gly Glu Val Gly Ala Pro Gly Ser Lys
305 310 315 320
Gly Glu Ala Gly Pro Thr Gly Pro Met Gly Ala Met Gly Pro Leu Gly
325 330 335
Pro Arg Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Arg Leu Gly Pro Gln Gly Ala
340 345 350
Pro Gly Gln Arg Gly Ala His Gly Met Pro Gly Lys Pro Gly Pro Met
355 360 365
Gly Pro Leu Gly Ile Pro Gly Ser Ser Gly Phe Pro Gly Asn Pro Gly
370 375 380
Met Lys Gly Glu Ala Gly Pro Thr Gly Ala Arg Gly Pro Glu Gly Pro
385 390 395 400
Gln Gly Gln Arg Gly Glu Thr Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly Ser Pro
405 410 415
Gly Leu Pro Gly Ala Ile Gly Thr Asp Gly Thr Pro Gly Ala Lys Gly
420 425 430
Pro Thr Gly Ser Pro Gly Thr Ser Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Pro
435 440 445
Pro Gly Ser Pro Gly Pro Gln Gly Ser Thr Gly Pro Gln Gly Ile Arg
450 455 460
Gly Gln Pro Gly Asp Pro Gly Val Pro Gly Phe Lys Gly Glu Ala Gly
465 470 475 480
Pro Lys Gly Glu Pro Gly Pro His Gly Ile Gln Gly Pro Ile Gly Pro
485 490 495
Pro Gly Glu Glu Gly Lys Arg Gly Pro Arg Gly Asp Pro Gly Thr Val
500 505 510
Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Asn Arg Gly
515 520 525
Phe Pro Gly Ser Asp Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Ala Gln Gly Glu
530 535 540
Arg Gly Pro Val Gly Ser Ser Gly Pro Lys Gly Ser Gln Gly Asp Pro
545 550 555 560
Gly Arg Pro Gly Glu Pro Gly Leu Pro Gly Ala Arg Gly Leu Thr Gly
565 570 575
Asn Pro Gly Val Gln Gly Pro Glu Gly Lys Leu Gly Pro Leu Gly Ala
580 585 590
Pro Gly Glu Asp Gly Arg Pro Gly Pro Pro Gly Ser Ile Gly Ile Arg
595 600 605
Gly Gln Pro Gly Ser Met Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Ser Ser Gly
610 615 620
Asp Pro Gly Lys Pro Gly Glu Ala Gly Asn Ala Gly Val Pro Gly Gln
625 630 635 640
Arg Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Glu Val Gly Pro Ser Gly Pro Val
645 650 655
Gly Pro Pro Gly Leu Ala Gly Glu Arg Gly Glu Gln Gly Pro Pro Gly
660 665 670
Pro Thr Gly Phe Gln Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Glu
675 680 685
Gly Gly Lys Pro Gly Asp Gln Gly Val Pro Gly Asp Pro Gly Ala Val
690 695 700
Gly Pro Leu Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Asn Pro Gly Glu Arg Gly
705 710 715 720
Glu Pro Gly Ile Thr Gly Leu Pro Gly Glu Lys Gly Met Ala Gly Gly
725 730 735
His Gly Pro Asp Gly Pro Lys Gly Ser Pro Gly Pro Ser Gly Thr Pro
740 745 750
Gly Asp Thr Gly Pro Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly
755 760 765
Ile Ala Gly Thr Pro Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Gly Ile Gly Glu
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785 790 795 800
Gly Pro Leu Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Thr Gly Glu Lys Gly
805 810 815
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820 825 830
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835 840 845
Gly Pro Gln Gly Pro Asp Gly Gln Pro Gly Val Lys Gly Glu Pro Gly
850 855 860
Glu Pro Gly Gln Lys Gly Asp Ala Gly Ser Pro Gly Pro Gln Gly Leu
865 870 875 880
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885 890 895
Gly Gly Arg Gly Thr Gln Gly Pro Pro Gly Ala Thr Gly Phe Pro Gly
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915 920 925
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930 935 940
Gly Asp Pro Gly Ser His Gly Arg Val Gly Asp Arg Gly Pro Ala Gly
945 950 955 960
Pro Pro Gly Gly Pro Gly Asp Lys Gly Asp Pro Gly Glu Asp Gly Gln
965 970 975
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980 985 990
Gly Ile Val Gly Met Pro Gly Gln Arg Gly Glu Arg Gly Met Pro Gly
995 1000 1005
Leu Pro Gly Pro Ala Gly Thr Pro Gly Lys Val Gly Pro Thr Gly Ala
1010 1015 1020
Thr Gly Asp Lys Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly Ser Asn
1025 1030 1035 1040
Gly Pro Val Gly Glu Pro Gly Pro Glu Gly Pro Ala Gly Asn Asp Gly
1045 1050 1055
Thr Pro Gly Arg Asp Gly Ala Val Gly Glu Arg Gly Asp Arg Gly Asp
1060 1065 1070
Pro Gly Pro Ala Gly Leu Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Thr Pro
1075 1080 1085
Gly Pro Val Gly Ala Pro Gly Asp Ala Gly Gln Arg Gly Asp Pro Gly
1090 1095 1100
Ser Arg Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Arg Ala Gly Lys Arg Gly Leu
1105 1110 1115 1120
Pro Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Asp His Gly Asp Arg
1125 1130 1135
Gly Asp Arg Gly Gln Lys Gly His Arg Gly Phe Thr Gly Leu Gln Gly
1140 1145 1150
Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Asn Gly Glu Gln Gly Ser Ala Gly Ile
1155 1160 1165
Pro Gly Pro Phe Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly Pro Ser
1170 1175 1180
Gly Lys Glu Gly Asn Pro Gly Pro Leu Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly
1185 1190 1195 1200
Val Arg Gly Ser Val Gly Glu Ala Gly Pro Glu Gly Pro Pro Gly Glu
1205 1210 1215
Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly His Leu Thr Ala Ala
1220 1225 1230
Leu Gly Asp Ile Met Gly His Tyr Asp Glu Ser Met Pro Asp Pro Leu
1235 1240 1245
Pro Glu Phe Thr Glu Asp Gln Ala Ala Pro Asp Asp Lys Asn Lys Thr
1250 1255 1260
Asp Pro Gly Val His Ala Thr Leu Lys Ser Leu Ser Ser Gln Ile Glu
1265 1270 1275 1280
Thr Met Arg Ser Pro Asp Gly Ser Lys Lys His Pro Ala Arg Thr Cys
1285 1290 1295
Asp Asp Leu Lys Leu Cys His Ser Ala Lys Gln Ser Gly Glu Tyr Trp
1300 1305 1310
Ile Asp Pro Asn Gln Gly Ser Val Glu Asp Ala Ile Lys Val Tyr Cys
1315 1320 1325
Asn Met Glu Thr Gly Glu Thr Cys Ile Ser Ala Asn Pro Ser Ser Val
1330 1335 1340
Pro Arg Lys Thr Trp Trp Ala Ser Lys Ser Pro Asp Asn Lys Pro Val
1345 1350 1355 1360
Trp Tyr Gly Leu Asp Met Asn Arg Gly Ser Gln Phe Ala Tyr Gly Asp
1365 1370 1375
His Gln Ser Pro Asn Thr Ala Ile Thr Gln Met Thr Phe Leu Arg Leu
1380 1385 1390
Leu Ser Lys Glu Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr Ile Cys Lys Asn Ser
1395 1400 1405
Val Gly Tyr Met Asp Asp Gln Ala Lys Asn Leu Lys Lys Ala Val Val
1410 1415 1420
Leu Lys Gly Ala Asn Asp Leu Asp Ile Lys Ala Glu Gly Asn Ile Arg
1425 1430 1435 1440
Phe Arg Tyr Ile Val Leu Gln Asp Thr Cys Ser Lys Arg Asn Gly Asn
1445 1450 1455
Val Gly Lys Thr Val Phe Glu Tyr Arg Thr Gln Asn Val Ala Arg Leu
1460 1465 1470
Pro Ile Ile Asp Leu Ala Pro Val Asp Val Gly Gly Thr Asp Gln Glu
1475 1480 1485
Phe Gly Val Glu Ile Gly Pro Val Cys Phe Val
1490 1495
<210> 5
<211> 6192
<212> DNA
<213> 智人
<400> 5
gcgagtgact gcaccgagcc cgagaagtcg ccgcgccccg cagccgcccc gactggttcc 60
ccgccttgcc cgtgggcccc gccgggatgg ggaaccgccg ggacctgggc cagccgcggg 120
ccggtctctg cctgctcctg gccgcgctgc agcttctgcc ggggacgcag gccgatcctg 180
tggatgtcct gaaggccctg ggtgtgcagg gaggccaggc tggggtcccc gaggggcctg 240
gcttctgtcc ccagaggact ccagagggtg accgggcatt cagaattggc caggccagca 300
cgctcggcat ccccacgtgg gaactctttc cagaaggcca ctttcctgag aacttctcct 360
tgctgatcac cttgcgggga cagccagcca atcagtctgt cctgctgtcc atttatgatg 420
aaaggggtgc ccggcagttg ggcctggcac tggggccagc gctgggtctc ctaggtgacc 480
ccttccgccc cctcccccag caggtcaacc tcacagatgg caggtggcac cgtgtggccg 540
tcagcataga tggtgagatg gtgaccctgg tagctgactg tgaagctcag ccccctgttt 600
tgggccatgg cccccgcttc atcagcatag ctggactcac tgtgctgggg acccaggacc 660
ttggggaaaa gactttcgag ggagacattc aggagctgct gataagccca gatcctcagg 720
ctgccttcca ggcttgtgag cggtacctcc ccgactgtga caacctggca ccggcagcca 780
cagtggctcc ccagggtgaa ccagaaaccc ctcgtcctcg gcggaagggg aagggaaaag 840
ggaggaagaa agggcgaggt cgcaagggga agggcaggaa aaagaacaag gaaatttgga 900
cctcaagtcc acctcctgac tccgcagaga accagacctc cactgacatc cccaagacag 960
agactccagc tccaaatctg cctccgaccc ccacgccttt ggtcgtcacc tccactgtga 1020
ctactggact caatgccacg atcctagaga ggagcttgga ccctgacagt ggaaccgagc 1080
tggggaccct ggagaccaag gcagccaggg aggatgaaga aggagatgat tccaccatgg 1140
gccctgactt ccgggcagca gaatatccat ctcggactca gttccagatc tttcctggtg 1200
ctggagagaa aggagcaaaa ggagagcccg cagtgattga aaaggggcag cagtttgagg 1260
gacctccagg agccccagga ccccaagggg tggttggccc ctcaggccct cccggccccc 1320
caggattccc tggcgaccct ggtccaccgg gccctgctgg cctcccagga atccccggca 1380
ttgatgggat ccgaggccca ccgggcactg tgatcatgat gccgttccag tttgcaggcg 1440
gctcctttaa aggcccccca gtctcattcc agcaggccca ggctcaggca gttctgcagc 1500
agactcagct ctctatgaaa ggcccccctg gtccagtggg gctcactggg cgcccaggcc 1560
ctgtgggtct ccccgggcat ccaggtctga aaggagagga gggagcagaa gggccacagg 1620
gtccccgagg cctgcaggga cctcatggac cccctggccg agtgggcaag atgggccgcc 1680
ctggagcaga tggagctcgg ggcctcccag gggacactgg acctaagggt gatcgtggct 1740
tcgatggcct ccctgggctg cctggtgaga agggccaaag gggtgacttt ggccatgtgg 1800
ggcaacccgg tcccccagga gaggatggtg agaggggagc agagggacct ccagggccca 1860
ctggccaggc tggggagccg ggtccacgag gactgcttgg ccccagaggc tctcctggcc 1920
ccacgggtcg cccgggtgtg actggaattg atggtgctcc tggtgccaaa ggcaatgtgg 1980
gtcctccagg agaaccaggc cctccgggac agcagggaaa ccatgggtcc cagggactcc 2040
ccggtcccca gggactcatt ggcactcctg gggagaaggg tccccctgga aacccaggaa 2100
ttccaggcct cccaggatcc gatggccctc tgggtcaccc aggacatgag ggccccacgg 2160
gagagaaagg ggctcagggt ccaccagggt cggcaggccc tccgggctat cctggacctc 2220
ggggagtgaa gggcacttca ggcaaccggg gcctccaggg ggagaaaggc gagaagggag 2280
aggacggctt cccaggcttc aagggcgatg tggggctcaa aggtgatcag gggaaacccg 2340
gagctccagg tccccgggga gaggatggtc ctgaggggcc gaaggggcag gcggggcagg 2400
ctggcgagga ggggccccca ggctcagctg gggagaaggg caagcttggg gtgccaggcc 2460
tcccaggtta tccaggacgc cctggaccta agggatctat tggatttccc ggtcccctgg 2520
gacccatagg agagaaaggg aagtcgggaa agacagggca gccaggcctg gaaggagagc 2580
ggggaccacc aggttcccgt ggagagaggg ggcaaccggg tgccacaggg caaccaggcc 2640
ccaagggcga tgtgggccag gatggagccc ctgggatccc tggagaaaag ggcctccctg 2700
gtctgcaagg ccctccagga ttccctgggc caaagggccc ccctggtcac caaggtaaag 2760
atgggcgacc agggcaccct ggacagagag gagaactggg cttccaaggt cagacaggcc 2820
cgcctggacc agctggtgtc ttaggccctc agggaaagac aggagaagtg ggacctctag 2880
gtgaaagggg gcctccaggc ccccctggac ctcctggtga acaaggtctt cctggcctgg 2940
aaggcagaga gggggccaag ggggaactgg gaccaccagg accccttggg aaagaagggc 3000
cagctggact caggggcttt cccggcccca aagggggccc tggggacccg ggacctactg 3060
gcttaaaggg tgataagggc cccccagggc ccgtgggggc caatggctcc cctggtgagc 3120
gcggtccttt gggcccagca ggaggcattg gacttcctgg ccaaagtggc agcgaaggcc 3180
ccgttggccc tgcaggcaag aaggggtccc ggggagaacg tggcccccct ggccccactg 3240
gcaaagatgg gatcccaggg cccctggggc ctctgggacc ccctggagct gctgggcctt 3300
ctggcgagga aggggacaag ggggatgtgg gtgcccccgg acacaagggg agtaaaggcg 3360
ataaaggaga cgcgggccca cctggacaac cagggatacg gggtcctgca ggacacccag 3420
gtcccccggg agcagacggg gctcaggggc gccggggacc cccaggcctc tttgggcaga 3480
aaggagatga cggagtcaga ggctttgtgg gggtgattgg ccctcctgga ctgcaggggc 3540
tgccaggccc tccgggagag aaaggggagg tcggagacgt cgggtccatg ggtccccatg 3600
gagctccagg tcctcggggt ccccaaggcc ccactggatc agagggcact ccagggctgc 3660
ctggaggagt tggtcagcca ggcgccgtgg gtgagaaggg tgagcgaggg gacgctggag 3720
acccagggcc tccaggagcc ccaggcatcc cggggcccaa gggagacatt ggtgaaaagg 3780
gggactcagg cccatctgga gctgctggac ccccaggcaa gaaaggtccc cctggagagg 3840
atggagccaa agggagcgtg ggccccacgg ggctgcccgg agatctaggg cccccaggag 3900
accctggagt ttcaggcata gatggttccc caggggagaa gggagaccct ggtgatgttg 3960
ggggaccggg tccgcctgga gcttctgggg agcccggcgc ccccgggccc cccggcaaga 4020
ggggtccttc aggccacatg ggtcgagaag gcagagaagg ggagaaaggt gccaaggggg 4080
agccaggtcc tgatgggccc ccagggagga cgggtccaat gggggctaga gggccccctg 4140
gacgtgtggg gcctgagggt cttcgaggga tccctggccc tgtgggtgaa ccaggcctcc 4200
tgggagcccc tggacagatg ggccctcctg gccccctggg gccctctggc ctcccagggc 4260
tgaagggaga cactggcccc aagggggaaa agggccacat tggattgatc ggtctcattg 4320
gccccccggg agaagctggt gagaaaggag atcaggggtt gccaggcgtg cagggacccc 4380
ctggtcccaa gggagaccct ggtccccctg gtcccattgg ctctctgggc caccctgggc 4440
ccccaggtgt ggcgggccct ctaggacaga aaggctcaaa agggtctccg gggtccatgg 4500
gcccccgtgg agacactgga cctgcaggcc caccaggccc cccgggtgcc cctgccgagc 4560
tgcatgggct gcgcaggcgc cggcgcttcg tcccagtccc gcttccagtc gtggagggcg 4620
gcctggagga ggtgctggcc tcgctcacat cgctgagctt ggagctggag cagctgcggc 4680
gtcctcccgg cactgcggag cgcccgggcc tcgtgtgcca cgagctgcac cgcaaccacc 4740
cgcacctgcc tgatggggaa tactggattg accccaacca gggctgcgcg cgggactcgt 4800
tcagggtttt ttgcaacttc acggcgggag gagagacctg cctctatccc gacaagaagt 4860
ttgagatcgt gaaattggcc tcctggtcca aggaaaagcc tggaggctgg tatagcacat 4920
tccgtcgagg gaagaagttc tcctacgtgg acgccgacgg gtccccagtg aatgtcgtgc 4980
agctgaactt cctgaaactg ctgagtgcca cagctcgcca gaacttcacc tactcctgcc 5040
agaatgcagc tgcctggctg gacgaagcca cgggtgacta cagccactcc gcccgcttcc 5100
ttggcaccaa tggagaggag ctgtctttca accagacgac agcagccact gtcagcgtcc 5160
cccaggatgg ctgccggctc cggaaaggac agacgaagac ccttttcgaa ttcagctctt 5220
ctcgagcggg atttctgccc ctgtgggatg tggcggccac tgactttggc cagacgaacc 5280
aaaagtttgg gtttgaactg ggccccgtct gcttcagcag ctgagagtgt ccggggtggg 5340
agggaccatg agggagcccc agaatggggt gcatttggtg ctgaggcttt gaagccaccg 5400
tatttttcgt tacctgtgac tatggagcca atgggatgtg acttcgctca tcacggacag 5460
tcattccttc tcctttccag ggtgctgggg gctggggttc cctggcccaa gggtccagcc 5520
tcctctcacc ccattccagg tggcatactg cagtctggct ctttctcccc tccctcccca 5580
cccaagcctc acctccccac cccttgaacc cccatgcaat gagcttctaa ctcagagctg 5640
atgaacaaaa gcccccccac ccccaatgcc tgcctcctca ctcctccgtc gctgcccttc 5700
acaccttttg gtgctacccc tccccagagt taagcactgg atgtctcctg atcccaggct 5760
gggaccccta cccccacccc ctttgatcct ttctacttcc acggtgaaag gactgaggtc 5820
ggactacaga gggaagaggg acttcccttg actgggttgt gtttcttttc ctgcctcagc 5880
ccagctctgc aaatcccctc cccctgcccc ccacctcccc aggctcacct tgccatgcca 5940
ggtggtttgg ggaccaagat gttggggggg tgaatcagga tcctaatggt gctgccctat 6000
ttatacctgg gtctgtatta aaagggaaag tcccccctgt tgtagatttc atctgcttcc 6060
tccttaggga aggctgggat atgatgagag attccagccc aagcctggcc ccccaccgcc 6120
aggccatagg gcataatttg catctcaaat ctgagaataa actgatgaac tgtgaaaaaa 6180
aaaaaaaaaa aa 6192
<210> 6
<211> 1745
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Met Gly Asn Arg Arg Asp Leu Gly Gln Pro Arg Ala Gly Leu Cys Leu
1 5 10 15
Leu Leu Ala Ala Leu Gln Leu Leu Pro Gly Thr Gln Ala Asp Pro Val
20 25 30
Asp Val Leu Lys Ala Leu Gly Val Gln Gly Gly Gln Ala Gly Val Pro
35 40 45
Glu Gly Pro Gly Phe Cys Pro Gln Arg Thr Pro Glu Gly Asp Arg Ala
50 55 60
Phe Arg Ile Gly Gln Ala Ser Thr Leu Gly Ile Pro Thr Trp Glu Leu
65 70 75 80
Phe Pro Glu Gly His Phe Pro Glu Asn Phe Ser Leu Leu Ile Thr Leu
85 90 95
Arg Gly Gln Pro Ala Asn Gln Ser Val Leu Leu Ser Ile Tyr Asp Glu
100 105 110
Arg Gly Ala Arg Gln Leu Gly Leu Ala Leu Gly Pro Ala Leu Gly Leu
115 120 125
Leu Gly Asp Pro Phe Arg Pro Leu Pro Gln Gln Val Asn Leu Thr Asp
130 135 140
Gly Arg Trp His Arg Val Ala Val Ser Ile Asp Gly Glu Met Val Thr
145 150 155 160
Leu Val Ala Asp Cys Glu Ala Gln Pro Pro Val Leu Gly His Gly Pro
165 170 175
Arg Phe Ile Ser Ile Ala Gly Leu Thr Val Leu Gly Thr Gln Asp Leu
180 185 190
Gly Glu Lys Thr Phe Glu Gly Asp Ile Gln Glu Leu Leu Ile Ser Pro
195 200 205
Asp Pro Gln Ala Ala Phe Gln Ala Cys Glu Arg Tyr Leu Pro Asp Cys
210 215 220
Asp Asn Leu Ala Pro Ala Ala Thr Val Ala Pro Gln Gly Glu Pro Glu
225 230 235 240
Thr Pro Arg Pro Arg Arg Lys Gly Lys Gly Lys Gly Arg Lys Lys Gly
245 250 255
Arg Gly Arg Lys Gly Lys Gly Arg Lys Lys Asn Lys Glu Ile Trp Thr
260 265 270
Ser Ser Pro Pro Pro Asp Ser Ala Glu Asn Gln Thr Ser Thr Asp Ile
275 280 285
Pro Lys Thr Glu Thr Pro Ala Pro Asn Leu Pro Pro Thr Pro Thr Pro
290 295 300
Leu Val Val Thr Ser Thr Val Thr Thr Gly Leu Asn Ala Thr Ile Leu
305 310 315 320
Glu Arg Ser Leu Asp Pro Asp Ser Gly Thr Glu Leu Gly Thr Leu Glu
325 330 335
Thr Lys Ala Ala Arg Glu Asp Glu Glu Gly Asp Asp Ser Thr Met Gly
340 345 350
Pro Asp Phe Arg Ala Ala Glu Tyr Pro Ser Arg Thr Gln Phe Gln Ile
355 360 365
Phe Pro Gly Ala Gly Glu Lys Gly Ala Lys Gly Glu Pro Ala Val Ile
370 375 380
Glu Lys Gly Gln Gln Phe Glu Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Gln
385 390 395 400
Gly Val Val Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Phe Pro Gly
405 410 415
Asp Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Leu Pro Gly Ile Pro Gly Ile
420 425 430
Asp Gly Ile Arg Gly Pro Pro Gly Thr Val Ile Met Met Pro Phe Gln
435 440 445
Phe Ala Gly Gly Ser Phe Lys Gly Pro Pro Val Ser Phe Gln Gln Ala
450 455 460
Gln Ala Gln Ala Val Leu Gln Gln Thr Gln Leu Ser Met Lys Gly Pro
465 470 475 480
Pro Gly Pro Val Gly Leu Thr Gly Arg Pro Gly Pro Val Gly Leu Pro
485 490 495
Gly His Pro Gly Leu Lys Gly Glu Glu Gly Ala Glu Gly Pro Gln Gly
500 505 510
Pro Arg Gly Leu Gln Gly Pro His Gly Pro Pro Gly Arg Val Gly Lys
515 520 525
Met Gly Arg Pro Gly Ala Asp Gly Ala Arg Gly Leu Pro Gly Asp Thr
530 535 540
Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Phe Asp Gly Leu Pro Gly Leu Pro Gly
545 550 555 560
Glu Lys Gly Gln Arg Gly Asp Phe Gly His Val Gly Gln Pro Gly Pro
565 570 575
Pro Gly Glu Asp Gly Glu Arg Gly Ala Glu Gly Pro Pro Gly Pro Thr
580 585 590
Gly Gln Ala Gly Glu Pro Gly Pro Arg Gly Leu Leu Gly Pro Arg Gly
595 600 605
Ser Pro Gly Pro Thr Gly Arg Pro Gly Val Thr Gly Ile Asp Gly Ala
610 615 620
Pro Gly Ala Lys Gly Asn Val Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly Pro Pro
625 630 635 640
Gly Gln Gln Gly Asn His Gly Ser Gln Gly Leu Pro Gly Pro Gln Gly
645 650 655
Leu Ile Gly Thr Pro Gly Glu Lys Gly Pro Pro Gly Asn Pro Gly Ile
660 665 670
Pro Gly Leu Pro Gly Ser Asp Gly Pro Leu Gly His Pro Gly His Glu
675 680 685
Gly Pro Thr Gly Glu Lys Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly
690 695 700
Pro Pro Gly Tyr Pro Gly Pro Arg Gly Val Lys Gly Thr Ser Gly Asn
705 710 715 720
Arg Gly Leu Gln Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Asp Gly Phe Pro
725 730 735
Gly Phe Lys Gly Asp Val Gly Leu Lys Gly Asp Gln Gly Lys Pro Gly
740 745 750
Ala Pro Gly Pro Arg Gly Glu Asp Gly Pro Glu Gly Pro Lys Gly Gln
755 760 765
Ala Gly Gln Ala Gly Glu Glu Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Glu Lys
770 775 780
Gly Lys Leu Gly Val Pro Gly Leu Pro Gly Tyr Pro Gly Arg Pro Gly
785 790 795 800
Pro Lys Gly Ser Ile Gly Phe Pro Gly Pro Leu Gly Pro Ile Gly Glu
805 810 815
Lys Gly Lys Ser Gly Lys Thr Gly Gln Pro Gly Leu Glu Gly Glu Arg
820 825 830
Gly Pro Pro Gly Ser Arg Gly Glu Arg Gly Gln Pro Gly Ala Thr Gly
835 840 845
Gln Pro Gly Pro Lys Gly Asp Val Gly Gln Asp Gly Ala Pro Gly Ile
850 855 860
Pro Gly Glu Lys Gly Leu Pro Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Phe Pro
865 870 875 880
Gly Pro Lys Gly Pro Pro Gly His Gln Gly Lys Asp Gly Arg Pro Gly
885 890 895
His Pro Gly Gln Arg Gly Glu Leu Gly Phe Gln Gly Gln Thr Gly Pro
900 905 910
Pro Gly Pro Ala Gly Val Leu Gly Pro Gln Gly Lys Thr Gly Glu Val
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Gly Pro Leu Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
930 935 940
Glu Gln Gly Leu Pro Gly Leu Glu Gly Arg Glu Gly Ala Lys Gly Glu
945 950 955 960
Leu Gly Pro Pro Gly Pro Leu Gly Lys Glu Gly Pro Ala Gly Leu Arg
965 970 975
Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Gly Pro Gly Asp Pro Gly Pro Thr Gly
980 985 990
Leu Lys Gly Asp Lys Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly Ala Asn Gly Ser
995 1000 1005
Pro Gly Glu Arg Gly Pro Leu Gly Pro Ala Gly Gly Ile Gly Leu Pro
1010 1015 1020
Gly Gln Ser Gly Ser Glu Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Lys Lys Gly
1025 1030 1035 1040
Ser Arg Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Lys Asp Gly Ile
1045 1050 1055
Pro Gly Pro Leu Gly Pro Leu Gly Pro Pro Gly Ala Ala Gly Pro Ser
1060 1065 1070
Gly Glu Glu Gly Asp Lys Gly Asp Val Gly Ala Pro Gly His Lys Gly
1075 1080 1085
Ser Lys Gly Asp Lys Gly Asp Ala Gly Pro Pro Gly Gln Pro Gly Ile
1090 1095 1100
Arg Gly Pro Ala Gly His Pro Gly Pro Pro Gly Ala Asp Gly Ala Gln
1105 1110 1115 1120
Gly Arg Arg Gly Pro Pro Gly Leu Phe Gly Gln Lys Gly Asp Asp Gly
1125 1130 1135
Val Arg Gly Phe Val Gly Val Ile Gly Pro Pro Gly Leu Gln Gly Leu
1140 1145 1150
Pro Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly Glu Val Gly Asp Val Gly Ser Met
1155 1160 1165
Gly Pro His Gly Ala Pro Gly Pro Arg Gly Pro Gln Gly Pro Thr Gly
1170 1175 1180
Ser Glu Gly Thr Pro Gly Leu Pro Gly Gly Val Gly Gln Pro Gly Ala
1185 1190 1195 1200
Val Gly Glu Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Asp Pro Gly Pro Pro
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Gly Ala Pro Gly Ile Pro Gly Pro Lys Gly Asp Ile Gly Glu Lys Gly
1220 1225 1230
Asp Ser Gly Pro Ser Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Lys Lys Gly Pro
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Pro Gly Glu Asp Gly Ala Lys Gly Ser Val Gly Pro Thr Gly Leu Pro
1250 1255 1260
Gly Asp Leu Gly Pro Pro Gly Asp Pro Gly Val Ser Gly Ile Asp Gly
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Ser Pro Gly Glu Lys Gly Asp Pro Gly Asp Val Gly Gly Pro Gly Pro
1285 1290 1295
Pro Gly Ala Ser Gly Glu Pro Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Lys Arg
1300 1305 1310
Gly Pro Ser Gly His Met Gly Arg Glu Gly Arg Glu Gly Glu Lys Gly
1315 1320 1325
Ala Lys Gly Glu Pro Gly Pro Asp Gly Pro Pro Gly Arg Thr Gly Pro
1330 1335 1340
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Gly Ile Pro Gly Pro Val Gly Glu Pro Gly Leu Leu Gly Ala Pro Gly
1365 1370 1375
Gln Met Gly Pro Pro Gly Pro Leu Gly Pro Ser Gly Leu Pro Gly Leu
1380 1385 1390
Lys Gly Asp Thr Gly Pro Lys Gly Glu Lys Gly His Ile Gly Leu Ile
1395 1400 1405
Gly Leu Ile Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly Glu Lys Gly Asp Gln Gly
1410 1415 1420
Leu Pro Gly Val Gln Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asp Pro Gly Pro
1425 1430 1435 1440
Pro Gly Pro Ile Gly Ser Leu Gly His Pro Gly Pro Pro Gly Val Ala
1445 1450 1455
Gly Pro Leu Gly Gln Lys Gly Ser Lys Gly Ser Pro Gly Ser Met Gly
1460 1465 1470
Pro Arg Gly Asp Thr Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala
1475 1480 1485
Pro Ala Glu Leu His Gly Leu Arg Arg Arg Arg Arg Phe Val Pro Val
1490 1495 1500
Pro Leu Pro Val Val Glu Gly Gly Leu Glu Glu Val Leu Ala Ser Leu
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Thr Ser Leu Ser Leu Glu Leu Glu Gln Leu Arg Arg Pro Pro Gly Thr
1525 1530 1535
Ala Glu Arg Pro Gly Leu Val Cys His Glu Leu His Arg Asn His Pro
1540 1545 1550
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Ser Lys Glu Lys Pro Gly Gly Trp Tyr Ser Thr Phe Arg Arg Gly Lys
1605 1610 1615
Lys Phe Ser Tyr Val Asp Ala Asp Gly Ser Pro Val Asn Val Val Gln
1620 1625 1630
Leu Asn Phe Leu Lys Leu Leu Ser Ala Thr Ala Arg Gln Asn Phe Thr
1635 1640 1645
Tyr Ser Cys Gln Asn Ala Ala Ala Trp Leu Asp Glu Ala Thr Gly Asp
1650 1655 1660
Tyr Ser His Ser Ala Arg Phe Leu Gly Thr Asn Gly Glu Glu Leu Ser
1665 1670 1675 1680
Phe Asn Gln Thr Thr Ala Ala Thr Val Ser Val Pro Gln Asp Gly Cys
1685 1690 1695
Arg Leu Arg Lys Gly Gln Thr Lys Thr Leu Phe Glu Phe Ser Ser Ser
1700 1705 1710
Arg Ala Gly Phe Leu Pro Leu Trp Asp Val Ala Ala Thr Asp Phe Gly
1715 1720 1725
Gln Thr Asn Gln Lys Phe Gly Phe Glu Leu Gly Pro Val Cys Phe Ser
1730 1735 1740
Ser
1745

Claims (34)

1.用于治疗COPD患者的慢性阻塞性肺病的组合物，其包含治疗有效量的V型胶原或其耐受原性片段，其中所述COPD患者患有肺气肿或慢性阻塞性支气管炎。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述V型胶原或其耐受原性片段被制备成用于口服给药。
3.如权利要求2所述的组合物，其包含0.1mg-0.5mg的V型胶原。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述V型胶原或其耐受原性片段被制备成用于静脉内给药、肺内灌注、通过吸入给药或用于肌内给药。
5.如权利要求1所述的组合物，还包含支气管扩张药或用于与支气管扩张药一起使用。
6.如权利要求1所述的组合物，还包含皮质类固醇或用于与皮质类固醇一起使用。
7.用于治疗哮喘的组合物，其包含治疗有效量的V型胶原或其耐受原性片段。
8.如权利要求7所述的组合物，其中所述V型胶原或其耐受原性片段被制备成用于静脉内给药、肺内灌注、通过吸入给药或用于肌内给药。
9.如权利要求8所述的组合物，其中以0.1mg-0.5mg的剂量给予所述V型胶原。
10.如权利要求7所述的组合物，还包含皮质类固醇或用于与皮质类固醇一起使用。
11.如权利要求7所述的组合物，还包含支气管扩张药或用于与支气管扩张药一起使用。
12.如权利要求7所述的组合物，还包含白三烯调节剂或用于与白三烯调节剂一起使用。
13.用于在有发展成慢性阻塞性肺病风险的个体中预防慢性阻塞性肺病的发展的组合物，其包含治疗有效量的V型胶原或其耐受原性片段。
14.如权利要求13所述的组合物，其中所述V型胶原或其耐受原性片段被口服给药。
15.如权利要求14所述的组合物，其中以0.1mg-0.5mg的剂量给予所述V型胶原。
16.如权利要求13所述的组合物，其中所述V型胶原或其耐受原性片段被制备成用于静脉内给药、肺内灌注、通过吸入给药或用于肌内给药。
17.用于在有发展成哮喘风险的个体中预防哮喘的发展和恶化的组合物，其包含治疗有效量的V型胶原或其耐受原性片段。
18.如权利要求17所述的组合物，其中所述V型胶原或其耐受原性片段被口服给药。
19.如权利要求18所述的组合物，其中以0.1mg-0.5mg的剂量给予所述V型胶原。
20.如权利要求17所述的组合物，其中所述V型胶原或其耐受原性片段被制备成用于静脉内给药、肺内灌注、通过吸入给药或用于肌内给药。
21.将COPD患者鉴定为V型胶原耐受疗法的候选者的方法，包括
将来自所述患者的血液样品的至少一部分与V型胶原或其抗原性片段接触；以及
测量与所述V型胶原或其抗原性片段结合的抗体的水平；
其中与所述V型胶原特异结合的抗体的存在指示所述COPD患者会从V型胶原耐受疗法受益。
22.如权利要求21所述的方法，其中将所述V型胶原或其抗原性片段结合于珠子上。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述测量包括：
将与所述V型胶原或其抗原性片段特异结合的抗体与荧光标记的抗IgG抗体接触；以及
通过流式细胞术检测与结合于所述V型胶原上的抗体结合的荧光标记的抗IgG抗体的量。
24.鉴定有发展成COPD风险的个体的方法，包括：
将来自所述个体的血液样品的至少一部分与V型胶原或其抗原性片段接触；以及
测量与所述V型胶原或其抗原性片段结合的抗体的水平；
其中与所述V型胶原特异结合的抗体的存在与更高的风险相关，所述更高的风险比在没有与所述V型胶原结合的抗体的个体中所预期的风险更高。
25.如权利要求24所述的方法，其中将所述V型胶原或其抗原性片段结合于珠子上。
26.如权利要求24所述的方法，其中所述测量包括：
将与所述V型胶原或其抗原性片段结合的抗体与荧光标记的抗IgG抗体接触；以及
通过流式细胞术检测与结合于所述V型胶原上的抗体结合的荧光标记的抗IgG抗体的量。
27.如权利要求23或26所述的方法，其中所述抗IgG抗体检测所有IgG亚型。
28.如权利要求23或26所述的方法，其中所述抗IgG抗体特异性地检测IgG1亚型。
29.如权利要求23或26所述的方法，其中所述抗IgG抗体特异性地检测IgG2亚型。
30.如权利要求23或26所述的方法，其中所述抗IgG抗体特异性地检测IgG3亚型。
31.如权利要求23或26所述的方法，其中所述抗IgG抗体特异性地检测IgG4亚型。
32.监测个体中COPD进展的方法，包括
将来自所述个体的第一血液样品的至少一部分与V型胶原或其抗原性片段接触；
测量所述第一血液样品中与所述V型胶原或其抗原性片段特异结合的抗体的水平；
将在较晚时间点采自所述个体的第二血液样品的至少一部分与V型胶原或其抗原性片段接触；
测量所述第二血液样品中与所述V型胶原或其抗原性片段特异结合的抗体的水平；以及
将所述第二血液样品中与所述V型胶原或其抗原性片段特异结合的抗体的水平与所述第一血液样品中与所述V型胶原或其抗原性片段特异结合的抗体的水平进行比较；
其中与所述第一样品相比，所述第二样品中与所述V型胶原结合的抗体的水平降低指示COPD在恶化，并且与所述第一样品相比，所述第二样品中与所述V型胶原结合的抗体的水平增加指示COPD的改善。
33.如权利要求32所述的方法，其中将所述V型胶原或其抗原性片段结合于珠子上。
34.如权利要求32所述的方法，其中所述测量包括：
将与所述V型胶原或其抗原性片段结合的抗体与荧光标记的抗IgG抗体接触；以及
通过流式细胞术检测与结合于所述V型胶原上的抗体结合的荧光标记的抗IgG抗体的量。
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