KR20030070092A - 죽상경화증을 예방 및 치료하기 위한 플라크 관련 분자를함유하는 조성물 및 이 분자를 이용하는 방법 - Google Patents

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Abstract

점막 내성을 유도하고 죽종 혈관 질환 및 후유증에 기여하는 염증 과정을 억제하는데 효과적인 플라크 관련 분자를 이용하는 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

죽상경화증을 예방 및 치료하기 위한 플라크 관련 분자를 함유하는 조성물 및 이 분자를 이용하는 방법{METHODS EMPLOYING AND COMPOSITIONS CONTAINING PLAQUE ASSOCIATED MOLECULES FOR PREVENTION AND TREATMENT OF ATHEROSCLEROSIS}
심혈관 질환은 산업화된 전세계적으로 건강을 위협하는 주요 위험요소이다. 심혈관 질환 중 가장 많은 죽상경화증은 심장마비, 발작 및 사지 회저의 주요 원인이고, 미국에서는 그 자체가 주요 사망 원인이다. 죽상경화증은 다양한 종류의 세포와 분자 요소를 수반하는 복잡한 질병이다 (상세한 검토를 위해서는 Ross, 1993, Nature 362: 801-809를 참조한다). 동맥벽의 내피세포와 평활근 세포(SMC)에 대한 손상 반응으로 나타나는 과정은 염증 이전과 이후에 나타나는 섬유지방(fibrofatty) 및 섬유상 병변 또는 플라크의 형성으로 이루어진다. 진행된 죽상경화증 병변은 관련 동맥을 차단시킬 수 있으며 다양한 여러 유형의 손상에 대한 지나친 염증성-섬유증식성 반응에 의해 초래된다. 예를 들어, 전단 응력은 분기점과 불규칙한 구조 같이 거친 혈류가 일어나는 혈행계 부근에서 종종 나타나는 죽상경화증 플라크 때문인 것으로 생각되고 있다.
죽상경화증 플라크 형성시 관찰할 수 있는 제1 과정은 단핵세포 유래의 대식세포가 혈관 내피층에 부착하여 내피하 공간으로 이동할 때 일어난다. 혈장 LDL 수치의 상승은 혈관벽의 지질 충혈을 유도하고, 인접 내피 세포는 산화된 저밀도 지단백(LDL)을 생산한다. 또한, 세포외 기질에 포획된 지단백은 리폭시게나제, 반응성 산소종, 퍼옥시니트라이트 및/또는 미엘로퍼옥시다제는 물론 다른 산화 화합물에 의한 LDL의 산화를 증가시킨다. 이와 같이 산화된 형태의 LDL은 그 다음 혈관 세포에 의해 그 표면상에 발현된 스캐빈저 수용체를 통해 다량으로 흡수된다.
지질이 충전된 단핵세포 및 평활근 유래의 세포는 포말 세포라 불리고, 지방층의 주요 성분이다. 포말 세포와 이 주위의 내피세포 및 평활근 세포 사이의 상호작용은 사실상 내피 세포 활성화, 증가된 대식세포 고사, 평활근 세포 증식과 이동, 및 섬유상 플라크 형성을 유도할 수 있는 만성 국소 염증 상태를 생성한다 (Hajjar,DP and Haverland, ME, J.Biol.Chem. 1997 Sep. 12:272(37):22975-78). 이러한 플라크는 관련 혈관을 차단시켜 혈액의 유동을 제한하여, 부적당한 관류에 의한 기관 조직내 산소 공급의 부족을 특징으로 하는 증상인 허혈증을 초래한다. 관련 동맥이 심장으로의 혈액 유동을 차단한 경우 사람은 "심장마비"를 겪게 되고, 뇌 동맥이 차단되면 사람은 발작을 겪게 된다. 사지로 향한 동맥이 좁아지면, 심한 동통, 신체 운동성 저조가 나타나고, 절단 수술이 필요할 가능성도 있다.
산화된 LDL은 단핵세포와 평활근 세포에 미치는 작용 및 내피세포 내의 응고방지물질의 균형을 깨뜨리는 내피세포 고사 유도에 의해 죽상경화증 및 죽상혈전증의 병인에 연루되어 있다. 또한, 산화된 LDL은 산화된 인지질의 항죽종형성성 HDL 결합 붕괴를 억제한다(Mertens, A and Holvoet P, FASEB J 2001 Oct; 15(12):2073-84). 이러한 관계는 다양한 동물 죽종발생 모델에서 조사한 플라크내의 산화된 LDL의 존재; 약리학적 조작 및/또는 유전자 조작에 의한 산화 억제를 통해 나타나는 죽종발생의 지연; 및 항산화성 비타민에 의한 몇몇 개재 시험의 유리한 결과를 입증하는 많은 연구의 지지를 받고 있다 (최근 문헌으로서, 예컨대 Witztum J and Steinberg,D, Trends Cardiovasc Med 2001 Apr-May; 11(3-4):93-102을 참조할 수 있다). 실제, 산화된 LDL과 말론디알데하이드(MDA) 변형 LDL은 최근 관상 동맥 질환의 1차 및 2차 단계의 정확한 혈액 마커로서 제안된 바 있다 [미국 특허 제6,309,888호(Holvoet et al) 및 제6,255,070호(Witztum, et al.)].
LDL 산화 및 활성의 감소는 심혈관 질환을 치료 및 예방하기 위한 제안된 다수의 임상 방법의 표적이었다. 미국 특허 제5869534호(Bucala et al.)는 연령, 질병 및 당뇨병과 관련된 포말 세포 형성을 특징으로 하는 지질인 진행 글리코실화 최종 산물을 감소시켜 지질 과산화를 변화시키는 방법을 개시한다. 미국 특허 제5945308호(인사이트 파마슈티컬스, 인코포레이티드에 근무하는 탱 외 다수)는 심혈관 및 자가면역 질환과 암을 치료하기 위해 인간의 산화된 LDL 수용체를 규명하고 임상 처치하는 방법을 제안하였다.
죽종발생과 관련 있는 다른 다량의 플라크 성분은 베타2-당단백 I 이다.β2-당단백 I(β2GPI)은 시험관내 분석에서 항응고물질로서 작용하는 50kDa의 분자이다. 죽종발생에 있어서 β2GPI의 정확한 역할은 아직 해명되어야 하지만, 몇가지 관련 성질이 관찰되었다: 1) 음하전 인지질 또는 인지질 발현 세포(고사 세포, 활성화된 혈소판)에 결합할 수 있는 성질; 2) 변형된 세포 표면에 결합하여 청소세포인 대식세포에 의한 제거율을 향상시키는 성질(Chonn A, et al. J.Biol.Chem. 1995; 270: 25845-49; 및 Thiagarajan P, et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol 1999; 19:2807-11); 및 3) 자가면역성 항인지질 항체 결합의 중요한 표적(aPLs). β2GPI는 aPLs에 의해 인식되기 위해서는 구조적 변형이 이루어져야 한다. 이러한 변형의 개시는 예를 들어 음하전 인지질 또는 고결합능의 평판에 결합시키는 것을 물론 생체내에서도 포스파티딜세린을 발현하는 고사 세포를 결합시킴으로써 이루어질 수 있다.
예비응고 상태를 촉진하는데 있어서 항β2GPI 항체의 중요성을 조사하는 최근 연구들은 이 항체가 응고계의 세포 및 단백질 성분(내피 세포, 혈소판 및 대식세포; 조직 인자 및 응고 인자)에 미치는 효과에 집중되고 있다. 이 연구들은 항β2GPI 항체가 식세포 청소율을 유지시키면서 혈소판의 불활성화를 방지하고; 인간 내피세포의 후기 엔도좀과 상호작용하며; 조직 인자 경로 억제제의 억제 활성을 차단한다고 시사하고 있다. 이러한 응고 과정과의 연계성은 전구혈전성 항인지질 증후군(APLS)에서 제안된 β2GPI 기능과 일치한다. 미국 특허 제5998223호 및 제5344758호(각각 Mausuura et al. 및 Krilis et al.)는 APLS 및 SLE를 진단하기위해 항 β2GPI 항체를, 몇몇은 잠재 에피토프에 대한 항체를 적용하는 것에 대해 개시하고 있다. 하지만, 이 문헌들에는 어떤 치료적 적용예도 개시되어 있지 않다.
죽종형성과 관련 있는 플라크 관련 성분으로서 중요한 제3 성분은 60/65 kDa 열충격단백질(HSP)이다. 이 미토콘드리아 단백질은 여러 종들 사이에서 고도의 서열 상동성을 나타내는 약 24개 단백질로 구성되는 HSP과의 성분이다. 그 명칭에서 암시되는 바와 같이 이 단백질들은 유리 라디칼, 열, 기계적 전단 응력, 감염 및 사이토킨에 노출되는 등의 응력에 대한 반응으로 발현되고 세포 단백질의 풀림과 변성을 방지한다. 이에 따라 분자 "차페론(chaperone)"으로 불리게 되었다. 하지만, HSP 기능은 바람직하지 않은 결과를 초래할 수 있는데, 이것은 HSP의 과잉 발현이 특정 조건하에서 조직 손상을 초래하는 자가면역 반응을 촉진할 수 있기 때문이다. HSP 면역 매개의 손상에 관여하는 기전은 아직 밝혀지지 않았으나, 상승조절 후 잠재, "비자기" 신생에피토프에 노출되기 때문인 것으로 추정되고 있다. 혹은, 천연 HSP에 대하여 병리학적 자가면역 반응을 유발할 수 있는 감염 후 유입된 "이종" HSP 에피토프와 자가 HSP 에피토프 사이의 교차 반응이 존재한다고도 제안되었다. 자가면역성에서의 HSP 관련성은 자가항체의 증가를 입증하는 연구 뿐만 아니라 몇 가지 자가면역 질환에서의 HSP 60/65에 대한 세포 반응을 입증하는 연구에 의해서도 지지를 받고 있다 (Schoenfeld,Y et al. Autoimmunity 2000 Sep; 15(2):199-202; 미국 특허 제6130059호 (Covacci, et al) 및 Gromadza G, et al. Cerebrovascul Dis 2001, Oct; 12(3):235-39).
HSP 65와 죽상경화증 사이의 연관성은 면역화에 사용한 제제가 완전 프로인트 보조제(CFA)를 포함한다면 상이한 항원으로 면역화된 정상콜레스테롤혈증 토끼가 죽상경화증을 발생시킨다는 것을 발견한 조지 윅의 그룹에 의해 최초로 밝혀졌다(Xu,Q, et al. Arterioscler Thromb 1992;12:789-99). CFA의 주성분은 HSP-65가 주성분인 열사멸 결핵균이기 때문에 이 성분에 대한 면역반응이 죽상경화증을 발생시킨 것으로 추론하였다. 이는 HSA65를 이용한 동물의 면역화가 현저한 죽상경화증을 발생시키고 실험적 죽상경화증 토끼 유래의 T 세포가 응력을 받은 동물 혈관에 제한적인 국소 면역반응을 나타내면서 HSP-65를 과잉발현한다는 본 발명자들의 입증을 통해 확인되었다. 또한, 죽종발생에 있어서 내인성 HSP-65의 중요성은 순수 생쥐의 HSP-65 (또는 결핵균) 면역화 후 지방층 형성이 가속화됨을 통해 입증되었다 (George J, et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1999; 19:505-10).
HSP-65에 대한 반응에서 체액 면역 기전의 관련성은 죽상경화증에서 관찰되었으며, 명백한 상관성이 고도의 항HSP65 항체와 건강한 개체의 스크린에서 좁아지는 음파촬영술에 의해 추정된 경동맥의 정도 간에 관찰된 바 있다 (Xu Q. et al Lancet 1993; 341: 255-9; Xu Q. et al Circulation 1999; 100(11):1169-74). 또한, 내피세포 배양물을 이용한 시험관내 실험에서는 HSP65와 항온처리 후 내피세포의 단핵세포 및 과립구에 대한 부착성이 농도 및 시간 의존적으로 유도됨을 증명하였다.
죽종발생과 HSP65의 관련성은 다수의 치료 용도를 제안하게 하였다. HSP65에 대한 면역 반응성이 미생물(예, H.피롤리) 감염 및 죽상경화증과 상관성이 있음을 관찰하여 버니 등(Eur Heart J 1998; 19:366-7)은 감염 및 항HSP 항체 감소를 위해항생제 요법을 제안하였다. 이와 마찬가지로, 코바치 등(미국 특허 제6130059호)은 죽상경화증에 진단적 및 치료적 적용하기 위한 H.피롤리 HSP 및 관련 펩타이드의 사용을 개시하였다.
죽상경화증 및 자가면역 질환
죽상경화증과 허혈에서 나타나는 과도한 염증성 섬유증식 반응의 추정된 역할로 인하여 점차 많은 수의 연구자들은 혈관 손상의 자가면역 성분을 규명하고자 시도하고 있다. 자가면역 질환에서 면역계는 침입된 이종의 항원을 공격하는 것 외에도 정상의 비항원성 체내 성분(자가항원)을 인식하여 공격한다. 자가면역 질환은 자가(또는 자기) 항체 매개 질환 또는 세포 매개 질환으로 분류된다. 전형적인 자가항체 매개의 자가면역 질환은 중증근무력증 및 특발혈소판감소자색반병(ITP)이고, 전형적인 세포 매개 질환은 하시모토 갑상샘염 및 제I형(소아) 당뇨병이다.
죽상경화증 병변에서 면역 매개 과정이 우세하다는 인식은 최초 단계, 즉 지방층에서 일관되게 관찰되는 림프구와 대식세포에 의한 것이다. 주로 CD4+ 세포를 포함하는(나머지는 CD8+ 세포임) 상기 림프구는 초기 병변에서는 대식세포 보다 다량인 반면, 더 진행된 병변에서는 이 비율이 역전되는 경향을 보이는 것으로 관찰되었다. 이러한 관찰을 통해 이 림프구가 가능한 항원에 대한 1차 면역 감작을 반영하는지 또는 기존에 유도된 국소 조직 손상에서 산출된 것인지에 대한 의문이 제기되었다. 이러한 염증성 세포를 초기 플라크로 집중시키는데 중요한 역할을 하는 요소가 있지만, 백혈구 공통 항원(CD45R0) 및 최후 항원 1(VLA-1) 인테그린 뿐만 아니라 MHC 제II군 HLA-DR 및 인터루킨(IL) 수용체가 동시 발현됨을 통해 분명한것처럼 이 림프구들은 활성 상태를 나타내는 것으로 보인다. 따라서, 죽상경화증 병변의 초기 단계의 염증 반응은 국소 세포(즉, 내피 세포, 대식세포, 평활근 세포 및 염증 세포)에 의한 다양한 사이토킨의 생성을 유도하는 1차 개시 과정이거나 또는 유해 과정에 대한 면역계의 반응의 일 형태일 수 있다. 정주 세포에 의해 상승조절되는 것으로 밝혀진 바 있는 몇 가지 사이토킨으로는 TNF-α, IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IFN-γ 및 단핵구 화학유인 펩타이드-1(MCP-1)이 있다. 죽상경화증 플라크에 존재하는 모든 세포 성분에 의해 발현되는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 및 인슐린계 성장인자(ILGF) 역시 과잉발현되는 것으로 밝혀진 바 있으며, 이에 따라 분열촉진인자 및 화학주성인자 형태로 지원되는 공동자극에 의해 기존의 염증 반응이 강해질 가능성이 있다. 최근, 우이에무라 등(J Clin Invest 1996; 97: 2130-2138)은 정상 동맥과 달리 IFN-γ는 강하게 발현되고 IL-4 mRNA는 그렇지 않은 인간 죽상경화증 병변에서의 제1형 T-세포 사이토킨 패턴을 규명하였다. 또한, 주로 활성화된 단핵구에 의해 생산되는 T-세포 성장 인자이며 Th1 사이토킨 패턴의 선택적 유도인자인 IL-12는 이의 주요 이종이량체 형태인 p70 및 p40(이의 주요 유도성 단백질) mRNA의 증가를 통해 입증되듯이 병변에서 과잉발현되는 것으로 관찰되었다.
죽상경화증 플라크 내에 세포 면역계가 우성이라는 강력한 증거와 유사하게, 국소 체약 면역계의 관련성을 입증하는 데이터도 많다. 즉, 정주 대식세포에서 C3b 및 C3Bi 수용체의 증가 발현 외에도 면역글로불린 및 보체 성분의 침착이 플라크에서 관찰된 바 있다.
죽상경화증의 진행에 면역 매개 염증의 기여도를 입증하는 귀중한 실마리는 동물 모델에서 얻는다. 면역능이 있는 생쥐에 비해 면역타협성 생쥐(제I군 MHC 결손형)는 가속죽상경화증을 진행시키는 경향이 있다. 또한, IL-2 전사의 강력한 억제제인 사이클로스포린 A를 이용한 C57BL/6 생쥐(Emeson EE and Shen ML Am J Pathol 1993; 142: 1906-1915) 및 뉴질랜드 화이트 토끼(Roselaar SE, et al J Clin Invest 1995; 96:1389-1394)의 치료는 "정상" 지단백 "부하"하에 죽상경화증을 유의적으로 향상시켰다. 후자의 연구에서는 죽상경화증 플라크 내에서 자가 영속성 염증 과정을 중화시키기 위한 면역계의 가능한 역할을 관찰할 수 있다.
혈관구조를 폐색시키는 플라크 생산과 같은 몇 가지 징후가 이상 면역 반응성과 관련이 있기는 하지만 죽상경화증은 고전적 자가면역 질환이 아니다. 고전적 자가면역 질환에서는 면역계의 공격을 받는 감작성 자가항원과 자가항원(체액성, 즉 자가항체 또는 세포성, 즉 림프구)을 인식하는 면역계의 성분을 분명하게 구분할 수 있다. 특히, 이러한 면역계의 성분을 수동 전달함으로써 건강한 동물에서도 질병을 유도할 수 있거나 또는 인간의 경우에는 산모 환자로부터 태아에게 질병을 전달할 수 있음을 확인할 수 있다. 이러한 성분중 대부분은 죽상경화증에는 많지 않다. 또한, 이 질병은 고혈압, 당뇨병, 신체 활성의 결여, 흡연 등과 같은 공통적인 위험 요소를 분명하게 갖고 있어 이 질병은 장년층에 침범하고 고전적 자가면역질환에서와 상이하게 우세한 유전자를 나타낸다.
염증 질환의 치료는 일반 면역반응 및/또는 질병 특이적 면역반응의 억제 또는 반전에 관한 것일 수 있다. 즉, 예컨대 아이엘로(미국 특허 제6034102호 및제6114395호)는 염증 세포의 집중을 억제하여 죽상경화증 및 죽상경화증 병변의 진행을 치료 및 예방하기 위한 에스트로겐계 화합물의 이용에 대하여 개시한다. 이와 유사하게, 메드포드 등(미국 특허 제5,846,959호)은 세포 부착 분자 VCAM-1에 의해 매개되는 심혈관 및 비심혈관 염증 질환을 치료하기 위하여 산화된 PUFA의 형성을 예방하는 방법을 개시한다. 또한, 팔브(미국 특허 제6,156,500호)는 소염 요법의 잠재 표적으로서 죽상경화성 플라크와 죽상경화증에 많은 다수의 세포 시그널링 분자 및 부착 분자를 명시하였다.
산화된 LDL, β2GPI 및 HSP65는 죽상경화증의 병인에 연관성이 있음이 분명한 바(전술한 내용 참조), 죽종 질환 과정에서 자가면역성에 기여하는 상기 주요 플라크 성분의 역할이 연구되고 있다.
플라크 관련 분자에 대한 면역 반응도
Ox LDL은 T-세포와 단핵세포에 대한 화학주성인 것으로 알려져 있다. OxLDL 및 이의 부산물은 또한 단핵세포 화학주성 인자 1과 같은 요소들의 발현, 콜로니자극인자의 분비 및 혈소판 활성화 성질을 유도하는 것으로 알려져 있으며, 이들은 모두 강력한 성장 촉진제이다. 죽상경화증에서의 세포 면역반응의 능동적 관련성은 최근에 촉진제로서 Ox LDL에 반응하는 플라크 클론에서 CD4+를 분리한 스템므 S. 등(Stemme S, et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 1995; 92:3893-97)에 의해 실체화되었다. Ox LDL에 반응하는 클론(27개 중 4개)은 IL-4보다는 인터페론-γ를 주로 생산하였다. 상기 T-세포 클론이 촉진성 강력 면역원(Ox LDL)을 이용하여 세포 면역계와 접촉만 하고 있는지 또는 이 반응이 명백한 불활성 죽상경화 과정을 퇴치하는 수단을 제공하는지는 연구되어야 한다.
체액 기전의 연관성에 관한 데이터와 이의 의미는 보다 더 연구되어야 한다. 최근의 한 연구에서는 심장 질환 및/또는 당뇨병을 앓고 있는 여성에서 LDL 산화의 대사산물인 MDA-LDL에 대한 항체 농도의 증가를 보고하였다(Dotevall, et al., Clin Sci 2001 Nov; 101(5): 523-31). 다른 연구자들은 죽상경화증 및 다른 질환, 예컨대 당뇨병, 신장혈관 증후군, 요독증, 류마티스열 및 홍반루푸스에서 지질 및 아포지단백 성분에 대한 면역반응성을 나타내는, 산화된 LDL 상의 복수의 에피토프를 인식하는 항체를 증명하였다(Steinerova A, et al., Physiol Res 2001; 50(2):131-41). 몇 가지 보고서에서는 Ox LDL에 대한 항체 농도의 증가와 죽상경화증의 진행 (목동맥 협착증, 말초 혈관 질환의 정도 등으로 판단)을 연관지었다. 보다 최근에 쉐리어 등(Sherer et al, Cardiology 2001;95(1):20-4)은 관상 심장 질환에서 포스파티딜콜린 또는 내피 세포를 제외한 카디오리핀, β-2GPI 및 oxLDL에 대한 항체 농도의 증가를 입증한 바 있다. 이것은 죽상경화성 플라크 내에 나타나는 면역 복합체 형태의 항플라크 성분 항체의 존재와 관련하여 일관성이 있는 것 같다.
Ox LDL에 대한 항체는 정상 및 병리상태의 지단백 대사에 모두 연관이 있다. 즉, Ox LDL과 이의 상응하는 항체의 면역복합체는 Ox LDL에 비해 현탁상태의 대식세포에 의해 보다 효과적으로 흡수되는 것으로 알려져 있다. 하지만, 대식세포에 의한 Ox LDL의 가속적 흡수가 유리한지 유해한지의 의문이 아직 해명된 바 없으므로, 죽상경화증의 병인에 대한 이러한 일관된 발견으로부터 결론을 도출해낼 수는없다.
죽종발생에서 체액 면역계의 유의성에 대한 중요한 데이터는 동물 모델에서 얻어진다: 동족의 산화된 LDL을 이용하여 LDL 수용체 결손형 토끼를 과면역화시킨 결과 다량의 항-Ox LDL 항체가 생성되었고, 이와 관련하여 죽상경화성 병변의 정도가 유의적으로 감소되었다. 이와 마찬가지로, 토끼를 고콜레스테롤 리포좀으로 면역화하고 항콜레스테롤 항체 생성을 자극한 후 플라크 형성이 감소되었다. 하지만, 이 효과는 극저밀도 지단백 콜레스테롤 농도를 35% 감소시켜 바람직하지 않았다.
β2GPI의 면역원성과 관련하여 β2GPI는 면역 매개 공격에 대한 표적 항원으로 작용하여 인간과 생쥐의 죽상경화증 진행에 영향을 미치는 것으로 밝혀져 있다. 조지 J. 등(George J et al)은 LDL-수용체 결손형 생쥐를 β2GPI로 면역화시켜 인간 β2GPI에 대한 체액 면역반응을 증가시키고 대조군에 비해 초기 죽상경화성 병변수를 증가시켰다(George J, et al. Circulation 1998; 15:1108-15). 아펙 A 등은 인간 β2GPI로 1회 면역화하고 5주 동안 고지방 식이를 섭취한 죽상경화증에 걸리기 쉬운 아포지단백-E 녹아웃 생쥐에서 유사한 결과를 얻었다(Afek A et al. Pathobiology 1999; 67:19-25).
또한, 전구혈전성 항인지질 증상이 있는 인간에서의 β2GPI에 대한 면역반응성이 관례적으로 β2GPI에 대한 자가항체의 존재 때문인 것으로 생각되었을 지라도 최근 관찰에서는 β2GPI에 대한 세포 면역 반응의 중요성을 시사하고 있다. β2GPI와 반응성인 T-세포는 항인지질 증상이 있는 환자의 말초 혈액에서 확인되었다. 이 T 세포는 T-헬퍼-1 표현형(전구염증성( 및 전구죽종발생성) 사이토킨 인터페론을분비함)을 나타내었고, 조직 인자 생산을 유도할 수도 있었다(Visvanathan S, and McNiel HP. J Immunolog 1999; 162: 6919-25). 종합해보면, 지금까지 항β2GPI에 관하여 모인 많은 자료(Roubey RA, Curr Opinion Rheumatol 2000; 12:374-378 참조)는 이 플라크 관련 항원에 대한 면역 반응이 죽상경화성 플라크의 크기와 조성에 영향을 미치는 중요한 역할을 할 수 있음을 시사한다.
마지막으로, 산화된 인지질과 β2GPI의 항원성 및 병원성에는 유의적 의존성이 있다. 전술하였듯이, 최소 변형 LDL 및 β2GPI와 관련된 몇 가지 자가면역 에피토프는 잠재적이다. 교바시 등(Kyobashi, et al. J Lipid Res 2001; 42:697-709)과 고이케 등(Koike et al, Ann Med 2000; 32: Suppl I 27-31)은 β2GPI-OxLDL 복합체형으로만 존재하는 대식세포 활성화 oxLDL 특이적 리간드를 규명하였다. 이 리간드는 APLS-특이적 자가항체에 의해 인식되었다. 즉, 산화된 LDL과 다른 플라크 성분의 병인성 역할 및 죽상경화증은 물론 다른 질환에서의 자가항체로서의 중요성은 실험실과 임상 연구에서 광범위하게 입증되어 있다.
자가면역 질환 치료에서의 점막 내성
최근에 자가면역 질환( 및 관련 T-세포 매개 염증 질환, 예컨대 동종이식 거부 및 레트로바이러스 관련 신경계 질환)을 치료하는데 유용한 신규 방법과 약학적 제제가 발견되었다. 이 치료법은 내성화제로서 자가항원, 방관자 항원 또는 자가항원이나 방관자 항원의 질환 억제성 단편이나 유사체를 이용하여 경구 또는 점막을 통해, 예컨대 흡입에 의해 내성을 유도한다. 이러한 치료법에 대해서는 예컨대 미국 특허 제5,935,577호(Weiner et al.)에 기술되어 있다. 자가항원 및 방관자 항원은 이하에 명시하고 있다 (점막 내성에 대한 전반적 고찰을 위해서는 Nagler-Anderson, C., Crit Rev Immunol 2000; 20(2):103-20을 참고한다). 자가항원( 및 이 분자의 면역우성 에피토프 영역을 포함하는 단편)의 정맥내 투여는 클론 무력화(clonal anergy)라는 기전을 통해 면역 억제를 유도하는 것으로 밝혀져 있다. 클론 무력화는 특정 항원에 특이적인 면역 공격성 T-세포만을 불활성화시켜, 결과적으로 이 항원에 대한 면역반응을 유의적으로 감소시킨다. 즉, 일단 무력화되면 자가항원에 특이적인 자가면역 반응 촉진성 T-세포는 더 이상 그 항원에 대한 반응으로 증식하지 않는다. 이러한 증식 감소는 또한 자가면역 질환 증상(예컨대 다발성 경화증(MS)에서 관찰되는 신경 조직 손상)에 중요한 역할을 하는 면역 반응을 감소시킨다. 또한, 자가항원을 단일 용량 및 "능동 억제"를 야기하는 양 보다 실질적으로 많은 양으로 경구 투여하여도 무력화 (또는 클론 결실)를 통해 내성을 유도할 수 있다는 것이 입증되었다.
또한, 능동 억제에 의해 진행되는 치료 방법도 개시되어 있다. 능동 억제는 클론 무력화 기전과 상이한 기전에 의해 작용한다. PCT 출원 PCT/US93/01705에서 광범위하게 논의되고 있는 이 방법은 자가면역 공격을 받는 조직에 특이적인 항원을 경구 또는 점막 투여하는 것을 포한다. 이 항원은 "방관자 항원(bystander antigen)"이라고도 불린다. 이 치료법은 조절성(억제인자) T-세포가 장관련 림프종 조직(GALT) 또는 기관지관련 림프종 조직(BALT), 또는 가장 일반적으로는 점막 관련 림프종 조직(MALT)(MALT는 GALT와 BALT를 포함한다)에서 유도되도록 한다. 이러한 조절성 세포는 혈액이나 림프 조직에서 방출된 뒤 자가면역 질환에 관련된 기관이나 조직으로 이동하여 그 관련 기관이나 조직의 자가면역 공격을 억제한다. 방관자 항원에 의해 유인된 T-세포(이 T-세포 유도에 사용된 방관자 항원의 적어도 하나의 항원성 결정인자를 인식함)는 특정 면역조절 인자 및 사이토킨, 예컨대 전환성장인자 베타(TGF 베타), 인터루킨-4(IL-4) 및/또는 인터루킨-10(IL-10)의 국소 방출을 매개하는 자가면역 공격의 부위를 표적으로 한다. 이 중에서, TGF-β는 공격을 야기하는 항원에 관계없이 면역 공격을 억제한다는 점에서 항원비특이적 면역억제 인자이다.(하지만, 방관자 항원만으로의 경구 또는 점막 내성화가 자가면역 공격 부근에서 TGF-β의 방출을 유발하므로 전신 면역억제는 일어나지 않는다). IL-4 및 IL-10 역시 항원비특이적 면역조절 사이토킨이다. 특히 IL-4는 Th2(T 헬퍼 2) 반응을 향상시키고, 즉 T-세포 전구체에 작용하여 이 전구체가 Th1반응을 제치고 Th2세포로 우선적으로 분화하도록 한다. IL-4는 또한 Th1격화를 간접적으로 억제한다. IL-10은 Th1반응의 직접적인 억제제이다. 자가면역 질환을 앓는 포유동물을 방관자 gdkdnjs으로 경구 내성화시킨 후 자가면역 공격 부위에서는 TGF-β, IL-4 및 IL-10의 농도가 증가되었다(Chen, Y. et al., Science, 265:1237-1240, 1994). 방관자 억제 기전은 문헌[von Herreth et al., J.Clin.Invest., 96:1324-1331, September 1996]에 확인되어 있다.
보다 최근에, 경구 내성화가 전구생물 박테리아를 섭취한 염증성 장질환의 동물 모델(Dunne, C., et al., Antonie Van Leeuwenhoek 1999 Jul-Nov; 76(1-4):279-92), 사구체 기저막을 섭취한 자가면역 사구체신염의 동물모델(Reynolds,J. et al., J Am Soc Nephrol 2001 Jan;12(1): 61-70), 미엘린 염기성 단백질(MBP)을 섭취한 실험적 알레르기성 뇌척수염(다발성 경화증 또는 MS의 등가물인 EAE)의 동물 모델, 피검체에게 콜라겐과 HSP-65를 섭취한 보조관절염 및 콜라겐 관절염 동물 모델을 각각 치료하는데 효과적으로 적용되고 있다. 오토임뮨(Autoimmune)이라 불리는 보스톤에 있는 한 회사는 당뇨병, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염 및 포도막염을 예방하기 위한 여러 인체 실험을 수행하였다. 임상 시험 결과는 관절염 예방에 약간의 성공을 거두었지만 동물 실험보다 인상적이지 않았다.
죽상경화성 플라크 병변에서 관찰된 자가항원에 대한 경구 내성도 연구되었다. 죽상경화증의 임상적 실험 모델에서 T-세포에 의해 인식되는 에피토프 및 Ig 역가에 대한 연구는 죽종 병변내의 염증을 억제하는 3종의 후보 항원, 즉 산화된 LDL, 응력 관련 열충격 단백질 HSP65 및 카디오리핀 결합 단백질 β2GP1을 시사하였다. 본 발명에 그대로 인용되는 미국 특허출원 09/806,400호(Shoenfeld et al, 1999. 9.30)는 산화된 인간 LDL을 섭취한 유전자적으로 감수성인 LDL 수용체 결손형 생쥐(LDL-RD)의 동맥에서 죽종발생이 약 30% 감소한다고 개시하고 있다. 죽종발생의 유의적인 억제가 아마도 경구 내성을 통해 달성되기는 하였지만 특정 지질 항원이나 면역원성 LDL 성분이 규명되지는 못하였다. 또 다른 장애물은 소화 분해에 의한 경구 투여된 항원의 생체내 고유 불안정성 및 간에 의한 산화된 LDL의 흡수와 과 세포 면역 기전이었다. 따라서, 섭취(경구) 보다는 점막 투여 경로가 보다 우수한 효율로 내성을 제공할 것으로 보인다.
면역 내성 유도 및 후속되는 자가면역 염증 과정의 예방 또는 억제는 장 이외의 다른 점막 부위를 통해 억제성 항원에 노출시켜 증명하고 있다. 눈, 중이, 호흡기 점막 및 다른 점막, 특히 장과 같은 비강 점막 주위의 막 조직은 자가항원은 물론 많은 침입성 항원에 노출되어 면역 반응성 기전을 갖고 있다. 즉, 로씨 등(Rossi et al., Scand J Immunol 1999 Aug;50(2):177-82)은 복부질병의 생쥐 모델에서 항원에 대한 면역반응을 억제조절하기 위한 글리아딘의 비측 투여가 정맥내 투여만큼 효과적임을 발견하였다. 이와 유사하게, 중증근육무력증의 생쥐 모델에서 근육 약화 및 특정 림프구 증식을 지연 및 감소시키는데 있어서 아세틸콜린 수용체 항원에 대한 비측 노출이 경구 노출 보다 훨씬 효과적이었다(Shi,FD. et al. J Immunol 1999 May 15; 162(10): 5757-63). 따라서, 점막은 물론 정맥내 또는 복강내 투여용의 면역원성 화합물은 비측 및 다른 막 경로를 통한 투여에 맞게 변조될 수 있어야 한다.
따라서, 점막, 특히 비측 투여로 면역원성을 우수하게 견딜 수 있는 플라크 관련 분자 조성물 및 이를 이용하는 신규 방법이 분명히 필요하다.
본 발명은 죽상경화증 및 관련 질환을 예방 및 치료하기 위한 죽상 플라크 관련 분자에 관한 것이고, 보다 상세하게는 점막 내성을 유도하고, 죽상 혈관 질환 및 후유증에 기여하는 염증 과정을 억제하는데 효과적인 플라크 관련 분자를 이용하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.
본 발명은 본원에서 첨부되는 도면을 참조하여 단지 예시적으로 설명되고 있다. 이하 도면에 대한 세부적인 설명으로, 제시된 세부사항이 본 발명의 바람직한구체예를 단지 예시하고 상세히 설명하기 위한 것이고, 본 발명의 원리와 개념적 양태가 가장 유용하고 쉽게 이해되는 설명인 것으로 생각되는 것을 제시하기 위한 것임을 분명히 한다. 이와 관련하여 본 발명의 기본을 이해하는데 필요한 것 보다 세부적으로 본 발명의 구성적 세부사항을 제시하고자 하지는 않았으며, 도면과 함께 제시된 상세한 설명을 통해 당업자라면 실제 구현될 수 있는 본 발명의 여러 형태를 분명하게 이해할 수 있을 것이다.
도면에서,
도 1은 플라크 관련 분자를 저용량으로 투여하여 유도한 비측 내성에 의한 아포-E 결손형 생쥐에서 나타나는 초기 죽종발생 억제 효과를 도시한 것이다. 9 내지 13주령의 아포-E 결손형 생쥐를 약한 마취하에 HSP 65(HSP-65)(n=12), 인간 산화된 LDL(H-oxLDL)(n=14), 인간 베타2GPI(B2gpi)(n=13), 소혈청 알부민(BSA) 노출 에 각각 생쥐당 10㎍씩 3회 용량으로 비내 노출시키거나 또는 식염수에 허위 노출(PBS)(n=12)시켰다. 최종 노출 후 모든 생쥐에게는 죽종발생성 "웨스턴" 식이를 공급하였다. 죽종발생은 3차 노출 후 5주째 대동맥굴내의 죽종 병변 부위로 나타낸다.
도 2는 HSP65를 지나치게 소량으로 비내 노출시켜 점막 내성을 유도한 아포-E 결손형 생쥐에서 나타나는 초기 죽종발생의 우수한 억제 효과를 도시한 것이다. 비측 내성은 12주 내지 16주령의 아포-E 결손형 생쥐에게 생쥐당 1㎍의 HSP65(저HSP-65)(n=16) 또는 10㎍의 HSP65(고HSP-65)(n=14)을 3회 용량으로 5일 동안 격일마다 비내 투여하여 유도하였다. 대조용 생쥐는 동부피(10㎕)의 소혈청 알부민 10㎍/생쥐(BSA)(n=14)을 비내 노출시키거나 또는 PBS에 허위 노출(PBS)(n=14)시켰다. 마지막 노출 후 모든 생쥐에게는 죽종발생성 "웨스턴" 식이를 공급하였다. 죽종발생은 최종 노출 후 5주째 대동맥굴내의 죽종 병변 부위로 나타낸다.
도 3은 인간 베타2GPI에 비내 노출시켜 유도된 죽상경화성 플라크 항원에 대한 면역 반응성의 우수한 억제 효과를 도시한 것이다. 5주령의 수컷 아포-E 결손형 생쥐에게 인간 베타2GPI(H-b2-nt)(n=3)를 생쥐당 10㎍씩 비내 노출시키거나; 또는 생쥐당 인간 베타2GPI(H-b20nt)(n=3) 100㎍을 PBS 0.2㎖에 용해시켜 위관공급으로 강제주입하거나; 또는 PBS만(PBS)(n=3)을 5일 동안 격일로 공급하였다. 최종 공급 후 1주일째 생쥐에게 생쥐당 인간 베타2GPI 10㎍의 1회 피하 주사액을 0.1㎖ 용량으로 투여하여 감작시켰다. 10일 후 서혜부 림프절 유래의 T-세포를 이하의 재료와 방법 항목에 기술한 바와 같이 제조하고 시험관내에서 증식을 평가하기 위하여 감작성 인간 베타2GPI 항원에 노출시켰다. 면역반응성을 나타내는 증식은 인간 베타2GPI 항원(자극 지수, S.I.)의 존재 유무하에 T-세포 DNA내로 병입된 표지된 티미딘 간의 비율로서 나타낸다.
바람직한 구체예의 상세한 설명
본 발명은 죽종 관련 항원에 대한 점막 내성을 유도하는데 효과적인 플라크 관련 분자를 이용하여, 죽종 혈관 질환 및 후유증에 기여하는 염증 과정을 억제하는 방법 및 조성물을 제공한다.
본 발명의 원리와 작동은 도면과 이하 상세한 설명을 참고로 하면 보다 잘 이해될 것이다.
본 발명의 1 이상의 구체예를 상세하게 설명하기에 앞서, 본 발명의 적용이 이하 상세한 설명에 기술되거나 실시예에 예시된 세부사항에만 제한되지 않는다는 것을 이해하고 있어야 한다. 본 발명은 다른 구체예가 있을 수 있거나 다양한 방식으로 실시 또는 시행될 수 있다. 또한, 본원에 사용된 구절 및 용어는 설명을 위한 것이지 제한하기 위한 것으로 간주되어서는 안된다.
실험적 및 임상 증거는 죽상경화증의 과도한 염증 반응의 병인으로서 플라크 관련 항원이 원인 역할을 한다는 것을 시사한다. 플라크 관련 분자인 산화된 LDL, 베타2GPI 및 HSP65에 대한 세포 면역반응성과 체액 면역반응성은 모두 입증된 바 있고, 이는 죽종발생에 항산화된 LDL 자가면역 성분이 중요하다는 것을 암시한다. 따라서, 산화된 LDL, 베타2GPI 및 HSP65, 및 이의 성분이 심장 질환, 뇌혈관 질환 및 말초 혈관 질환의 예방 및 치료를 위한 다양한 치료법의 표적이 되어왔다.
종래 기술에서는 죽상경화증 및 다른 플라크 관련 및 혈전증 관련 증상의 검출 및 진단을 위한 플라크 관련 항원의 적용을 교시하고 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,309,888호(Holvoet)는 관상동맥 질환을 판별하기 위하여 단계 특이적인 플라크 관련 항원 oxLDL과 MDA-LDL의 이용에 대하여 교시하고 있다. 이와 유사하게, 미국 특허 제5,998,223호 및 제5,344,758호(각각 Matsuura, et al 및 Krilis, et al.)는 APLS, SLE 및 죽상경화증의 혈청 표시인자를 선별하기 위하여 항 베타-2GPI 항체의 이용을 개시한 바 있다. 이와 같은 문헌들은 단지 진단 용도만을 제안하고 있고 이 플라크 관련 분자의 치료적 잠재성은 인식하지 못하고 있다.
죽상경화증 및 다른 플라크 관련 질환의 병인과 진행에서 면역반응의 역할이아직 논쟁 대상이 되고 있지만(Meir, K, et al., International Atherosclerosis Soc. 2001 Commentary), 다양한 면역계 요법이 죽상경화증에 대해 제안되었다. 염증 및 과민 증상에서 면역 반응을 감소시키는 일반 방법은 예컨대 미국 특허 제6,277,969호; 제5,698,195호 및 제5,656,272호(Le et al.), 및 제6,224,902호(Alving et al.), 국제 특허 출원번호 001 001 2514(Shurkovitz et al) 및 20010051156A1(Zeng)에 교시되어 있다. 하지만, 제안된 면역 반응성 매개인자, 예컨대 사이토킨, 종양 괴사 인자(TNF) 및 다른 병원성 인자의 감소 또는 제거는 혈액 면역흡착 및 지속적인 항사이토킨 투여와 같은, 현재 고가이며 잠재적으로 위험한 방법을 필요로 한다. 또한, 죽상경화증 또는 플라크 관련 질환의 치료적 적용에 대해서는 개시된 바가 없다.
플라크 관련 항원을 이용한 특정 면역요법이 또한 제안된 바 있다. 부몰(Bumol) 등, 칼레노프(Calenoff) 등 및 다카노(Takano) 등(각각 미국 특허 제5,196,324호; 제6,024,477호 및 제5,110,738호)은 면역화, 모노클로널 Ab 제제, 죽상경화증의 진단 및 치료를 위한 미정제된, 불분명하게 분획된 플라크 제제의 이용을 개시하고 있다. 죽종 조직의 이러한 항원, 단백질 및 지질 분획은 명확히 규명되지 않아 치료용으로 사용하기 어렵고 장기 치료에 잠재적 위험성이 있다.
종래 기술은 죽상경화증의 치료 및 예방을 위하여 산화된 LDL에 대하여 지향성인 면역요법을 교시하고 있다. 미국 특허 제6,225,070호(Witztum et al)는 대식세포에 대한 산화된 LDL의 결합 및 포말세포 형성을 억제하기 위하여 산화된 LDL에 대한 mAb를 이용하는 것에 대해 개시하고 있다. 이와 유사하게, 맥그레고르등(McGregor, et al. 국제특허출원 EP1162458 A1)은 대식세포에 의한 산화된 LDL의 흡수 및 전달을 특이적으로 변조시키는 방법을 개시한다. 미국 특허 제5,733,524호 및 제5,733,933호(Bucala et al.)는 진행 글리코실화 최종 산물 지질(AGE-지질)을 감소시켜 특이적인 항산화된 LDL 면역반응을 감소시키는 방법을 개시한다. 제안된 치료법 중에서 산화된 LDL에 대한 능동 면역법을 교시하거나 지속적 치료섭생을 요하는 방법은 전혀 없다.
조우(Zhou) 등(Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2001; 21:108)은 생쥐내 초기 플라크 형성을 균질화된 플라크 또는 상동성 MDA LDL을 이용한 발바닥 면역화 후 유의적으로 감소시켰다. 팔린스키(Palinski) 등(PNAS USA 1995; 92: 821-25)은 산화된 LDL로 면역화한 토끼에서 유사한 수준의 보호효과를 얻었다. 하지만, 산화된 LDL에 대한 종래의 면역화 기법 적용에는 문제가 있는데, 이것은 면역화 및 추가접종에 필요한 보조 제제가 유사한 면역화 섭생에서 플라크 형성을 가속화시킨다는 것이다. 또한, 면역화를 위하여 비교적 고용량(100㎍/생쥐/주사)의 플라크 항원이 요구되었다. 점막 투여와 내성 유도에 대해서는 언급되고 있지 않다.
또한, 다른 플라크 항원을 이용한 면역 요법이 제안되기도 하였다. 최근 베타GPI를 이용한 동물 및 시험관내 연구(George J, et al Rheum Dis Clin North Am 2001;27:603-10; Brey, et al. Stroke 2001; 32: 1701-06; Kyobashi, et al. J Lipid Res 2001; 42: 697-709; Koike T, et al Ann Med 2000; 32, Suppl. I:27-31 및 Cabral AR et al Am J Med 1996; 101:472-81)에서, 발작, APLS, 죽상경화증 및 심근경색과 베타2GPI의 관련성을 입증한 바 있다. 이 단백질의 잠재 에피토프가 산화된 LDL에 대한 체액 및 세포 면역반응에 연관이 있음이 명백하지만 상기 연구보고서 중에서 상기 단백질을 이용한 예방 면역성을 입증한 문헌은 없다. 이와 유사하게, HSP65를 이용한 연구(Birnie DH Eur Heart J 1998; 19:366-67; Xu Q, et al. Circulation 1999; 100:1169-74; 및 Gromadzk G et al., Cerebrovasc Dis 2001; 12:235-39)에서는 이 플라크 관련 항원이 발작 및 심장 질환에 연관이 있음을 밝히며, 체액 면역성이 촉발 인자일 수 있음을 암시하고 있다.
죽상경화증에 관여하는 플라크 항원 면역성의 복잡성은 강한 세포 및 체액 반응을 나타내는 HSP65 및 베타2GPI 단백질 항원을 이용하여 LDL 수용체 결손형(KO) 생쥐를 면역화하고 플라크 형성을 증가시킨 쇼엔펠드 Y. 등(Schoenfeld Y. et al, Autoimmunity 2000; 15:199-202)에 의해 증명되었다. 이와 유사하게 죽종발생 증가는 플라크 항원에 의해 활성화된 림프구를 수동 전달함으로써 관찰되었다. 하지만, 전술한 연구 중에서 면역 내성에 의해 죽종발생 과정의 억제를 입증한 문헌은 없다.
죽상경화증 및 관련 질환에서 자가항원에 대한 면역 반응을 억제하는 방법은 최근에 연구된 바 있다. 빅토리아(Victoria) 등(미국 특허 제6,207,160호 및 제5,844,409호)은 APLS, SLE 및 다른 질환에서 면역 세포의 항체 결합을 감소시키고 B-세포 내성을 유도하기 위하여 특이적 비면역원성 베타2GPI 펩타이드가 결여된 T 세포 에피토프를 개시하고 있다. 하지만, 능동 보호에 대해서는 전혀 증명된 바가 없으며, 이 문헌들은 비면역원성 펩타이드의 진단 용도만을 강조하고 있다. 조지 J 등(George J, et al Atherosclerosis 1998;138: 147-52)은 MDA LDL을 이용한과면역화로 면역 억제가 실행가능하며, 생쥐에서 죽종발생이 감소됨을 입증하였다. 하지만, 필요한 항원 용량이 비현실적으로 다량이어서, 플라크 항원을 이용한 면역화에 대한 역설적 반응으로 이 치료법의 임상적 효능이 쓸모없게 된다. 또한, 전술한 연구들에서는 죽상경화증을 치료하기 위하여 점막 내성을 유도하는 방법에 대해서는 개시된 바가 전혀 없다.
염증 증상을 억제 및 예방하기 위한 경구 및 점막 내성은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 사용가능한 증상, 항원 및 치료 방식에 대한 예는 미국 특허 제5,935,577호; 제5,397,771호; 제4,690,683호(Weiner et al.) 및 국제특허번호 EP 0886471 A1 및 WO 01821951(Haas et al)에서 찾아볼 수 있다. 미국 특허출원 09/806,400(Shoenfeld et al. 1999.9.30. 출원)은 그대로 본원에 참고원용되고 있으며, LDL 수용체 결손형 생쥐에서 내성 유도를 위해 플라크 관련 항원을 경구 투여하는 것을 교시하고 있다. 이 발명자들은 동맥의 지방층 병변 밀도를 측정함으로써 동물 유래의 산화된 LDL, 베타2GPI 및 HSP65의 경구 투여가 각각 약 30%의 죽종발생 감소를 유발할 수 있음을 입증하였다. 하지만, 일반적으로 항원의 경구 투여는 내성과 정확한 용량을 달성하는데 수많은 방해를 받는다. 즉, 항원은 분해 작용을 받아 파이어판의 림프 조직에 제공되기 전에 농도와 분자 구조가 모두 변화된다. 또한, 이 발명자들은 점막 및 비측 내성과 같은 다른 투여 경로를 통해 내성 유도의 효능에 대해서는 연구하지 못했다. 전술한 문헌들에 명백하게 입증되고 있듯이, 경구 및 점막 내성을 유도하기 위한 변수는 종래의 면역화에서의 항원성 활성이나 심지어 시험관내 결과로부터 추론될 수는 없는 것이며 집중적인 실험을 통해 얻어지는 것이다. 실제, 많은 연구들에서 면역계내의 "반응성과 비반응성 사이의 균형"을 조절하는데 있어서의 고유한 복잡성을 입증하고 있다. 지브니(Zivny) 등(Clin Immunol 2001;101:150-68)은 "일반적으로, 한 항원(내성 유도 항원)에 대한 반응으로부터 다른 항원에 대한 반응을 항상 추론할 수 없다"는 것을 분명히 하고 있다. 이와 마찬가지로, 한니헨(Hannihen) 등(Diabetes 2001;50:771-75)은 항원을 경구, 비측 및 호흡기로 투여하여 내성을 유도하기 보다는 질환 증상(당뇨방)을 유도하였다. 점막 내성에 있어서의 유사한 비일관성은 후지하시(Fijuhashi) 등(Acta Odontol Scand 2001; 59:301-08), 쟝(Jiang) HR 등(Br J Ophthalmol 2001; 85:739-44)에 의해 보고된 바 있다. 점막 예방접종 방법의 문제점은 최근에 검토된 바 있다(Ogra PL, et al, Clin Microbiol Rev 2001;14:430-45; Chen H et al, J Control Release 2000; 67:117-28; 및 Lehner T et al., J Infect Dis 1999; 179 Suppl 3: S4890-92).
본 발명자들은 본 발명을 실용화하면서 플라크 관련 분자의 비측 투여가 점막 내성을 유도하고 항플라크 관련 항원 면역 반응성을 억제하며 죽상경화증을 예방할 것이라는 것을 발견하였다. 점막 내성은 이의 우수한 적용 용이성, 용량 정확성 및 소화 및 대사 과정에 의한 내성화 분자 변화의 극히 낮은 발생 가능성(특히 비경구 투여 경로에서)의 측면에서 유리하다. 이러한 장점은 죽종발생 과정의 우수한 예방효과, 향상된 환자 적응성 및 치료비용의 감소 효과를 제공한다.
따라서, 본 발명의 제1 양태에 따라 본 발명은 인간과 같은 피검체에 플라크 관련 분자에 대한 면역 내성을 유도하는 방법을 제공한다.
이러한 양태의 본 발명에 따른 방법은 적어도 하나의 플라크 관련 분자의 항원성 부를 치료적 유효량으로 피검체(예, 인간)에게 투여함으로써 실시된다.
본 명세서에 사용된 "점막 투여"란 용어는 점막 관련 림프 조직의 성분을 가진 점막에 임의의 그리고 모든 화합물 및/또는 조성물을 투여하는 것을 의미한다. 점막 투여의 비제한적 예로는 협측, 비내, 귀측(중이), 결막측, 질내, 직장측 등이 있다. 점막 투여에는 예컨대 정맥내, 피하 및 경막외 투여는 포함되지 않는다.
본 명세서에 사용된, "플라크 관련 분자"는 플라크 관련 증상 또는 질환의 병인, 병원성, 증후학 및/또는 치료와 물리적 또는 기능적으로 관련된 임의 및 모든 단백질, 탄수화물, 지질 및 핵산 분자, 이의 일부(항원성 부), 이의 유도체 또는 이의 배합물을 의미한다. 이 분자들은 예컨대 산화된 LDL, 포말 세포 성분등과 같은 플라크 성분일 수 있으나 항체, 사이토킨, 성장 인자 및 T 세포 수용체와 같은 체액성 및 세포성 실체물을 포함할 수도 있다.
본 명세서에 사용된 "항원성 부"라는 용어는 면역 반응을 유도할 수 있는 분자의 일부를 의미한다. 예를 들어, 분자가 단백질(예컨대, HSP65, 베타2GPI)인 경우에 그 일부는 항원성 에피토프를 구성하는 6 내지 8개의 아미노산 스트레치를 포함할 수 있다. 항원성 부를 예측하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 그 예로는 DNASTAR'S PROTEAN 서열분석 및 예측 모듈(DNAStar, Madison, WI)이 있다. 이와 같은 본 발명에 사용하기에 적합한 플라크 관련 분자의 항원성 부 측정은 통상의 기술을 가진 당업자의 능력 범위내에서 충분히 시행가능한 것이다.
플라크 관련 분자( 및 이의 단편, 유사체, 일부 및 유도체)는 자연원(일반적으로 이 분자가 나타나는 조직이나 기관)으로부터 정제할 수 있고, 뿐만 아니라 재조합 DNA 기법을 사용하여 당업자에게 공지된 기술에 따라 박테리아, 효모, 곤충(예, 바큘로바이러스) 및 포유동물 세포로부터 수득할 수 있다. 다양한 잠재적 플라크 관련 분자는 물론 실제 플라크 관련 분자의 아미노산 서열은 공지되어 있으며, 예컨대 인간 베타2GPI(수탁번호 AAB21330, Matsuura, et al), HSP65(수탁번호 AF65546, Oliviera et al) 및 인간 대식세포 LDL 스캐빈저 수용체(수탁번호 XP_008489, NCBI Annotation Project).
본 발명의 방법론을 사용하여 확립된 면역 내성은 플라크 형성과 관련된 질환, 예컨대, 비제한적으로, 죽상경화증, 죽상경화성 심혈관 질환, 뇌혈관 질환, 혈관 질환, 협착증, 재협착증 및 스텐트내 협착증 등의 예방 및/또는 치료에 사용할 수 있다. 죽상경화성 심혈관 질환의 몇 가지 비제한적 예는 심근 경색, 관상 동맥 질환, 급성 관상 증후군, 울혈성 심부전, 협심증 및 심근 허혈이다. 말초 혈관 질환의 몇 가지 예로는 괴저, 당뇨성 혈관병증, 허혈성 장 질환, 혈전증, 당뇨성 망막병증 및 당뇨성 신장병증이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 심혈관 질환의 비제한적 예로는 발작, 심혈관 염증, 뇌출혈 및 척추동매부족증이 있다. 협착증은 일반적으로 죽상 플라크 및 향상된 혈소판 활성이 원인이고 관상 혈관구조에 가장 심각한 영향을 미치는 혈관구조의 폐색성 질환이다. 재협착증은 협착 혈관구조에서 폐색이 감소된 후 종종 진행되는 재폐색성 질환이다. 혈관구조의 개통에 스텐트의 기계적 지지가 필여한 경우에 스텐트내 협착증이 일어나 처리된 혈관을 재폐색시킬 수 있다.
본 방법과 함께 사용하기에 적합한 플라크 관련 분자로는 몇 가지가 있다. 그 예로서, 변형 지질, 인지질 및 지단백, 아포지단백-지질 복합체, 예컨대 LDL-카디오리핀, HSP 및 베타2GPI와 같은 단백성 분자의 특정 에피토프, LDL 수용체와 같은 포말 세포 표면 항원 및 트로포닌과 같은 평활근 성분이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 사용된 플라크 관련 분자는 산화된 LDL, 베타2GPI, HSP65 및/또는 이의 유도체이다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에 따르면, 전술한 분자 중 2 이상의 배합물을 피검체에게 투여한다.
본 발명의 방법은 비죽상경화성 관련 질환의 예방 및/또는 치료에 사용할 수 있다. 예를 들어, 인지질, 인지질 대사산물 및 HSP65는 다른 비죽상경화성 관련 질환의 병원성에 연관이 있는 것이 분명한 바 그 질환의 치료에 사용가능할 것이다. 이러한 질환 및 증후로는 노화의 산화 스트레스(Onorato JM, et al, Annal N Y Acad Sci 1998 Nov 20;854:277-90), 류마티스성 관절염(RA)(Paimela L, et al. Ann Rheum Dis 1996 Aug; 55(8):558-9), 소아 류마티스성 관절염(Savolainen A, et al, 1995;24(4):209-11), 염증성 장 질환(IBD)(Sawai, T, et al, Pediatr Surg Int 2001 May;17(4):269-74), 신장암(Noguchi S, et al., Biochem Biophys Res Commun 1992 Jan 31; 182(2):544-50), 정맥 및 동맥 혈전증(Cabral AR, et al Am J Med 1996; 101:472-81), 항인지질 증후군(APLS 또는 APS)(Koike T, et al Ann Med 2000; 32 Suppl I:27-31), 전신홍반성낭창(미국 특허 제5,344,758호 및제6,207,160호, 각각 Krilis et al 및 Victoria, et al)이 있다. 즉, 본 발명의 방법은 노화, RA, 소아RA, IBD, SLE, APLS, 혈전증 및 암과 같은 비죽상경화성 관련 질환의 예방 및/또는 치료에 사용할 수 있다.
전술한 면역 내성 유도 분자 또는 분자 배합물은 그대로 투여하거나 또는 적합한 담체 또는 부형제와 혼합한 약학적 조성물로서 투여할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "약학적 조성물"이란 생리적으로 적합한 담체 및 부형제와 같은 다른 화학 성분과 본 명세서에 기술된 1종 이상의 활성 성분으로 이루어진 제제이다. 본 발명의 약학적 조성물의 목적은 유기체에 대한 면역 내성 유도 분자의 점막 투여를 용이하게 하기 위함이다.
본 명세서에 사용된 "활성 성분"이란 용어는 생물학적 효과(면역 내성)에 중요한 역할을 하는 플라크 관련 분자(예컨대, 산화된 LDL, HSP65 및 베타2GPI)의 적어도 항원성 부 또는 이의 배합물을 의미한다.
이하에 호환적으로 사용될 수 있는 "생리적 허용성 담체" 및 "약학적 허용성 담체"란 용어는 유기체에 유의적인 자극을 일으키지 않는 담체 또는 희석제를 의미하며 투여된 화합물의 생물학적 활성과 성질을 저해하지 않는다. 보조제는 이러한 용어에 포함되는 것이다.
본 명세서에서 "부형제"란 용어는 활성 성분의 투여를 보다 용이하게 하기 위하여 약학적 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 의미한다. 부형제의 예로는 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당과 다양한 종류의 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 식물성 오일 및 폴리에틸렌 글리콜이 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
약물의 배합과 투여 기법은 본발명에 참고인용되는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, 최근판]에서 찾아볼 수 있다.
적합한 점막 투여 경로로는 예컨대 직장, 협측, 질내 및 특히 경비적, 귀, 결막 및 호흡기(기관지내) 투여 경로가 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 기술분야에 공지된 방법, 예컨대 통상의 혼합, 용해, 과립화, 당의정 제조, 분말화, 유화, 캡슐화, 포획화 또는 동결건조 공정을 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 약학적 조성물은 따라서 활성 성분의 제제로의 가공을 용이하게 하고 약학적으로 사용할 수 있는 부형제 및 보조제를 포함하는 1종 또는 그 이상의 생리적 허용성 담체를 사용하여 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 적당한 배합은 선택한 점막 투여 경로에 따라 달라진다.
약학적 조성물의 활성 성분은 수용액, 바람직하게는 항크스액, 링거액 또는 생리적 염 완충액과 같은 생리적 상용성 완충액 중에서 배합될 수 있다. 이러한 배합 중에 투과될 장벽에 적당한 침투제를 사용할 수도 있다. 이러한 침투제는 당해 기술분야에 일반적으로 공지되어 있다.
비측 흡입에 의한 투여의 경우, 본 발명에 따라 사용하기 위한 활성 성분은 적합한 추진제, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로-테트라플루오로에탄 또는 이산화탄소의 사용으로 가압 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 분무제 형태로 편리하게 전달된다. 압축 에어로졸의 경우, 용량 단위는 계량된 함량을 전달하는 밸브를 사용하여 측정할 수 있다. 분배기에 사용되는 젤라틴 등의 캡슐 및 카트리지는 화합물의 분말 믹스와 락토스 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제를 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 결막과 같은 눈의 막에 투여할 수 있다. 이와 같은 조성물은 예컨대 점적 투여기를 사용하여 투여할 수 있는 전술한 액체 또는 반액체 조성물로 제조할 수 있다. 멸균은 당해 기술분야에 공지된 멸균 방법으로 확실하게 할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 코코아 버터 또는 다른 글리세라이드와 같은 통상의 좌약용 기제를 사용하여 좌약 또는 정체관장제 등의 직장 및 질측 조성물로 제조할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 흡입 투여할 수 있다. 흡입 투여되는 내성화제용 제제의 예는 1990.12.17에 출원된 PCT/US90/07455에 제시되어 있다. 본 발명의 흡입 투여용 약학적 제제는 선택 성분으로서 약학적 허용성 담체, 희석제, 가용화제 및 유화제, 및 당해 기술분야에 공지된 유형의 염을 포함할 수 있다. 이러한 물질의 예로는 생리적 완충 식염수와 같은 일반 식염수 용액 및 물이 있다.
본 발명의 다른 구체예에 따른 내성화 항원의 투여 경로는 에어로졸 형태 또는 흡입 형태가 이용되는 것이다. 이 때 항원은 운반 기체(예, 공기 또는 N2)에 현탁된 분무 수용액으로 또는 무수 분말 입자로서 투여될 수 있다. 바람직한 에어로졸 약제는 예컨대 약 1mg 내지 약 300mg 범위의 항원을 함유하는 생리적 허용성 완충 식염수 용액을 포함할 수 있다.
액체에 용해 또는 현탁되지 않는 내성화 항원의 고체 미립자 형태의 무수 에어로졸도 본 발명의 실시에 유용하다. 이 때, 내성화 항원은 먼지 분말 형태일 수 있고, 평균 입자 크기가 약 1 내지 5 마이크론, 바람직하게는 2 내지 3 마이크론 사이인 미립자를 포함할 수 있다. 미립자는 당해 기술분야에 공지된 기법을 사용하여 분쇄 및 망여과에 의해 제조할 수 있다. 이 미립자는 분말 형태일 수 있는 소정량의 미분 물질을 흡입함으로써 투여될 수 있다.
흡입용 약제에 유용한 담체 및/또는 희석제의 비제한적인 구체예로는 물 및 인산염 완충 식염수 용액 pH7.0 내지 8.0과 같은 생리적 허용성 완충 식염수 용액이 있다. 본 발명의 흡입용 약제 또는 용량 형태에 사용하기에 적합한 담체 또는 희석제는 미국 특허 제5,935,577호(Weiner et al.)에 개시되어 있다.
본 발명의 약제는 미국 특허 제5,935,577호(Weiner et al.)에 기술된 것과 같은 분무기를 사용하여 에어로졸 분무제 형태로 투여할 수 있다. 에어로졸 물질은 치료받는 피검체에 의해 흡입된다.
문헌[Newman, S.P. in Aerosols 및 Lung, Clarke, S.W. and Davia, D. eds, pp. 197-224, Butterworths, London, England, 1984]에 개시된 바와 같은 압축 계량 투여 흡입기(MDI) 및 무수 분말 흡입기 등의 다른 에어로졸 전달 시스템도 본 발명의 실시에 사용할 수 있다. 본 명세서에 개시된 유형의 에어로졸 전달 시스템은 다양한 시판원, 예컨대 피손스 코포레이션(Bedford, Mass.), 쉐링 코포레이션(Kenilworth, N.J.) 및 아메리칸 파모실 컴패니(Valencia, Calif.)로부터 입수용이한 것이다.
본 발명의 상황에서 사용하기에 적합한 약학적 조성물은 목적 용도를 달성하기에 효과적인 양으로 활성 성분을 포함하는 조성물을 포함한다. 보다 상세하게는, 치료적 유효량은 면역반응을 유도하여 질환(예, 죽상경화증)의 증후를 예방, 경감 또는 완화시키기에 효과적인 활성 성분의 양을 의미한다.
활성 성분을 투여하기에 최적인 섭생의 확인은 본 명세서에 개시된 정보와 점막 활성 항원 및 자가항원의 투여에 관한 공지의 정보를 기초로 하여 측정한다. 치료 투여량, 배합물 및 지속기간의 통상적인 변화는 죽종 발생의 정도가 측정될 수 있는 상황하에서 실시한다. 유용한 투여량과 투여 변수는 자가반응성 T 세포의 수를 감소시키거나 질환의 적어도 하나의 임상 증후 또는 조직학적 증후의 발생이나 정도의 감소를 비롯하여 염증 반응을 감소시키는 것이다.
본 발명의 약학적 조성물은 플라크 관련 질환의 치료 또는 예방에 유용한 추가 화합물의 치료적 유효량을 포함하도록 제조할 수 있다. 바람직한 일 구체예에서, 추가 화합물은 HMGCoA 환원효소 억제제(스타틴), 점막 보조제(예컨대, 미국 특허 제6,270,758호, Staats et al 참조), 코르티코스테로이드, 소염 화합물(예컨대, 미국 특허 제6,297,260호, Bandarage, et al), 진통제, 성장 인자, 독소 및 부가 내성화제이다. 또한, 본 발명의 방법과 조성물은 특별히 반대지시가 없는 한 전술한 질환이나 증상의 다른 요법을 개시하거나 지속하는 것을 배제하지 않는다는 것은 당연한 것이다.
본 발명의 방법에 사용된 모든 제제에서 치료적 유효량 또는 용량은 먼저 시험관내 분석 및 세포 배양 분석으로부터 산정할 수 있다. 예를 들어, 용량은 동물 모델에서 목적 농도 또는 역가를 달성하도록 조제될 수 있다. 이러한 정보를 사용하여 인간에 유용한 용량을 보다 정확하게 결정할 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 사이토킨 및 비사이토킨 상승작용제는 플라크 관련 분자와 점막 내성의 효과를 향상시키기 위해 치료에 배합될 수 있다. 다른 사이토킨 상승작용제(제I형 인터페론)의 경구 및 비경구 사용은 1995년 4월 7일에 출원된 PCT/US95/04120에 기술된 바 있다. Th2 상승성 사이토킨의 투여는 1995년 4월 7일에 출원된 PCT 출원 PCT/US95/04512에 기술되어 있다. 예를 들어, IL-4와 IL-10은 PCT/US95/04512에 기술된 방식으로 투여할 수 있다.
본 명세서에 기술된 활성 성분의 독성 및 치료 효능은 시험관내, 세포 배양물내 또는 실험 동물내에서 표준 약학적 절차에 따라 측정할 수 있다. 이와 같은 시험관내 및 세포 배양물 분석과 동물 연구에서 수득된 데이터는 인간에 사용하기 위한 투여량 범위를 조제하는데 사용할 수 있다. 투여량은 사용되는 투여량 형태와 이용된 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 정확한 배합, 투여 경로 및 투여량은 환자 증상에 기초하여 담당의사에 의해 선택되어질 수 있다(예컨대, Fingl et al., 1975, "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch.1 p.1).
투여량과 투여간격은 각각 내성을 유도하기에 충분한 활성 성분의 점막 수준을 제공하도록 조정할 수 있다. 각 제제마다 "내성화 투여량"이 달라지지만, 시험관내 데이터로부터 계산할 수 있다. 내성화 투여량을 달성하는데 필요한 투여량은 개개인의 특성과 투여경로에 따라 달라진다. 검출 분석은 혈장 농도를 측정하는데사용할 수 있다.
치료할 증상의 정도와 반응도에 따라 용량은 수일에서 수주간 지속되는 치료 기간 동안 또는 치료가 효과를 거두거나 질환 상태가 감소될 때까지 1회분 또는 복수 투여분으로 제조할 수 있다.
투여할 조성물의 함량은 물론 치료받는 피검체, 고통의 정도, 투여 방식, 처방 의사의 판단 등에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 조성물은 필요한 경우 활성 성분을 함유하는 1 또는 그 이상의 단위 투여량 형태를 포함할 수 있는 FDA 승인 키트와 같은 팩이나 분배 장치로 제공될 수 있다. 팩은 예컨대 흡입기를 포함할 수 있다. 팩 또는 흡입기는 투여 지시서를 수반할 수 있다. 팩 또는 흡입기는 또한 약제의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부부처가 지시한 형태로 용기에, 그 조성물 형태에 대한 정부부처의 승인이나 인체용 또는 수의용에 관한 주의문을 부착할 수 있다. 이러한 주의문은 예컨대 처방약물에 대한 미국 식약청이 승인한 라벨이거나 승인된 제품 삽입 구문일 수 있다. 상용성 약학적 담체에 조제된 본 발명의 제제를 포함하는 조성물은 제조되어 적당한 용기에 첨가된 후, 전술한 바와 같은 제시된 증상의 치료용이라는 라벨을 부착할 수 있다.
본 발명의 내성화 조성물의 투여 및 내성화 방법은 피내, 피하 및 복강내 투여와 같은 비점막 방법으로 추가 실시될 수 있음은 당연한 것이다.
본 발명의 다른 양태에 따라, 본 발명은 죽상경화증 관련 질환이나 증상이 있는 피검체에게 플라크 관련 분자 또는 이의 조성물을 점막 투여하는 단계 및 그다음 죽종발생이나 염증의 적어도 하나의 표시인자를 분석하여 실시되는 것이 특징인, 죽상경화증 관련 질환이나 증상에 미치는 플라크 관련 분자의 점막 투여 효과를 측정하는 분석법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 플라크 관련 분자는 산화된 LDL, 베타2-GPI, HSP 및/또는 이의 유도체이다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 플라크 관련 분자의 적어도 항원성 부는 점막 투여되고, 상기 플라크 관련 분자는 자연 발생 분자이거나 합성 분자이다.
본 발명의 분석법 측면에서 분석될 수 있는 죽종발생 또는 염증의 표시인자는 당해기술분야에 공지되어 있다. 비제한적인 몇 가지 예로는 지방층 병변 계수와 같은 조직학적 방법과 자극 지수와 같은 면역학적 방법이 있으며, 이는 이하 실시예 항목에서 상세히 설명된다. 죽상경화증의 진행은 예컨대 죽종발생 식이로 사육되는 죽상경화증이 발생하기 쉬운 생쥐(예컨대 George J, et al Circulation 1999; 99: 2227-30)에서 분석할 수 있다. 염증은 당해 기술분야에 공지된 세포학적, 면역학적, 생화학적, 분자 유전학 기법으로 분석할 수 있다.
본 발명의 다른 목적, 장점 및 신규 특징은 이하 실시예를 검토할 때 당업자라면 분명하게 파악할 수 있으며, 이하 실시예는 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다. 또한, 상기 기술되고 이하 청구의 범위에서 청구되는 본 발명의 다양한 구체예와 양태는 각각 다음 실시예에 의해 실험적으로 지지된다.
발명의 개요
본 발명의 제1 양태에 따라, 본 발명은 활성 성분으로서 적어도 하나의 플라크 관련 분자의 적어도 항원성 부를 치료적 유효량으로 포함하여, 죽상경화증, 심혈관 질환, 뇌혈관 질환, 말초 혈관 질환, 협착증, 재협착증 및/또는 스텐트내 협착증(in-stent-stenosis)의 예방 및/또는 치료를 요하는 피검체의 상기 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 약학적 조성물, 또는 이의 약학적 허용성 염을 제공하며, 이 조성물은 추가로 약학적 허용성 담체를 포함하기도 하고, 점막 투여용으로 고안된 것이다.
제2 양태에 따라, 본 발명은 죽상경화증 관련 질환 또는 증상이 있는 피검체에게 적어도 하나의 플라크 관련 분자의 적어도 항원성 부를 점막 투여하고, 그 피검체에서 나타나는 적어도 하나의 죽종발생 표시인자를 분석하여 죽상경화증 관련 질환 또는 증상에 미치는 상기 적어도 하나의 플라크 관련 분자의 적어도 항원성 부의 점막 투여 효과를 측정함으로써 실시되는, 죽상경화증 관련 질환 또는 증상에 미치는 플라크 성분의 점막 투여 효과를 측정하는 분석법을 제공한다.
제3 양태에 따라, 본 발명은 죽상경화증, 심혈관 질환, 뇌혈관 질환, 말초 혈관 질환, 협착증, 재협착증 및/또는 스텐트내 협착증(in-stent-stenosis)의 예방 및/또는 치료를 요하는 피검체에게 적어도 하나의 플라크 관련 분자의 적어도 항원성 부를 치료적 유효량으로 점막 투여하는 것을 포함하여, 상기 피검체의 죽상경화증, 심혈관 질환, 뇌혈관 질환, 말초 혈관 질환, 협착증, 재협착증 및/또는 스텐트내 협착증(in-stent-stenosis)을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다.
하기 기술되는 본 발명의 바람직한 구체예에 제시된 다른 특징에 따르면, 플라크 관련 분자는 산화된 LDL, 베타2GPI, HSP 및 이의 유도체로 구성된 군 중에서 선택되는 것이다.
하기 기술되는 본 발명의 바람직한 구체예에 제시된 또 다른 특징에 따르면, 적어도 하나의 플라크 관련 분자의 항원성 부는 자연 발생 분자 또는 합성 분자이다.
하기 기술되는 본 발명의 바람직한 구체예에 제시된 또 다른 특징에 따르면, 약학적 조성물은 비측, 호흡기측, 귀측 및/또는 결막 투여용으로 고안된 것이다.
하기 기술되는 본 발명의 바람직한 구체예에 제시된 또 다른 특징에 따르면, 적어도 하나의 플라크 관련 분자의 적어도 항원성 부는 상기 피검체내에 존재하는 플라크 성분에 대한 면역 반응성을 감소시킬 수 있는 것으로 선택한다.
하기 기술되는 본 발명의 바람직한 구체예에 제시된 또 다른 특징에 따르면, 약학적 조성물은 죽상경화증, 심혈관 질환, 뇌혈관 질환, 말초 혈관 질환, 협착증, 재협착증 및/또는 스텐트내 협착증으로 구성된 군 중에서 선택되는 1종 이상의 질환을 예방 및/또는 치료하기 위하여 포장되고 표시된 것이다.
하기 기술되는 본 발명의 바람직한 구체예에 제시된 또 다른 특징에 따르면, 약학적 조성물은 추가로 HMGCoA 환원효소 억제제(스타틴), 점막 보조제, 코르티코스테로이드, 소염 화합물, 진통제, 성장 인자, 독소 및 또 다른 내성화 항원으로 구성된 군 중에서 선택되는 1종 이상의 추가 화합물의 치료적 유효량을 포함한다.
본 발명은 플라크 관련 분자의 점막 투여에 의해 우수한 면역 내성을 유도함으로써 죽상경화증 및 다른 플라크 관련 질환을 억제하는 신규 방법을 제공함으로써 현재 공지된 구성의 문제점을 성공적으로 해결하고 있다.
이하 실시예는 전술한 상세한 설명과 함께 비제한적 방식으로 본 발명을 설명한 것으로 참고할 수 있다.
일반적으로, 본 명세서에 사용된 명칭과 본 발명에 사용된 실험 절차는 생화학적 기법과 면역학적 기법을 포함한다. 이러한 기법은 문헌에 상세하게 설명되어 있다. 예컨대, "Cell biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J.E.,ed.(1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J.E., ed.(1994); Stites et al.(eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT(1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W.H.Freeman and Co., New York(1980); 이용가능한 면역분석법은 다음과 같은 특허문헌과 과학지에 광범위하게 기술되어 있다: 미국 특허 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 및 5,281,521; 및 "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; Marshak et al., 이 문헌들은 모두 본 명세서에 상세히 기술된 바와 같이 참고원용된 것이다. 이 서류를 통해 다른 일반 문헌들도 제공된다. 본 명세서에 제시된 절차는 당해 기술 분야에 공지된 것으로 생각되지만 독자가 편리하도록 제시하였다. 여기에 포함된 모든 정보는 본원에 참고원용된 것이다.
재료 및 실험 방법
동물:본 실험에 사용된 아포-E 결손형 생쥐는 죽상경화증에 걸리기 쉬운 종인 C57BL/6J-Apo-Etmlunc에서 유래된 것이다. Apo-Etmlunc돌연변이와 동질접합체인 생쥐는 연령이나 성별에 관계없이 현저하게 증가된 총 혈장의 콜레스테롤 수준을 나타낸다. 근접 대동맥 중의 지방층은 3개월령에서 발견된다. 이 병변은 연령에 따라 증가하고, 전형적인 전구죽상경화성 병변의 보다 진행된 단계인, 지질은 적지만 세장형 세포가 많은 병변으로 진행한다.
종 성장: Apo-Etmlunc돌연변이종은 채플 힐에 소재하는 노스캐롤라이나 대학의 노부요 마에다 박사의 실험에서 성장시켰다. 129 유래의 E14Tg2a ES 세포주를 사용하였다. 사용한 플라스미드는 pNMC109이고 파운더 라인(founder line)은 T-89이다. Apo-Etmlunc돌연변이를 10회 역교배하여 C57BL/6J 균주를 C58BL/6J 생쥐로 생산하였다(11,12).
이 생쥐는 쉐바 병원 동물 사육실(Tep-Hashomer, Israel)에서 12시간의 명/암 사이클 하에 22 내지 24℃에서 유지시키고 콜레스테롤 0.027%, 총 지방 약 4.5% 및 물을 함유하는 일반 실험용 지방식(Purina Rodent Laboratory Chow No.5001)을 임의로 공급하였다. "웨스턴 식이"(TD96125, Harlan Teklad, 지방에서 42% 칼로리, 탄수화물에서 43% 칼로리 및 단백질에서 15% 칼로리)는 표준화된 고지방 죽종발생 식이이다.
비측 내성:비측 내성은 산화된 LDL, 베타2GPI 또는 HSP65를 총 부피 10㎕ PBS로 만들어 비내 투여하여 유도하였다. 비내 투여는 약간 진정시킨 생쥐(12주 내지 16주령)에게 생쥐마다 표시된 농도의 항원 3회 용량을 격일로 공급하여 실시하였다. 죽종발생은 최종 비내 투여한 당일부터 5주간 웨스턴 식이로 유도하였다. 대조군에게는 동일한 섭생으로 표시된 바와 같이 동량의 BSA 및/또는 PBS를 공급하였다. 모든 생쥐의 콜레스테롤과 트리글리세라이드 수준을 측정하기 위하여 혈장 시료를 수득하고, 이하 기술되는 바와 같이 죽상경화증의 평가를 위해 5주간의 웨스턴 식이 후 생쥐를 죽였다.
경구 내성:비교를 위해, 플라크 관련 분자에 대한 경구 내성은 비측 내성과 유사한 섭생으로 3회 용량의 항원을 격일로 급식하여 유도하였다 (경구 내성 유도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 출원 09/806,400호, Shoenfeld et al., (1999.9.30. 출원)을 참조한다).
항원 제제
베타2GPI:인간 베타2GPI는 문헌(Gharavi, et al. J Clin Invest 1992; 92:1105-09)에 기술된 바와 같이 건강한 성인의 혈청에서 정제하였다.
산화된 LDL:인간 LDL(밀도=1.019-1.063g/l)은 금식시킨 개체의 혈장으로부터 정제형 초원심분리기(50,000 rpm/min, 22min)로 분리하고, 세척한 뒤, 150mM EDTA(pH 7.4)로 투석하고, 여과(세공 크기 0.22㎛)하여 응집물을 제거하고, 질소하에 보관하였다. LDL 산화는 투석하여 EDTA를 제거한 LDL을 황산구리(10μM)와 37℃에서 24시간 동안 항온처리하여 실시하였다. 지단백 산화는 말론디알데하이드(MDA) 등가물을 측정하는 티오바르비추르산 반응성 물질(TBARS)을 분석하여 확인하였다.
HSP65:문헌(Prohaszka Z et al., Int Immunol 1999;11:1363-70)에 기술된 바와 같이 제조한 재조합 마이코박테리아 HSP-65는 엠.신그흐(M.Singh, Braunschweig, Germany) 박사에게서 공급받았다.
면역화:인간 베타2GPI를 이용한 피하 면역화: 인간 베타2GPI는 전술한 바와같이 인간 혈장 수집물로부터 제조하였다. 면역화를 위하여 인간 베타2GPI를 PBS에 용해시키고 동량의 프로인트 불완전 보조제와 혼합하였다. 0.1ml 부피의 10㎍ 항원/생쥐을 1회 피하 주사하여 면역화를 실시하였다. 플라크 관련 분자를 마지막으로 점막 투여한 후 3일째 생쥐에게 1회 면역을 실시하고 면역화 후 10일째 죽였다.
콜레스테롤 수준 측정:실험 마지막에 혈액 1 내지 1.5ml을 심장 천공으로 수득하여 EDTA를 함유하는 용기에 담고, 원심분리하여 혈장을 분리하였다. 총 혈장의 콜레스테롤 수준은 자동 효소 기법(Boehringer Mannheim, Germany)으로 측정하였다.
FPLC 분석:콜레스테롤과 지단백의 지질 함량을 측정하기 위한 고속 단백질 액체 크로마토그래피 분석을 FPLC 시스템(Pharmacia LKB, FRAC-200, Pharmacia, Peapack, NJ) 상에서 Superose 6 HR 10/30 컬럼(Amersham Pharmacia Biotech, Inc, Peapack, NJ)을 사용하여 실시하였다. 자동 시료채집기가 200㎕ 시료 루프를 완전히 채울 수 있도록 시료 바이엘에는 최소 300㎕의 시료 부피(3마리의 생쥐에게서 수집한 혈액을 1:2로 희석하고 충전하기 전에 여과하였다)가 필요하였다. 각 분획이 0.5㎖를 포함하는 분획 10 내지 40을 수집하였다. 각 분획의 250㎕ 시료를 새로 제조한 콜레스테롤 시약이나 트리글리세라이드 시약과 각각 혼합하고 37℃에서 5분 동안 항온처리한 후 분광분석기로 500nm에서 분석하였다.
죽상경화증 분석:죽상경화성 지방층 병변의 정량은 전술한(George J et al Circulation 1999;99:2227-30) 바와 같이 대동맥굴내의 병변 크기를 계산하고 대동맥내의 병변 크기를 계산하여 실시하였다. 간략히 설명하면, 식염수 트리스 EDTA를 관류한 후 동물로부터 심장과 대동맥을 분리한 후 주위 지방을 조심스럽게 세척해냈다. 심장의 상부를 OCT 배지(폴리비닐 알코올 10.24% w/w; 폴리에틸렌 글리콜 4.26% w/w; 비반응성 성분 85.50% w/w)에 매립시키고 동결시켰다. 분석을 위하여 대동맥굴(400㎛) 전반에 걸쳐 다른 구역(10㎛ 두께)을 모두 수집하였다. 대동맥굴의 말단부는 심장에 붙은 대동맥의 접합부는 3개의 판막 첨단으로 확인하였다. 각 구역을 오일-레드 O로 염색한 후 지방층 병변을 측정하였다. 각 구역마다의 병변 부위는 관찰자가 번호를 매긴 미확인 표본을 계수하여 격자 상에서 계산하였다. 대동맥을 심장에서 절제해내고 주변 이종 조직을 제거하였다. 대동맥 고정과 혈관의 수단 염색은 전술한 바와 같이 실시하였다(George J et al Circulation 1999; 99:2227-30).
증식 분석:죽상경화증을 측정하기 위하여 전술한 바와 같은 시험 항원에 생쥐를 노출시킨 뒤, 전술한 바와 같이 정제된 인간 베타2GPI로 준비한 0.1ml pBS 중의 10㎍ 베타2GPI를 피하 주사하여 면역화시켰다(마지막 노출 후 1 내지 3일째).
베타2GPI로 면역화한 지 10일 후부터 다음과 같이 증식 분석을 실시하였다: 서혜부 림프절 조직을 100 메시 체위에 올려놓고 배수된 서혜부 림프절을 준비하였다. 적혈구 세포를 저온의 멸균성 2차 증류수(6ml)로 30초 동안 용해시키고 NaCl 3.5% 2ml을 첨가하였다. 불완전 배지를 첨가(10ml)하고 세포를 1,700 rpm에서 7분 동안 원심분리한 뒤, RPMI 배지에 재현탁시키고 1:20 희석율로 희석하여(세포 10㎕ + 트립판 블루 190㎕) 혈구계로 계수하였다. 증식은 96웰 미량역가 평판에 충전된세포(1x106세포/ml) 100㎕씩을 3반복으로 주입한 시료에서 나타나는 DNA 내로의 [3H] 티미딘 병입률을 측정하여 분석하였다. 베타2GPI(10㎍/ml, 100㎕/웰) 시료를 3반복으로 첨가하고 세포를 72시간 동안 항온처리(37℃, 5% CO2및 약 98% 습도)한 뒤3[H]티미딘(0.5μCi/웰) 10㎕를 첨가하였다. 하루 더 항온처리한 후 세포를 수거하고, 세포 수거기(Brandel)를 사용하여 유리 섬유 여지로 옮겨놓은 다음 β-계수기(Lumitron)를 사용하여 계수하였다. 마지막 배양 12시간 동안 [3H] 티미딘의 DNA 내로의 병입률로 증식을 측정하였다. 그 결과는 자극 지수(S.I.), 즉 항원의 부재하에 수득되는 평균 배경값(cpm)에 대한 항원의 평균 방사능(cpm)의 비로써 나타내었다. 표면 편차는 항상 평균 cpm값의 <10% 이었다.
통계 분석:1방식 ANOVA 테스트를 사용하여 각 수치를 비교하였다. p<0.05는 통계적 유의값으로 인정되었다.
실시예 1
플라크 관련 분자인 산화된 LDL, 인간 베타2GPI 및 HSP65를 저용량으로 사용하여 비측 내성을 유도함으로써 나타나는 유전자적 소인을 만든(Apo-E-결손형) 생쥐에서의 죽종발생의 억제 효과
본 발명자들은 여기에서 플라크 관련 분자인 산화된 LDL, 베타2GPI 및 HSP65를 저용량으로 비측 노출시켜 항원에 대한 내성을 유도하고 죽종발생을 유의적으로 억제할 수 있음을 처음으로 입증하였다. 즉, 정제하여 산화시킨 인간 LDL, 인간 베타2GPI 및 재조합 마이코박테이라 HSP65에 대한 비측 노출시험은 Apo-E 결손형 생쥐에서의 죽종발생을 억제하는 효과를 측정하여 비교하였다. 63마리의 9 내지 13주령의 ApoE/C 57 숫생쥐를 5 그룹으로 나누었다. 그룹 A(HSP-65)(n=12)의 비측 내성은 상기 '재료와 방법' 문항에 기술된 바와 같이 PBS 중에 현탁시킨 재조합 마이코박테리아 HSP 65(10㎍/생쥐/10㎕)를 5일 동안 격일로 투여하여 유도하였다. 그룹 B(H-oxLDL)(n=14)의 비측 내성은 상기 '재료와 방법' 문항에 기술된 바와 같이 PBS 중에 현탁시킨 10㎍/생쥐/10㎕의 정제 산화된 인간 LDL을 5일 동안 격일로 투여하여 유도하였다. 그룹 C(B2GPI)(n=13)의 생쥐에게는 상기 '재료와 방법' 문항에 기술된 바와 같이 10㎍/생쥐/10㎕의 인간 베타2GPI를 5일 동안 격일로 투여하였다. 그룹 D(BSA)(n=12)의 생쥐에게는 상기 '재료와 방법' 문항에 기술된 바와 같이 10㎍/생쥐/10㎕의 소혈청 알부민(BSA)을 비내로 5일 동안 격일로 투여하였다. 그룹 E(PBS)(n=12)의 생쥐에게는 생쥐당 10㎕ PBS를 비내로 투여하였다. 투여 전(시간 0)과 지질 프로필 측정 실험 마지막(종점)에 생쥐의 혈액을 채혈하였다. 최종 투여 8주 후에 전술한 바와 같이 심장과 대동맥에서 죽상경화증을 분석하였다. 실험 동안 2주 마다 생쥐의 체중을 측정하였다. 모든 생쥐에게 물은 임의 공급하고 최종 항원 노출시까지는 4.5중량% 지방을 함유하는 정상 식이(0.02% 콜레스테롤)를 공급하고 죽이기 전까지 "웨스턴" 식이를 공급하였다.
지나치게 저용량인 플라크 관련 분자를 비내 투여하여 Apo-E 결손형 생쥐에서 얻어지는 죽종발생의 억제 효과
HSP-65 H-oxLDL H-B2-GPI BSA PBS
시간 0 중량(gr)(평균±S.E) 22.6±0.8 22.3±0.5 22.3±0.7 21.8±0.7 21.7±0.5 P=0.833
Chol(mg/dL)(평균±S.E) 237±13 230±10 230±14 236±19 227±14 P=0.986
TG(mg/dL)(평균±S.E) 150±19 178±17 162±18 185±22 160±15 P=0.664
종점 중량(gr)(평균±S.E) 26.8±0.9 28.2±1.0 29.2±1.5 25.5±1.0 26.3±1.3 P=0.157
Chol(mg/dL)(평균±S.E) 1181±114 1611±119 1601±125 1470±183 1606±181 P=0.197
TG(mg/dL)(평균) 288 275 380 315 403 P=0.416
굴 병변(㎛2)(평균±S.E) 44375±5437 43393±4107 46250±4486 120500±8746 128182±9102 P<0.001
주: "중량"은 g 중량이고; "Chol"은 혈청 콜레스테롤이며, "TG"는 혈청 트리글리세라이드로서 각각 mg/dL로 나타내었다.
도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 표 1에 제시된 결과는 허위 항원(BSA) 또는 PBS에 노출된 대조군 생쥐에 비해 저용량(10㎍/생쥐)의 플라크 관련 분자에 비측 노출시킨 생쥐의 조직내에서 현저하게 효과적인 죽종발생 억제효과가 나타남을 입증하고 있다. 또한, 비측 내성은 보호 방식면에서 특이하다: 즉, 비측 내성의 유도는 측정된 다른 일반 변수, 예컨대 체중 증가, 트리글리세라이드 또는 콜레스테롤 혈액 수준에는 유의적 효과를 전혀 미치지 않았다. 즉, 항원성 플라크 관련 분자인 산화된 LDL, 베타2GPI 및 HSP65는 매우 저용량(10㎍/생쥐)과 단기 노출(3일)을 통해 상기 유전자적으로 감수성인 Apo-E 결손형 생쥐에서 유의적(65% 초과)이고 지속적인 죽종발생 예방작용을 나타내는 매우 강력한 유도인자이다.
실시예 2
HSP65를 사용하여 비측 내성을 유도함으로써 나타나는 유전자적 소인을 만든(Apo-E-결손형) 생쥐에서의 죽종발생의 우수한 억제 효과
본 발명자들은 여기에서 플라크 관련 분자인 HSP65를 매우 낮은 용량으로 비측 노출시켜 항원에 대한 내성과 죽종발생 억제를 우수하게 유도할 수 있음을 처음으로 입증하였다. 즉, 저용량 및 극히 낮은 용량의 재조합 인간 HSP65에 대한 비측 노출시험은 Apo-E 결손형 생쥐에서의 죽종발생을 억제하는 효과를 측정하여 비교하였다. 58마리의 12 내지 16주령의 ApoE/C 57 숫생쥐를 4 그룹으로 나누었다. 그룹 A(HSP-65 고)(n=14)의 비측 내성은 상기 '재료와 방법' 문항에 기술된 바와 같이 PBS 중에 현탁시킨 재조합 인간 HSP 65(10㎍/생쥐/10㎕)를 5일 동안 격일로 비내 투여하여 유도하였다. 그룹 B(HSP-65 저)(n=16)의 비측 내성은 상기 '재료와 방법' 문항에 기술된 바와 같이 PBS 중에 현탁시킨 1㎍/생쥐/10㎕의 재조합 인간 HSP 65를 5일 동안 격일로 투여하여 유도하였다. 그룹 C(BSA)(n=14)의 생쥐에게는 1㎍/생쥐/10㎕의 소혈청 알부민(BSA)을 비내로 5일 동안 격일로 투여하였다. 그룹 D(PBS)(n=14)의 생쥐에게는 생쥐당 10㎕ PBS를 비내로 투여하였다. 투여 전(시간 0)과 지질 프로필 측정 실험 마지막(종점)에 생쥐의 혈액을 채혈하였다. 최종 투여 8주 후에 전술한 바와 같이 심장과 대동맥에서 죽상경화증을 분석하였다. 실험 동안 2주 마다 생쥐의 체중을 측정하였다. 모든 생쥐에게 물은 임의 공급하고 최종 항원 노출시까지는 4.5중량% 지방을 함유하는 정상 식이(0.02% 콜레스테롤)를 공급하고 죽이기 전까지 "웨스턴" 식이를 공급하였다.
인간 HSP65를 비내 투여하여 Apo-E 결손형 생쥐에서 얻어지는 죽종발생의 우수한 억제 효과
HSP-6510㎍/생쥐N=12 HSP651㎍/생쥐N=16 BSA100㎍/생쥐 N=11 PBSN=10 통계
종점 중량(gr) 28.4±1.0 26.9±0.9 27.7±0.5 28.7±0.7 P=0.363
Chol 1073±65 1010±74 1009±74 1015±85 P=0.897
TG 348±32 315±46 316±32 390±44 P=0.564
굴 병변(㎛2) 22292±2691 17109±2053 54432±8201 47750±5779 P<0.05HSP-65와 PBS 또는 BSA 사이
주: "중량"은 g 중량이고; "Chol"은 혈청 콜레스테롤이며, "TG"는 혈청 트리글리세라이드로서 각각 mg/dL로 나타내었다.
도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 표 2에 제시된 결과는 허위 항원(BSA) 또는 PBS에 노출된 대조군 생쥐에 비해 매우 낮은 용량(1㎍/생쥐)의 HSP65에 비측 노출시킨 생쥐의 조직내에서 측정된 우수한 죽종발생 억제효과를 입증하고 있다. 또한, 비측 내성은 보호 방식면에서 특이하다: 즉, 비측 내성의 유도는 측정된 다른 일반 변수, 예컨대 체중 증가, 트리글리세라이드 또는 콜레스테롤 혈액 수준에는 유의적 효과를 전혀 미치지 않았다. 즉, 항원성 플라크 관련 분자인 HSP65는 심지어 극히 낮은 용량이 유전자적으로 감수성인 Apo-E 결손형 생쥐에서 죽종 발생의 유의적인(약 70%) 예방작용을 나타내는 바, 경구 내성의 유도로 달성된 예방효과(30%; 1999년 9월 30일에 출원된 미국 특허 출원 09/806,400, Shoenfeld et al.)에 비해 매우 우수한, 매우 강력한 유도인자이다.
실시예 3
인간 베타2GPI를 비내 투여하여 얻어지는 유전자적 소인을 만든(Apo-E-결손형) 생쥐에서의 특이적 항-베타2GPI 면역반응성의 우수한 억제 효과
플라크 관련 분자를 점막 노출시켜 유도하는 내성은 이 플라크 관련 분자의 항원성 부에 대한 특이적 면역 반응을 억제함으로써 매개될 수 있다. 이에 따라,인간 베타2GPI를 점막(비측 및 경구) 노출시킨 후 림프구 증식을 Apo-E 결손형 생쥐로부터 측정하였다. 9마리의 5주령의 ApoE/C 57 결손형 숫생쥐를 3 그룹으로 나누었다. 그룹 A(n=3)의 경구 내성은 0.2ml PBS 중에 현탁시킨 베타2GPI 100㎍/생쥐을 전술한 바와 같이 위관으로 5일 동안 격일로 투여하여 유도하였다. 그룹 B(n=3)의 비측 내성은 10㎕ PBS 중에 현탁시킨 10㎍/생쥐의 베타2GPI를 전술한 바와 같이 비내로 5일 동안 격일로 투여하여 유도하였다. 그룹 C(n=3)의 생쥐에게는 200㎕ PBS를 5일 동안 격일로 경구 투여하였다. 최종 투여 1일 후에 상기 '재료와 방법' 문항에 기술된 바와 같이 인간 베타2GPI로 면역화함으로써 모든 생쥐의 면역 반응성을 자극하였다. 면역화 10일 후 림프절을 수거하여 증식 분석을 실시하였다. 모든 생쥐에게 물은 임의 공급하고 4.5중량% 지방을 함유하는 정상 식이(0.02% 콜레스테롤)를 공급하였다.
인간 베타2GPI를 이용한 비내 전처리로부터 Apo-E 결손형 생쥐에서 얻어지는 인간 베타2GPI에 대한 면역반응의 억제 효과
PBS H-β2-GPI OT H-β2-GPI NT
S.I(자극 지수) 7.0±0.2 4.4±0.5 2.1±0.5
도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 표 3에 제시된 결과는 Apo-E-결손형 생쥐의 림프절에서 측정한 증식 억제를 통해 인간 베타2GPI 항원에 대한 면역반응성의 유의적인 억제효과를 입증하고 있다. 낮은 죽종발생 억제 용량(10㎍/생쥐)의 인간 베타2GPI에 비내 노출시킨 생쥐의 림프절은 베타2GPI에 의한 면역화 후 경구 노출된 생쥐 및 대조군(PBS) 생쥐에 비해 현저히 감소된 자극 지수를 보여주었다. 비측 내성 유도를 이용한 이전의 연구에서 나타난 바와 같이 측정된 다른 변수, 예컨대 체중 증가, 트리글리세라이드 또는 콜레스테롤 혈액 수준 또는 면역 적응성(전술한 실시예 참조)에는 거의 영향을 미치지 않았으므로, 이러한 결과로부터 항-베타2GPI 면역반응성의 억제 효과가 특이적임을 알 수 있다. 즉, 정제된 플라크 관련 분자인 베타2GPI의 비내 투여는 유전자적으로 감수성인 Apo-E 결손형 생쥐에 있어서 면역원성 및 죽종발생성 플라크 관련 분자에 대한 세포 면역 반응을 약화시키는 우수한 방법이다.
이상, 본 발명은 그 특정 구체예와 함께 설명하였으나, 당업자라면 다른 많은 대안예, 변형예 및 수정예를 분명하게 파악할 수 있을 것이다. 따라서, 이와 같은 모든 대안예, 변형예 및 수정예는 첨부되는 청구의 범위의 취지와 총괄적인 범위에 속하는 것이다. 본 명세서에 언급된 모든 공개, 특허 및 특허출원 문헌과 수탁번호로 나타낸 서열은 그대로 본 명세서에 참고인용되며, 그 인용 범위는 각 공개, 특허, 특허출원 문헌 또는 수탁번호로 표기한 서열이 각각 특이적으로 본 명세서에 참고인용되는 것으로 표시되었을지라도 동일한 범위이다. 또한, 본 명세서에 인용되거나 표시된 모든 참고문헌은 그 참고문헌이 종래 기술로서 본 발명에 이용할 수 있다는 허락으로 해석되어서는 안된다.

Claims (16)

  1. 활성 성분으로서 적어도 하나의 플라크 관련 분자의 적어도 항원성 부를 치료적 유효량으로 포함하고, 추가로 약학적 허용성 담체를 포함하며, 점막 투여용으로 고안된, 죽상경화증, 심혈관 질환, 뇌혈관 질환, 말초 혈관 질환, 협착증, 재협착증 및/또는 스텐트내 협착증(in-stent-stenosis)의 예방 및/또는 치료를 요하는 피검체의 상기 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 약학적 조성물, 또는 이의 약학적 허용성 염.
  2. 제 1 항에 있어서, 플라크 관련 분자가 산화된 LDL, 베타-2GPI, HSP 및 이의 유도체로 구성된 군 중에서 선택되는 것이 특징인 약학적 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 적어도 하나의 플라크 관련 분자의 항원성 부가 자연 발생 분자 또는 합성 분자인 것이 특징인 약학적 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 약학적 조성물이 비측, 호흡기측, 귀측 및/또는 결막측 투여용으로 조제된 것이 특징인 약학적 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 적어도 하나의 플라크 관련 분자의 적어도 항원성 부가 피검체내의 플라크 성분에 대한 면역반응성을 감소시킬 수 있도록 선택되는 것이특징인 약학적 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 죽상경화증, 심혈관 질환, 뇌혈관 질환, 말초 혈관 질환, 협착증, 재협착증 및/또는 스텐트내 협착증(in-stent-stenosis)으로 구성된 군 중에서 선택되는 적어도 하나의 질환을 예방 및/또는 치료하는데 사용하기 위해 포장되고 규명된 것이 특징인 약학적 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서, 추가로 HMGCoA 환원효소 억제제(스타틴), 점막 보조제, 코르티코스테로이드, 소염 화합물, 진정제, 성장 인자, 독소 및 다른 내성화제로 구성된 군 중에서 선택되는 적어도 하나의 추가 화합물을 치료적 유효량으로 포함하는 것이 특징인 약학적 조성물.
  8. (a) 죽상경화증 관련 질환이나 증상이 있는 피검체에게 적어도 하나의 플라크 관련 분자의 적어도 항원성 부를 점막 투여하는 단계, 및
    (b) 상기 피검체내의 죽종발생의 적어도 하나의 표시인자를 분석하여 상기 죽상경화증 관련 질환이나 증상에 상기 적어도 하나의 플라크 관련 분자의 적어도 항원성 부를 점막 투여한 효과를 측정하는 단계를 포함하여,
    죽상경화증 관련 질환이나 증상에 미치는 플라크 성분의 점막 투여 효과를 측정하기 위한 분석법.
  9. 제 8 항에 있어서, 플라크 관련 분자가 산화된 LDL, 베타-2GPI, HSP 및 이의 유도체로 구성된 군 중에서 선택되는 것이 특징인 분석법.
  10. 제 8 항에 있어서, 적어도 하나의 플라크 관련 분자의 항원성 부가 자연 발생 분자 또는 합성 분자인 것이 특징인 분석법.
  11. 죽상경화증, 심혈관 질환, 뇌혈관 질환, 말초 혈관 질환, 협착증, 재협착증 및/또는 스텐트내 협착증(in-stent-stenosis)의 예방 및/또는 치료를 요하는 피검체에게 적어도 하나의 플라크 관련 분자의 적어도 항원성 부를 치료적 유효량으로 점막 투여하는 것을 포함하여, 상기 피검체의 죽상경화증, 심혈관 질환, 뇌혈관 질환, 말초 혈관 질환, 협착증, 재협착증 및/또는 스텐트내 협착증(in-stent-stenosis)을 예방 및/또는 치료하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 플라크 관련 분자가 산화된 LDL, 베타-2GPI, HSP 및 이의 유도체로 구성된 군 중에서 선택되는 것이 방법.
  13. 제 11 항에 있어서, 적어도 하나의 플라크 관련 분자의 항원성 부가 자연 발생 분자 또는 합성 분자인 것이 특징인 방법.
  14. 제 11 항에 있어서, 적어도 하나의 플라크 관련 분자의 적어도 항원성 부의투여가 비측, 호흡기측, 귀측 및/또는 결막측 경로를 통해 실시되는 것이 특징인 방법.
  15. 제 11 항에 있어서, 적어도 하나의 플라크 관련 분자의 적어도 항원성 부의 투여가 피검체내의 적어도 하나의 플라크 관련 성분에 대한 면역반응성을 감소시키는 것이 특징인 방법.
  16. 제 12 항에 있어서, 적어도 하나의 플라크 관련 분자의 적어도 항원성 부가 HMGCoA 환원효소 억제제(스타틴), 점막 보조제, 코르티코스테로이드, 소염 화합물, 진정제, 성장 인자, 독소 및 다른 내성화제로 구성된 군 중에서 선택되는 화합물의 치료적 유효량과 함께 투여되는 것이 특징인 방법.
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