ES2329444T3 - Composiciones y metodos para la terapia y el diagnostico del cancer de pulmon. - Google Patents

Composiciones y metodos para la terapia y el diagnostico del cancer de pulmon. Download PDF

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Aijun Wang
Yasir A.W. Skeiky
Samuel X. Li
Michael D. Kalos
Robert A. Henderson
Patricia D. Mcneill
Neil Fanger
Marc W. Retter
Margarita Durham
Gary R. Fanger
Thomas S. Vedvick
Darrick Carter
Yoshihiro Watanabe
David W. Peckham
Feng Cai
Teresa M. Foy
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Abstract

Un polipéptido aislado que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 468 o una variante inmunológicamente reactiva de éste que presenta una identidad de secuencia de al menos 91% a lo largo de su longitud completa con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 468.

Description

Composiciones y métodos para la terapia y el diagnóstico del cáncer de pulmón.
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere en general a terapia y diagnóstico de cáncer, tal como cáncer de pulmón. La invención se refiere más específicamente a polipéptidos, que comprenden al menos una parte de una proteína de tumor de pulmón, y a polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos. Dichos polipéptidos y polinucleótidos son útiles en composiciones farmacéuticas, p. ej., vacunas, y otras composiciones para el diagnóstico y tratamiento de cáncer de pulmón.
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Antecedentes de la invención Campo de la invención
El cáncer es un problema de salud significativo en todo el mundo. Aunque se han hecho avances en la detección y terapia del cáncer, actualmente no está disponible ninguna vacuna u otro método exitoso universalmente para la prevención y/o tratamiento. Las terapias actuales, que se basan generalmente en una combinación de quimioterapia o cirugía y radiación, continúan mostrándose inadecuadas en muchos pacientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Descripción de la técnica relacionada
El cáncer de pulmón es la causa principal de muerte por cáncer en los hombres y las mujeres en los EEUU, indicándose en 1994 una estimación de 172.000 nuevos casos. La proporción de supervivencia en cinco años en todos los pacientes con cáncer de pulmón, independientemente del estadio de la enfermedad en el momento del diagnóstico, es sólo 13%. Esto contrasta con una proporción de supervivencia en cinco años de 46% en los casos detectados cuando la enfermedad está todavía localizada. Sin embargo, sólo 16% de los cánceres de pulmón se descubre antes de que la enfermedad se haya extendido.
A pesar de las investigaciones considerables en terapias para éstos y otros cánceres, el cáncer de pulmón es aún difícil de diagnosticar y tratar eficazmente. De acuerdo con esto, existe una necesidad en la técnica de métodos mejorados para detectar y tratar dichos cánceres. La presente invención satisface estas necesidades y proporciona además otras ventajas relacionadas.
En un primer aspecto de la presente invención se proporciona un polipéptido aislado que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:468 o una variante inmunológicamente reactiva de éste que presenta una identidad de secuencia de al menos 91% a lo largo de su longitud completa respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:468.
También se proporciona un polinucleótido aislado de la invención.
La presente invención también proporciona un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígenos de éste, que se une específicamente al polipéptido de la invención.
Preferiblemente, el anticuerpo de la invención puede distinguir entre L523S humano y L523S de ratón.
Más preferiblemente, el anticuerpo de la invención puede distinguir entre hL523S y el ARNm de la proteína de unión 1 de IGF-II (hIMP-1) o el ARNm de la proteína de unión 2 de IGF-II (hIMP-2).
En un aspecto más de la invención, se proporciona un método para detectar la presencia de un cáncer de pulmón en un paciente, que comprende las etapas de:
poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo que se une al polipéptido de la invención;
detectar en la muestra una cantidad de polipéptido que se une al anticuerpo;
y
comparar la cantidad de polipéptido con un valor de corte predeterminado y determinar a partir de esto la presencia de un cáncer en el paciente.
También se proporciona una proteína de fusión que comprende el polipéptido de la invención.
\newpage
En un aspecto más de la invención se proporciona una composición que comprende un primer componente seleccionado del grupo que consiste en vehículos e inmunoestimulantes fisiológicamente aceptables, y un segundo componente seleccionado del grupo que consiste en:
el polipéptido de la invención;
el polinucleótido de la invención;
el anticuerpo de la invención; y
la proteína de fusión de la invención.
La composición de la invención para utilizarse en la estimulación de una respuesta inmune en un paciente con cáncer de pulmón.
La composición de la invención para utilizarse en el tratamiento de un paciente con cáncer de pulmón.
La composición de la invención para utilizarse en terapia.
La utilización de la composición de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer de pulmón.
Un kit de diagnóstico que comprende el anticuerpo según una cualquiera de la invención.
La presente invención proporciona además polinucleótidos que codifican un polipéptido descrito anteriormente, vectores de expresión que comprenden dichos polinucleótidos y células anfitrionas transformadas o transfectadas con dichos vectores de expresión.
En otros aspectos, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un polipéptido o polinucleótido como se ha descrito anteriormente y un vehículo fisiológicamente aceptable.
En un aspecto relacionado de la presente invención, las composiciones farmacéuticas, p. ej., composiciones de vacuna, se proporcionan para aplicaciones profilácticas o terapéuticas. Dichas composiciones comprenden generalmente un polipéptido o polinucleótido inmunogénico de la invención y un inmunoestimulante, tal como un adyuvante.
La presente invención proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden: (a) un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos de éste que se une específicamente a un polipéptido de la presente invención, o un fragmento de éste; y (b) un vehículo fisiológicamente aceptable.
En aspectos adicionales, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden: (a) una célula presentadora de antígenos que expresa un polipéptido como se ha descrito anteriormente y (b) un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Las células presentadoras de antígenos ilustrativas incluyen células dendríticas, macrófagos, monocitos, fibroblastos y células B.
En aspectos relacionados, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden: (a) una células presentadora de antígenos que expresa un polipéptido como se ha descrito anteriormente y (b) un inmunoestimulante.
La presente invención proporciona además, en otros aspectos, proteínas de fusión que comprenden al menos un polipéptido como se ha descrito anteriormente, así como polinucleótidos que codifican dichas proteínas de fusión, típicamente en la forma de composiciones farmacéuticas, p. ej., composiciones de vacuna, que comprenden un vehículo y/o un inmunoestimulante aceptable fisiológicamente. Las proteínas de fusión pueden comprender múltiples polipéptidos inmunogénicos o partes/variantes de éstos, como se describe en la presente memoria, y pueden comprender además uno o más segmentos de polipéptido para facilitar la expresión, purificación y/o inmunogenicidad del o de los polipéptidos.
En aspectos adicionales, la presente invención proporciona la utilización de las composiciones farmacéuticas de la invención en métodos para estimular una respuesta inmune en un paciente, preferiblemente una respuesta de células T en un paciente humano, que comprende administrar una composición farmacéutica como se describe en la presente memoria. El paciente puede padecer cáncer de pulmón, en cuyo caso los métodos proporcionan tratamiento para la enfermedad, o el paciente que se considera en riesgo de dicha enfermedad puede tratarse profiláctica-
mente.
En aspectos adicionales, la presente invención proporciona la utilización de las composiciones farmacéuticas de la invención en métodos para inhibir el desarrollo de un cáncer en un paciente, que comprenden administrar a un paciente una composición farmacéutica como se ha indicado anteriormente. El paciente puede padecer cáncer de pulmón, en cuyo caso los métodos proporcionan tratamiento para la enfermedad, o el paciente que se considera en riesgo de dicha enfermedad puede tratarse profilácticamente.
La presente descripción proporciona además, en otros aspectos, métodos para eliminar células tumorales de una muestra biológica, que comprenden poner en contacto una muestra biológica con células T que reaccionan específicamente con un polipéptido de la presente invención, en el que la etapa de poner en contacto se realiza en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la eliminación de células que expresan la proteína de la muestra.
En aspectos descritos relacionados, se proporcionan métodos para inhibir el desarrollo de un cáncer en un paciente, que comprenden administrar a un paciente una muestra biológica tratada como se ha descrito anteriormente.
Se proporcionan además métodos, en otros aspectos descritos, para estimular y/o expandir células T específicas para un polipéptido de la presente invención, que comprenden poner en contacto células T con uno o más de: (i) un polipéptido como se ha descrito anteriormente; (ii) un polinucleótido que codifica dicho polipéptido; y/o (iii) una célula presentadora de antígenos que expresa dicho polipéptido; en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la estimulación y/o expansión de las células T. También se proporcionan poblaciones de células T aisladas que comprenden células T preparadas como se ha descrito anteriormente.
En aspectos adicionales, la presente descripción proporciona métodos para inhibir el desarrollo de un cáncer en un paciente, que comprenden administrar a un paciente una cantidad eficaz de una población de células T como se ha descrito anteriormente.
La presente descripción proporciona además métodos para inhibir el desarrollo de un cáncer en un paciente, que comprenden las etapas de: (a) incubar células T CD4^{+} y/o CD8^{+} aisladas de un paciente con uno o más de: (i) un polipéptido que comprende al menos una parte inmunogénica de polipéptido descrito en la presente memoria; (ii) un polinucleótido que codifica dicho polipéptido; y (iii) una célula presentadora de antígenos que expresa dicho polipéptido; y (b) administrar al paciente una cantidad eficaz de las células T proliferadas, e inhibir de esta manera el desarrollo de un cáncer en el paciente. Las células proliferadas pueden, aunque no es necesario, clonarse antes de la administración al paciente.
En aspectos adicionales, la presente invención proporciona métodos para determinar la presencia o ausencia de un cáncer, preferiblemente un cáncer de pulmón, en un paciente que comprenden: (a) poner en contacto una muestra biológica obtenida de un paciente con un anticuerpo que se une a un polipéptido como se ha indicado anteriormente; (b) detectar en la muestra una cantidad de polipéptido que se une al anticuerpo; y (c) comparar la cantidad de polipéptido con un valor de corte predeterminado, y determinar a partir de esto la presencia o ausencia de un cáncer en el paciente. En las realizaciones preferidas, el anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo monoclonal.
La presente invención también proporciona, en otros aspectos, métodos para monitorizar la progresión de un cáncer en un paciente. Dichos métodos comprenden las etapas de: (a) poner en contacto una muestra biológica obtenida de un paciente en un primer punto de tiempo con un anticuerpo monoclonal que se une a un polipéptido como se ha indicado anteriormente; (b) detectar en la muestra biológica una cantidad de polipéptido que se une al anticuerpo; (c) repetir las etapas (a) y (b) utilizando una muestra biológica obtenida del paciente en un punto de tiempo posterior; y (d) comparar la cantidad de polipéptido detectada en la etapa (c) con la cantidad detectada en la etapa (b) y a partir de esto monitorizar la progresión del cáncer en el paciente.
La presente descripción proporciona además, en otros aspectos, métodos para determinar la presencia o ausencia de un cáncer en un paciente, que comprenden las etapas de: (a) poner en contacto una muestra biológica obtenida de un paciente con un oligonucleótido que hibrida con un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención; (b) detectar en la muestra un nivel de un polinucleótido, preferiblemente ARNm, que hibrida con el oligonucleótido; y (c) comparar el nivel de polinucleótido que hibrida con el oligonucleótido con un valor de corte predeterminado, y a partir de esto determinar la presencia o ausencia de un cáncer en el paciente. En determinadas realizaciones, la cantidad de ARNm se detecta mediante la reacción en cadena de la polimerasa utilizando, por ejemplo, al menos un cebador oligonucleotídico que hibrida con un polinucleótido que codifica un polipéptido como se ha indicado anteriormente, o un complemento de dicho polinucleótido. En otras realizaciones, la cantidad de ARNm se detecta utilizando una técnica de hibridación, empleando una sonda oligonucleotídica que hibrida con un polinucleótido que codifica un polipéptido como se ha indicado anteriormente, o un complemento de dicho polinucleótido.
Se describen métodos para monitorizar la progresión de un cáncer en un paciente, que comprenden las etapas de: (a) poner en contacto una muestra biológica obtenida de un paciente con un oligonucleótido que hibrida con un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención; (b) detectar en la muestra una cantidad de un polinucleótido que hibrida con el oligonucleótido; (c) repetir las etapas (a) y (b) utilizando una muestra biológica obtenida del paciente en un punto de tiempo posterior; y (d) comparar la cantidad de polinucleótido detectada en la etapa (c) con la cantidad detectada en la etapa (b) y a partir de esto monitorizar la progresión del cáncer en el paciente.
En aspectos adicionales, la presente invención proporciona anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales, que se unen a un polipéptido como se ha descrito anteriormente, así como kits de diagnóstico que comprenden dichos anticuerpos. También se proporcionan kits de diagnóstico que comprenden una o más sondas o cebadores oligonucleotídicos como se ha descrito anteriormente.
Estos y otros aspectos de la presente invención serán evidentes en referencia a la descripción detallada siguiente.
Identificadores de Secuencia
SEQ ID NO:1 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S1-2.
SEQ ID NO:2 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S1-28.
SEQ ID NO:3 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S1-90.
SEQ ID NO:4 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S1-144.
SEQ ID NO:5 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S1-133.
SEQ ID NO:6 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S1-169.
SEQ ID NO:7 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-6.
SEQ ID NO:8 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-11.
SEQ ID NO:9 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-17.
SEQ ID NO:10 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-25.
SEQ ID NO:11 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-39.
SEQ ID NO:12 es una primera secuencia de ADNc determinada para LST-S2-43.
SEQ ID NO:13 es una segunda secuencia de ADNc determinada para LST-S2-43.
SEQ ID NO:14 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-65.
SEQ ID NO:15 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-68.
SEQ ID NO:16 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-72.
SEQ ID NO:17 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-74.
SEQ ID NO:18 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-103.
SEQ ID NO:19 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-N1-1F.
SEQ ID NO:20 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-N1-2A.
SEQ ID NO:21 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-N1-4H.
SEQ ID NO:22 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-N1-5A.
SEQ ID NO:23 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-N1-6B.
SEQ ID NO:24 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-N1-7B.
SEQ ID NO:25 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-N1-7H.
SEQ ID NO:26 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-N1-8A.
SEQ ID NO:27 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-N1-8D.
SEQ ID NO:28 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-N1-9A.
SEQ ID NO:29 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-N1-9E.
SEQ ID NO:30 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-N1-10A.
SEQ ID NO:31 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-N1-10G.
SEQ ID NO:32 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-N1-11A.
SEQ ID NO:33 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-N1-12C.
SEQ ID NO:34 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-N1-12E.
SEQ ID NO:35 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-B1-3D.
SEQ ID NO:36 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-B1-6C.
SEQ ID NO:37 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-B1-5D.
SEQ ID NO:38 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-B1-5F.
SEQ ID NO:39 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-B1-6G.
SEQ ID NO:40 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-B1-8A.
SEQ ID NO:41 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-B1-8D.
SEQ ID NO:42 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-B1-10A.
SEQ ID NO:43 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-B1-9B.
SEQ ID NO:44 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-B1-9F.
SEQ ID NO:45 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-B1-12D.
SEQ ID NO:46 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-I2-2B.
SEQ ID NO:47 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-I2-5F.
SEQ ID NO:48 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-I2-6B.
SEQ ID NO:49 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-I2-7F.
SEQ ID NO:50 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-I2-8G.
SEQ ID NO:51 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-I2-9E.
SEQ ID NO:52 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-I2-12B.
SEQ ID NO:53 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-H2-2C.
SEQ ID NO:54 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-H2-1G.
SEQ ID NO:55 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-H2-4G.
SEQ ID NO:56 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-H2-3H.
SEQ ID NO:57 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-H2-5G.
SEQ ID NO:58 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-H2-9B.
SEQ ID NO:59 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-H2-10H.
SEQ ID NO:60 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S2-H2-12D.
SEQ ID NO:61 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S3-2.
SEQ ID NO:62 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S3-4.
SEQ ID NO:63 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S3-7.
SEQ ID NO:64 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S3-8.
SEQ ID NO:65 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S3-12.
SEQ ID NO:66 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S3-13.
SEQ ID NO:67 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S3-14.
SEQ ID NO:68 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S3-16.
SEQ ID NO:69 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S3-21.
SEQ ID NO:70 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S3-22.
SEQ ID NO:71 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S1-7.
SEQ ID NO:72 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S1-A-1E.
SEQ ID NO:73 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S1-A-1G.
SEQ ID NO:74 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S1-A-3E.
SEQ ID NO:75 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S1-A-4E.
SEQ ID NO:76 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S1-A-6D.
SEQ ID NO:77 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S1-A-8D.
SEQ ID NO:78 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S1-A-10A.
SEQ ID NO:79 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S1-A-10C.
SEQ ID NO:80 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S1-A-9D.
SEQ ID NO:81 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S1-A-10D.
SEQ ID NO:82 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S1-A-9H.
SEQ ID NO:83 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S1-A-11D.
SEQ ID NO:84 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S1-A-12D.
SEQ ID NO:85 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S1-A-11E.
SEQ ID NO:86 es la secuencia de ADNc determinada para LST-S1-A-12E.
SEQ ID NO:87 es la secuencia de ADNc determinada para L513S (T3).
SEQ ID NO:88 es la secuencia de ADNc determinada para L513S contig 1.
SEQ ID NO:89 es una primera secuencia de ADNc determinada para L514S.
SEQ ID NO:90 es una segunda secuencia de ADNc determinada para L514S.
SEQ ID NO:91 es una primera secuencia de ADNc determinada para L516S.
SEQ ID NO:92 es una segunda secuencia de ADNc determinada para L516S.
SEQ ID NO:93 es la secuencia de ADNc determinada para L517S.
SEQ ID NO:94 es la secuencia de ADNc extendida para LST-S1-169 (también conocido como L519S).
SEQ ID NO:95 es una primera secuencia de ADNc determinada para L520S.
SEQ ID NO:96 es una segunda secuencia de ADNc determinada para L520S.
SEQ ID NO:97 es una primera secuencia de ADNc determinada para L521S.
SEQ ID NO:98 es una segunda secuencia de ADNc determinada para L521S.
SEQ ID NO:99 es la secuencia de ADNc determinada para L522S.
SEQ ID NO:100 es la secuencia de ADNc determinada para L523S.
SEQ ID NO:101 es la secuencia de ADNc determinada para L524S.
SEQ ID NO:102 es la secuencia de ADNc determinada para L525S.
SEQ ID NO:103 es la secuencia de ADNc determinada para L526S.
SEQ ID NO:104 es la secuencia de ADNc determinada para L527S.
SEQ ID NO:105 es la secuencia de ADNc determinada para L528S.
SEQ ID NO:106 es la secuencia de ADNc determinada para L529S.
SEQ ID NO:107 es una primera secuencia de ADNc determinada para L530S.
SEQ ID NO:108 es una segunda secuencia de ADNc determinada para L530S.
SEQ ID NO:109 es la secuencia de ADNc de longitud completa determinada para la forma corta de L531S.
SEQ ID NO:110 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO:109.
SEQ ID NO:111 es la secuencia de ADNc de longitud completa determinada para la forma larga de L531S.
SEQ ID NO:112 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO:111.
SEQ ID NO:113 es la secuencia de ADNc de longitud completa determinada para L520S.
SEQ ID NO:114 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO:113.
SEQ ID NO:115 es la secuencia de ADNc determinada para contig 1.
SEQ ID NO:116 es la secuencia de ADNc determinada para contig 3.
SEQ ID NO:117 es la secuencia de ADNc determinada para contig 4.
SEQ ID NO:118 es la secuencia de ADNc determinada para contig 5.
SEQ ID NO:119 es la secuencia de ADNc determinada para contig 7.
SEQ ID NO:120 es la secuencia de ADNc determinada para contig 8.
SEQ ID NO:121 es la secuencia de ADNc determinada para contig 9.
SEQ ID NO:122 es la secuencia de ADNc determinada para contig 10.
SEQ ID NO:123 es la secuencia de ADNc determinada para contig 12.
SEQ ID NO:124 es la secuencia de ADNc determinada para contig 11.
SEQ ID NO:125 es la secuencia de ADNc determinada para contig 13 (también conocido como L761P).
SEQ ID NO:126 es la secuencia de ADNc determinada para contig 15.
SEQ ID NO:127 es la secuencia de ADNc determinada para contig 16.
SEQ ID NO:128 es la secuencia de ADNc determinada para contig 17.
SEQ ID NO:129 es la secuencia de ADNc determinada para contig 19.
SEQ ID NO:130 es la secuencia de ADNc determinada para contig 20.
SEQ ID NO:131 es la secuencia de ADNc determinada para contig 22.
SEQ ID NO:132 es la secuencia de ADNc determinada para contig 24.
SEQ ID NO:133 es la secuencia de ADNc determinada para contig 29.
SEQ ID NO:134 es la secuencia de ADNc determinada para contig 31.
SEQ ID NO:135 es la secuencia de ADNc determinada para contig 33.
SEQ ID NO:136 es la secuencia de ADNc determinada para contig 38.
SEQ ID NO:137 es la secuencia de ADNc determinada para contig 39.
SEQ ID NO:138 es la secuencia de ADNc determinada para contig 41.
SEQ ID NO:139 es la secuencia de ADNc determinada para contig 43.
SEQ ID NO:140 es la secuencia de ADNc determinada para contig 44.
SEQ ID NO:141 es la secuencia de ADNc determinada para contig 45.
SEQ ID NO:142 es la secuencia de ADNc determinada para contig 47.
SEQ ID NO:143 es la secuencia de ADNc determinada para contig 48.
SEQ ID NO:144 es la secuencia de ADNc determinada para contig 49.
SEQ ID NO:145 es la secuencia de ADNc determinada para contig 50.
SEQ ID NO:146 es la secuencia de ADNc determinada para contig 53.
SEQ ID NO:147 es la secuencia de ADNc determinada para contig 54.
SEQ ID NO:148 es la secuencia de ADNc determinada para contig 56.
SEQ ID NO:149 es la secuencia de ADNc determinada para contig 57.
SEQ ID NO:150 es la secuencia de ADNc determinada para contig 58.
SEQ ID NO:151 es la secuencia de ADNc de longitud completa determinada para L530S.
SEQ ID NO:152 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO:151.
SEQ ID NO:153 es la secuencia de ADNc de longitud completa de una primera variante de L514S.
SEQ ID NO:154 es la secuencia de ADNc de longitud completa de una segunda variante de L514S.
SEQ ID NO:155 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO:153.
SEQ ID NO:156 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO:154.
SEQ ID NO:157 es la secuencia de ADNc determinada para contig 59.
SEQ ID NO:158 es la secuencia de ADNc de longitud completa para L763P (también referido como contig 22).
SEQ ID NO:159 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO:158.
SEQ ID NO:160 es la secuencia de ADNc de longitud completa para L762P (también referido como contig 17).
SEQ ID NO:161 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO:160.
SEQ ID NO:162 es la secuencia de ADNc determinada para L515S.
SEQ ID NO:163 es la secuencia de ADNc de longitud completa de una primera variante de L524S.
SEQ ID NO:164 es la secuencia de ADNc de longitud completa de una segunda variante de L524S.
SEQ ID NO:165 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO:163.
SEQ ID NO:166 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO:164.
SEQ ID NO:167 es la secuencia de ADNc de longitud completa de una primera variante de L762P.
SEQ ID NO:168 es la secuencia de ADNc de longitud completa de una segunda variante de L762P.
SEQ ID NO:169 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO:167.
SEQ ID NO:170 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO:168.
SEQ ID NO:171 es la secuencia de ADNc de longitud completa para L773P (también referido como contig 56).
SEQ ID NO:172 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO:171.
SEQ ID NO:173 es una secuencia de ADNc extendida para L519S.
SEQ ID NO:174 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO:174.
SEQ ID NO:175 es la secuencia de ADNc de longitud completa para L523S.
SEQ ID NO:176 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO:175.
SEQ ID NO:177 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub5-7A.
SEQ ID NO:178 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub5-8G.
SEQ ID NO:179 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub5-8H.
SEQ ID NO:180 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub5-10B.
SEQ ID NO:181 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub5-10H.
SEQ ID NO:182 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub5-12B.
SEQ ID NO:183 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub5-11C.
SEQ ID NO:184 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-1c.
SEQ ID NO:185 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-2f.
SEQ ID NO:186 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-2G.
SEQ ID NO:187 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-4d.
SEQ ID NO:188 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-4e.
SEQ ID NO:189 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-4f.
SEQ ID NO:190 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-3h.
SEQ ID NO:191 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-5d.
SEQ ID NO:192 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-5h.
SEQ ID NO:193 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-6h.
SEQ ID NO:194 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-7a.
SEQ ID NO:195 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-8a.
SEQ ID NO:196 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-7d.
SEQ ID NO:197 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-7e.
SEQ ID NO:198 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-8e.
SEQ ID NO:199 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-7g.
SEQ ID NO:200 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-9f.
SEQ ID NO:201 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-9h.
SEQ ID NO:202 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-11b.
SEQ ID NO:203 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-11c.
SEQ ID NO:204 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-12c.
SEQ ID NO:205 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-12e.
SEQ ID NO:206 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-12f.
SEQ ID NO:207 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-11g.
SEQ ID NO:208 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-12g.
SEQ ID NO:209 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-12h.
SEQ ID NO:210 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-II-1a.
SEQ ID NO:211 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-II-2b.
SEQ ID NO:212 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-II-2g.
SEQ ID NO:213 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-II-1h.
SEQ ID NO:214 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-II-4a.
SEQ ID NO:215 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-II-4b.
SEQ ID NO:216 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-II-3e.
SEQ ID NO:217 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-II-4f.
SEQ ID NO:218 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-II-4g.
SEQ ID NO:219 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-II-4h.
SEQ ID NO:220 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-II-5c.
SEQ ID NO:221 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-II-5e.
SEQ ID NO:222 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-II-6f.
SEQ ID NO:223 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-II-5g.
SEQ ID NO:224 es la secuencia de ADNc determinada para LST-sub6-II-6g.
SEQ ID NO:225 es la secuencia de aminoácidos para L528S.
SEQ ID NO:226-251 son péptidos sintéticos obtenidos de L762P.
SEQ ID NO:252 es la secuencia de aminoácidos expresada de L514S.
SEQ ID NO:253 es la secuencia de ADN correspondiente a SEQ ID NO:252.
SEQ ID NO:254 es la secuencia de ADN de una construcción de expresión de L762P.
SEQ ID NO:255 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 23785.
SEQ ID NO:256 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 23786.
SEQ ID NO:257 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 23788.
SEQ ID NO:258 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 23790.
SEQ ID NO:259 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 23793.
SEQ ID NO:260 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 23794.
SEQ ID NO:261 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 23795.
SEQ ID NO:262 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 23796.
SEQ ID NO:263 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 23797.
SEQ ID NO:264 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 23798.
SEQ ID NO:265 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 23799.
SEQ ID NO:266 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 23800.
SEQ ID NO:267 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 23802.
SEQ ID NO:268 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 23803.
SEQ ID NO:269 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 23804.
SEQ ID NO:270 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 23805.
SEQ ID NO:271 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 23806.
SEQ ID NO:272 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 23807.
SEQ ID NO:273 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 23808.
SEQ ID NO:274 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 23809.
SEQ ID NO:275 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 23810.
SEQ ID NO:276 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 23811.
SEQ ID NO:277 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 23812.
SEQ ID NO:278 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 23813.
SEQ ID NO:279 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 23815.
SEQ ID NO:280 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25298.
SEQ ID NO:281 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25299.
SEQ ID NO:282 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25300.
SEQ ID NO:283 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25301
SEQ ID NO:284 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25304
SEQ ID NO:285 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25309.
SEQ ID NO:286 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25312.
SEQ ID NO:287 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25317.
SEQ ID NO:288 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25321.
SEQ ID NO:289 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25323.
SEQ ID NO:290 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25327.
SEQ ID NO:291 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25328.
SEQ ID NO:292 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25332.
SEQ ID NO:293 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25333.
SEQ ID NO:294 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25336.
SEQ ID NO:295 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25340.
SEQ ID NO:296 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25342.
SEQ ID NO:297 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25356.
SEQ ID NO:298 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25357.
SEQ ID NO:299 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25361.
SEQ ID NO:300 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25363.
SEQ ID NO:301 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25397.
SEQ ID NO:302 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25402.
SEQ ID NO:303 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25403.
SEQ ID NO:304 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25405.
SEQ ID NO:305 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25407.
SEQ ID NO:306 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25409.
SEQ ID NO:307 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25396.
SEQ ID NO:308 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25414.
SEQ ID NO:309 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25410.
SEQ ID NO:310 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25406.
SEQ ID NO:311 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25306.
SEQ ID NO:312 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25362.
SEQ ID NO:313 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25360.
SEQ ID NO:314 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25398.
SEQ ID NO:315 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25355.
SEQ ID NO:316 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25351.
SEQ ID NO:317 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25331.
SEQ ID NO:318 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25338.
SEQ ID NO:319 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25335.
SEQ ID NO:320 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25329.
SEQ ID NO:321 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25324.
SEQ ID NO:322 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25322.
SEQ ID NO:323 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25319.
SEQ ID NO:324 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25316.
SEQ ID NO:325 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25311.
SEQ ID NO:326 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25310.
SEQ ID NO:327 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25302.
SEQ ID NO:328 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25315.
SEQ ID NO:329 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25308.
SEQ ID NO:330 es la secuencia de ADNc determinada para el clon 25303.
SEQ ID NO:331-337 son las secuencias de ADNc de las isoformas del homólogo del supresor tumoral p53, p63 (también referido como L530S).
SEQ ID NO:338-344 son las secuencias de aminoácidos codificadas por SEQ ID NO:331-337, respectivamente
SEQ ID NO:345 es una segunda secuencia de ADNc para el antígeno L763P.
SEQ ID NO:346 es la secuencia de aminoácidos codificadas por la secuencia de SEQ ID NO:345.
SEQ ID NO:347 es una secuencia de ADNc de longitud completa determinada para L523S.
SEQ ID NO:348 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO:347.
SEQ ID NO:349 es la secuencia de ADNc que codifica la parte N-terminal de L773P.
SEQ ID NO:350 es la secuencia de aminoácidos de la parte N-terminal de L773P.
SEQ ID NO:351 es la secuencia de ADN de una fusión de Ra12 y la parte N-terminal de L763P.
SEQ ID NO:352 es la secuencia de aminoácidos de la fusión de Ra12 y la parte N-terminal de L763P.
SEQ ID NO:353 es la secuencia de ADN de una fusión de Ra12 y la parte C-terminal de L763P.
SEQ ID NO:354 es la secuencia de aminoácidos de la fusión de Ra12 y la parte C-terminal de L763P.
SEQ ID NO:355 es un cebador.
SEQ ID NO:356 es un cebador.
SEQ ID NO:357 es la secuencia de la proteína de L762P recombinante expresado.
SEQ ID NO:358 es la secuencia de ADN de L762P recombinante expresado.
SEQ ID NO:359 es un cebador.
SEQ ID NO:360 es un cebador.
SEQ ID NO:361 es la secuencia de la proteína de L773P A recombinante expresado.
SEQ ID NO:362 es la secuencia de ADN de L773P A recombinante expresado.
SEQ ID NO:363 es un epítopo obtenido del polipéptido del clon L773P.
SEQ ID NO:364 es un polinucleótido que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:363.
SEQ ID NO:365 es un epítopo obtenido del polipéptido del clon L773P.
SEQ ID NO:366 es un polinucleótido que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:365.
SEQ ID NO:367 es un epítopo que consiste en los aminoácidos 571-590 de SEQ ID NO:161, clon L762P.
SEQ ID NO:368 es la secuencia de ADN de longitud completa para contig 13 (SEQ ID NO:125), también referido como L761P.
SEQ ID NO:369 es la secuencia de la proteína codificada por la secuencia de ADN de SEQ ID NO:368.
SEQ ID NO:370 es una secuencia de ADN de L762P de los nucleótidos 2071-2130.
SEQ ID NO:371 es una secuencia de ADN de L762P de los nucleótidos 1441-1500.
SEQ ID NO:372 es una secuencia de ADN de L762P de los nucleótidos 1936-1955.
SEQ ID NO:373 es una secuencia de ADN de L762P de los nucleótidos 2620-2679.
SEQ ID NO:374 es una secuencia de ADN de L762P de los nucleótidos 1801-1860.
SEQ ID NO:375 es una secuencia de ADN de L762P de los nucleótidos 1531-1591.
SEQ ID NO:376 es la secuencia de aminoácidos del péptido L762P codificado por SEQ ID NO:373.
SEQ ID NO:377 es la secuencia de aminoácidos del péptido L762P codificado por SEQ ID NO:370.
SEQ ID NO:378 es la secuencia de aminoácidos del péptido L762P codificado por SEQ ID NO:372.
SEQ ID NO:379 es la secuencia de aminoácidos del péptido L762P codificado por SEQ ID NO:374.
SEQ ID NO:380 es la secuencia de aminoácidos del péptido L762P codificado por SEQ ID NO:371.
SEQ ID NO:381 es la secuencia de aminoácidos del péptido L762P codificado por SEQ ID NO:375.
SEQ ID NO:382 es la secuencia de aminoácidos de un epítopo de L762P.
SEQ ID NO:383-386 son cebadores de PCR.
SEQ ID NO:387-395 son las secuencias de aminoácidos de péptidos L773P.
SEQ ID NO:396-419 son las secuencias de aminoácidos de péptidos L523S.
SEQ ID NO:420 es la secuencia de ADNc determinada para el clon #19014.
SEQ ID NO:421 es el cebador directo PDM-278 para la región codificadora L514S-13160.
SEQ ID NO:422 es el cebador inverso PDM-278 para la región codificadora L514S-13160.
SEQ ID NO:423 es la secuencia de aminoácidos para L514S recombinante expresado.
SEQ ID NO:424 es la secuencia de ADN codificadora para L514S recombinante.
SEQ ID NO:425 es el cebador directo PDM-414 para la región codificadora de L523S.
SEQ ID NO:426 es el cebador inverso PDM-414 para la región codificadora de L523S.
SEQ ID NO:427 es la secuencia de aminoácidos para L523S recombinante expresado.
SEQ ID NO:428 es la secuencia de ADN codificadora para L523S recombinante.
SEQ ID NO:429 es el cebador inverso PDM-279 para la región codificadora de L762PA.
SEQ ID NO:430 es la secuencia de aminoácidos para L762PA recombinante expresado.
SEQ ID NO:431 es la secuencia de ADN codificadora para L762PA recombinante.
SEQ ID NO:432 es el cebador inverso PDM-300 para la región codificadora de L773P.
SEQ ID NO:433 es la secuencia de aminoácidos de L773P recombinante expresado.
SEQ ID NO:434 es la secuencia de ADN codificadora para L773P recombinante.
SEQ ID NO:435 es el cebador directo para TCR Valfa8.
SEQ ID NO:436 es el cebador inverso para TCR Valfa8.
SEQ ID NO:437 es el cebador directo para TCR Vbeta8.
SEQ ID NO:438 es el cebador inverso para TCR Vbeta8
SEQ ID NO:439 es la secuencia de ADN de TCR Valfa del clon TCR específico para el antígeno de pulmón L762P.
SEQ ID NO:440 es la secuencia de ADN de TCR Vbeta del clon TCR específico para el antígeno de pulmón L762P.
SEQ ID NO:441 es la secuencia de aminoácidos del péptido #2684 de L763.
SEQ ID NO:442 es el ADNc de longitud completa predicho para la secuencia parcial clonada del clon L529S (SEQ ID NO:106).
SEQ ID NO:443 es la secuencia de aminoácidos deducida codificada por SEQ ID NO:442.
SEQ ID NO:444 es el cebador directo PDM-734 para la región codificadora del clon L523S.
SEQ ID NO:445 es el cebador inverso PDM-735 para la región codificadora del clon L523S.
SEQ ID NO:446 es la secuencia de aminoácidos para L523S recombinante expresado.
SEQ ID NO:447 es la secuencia de ADN codificadora para L523S recombinante.
SEQ ID NO:448 es otro cebador directo PDM-733 para la región codificadora del clon L523S.
SEQ ID NO:449 es la secuencia de aminoácidos para un segundo L523S recombinante expresado.
SEQ ID NO:450 es la secuencia de ADN codificadora para un segundo L523S recombinante.
SEQ ID NO:451 corresponde a los aminoácidos 86-110, un epítopo de L514S específico en la generación de anticuerpos.
SEQ ID NO:452 corresponde a los aminoácidos 21-45, un epítopo de L514S específico en la generación de anticuerpos.
SEQ ID NO:453 corresponde a los aminoácidos 121-135, un epítopo de L514S específico en la generación de anticuerpos.
SEQ ID NO:454 corresponde a los aminoácidos 440-460, un epítopo de L523S específico en la generación de anticuerpos.
SEQ ID NO:455 corresponde a los aminoácidos 156-175, un epítopo de L523S específico en la generación de anticuerpos.
SEQ ID NO:456 corresponde a los aminoácidos 326-345, un epítopo de L523S específico en la generación de anticuerpos.
SEQ ID NO:457 corresponde a los aminoácidos 40-59, un epítopo de L523S específico en la generación de anticuerpos.
SEQ ID NO:458 corresponde a los aminoácidos 80-99, un epítopo de L523S específico en la generación de anticuerpos.
SEQ ID NO:459 corresponde a los aminoácidos 160-179, un epítopo de L523S específico en la generación de anticuerpos.
SEQ ID NO:460 corresponde a los aminoácidos 180-199, un epítopo de L523S específico en la generación de anticuerpos.
SEQ ID NO:461 corresponde a los aminoácidos 320-339, un epítopo de L523S específico en la generación de anticuerpos.
SEQ ID NO:462 corresponde a los aminoácidos 340-359, un epítopo de L523S específico en la generación de anticuerpos.
SEQ ID NO:463 corresponde a los aminoácidos 370-389, un epítopo de L523S específico en la generación de anticuerpos.
SEQ ID NO:464 corresponde a los aminoácidos 380-399, un epítopo de L523S específico en la generación de anticuerpos.
SEQ ID NO:465 corresponde a los aminoácidos 37-55, un epítopo de L523S reconocido por la línea CTL específica de L523S 6B1.
SEQ ID NO:466 corresponde a los aminoácidos 41-51, el epítopo antigénico mapeado de L523S reconocido por la línea CTL específica de L523S 6B1.
SEQ ID NO:467 corresponde a la secuencia de ADN que codifica SEQ ID NO:466.
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SEQ ID NO:468, la materia de la presente invención, corresponde a los aminoácidos del péptido 16, 17 de hL523S.
SEQ ID NO:469 corresponde a los aminoácidos del péptido 16, 17 de mL523S.
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Descripción detallada de la invención
La presente invención está dirigida en general a composiciones y a su utilización en la terapia y diagnóstico de cáncer, particularmente cáncer de pulmón. Como se describe adicionalmente más adelante, las composiciones ilustrativas de la presente invención incluyen, pero no están restringidas a, polipéptidos, particularmente polipéptidos inmunogénicos, polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos, anticuerpos y otros agentes de unión, células presentadoras de antígenos (APC) y células del sistema inmune (p. ej., células T).
La práctica de la presente invención empleará, a no ser que se indique específicamente lo contrario, métodos convencionales de virología, inmunología, microbiología, biología molecular y técnicas de ADN recombinante en la habilidad de la técnica, muchos de los cuales se describen más adelante para el propósito de ilustración. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véanse, p, ej., Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a Edición, 1989); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I y II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames y S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames y S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984).
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente memoria, ya sea anteriormente o posteriormente, se incorporan en la presente memoria por referencia en su totalidad.
Tal y como se utilizan en esta especificación y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares, "un", "una" y "el/la" incluyen las referencias en plural a no ser que el contenido indique claramente otra cosa.
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Composiciones de Polipéptidos
Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "polipéptido" se utiliza en su significado convencional, es decir, como una secuencia de aminoácidos. Los polipéptidos no están limitados a una longitud específica del producto; así, se incluyen en la definición de polipéptido, péptidos, oligopéptidos y proteínas, y dichos términos pueden utilizarse indistintamente en la presente memoria a no ser que se indique específicamente otra cosa. Este término tampoco se refiere a o excluye modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y semejantes, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto naturales como no naturales. Un polipéptido puede ser una proteína completa, o una subsecuencia de ésta. Los polipéptidos particulares de interés en el contexto de esta invención son subsecuencias de aminoácidos que comprenden epítopos, es decir, determinantes antigénicos responsables sustancialmente de las propiedades inmunogénicas de un polipéptido y que son capaces de provocar una respuesta inmune.
Los polipéptidos particularmente ilustrativos de la presente descripción comprenden los codificados por una secuencia de polinucleótido mostrada en una cualquiera de SEQ ID NO:1-3, 6-8, 10-13, 15-27, 29, 30, 32, 34-49, 51, 52, 54, 55, 57-59, 61-69, 71, 73, 74, 77, 78, 80-82, 84, 86-96, 107-109, 111, 113, 125, 127, 128, 129, 131-133, 142, 144, 148-151, 153, 154, 157, 158, 160, 167, 168, 171, 179, 182, 184-186, 188-191, 193, 194, 198-207, 209, 210, 213, 214, 217, 220-224, 253-337, 345, 347, 349, 358, 362, 364, 365, 368, 370-375, 420, 424, 428, 431, 434, 442, 447, 450 y 467, o una secuencia que hibrida en condiciones moderadamente astringentes, o alternativamente, en condiciones altamente astringentes, con una secuencia de polinucleótido mostrada en una cualquiera de SEQ ID NO:1-3, 6-8, 10-13, 15-27, 29, 30, 32, 34-49, 51, 52, 54, 55, 57-59, 61-69, 71, 73, 74, 77, 78, 80-82, 84, 86-96, 107-109, 111, 113, 125, 127, 128, 129, 131-133, 142, 144, 148-151, 153, 154, 157, 158, 160, 167, 168, 171, 179, 182, 184-186, 188-191, 193, 194, 198-207, 209, 210, 213, 214, 217, 220-224, 253-337, 345, 347, 349, 358, 362, 364, 365, 368, 370-375, 420, 424, 428, 431, 434, 442, 447, 450 y 467. Determinados polipéptidos ilustrativos de la invención consisten en las secuencias de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:468.
Los polipéptidos de la presente invención se refieren algunas veces en la presente memoria como proteínas de tumor de pulmón o polipéptidos de tumor de pulmón, como una indicación de que su identificación se ha basado al menos en parte en sus niveles incrementados de expresión en muestras de tumor de pulmón. Así, un "polipéptido de tumor de pulmón" o "proteína de tumor de pulmón", se refiere generalmente a una secuencia de polipéptido de la presente invención, o a una secuencia de polinucleótido que codifica dicho polipéptido, que está expresada en una proporción sustancial de muestras de tumor de pulmón, por ejemplo preferiblemente mayor de aproximadamente 20%, más preferiblemente mayor de aproximadamente 30%, y lo más preferiblemente mayor de aproximadamente 50% o más de las muestras de tumor de pulmón ensayadas, a un nivel que es al menos dos veces, y preferiblemente al menos cinco veces, mayor que el nivel de expresión en los tejidos normales, según se determina utilizando un ensayo representativo proporcionado en la presente memoria. Una secuencia de polipéptido de tumor de pulmón de la invención, tomando como base su nivel de expresión incrementado en las células de tumor, tiene una utilidad particular como un marcador de diagnóstico así como una diana terapéutica, como se describe adicionalmente más
adelante.
En determinadas realizaciones preferidas, los polipéptidos de la invención son inmunogénicos, es decir, reaccionan de manera detectable en un inmunoensayo (tal como un ensayo ELISA o de estimulación de células T) con antisuero y/o células T de un paciente con cáncer de pulmón. El cribado de actividad inmunogénica puede realizarse utilizando técnicas muy conocidas por el experto en la técnica. Por ejemplo, dichos cribados pueden realizarse utilizando métodos tales como los descritos en Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. En un ejemplo ilustrativo, un polipéptido puede inmovilizarse en un soporte sólido y ponerse en contacto con suero de pacientes para permitir la unión de anticuerpos del suero con el polipéptido inmovilizado. El suero no unido puede eliminarse y detectarse los anticuerpos unidos utilizando, por ejemplo, Proteína A marcada con
^{125}I.
Como reconocerá el experto en la técnica, las partes inmunogénicas de los polipéptidos descritos en la presente memoria también están englobadas en la presente invención. Una "parte inmunogénica", tal y como se utiliza en la presente memoria, es un fragmento de un polipéptido inmunogénico de la invención que en sí mismo es reactivo inmunológicamente (es decir, se une específicamente) con las células B y/o los receptores de antígenos de superficie de la célula T que reconocen el polipéptido. Las partes inmunogénicas pueden identificarse generalmente utilizando técnicas muy conocidas, tales como las resumidas en Paul, Fundamental Immunology, 3a ed., 243-247 (Raven Press, 1993) y las referencias citadas en ella. Dichas técnicas incluyen el cribado de polipéptidos para detectar la capacidad de reaccionar con anticuerpos específicos de antígeno, antisuero y/o líneas de células T o clones. Tal y como se utiliza en la presente memoria, los antisueros y anticuerpos son "específicos de antígeno" si se unen específicamente a un antígeno (es decir, reaccionan con la proteína en un ELISA u otro inmunoensayo, y no reaccionan de manera detectable con proteínas no relacionadas). Dichos antisueros y anticuerpos pueden prepararse como se describe en la presente memoria, y utilizando técnicas muy conocidas.
En una realización preferida, una parte inmunogénica de un polipéptido de la presente invención es una parte que reacciona con antisueros y/o células T a un nivel que no es sustancialmente menor que la reactividad del polipéptido de longitud completa (p. ej., en un ELISA y/o un ensayo de reactividad de células T). Preferiblemente, el nivel de actividad inmunogénica de la parte inmunogénica es al menos aproximadamente 50%, preferiblemente al menos aproximadamente 70% y lo más preferiblemente mayor de aproximadamente 90% de la inmunogenicidad del polipéptido de longitud completa. En algunos casos, se identificará que las partes inmunogénicas preferidas tienen un nivel de actividad inmunogénica mayor que el del polipéptido de longitud completa correspondiente, p. ej., que tiene más de aproximadamente 100% ó 150% o más actividad inmunogénica.
En otras realizaciones determinadas, las partes inmunogénicas ilustrativas pueden incluir péptidos en los que se ha delecionado una secuencia líder N-terminal y/o un dominio transmembrana. Otras partes inmunogénicas ilustrativas contendrán una pequeña deleción N-terminal y/o C-terminal (p. ej., 1-30 aminoácidos, preferiblemente 5-15 aminoácidos), respecto a la proteína madura.
En otra realización, una composición de polipéptido de la invención también puede comprender uno o más polipéptidos que son inmunológicamente reactivos con células T y/o anticuerpos generados frente a un polipéptido de la invención, particularmente un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en la presente memoria, o frente a un fragmento o variante inmunogénica de éste.
En otra realización de la invención, se proporcionan polipéptidos que comprenden uno o más polipéptidos que son capaces de incitar células T y/o anticuerpos que son inmunológicamente reactivos con uno o más polipéptidos descritos en la presente memoria, o uno o más polipéptidos codificados por secuencias de ácido nucleico contiguas contenidas en las secuencias de polinucleótidos descritas en la presente memoria, o fragmentos o variantes inmunogénicas de estos, o una o más secuencias de ácido nucleico que hibridan con una o más de estas secuencias en condiciones de moderada a alta astringencia.
La presente descripción, en otro aspecto, proporciona fragmentos de polipéptido que comprenden al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 50, ó 100 aminoácidos contiguos o más, incluyendo todas las longitudes intermedias, de una composición de polipéptido mostrada en la presente memoria, tales como las mostradas en SEQ ID NO:152, 155, 156, 165, 166, 169, 170, 172, 174, 176, 226-252, 338-344, 346, 350, 357, 361, 363, 365, 367, 369, 376-382 y 387-419, 441, 443, 446, 449, 451-466 y 468-469, o las codificadas por una secuencia de polinucleótido mostrada en una secuencia de SEQ ID NO: 1-3, 6-8, 10-13, 15-27, 29, 30, 32, 34-49, 51, 52, 54, 55, 57-59, 61-69, 71, 73, 74, 77, 78, 80-82, 84, 86-96, 107-109, 111, 113, 125, 127, 128, 129, 131-133, 142, 144, 148-151, 153, 154, 157, 158, 160, 167, 168, 171, 179, 182, 184-186, 188-191, 193, 194, 198-207, 209, 210, 213, 214, 217, 220-224, 253-337, 345, 347, 349, 358, 362, 364, 365, 368, 370-375, 420, 424, 428, 431, 434, 442, 447, 450 y
467.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona variantes de las composiciones de polipéptido descritas en la presente memoria. Las variantes de polipéptido englobadas generalmente por la presente invención presentarán típicamente al menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% o más de identidad (determinada como se describe más adelante), a lo largo de su longitud, respecto a una secuencia de polipéptido mostrada en la presente memoria.
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En una realización preferida, los fragmentos y variantes de polipéptido proporcionados por la presente invención son inmunológicamente reactivos con un anticuerpo y/o células T que reacciona con un polipéptido de longitud completa mostrado específicamente en la presente memoria.
En otra realización preferida, los fragmentos y variantes de polipéptido proporcionados por la presente invención presentan un nivel de actividad inmunogénica de al menos aproximadamente 50%, preferiblemente al menos aproximadamente 70%, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 90% o más de la que presenta una secuencia de polipéptido de longitud completa mostrada específicamente en la presente memoria.
Una "variante" de polipéptido, tal y como se utiliza el término en la presente memoria, es un polipéptido que se diferencia típicamente de un polipéptido descrito específicamente en la presente memoria en una o más sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones. Dichas variantes pueden ser naturales o pueden generarse sintéticamente, por ejemplo, modificando una o más de las secuencias de polipéptido anteriores de la invención y evaluando su actividad inmunogénica como se describe en la presente memoria y/o utilizando cualquiera de varias técnicas muy conocidas en la técnica.
Por ejemplo, determinadas variantes ilustrativas de los polipéptidos de la invención incluyen aquellas en las que se han eliminado una o más partes, tales como una secuencia líder N-terminal o dominio transmembrana. Otras variantes ilustrativas incluyen variantes en las que se ha eliminado una pequeña parte (p. ej., 1-30 aminoácidos, preferiblemente 5-15 aminoácidos) del extremo N-terminal y/o C-terminal de la proteína madura.
En muchos casos, una variante contendrá sustituciones conservativas. Una "sustitución conservativa" es una en la que un aminoácido se ha sustituido por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de manera que un experto en la técnica de química de péptidos preverá que no cambie sustancialmente la estructura secundaria y naturaleza hidropática del polipéptido. Como se ha descrito anteriormente, pueden hacerse modificaciones en la estructura de los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención y aún así obtener una molécula funcional que codifica un polipéptido variante o derivado con las características deseables, p. ej., con características inmunogénicas. Cuando se desea alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido para crear un equivalente, o incluso una variante o parte inmunogénica mejorada de un polipéptido de la invención, un experto en la técnica cambiará típicamente uno o más de los codones de la secuencia de ADN codificadora según la Tabla 1.
Por ejemplo, pueden sustituirse determinados aminoácidos por otros aminoácidos en una estructura de proteína sin la pérdida apreciable de la capacidad de unión interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, regiones de unión a antígeno de anticuerpos o sitios de unión en moléculas sustrato. Debido a que es la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína la que define la actividad biológica funcional de esa proteína, pueden hacerse determinadas sustituciones en la secuencia de aminoácidos en una secuencia de proteína y, por supuesto, su secuencia de ADN codificadora subyacente, y obtener sin embargo una proteína con propiedades semejantes. Se contempla así que pueden hacerse varios cambios en las secuencias de péptido de las composiciones descritas, o secuencias de ADN correspondientes que codifican dichos péptidos sin la pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1
1 
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Al realizarse dichos cambios, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos para conferir la función biológica interactiva a una proteína se entiende generalmente en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982, incorporado en la presente memoria por referencia). Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos, y semejantes. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático tomando como base su hidrofobicidad y características de carga (Kyte y Doolittle, 1982). Estos valores son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).
Se sabe en la técnica que determinados aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tienen un índice o valor hidropático similar y aún así resulta en una proteína con una actividad biológica similar, es decir, aún así se obtiene una proteína biológica funcionalmente equivalente. Al realizarse dichos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos son \pm2, se prefieren particularmente los que son \pm1, y son aún más particularmente preferidos los que son \pm0,5. También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos semejantes puede hacerse eficazmente tomando como base la hidrofilicidad. La patente de EEUU 4.554.101 (incorporada específicamente en la presente memoria por referencia en su totalidad), indica que la mayor hidrofilicidad media local de una proteína, gobernada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína.
Como se detalla en la Patente de EEUU 4.554.101, los valores de hidrofilicidad siguientes se han asignado a restos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 \pm 1); glutamato (+3,0 \pm 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 \pm 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4). Se entiende que un aminoácido puede sustituirse por otro que tenga un valor de hidrofilicidad similar y aún así obtener un equivalente biológico, y en particular, una proteína inmunológicamente equivalente. En dichos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad son \pm2, se prefieren particularmente los que son \pm1, y son aún más particularmente preferidos los que son \pm0,5.
Como se ha indicado anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan generalmente por lo tanto en la relativa similitud de los sustituyentes de la cadena lateral del aminoácido, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño, y semejantes. Las sustituciones ejemplares que tienen en cuenta varias de las características anteriores son muy conocidas por los expertos en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.
Además, cualquier polinucleótido puede modificarse más para incrementar la estabilidad in vivo. Las modificaciones posibles incluyen, pero no están limitadas a, la adición de secuencias flanqueadoras en los extremos 5' y/o 3'; la utilización de fosforotioato ó 2' O-metilo en lugar de uniones fosfodiesterasa en el núcleo central; y/o la inclusión de bases no tradicionales tales como inosina, queosina y wybutosina, así como acetil-, metil-, tio- y otras formas modificadas de adenina, citidina, guanina, timina y uridina.
Las sustituciones de aminoácidos pueden hacerse adicionalmente tomando como base la similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o naturaleza anfipática de los restos. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza polares no cargados que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen leucina, isoleucina y valina; glicina y alanina; asparagina y glutamina; y serina, treonina, fenilalanina y tirosina. Otros grupos de aminoácidos que pueden representar cambios conservativos incluyen: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his. Una variante también puede, o alternativamente, contener cambios no conservativos. En una realización preferida, los polipéptidos variantes se diferencian de una secuencia nativa por la sustitución, deleción o adición de cinco aminoácidos o menos. Las variantes también pueden (o alternativamente) estar modificadas, por ejemplo, por la deleción o adición de aminoácidos que tienen una influencia mínima en la inmunogenicidad, estructura secundaria y naturaleza hidropática del polipéptido.
Como se ha indicado anteriormente, los polipéptidos pueden comprender una secuencia señal (líder) en el extremo N-terminal de la proteína, que dirige la transferencia de la proteína en la traducción o después de la traducción. El polipéptido también puede estar conjugado con un conector u otra secuencia para facilitar la síntesis, purificación o identificación del polipéptido (p. ej., poli-His), o para incrementar la unión del polipéptido a un soporte sólido. Por ejemplo, un polipéptido puede estar conjugado con una región Fc de una inmunoglobulina.
Cuando se comparan secuencias de polipéptidos, se dice que dos secuencias son "idénticas" si la secuencia de aminoácidos en las dos secuencia es la misma cuando se alinean para una correspondencia máxima, como se describe más adelante. Las comparaciones entre dos secuencias se realiza típicamente comparando las secuencias en una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación" tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, habitualmente 30 a aproximadamente 75, 40 a aproximadamente 50, en la que una secuencia puede compararse a una secuencia de referencia con el mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se han alineado de manera óptima.
El alineamiento óptimo de secuencias para la comparación puede realizarse utilizando el programa Megalign en el paquete de programas bioinformáticos Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, WI), utilizando parámetros por defecto. Este programa engloba varios esquemas de alineamiento descritos en las referencias siguientes: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. En Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Supl. 3, p. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes p. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. y Sharp, P.M. (1989) CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. y Muller W. (1988) CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D. (1971) Comb. Theor 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. y Sokal, R.R. (1973) Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. y Lipman, D.J. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730.
Alternativamente, el alineamiento óptimo de secuencias para comparación puede realizarse por el algoritmo de identidad local de Smith y Waterman (1981) Add. APL. Math 2:482, por el algoritmo de alineamiento de identidad de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, por la búsqueda de métodos de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, por implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en el Paquete Informático de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI), o por inspección.
Un ejemplo preferido de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al. (1977) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402 y Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. BLAST y BLAST 2.0 pueden utilizarse, por ejemplo con los parámetros descritos en la presente memoria, para determinar el porcentaje de identidad de secuencia para los polinucleótidos y polipéptidos de la invención. El programa informático para realizar los análisis BLAST está disponible para el público en el National Center for Biotechnology Information. Para las secuencias de aminoácidos, puede utilizarse una matriz de valores para calcular el valor cumulativo. La extensión de los word hits en cada dirección se paran cuando: el valor de alineamiento cumulativo desciende por la cantidad X de su valor máximo conseguido; el valor cumulativo es cero o menor, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de restos con valor negativo; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento.
En un método preferido, el "porcentaje de identidad de secuencia" se determina comparando dos secuencias alineadas de manera óptima en una ventana de comparación de al menos 20 posiciones, en el que la parte de la secuencia de polipéptido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) de 20 por ciento o menos, habitualmente 5 a 15 por ciento, ó 10 a 12 por ciento, comparado con las secuencias de referencia (que no comprenden adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que el resto de aminoácido idéntico aparece en ambas secuencias para rendir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la secuencia de referencia (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando los resultados por 100 para rendir el porcentaje de identidad de secuencia.
En otras realizaciones ilustrativas, un polipéptido puede ser un polipéptido de fusión que comprende múltiples polipéptidos como se describe en la presente memoria, o que comprende al menos un polipéptido como se describe en la presente memoria y una secuencia no relacionada, tal como una proteína de tumor conocida. Una pareja de fusión puede, por ejemplo, ayudar proporcionando epítopos de T auxiliar (una pareja de fusión inmunológica), preferiblemente epítopos de T auxiliar reconocidos por seres humanos, o puede ayudar en la expresión de la proteína (un amplificador de la expresión) con rendimientos mayores que la proteína recombinante nativa. Determinadas parejas de fusión preferidas son parejas de fusión tanto inmunológicas como amplificadores de la expresión. Pueden seleccionarse otras parejas de fusión para incrementar la solubilidad del polipéptido o para permitir el direccionamiento del polipéptido hacia compartimentos intracelulares deseados. Las parejas de fusión adicionales incluyen etiquetas de afinidad, que facilitan la purificación del polipéptido.
Los polipéptidos de fusión pueden prepararse generalmente utilizando técnicas estándar, incluyendo conjugación química. Preferiblemente, un polipéptido de fusión se expresa como un polipéptido recombinante, lo que permite la producción de niveles incrementados, respecto a un polipéptido no fusionado, en un sistema de expresión. Brevemente, las secuencias de ADN que codifican los componentes del polipéptido pueden ensamblarse independientemente, y ligarse en un vector de expresión apropiado. El extremo 3' de la secuencia de ADN que codifica un componente polipeptídico se liga, con o sin un péptido conector, al extremo 5' de una secuencia de ADN que codifica el segundo componente polipeptídico de manera que los marcos de lectura de las secuencias están en fase. Esto permite la traducción en un único polipéptido de fusión que retiene la actividad biológica de ambos componentes polipeptídicos.
Puede emplearse una secuencia de conector peptídico para separar el primer y segundo componente polipeptídico por una distancia suficiente para asegurar que cada polipéptido se pliega en sus estructuras secundarias y terciarias. Dicha secuencia de conector peptídico se incorpora en el polipéptido de fusión utilizando técnicas estándar muy conocidas en la técnica. Las secuencias de conector peptídico adecuadas pueden elegirse tomando como base los factores siguientes: (1) su capacidad para adoptar una conformación extendida flexible; (2) su incapacidad para adoptar una estructura secundaria que podría interaccionar con los epítopos funcionales en el primer y segundo polipéptido; y (3) la ausencia de restos hidrofóbicos o cargados que podrían reaccionar con los epítopos funcionales del polipéptido. Las secuencias de conector peptídico preferidas contienen restos Gly, Asn y Ser. También pueden utilizarse en la secuencia conectora otros aminoácidos casi neutros, tales como Thr y Ala. Las secuencias de aminoácidos que pueden emplearse útilmente como conectores incluyen las descritas en Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262, 1986; Patente de EEUU No. 4.935.233 y Patente de EEUU No. 4.751.180. La secuencia conectora puede tener generalmente una longitud de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 aminoácidos. La secuencia conectora no se requiere cuando el primer y segundo polipéptido tienen regiones N-terminales de aminoácidos no esenciales que pueden utilizarse para separar los dominios funcionales y evitar la interferencia estérica.
Las secuencias de ADN ligadas se unen de manera operativa a elementos reguladores de la transcripción o la traducción adecuados. Los elementos reguladores responsables de la expresión del ADN están localizados sólo en 5' respecto a la secuencia de ADN que codifica el primer polipéptido. De manera similar, los codones de parada requeridos para terminar la traducción y las señales de terminación de la transcripción sólo están presentes en 3' respecto a la secuencia de ADN que codifica el segundo polipéptido.
El polipéptido de fusión puede comprender un polipéptido como se describe en la presente memoria junto con una proteína inmunogénica no relacionada, tal como una proteína inmunogénica capaz de incitar una respuesta de llamada. Los ejemplos de dichas proteínas incluyen proteínas del tétanos, tuberculosis y hepatitis (véase, por ejemplo, Stoute et al. New Engl. J. Med., 336:86-91, 1997).
En una realización preferida, la pareja de fusión inmunológica se obtiene de una especie de Mycobacterium, tal como un fragmento Ra12 obtenido de Mycobacterium tuberculosis. Las composiciones de Ra12 y los métodos para su utilización para incrementar la expresión y/o inmunogenicidad de secuencias de polinucleótido/polipéptido heterólogas se describe en la patente de EEUU 6.627.798. Brevemente, Ra12 se refiere a una región de polinucleótido que es una subsecuencia de un ácido nucleico de Mycobacterium tuberculosis MTB32A. MTB32A es una proteasa de serina con un peso molecular de 32 KD codificada por un gen en cepas virulentas y avirulentas de M. tuberculosis. Se ha descrito la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de MTB32A (por ejemplo, Solicitud de Patente de EEUU 60/158.585); véase también, Skeiky et al., Infection and Immun. (1999) 67:3998-4007. Los fragmentos C-terminales de la secuencia codificadora de MTB32A se expresan a altos niveles y permanecen como polipéptidos solubles a lo largo del proceso de purificación. Más aún, Ra12 puede incrementar la inmunogenicidad de polipéptidos inmunogénicos heterólogos con los que está fusionado. Un polipéptido de fusión de Ra12 preferido comprende un fragmento C-terminal de 14 KD correspondiente a los restos de aminoácidos 192 a 323 de MTB32A.
Otros polinucleótidos preferidos de Ra12 comprenden generalmente al menos aproximadamente 15 nucleótidos consecutivos, al menos aproximadamente 30 nucleótidos, al menos aproximadamente 60 nucleótidos, al menos aproximadamente 100 nucleótidos, al menos aproximadamente 200 nucleótidos, o al menos aproximadamente 300 nucleótidos que codifican una parte de un polipéptido Ra12.
Los polinucleótidos de Ra12 pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifica un polipéptido Ra12 o una parte de éste) o pueden comprender una variante de dicha secuencia. Las variantes del polinucleótido de Ra12 pueden contener una o más sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones de manera que la actividad biológica del polipéptido de fusión codificado no se disminuye sustancialmente, respecto a un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido Ra12 nativo. Las variantes presentan preferiblemente al menos aproximadamente 70% de identidad, más preferiblemente al menos aproximadamente 80% de identidad y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 90% de identidad respecto a una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido Ra12 nativo o una parte de éste.
En otras realizaciones preferidas, una pareja de fusión inmunológica se obtiene de la proteína D, una proteína de superficie de la bacteria gram negativa Haemophilus influenza B (WO 91/18926). Preferiblemente, un derivado de proteína D comprende aproximadamente el primer tercio de la proteína (p. ej., los primeros 100-110 aminoácidos N-terminales) y un derivado de proteína D puede estar lipidado. En determinadas realizaciones preferidas, se incluyen los primeros 109 restos de una pareja de fusión Lipoproteína D en el extremo N-terminal para proporcionar epítopos de célula T exógenos adicionales al polipéptido y para incrementar el nivel de expresión en E. coli (funcionando así como un amplificador de la expresión). La cola de lípido asegura la presentación óptima del antígeno a las células presentadoras de antígeno. Otras parejas de fusión incluyen la proteína no estructural del virus de influenza, NS1 (hemaglutinina). Típicamente, se utilizan los 81 aminoácidos N-terminales, aunque pueden utilizarse diferentes fragmentos que incluyan epítopos de T auxiliar.
En otra realización, la pareja de fusión inmunológica es la proteína conocida como LYTA, o una parte de ésta (preferiblemente una parte C-terminal). LYTA se obtiene de Streptococcus pneumoniae, que sintetiza una N-acetil-L-alanina amidasa conocida como amidasa LYTA (codificada por el gen LytA; Gene 43:265-292, 1986). LYTA es una autolisina que degrada específicamente determinados enlaces en el núcleo péptidoglicano. El dominio C-terminal de la proteína LYTA es responsable de la afinidad a la colina o a algunos análogos de la colina tal como DEAE. Esta propiedad se ha explotado para el desarrollo de plásmidos que expresan C-LYTA de E. coli útiles para la expresión de proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento C-LYTA en el extremo amino (véase Biotechnology 10:795-798, 1992). En una realización preferida, puede incorporarse una parte repetida de LYTA en un polipéptido de fusión. Una parte repetida se encuentra en la región C-terminal empezando en el resto 178. Una parte repetida particularmente preferida incorpora los restos 188-305.
Otra realización ilustrativa más implica polipéptidos de fusión, y los polinucleótidos que los codifican, en los que la pareja de fusión comprende una señal de direccionamiento capaz de dirigir un polipéptido al compartimento endosomal/lisosomal, como se describe en la Patente de EEUU No. 5.633.234. Un polipéptido inmunogénico de la invención, cuando se fusiona con esta señal de direccionamiento, se asociará más eficazmente a las moléculas MHC clase II y proporciona de esta manera una estimulación in vivo incrementada de células T CD4+ específicas para el polipéptido.
Los polipéptidos de la invención se preparan utilizando cualquiera de las diferentes técnicas muy conocidas sintéticas y/o recombinantes, describiéndose más las últimas de éstas más adelante. Los polipéptidos, partes y otras variantes generalmente de menos de aproximadamente 150 aminoácidos pueden generarse por medios sintéticos, utilizando técnicas muy conocidas por los expertos en la técnica. En un ejemplo ilustrativo, dichos polipéptidos se sintetizan utilizando cualquiera de las técnicas de fase sólida disponibles comercialmente, tal como el método de síntesis de fase sólida Merrifield, en el que los aminoácidos se añaden secuencialmente a la cadena de aminoácidos en crecimiento. Véase Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963. El equipo para la síntesis automatizada de polipéptidos está disponible comercialmente a partir de distribuidores tal como Perkin Elmer/Applied BioSystems Division (Foster City, CA) y puede operarse según las instrucciones del fabricante.
En general, las composiciones de polipéptidos (incluyendo los polipéptidos de fusión) de la invención son polipéptidos aislados. Un polipéptido "aislado" es uno que se ha extraído de su entorno original. Por ejemplo, una proteína o polipéptido natural se aísla si se separa de alguno o todos los materiales coexistentes en el sistema natural. Preferiblemente, dichos polipéptidos también están purificados, p. ej., son al menos aproximadamente 90% puros, más preferiblemente al menos aproximadamente 95% puros y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 99% puros.
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Composiciones de Polinucleótidos
La presente invención, en otros aspectos, proporciona composiciones de polinucleótidos. Los términos "ADN" y "polinucleótido" se utilizan esencialmente indistintamente en la presente memoria para referirse a una molécula de ADN que se ha aislado sin el ADN genómico total de una especie particular. "Aislado", tal y como se utiliza en la presente memoria, significa que un polinucleótido carece sustancialmente de otras secuencias codificadoras, y que la molécula de ADN no contiene partes grandes de ADN codificador no relacionado, tal como fragmentos cromosómicos grandes u otros genes funcionales o regiones codificadoras de polipéptidos. Por supuesto, esto se refiere a la molécula de ADN tal y como se aisló originalmente, y no excluye genes o regiones codificadoras que se añaden después al segmento artificialmente.
Como entenderán los expertos en la técnica, las composiciones de polinucleótidos de esta invención pueden incluir secuencias genómicas, secuencias extragenómicas y codificadas por plásmidos y segmentos génicos pequeños obtenidos por ingeniería que expresan, o pueden adaptarse para expresar, proteínas, polipéptidos, péptidos y semejantes. Dichos segmentos pueden aislarse en forma natural, o modificarse sintéticamente de forma artificial.
Como también reconocerá el experto en la técnica, los polinucleótidos de la invención pueden ser de una hebra (codificadora o antisentido) o de doble hebra, y pueden ser moléculas de ADN (genómico, ADNc o sintético) o de ARN. Las moléculas de ARN pueden incluir moléculas de HnARN, que contienen intrones y corresponden a una molécula de ADN de manera exacta, y moléculas de ARNm, que no contienen intrones. Pueden estar presentes, aunque no es necesario, secuencias codificadoras o no codificadoras adicionales en un polinucleótido de la presente invención, y un polinucleótido puede estar unido, aunque no es necesario, a otras moléculas y/o materiales de soporte.
Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifica un polipéptido/proteína de la invención o una parte de éste) o pueden comprender una secuencia que codifica una variante o derivado, preferiblemente una variante o derivado inmunogénico, de dicha secuencia.
Por lo tanto, según otro aspecto de la presente invención, se proporcionan composiciones de polinucleótidos que comprenden parte o toda de una secuencia de polinucleótido mostrada en una cualquiera de SEQ ID NO: 1-3, 6-8, 10-13, 15-27, 29, 30, 32, 34-49, 51, 52, 54, 55, 57-59, 61-69, 71, 73, 74, 77, 78, 80-82, 84, 86-96, 107-109, 111, 113, 125, 127, 128, 129, 131-133, 142, 144, 148-151, 153, 154, 157, 158, 160, 167, 168, 171, 179, 182, 184-186, 188-191, 193, 194, 198-207, 209, 210, 213, 214, 217, 220-224, 253-337, 345, 347, 349, 358, 362, 364, 365, 368, 370-375, 420, 424, 428, 431, 434, 442, 447, 450 y 467, complementos de una secuencia de polinucleótido mostrada en una cualquiera de SEQ ID NO: 1-3, 6-8, 10-13, 15-27, 29, 30, 32, 34-49, 51, 52, 54, 55, 57-59, 61-69, 71, 73, 74, 77, 78, 80-82, 84, 86-96, 107-109, 111, 113, 125, 127, 128, 129, 131-133, 142, 144, 148-151, 153, 154, 157, 158, 160, 167, 168, 171, 179, 182, 184-186, 188-191, 193, 194, 198-207, 209, 210, 213, 214, 217, 220-224, 253-337, 345, 347, 349, 358, 362, 364, 365, 368, 370-375, 420, 424, 428, 431, 434, 442, 447, 450 y 467, y variantes degeneradas de una secuencia de polinucleótido mostrada en una cualquiera de SEQ ID NO:1-3, 6-8, 10-13, 15-27, 29, 30, 32, 34-49, 51, 52, 54, 55, 57-59, 61-69, 71, 73, 74, 77, 78, 80-82, 84, 86-96, 107-109, 111, 113, 125, 127, 128, 129, 131-133, 142, 144, 148-151, 153, 154, 157, 158, 160, 167, 168, 171, 179, 182, 184-186, 188-191, 193, 194, 198-207, 209, 210, 213, 214, 217, 220-224, 253-337, 345, 347, 349, 358, 362, 364, 365, 368, 370-375, 420, 424, 428, 431, 434, 442, 447, 450 y 467. En determinadas realizaciones preferidas, las secuencias de polinucleótido mostradas en la presente memoria codifican polipéptidos inmunogénicos, como se ha descrito anteriormente.
En otras realizaciones relacionadas, la presente invención proporciona variantes de polinucleótidos que tienen una identidad sustancial con las secuencias descritas en la presente memoria en SEQ ID NO: 1-3, 6-8, 10-13, 15-27, 29, 30, 32, 34-49, 51, 52, 54, 55, 57-59, 61-69, 71, 73, 74, 77, 78, 80-82, 84, 86-96, 107-109, 111, 113, 125, 127, 128, 129, 131-133, 142, 144, 148-151, 153, 154, 157, 158, 160, 167, 168, 171, 179, 182, 184-186, 188-191, 193, 194, 198-207, 209, 210, 213, 214, 217, 220-224, 253-337, 345, 347, 349, 358, 362, 364, 365, 368, 370-375, 420, 424, 428, 431, 434, 442, 447, 450 y 467, por ejemplo las que comprenden al menos 70% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% o más, de identidad de secuencia comparado con una secuencia de polinucleótido de esta invención utilizando los métodos descritos en la presente memoria (p.ej., análisis BLAST utilizando parámetros estándar, como se describe más adelante). Un experto en esta técnica reconocerá que estos valores pueden ajustarse apropiadamente para determinar la identidad correspondiente de proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos teniendo en cuenta la degeneración de los codones, similitud de aminoácidos, posicionamiento del marco de lectura y semejantes.
Típicamente, las variantes de polinucleótidos contendrán una o más sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones, preferiblemente de manera que la inmunogenicidad del polipéptido codificado por la variante de polinucleótido no está sustancialmente disminuida respecto a un polipéptido codificado por una secuencia de polinucleótido específicamente mostrada en la presente memoria). También debería entenderse que el término "variantes" engloba a los genes homólogos de origen xenogénico.
En realizaciones adicionales, la presente invención proporciona fragmentos de polinucleótido que comprenden varias longitudes de cadenas contiguas de secuencia idénticas a o complementarias a una o más de las secuencias descritas en la presente memoria. Por ejemplo, esta invención proporciona polinucleótidos que comprenden al menos aproximadamente 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 ó 1.000 o más nucleótidos contiguos de una o más de las secuencias descritas en la presente memoria así como todas las longitudes intermedias entre ellas. Se entenderá fácilmente que "longitudes intermedias", en este contexto, significa cualquier longitud entre los valores indicados, tal como 16, 17, 18, 19, etc.; 21, 22, 23, etc.; 30, 31, 32, etc.; 50, 51, 52, 53, etc.; 100, 101, 102, 103, etc.; 150, 151, 152, 153, etc.; incluyendo todos los números enteros a lo largo de 200-500; 500-1.000 y semejantes.
En otra realización de la invención, se proporcionan composiciones de polinucleótidos que son capaces de hibridar en condiciones de astringencia moderada a alta con una secuencia de polinucleótidos proporcionada en la presente memoria, o un fragmento de ésta, o una secuencia complementaria de ésta. Las técnicas de hibridación son muy conocidas en la técnica de biología molecular. Para propósitos de ilustración, las condiciones moderadamente astringentes adecuadas para ensayar la hibridación de un polinucleótido de esta invención con otros polinucleótidos incluyen prelavado en una disolución de 5 X SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0); hibridación a 50ºC-60ºC, 5 X SSC, toda la noche; seguido de dos lavados a 65ºC durante 20 minutos con cada uno de 2X, 0,5X y 0,2X SSC que contiene 0,1% SDS. Un experto en la técnica entenderá que la astringencia de una hibridación puede manipularse fácilmente, tal como alterando el contenido de sal de la disolución de hibridación y/o la temperatura a la que se realiza la hibridación. Por ejemplo, en otra realización, las condiciones de hibridación altamente astringentes adecuadas incluyen las descritas anteriormente, con la excepción de que la temperatura de hibridación se incrementa, p. ej., a 60-65ºC ó 65-70ºC.
En determinadas realizaciones preferidas, los polinucleótidos descritos anteriormente, p. ej., variantes de polinucleótidos, fragmentos y secuencias de hibridación, codifican polipéptidos que presentan reacciones inmunológicas cruzadas con una secuencia de polipéptido mostrada específicamente en la presente memoria. En otras realizaciones preferidas, dichos polinucleótidos codifican polipéptidos que tienen un nivel de actividad inmunogénica de al menos aproximadamente 50%, preferiblemente de al menos aproximadamente 70%, y más preferiblemente de al menos aproximadamente 90% del de una secuencia de polipéptido mostrada específicamente en la presente memoria.
Los polinucleótidos de la presente invención, o fragmentos de estos, independientemente de la longitud de la secuencia codificadora, pueden combinarse con otras secuencias de ADN tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios de enzimas de restricción adicionales, sitios múltiples de clonación, otros segmentos codificadores, y semejantes, de manera que su longitud total puede variar considerablemente. Se contempla por lo tanto que puede emplearse un fragmento de ácido nucleico casi de cualquier longitud, estando limitada la longitud total preferiblemente por la facilidad de preparación y utilización en el protocolo de ADN recombinante pretendido. Por ejemplo, se contempla que son útiles en muchas implementaciones de esta invención los segmentos de polinucleótido ilustrativos con longitudes totales de aproximadamente 10.000, aproximadamente 5.000, aproximadamente 3.000, aproximadamente 2.000, aproximadamente 1.000, aproximadamente 500, aproximadamente 200, aproximadamente 100, aproximadamente 50 pares de bases de longitud, y semejantes (incluyendo todas las longitudes intermedias).
Cuando se comparan secuencias de polinucleótido, se dice que dos secuencias son "idénticas" si la secuencia de nucleótidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinean para la máxima correspondencia, como se describe más adelante. Las comparaciones entre dos secuencias se realizan típicamente comparando las secuencias en una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación" tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un segmento de al menos 20 posiciones contiguas, habitualmente 30 a aproximadamente 75, 40 a aproximadamente 50, en la que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias estén alineadas óptimamente.
El alineamiento óptimo de secuencias para la comparación puede realizarse utilizando el programa Megalign en el paquete de programas bioinformáticos Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, WI), utilizando parámetros por defecto. Este programa engloba varios esquemas de alineamiento descritos en las referencias siguientes: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. En Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Supl. 3, p. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes p. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. y Sharp, P.M. (1989) CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. y Muller W. (1988) CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D. (1971) Comb. Theor 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. y Sokal, R.R. (1973) Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. y Lipman, D.J. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730.
Alternativamente, el alineamiento óptimo de secuencias para comparación puede realizarse por el algoritmo de identidad local de Smith y Waterman (1981) Add. APL. Math 2:482, por el algoritmo de alineamiento de identidad de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, por la búsqueda de métodos de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, por implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en el Paquete Informático de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI), o por inspección.
Un ejemplo preferido de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y de similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al. (1977) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402 y Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. BLAST y BLAST 2.0 pueden utilizarse, por ejemplo con los parámetros descritos en la presente memoria, para determinar el porcentaje de identidad de secuencia para los polinucleótidos de la invención. El programa informático para realizar los análisis BLAST está disponible para el público en el National Center for Biotechnology Information. En un ejemplo ilustrativo, los valores cumulativos pueden calcularse utilizando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (valor de recompensa para un par de restos coincidentes; siempre >0) y N (valor de penalización para restos no coincidentes; siempre <0). La extensión de los aciertos de palabras en cada dirección se para cuando: el valor de alineamiento cumulativo desciende por la cantidad X de su valor máximo conseguido; el valor cumulativo es cero o menor, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de restos con valor negativo; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza como defecto una longitud de palabra (W) de 11, y expectación (E) de 10, y la matriz de valores BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) de alineamientos, (B) de 50, expectación (E) de 10, M=5, N=4 y una comparación de ambas hebras.
Preferiblemente, el "porcentaje de identidad de secuencia" se determina comparando dos secuencias alineadas de manera óptima en una ventana de comparación de al menos 20 posiciones, en el que la parte de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) de 20 por ciento o menos, habitualmente 5 a 15 por ciento, ó 10 a 12 por ciento, comparado con las secuencias de referencia (que no comprenden adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que las bases de ácido nucleico idénticas aparece en ambas secuencias para rendir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la secuencia de referencia (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando los resultados por 100 para rendir el porcentaje de identidad de secuencia.
Los expertos en la técnica apreciarán que, como resultado de la degeneración del código genético, hay muchas secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido como se describe en la presente memoria. Algunos de estos polinucleótidos presentan una homología mínima respecto a la secuencia de nucleótidos de cualquier gen nativo. Sin embargo, los polinucleótidos que pueden variar debido a diferencias en la utilización de codones están contemplados específicamente por la presente invención. Además, los alelos de los genes que comprenden las secuencias de polinucleótido proporcionadas en la presente memoria están en el alcance de la presente invención. Los alelos son genes endógenos que están alterados como resultado de una o más mutaciones, tales como deleciones, adiciones y/o sustituciones de nucleótidos. El ARNm y la proteína resultante, pueden, aunque no es necesario, tener una estructura o función alterada. Los alelos pueden identificarse utilizando técnicas estándar (tales como hibridación, amplificación y/o comparación de secuencias en una base de datos).
Por lo tanto, en otra realización de la invención, se emplea un método de mutagénesis, tal como mutagénesis específica de sitio, para la preparación de variantes y/o derivados inmunogénicos de los polipéptidos descritos en la presente memoria. Mediante este método, pueden hacerse modificaciones específicas en una secuencia de polipéptido por mutagénesis de los polinucleótidos subyacentes que los codifican. Estas técnicas proporcionan un método directo para preparar y ensayar variantes de secuencia, por ejemplo, incorporando una o más de las consideraciones anteriores, mediante la introducción de uno o más cambios en la secuencia de nucleótidos en el polinucleótido.
La mutagénesis específica de sitio permite la producción de mutantes mediante la utilización de secuencias de oligonucleótidos específicas que codifican la secuencia de ADN de la mutación deseada, así como un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proporcionar una secuencia cebadora con un tamaño y complejidad de secuencia suficiente para formar un dúplex estable en ambos lados de la unión de deleción que se está atravesando. Pueden emplearse mutaciones en una secuencia de polinucleótido seleccionada para mejorar, alterar, disminuir, modificar, o cambiar de otra manera las propiedades del polinucleótido en sí mismo, y/o alterar las propiedades, actividad, composición, estabilidad, o secuencia primaria del polipéptido codificado.
En determinadas realizaciones de la presente invención, los inventores contemplan la mutagénesis de las secuencias de polinucleótido descritas para alterar una o más propiedades del polipéptido codificado, tal como la inmunogenicidad de una vacuna de polipéptido. Las técnicas de mutagénesis específica de sitio son muy conocidas en la técnica, y se utilizan ampliamente para crear variantes tanto de polipéptidos como de polinucleótidos. Por ejemplo, la mutagénesis específica de sitio se utiliza frecuentemente para alterar una parte específica de una molécula de ADN. En dichas realizaciones, se emplea un cebador que comprende típicamente aproximadamente 14 a aproximadamente 25 nucleótidos o así de longitud, con aproximadamente 5 a aproximadamente 10 restos en ambos extremos de la unión de la secuencia que se está alterando.
Como apreciarán los expertos en la técnica, las técnicas de mutagénesis específica de sitio han empleado frecuentemente un vector fago que existe tanto en forma de una hebra como de doble hebra. Los vectores típicos útiles en la mutagénesis específica de sitio incluyen vectores tal como el fago M13. Estos fagos están disponibles comercialmente y su utilización es generalmente muy conocida por los expertos en la técnica. Los plásmidos de doble hebra también se emplean rutinariamente en la mutagénesis específica de sitio lo que elimina la etapa de transferir el gen de interés de un plásmido a un fago.
En general, la mutagénesis específica de sitio según esto se realiza obteniendo en primer lugar un vector de una hebra o separando por fusión las dos hebras de un vector de doble hebra que incluye en su secuencia una secuencia de ADN que codifica el péptido deseado. Se prepara, generalmente sintéticamente, un cebador oligonucleotídico que contiene la secuencia mutada deseada. Este cebador se hibrida con el vector de una hebra, y se somete a enzimas que polimerizan el ADN tal como el fragmento Klenow de la polimerasa I de E. coli, con el fin de completar la síntesis de la hebra que contiene la mutación. Así, se forma un heterodúplex en el que una hebra codifica la secuencia original no mutada y la segunda hebra contiene la mutación deseada. Este vector heterodúplex se utiliza entones para transformar células apropiadas, tal como células de E. coli, y se seleccionan los clones que incluyen los vectores recombinantes que contienen la disposición de la secuencia mutada.
La preparación de las variantes de secuencia de los segmentos de ADN seleccionados que codifican el péptido utilizando mutagénesis específica de sitio proporciona un medio para producir especies potencialmente útiles y no se pretende que sea limitativo ya que hay otras vías por las que pueden obtenerse variantes de secuencia de péptidos y las secuencias de ADN que los codifican. Por ejemplo, los vectores recombinantes que codifican la secuencia de péptido deseada pueden tratarse con agentes mutagénicos, tal como hidroxilamina, para obtener variantes de secuencia. Los detalles específicos respecto a estos métodos y protocolos se encuentran en las enseñanzas de Maloy et al., 1994; Segal, 1976; Prokop y Bajpai, 1991; Kuby, 1994; y Maniatis et al., 1982.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "procedimiento de mutagénesis dirigida de un oligonucleótido" se refiere a procesos dependientes de molde y propagación mediada por vectores que resultan en un incremento de la concentración de una molécula de ácido nucleico específica respecto a su concentración inicial, o en un incremento de la concentración de una señal detectable, tal como amplificación. Tal y como se utiliza en la presente memoria, se pretende que el término "procedimiento de mutagénesis dirigida de un oligonucleótido" se refiera a un proceso que implica la extensión dependiente de mole de una molécula cebadora. El término proceso dependiente de molde se refiere a la síntesis de ácido nucleico de una molécula de ARN o ADN en el que la secuencia de la hebra recién sintetizada de ácido nucleico está gobernada por las reglas muy conocidas de emparejamiento de bases complementarias (véase, por ejemplo, Watson, 1987). Típicamente, las metodologías mediadas por vectores implican la introducción del fragmento de ácido nucleico en un vector de ADN o ARN, la amplificación clonal del vector, y la recuperación del fragmento de ácido nucleico amplificado. Los ejemplos de dichas metodologías se proporcionan en la Patente de EEUU No. 4.237.224.
En otro método para la producción de variantes de polipéptido de la presente invención, puede emplearse recombinación de secuencias recursivas, como se describe en la Patente de EEUU No. 5.837.458. En este método, se realizan ciclos iterativos de recombinación y cribado o selección para "producir" variantes de polinucleótido individuales de la invención que tienen, por ejemplo, una actividad inmunogénica incrementada.
En otras realizaciones de la presente invención, las secuencias de polinucleótido proporcionadas en la presente memoria pueden utilizarse ventajosamente como sondas o cebadores para la hibridación de ácidos nucleicos. Como tales, se contempla que serán de una utilidad particular los segmentos de ácido nucleico que comprenden una región de secuencia de al menos aproximadamente 15 nucleótidos de longitud de secuencia contigua que tiene la misma secuencia que, o es complementaria a, una secuencia contigua de 15 nucleótidos de longitud descrita en la presente memoria. También podrán ser útiles en determinadas realizaciones las secuencias contiguas más largas idénticas o complementarias, p. ej., las de aproximadamente 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1.000 (incluyendo todas las longitudes intermedias) e incluso hasta secuencias de longitud completa.
La capacidad de dichas sondas de ácido nucleico para hibridar específicamente con una secuencia de interés permitirá utilizarlas para detectar la presencia de secuencias complementarias en una muestra dada. Sin embargo, también se consideran otras utilizaciones, tal como la utilización de la información de secuencia para la preparación de especies de cebadores mutantes, o cebadores para utilizarse en la preparación de otras construcciones genéticas.
Las moléculas de polinucleótido que tienen regiones de secuencia que consisten en cadenas de nucleótido contiguas de 10-14, 15-20, 30, 50, o incluso 100-200 nucleótidos o así (incluyendo también las longitudes intermedias), idénticas o complementarias a una secuencia de polinucleótido descrita en la presente memoria, se contemplan particularmente como sondas de hibridación para utilizarse p.ej., en transferencia Southern y Northern. Esto permitirá analizar un producto génico, o un fragmento de éste, tanto en tipos celulares diversos como también en varias células bacterianas. El tamaño total del fragmento, así como el tamaño de la o las cadenas complementarias, dependerá fundamentalmente de la utilización o aplicación pretendida del segmento de ácido nucleico particular. Los fragmentos más pequeños encontrarán generalmente su utilización en las realizaciones de hibridación, en las que la longitud de la región complementaria contigua puede variar, tal como entre aproximadamente 15 y aproximadamente 100 nucleótidos, aunque pueden utilizarse cadenas complementarias contiguas más largas, según la longitud de las secuencias complementarias que se desean detectar.
La utilización de una sonda de hibridación de aproximadamente 15-25 nucleótidos de longitud permite la formación de una molécula dúplex que es tanto estable como selectiva. Se prefieren generalmente las moléculas que tienen secuencias complementarias contiguas sobre cadenas mayores de 15 bases de longitud, sin embargo, con el fin de incrementar la estabilidad y selectividad del híbrido, y mejorar así la calidad y grado de las moléculas híbridas específicas obtenidas. Se preferirá generalmente diseñar moléculas de ácido nucleico que tienen cadenas génicas complementarias de 15 a 25 nucleótidos contiguos, o incluso más largas cuando se desee.
Las sondas de hibridación pueden seleccionarse a partir de cualquier parte de cualquiera de las secuencias descritas en la presente memoria. Todo lo que se requiere es revisar las secuencias mostradas en la presente memoria, o cualquier parte continua de las secuencias, de aproximadamente 15-25 nucleótidos de longitud hasta e incluyendo la secuencia de longitud completa, que se desea utilizar como sonda o cebador. La elección de las secuencias sonda y cebador puede verse influida por varios factores. Por ejemplo, puede desearse emplear cebadores desde alrededor de los extremos de la secuencia total.
Los segmentos o fragmentos pequeños de polinucleótido pueden prepararse fácilmente, por ejemplo, sintetizando directamente el fragmento por medios químicos, como se lleva a la práctica habitualmente utilizando un sintetizador de oligonucleótidos automatizado. También pueden obtenerse fragmentos mediante la aplicación de tecnología de reproducción de ácidos nucleicos, tal como tecnología PCR^{TM} de la Patente de EEUU 4.683.202 (incorporada en la presente memoria por referencia), mediante la introducción de secuencias seleccionadas en vectores recombinantes para la producción recombinante, y mediante otras técnicas de ADN recombinante conocidas generalmente por los expertos en la técnica de la biología molecular.
Las secuencias de nucleótidos de la invención pueden utilizarse por su capacidad de formar selectivamente moléculas dúplex con cadenas complementarias del gen completo o de fragmentos del gen de interés. Dependiendo de la aplicación pretendida, se deseará emplear típicamente condiciones variadas de hibridación para conseguir grados variados de selectividad de la sonda frente a la secuencia diana. Para las aplicaciones que requieren una alta selectividad, se deseará emplear típicamente condiciones relativamente astringentes para formar los híbridos, p. ej., se seleccionarán condiciones de relativamente sal baja y/o temperatura alta, tal como las proporcionadas por una concentración de sal de aproximadamente 0,02 M a aproximadamente 0,15 M de sal a temperaturas de aproximadamente 50ºC a aproximadamente 70ºC. Dichas condiciones selectivas toleran un emparejamiento erróneo pequeño, o ninguno, entre la sonda y el molde o hebra diana, y serán particularmente adecuadas para aislar las secuencias relacionadas.
Por supuesto, para algunas aplicaciones, por ejemplo, cuando se desea preparar mutantes empleando una hebra de cebador mutante hibridada con un molde subyacente, se necesitarán típicamente condiciones de hibridación menos astringentes (astringencia reducida) con el fin de permitir la formación del heterodúplex. En estas circunstancias, se puede desear emplear condiciones de sal tales como las de aproximadamente 0,15 M a aproximadamente 0,9 M de sal, a temperaturas que varían de aproximadamente 20ºC a aproximadamente 55ºC. Las especies con hibridación cruzada pueden identificarse así fácilmente como señales de hibridación positivas respecto a las hibridaciones control. En cualquier caso, se aprecia generalmente que las condiciones pueden convertirse en más astringentes mediante la adición de cantidades crecientes de formamida, que sirven para desestabilizar el dúplex híbrido de la misma manera que una temperatura incrementada. Así, las condiciones de hibridación pueden manipularse fácilmente, y así será generalmente un método preferido dependiendo de los resultados deseados.
Según otra realización de la presente invención, se proporcionan composiciones de polinucleótidos que comprenden oligonucleótidos antisentido. Se ha demostrado que los oligonucleótidos antisentido son inhibidores eficaces y selectivos de diana de la síntesis de proteínas y, consecuentemente, proporcionan un método terapéutico mediante el que puede tratarse una enfermedad mediante la inhibición de la síntesis de proteínas que contribuyen a la enfermedad. La eficacia de los oligonucleótidos antisentido para inhibir la síntesis de proteínas está bien establecida. Por ejemplo, la síntesis de poligalacturonasa y el receptor muscarínico de tipo 2 de la acetilcolina se inhiben por los oligonucleótidos antisentido dirigidos a sus secuencias de ARNm respectivas (Patente de EEUU 5.739.119 y Patente de EEUU 5.759.829). Además, se han demostrado ejemplos de inhibición antisentido con la proteína nuclear ciclina, el gen de resistencia a múltiples fármacos (MDG1), ICAM-1, E-selectina, STK-1, receptor estriatal GABA_{A} y EGF humano (Jaskulski et al., Science, 1988 Jun 10;240(4858):1544-6; Vasanthakumar y Ahmed, Cancer Commun. 1989;1(4):225-32; Peris et al., Brain Res Mol Brain Res. 1998 Jun 15;57(2):310-20; Patente de EEUU 5.801.154; Patente de EEUU 5.789.573; Patente de EEUU 5.718.709 y Patente de EEUU 5.610.288). También se han descrito construcciones antisentido que inhiben y pueden utilizarse para tratar una variedad de proliferaciones celulares anormales, p. ej., cáncer (Patente de EEUU 5.747.470; Patente de EEUU 5.591.317 y Patente de EEUU 5.783.683).
Por lo tanto, en determinadas realizaciones, la presente invención proporciona secuencias de oligonucleótido que comprenden todo, o parte, de cualquier secuencia que es capaz de unirse específicamente a una secuencia de polinucleótido descrita en la presente memoria, o un complemento de ésta. En una realización, los oligonucleótidos antisentido comprenden ADN o derivados de éste. En otra realización, los oligonucleótidos comprenden ARN o derivados de éste. En una tercera realización, los oligonucleótidos son ADN modificados que comprenden un núcleo fosforotioato modificado. En una cuarta realización, las secuencias de oligonucleótido comprenden ácidos nucleicos peptídicos o derivados de estos. En cada caso, las composiciones preferidas comprenden una región de secuencia que es complementaria, y más preferiblemente sustancialmente complementaria, y aún más preferiblemente, completamente complementaria a una o más partes de los polinucleótidos descritos en la presente memoria. La selección de composiciones antisentido específicas para una secuencia génica dada se basa en el análisis de la secuencia diana elegida y en la determinación de la estructura secundaria, T_{m}, energía de unión y estabilidad relativa. Las composiciones antisentido pueden seleccionarse tomando como base su incapacidad relativa de formar dímeros, horquillas y otras estructuras secundarias que reducirían o prohibirían la unión específica al ARNm diana en una célula anfitriona. Las regiones diana altamente preferidas del ARNm, son aquellas que están en o cerca del codon de inicio de la traducción AUG, y aquellas secuencias que son sustancialmente complementarias a regiones 5' del ARNm. Estos análisis de estructura secundaria y consideraciones de la selección del sitio diana pueden realizarse, por ejemplo, utilizando v.4 del programa informático de análisis de cebadores OLIGO y/o el programa informático del algoritmo BLASTN 2.0.5 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997, 25(17):3389-402).
También se contempla la utilización de un método de administración antisentido que emplea como vector un péptido corto, denominado MPG (27 restos). El péptido MPG contiene un dominio hidrofóbico obtenido de la secuencia de fusión de gp41 de VIH y un dominio hidrofílico de la secuencia de localización nuclear del antígeno T de SV40 (Morris et al., Nucleic Acids Res. 1997 Jul 15;25(14):2370-6). Se ha demostrado que varias moléculas del péptido MPG recubren los oligonucleótidos antisentido y pueden administrarse a células de mamífero cultivadas en menos de 1 hora con una eficacia relativamente alta (90%). Además, la interacción con MPG incrementa mucho tanto la estabilidad del oligonucleótido frente a la nucleasa como la capacidad de atravesar la membrana plasmática.
Según otra realización de la invención, las composiciones de polinucleótidos descritas en la presente memoria se utilizan en el diseño y preparación de moléculas de ribozima para inhibir la expresión de los polipéptidos y proteínas de tumor de la presente invención en células tumorales. Las ribozimas son complejos de ARN-proteína que escinden los ácidos nucleicos de manera específica de sitio. Las ribozimas tienen dominios catalíticos específicos que poseen actividad endonucleasa (Kim y Cech, Proc Natl Acad Sci USA. 1987 Dic;84(24):8788-92; Forster y Symons, Cell. 1987 Abr 24;49(2):211-20). Por ejemplo, una gran número de ribozimas aceleran las reacciones de transferencia de fosfoéster con un alto grado de especificidad, escindiendo frecuentemente sólo uno de varios fosfoésteres en un sustrato oligonucleotídico (Cech et al., Cell. 1981 Dic;27(3 Pt 2):487-96; Michel y Westhof, J Mol Biol. 1990 Dic 5;216(3):585-610; Reinhold-Hurek y Schub, Nature. 1992 Mayo 14;357(6374):173-6). Esta especificidad se ha atribuido al requerimiento de que el sustrato se une mediante interacciones de emparejamiento de bases específicas a la secuencia guía interna ("IGS") de la ribozima antes de la reacción química.
Actualmente, se conocen seis variedades básicas de ARN enzimáticos naturales. Cada uno cataliza la hidrólisis de los enlaces fosfodiéster en trans del ARN (y así pueden escindir otras moléculas de ARN) en condiciones fisiológicas. En general, los ácidos nucleicos enzimáticos actúan uniéndose en primer lugar al ARN diana. Dicha unión ocurre a través de la parte de unión diana de un ácido nucleico enzimático que se encuentra muy próxima a una parte enzimática de la molécula que actúa escindiendo el ARN diana. Así, el ácido nucleico enzimático reconoce en primer lugar y después se une a un ARN diana a través de emparejamiento de bases complementarias, y una vez unido al sitio correcto, actúa enzimáticamente cortando el ARN diana. La escisión estratégica de dicho ARN diana destruirá su capacidad de dirigir la síntesis de una proteína codificada. Después de que un ácido nucleico enzimático se ha unido y ha escindido su ARN diana, se libera de dicho ARN para buscar otra diana y puede unirse y escindir repetidamente nuevas dianas.
La naturaleza enzimática de una ribozima es ventajosa sobre muchas tecnologías, tal como tecnología antisentido (en la que una molécula de ácido nucleico simplemente se une a un ácido nucleico diana para bloquear su traducción) ya que la concentración de ribozima necesaria para influir en un tratamiento terapéutico es menor que la de un oligonucleótido antisentido. Esta ventaja refleja la capacidad de la ribozima para actuar enzimaticamente. Así, una única molécula de ribozima es capaz de escindir muchas moléculas de ARN diana. Además, la ribozima es un inhibidor altamente específico, dependiendo la especificidad de la inhibición no sólo del mecanismo de emparejamiento de bases de la unión al ARN diana, sino también del mecanismo de escisión del ARN diana. Los emparejamientos erróneos únicos, o sustituciones de base, cerca del sitio de escisión pueden eliminar completamente la actividad catalítica de una ribozima. Los emparejamientos erróneos similares en moléculas antisentido no evitan su acción (Woolf et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Ago 15;89(16):7305-9). Así, la especificidad de acción de una ribozima es mayor que la de un oligonucleótido antisentido que se une al mismo sitio del ARN.
La molécula de ácido nucleico enzimático puede formarse en una cabeza de martillo, horquilla, un virus \delta de la hepatitis, intrón del grupo I o ARN ARNasaP (en asociación con una secuencia guía de ARN) o resto VS ARN de Neurospora. Los ejemplos de restos cabeza de martillo son descritos por Rossi et al. Nuclei Acids Res. 1992 Sep 11;20(17):4559-65. Los ejemplos de restos horquilla son descritos por Hampel et al. (Eur. Pat. Appl. Publ. No. EP 0360257), Hampel y Tritz, Biochemistry 1989 Jun 13;28(12):4929-33; Hampel et al., Nucleic Acids Res. 1990 Ene 25;18(2):299-304 y la Patente de EEUU 5.631.359. Un ejemplo del resto del virus \delta de la hepatitis es descrito por Perrotta y Been, Biochemistry. 1992 Dic 1;31(47):11843-52; un ejemplo del resto de ARNasaP es descrito por Guerrier-Takada et al., Cell. 1983 Dic;35(3 Pt 2):849-57; el resto de ARN de ribozima VS de Neurospora es descrito por Collins (Saville y Collins, Cell. 1990 Mayo 18;61(4):685-96; Saville y Collins, Proc Natl Acad Sci USA. 1991 Oct 1;88(19):8826-30; Collins y Olive, Biochemistry. 1993 Mar 23;32(11):2795-9); y un ejemplo del intrón del Grupo I se describe en (Patente de EEUU 4.987.071). Todo lo que es importante en una molécula de ácido nucleico enzimático de esta invención es que tenga un sitio de unión a un sustrato específico que es complementario a una o más de las regiones del ARN del gen diana, y que tenga secuencias de nucleótidos en o alrededor de ese sitio de unión al sustrato que confieran una actividad de escisión de ARN a la molécula. Así, las construcciones de ribozima no necesitan estar limitadas a los restos específicos mencionados en la presente memoria.
Las ribozimas pueden diseñarse como se describe en Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 93/23569 e Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 94/02595, incorporada cada una específicamente en la presente memoria por referencia) y sintetizarse para ensayarse in vitro e in vivo, como se describe. Dichas ribozimas también pueden optimizarse para la administración. Aunque se proporcionan ejemplos específicos, los expertos en la técnica reconocerán que cuando sea necesario pueden utilizarse ARN dianas equivalentes en otras especies.
La actividad ribozima puede optimizarse alterando la longitud de los brazos de unión de la ribozima, o sintetizando químicamente ribozimas con modificaciones que eviten su degradación por las ribonucleasas séricas (véanse, p. ej., Solic. Pat. Int. Pub. No. WO 92/07065; Solic. Pat. Int. Pub. No. WO 93/15187; Solic. Pat. Int. Pub. No. WO 91/03162; Solic. Pat. Eur. Pub. No. 92110298.4; Patente de EEUU 5.334.711; y Solic. Pat. Int. Pub. No. WO 94/13688, que describen varias modificaciones químicas que pueden hacerse a restos de azúcar de moléculas de ARN enzimático), modificaciones que incrementan su eficacia en las células, y eliminando las bases stem II para acortar los tiempos de síntesis del ARN y reducir los requerimientos químicos.
Sullivan et al. (Solic. Pat. Int. Pub. No. WO 94/02595) describe los métodos generales para la administración de moléculas de ARN enzimático. Las ribozimas pueden administrarse a las células mediante varios métodos conocidos para los expertos en la técnica, incluyendo, pero sin restringirse a, encapsulación en liposomas, por iontoforesis, o por incorporación en otros vehículos, tales como hidrogeles, ciclodextrinas, nanocápsulas biodegradables, y microesferas bioadhesivas. Para algunas indicaciones, las ribozimas pueden administrarse directamente ex vivo a células o tejidos con o sin los vehículos mencionados anteriormente. Alternativamente, la combinación ARN/vehículo puede administrarse localmente por inhalación directa, por inyección directa o mediante la utilización de un catéter, bomba de infusión o prótesis endovascular. Otras rutas de administración incluyen, pero no están limitadas a, inyección intravascular, intramuscular, subcutánea o articular, inhalación de aerosol, administración oral (forma de comprimido o pastilla), tópica, sistémica, ocular, intraperitoneal y/o intratecal. En Solic. Pat. Int. Pub. No. WO 94/02595 y en Solic. Pat. Int. Pub. No. WO 93/23569 se proporcionan descripciones más detalladas de la administración de ribozimas, cada una incorporada específicamente en la presente memoria por referencia.
Otro medio para acumular altas concentraciones de una o unas ribozimas en las células es incorporar las secuencias que codifican la ribozima en un vector de expresión de ADN. La transcripción de las secuencias de ribozima está dirigida desde un promotor para la ARN polimerasa I (poli I), ARN polimerasa II (pol II), o ARN polimerasa III (pol III) eucariotas. Los transcritos de los promotores de pol II o pol III se expresarán a altos niveles en todas las células; los niveles de un promotor pol II dado en un tipo de célula dado dependerán de la naturaleza de las secuencias reguladoras de los genes (amplificadores, silenciadores, etc.) que están presentes cerca. También pueden utilizarse promotores de ARN polimerasa procariotas, siempre que la enzima ARN polimerasa procariota se exprese en las células apropiadas. Se ha mostrado que las ribozimas expresadas a partir de dichos promotores funcionan en las células de mamífero. Dichas unidades de transcripción pueden incorporarse en una variedad de vectores para introducirse en células de mamífero, incluyendo pero sin restringirse a, vectores de ADN plasmídico, vectores de ADN viral (tales como vectores de adenovirus o adeno-asociados), o vectores de ARN viral (tales como vectores retrovirales, virus del bosque Semliki, virus sindbis).
En otra realización de la invención, se proporcionan composiciones de ácidos nucleicos peptídicos (PNA). PNA es un ADN mímico en el que las nucleobases están unidas a un núcleo pseudopeptídico (Good y Nielsen, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1997 7(4) 431-37). PNA se puede utilizar en varios métodos que tradicionalmente han utilizado ARN o ADN. Frecuentemente, las secuencias de PNA tienen un comportamiento mejor en las técnicas que las secuencias de ARN o ADN correspondientes y tienen utilidades que no son inherentes a ARN o ADN. Una revisión de PNA incluyendo métodos de preparación, sus características y métodos de utilización, se proporcionan por Corey (Trends Biotechnol 1997 Jun;15(6):224-9). Así, en determinadas realizaciones, se pueden preparar secuencias de PNA que son complementarias a una o más partes de la secuencia de ARNm de ACE, y dichas composiciones de PNA pueden utilizarse para regular, alterar, disminuir, o reducir la traducción del ARNm específico de ACE, y de esta manera alterar el nivel de actividad ACE en una célula anfitriona a la que se han administrado dichas composiciones de PNA.
Los PNA tienen uniones 2-aminoetil-glicina reemplazando el núcleo fosfodiéster normal del ADN (Nielsen et al., Science 1991 Dic 6;254(5037):1497-500; Hanvey et al., Science. 1992 Nov 27;258(5087):1481-5; Hyrup y Nielsen, Bioorg Med Chem. 1996 Ene;4(1):5-23). Esta química tiene tres consecuencias importantes: en primer lugar, a diferencia del ADN u oligonucleótidos fósforotioato, los PNA son moléculas neutras; en segundo lugar, los PNA son aquirales, lo que evita la necesidad de desarrollar una síntesis estereoselectiva; y en tercer lugar, la síntesis de PNA utiliza protocolos Boc o Fmoc estándar para la síntesis de péptidos en fase sólida, aunque se han utilizado otros métodos, incluyendo un método de Merrifield modificado.
Los monómeros de PNA o los oligómeros ya preparados están disponibles comercialmente en PerSeptive Biosystems (Framingham, MA). Las síntesis de PNA bien por protocolos Boc o Fmoc son sencillas utilizando protocolos manuales o automatizados (Norton et al., Bioorg Med Chem. 1995 Abr;3(4):437-45). El protocolo manual da lugar a la producción de PNA modificados químicamente o a la síntesis simultánea de familias de PNA muy relacionados.
Como ocurre con la síntesis de péptidos, el éxito de una síntesis particular de PNA dependerá de las propiedades de la secuencia elegida. Por ejemplo, aunque en teoría los PNA pueden incorporar cualquier combinación de bases de nucleótido, la presencia de purinas adyacentes puede dar lugar a deleciones de uno o más restos en el producto. Previendo esta dificultad, se sugiere que, en la producción de PNA con purinas adyacentes, se debería repetir el acoplamiento de restos que probablemente se añadirán de manera ineficaz. Después de esto los PNA se deberían purificar por cromatografía líquida de alta presión en fase inversa, proporcionando unos rendimientos y pureza del producto similares a los observados durante la síntesis de péptidos.
Las modificaciones de los PNA para una aplicación dada pueden conseguirse acoplando aminoácidos durante la síntesis en fase sólida o uniendo compuestos que contienen un grupo ácido carboxílico a la amina N-terminal expuesta. Alternativamente, los PNA pueden modificarse después de la síntesis por acoplamiento a una lisina o cisteína introducida. La facilidad con la que los PNA pueden modificarse facilita la optimización para una mejor solubilidad o para los requerimientos funcionales específicos. Una vez sintetizados, la identidad de los PNA y de sus derivados puede confirmarse por espectrometría de masas. Varios estudios han hecho y utilizado modificaciones de PNA (por ejemplo, Norton et al., Bioorg Med Chem. 1995 Abr;3(4):437-45; Petersen et al., J Pept Sci. 1995 Mayo-Jun;1(3):175-83; Orum et al., Biotechniques. 1995 Sep;19(3):472-80; Footer et al., Biochemistry. 1996 Ago 20;35(33):10673-9; Griffith et al., Nucleic Acids Res. 1995 Ago 11;23(15):3003-8; Pardridge et al., Proc Natl Acad Sci USA 1995 Jun 6;92(12):5592-6; Boffa et al., Proc Natl Acad Sci USA 1995 Mar 14;92(6):1901-5; Gambacorti-Passerini et al., Blood. 1996 Ago 15;88(4):1411-7; Armitage et al., Proc Natl Acad Sci USA 1997 Nov 11;94(23):12320-5; Seeger et al., Biotechniques. 1997 Sep;23(3):512-7). La Patente de EEUU No. 5.700.922 describe moléculas quiméricas PNA-ADN-PNA y sus utilizaciones en diagnóstico, en la modulación de proteínas en organismos, y en el tratamiento de condiciones susceptibles a terapéuticos.
Los métodos para caracterizar las propiedades de unión antisentido de los PNA se discuten en Rose (Anal Chem. 1993 Dic 15;65(24):3545-9) y Jensen et al. (Biochemistry. 1997 Abr 22;36(16):5072-7). Rose utiliza electroforesis capilar en gel para determinar la unión de los PNA a sus oligonucleótidos complementarios, midiendo las cinéticas y estequiometría de unión relativas. Jensen et al., hicieron tipos medidas similares utilizando tecnología BIAcore^{TM}.
Otras aplicaciones de los PNA que se han descrito y que serán evidentes para el experto en la técnica incluyen la utilización en la invasión de hebras de ADN, inhibición antisentido, análisis mutacional, amplificadores de la transcripción, purificación de ácidos nucleicos, aislamiento de genes transcripcionalmente activos, bloqueo de la unión de factores de transcripción, escisión genómica, biosensores, hibridación in situ, y semejantes.
Identificación, Caracterización y Expresión de Polinucleótidos
Las composiciones de polinucleótidos de la presente invención pueden identificarse, prepararse y/o manipularse utilizando cualquiera de las diferentes técnicas bien establecidas (véase en general, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989, y otras referencias semejantes). Por ejemplo, un polinucleótido puede identificarse, como se describe con más detalle más adelante, cribando una micromatriz de ADNc para detectar la expresión asociada a tumores (es decir, la expresión que es al menos dos veces mayor en un tumor que en un tejido normal, determinada utilizando un ensayo representativo proporcionado en la presente memoria). Dichos cribados pueden realizarse, por ejemplo, utilizando la tecnología de micromatriz de Affymetrix, Inc. (Santa Clara, CA) según las instrucciones del fabricante (y esencialmente como describen Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619, 1996 y Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155, 1997). Alternativamente, los polinucleótidos pueden amplificarse a partir de ADNc preparado a partir de células que expresan las proteínas descritas en la presente memoria, tal como células tumorales.
Muchos procesos dependientes de molde están disponibles para amplificar una secuencia diana de interés presente en una muestra. Uno de los métodos de amplificación más conocidos es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR^{TM}) que se describe con detalle en las Patentes de EEUU Nos. 4.683.195, 4.683.202 y 4.800.159. Brevemente, en la PCR^{TM}, se preparan dos secuencias cebadoras que son complementarias a regiones en hebras complementarias opuestas de la secuencia diana. Se añade a la mezcla de reacción un exceso de desoxinucleósido trifosfatos junto con una ADN polimerasa (p. ej., polimerasa Taq). Si la secuencia diana está presente en una muestra, los cebadores se unirán a la diana y la polimerasa hará que los cebadores se extiendan a lo largo de la secuencia diana mediante la adición de nucleótidos. Elevando y disminuyendo la temperatura de la mezcla de reacción, los cebadores extendidos se disociarán de la diana para formar productos de la reacción, los cebadores en exceso se unirán a la diana y al producto de la reacción y el proceso se repite. Preferiblemente, puede realizarse el procedimiento de transcripción inversa y de amplificación por PCR^{TM} con el fin de cuantificar la cantidad de ARNm amplificado. Las metodologías de la reacción en cadena de la polimerasa son muy conocidas en la técnica.
Varios procesos dependientes de molde adicionales, muchos de los cuales son variaciones de la técnica de amplificación por PCR^{TM}, son muy conocidos y están disponibles en la técnica. De manera ilustrativa, algunos de dichos métodos incluyen la reacción en cadena de la ligasa (referida como LCR), descrita, por ejemplo, en Solic. Pat. Eur. Publ. No. 320.308 y en la Patente de EEUU No. 4.883.750; Replicasa Qbeta, descrita en PCT Solic. Pat. Int. Publ. No. PCT/US87/00880; Amplificación por Desplazamiento de Hebra (SDA) y Reacción de Reparación de Cadena (RCR). Otros métodos de amplificación más se describen en Gran Bretaña Solic. Pat. No. 2.202.328, y en PCT Solic. Pat. Int. Publ. No. PCT/US89/01025. Otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos incluyen sistemas de amplificación basados en la transcripción (TAS) (PCT Solic. Pat. Int. Publ. No. WO 88/10315), incluyendo amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA) y 3SR. La Solic. Pat. Eur. Publ. No. 329.822 describe un proceso de amplificación de ácidos nucleicos que implica sintetizar cíclicamente ARN de una hebra ("ARNss"), ADNss, y ADN de doble hebra (ADNds). La PCT Solic. Pat. Int. Publ. No. WO 89/06700 describe un esquema de amplificación de secuencia de ácido nucleico basado en la hibridación de una secuencia promotora/cebadora con un ADN de una hebra ("ADNss") diana seguido de la transcripción de muchas copias de ARN de la secuencia. Otros métodos de amplificación tales como "RACE" (Frohman, 1990), y "PCR anclada" (Ohara, 1989) también son muy conocidos para los expertos en la técnica.
Puede utilizarse una parte amplificada de un polinucleótido de la presente invención para aislar un gen de longitud completa a partir de una biblioteca adecuada (p. ej., una biblioteca de ADNc tumoral) utilizando técnicas muy conocidas. En dichas técnicas, se criba una biblioteca (ADNc o genómico) utilizando una o más sondas o cebadores polinucleotídicos adecuados para la amplificación. Preferiblemente, se selecciona una biblioteca por tamaño para incluir moléculas más largas. También pueden preferirse bibliotecas con cebado aleatorio para identificar regiones de genes en 5' y antes del extremo 5'. Se prefieren las bibliotecas genómicas para obtener intrones y secuencias que se extienden en 5'.
Para las técnicas de hibridación, puede marcarse una secuencia parcial (p. ej., por desplazamiento de mella o marcaje terminal con ^{32}P) utilizando técnicas muy conocidas. Entonces, se criba generalmente una biblioteca bacteriana o de bacteriófagos hibridando filtros que contienen colonias bacterianas desnaturalizadas (o calvas que contienen placas de fago) con la sonda marcada (véase Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Las colonias o placas hibridadas se seleccionan y expanden, y se aísla el ADN para análisis adicionales. Los clones de ADNc pueden analizarse para determinar la cantidad de secuencia adicional, por ejemplo, por PCR utilizando un cebador de la secuencia parcial y un cebador del vector. Pueden generarse mapas de restricción y secuencias parciales para identificar uno o más clones superpuestos. La secuencia completa puede determinarse entonces utilizando técnicas estándar, que pueden implicar la generación de una serie de clones de deleción. Las secuencias superpuestas resultantes pueden ensamblarse en una única secuencia contigua. Puede generarse una molécula de ADNc de longitud completa ligando fragmentos adecuados, utilizando técnicas muy conocidas.
Alternativamente, las técnicas de amplificación, tales como las descritas anteriormente, pueden ser útiles para obtener una secuencia codificadora de longitud completa a partir de una secuencia parcial de ADNc. Una de dichas técnicas de amplificación es PCR inversa (véase Triglia et al., Nucl. Acids Res. 16:8186, 1988), que utiliza enzimas de restricción para generar un fragmento en la región conocida del gen. El fragmento se circulariza por ligadura intramolecular y se utiliza como un molde para PCR con cebadores divergentes obtenidos de la región conocida. En un método alternativo, las secuencias adyacentes a una secuencia parcial pueden recogerse por amplificación con un cebador para una secuencia conectora y un cebador específico para una región conocida. Las secuencias amplificadas se someten típicamente a un segundo ciclo de amplificación con el mismo cebador del conector y un segundo cebador específico de la región conocida. Una variación de este procedimiento, que emplea dos cebadores que inician la extensión en direcciones opuestas de la secuencia conocida, se describe en WO 96/38591. Otra técnica como ésta se conoce como "amplificación rápida de extremos de ADNc" o RACE. Esta técnica implica la utilización de un cebador interno y un cebador externo, que hibrida con una región poliA o secuencia de vector, para identificar secuencias que están en 5' y 3' de una secuencia conocida. Las técnicas adicionales incluyen PCR de captura (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1:111-19, 1991) y reacciones solapantes de PCR (Parker et al., Nucl. Acids Res. 19:3055-60, 1991). También pueden emplearse otros métodos que emplean amplificación para obtener una secuencia de ADNc de longitud completa.
En determinados casos, es posible obtener una secuencia de ADNc de longitud completa por análisis de secuencias proporcionadas en una base de datos de etiquetas de secuencia expresada (EST), tal como la disponible en GenBank. Las búsquedas de EST superpuestas pueden realizarse generalmente utilizando programas muy conocidos (p. ej., búsquedas NCBI BLAST), y dichas EST pueden utilizarse para generar una secuencia de longitud completa contigua. También pueden obtenerse secuencias de ADN de longitud completa por análisis de fragmentos genómicos.
En otras realizaciones de la invención, pueden utilizarse secuencias de polinucleótido o fragmentos de éstos que codifican polipéptidos de la invención, o proteínas de fusión o equivalentes funcionales de éstas, en moléculas de ADN recombinante para dirigir la expresión de un polipéptido en células anfitrionas apropiadas. Debido a la degeneración inherente del código genético, pueden producirse otras secuencias de ADN que codifican sustancialmente la misma o una secuencia de aminoácidos funcionalmente equivalente y estas secuencias pueden utilizarse para clonar y expresar un polipéptido dado.
Como entenderán los expertos en la técnica, puede ser ventajoso en algunos casos producir secuencias de nucleótido que codifican un polipéptido que posean codones no naturales. Por ejemplo, los codones preferidos por un anfitrión procariota o eucariota particular pueden seleccionarse para incrementar la velocidad de la expresión de las proteínas o para producir un transcrito de ARN recombinante que tiene propiedades deseadas, tales como una vida media que es más larga que la de un transcrito generado a partir de la secuencia natural.
Más aún, las secuencias de polinucleótido de la presente invención pueden obtenerse por ingeniería utilizando método conocidos generalmente en la técnica con el fin de alterar secuencias que codifican polipéptidos por varias razones, incluyendo pero sin limitarse a, alteraciones que modifican la clonación, el procesamiento y/o la expresión del producto génico. Por ejemplo, puede utilizarse transposición de secuencias de ADN por fragmentación aleatoria y reensamblaje por PCR de los fragmentos génicos y oligonucleótidos sintéticos para obtener por ingeniería las secuencias de nucleótido. Además, puede utilizarse mutagénesis específica de sitio para insertar sitios de restricción nuevos, alterar patrones de glicosilación, cambiar la preferencia de codones, producir variantes de corte y empalme, o introducir mutaciones, etcétera.
En otra realización de la invención, pueden ligarse secuencias de ácido nucleico naturales, modificadas o recombinantes a una secuencia heteróloga para codificar una proteína de fusión. Por ejemplo, el cribado de bibliotecas de péptidos para detectar inhibidores de la actividad del polipéptido, puede ser útil para codificar una proteína quimérica que pueda ser reconocida por un anticuerpo disponible comercialmente. Una proteína de fusión también puede obtenerse por ingeniería de manera que contenga un sitio de escisión localizado entre la secuencia de codifica el polipéptido y la secuencia de proteína heteróloga, de forma que el polipéptido puede ser escindido y purificado aparte del resto heterólogo.
Las secuencias que codifican un polipéptido deseado pueden sintetizarse, completamente o en parte, utilizando métodos químicos muy conocidos en la técnica (véanse Caruthers, M.H. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, Horn, T. et al. (1980) Nucl. Acid Res. Symp. Ser. 225-232). Alternativamente, puede producirse la proteína en sí misma utilizando métodos químicos para sintetizar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido, o una parte de éste. Por ejemplo, la síntesis del péptido puede realizarse utilizando varias técnicas de fase sólida (Roberge, J.Y. et al. (1995) Science 269:202-204) y puede conseguirse la síntesis automatizada, por ejemplo, utilizando el Sintetizador de Péptidos ABI 431A (Perkin Elemer, Palo Alto, CA).
Un péptido sintetizado de nuevas puede purificarse sustancialmente por cromatografía líquida de alta resolución preparativa (p. ej., Creighton, T. (1983) Proteins, Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., Nueva York, N.Y.) u otras técnicas comparables disponibles en la técnica. La composición de los péptidos sintéticos puede confirmarse por análisis o secuenciación de aminoácidos (p. ej., el procedimiento de degradación de Edman). Adicionalmente, la secuencia de aminoácidos de un polipéptido, o cualquier parte de éste, puede alterarse durante la síntesis directa y/o combinarse utilizando métodos químicos con secuencias de otras proteínas, o cualquier parte de estas, para producir un polipéptido variante.
Con el fin de expresar un polipéptido deseado, las secuencias de nucleótido que codifican el polipéptido, o equivalentes funcionales, pueden insertarse en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificadora insertada. Pueden utilizarse los métodos que son muy conocidos por los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contienen secuencias que codifican un polipéptido de interés y elementos de control de la transcripción y de la traducción apropiados. Estos métodos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación genética in vivo. Dichas técnicas se describen, por ejemplo, en Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. y Ausubel, F.M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y.
Puede utilizarse una variedad de sistemas de vector de expresión/anfitrión para contener y expresar secuencias de polinucleótido. Éstos incluyen, pero no están limitados a, microorganismos tales como bacterias transformadas con vectores de expresión de ADN recombinante de bacteriófago, plásmido o cósmido; levaduras transformadas con vectores de expresión de levaduras; sistemas de células de insectos infectadas con vectores de expresión de virus (p. ej., baculovirus); sistemas de células de plantas transformadas con vectores de expresión de virus (p. ej., virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacterianos (p. ej., plásmidos Ti o pBR322); o sistemas de células animales.
Los "elementos de control" o "secuencias reguladoras" presentes en un vector de expresión son aquellas regiones no traducidas del vector-amplificadores, promotores, regiones en 5' y 3' no traducidas- que interaccionan con las proteínas celulares del anfitrión para llevar a cabo la transcripción y la traducción. Dichos elementos pueden tener una fuerza y especificidad variadas. Dependiendo del sistema de vector y anfitrión utilizado, pueden utilizarse muchos elementos de transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, pueden utilizarse promotores inducibles tal como el promotor híbrido de lacZ del fagémido PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, Calif.) o el plásmido PSPORT1 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) y semejantes. En los sistemas de células de mamíferos, se prefieren generalmente los promotores de genes de mamífero o de virus de mamífero. Si es necesario general una línea celular que contiene múltiples copias de la secuencia que codifica un polipéptido, pueden utilizarse ventajosamente los vectores basados en SV40 o EBV con un marcador seleccionable adecuado.
En los sistemas bacterianos, pueden seleccionarse muchos vectores de expresión dependiendo de la utilización pretendida para el polipéptido expresado. Por ejemplo, cuando se necesitan grandes cantidades, por ejemplo para la inducción de anticuerpos, pueden utilizarse vectores que dirigen un nivel alto de expresión de proteínas de fusión que se purifican fácilmente. Dichos vectores incluyen, pero no están limitados a, los vectores multifuncionales de clonación y expresión de E. coli tal como BLUESCRIPT (Stratagene), en los que la secuencia que codifica el polipéptido de interés puede estar ligada en el vector en marco con secuencias para la Met amino-terminal y los 7 restos posteriores de beta-galactosidasa de manera que se produce una proteína híbrida; vectores pIN (Van Heeke, G. y S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509); y semejantes. También pueden utilizarse los vectores pGEX (Promega, Madison, Wis.) para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con la glutatión S-transferasa (GST). En general, dichas proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de células lisadas por adsorción a lechos de glutatión-agarosa seguido de elución en presencia de glutatión libre. Las proteínas obtenidas en dichos sistemas pueden diseñarse para incluir sitios de escisión de proteasa de heparina, trombina, o factor XA de manera que el polipéptido de interés clonado puede liberarse del resto GST cuando se
desee.
En la levadura, Saccharomyces cerevisiae, pueden utilizarse varios vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles tales como factor alfa, alcohol oxidasa y PGH. Para revisiones, véanse Ausubel et al. (supra) y Grant et al. (1987) Methods Enzymol. 153:516-544.
En los casos en los que se utilizan vectores de expresión de plantas, la expresión de las secuencias que codifican polipéptidos puede estar dirigida por muchos promotores. Por ejemplo, pueden utilizarse promotores virales tales como los promotores 35S y 19S de CaMV solos o en combinación con la secuencia líder omega de TMV (Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311. Alternativamente, pueden utilizarse promotores de plantas tales como la subunidad pequeña de RUBISCO o promotores de choque térmico (Coruzzi, G. et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R. et al. (1984) Science 224:838-843; y Winter, J. et al. (1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105). Estas construcciones pueden introducirse en las células de las plantas por transformación directa con ADN o transfección mediada por patógeno. Dichas técnicas se describen en varias revisiones disponibles generalmente (véase, por ejemplo, Hobbs,S. o Murry, L.E. en McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, Nueva York, N.Y.; p. 191-196).
También puede utilizarse un sistema de insectos para expresar un polipéptido de interés. Por ejemplo, en uno de dichos sistemas, se utiliza el virus de polihedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar genes extraños en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. Las secuencias que codifican el polipéptido pueden clonarse en una región no esencial del virus, tal como el gen de polihedrina, y ponerse bajo el control del promotor de polihedrina. La inserción exitosa de la secuencia que codifica el polipéptido dará lugar al gen de polihedrina inactivo y producirá virus recombinantes que carecen de la proteína de la envoltura. Los virus recombinantes pueden utilizarse para infectar, por ejemplo, células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en las que el polipéptido de interés puede expresarse (Engelhard, E.K. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:3224-3227).
En células anfitrionas de mamífero, están disponibles varios sistemas de expresión basados en virus. Por ejemplo, en los casos en los que se utiliza un adenovirus como vector de expresión, las secuencias que codifican un polipéptido de interés pueden ligarse a un complejo transcripción/traducción de un adenovirus que consiste en la secuencia del promotor tardío y el líder tripartito. Puede utilizarse la inserción en una región no esencial E1 o E3 del genoma viral para obtener un virus viable que es capaz de expresar el polipéptido en células anfitrionas infectadas (Logan, J. y Schenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659). Además, pueden utilizarse amplificadores de la transcripción, tal como el amplificador del virus del sarcoma de Rous (RSV), para incrementar la expresión en células anfitrionas de mamífero.
También pueden utilizarse señales de inicio específicas para conseguir una traducción más eficaz de las secuencias que codifican un polipéptido de interés. Dichas señales incluyen el codon de inicio ATG y secuencias adyacentes. En los casos en los que las secuencias que codifican el polipéptido, su codon de inicio, y secuencias antes del extremo 5' se insertan en el vector de expresión apropiado, pueden no ser necesarias señales adicionales de control de la transcripción o la traducción. Sin embargo, en los casos en los que sólo se inserta la secuencia codificadora, o una parte de ésta, deben proporcionarse señales de control de la traducción exógenas incluyendo el codon de inicio ATG. Además, el codon de inicio debe estar en el marco de lectura correcto para asegurar la traducción del inserto completo. Los elementos de la traducción y los codones de inicio exógenos pueden tener varios orígenes, tanto natural como sintético. La eficacia de la expresión puede amplificarse mediante la inclusión de amplificadores que son apropiados para el sistema celular particular que se utiliza, tales como los descritos en la bibliografía (Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162).
Además, puede elegirse una cepa celular anfitriona por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar la proteína expresada en la forma deseada. Dichas modificaciones del polipéptido incluyen, pero no están limitadas a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación, y acilación. También puede utilizarse un procesamiento posterior a la traducción que escinde una forma "prepro" de la proteína para facilitar la inserción, plegamiento y/o función correcta. Pueden elegirse diferentes células anfitrionas tales como CHO, COS, HeLa, MDCK, HEK293, y WI38, que tienen una maquinaria celular específica y mecanismos característicos para dichas actividades posteriores a la traducción, para asegurar la modificación y procesamiento correctos de la proteína extraña.
Para una producción a largo plazo y con un rendimiento alto de las proteínas recombinantes, se prefiere generalmente una expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan de manera estable un polinucleótido de interés pueden transformarse utilizando vectores de expresión que pueden contener orígenes virales de replicación y/o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable en el mismo vector o en otro vector. Después de la introducción del vector, puede permitirse crecer a las células durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de cambiarlas a un medio selectivo. El propósito del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y la recuperación de las células que expresan exitosamente las secuencias introducidas. Los clones resistentes de células trasformadas de manera estable pueden proliferar utilizando técnicas de cultivo de tejidos apropiadas para el tipo de célula.
Pueden utilizarse varios sistemas de selección para recuperar las líneas celulares transformadas. Estos incluyen, pero no están limitados a, los genes de la timidina quinasa del virus del herpes simplex (Wigler, M. et al. (1977) Cell 11:223-32) y de la adenina fosforibosiltransferasa (Lowy, I. et al. (1990) Cell 22:817-23) que pueden emplearse en células tk.sup.- o aprt.sup.-, respectivamente. También puede utilizarse resistencia a antimetabolitos, antibióticos o herbicidas como base para la selección; por ejemplo, dhfr que confiere resistencia a metotrexato (Wigler, M. et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70); npt, que confiere resistencia a aminoglicósidos, neomicina y G-418 (Colbere-Garapin, F. et al (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14); y als o pat, que confieren resistencia a clorsulfurón y fosfinotricina acetiltransferasa, respectivamente (Murray, supra). Se han descrito genes seleccionables adicionales, por ejemplo, trpB, que permite a las células utilizar indol en lugar de triptófano, o hisD, que permite a las células utilizar histinol en lugar de histidina (Hartman, S.C. y R.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51). La utilización de marcadores visibles ha ganado popularidad utilizándose ampliamente marcadores tales como antocianinas, beta-glucuronidasa y su sustrato GUS, y luciferasa y su sustrato luciferina, no sólo para identificar transformantes, sino también para cuantificar la cantidad de expresión transitoria o estable de la proteína atribuíble a un sistema de vector específico (Rhodes, C.A. et al. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131).
Aunque la presencia/ausencia de la expresión del gen marcador sugiere que el gen de interés está también presente, se necesita confirmar su presencia y expresión. Por ejemplo, si la secuencia que codifica un polipéptido se inserta en una secuencia del gen marcador, las células recombinantes que contienen secuencias pueden identificarse por la ausencia de la función del gen marcador. Alternativamente, un gen marcador puede ponerse en tándem con una secuencia que codifica un polipéptido bajo el control de un único promotor. La expresión del gen marcador en respuesta a la inducción o selección indica asimismo habitualmente la expresión del gen en tándem.
Alternativamente, las células anfitrionas que contienen y expresan una secuencia de polinucleótido deseada pueden identificarse mediante una variedad de procedimientos conocidos para los expertos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, hibridaciones ADN-ADN o ADN-ARN y técnicas de bioensayo o inmunoensayo de proteínas que incluyen, por ejemplo, tecnologías basadas en membranas, disolución o chip para la detección y/o cuantificación de ácidos nucleicos o proteínas.
En la técnica se conocen varios protocolos para detectar y medir la expresión de productos codificados por polinucleótidos, utilizando anticuerpos policlonales o monoclonales específicos del producto. Los ejemplos incluyen ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y separación de células activada por fluorescencia (FACS). Para algunas aplicaciones, puede preferirse un inmunoensayo de dos sitios con base monoclonal utilizando anticuerpos monoclonales reactivos frente a dos epítopos que no interfieren en un polipéptido dado, aunque también puede emplearse un ensayo de unión competitiva. Estos y otros ensayos se describen, entre otros sitios, en Hampton, R. et al. (1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul. Minn.) y Maddox, D.E. et al. (1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216).
Los expertos en la técnica conocen una amplia variedad de marcadores y técnicas de conjugación y pueden utilizarse en varios ensayos de ácidos nucleicos y aminoácidos. Los medios para producir sondas marcadas de hibridación o PCR para detectar secuencias relacionadas con polinucleótidos incluyen oligomarcaje, desplazamiento de mella, marcaje terminal o amplificación por PCR utilizando un nucleótido marcado. Alternativamente, las secuencias, o cualquier parte de éstas, puede clonarse en un vector para la producción de una sonda de ARNm. Dichos vectores son conocidos en la técnica, están disponibles comercialmente, y pueden utilizarse para sintetizar sondas de ARN in vitro mediante la adición de una ARN polimerasa apropiada tal como T7, T3 o SP6 y nucleótidos marcados. Estos procedimientos pueden realizarse utilizando una variedad de kits disponibles comercialmente. Las moléculas o marcadores informadores, que pueden utilizarse incluyen radionúclidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogénicos así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas, y semejantes.
Las células anfitrionas transformadas con una secuencia de polinucleótido de interés pueden cultivarse en condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína a partir del cultivo celular. La proteína producida por una célula recombinante puede secretarse o estar contenida intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o del vector utilizado. Como entenderán los expertos en la técnica, los vectores de expresión que contienen los polinucleótidos de la invención pueden diseñarse para contener secuencias señal que dirigen la secreción del polipéptido codificado a través de una membrana celular procariota o eucariota. Pueden utilizarse otras construcciones recombinantes para unir las secuencias que codifican un polipéptido de interés con una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio polipeptídico que facilitará la purificación de las proteínas solubles. Dichos dominios que facilitan la purificación incluyen, pero no están limitados a, péptidos quelantes de metales tal como módulos histidina-triptófano que permiten la purificación en metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación en inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de purificación FLAGS de extensión/afinidad (Immunex Corp., Seattle, Wash.). La inclusión de secuencias conectoras escindibles tales como las específicas para el Factor XA o enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, Calif.) entre el dominio de purificación y el polipéptido codificado puede utilizarse para facilitar la purificación. Uno de dichos vectores de expresión proporciona la expresión de una proteína de fusión que contiene un polipéptido de interés y un ácido nucleico que codifica 6 restos de histidina anteriores a un sitio de escisión de tioredoxina o enteroquinasa. Los restos de histidina facilitan la purificación en IMIAC (cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados) como se describe en Porath, J. et al. (1992, Prot. Exp. Purif. 3:263-281) mientras que el sitio de escisión de enteroquinasa proporciona un medio para purificar el polipéptido deseado a partir de la proteína de fusión. Una discusión de los vectores que contienen proteínas de fusión se proporciona en Kroll, D.J. et al. (1993; DNA Cell Biol. 12:441-453).
Además de los métodos de producción recombinantes, los polipéptidos de la invención, y fragmentos de estos, pueden producirse por síntesis peptídica directa utilizando técnicas de fase sólida (Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154). La síntesis proteica puede realizarse utilizando técnicas manuales o automatizadas. La síntesis automatizada puede conseguirse, por ejemplo, utilizando el Sintetizador de Péptidos 431A de Applied Biosystems (Perkin Elmer). Alternativamente, varios fragmentos pueden sintetizarse químicamente por separado y combinarse utilizando métodos químicos para producir la molécula de longitud completa.
Composiciones de Anticuerpos, Fragmentos de Estos y Otros Agentes de Unión
Según otro aspecto, la presente invención proporciona además agentes de unión, tales como anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos de estos, que presentan unión inmunológica a un polipéptido tumoral descrito en la presente memoria, o a una parte, variante o derivado de éste. Se dice que un anticuerpo, o fragmento de unión a antígenos de éste, "se une específicamente", "se une inmunológicamente" y/o es "inmunológicamente reactivo" frente a un polipéptido de la invención si reacciona a un nivel detectable (por ejemplo, en un ensayo ELISA) con el polipéptido, y no reacciona de manera detectable con polipéptidos no relacionados en condiciones similares.
La unión inmunológica, tal y como se utiliza en este contexto, se refiere generalmente a las interacciones no covalentes del tipo que ocurren entre una molécula de inmunoglobulina y un antígeno para el que la inmunoglobulina es específica. La fuerza, o afinidad de las interacciones de unión inmunológicas puede expresarse en términos de la constante de disociación (K_{d}) de la interacción, en la que una K_{d} pequeña representa una mayor afinidad. Las propiedades de la unión inmunológica de polipéptidos seleccionados puede cuantificarse utilizando métodos muy conocidos en la técnica. Uno de dichos métodos implica medir las velocidades de la formación y disociación del complejo sitio de unión al antígeno/antígeno, en el que las velocidades dependen de las concentraciones de las parejas del complejo, de la afinidad de la interacción, y de parámetros geométricos que influyen de la misma manera en la velocidad en ambas direcciones. Así, tanto la "constante de la velocidad de asociación" (K_{on}) como la "constante de la velocidad de disociación" (K_{off}) puede determinarse calculando las concentraciones y velocidades reales de asociación y disociación. La proporción K_{off}/K_{on} permite la cancelación de todos los parámetros no relacionados con la afinidad, y es así igual a la constante de disociación K_{d}. Véase, en general, Davies et al. (1990) Annual Rev. Biochem. 59:439-473.
Un "sitio de unión al antígeno", o "parte de unión" de un anticuerpo se refiere a la parte de la molécula de inmunoglobulina que participa en la unión al antígeno. El sitio de unión al antígeno está formado por los restos de aminoácidos de las regiones variables ("V") N-terminales de las cadenas pesadas ("H") y ligeras ("L"). Tres cadenas altamente divergentes en las regiones V de las cadenas pesadas y ligeras son referidas como "regiones hipervariables" que están interpuestas entre cadenas flanqueadoras más conservadas conocidas como "regiones marco", o "FR". Así, el término "FR" se refiere a secuencias de aminoácidos que se encuentran naturalmente entre y adyacentes a regiones hipervariables en las inmunoglobulinas. En una molécula de anticuerpo, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera y las tres regiones hipervariables de una cadena pesada están dispuestas una respecto a la otra tridimensionalmente para formar una superficie de unión al antígeno. La superficie de unión al antígeno es complementaria a la superficie tridimensional de un antígeno unido, y las tres regiones hipervariables de cada una de las cadenas pesada y ligera son referidas como "regiones determinantes de la complementariedad", o "CDR".
Los agentes de unión pueden ser además capaces de diferenciar entre pacientes con o sin cáncer, tal como cáncer de pulmón, utilizando ensayos representativos proporcionados en la presente memoria. Por ejemplo, los anticuerpos u otros agentes de unión que se unen a una proteína tumoral generarán preferiblemente una señal que indica la presencia de un cáncer en al menos aproximadamente 20% de los pacientes con la enfermedad, más preferiblemente al menos aproximadamente 30% de los pacientes. Alternativamente, o además, el anticuerpo generará una señal negativa que indica la ausencia de la enfermedad en al menos aproximadamente 90% de los individuos sin cáncer. Para determinar si un agente de unión satisface este requerimiento, pueden ensayarse muestras biológicas (p. ej., sangre, suero, esputo, orina y/o biopsias tumorales) de pacientes con y sin un cáncer (determinado utilizando ensayos clínicos estándar) como se describe en la presente memoria para determinar la presencia de polipéptidos que se unen al agente de unión. Preferiblemente, se ensayará un número estadísticamente significativo de muestras con y sin la enfermedad. Cada agente de unión debe satisfacer los criterios anteriores; sin embargo, los expertos en la técnica reconocerán que los agentes de unión pueden utilizarse en combinación para mejorar la sensibilidad.
Cualquier agente que satisfaga los requerimientos anteriores puede ser un agente de unión. Por ejemplo, un agente de unión puede ser un ribosoma, con o sin un componente peptídico, una molécula de ARN o un polipéptido. En una realización preferida, un agente de unión es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígenos de éste. Los anticuerpos pueden prepararse mediante una variedad de técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Véase, p. ej., Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. En general, los anticuerpos pueden producirse por técnicas de cultivo celular, incluyendo la generación de anticuerpos monoclonales como se describe en la presente memoria, o mediante la transfección de genes de anticuerpos en células anfitrionas bacterianas o de mamíferos adecuadas, con el fin de permitir la producción de anticuerpos recombinantes. En una técnica, un inmunógeno que comprende el polipéptido se inyecta inicialmente en uno cualquiera de una amplia variedad de mamíferos (p. ej., ratones, ratas, conejos, ovejas o cabras). En esta etapa, los polipéptidos de esta invención pueden servir como el inmunógeno sin modificación. Alternativamente, particularmente para polipéptidos relativamente cortos, puede incitarse una respuesta inmune superior si el polipéptido se une a una proteína transportadora, tal como albúmina de suero bovino o hemocianina de lapa. El inmunógeno se inyecta en el anfitrión animal, preferiblemente según un esquema predeterminado que incorpora una o más inmunizaciones de refuerzo, y los animales se sangran periódicamente. Los anticuerpos policlonales específicos para el polipéptido pueden purificarse a partir de dichos antisueros, por ejemplo, por cromatografía de afinidad utilizando el polipéptido acoplado a un soporte sólido adecuado.
Los anticuerpos monoclonales específicos para un polipéptido antigénico de interés pueden prepararse, por ejemplo, utilizando la técnica de Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976, y las mejoras de ésta. Brevemente, estos métodos implican la preparación de líneas celulares inmortales que son capaces de producir anticuerpos que tienen la especificidad deseada (es decir, reactividad con el polipéptido de interés). Dichas líneas celulares pueden producirse, por ejemplo, a partir de células de bazo obtenidas de un animal inmunizado como se ha descrito anteriormente. Las células de bazo se inmortalizan, por ejemplo, por fusión con una célula de mieloma como pareja de fusión, preferiblemente una que es singénica con el animal inmunizado. Puede emplearse una variedad de técnicas de fusión. Por ejemplo, las células de bazo y las células de mieloma pueden combinarse con un detergente no iónico durante unos pocos minutos y plaquearse a baja densidad en un medio selectivo que permita el crecimiento de las células híbridas, pero no de las células de mieloma. Una técnica de selección preferida utiliza selección HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Después de un tiempo suficiente, habitualmente aproximadamente 1 a 2 semanas), se observan las colonias de híbridos. Se seleccionan colonias independientes y sus sobrenadantes de cultivo se ensayan para detectar actividad de unión frente al polipéptido. Se prefieren los hibridomas que tienen una alta reactividad y especificidad.
Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse a partir de los sobrenadantes de colonias de hibridoma en crecimiento. Además, pueden emplearse varias técnicas para incrementar el rendimiento, tal como inyección de la línea celular de hibridoma en la cavidad peritoneal de un anfitrión vertebrado adecuado, tal como un ratón. Los anticuerpos monoclonales pueden recogerse del fluido ascítico o de la sangre. Los contaminantes pueden eliminarse de los anticuerpos por técnicas convencionales, tales como cromatografía, filtración en gel, precipitación, y extracción. Los polipéptidos de esta invención pueden utilizarse en el proceso de purificación, por ejemplo, en una etapa de cromatografía de afinidad.
En la técnica se conocen varias moléculas terapéuticamente útiles que comprenden sitios de unión a antígenos que son capaces de presentar propiedades de unión inmunológica de una molécula de anticuerpo. La enzima proteolítica papaína escinde preferentemente moléculas de IgG para rendir varios fragmentos, dos de los cuales (los fragmentos "F(ab)") comprenden cada uno un heterodímero covalente que incluye un sitio de unión a antígenos intacto. La enzima pepsina es capaz de escindir moléculas de IgG para proporcionar varios fragmentos, incluyendo el fragmento "F(ab')_{2}" que comprende los dos sitios de unión a antígenos. Un fragmento "Fv" puede producirse por la escisión proteolítica preferencial de una IgM, y en raras ocasiones una molécula de inmunoglobulina IgG o IgA. Los fragmentos Fv se obtienen, sin embargo, más habitualmente utilizando técnicas recombinantes conocidas en la técnica. El fragmento Fv incluye un heterodímero no covalente V_{H}::V_{L} que incluye un sitio de unión a antígenos que retiene muchas de las capacidades de reconocimiento y unión a antígenos de la molécula de anticuerpo nativa. Inbar et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2659-2662; Hochman et al. (1976) Biochem. 15:2706-2710; y Ehrlich et al. (1980) Biochem 19:4091-4096.
Un polipéptido de cadena única Fv ("Fvs") es un heterodímero V_{H}::V_{L} unido covalentemente que se expresa a partir de una fusión génica que incluye los genes que codifican V_{H} y V_{L} unidos por un conector que codifica un péptido. Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(16):5879-5883. Se han descrito varios métodos para discernir las estructuras químicas para convertir las cadenas de polipéptido ligera y pesada agregadas naturalmente-pero químicamente separadas- de una región V de un anticuerpo en una molécula Fvs que se plegará en una estructura tridimensional sustancialmente similar a la estructura de un sitio de unión a antígenos. Véanse, p. ej., Pat. de EEUU Nos. 5.091.513 y 5.132.405, de Huston et al.; y Pat. de EEUU No. 4.946.778, de Ladner et al.
Cada una de las moléculas descritas anteriormente incluye un conjunto de CDR de la cadena pesada y de la cadena ligera, interpuesto respectivamente entre un conjunto de FR de la cadena pesada y de la cadena ligera que proporciona soporte a la CDR y define la relación espacial de las CDR unas respecto a las otras. Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "conjunto de CDR" se refiere a las tres regiones hipervariables de una región V de cadena pesada o cadena ligera. A partir del extremo N-terminal de una cadena pesada o ligera, estas regiones se indican como "CDR1", "CDR2", y "CDR3", respectivamente. Un sitio de unión a antígenos incluye, por lo tanto, seis CDR, que comprende el conjunto de CDR de cada una de las regiones V de una cadena pesada y ligera. Un polipéptido que comprende una única CDR, (p. ej., una CDR1, CDR2 o CDR3) se refiere en la presente memoria como una "unidad de reconocimiento molecular". El análisis cristalográfico de varios complejos antígeno-anticuerpo ha demostrado que los restos de aminoácidos de las CDR forman un amplio contacto con el antígeno unido, en el que el contacto más amplio con el antígeno es con CDR3 de la cadena pesada. Así, las unidades de reconocimiento molecular son las principalmente responsables de la especificidad de un sitio de unión a antígenos.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término conjunto de "FR" se refiere a las cuatro secuencias de aminoácidos flanqueadoras que enmarcan las CDR de un conjunto de CDR de una región V de una cadena pesada o ligera. Algunos restos de FR pueden estar en contacto con un antígeno unido; sin embargo, las FR son principalmente responsables del plegamiento de la región V en el sitio de unión al antígeno, particularmente los restos de FR directamente adyacentes a las CDR. En las FR, determinados restos de aminoácidos y determinadas características estructurales están muy conservadas. A este respecto, todas las secuencias de las regiones V contienen un bucle disulfuro interno de aproximadamente 90 restos de aminoácidos. Cuando las regiones V se pliegan en un sitio de unión, las CDR se muestran como restos del bucle proyectados que forman una superficie de unión al antígeno. Se reconoce generalmente que hay regiones estructurales conservadas de FR que influyen en la forma plegada de los bucles de CDR en determinadas estructuras "canónicas" independientemente de la secuencia de aminoácidos precisa de la CDR. Además, se sabe que determinados restos de FR participan en contactos interdominio no covalentes que estabilizan la interacción de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo.
Se han descrito varias moléculas de anticuerpo "humanizadas" que comprenden un sitio de unión a antígenos obtenido a partir de una inmunoglobulina no humana, incluyendo anticuerpos quiméricos que tienen regiones V de roedor y sus CDR asociadas fusionadas a dominios constantes humanos (Winter et al. (1991) Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:4220-4224; Shaw et al. (1987) J Immunol. 138:4534-4538; y Brown et al. (1987) Cancer Res. 47:3577-3583), CDR de roedor injertadas en una FR humana de soporte antes de la fusión con un dominio constante de anticuerpo humano apropiado (Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536; y Jones et al. (1986) Nature 321:522-525), y CDR de roedor soportadas por FR de roedor recombinantemente modificadas en superficie (Publicación de Patente Europea No. 519.596, publicada en Dic. 23, 1992). Estas moléculas "humanizadas" se diseñan para minimizar la respuesta inmunológica no deseada frente a moléculas de anticuerpo anti-humano de roedor que limita la duración y eficacia de las aplicaciones terapéuticas de estos restos en receptores humanos.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, los términos "FR modificada en superficie" y "FR recombinantemente modificada en superficie" se refieren al reemplazamiento selectivo de restos de FR de, p, ej., una región V de cadena pesada o ligera de roedor, por restos de FR humanos con el fin de proporcionar una molécula xenogénica que comprende un sitio de unión a antígenos que retiene sustancialmente toda la estructura de plegamiento del polipéptido FR nativo. Las técnicas de modificación en superficie se basan en la comprensión de que las características de unión al ligando de un sitio de unión a antígenos están determinadas principalmente por la estructura y disposición relativa de los conjuntos de CDR de la cadena pesada y ligera en la superficie de unión al antígeno. Davies et al. (1990) Ann. Rev. Biochem. 59:439-473. Así, la especificidad de unión al antígeno puede conservarse en un anticuerpo humanizado sólo cuando se mantengan cuidadosamente las estructuras de las CDR, su interacción entre sí, y sus interacciones con el resto de los dominios de la región V. Utilizando técnicas de modificación en superficie, se reemplazan restos de FR exteriores (p. ej., accesibles para los disolventes) que el sistema inmune encuentra fácilmente por restos humanos para proporcionar una molécula híbrida que comprende una superficie modificada en superficie poco inmunogénica, o sustancialmente no inmunogénica.
El proceso de modificación en superficie utiliza los datos de secuencia disponibles para los dominios variables de los anticuerpos humanos compilados por Kabat, et al., en Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4a ed., (U.S. Dept. of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, 1987), las actualizaciones de la base de datos de Kabat, y otras bases de datos accesibles de EEUU y extranjeras (tanto de ácidos nucleicos como de proteínas). Las accesibilidades al disolvente de los aminoácidos de la región V puede deducirse a partir de la estructura tridimensional conocida para los fragmentos de anticuerpo humanos y murinos. Hay dos etapas generales en la modificación en superficie de un sitio de unión a antígenos murino. Inicialmente, las FR de los dominios variables de una molécula de anticuerpo de interés se comparan con las secuencias FR correspondientes de dominios variables humanos obtenidos a partir de las fuentes identificadas anteriormente. Las regiones V humanas más homólogas se comparan resto a resto con los aminoácidos murinos correspondientes. Los restos de la FR murina que se diferencian del equivalente humano se reemplazan por los restos presentes en el resto humano utilizando técnicas recombinantes muy conocidas en la técnica. El cambio de restos sólo se realiza con restos que están al menos parcialmente expuestos (accesibles para el disolvente) y se pone cuidado en el reemplazamiento de restos de aminoácidos que pueden tener un efecto significativo en la estructura terciaria de los dominios de la región V, tales como prolina, glicina y aminoácidos cargados.
De esta manera, los sitios de unión a antígenos murinos "modificados en superficie" resultantes se diseñan así para retener los restos CDR murinos, los restos sustancialmente adyacentes a las CDR, los restos identificados como enterrados o en su mayor parte enterrados (inaccesibles para el disolvente), los restos que se cree que participan en contactos no covalentes (p. ej., electrostáticos e hidrofóbicos) entre los dominios de la cadena pesada y ligera, y los restos de regiones estructurales conservadas de las FR que se cree que influyen en las estructuras terciarias "canónicas" de los bucles de CDR. Estos criterios de diseño se utilizan para preparar secuencias de nucleótidos recombinantes que combinan las CDR tanto de la cadena pesada como ligera de un sitio de unión a antígenos murino en FR aparentemente humanas que pueden utilizarse para transfectar células de mamífero para la expresión de anticuerpos humanos recombinantes que presentan la especificidad de antígeno de la molécula de anticuerpo
murina.
En otra realización de la invención, los anticuerpos monoclonales de la presente invención pueden acoplarse a uno o más agentes terapéuticos. Los agentes adecuados a este respecto incluyen radionúclidos, inductores de la diferenciación, fármacos, toxinas, y derivados de estos. Los radionúclidos preferidos incluyen ^{90}Y, ^{123}I, ^{125}I, ^{131}I, ^{186}Re, ^{188}Re, ^{211}At, y ^{212}Bi. Los fármacos preferidos incluyen metotrexato, y análogos de pirimidina y purina. Los inductores de la diferenciación preferidos incluyen ésteres de forbol y ácido butírico. Las toxinas preferidas incluyen ricina, abrina, toxina de la difteria, toxina del cólera, gelonina, exotoxina de Pseudomonas, toxina de Shigella, y proteína antiviral pokeweed.
Un agente terapéutico puede acoplarse (p. ej., unido covalentemente) a un anticuerpo monoclonal adecuado bien directamente o indirectamente (p. ej., mediante un grupo conector). Una reacción directa entre un agente y un anticuerpo es posible cuando cada uno posee un sustituyente capaz de reaccionar con el otro. Por ejemplo, un grupo nucleofílico, tal como un grupo amino o sulfidrilo, en uno puede ser capaz de reaccionar con un grupo que contiene carbonilo, tal como un anhídrido o un haluro de ácido, o con un grupo alquilo que contiene un buen grupo saliente (p. ej., un haluro) en el otro.
Alternativamente, puede ser deseable acoplar un agente terapéutico y un anticuerpo mediante un grupo conector. Un grupo conector puede funcionar como un espaciador para separar un anticuerpo de un agente con el fin de evitar interferencias con las capacidades de unión. Un grupo conector también puede servir para incrementar la reactividad química de un sustituyente en un agente o un anticuerpo, e incrementar así la eficacia del acoplamiento. Un incremento en la reactividad química también puede facilitar la utilización de agentes, o grupos funcionales en los agentes, que de otra manera no sería posible.
Será evidente para los expertos en la técnica que puede emplearse una variedad de reactivos bifuncionales o polifuncionales, tanto homo como hetero funcionales (tales como los descritos en el catálogo de Pierce Chemical Co., Rockford, IL) como grupo conector. El acoplamiento puede efectuarse, por ejemplo, mediante grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfidrilo o restos de carbohidrato oxidados. Hay numerosas referencias que describen dicha metodología, p. ej., Patente de EEUU No. 4.671.958, de Rodwell et al.
Cuando un agente terapéutico es más potente si no contiene la parte de anticuerpo de los inmunoconjugados de la presente invención, puede ser deseable utilizar un grupo conector que se escinda durante o después de la internalización en una célula. Se han descrito numerosos grupos conectores escindibles diferentes. Los mecanismos para la liberación intracelular de un agente de estos grupos conectores incluyen escisión por reducción de un enlace disulfuro (p. ej., Patente de EEUU No. 4.489.710, de Spitler), por irradiación de un enlace fotolábil (p. ej., Patente de EEUU No. 4.625.014, de Senter et al.), por hidrólisis de cadenas laterales de aminoácidos derivatizadas (p. ej., Patente de EEUU No. 4.638.045, de Kohn et al.), por hidrólisis mediada por el complemento del suero (p. ej., Patente de EEUU No. 4.671.958, de Rodwell et al.), e hidrólisis catalizada por ácidos (p. ej., Patente de EEUU No. 4.569.789, de Blattler et al.).
Puede ser deseable acoplar más de un agente a un anticuerpo. En una realización, múltiples moléculas de un agente se acoplan a una molécula de anticuerpo. En otra realización, más de un tipo de agente puede acoplarse a un anticuerpo. Independientemente de la realización particular, pueden prepararse inmunoconjugados con más de un agente de distintas formas. Por ejemplo, más de un agente puede acoplarse directamente a una molécula de anticuerpo, o pueden utilizarse conectores que proporcionan múltiples sitios para la unión. Alternativamente, puede utilizarse un vehículo.
Un vehículo puede llevar a los agentes de diferentes formas, incluyendo unión covalente bien directamente o mediante un grupo conector. Los vehículos adecuados incluyen proteínas tales como albúminas (p. ej., Patente de EEUU No. 4.507.234, de Kato et al.), péptidos y polisacáridos tal como aminodextrano (p. ej., Patente de EEUU No. 4.699.784, de Shih et al.). Un vehículo también puede llevar un agente por unión no covalente o por encapsulación, tal como en una vesícula de liposoma (p. ej., Patente de EEUU Nos. 4.429.008 y 4.873.088). Los vehículos específicos para agentes radionúclidos incluyen moléculas pequeñas radiohalogenadas y compuestos quelantes. Por ejemplo, la Patente de EEUU No. 4.735.792 describe moléculas pequeñas radiohalogenadas representativas y su síntesis. Un quelato de radionúclido puede formarse a partir de compuestos quelantes que incluyen los que contienen átomos de nitrógeno y de azufre como átomos donantes para unir el radionúclido metálico, u óxido de metal. Por ejemplo, la Patente de EEUU No. 4.673.562, de Davison et al., describe compuestos quelantes representativos y su
síntesis.
Composiciones de Células T
La presente invención, en otro aspecto, proporciona células T específicas para un polipéptido tumoral descrito en la presente memoria, o para una variante o derivado de éste. Dichas células pueden prepararse generalmente in vitro o ex vivo, utilizando procedimientos estándar. Por ejemplo, las células T pueden aislarse a partir de médula ósea, sangre periférica, o una fracción de médula ósea o de sangre periférica de un paciente, utilizando un sistema de separación de células disponible comercialmente, tal como el Sistema Isolex^{TM}, disponible en Nexell Therapeutics, Inc. (Irvine, CA; véase también la Patente de EEUU No. 5.240.856; Patente de EEUU No. 5.215.926; WO 89/06280; WO 91/16116 y WO 92/07243). Alternativamente, las células T pueden obtenerse a partir de seres humanos relacionados o no relacionados, mamíferos no humanos, líneas o cultivos celulares.
Las células T pueden estimularse con un polipéptido, polinucleótido que codifica un polipéptido y/o una célula presentadora de antígenos (APC) que expresa dicho polipéptido. Dicha estimulación se realiza en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la generación de células T que son específicas para el polipéptido de interés. Preferiblemente, un polipéptido o polinucleótido tumoral de la invención está presente en un vehículo de administración, tal como una microesfera, para facilitar la generación de células T específicas.
Se considera que las células T son específicas para un polipéptido de la presente invención si las células T específicamente proliferan, secretan citoquinas o matan a células diana recubiertas con el polipéptido o que expresan un gen que codifica el polipéptido. La especificidad de las células T puede evaluarse utilizando varias técnicas estándar. Por ejemplo, en un ensayo de liberación de cromo o un ensayo de proliferación, un índice de estimulación con un incremento de más de dos veces en lisis y/o proliferación, comparado con controles negativos, indica especificidad de las células T. Dichos ensayos pueden realizarse, por ejemplo, como se describe en Chen et al., Cancer Res. 54:1065-1070, 1994. Alternativamente, la detección de la proliferación de las células T puede conseguirse mediante una variedad de técnicas conocidas. Por ejemplo, la proliferación de las células T puede detectarse midiendo una proporción incrementada de la síntesis de ADN (p. ej., mediante cultivos de células T marcados con un pulso de timidina tritiada y midiendo la cantidad de timidina tritiada incorporada en el ADN). El contacto con un polipéptido tumoral (100 ng/ml - 100 \mug/ml, preferiblemente 200 ng/ml - 25 \mug/ml) durante 3 - 7 días resultará típicamente en un incremento de al menos dos veces de la proliferación de las células T. El contacto como se ha descrito anteriormente durante 2-3 horas debería resultar en la activación de las células T, medido utilizando ensayos de citoquina estándar en los que un incremento de dos veces del nivel de liberación de citoquinas (p. ej., TNF o IFN-\gamma) es indicativo de la activación de las células T (véase Coligan et al., Current Protocols in Immunology, vol. 1, Wiley Interscience (Greene 1998)). Las células T que se han activado en respuesta a un polipéptido tumoral, polinucleótido o APC que expresa el polipéptido pueden ser CD4^{+} y/o CD8^{+}. Las células T específicas del polipéptido tumoral pueden expandirse utilizando técnicas estándar. En las realizaciones preferidas, las células T se obtienen de un paciente, un donante relacionado o un donante no relacionado, y se administran al paciente después de la estimulación y expansión.
Para propósitos terapéuticos, las células T CD4^{+} o CD8^{+} que proliferan en respuesta a un polipéptido tumoral, polinucleótido o APC pueden expandirse en número bien in vitro o in vivo. La proliferación de dichas células T in vitro puede conseguirse de diferentes formas. Por ejemplo, las células T pueden volver a exponerse a un polipéptido tumoral, o a un péptido corto correspondiente a una parte inmunogénica de dicho polipéptido, con o sin la adición de factores de crecimiento de las células T, tales como interleuquina-2, y/o células estimulantes que sintetizan un polipéptido tumoral. Alternativamente, una o más células T que proliferan en presencia del polipéptido tumoral pueden expandirse en número por clonación. Los métodos para clonar células son muy conocidos en la técnica, e incluyen dilución limitante.
Composiciones de Receptor de Células T
El receptor de las células T (TCR) consiste en 2 cadenas polipeptídicas diferentes, altamente variables, denominadas cadenas \alpha y \beta del receptor de células T, que están unidas mediante un enlace disulfuro (Janeway, Travers, Walport. Immunobiology. Cuarta Ed., 148-159. Elsevier Science Ltd/Garland Publishing, 1999). El heterodímero \alpha/\beta forma un complejo con las cadenas CD3 no variantes en la membrana celular. Este complejo reconoce péptidos antigénicos específicos unidos a las moléculas de MHC. La enorme diversidad de las especificidades de TCR se genera de forma parecida a la diversidad de las inmunoglobulinas, a través de redisposición de genes somáticos. Los genes de la cadena \beta contienen más de 50 segmentos variables (V), 2 de diversidad (D), más de 10 segmentos de unión (J), y 2 segmentos de región constante (C). Los genes de la cadena \alpha contienen más de 70 segmentos V, y más de 60 segmentos J pero no segmentos D, así como un segmento C. Durante el desarrollo de las células T en el timo, se produce la redisposición de los genes D a J de la cadena \beta, seguido de la redisposición del segmento del gen V a DJ. Este exón funcional VDJ_{\beta} se transcribe y se corta y empalma para unirse a un C_{\beta}. Para la cadena \alpha, un gen del segmento V_{\alpha} se redispone a un gen del segmento J_{\alpha} para crear el exón funcional que se transcribe y corta y empalma a C_{\alpha}. La diversidad se incrementa más durante el proceso de recombinación por la adición aleatoria de nucleótidos P y N entre los segmentos V, D y J de la cadena \beta y entre los segmentos V y J en la cadena \alpha (Janeway, Travers, Walport. Immunobiology. Cuarta Ed., 98 y 150. Elsevier Science Ltd/Garland Publishing, 1999).
La presente invención, en otro aspecto, proporciona TCR específicos para un polipéptido descrito en la presente memoria, o para una variante o derivado de éste. Según la presente invención, se proporcionan secuencias de polinucleótido y aminoácidos para las regiones de unión V-J o V-D-J o partes de éstas para las cadenas alfa y beta del receptor de células T que reconocen los polipéptidos tumorales descritos en la presente memoria. En general, este aspecto de la invención se refiere a receptores de células T que reconocen o se unen a polipéptidos tumorales presentados en el contexto de MHC. En una realización preferida, los antígenos tumorales reconocidos por los receptores de las células T comprenden un polipéptido de la presente invención. Por ejemplo, el ADNc que codifica un TCR específico para un péptido tumoral puede aislarse a partir de células T específicas para un polipéptido tumoral utilizando técnicas estándar de biología molecular y de ADN recombinante.
Esta invención incluye además los receptores de células T o análogos de estos que tienen sustancialmente la misma función o actividad que los receptores de células T de esta invención que reconocen o se unen a polipéptidos tumorales. Dichos receptores incluyen, pero no están limitados a, un fragmento del receptor, o un mutante por sustitución, adición o deleción de un receptor de células T proporcionado en la presente memoria. Esta invención también engloba a los polipéptidos o péptidos que son sustancialmente homólogos a los receptores de células T proporcionados en la presente memoria o que retienen sustancialmente la misma actividad. El término "análogo" incluye cualquier proteína o polipéptido que tiene una secuencia de restos de aminoácidos sustancialmente idéntica a los receptores de células T proporcionados en la presente memoria en las que uno o más restos, preferiblemente no más de 5 restos, más preferiblemente no más de 25 restos se han sustituido de manera conservativa con un resto funcionalmente similar y que muestra los aspectos funcionales del receptor de células T como se describe en la presente memoria.
La presente invención proporciona además células anfitrionas de mamífero adecuadas, por ejemplo, células T no específicas, que se han transfectado con un polinucleótido que codifica TCR específicos para un polipéptido descrito en la presente memoria, haciendo de esta manera que la célula anfitriona sea específica para el polipéptido. Las cadenas \alpha y \beta del TCR pueden estar contenidas en vectores de expresión independientes o alternativamente, en un único vector de expresión que también contiene un sitio interno interno de entrada ribosomal (IRES) para la traducción independiente de cap del gen antes del extremo 5' del IRES. Dichas células anfitrionas que expresan TCR específicos para el polipéptido pueden utilizarse, por ejemplo, para inmunoterapia adoptiva de cáncer de pulmón como se discute adicionalmente más adelante.
En aspectos adicionales de la presente invención, pueden utilizarse TCR clonados específicos para un polipéptido de la presente memoria en un kit para el diagnóstico de cáncer de pulmón. Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico o partes de ésta, de TCR específicos de tumores puede utilizarse como sondas o cebadores para la detección de la expresión de los genes redispuestos que codifican el TCR específico en una muestra biológica. Por lo tanto, la presente invención proporciona además un ensayo para detectar el ARN mensajero o ADN que codifica el TCR específico para un polipéptido.
Composiciones Farmacéuticas
En realizaciones adicionales, la presente invención se refiere a la formulación de una o más de las composiciones de polinucleótidos, polipéptidos, células T y/o anticuerpos descritas en la presente memoria en vehículos farmacéuticamente aceptables para la administración a una célula o un animal, bien solas, o en combinación con una o más de otras modalidades de terapia.
Se entenderá que, si se desea, una composición como se describe en la presente memoria puede administrarse también en combinación con otros agentes, tales como, p. ej., otras proteínas o polipéptidos o varios agentes farmacéuticamente activos. De hecho, no hay virtualmente un límite para otros componentes que también pueden incluirse, siempre que los agentes adicionales no causen un efecto significativamente adverso al ponerse en contacto con las células o tejidos diana del anfitrión. Las composiciones pueden administrase así junto con otros agentes según se requiera en el caso particular. Dichas composiciones pueden purificarse a partir de células anfitrionas u otras fuentes biológicas, o alternativamente pueden sintetizarse químicamente como se describe en la presente memoria. Asimismo, dichas composiciones pueden comprender además composiciones de ARN o ADN sustituido o derivatizado.
Por lo tanto, en otro aspecto de la presente invención, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una o más de las composiciones de polinucleótidos, polipéptidos, anticuerpos y/o células T descritas en la presente memoria en combinación con un vehículo fisiológicamente aceptable. En determinadas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden composiciones de polinucleótidos y/o polipéptidos inmunogénicos de la invención para utilizarse en aplicaciones de vacuna profilácticas y terapéuticas. La preparación de vacunas se describe generalmente, por ejemplo, en M.F. Powell y M.J. Newman, eds., "Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach)", Plenum Press (NY, 1995). Generalmente, dichas composiciones comprenderán una o más de las composiciones de polinucleótidos y/o polipéptidos de la presente invención en combinación con uno o más inmunoestimulantes.
Será evidente que cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria puede contener sales farmacéuticamente aceptables de los polinucleótidos y polipéptidos de la invención. Dichas sales pueden prepararse, por ejemplo, a partir de bases no tóxicas farmacéuticamente aceptables, incluyendo bases orgánicas (p. ej., sales de aminas primarias, secundarias y terciarias y aminoácidos básicos) y bases inorgánicas (p. ej., sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio y magnesio).
En otra realización, las composiciones inmunogénicas ilustrativas, p. ej., composiciones de vacuna, de la presente invención comprenden ADN que codifica uno o más de los polipéptidos como se ha descrito anteriormente, de manera que el polipéptido se genera in situ. Como se ha indicado anteriormente, el polinucleótido puede administrarse en varios sistemas de administración conocidos por los expertos en la técnica. De hecho, son muy conocidas en la técnica numerosas técnicas de administración de genes, tales como las descritas por Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198, 1998, y las referencias citadas en ésta. Los sistemas de expresión de polinucleótidos apropiados contendrán, por supuesto, las secuencias reguladoras de ADN necesarias para la expresión en un paciente (tales como un promotor y una señal de terminación adecuadas). Alternativamente, los sistemas de administración bacterianos pueden implicar la administración de una bacteria (tal como Bacillus-Calmette-Guerrin) que expresa una parte inmunogénica del polipéptido en su superficie celular o que secreta dicho epítopo.
Por lo tanto, en determinadas realizaciones, los polinucleótidos que codifican los polipéptidos inmunogénicos descritos en la presente memoria se introducen en células anfitrionas de mamífero adecuadas para la expresión utilizando uno cualquiera de los distintos sistemas basados en virus conocidos. En una realización ilustrativa, los retrovirus proporcionan una plataforma conveniente y eficaz para los sistemas de administración de genes. Una secuencia de nucleótido seleccionada que codifica un polipéptido de la presente invención puede insertarse en un vector y empaquetarse en partículas retrovirales utilizando técnicas conocidas en la técnica. Los virus recombinantes pueden aislarse y administrarse a un sujeto. Se han descrito varios sistemas retrovirales ilustrativos (p. ej., Patente de EEUU No. 5.219.740; Miller y Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A.D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; y Boris-Lawrie y Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109.
Además, también se han descrito varios sistemas basados en adenovirus ilustrativos. A diferencia de los retrovirus que se integran en el genoma del anfitrión, los adenovirus persisten extracromosómicamente minimizando así los riesgos asociados con la mutagénesis insercional (Haj-Ahmad y Graham (1986) J. Virol. 57:267-274; Bett et al. (1993) J. Virol. 67:5911-5921; Mittereder et al. (1994) Human Gene Therapy 5:717-729; Seth et al. (1994) J. Virol. 68:933-940; Barr et al. (1994) Gene Therapy 1:51-58; Berkner, K.L. (1988) BioTechniques 6:616-629; y Rich et al. (1993) Human Gene Therapy 4:461-476).
También se han desarrollado varios sistemas de vector de virus adeno asociados (AAV) para la administración de polinucleótidos. Los vectores AAV pueden construirse fácilmente utilizando técnicas muy conocidas en la técnica. Véanse, p. ej., las Patentes de EEUU Nos. 5.173.414 y 5.139.941; las Publicaciones Internacionales Nos. WO 92/01070 y WO 93/03769; Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B.J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129; Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Shelling y Smith (1994) Gene Therapy 1:165-169; y Zhou et al. (1994) J. Exp. Med. 179:1867-1875.
Los vectores virales adicionales útiles para administrar los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la presente invención por transferencia genética incluyen los obtenidos a partir de la familia pox de virus, tal como virus vaccinia y virus de la viruela aviar. Como ejemplo, los recombinantes de los virus vaccinia que expresan las nuevas moléculas pueden construirse como sigue. El ADN que codifica un polipéptido se inserta en primer lugar en un vector apropiado de manera que es adyacente a un promotor de vaccinia y a secuencias de ADN de vaccinia flanqueadoras, tal como la secuencia que codifica la timidina quinasa (TK). Este vector se utiliza para transfectar células que se infectan simultáneamente con vaccinia. La recombinación homóloga sirve para insertar el promotor de vaccinia más el gen que codifica el polipéptido de interés en el genoma viral. El recombinante TK.sup.(-) resultante puede seleccionarse cultivando las células en presencia de 5-bromodesoxiuridina y tomando las placas virales resistentes a
ésta.
Un sistema de infección/transfección basado en vaccinia puede utilizarse convenientemente para proporcionar la expresión o coexpresión inducible transitoria de uno o más polipéptidos descritos en la presente memoria en las células anfitrionas de un organismo. En este sistema particular, las células se infectan en primer lugar in vitro con un virus vaccinia recombinante que codifica la ARN polimerasa T7 de bacteriófago. Esta polimerasa presenta una especificidad exquisita en el sentido de que sólo transcribe los moldes que contienen promotores T7. Después de la infección, las células se transfectan con el polinucleótido o polinucleótidos de interés, dirigidos por un promotor T7. La polimerasa expresada en el citoplasma del virus vaccinia recombinante transcribe el ADN transfectado en ARN que se traduce en el polipéptido por la maquinaria de traducción del anfitrión. El método proporciona una producción de alto nivel, transitoria y citoplásmica de grandes cantidades de ARN y de sus productos de traducción. Véanse, p. ej., Elroy-Stein y Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:6743-6747; Fuerst et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:8122-8126.
Alternativamente, también pueden utilizarse virus de la viruela aviar, tal como el virus de la viruela del pollo y el virus de la viruela del canario, para administrar las secuencias codificadoras de interés. Se sabe que los virus de la viruela aviar recombinantes, que expresan los inmunógenos de patógenos de mamíferos, confieren una inmunidad protectora cuando se administran a especies no aviares. La utilización de un vector de la viruela aviar es particularmente deseable en el ser humano y otras especies de mamíferos ya que los miembros del género Avipox sólo pueden replicarse productivamente en especies aviares susceptibles y por lo tanto no son infectivos en células de mamíferos. Los métodos para producir virus de la viruela aviar recombinantes son conocidos en la técnica y emplean recombinación genética, como se ha descrito anteriormente respecto a la producción de los virus vaccinia. Véanse, p. ej., WO 91/12882; WO 89/03429; y WO 92/03545.
También puede utilizarse cualquiera de varios vectores alfavirus para la administración de las composiciones de polinucleótidos de la presente invención, tales como los vectores descritos en las Patentes de EEUU Nos. 5.843.723; 6.015.686; 6.008.035 y 6.015.694. También pueden utilizarse determinados vectores basados en la Encefalitis Equina de Venezuela (VEE), de los que se encuentran ejemplos ilustrativos en las Patentes de EEUU Nos. 5.505.947 y 5.643.576.
Además, también pueden utilizarse vectores de conjugados moleculares, tal como los vectores quiméricos de adenovirus descritos en Michael et al. J. Biol. Chem. (1993) 268:6866-6869 y Wagner et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:6099-6103 para la administración de genes bajo la invención.
Puede encontrarse información ilustrativa adicional de estos y otros sistemas de administración basados en virus, por ejemplo, en Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317-321, 1989; Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 569:86-103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8:17-21, 1990; Patentes de EEUU Nos. 4.603.112, 4.769.330, y 5.017.487; WO 89/01973; Patente de EEUU No. 4.777.127; GB 2.200.651; EP 0.345.242; WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 6:616-627, 1988; Rosenfeld et al., Science 252:431-434, 1991; Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219, 1994; Kass-Eisler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11498-11502, 1993; Guzman et al., Circulation 88:2838-2848, 1993; y Guzman et al., Cir. Res. 73:1202-1207, 1993.
En determinadas realizaciones, un polinucleótido puede integrarse en el genoma de una célula diana. Esta integración puede ser en la localización y orientación específica a través de recombinación homóloga (reemplazamiento de genes) o puede integrarse en una localización aleatoria y no específica (aumento de genes). En más realizaciones adicionales, el polinucleótido puede mantenerse establemente en la célula como un segmento independiente, episomal de ADN. Dichos segmentos de polinucleótido o "episomas" codifican secuencias suficientes para permitir el mantenimiento y replicación independientes de o en sincronización con el ciclo celular del anfitrión. La manera en la que se administra la construcción de expresión a una célula y dónde permanece el polinucleótido en la célula depende del tipo de construcción de expresión empleado.
En otra realización de la invención, un polinucleótido se administra/entrega como ADN "desnudo", por ejemplo como se describe en Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993 y revisado por Cohen, Science 259:1691-1692, 1993. La internalización del ADN desnudo puede incrementarse recubriendo el ADN en lechos biodegradables, que se trasnportan eficazmente al interior de las células.
En otra realización más, una composición de la presente invención puede administrarse a través de un método de bombardeo de partículas, muchos de los cuales se han descrito. En un ejemplo ilustrativo, puede conseguirse la aceleración de partículas dirigida por gas con dispositivos tales como los fabricados por Powderject Pharmaceuticals PLC (Oxford, Reino Unido) y Powderject Vaccines Inc. (Madison, WI), algunos ejemplos de los cuales se describen en las Patentes de EEUU Nos. 5.846.796; 6.010.478; 5.865.796; 5.584.807; y Patente EP No. 0500 799. Este método ofrece un método de administración sin aguja en el que una formulación en polvo seco de partículas microscópicas, tales como partículas de polinucleótido o polipéptido, se acelera a alta velocidad en un chorro de gas helio generado por un dispositivo manual, propulsando las partículas en un tejido diana de interés.
En una realización relacionada, otros dispositivos y métodos que pueden ser útiles para la inyección sin aguja dirigida por gas de las composiciones de la presente invención incluyen las proporcionadas por Bioject, Inc. (Portland, OR), algunos ejemplos de los cuales se describen en las Patentes de EEUU Nos. 4.790.824; 5.064.413; 5.312.335; 5.383.851; 5.399.163; 5.520.639 y 5.993.412.
Según otra realización, las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria comprenderán uno o más inmunoestimulantes además de las composiciones inmunogénicas de polinucleótidos, polipéptidos, anticuerpos, células T y/o APC de esta invención. Un inmunoestimulante se refiere esencialmente a cualquier sustancia que incrementa o potencia una respuesta inmune (mediada por anticuerpos y/o células) frente a un antígeno exógeno. Un tipo preferido de inmunoestimulante comprende un adyuvante. Muchos adyuvantes contienen una sustancia diseñada para proteger el antígeno de un catabolismo rápido, tal como hidróxido de aluminio o aceite mineral, y un estimulador de respuestas inmunes, tal como lípido A, proteínas obtenidas de Bortadella pertussis o Mycobacterium tuberculosis. Determinados adyuvantes están disponibles comercialmente tal como, por ejemplo, Adyuvante Incompleto y Adyuvante Completo de Freund (Difco laboratories, Detroit, MI); Adyuvante 65 de Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); sales de aluminio tal como gel de hidróxido de aluminio (alum) o fosfato de aluminio; sales de calcio, hierro o cinc; una suspensión insoluble de tirosina acilada; azúcares acilados; polisacáridos derivatizados catiónicamente o aniónicamente; polifosfacenos; microesferas biodegradables; monofosforil lípido A y quil A. También pueden utilizarse, como adyuvantes, citoquinas, tales como GM-CSF, interleuquina-2, -7, -12, y otros factores de crecimiento semejantes.
En determinadas realizaciones de la invención, la composición adyuvante es preferiblemente una que induce una respuesta inmune predominantemente del tipo Th1. Unos niveles altos de citoquinas de tipo Th1 (p. ej., IFN-\gamma, TNF\alpha, IL-2 e IL-12) tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes mediadas por células frente a un antígeno administrado. Por el contrario, unos niveles altos de citoquinas de tipo Th2 (p. ej., IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10) tienen a favorecer la inducción de respuestas inmunes humorales. Después de la aplicación de una vacuna como se proporciona en la presente memoria, un paciente producirá una respuesta inmune que incluye respuestas de tipo Th1 y Th2. En una realización preferida, en la que una respuesta es predominantemente de tipo Th1, el nivel de citoquinas de tipo Th1 se incrementará en un grado mayor que el nivel de citoquinas de tipo Th2. Los niveles de estas citoquinas pueden evaluarse fácilmente utilizando ensayos estándar. Para una revisión de las familias de citoquinas, véase Mosmann y Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173, 1989.
Determinados adyuvantes preferidos para incitar una respuesta predominantemente de tipo Th1 incluyen, por ejemplo, una combinación de monofosforil lípido A, preferiblemente monofosforil lípido A 3-de-O-acetilado, junto con una sal de aluminio. Los adyuvantes MPL® están disponibles en Corixa Corporation (Seattle, WA; véanse, por ejemplo, las Patentes de EEUU Nos. 4.436.727; 4.877.611; 4.866.034 y 4.912.094). Los oligonucleótidos que contienen CpG (en los que el dinucleótido CpG no está metilado) también inducen una respuesta predominantemente Th1. Dichos oligonucleótidos son muy conocidos y se describen, por ejemplo, en WO 96/02555, WO 99/33488 y las Patentes de EEUU Nos. 6.008.200 y 5.856.462. Las secuencias de ADN inmunoestimuladoras también se describen, por ejemplo, en Sato et al., Science 273:352, 1996. Otro adyuvante preferido comprende una saponina, tal como Quil A, o derivados de ésta, incluyendo QS21 y QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA); Escina; Digitonina; o saponinas de Gypsophila o Chenopodium quinoa. Otras formulaciones preferidas incluyen más de una saponina en las combinaciones de adyuvante de la presente invención, por ejemplo combinaciones de al menos dos del grupo siguiente que comprende QS21, QS7, QuilA, \beta-escina o digitonina.
Alternativamente, las formulaciones de saponina pueden combinarse con vehículos de vaccina compuestos por quitosán u otros polímeros policatiónicos, partículas de poliláctido o poliláctido-co-glicólido, matriz polimérica basada en glucosamina poli-N-acetilada, partículas compuestas por polisacáridos o polisacáridos modificados químicamente, partículas basadas en liposomas y lípidos, partículas compuestas por monoésteres de glicerol, etc. Las saponinas también pueden formularse en presencia de colesterol para formar estructuras particuladas tales como liposomas o ISCOM. Además, las saponinas pueden formularse junto con un éter o éster de polioxietileno, en una disolución o suspensión no particulada, o en una estructura particulada tal como un liposoma paucilamelar o ISCOM. Las saponinas también pueden formularse con excipientes tal como Carbopol® para incrementar la viscosidad, o pueden formularse en una forma de polvo seco con un excipiente en polvo tal como lactosa.
En una realización preferida, el sistema adyuvante incluye la combinación de un monofosforil lípido A y un derivado de saponina, tal como la combinación de QS21 y adyuvante 3D-MPL®, como se describe en WO 94/00153, o una composición menos reactogénica en la que QS21 se inactiva con colesterol, como se describe en WO 96/33739. Otras formulaciones preferidas comprenden una emulsión de aceite en agua y tocoferol. Otra formulación de adyuvante particularmente preferida que emplea QS21, adyuvante 3D-MPL® y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en WO 95/17210.
Otro sistema adyuvante incrementado implica la combinación de un oligonucleótido que contiene CpG y un derivado de saponina particularmente la combinación de CpG y QS21 se describe en WO 00/09159. Preferiblemente, la formulación comprende adicionalmente una emulsión de aceite en agua y tocoferol.
Los adyuvantes adicionales ilustrativos para utilizarse en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen Motanida ISA 720 (Seppic, Francia), SAF (Chiron, California, Estados Unidos), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), la serie SBAS de adyuvantes (p. ej., SBAS-2 o SBAS-4, disponibles en SmithKline Beecham, Rixensart, Bélgica), Detox (Enhanzyn®) (Corixa, Hamilton, MT), RC-529 (Corixa, Hamilton, MT) y otros 4-fosfatos de aminoalquil glucosaminida (AGP), tales como los descritos en las Series de Solicitudes de Patente de EEUU en tramitación Nos. 08/853.826 y 09/074.720, y adyuvantes de éter de polioxietileno tales como los descritos en WO 99/52549A1.
Otros adyuvantes preferidos incluyen moléculas de la fórmula general (I):
HO(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-A-R,
en la que, n es 1-50, A es un enlace o -C(O)-, R es alquilo C_{1-50} o Fenilalquilo C_{1-50}.
Una realización de la presente invención consiste en una formulación de vacuna que comprende un éter de polioxietileno de fórmula general (I), en la que n es entre 1 y 50, preferiblemente 4-24, lo más preferiblemente 9; el componente R es alquilo C_{1-50}, preferiblemente C_{4}-C_{20} y lo más preferiblemente alquilo C_{12}, y A es un enlace. La concentración de los éteres de polioxietileno debe estar en el intervalo 0,1-20%, preferiblemente de 0,1-10%, y lo más preferiblemente en el intervalo 0,1-1%. Los éteres de polioxietileno preferidos se seleccionan del grupo siguiente: 9-lauril éter de polioxietileno, 9-esteoril éter de polioxietileno, 8-esteoril éter de polioxietileno, 4-lauril éter de polioxietileno, 35-lauril éter de polioxietileno, y 23-lauril éter de polioxietileno. Los éteres de polioxietileno tal como lauril éter de polioxietileno se describen en el índice Merck (12ª edición: entrada 7717). Estas moléculas adyuvantes se describen en WO 99/52549.
El éter de polioxietileno según la fórmula general (I) anterior puede combinarse, si se desea, con otro adyuvante. Por ejemplo, una combinación de adyuvante preferida es preferiblemente con CpG como se describe en la solicitud de patente de UK en tramitación GB 9820956.2.
Según otra realización de esta invención, una composición inmunogénica descrita en la presente memoria se administra a un anfitrión mediante células presentadoras de antígenos (APC), tales como células dendríticas, macrófagos, células B, monocitos y otras células que pueden modificarse por ingeniería para ser APC eficaces. Dichas células, pueden, pero no es necesario, estar genéticamente modificadas para incrementar la capacidad para presentar el antígeno, para mejorar la activación y/o mantenimiento de la respuesta de las células T, para tener efectos anti-tumorales per se y/o para ser inmunológicamente compatibles con el receptor (es decir, halotipo HLA coincidente). Las APC pueden aislarse generalmente a partir de varios fluidos biológicos y órganos, incluyendo tejidos tumorales y peritumorales, y pueden ser células autólogas, alogénicas, singénicas o xenogénicas.
Determinadas realizaciones preferidas de la presente invención utilizan células dendríticas o progenitores de éstas como células presentadoras de antígenos. Las células dendríticas son APC muy potentes (Banchereau y Steinman, Nature 392:245-251, 1998) y se ha mostrado que son eficaces como un adyuvante fisiológico para incitar inmunidad antitumoral profiláctica o terapéutica (véase Timmerman y Levy, Ann. Rev. Med. 50:507-529, 1999). En general, las células dendríticas pueden identificarse tomando como base su forma típica (estrellada in situ, con procesos citoplásmicos marcados (dendritas) visibles in vitro), su capacidad de internalizar, procesar y presentar antígenos con una alta eficacia y su capacidad de activar respuestas de células T sin activar. Las células dendríticas pueden, por supuesto, modificarse por ingeniería para expresar receptores de la superficie celular específicos o ligandos que no se encuentran habitualmente en las células dendríticas in vivo o ex vivo, y dichas células dendríticas modificadas son contempladas por la presente invención. Como alternativa a las células dendríticas, pueden utilizarse células dendríticas con vesículas secretadas cargadas de antígeno (denominadas exosomas) en una vacuna (véase Zitvogel et al., Nature Med. 4:594-600, 1998).
Las células dendríticas y los progenitores pueden obtenerse a partir de sangre periférica, médula ósea, células tumorales infiltrantes, células infiltrantes de tejidos peritumorales, nódulos linfáticos, bazo, piel, sangre del cordón umbilical o cualquier tejido o fluido adecuado. Por ejemplo, las células dendríticas pueden diferenciarse ex vivo mediante la adición de una combinación de citoquinas tales como GM-CSF, IL-4, IL-13 y/o TNF\alpha a cultivos de monocitos recogidos de sangre periférica. Alternativamente, las células CD34 positivas recogidas de sangre periférica, sangre del cordón umbilical o médula ósea pueden diferenciarse en células dendríticas mediante la adición al medio de cultivo de combinaciones de GM-CSF, IL-3, TNF\alpha, ligando CD40, LPS, ligando ft3 y/o otro compuesto o compuestos que inducen la diferenciación, maduración y proliferación de las células dendríticas.
Las células dendríticas se clasifican convenientemente como células "inmaduras" y "maduras", lo que permite una manera simple de discriminar entre dos fenotipos bien caracterizados. Sin embargo, no debe interpretarse que esta nomenclatura excluye todas las etapas intermedias posibles de diferenciación. Las células dendríticas inmaduras se caracterizan como APC con una alta capacidad de internalización y procesamiento de antígenos, lo que correlaciona con la alta expresión del receptor Fc\gamma y el receptor de manosa. El fenotipo maduro se caracteriza típicamente por una expresión menor de estos marcadores, pero una alta expresión de moléculas de la superficie celular responsables de la activación de las células T tales como MHC de clase I y clase II, moléculas de adhesión (p. ej., CD54 y CD11) y moléculas coestimuladoras (p. ej., CD40, CD80, CD86 y 4-IBB).
Las APC pueden transfectarse generalmente con un polinucleótido de la invención (o parte u otra variante de éste) de manera que el polipéptido codificado, o una parte inmunogénica de éste, se expresa en la superficie celular. Dicha transfección puede tener lugar ex vivo, y puede utilizarse entonces una composición farmacéutica que comprende dichas células transfectadas para propósitos terapéuticos, como se describe en la presente memoria. Alternativamente, puede administrarse a un paciente un vehículo para la administración de genes que se dirige a una célula dendrítica u otra célula presentadora de antígenos, lo que resulta en transfección que ocurre in vivo. La transfección in vivo y ex vivo de células dendríticas, por ejemplo, puede realizarse generalmente utilizando cualquier método conocido en la técnica, tales como los descritos en WO 97/24447, o el método de pistola de genes descrito por Mahvi et al., Immunology and cell Biology 75:456-460, 1997. La carga de antígeno de las células dendríticas puede conseguirse incubando las células dendríticas o células progenitoras con el polipéptido, ADN (desnudo o en un vector plasmídico) o ARN tumoral; o con bacterias o virus recombinantes que expresan el antígeno (p. ej., vectores vaccinia, viruela del pollo, adenovirus o lentivirus). Antes de la carga, el polipéptido puede conjugarse covalentemente con una pareja inmunológica que proporciona protección de células T (p. ej., una molécula vehicular). Alternativamente, una célula dendrítica puede pulsarse con una pareja inmunológica no conjugada, independientemente o en presencia del
polipéptido.
Aunque puede emplearse cualquier vehículo adecuado conocido por los expertos en la técnica en las composición farmacéuticas de esta invención, el tipo de vehículo variará típicamente dependiendo del modo de administración. Las composiciones de la presente invención pueden formularse para cualquier manera de administración apropiada, incluyendo por ejemplo administración tópica, oral, nasal, mucosal, intravenosa, intracraneal, intraperitoneal, subcutánea e intramuscular.
Los vehículos para utilizarse en dichas composiciones farmacéuticas son biocompatibles, y también pueden ser biodegradables. En determinadas realizaciones, la formulación proporciona preferiblemente un nivel relativamente constante de liberación del componente activo. En otras realizaciones, sin embargo, puede desearse una velocidad más rápida de liberación inmediatamente después de la administración. La formulación de dichas composiciones también está en el nivel de la experiencia ordinaria en la técnica utilizando técnicas conocidas. Los vehículos ilustrativos útiles a este respecto incluyen micropartículas de poli(láctido-co-gicólido), poliacrilato, látex, almidón, celulosa, dextrano y semejantes. Otros vehículos ilustrativos de liberación retardada incluyen biovectores supramoleculares, que comprenden un núcleo hidrofílico no líquido (p. ej., un polisacárido u oligosacárido entrecruzado) y, opcionalmente, una capa externa que comprende un compuesto anfifílico, tal como un fosfolípido (véanse p.ej., la Patente de EEUU No. 5.151.254 y las solicitudes PCT WO 94/20078, WO 94/23701 y WO 96/06638). La cantidad de compuesto activo contenida en una formulación de liberación sostenida depende del sitio del implante, la velocidad y duración esperadas de la liberación y de la naturaleza de la condición que se va a tratar o prevenir.
En otra realización ilustrativa, se emplean microesferas biodegradables (p.ej., polilactato poliglicolato) como vehículos para las composiciones de esta invención. Las microesferas biodegradables adecuadas se describen, por ejemplo, en las Patentes de EEUU Nos. 4.897.268; 5.075.109; 5.928.647; 5.811.128; 5.820.883; 5.853.763; 5.814.344, 5.407.609 y 5.942.252. También pueden ser útiles para muchas aplicaciones los sistemas vehiculares de proteína de la hepatitis B modificados tales como los descritos en WO 99/40934, y las referencias citadas en éste. Otro sistema vehicular/de administración ilustrativo emplea un vehículo que comprende complejos particulado-proteína, tales como los descritos en la Patente de EEUU No. 5.928.647, que son capaces de inducir respuestas de linfocitos T citotóxicos restringidas por la clase I en un anfitrión.
Las composiciones farmacéuticas de la invención comprenderán además habitualmente uno o más tampones (p. ej., disolución salina neutra tamponada o disolución salina tamponada con fosfato), carbohidratos (p. ej., glucosa, manosa, sacarosa o dextranos), manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos tales como glicina, antioxidantes, bacteriostáticos, agentes quelantes tales como EDTA o glutatión, adyuvantes (p. ej., hidróxido de aluminio), solutos que convierten la formulación en isotónica, hipotónica o débilmente hipertónica con la sangre de un receptor, agentes de suspensión, agentes espesantes y/o conservantes. Alternativamente, las composiciones de la presente invención pueden formularse como un liofilizado.
Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria pueden presentarse en contenedores unidosis o multidosis, tales como ampollas o viales sellados. Dichos contenedores están sellados típicamente de manera que se conserva la esterilidad y estabilidad de la formulación hasta su utilización. En general, las formulaciones pueden almacenarse como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos grasos o acuosos. Alternativamente, una composición farmacéutica puede almacenarse en una condición liofilizada que requiere sólo la adición de un vehículo líquido estéril inmediatamente antes de su utilización.
El desarrollo de regímenes de dosificación y tratamiento adecuados para utilizar las composiciones particulares descritas en la presente memoria en una variedad de regímenes de tratamiento, incluyendo p. ej., administración oral, parenteral, intravenosa, intranasal e intramuscular y la formulación, es muy conocido en la técnica, algunos de los cuales se discuten brevemente más adelante para propósitos generales de ilustración.
En determinadas aplicaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria pueden administrarse mediante administración oral a un animal. Como tales, estas composiciones pueden formularse con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable, o pueden estar incluidas en cápsulas de gelatina con cubierta dura o blanda, o pueden comprimirse en comprimidos, o pueden incorporarse directamente con los alimentos de la dieta.
Los compuestos activos pueden incluso incorporarse con excipientes y utilizarse en la forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, pastillas, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y semejantes (véanse, por ejemplo, Mathiowitz et al., Nature 1997 Mar 27;386(6623):410-4; Hwang et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 1998;15(3):243-84; Patente de EEUU 5.641.515; Patente de EEUU 5.580.579 y Patente de EEUU 5.792.451). Los comprimidos, pastillas, tabletas, cápsulas y semejantes también pueden contener cualquiera de una variedad de componentes adicionales, por ejemplo, puede añadirse un aglutinante, tal como goma de tragacanto, goma arábiga, almidón de maíz, o gelatina; excipientes, tales como fosfato de dicalcio; un agente disgregante, tal como almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico y semejantes; un lubricante, tal como estearato de magnesio; y un agente edulcorante, tal como sacarosa, lactosa o sacarina o un agente saporífero, tal como menta, aceite de gualteria, o sabor a cereza. Cuando la forma de la unidad de dosificación es una cápsula, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un vehículo líquido. Pueden estar presentes varios materiales diferentes como recubrimientos o para modificar de otra forma la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, los comprimidos, tabletas o cápsulas pueden estar recubiertas con goma laca, azúcar o ambos. Por supuesto, cualquier material utilizado para preparar cualquier forma de unidad de dosificación debe ser farmacéuticamente puro y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, los compuestos activos pueden incorporarse en preparaciones y formulaciones de liberación
sostenida.
Típicamente, estas formulaciones contendrán al menos aproximadamente 0,1% del compuesto activo o más, aunque el porcentaje del o de los ingredientes activos puede, por supuesto, variar y puede ser convenientemente entre aproximadamente 1 ó 2% y aproximadamente 60% ó 70% o más del peso o volumen de la formulación total. Naturalmente, la cantidad del o de los compuestos activos en cada composición terapéuticamente útil puede prepararse de tal forma que se obtendrá una dosificación adecuada en cualquier unidad de dosis dada del compuesto. Los factores tales como solubilidad, biodisponibilidad, vida biológica media, ruta de administración, vida del producto a temperatura ambiente, así como otras consideraciones farmacológicas se contemplarán por un experto en la técnica de preparar dichas formulaciones farmacéuticas, y como tal, puede ser deseable una variedad de regímenes de dosificaciones y tratamiento.
Para la administración oral, las composiciones de la presente invención pueden incorporarse alternativamente con uno o más excipientes en la forma de una formulación administrada oralmente como un enjuage bucal, dentífrico, tableta bucal, pulverizador oral, o sublingual. Alternativamente, el ingrediente activo puede incorporarse en una disolución oral tal como una que contiene borato de sodio, glicerina y bicarbonato de potasio, o dispersarse en un dentífrico, o añadirse en una cantidad terapéuticamente eficaz a una composición que puede incluir agua, aglutinantes, abrasivos, agentes saporíferos, agentes espumantes, y humectantes. Alternativamente, las composiciones pueden formarse en forma de un comprimido o disolución que puede ponerse debajo de la lengua o disolverse de otra forma en la boca.
En determinadas circunstancias, será deseable administrar las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria de forma parenteral, intravenosa, intramuscular o incluso intraperitoneal. Dichos métodos son muy conocidos para el experto en la técnica, algunos de los cuales se describen más, por ejemplo, en la Patente de EEUU 5.543.158; Patente de EEUU 5.641.515 y Patente de EEUU 5.399.363. En determinadas realizaciones, las disoluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables pueden prepararse en agua mezcladas adecuadamente con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilen glicoles líquidos, y mezclas de estos y en aceites. En condiciones ordinarias de almacenamiento y utilización, estas preparaciones contendrán generalmente un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.
Las formas farmacéuticas ilustrativas adecuadas para una utilización inyectable incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación inmediata de disoluciones o dispersiones inyectables estériles (por ejemplo, véase la Patente de EEUU 5.466.468). En todos los casos la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el punto de que exista una fácil jeringabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (p. ej., glicerol, propilen glicol, y polietilen glicol líquido, y semejantes), mezclas adecuadas de estos, y/o aceites vegetales. Debe mantenerse una fluidez apropiada, por ejemplo, mediante la utilización de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y/o mediante la utilización de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede facilitarse mediante varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y semejantes. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico. Puede conseguirse la absorción prolongada de las composiciones inyectables mediante la utilización en las composiciones de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
En una realización, para la administración parenteral en una disolución acuosa, la disolución debe tamponarse adecuadamente si es necesario y el diluyente líquido debe convertirse en primer lugar en isotónico con suficiente disolución salina o glucosa. Estas disoluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, un medio acuoso estéril que puede emplearse será conocido para los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción. Por ejemplo, una dosificación puede disolverse en 1 ml de disolución isotónica de NaCl y añadirlo a 1.000 ml de fluido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio propuesto de infusión (véase por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15a Edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Alguna variación en la dosificación ocurrirá necesariamente dependiendo de la condición del sujeto que se va a tratar. Además, para la administración a seres humanos, las preparaciones preferiblemente cumplirán, por supuesto, los estándares de esterilidad, pirogenicidad, y de seguridad y pureza generales según requieren los estándares de la FDA Office of Biologics.
En otra realización de la invención, las composiciones descritas en la presente memoria pueden formularse en una forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables ilustrativas incluyen las sales de adición a ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y semejantes. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden obtenerse a partir de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio, o hidróxidos férricos, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y semejantes. Después de la formulación, las disoluciones se administrará de una manera compatible con la formulación de la dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente
eficaz.
Los vehículos pueden comprender además todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, tampones, disoluciones vehiculares, suspensiones, coloides, y semejantes. La utilización de dichos medios y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas es muy conocida en la técnica. Excepto en la medida en la que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, su utilización se contempla en las composiciones terapéuticas. Pueden incorporarse en las composiciones ingredientes activos adicionales. La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción alérgica o similar adversa cuando se administran a un ser humano.
En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse por pulverizadores intranasales, inhalación y/o otros vehículos de administración por aerosol. Los métodos para administrar composiciones de genes, ácidos nucleicos, y péptidos directamente a los pulmones mediante pulverizadores en aerosol nasales se han descrito, p. ej., en la Patente de EEUU 5.756.353 y Patente de EEUU 5.804.212. Asimismo, la administración de fármacos utilizando resinas de micropartícula intranasales (Takenaga et al., J Controlled Release 1998 Mar 2;52(1-2):81-7) y compuestos lisofosfatidil-glicerol (Patente de EEUU 5.725.871) son muy conocidas en las técnicas farmacéuticas. Asimismo, la administración ilustrativa de fármacos transmucosal en la forma de una matriz de soporte de politetrafluoroetileno se describe en la Patente de EEUU 5.780.045.
En determinadas realizaciones, se utilizan liposomas, nanocápsulas, micropartículas, partículas lipídicas, vesículas, y semejantes, para la introducción de las composiciones de la presente invención en células/organismos anfitriones adecuados. En particular, las composiciones de la presente invención pueden formularse para administrarse encapsuladas en una partícula lipídica, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera, o una nanopartícula o semejantes. Alternativamente, las composiciones de la presente invención pueden unirse, covalentemente o no covalentemente, a la superficie de dichos vehículos.
La formación y utilización de preparaciones de liposomas y semejantes a liposomas como vehículos potenciales de fármacos es conocida generalmente para los expertos en la técnica (véanse por ejemplo, Lasic, Trends Biotechnol 1998 Jul;16(7):307-21; Takakura, Nippon Rinsho 1998 Mar;56(3):691-5; Chandran et al., Indian J Exp Biol. 1997 Ago;35(8):801-9; Margalit, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1995;12(2-3):233-61; Patente de EEUU 5.567.434; Patente de EEUU 5.552.157; Patente de EEUU 5.565.213; Patente de EEUU 5.738.868 y Patente de EEUU 5.795.587.
Los liposomas se han utilizado con éxito con varios tipos celulares que normalmente son difíciles de transfectar mediante otros procedimientos, incluyendo suspensiones de células T, cultivos primarios de hepatocitos y células PC 12 (Renneisen et al., J Biol Chem. 1990 Sep 25;265(27):16337-42; Muller et al., DNA Cell Biol. 1990 Abr;9(3):221-9). Además, los liposomas no contienen las restricciones de longitud del ADN que son típicas de sistemas de administración basados en virus. Los liposomas se han utilizado eficazmente para introducir genes, varios fármacos, agentes radioterapéuticos, enzimas, virus, factores de la transcripción, efectores alostéricos y semejantes, en una variedad de líneas celulares cultivadas y animales. Además, no parece que la utilización de liposomas esté asociada con respuestas autoinmunes o toxicidad inaceptable después de la administración sistémica.
En determinadas realizaciones, los liposomas se forman a partir de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas bicapa concéntricas multilamelares (también denominadas vesículas multilamelares (MLV)).
Alternativamente, en otras realizaciones, la invención proporciona formulaciones de nanocápsulas farmacéuticamente aceptables de las composiciones de la presente invención. Las nanocápsulas pueden contener generalmente compuestos de una manera estable y reproducible (véase, por ejemplo, Quintanar-Guerrero et al., Drug Dev Ind Pharm. 1998 Dic;24(12):1113-28). Para evitar efectos secundarios debidos a sobrecarga polimérica intracelular, dichas partículas ultrafinas (con un tamaño de aproximadamente 0,1 \mum) pueden diseñarse utilizando polímeros capaces de degradarse in vivo. Dichas partículas pueden prepararse como se describe, por ejemplo, en Couvreur et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1988;5(1):1-20; zur Muhlen et al., Eur J Pharm Biopharm. 1998 Mar;45(2):149-55; Zambaux et al., J Controlled Release. 1998 Ene 2;50(1-3):31-40; y Patente de EEUU 5.145.684.
Métodos Terapéuticos de Cáncer
Los métodos inmunológicos para la terapia del cáncer se basan en el reconocimiento de que las células cancerosas pueden evitar habitualmente las defensas del cuerpo frente a células y moléculas aberrantes o extrañas, y que estas defensas podrían estimularse terapéuticamente para recuperar el terreno perdido, p. ej., p. 623-648 en Klein, Immunology (Wiley-Interscience, Nueva York, 1982). Numerosas observaciones recientes de que varios factores inmunes pueden inhibir directamente o indirectamente el crecimiento de tumores han dado lugar a un interés renovado en este método para la terapia del cáncer, p. ej., Jager, et al., Oncology 2001;60(1):1-7; Renner, et al., Ann Hematol 2000 Dic;79(12):651-9.
Cuatro tipos celulares básicos cuya función se ha asociado con la inmunidad celular antitumoral y la eliminación de células tumorales del cuerpo son: i) linfocitos B que secretan inmunoglobulinas en el plasma sanguíneo para identificar y marcar las células invasoras no propias; ii) monocitos que secretan las proteínas del complemento que son responsables de la lisis y procesamiento de las células invasoras diana recubiertas con inmunoglobulina; iii) linfocitos asesinos naturales que tienen dos mecanismos para la destrucción de células tumorales, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y asesinato natural; y iv) linfocitos T que poseen receptores específicos de antígeno y que tienen la capacidad de reconocer una célula tumoral que contiene moléculas marcadoras complementarias (Schreiber, H., 1989, en Fundamental Immunology (ed) W.E. Paul, p. 923-955).
La inmunoterapia del cáncer se centra generalmente en la inducción de respuestas inmunes humorales, respuestas inmunes celulares, o ambas. Además, está bien establecido que la inducción de células T auxiliares CD4^{+} es necesaria con el fin de inducir secundariamente anticuerpos o células T citotóxicas CD8^{+}. Los antígenos polipeptídicos que son selectivos o idealmente específicos para las células cancerosas, particularmente células de cáncer de pulmón, ofrecen un método poderoso para inducir respuestas inmunes frente al cáncer de pulmón, y son un aspecto importante de la presente invención.
Por lo tanto, en aspectos adicionales de la presente invención, las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria pueden utilizarse para el tratamiento del cáncer, particularmente para la inmunoterapia del cáncer de pulmón. En dichos métodos, las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria se administran a un paciente, típicamente un animal de sangre caliente, preferiblemente un ser humano. Un paciente puede o no puede padecer cáncer. De acuerdo con esto, las composiciones farmacéuticas anteriores pueden utilizarse para prevenir el desarrollo de un cáncer o para tratar un paciente que padece un cáncer. Las composiciones farmacéuticas y vacunas pueden administrarse antes o después de la eliminación quirúrgica de tumores primarios y/o del tratamiento tal como administración de radioterapia o fármacos quimioterapéuticos tradicionales. Como se ha discutido anteriormente, la administración de las composiciones farmacéuticas puede ser por cualquier método adecuado, incluyendo administración por ruta intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal, intradérmica, anal, vaginal, tópica y oral.
En determinadas realizaciones, la inmunoterapia puede ser inmunoterapia activa, en la que el tratamiento se basa en la estimulación in vivo del sistema inmune endógeno del anfitrión para reaccionar frente a tumores con la administración de agentes que modifican la respuesta inmune (tales como polipéptidos y polinucleótidos como se proporcionan en la presente memoria).
En otras realizaciones, las inmunoterapia puede ser inmunoterapia pasiva, en la que el tratamiento implica la administración de agentes con una reactividad inmune frente al tumor establecida (tales como células efectoras o anticuerpos) que pueden mediar directamente o indirectamente los efectos antitumorales y que no dependen necesariamente de un sistema inmune del anfitrión intacto. Los ejemplos de células efectoras incluyen células T como se ha discutido anteriormente, linfocitos T (tales como linfocitos T citotóxicos CD8^{+} y linfocitos T auxiliares infiltrantes de tumores CD4^{+}), células asesinas (tales como células Asesinas Naturales y células asesinas activadas por linfoquinas), células B y células presentadoras de antígenos (tales como células dendríticas y macrófagos) que expresan un polipéptido proporcionado en la presente memoria. Los receptores de las células T y los receptores de anticuerpos específicos para los polipéptidos mostrados en la presente memoria pueden clonarse, expresarse y transferirse a otros vectores o células efectoras para inmunoterapia adoptiva. Los polipéptidos proporcionados en la presente memoria también pueden utilizarse para generar anticuerpos o anticuerpos antiidiotípicos (como se ha descrito anteriormente y en la Patente de EEUU No. 4.918.164) para inmunoterapia pasiva.
Los anticuerpos monoclonales pueden marcarse con cualquiera de una variedad de marcadores para las utilizaciones selectivas deseadas en la detección, ensayos de diagnóstico o aplicaciones terapéuticas (como se describe en las Patentes de EEUU Nos. 6.090.365; 6.015.542; 5.843.398; 5.595.721; y 4.708.930). En cada caso, la unión del anticuerpo monoclonal marcado al sitio determinante del antígeno señalará la detección o administración de un agente terapéutico particular al determinante antigénico en la célula no normal. Un objeto adicional de esta invención es proporcionar el anticuerpo monoclonal específico marcado adecuadamente para conseguir dichas utilizaciones selectivas deseadas de éste.
Las células efectoras pueden obtenerse generalmente en cantidades suficientes para inmunoterapia adoptiva por crecimiento in vitro, como se describe en la presente memoria. Las condiciones de cultivo para expandir células efectoras únicas específicas de antígeno a varios billones en número con la retención del reconocimiento del antígeno in vivo son muy conocidas en la técnica. Dichas condiciones de cultivo in vitro utilizan típicamente estimulación intermitente con el antígeno, habitualmente en presencia de citoquinas (tales como IL-2) y células de alimentación que no se dividen. Como se ha indicado anteriormente, los polipéptidos inmunoreactivos como se proporcionan en la presente memoria pueden utilizarse para expandir rápidamente cultivos de células T específicas de antígeno con el fin de generar un número suficiente de células para inmunoterapia. En particular, las células presentadoras de antígeno, tales como células dendríticas, macrófagos, monocitos, fibroblastos y/o células B, pueden pulsarse con polipéptidos inmunoreactivos o transfectarse con uno o más polinucleótidos utilizando técnicas estándar muy conocidas en la técnica. Por ejemplo, las células presentadoras de antígeno pueden transfectarse con un polinucleótido que tiene un promotor apropiado para incrementar la expresión en un virus recombinante u otro sistema de expresión. Las células efectoras cultivadas para utilizarse en terapia deben ser capaces de crecer y distribuirse ampliamente, y de sobrevivir a largo plazo in vivo. Los estudios han mostrado que las células efectoras cultivadas pueden inducirse para crecer in vivo y para sobrevivir a largo plazo en números sustanciales por la estimulación reiterada con antígeno suplementado con IL-2 (véase, por ejemplo, Cheever et al., Immunological Reviews 157:177, 1997).
Alternativamente, un vector que expresa un polipéptido mostrado en la presente memoria puede introducirse en células presentadoras de antígenos tomadas de un paciente y propagarse por clonación ex vivo para transplantarlas de nuevo al mismo paciente. Las células transfectadas pueden reintroducirse en el paciente utilizando cualquier medio conocido en la técnica, preferiblemente en forma estéril por administración intravenosa, intracavitaria, intraperitoneal o intratumoral.
Las rutas y la frecuencia de administración de las composiciones terapéuticas descritas en la presente memoria, así como la dosificación, variarán de un individuo a otro, y pueden establecerse fácilmente utilizando técnicas estándar. En general, las composiciones farmacéuticas y vacunas pueden administrarse por inyección (p. ej., intracutánea, intramuscular, intravenosa o subcutánea), intranasalmente (p. ej., por aspiración) u oralmente. Preferiblemente, pueden administrarse entre 1 y 10 dosis en un periodo de 52 semanas. Preferiblemente, se administran 6 dosis, a intervalos de 1 mes, y se pueden dar vacunaciones de refuerzo periódicamente después. Para pacientes individuales pueden ser apropiados protocolos alternativos. Una dosis adecuada es una cantidad de un compuesto que, cuando se administra como se ha descrito anteriormente, es capaz de promover una respuesta inmune anti-tumoral, y es al menos 10-50% por encima del nivel basal (es decir, no tratado). Dicha respuesta puede monitorizarse midiendo los anticuerpos anti-tumorales en un paciente o por la generación dependiente de la vacuna de células efectoras citolíticas capaces de matar a las células tumorales del paciente in vitro. Dichas vacunas también deberían ser capaces de causar una respuesta inmune que da lugar a un resultado clínico mejorado (p. ej., remisiones más frecuentes, supervivencia sin enfermedad completa o parcial o más larga) en los pacientes vacunados comparado con los pacientes no vacunados. En general, para las composiciones farmacéuticas y vacunas que comprenden uno o más polipéptidos, la cantidad de cada polipéptido presente en una dosis varía de aproximadamente 25 \mug a 5 mg por kg de anfitrión. Los tamaños adecuados de las dosis variarán con el tamaño del paciente, pero variarán típicamente de aproximadamente 0,1 mL a aproximadamente 5 mL.
En general, un régimen de dosificación y tratamiento apropiado proporciona el o los compuestos activos en una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico y/o profiláctico. Dicha respuesta puede monitorizarse estableciendo un resultado clínico mejorado (p. ej., remisiones más frecuentes, supervivencia sin enfermedad completa, parcial, o más larga) en los pacientes tratados comparado con los pacientes no tratados. Los incrementos en las respuestas inmunes preexistentes frente a una proteína tumoral correlacionan generalmente con un resultado clínico mejorado. Dichas respuestas inmunes pueden evaluarse generalmente utilizando ensayos de proliferación, citotoxicidad o citoquina estándar, que pueden realizarse utilizando muestras obtenidas de un paciente antes y después del tratamiento.
Composiciones, Métodos y Kits para la Detección y Diagnóstico del Cáncer
En general, un cáncer puede detectarse en un paciente tomando como base la presencia de una o más proteínas tumorales de pulmón y/o polinucleótidos que codifican dichas proteínas en una muestra biológica (por ejemplo, sangre, suero, esputo, orina y/o biopsias del tumor) obtenidas del paciente. En otras palabras, dichas proteínas pueden utilizarse como marcadores para indicar la presencia o ausencia de un cáncer tal como cáncer de pulmón. Además, dichas proteínas pueden ser útiles para la detección de otros cánceres. Los agentes de unión proporcionados en la presente memoria permiten generalmente la detección del nivel de antígeno que se une al agente en la muestra
biológica.
Pueden utilizarse cebadores y sondas polinucleotídicas para detectar el nivel de ARNm que codifica una proteína tumoral, que también es indicativo de la presencia o ausencia de un cáncer. En general, una secuencia tumoral debería estar presente a un nivel que es al menos dos veces, preferiblemente tres veces, y más preferiblemente cinco veces o más en el tejido tumoral que en el tejido normal del mismo tipo del que surge el tumor. Los niveles de expresión de una secuencia tumoral particular en los tipos de tejidos diferentes del que ha surgido el tumor son irrelevantes en determinadas realizaciones de diagnóstico ya que la presencia de células tumorales puede confirmarse por la observación de niveles de expresión diferenciales predeterminados, p. ej., 2 veces, 5 veces, etc, en el tejido tumoral respecto a los niveles de expresión en el tejido normal del mismo tipo.
Para propósitos de diagnóstico pueden utilizarse ventajosamente otros patrones de expresión diferenciales. Por ejemplo, en un aspecto de la invención, la sobreexpresión de una secuencia tumoral en el tejido tumoral y en el tejido normal del mismo tipo, pero no en otros tipos de tejido normal, p. ej., PBMC, pueden aprovecharse para diagnóstico. En este caso, la presencia de células tumorales metastásicas, por ejemplo en una muestra tomada de la circulación o de otro sitio de tejido diferente del que ha surgido el tumor, puede identificarse y/o confirmarse detectando la expresión de la secuencia tumoral en la muestra, por ejemplo, utilizando análisis RT-PCR. En muchos casos, será deseable enriquecer la muestra de interés con células tumorales, p. ej., PBMC, utilizando técnicas de captura de células u otras técnicas semejantes.
Hay una variedad de formatos de ensayo conocidos por los expertos en la técnica para utilizar un agente de unión para detectar marcadores polipeptídicos en una muestra. Véase, p, ej., Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. En general, la presencia o ausencia de un cáncer en un paciente puede determinarse (a) poniendo en contacto una muestra biológica obtenida de un paciente con un agente de unión; (b) detectando en la muestra un nivel de polipéptido que se une al agente de unión; y (c) comparando el nivel de polipéptido con un valor de corte predeterminado.
En una realización preferida, el ensayo implica la utilización del agente de unión inmovilizado en un soporte sólido para unirse a y eliminar el polipéptido del resto de la muestra. El polipéptido unido puede detectarse utilizando un reactivo de detección que contiene un grupo informador y que se une específicamente al complejo agente de unión/polipéptido. Dichos reactivos de detección pueden comprender, por ejemplo, un agente de unión que se une específicamente al polipéptido o un anticuerpo u otro agente que se une específicamente al agente de unión, tal como una anti-inmunoglobulina, proteína G, proteína A o una lecitina. Alternativamente, puede utilizarse un ensayo competitivo, en el que un polipéptido se marca con un grupo informador y se permite que se una al agente de unión inmovilizado después de la incubación del agente de unión con la muestra. La magnitud a la cual los componentes de la muestra inhiben la unión del polipéptido marcado al agente de unión es indicativa de la reactividad de la muestra con el agente de unión inmovilizado. Los polipéptidos adecuados para utilizarse en dichos ensayos incluyen proteínas tumorales de longitud completa y partes polipeptídicas de éstas a las que se une el agente de unión, como se ha descrito anteriormente.
El soporte sólido puede ser cualquier material conocido por los expertos en la técnica al que puede unirse la proteína tumoral. Por ejemplo, el soporte sólido puede ser un pocillo de ensayo en una placa de microtitulación o una membrana de nitrocelulosa u otra membrana adecuada. Alternativamente, el soporte puede ser un lecho o disco, tal como un material de vidrio, fibra de vidrio, látex o plástico tal como poliestireno o polivinilcloruro. El soporte también puede ser una partícula magnética o un sensor de fibra óptica, tales como los descritos, por ejemplo, en la Patente de EEUU No. 5.359.681. El agente de unión puede inmovilizarse en el soporte sólido utilizando una variedad de técnicas conocidas por los expertos en la técnica, que se describen ampliamente en la bibliografía de patentes y científica. En el contexto de la presente invención, el término "inmovilización" se refiere tanto a la asociación no covalente, tal como adsorción, como unión covalente (que puede ser una unión directa entre el agente y los grupos funcionales en el soporte o puede ser una unión mediante un agente de entrecruzamiento). Se prefiere la inmovilización por adsorción a un pocillo en una placa de microtitulación o a una membrana. En dichos casos, la adsorción puede conseguirse poniendo en contacto el agente de unión, en un tampón adecuado, con el soporte sólido durante una cantidad de tiempo adecuada. El tiempo de contacto varía con la temperatura, pero es típicamente entre aproximadamente 1 hora y aproximadamente 1 día. En general, poner en contacto un pocillo de una placa de microtitulación de plástico (tal como poliestireno o polivinilcloruro) con una cantidad de agente de unión que varía de aproximadamente 10 ng a aproximadamente 10 \mug, y preferiblemente aproximadamente 100 ng a aproximadamente 1 \mug, es suficiente para inmovilizar una cantidad adecuada de agente de unión.
La unión covalente del agente de unión a un soporte sólido puede conseguirse generalmente haciendo reaccionar en primer lugar el soporte con un reactivo bifuncional que reaccionará tanto con el soporte como con un grupo funcional, tal como un grupo hidroxilo o amino, en el agente de unión. Por ejemplo, el agente de unión puede unirse covalentemente a soportes que tienen un recubrimiento de polímero apropiado utilizando benzoquinona o por condensación de un grupo aldehído en el soporte con una amina y un hidrógeno activo en la pareja de unión (véase, p. ej., Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, en A12-A13).
En determinadas realizaciones, el ensayo es un ensayo sandwich con dos anticuerpos. Este ensayo puede realizarse poniendo en contacto en primer lugar un anticuerpo que ha sido inmovilizado en un soporte sólido, habitualmente el pocillo de una placa de microtitulación, con la muestra, de manera que se permite que los polipéptidos de la muestra se unan al anticuerpo inmovilizado. La muestra no unida se elimina de los complejos polipéptido-anticuerpo inmovilizados y se añade un reactivo de detección (preferiblemente un segundo anticuerpo capaz de unirse a un sitio diferente del polipéptido) que contiene un grupo informador. La cantidad del reactivo de detección que permanece unida al soporte sólido se determina utilizando un método apropiado para el grupo informador específico.
Más específicamente, una vez que el anticuerpo está inmovilizado en el soporte como se ha descrito anteriormente, se bloquean típicamente los sitios de unión a la proteína restantes del soporte. Puede utilizarse cualquier agente bloqueante adecuado conocido por el experto en la técnica, tal como albúmina de suero bovino o Tween 20^{TM} (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). El anticuerpo inmovilizado se incuba con la muestra, y se permite que el polipéptido se una al anticuerpo. La muestra puede diluirse con un diluyente adecuado, tal como disolución salina tamponada con fosfato (PBS) antes de la incubación. En general, un tiempo de contacto apropiado (es decir, tiempo de incubación) es un periodo de tiempo que es suficiente para detectar la presencia de polipéptido en una muestra obtenida de un individuo con cáncer de pulmón. Preferiblemente, el tiempo de contacto es suficiente para conseguir un nivel de unión que es al menos aproximadamente 95% del conseguido en equilibrio entre polipéptido unido y no unido. Los expertos en la técnica reconocerán que el tiempo necesario para conseguir el equilibrio puede determinarse fácilmente ensayando el nivel de unión que ocurre durante un periodo de tiempo. A temperatura ambiente, un tiempo de incubación de aproximadamente 30 minutos es generalmente suficiente.
La muestra no unida puede eliminarse lavando el soporte sólido con un tampón apropiado, tal como PBS que contiene 0,1% Tween 20^{TM}. El segundo anticuerpo, que contiene un grupo informador, puede añadirse al soporte sólido. Los grupos informadores preferidos incluyen los grupos indicado anteriormente.
El reactivo de detección se incuba con el complejo inmovilizado anticuerpo- polipéptido durante una cantidad de tiempo suficiente para detectar el polipéptido unido. Una cantidad apropiada de tiempo puede determinarse generalmente ensayando el nivel de unión que ocurre durante un periodo de tiempo. El reactivo de detección no unido se elimina y el reactivo de detección unido se detecta utilizando el grupo informador. El método empleado para detectar el grupo informador depende de la naturaleza del grupo informador. Para grupos radiactivos, son generalmente apropiados los métodos de contaje por centelleo o autorradiográficos. Los métodos espectroscópicos pueden utilizarse para detectar colorantes, grupos luminiscentes y grupos fluorescentes. La biotina puede detectarse utilizando avidina, acoplada a un grupo informador diferente (habitualmente un grupo radiactivo o fluorescente o una enzima). Los grupos informadores enzimáticos pueden detectarse generalmente mediante la adición de sustrato (generalmente durante un periodo de tiempo específico), seguido de análisis espectroscópico u otro análisis de los productos de la
reacción.
Para determinar la presencia o ausencia de un cáncer, tal como cáncer de pulmón, la señal detectada del grupo informador que permanece unido al soporte sólido se compara generalmente con una señal que corresponde a un valor de corte predeterminado. En una realización preferida, el valor de corte para la detección de un cáncer es la señal media obtenida cuando el anticuerpo inmovilizado se incuba con muestras de pacientes sin cáncer. En general, una muestra que genera una señal que es tres desviaciones estándar mayor que el valor de corte predeterminado se considera positiva para el cáncer. En una realización alternativa preferida, el valor de corte se determina utilizando una Receiver Operator Curve, según el método de Sackett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, p. 106-7. Brevemente, en esta realización, el valor de corte puede determinarse a partir de un gráfico de pares de proporciones positivas verdaderas (es decir, sensibilidad) y proporciones positivas falsas (100% de especificidad) que corresponde a cada valor de corte posible para el resultado del ensayo de diagnóstico. El valor de corte en el gráfico más cercano a la esquina izquierda superior (es decir, el valor que incluye el área mayor) es el valor de corte más preciso, y una muestra que genera una señal que es mayor que el valor de corte determinado por este método puede considerarse positiva. Alternativamente, el valor de corte puede moverse hacia la izquierda a lo largo del gráfico, para minimizar la proporción de positivos falsos, o hacia la derecha, para minimizar la proporción de negativos falsos. En general, una muestra que genera una señal que es mayor que el valor de corte determinado por este método se considera positiva para un cáncer.
En una realización relacionada, el ensayo se realiza en un formato de flujo directo o de ensayo de tiras, en el que el agente de unión se inmoviliza en una membrana, tal como nitrocelulosa. En el ensayo de flujo directo, los polipéptidos de la muestra se unen al agente de unión inmovilizado al pasar la muestra a través de la membrana. Un segundo agente de unión marcado se une al complejo agente de unión-polipéptido al fluir una disolución que contiene el segundo agente de unión a través de la membrana. La detección del segundo agente de unión unido puede realizarse como se ha descrito anteriormente. En el formato de ensayo de tiras, un extremo de la membrana al que se une el agente de unión se sumerge en una disolución que contiene la muestra. La muestra migra a lo largo de la membrana a través de una región que contiene un segundo agente de unión y hacia el área del agente de unión inmovilizado. La concentración del segundo agente de unión en el área del anticuerpo inmovilizado indica la presencia de un cáncer. Típicamente, la concentración del segundo agente de unión en ese sitio genera un patrón, tal como una línea, que puede leerse visualmente. La ausencia de dicho patrón indica un resultado negativo. En general, la cantidad de agente de unión inmovilizado en la membrana se selecciona para generar un patrón discernible visualmente cuando la muestra biológica contiene un nivel de polipéptido que sería suficiente para generar una señal positiva en el ensayo sándwich con dos anticuerpos, en el formato discutido anteriormente. Los agentes de unión preferidos para utilizarse en dichos ensayos son anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos de estos. Preferiblemente, la cantidad de anticuerpo inmovilizado en la membrana varía de aproximadamente 25 ng a aproximadamente 1 \mug, y más preferiblemente de aproximadamente 50 ng a aproximadamente 500 ng. Dichos ensayos pueden realizarse típicamente con una cantidad muy pequeña de muestra biológica.
Por supuesto, existen numerosos protocolos de ensayos distintos que son adecuados para utilizarse con las proteínas tumorales o agentes de unión de la presente invención. Se pretende que las descripciones anteriores sean sólo ejemplares. Por ejemplo, será evidente para los expertos en la técnica que los protocolos anteriores pueden modificarse fácilmente para utilizar polipéptidos tumorales para detectar anticuerpos que se unen a dichos polipéptidos en una muestra biológica. La detección de dichos anticuerpos específicos de proteínas tumorales puede correlacionarse con la presencia de un cáncer.
Un cáncer también, o alternativamente, puede detectarse tomando como base la presencia de células T que reaccionan específicamente con una proteína tumoral en una muestra biológica. En determinados métodos, una muestra biológica que comprende células T CD4^{+} y/o CD8^{+} aisladas de un paciente se incuba con un polipéptido tumoral, un polinucleótido que codifica dicho polipéptido y/o una APC que expresa al menos una parte inmunogénica de dicho polipéptido, y se detecta la presencia o ausencia de la activación específica de las células T. Las muestras biológicas adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, células T aisladas. Por ejemplo, las células T pueden aislarse de un paciente por técnicas rutinarias (tales como por centrifugación en gradiente de densidad Ficoll/Hypaque de linfocitos de sangre periférica). Las células T pueden incubarse in vitro durante 2-9 días (típicamente 4 días) a 37ºC con el polipéptido (p. ej., 5-25 \mug/ml). Puede ser deseable incubar otra alícuota de una muestra de células T en ausencia del polipéptido tumoral para servir como control. Para las células T CD4^{+}, la activación se detecta preferiblemente evaluando la proliferación de las células T. Para las células T CD8^{+}, la activación se detecta preferiblemente evaluando la actividad citolítica. Un nivel de proliferación que es al menos dos veces mayor y/o un nivel de actividad citolítica que es al menos un 20% mayor que en pacientes sin enfermedad indica la presencia de un cáncer en el
paciente.
Como se ha indicado anteriormente, un cáncer también, o alternativamente, puede detectarse tomando como base el nivel del ARNm que codifica una proteína tumoral en una muestra biológica. Por ejemplo, pueden emplearse al menos dos cebadores oligonucleotídicos en un ensayo basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar una parte de un ADNc tumoral obtenido de una muestra biológica, en el que al menos uno de los cebadores oligonucleotídicos es específico para (es decir, híbrida con) un polinucleótido que codifica la proteína tumoral. El ADNc amplificado se separa y detecta utilizando técnicas muy conocidas en la técnica, tal como electroforesis en
gel.
De manera similar, pueden utilizarse sondas oligonucleotídicas que hibridan específicamente con un polinucleótido que codifica una proteína tumoral en un ensayo de hibridación para detectar la presencia de un polinucleótido que codifica la proteína tumoral en una muestra biológica.
Para permitir la hibridación en las condiciones del ensayo, los cebadores y sondas oligonucleotídicas deben comprender una secuencia oligonucleotídica que tiene al menos aproximadamente 60%, preferiblemente al menos aproximadamente 75% y más preferiblemente al menos aproximadamente 90% de identidad con una parte de un polinucleótido que codifica una proteína tumoral de la invención que tiene una longitud de al menos 10 nucleótidos, y preferiblemente al menos 20 nucleótidos. Preferiblemente, los cebadores y/o sondas oligonucleotídicos hibridan con un polinucleótido que codifica un polipéptido descrito en la presente memoria en condiciones moderadamente astringentes, como se han definido anteriormente. Los cebadores y/o sondas oligonucleotídicos que pueden emplearse útilmente en los métodos de diagnóstico descritos en la presente invención, tienen preferiblemente una longitud de al menos 10-40 nucleótidos. En una realización preferida, los cebadores oligonucleotídicos comprenden al menos 10 nucleótidos contiguos, más preferiblemente al menos 15 nucleótidos contiguos, de una molécula de ADN que tiene una secuencia como se describe en la presente memoria. Las técnicas tanto para los ensayos basados en PCR como los ensayos de hibridación son muy conocidas en la técnica (véanse, por ejemplo, Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.., 51:263, 1987; Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, NY,
1989).
Un ensayo preferido emplea RT-PCR, en el que la PCR se aplica junto con la transcripción inversa. Típicamente, se extrae ARN de una muestra biológica, tal como un tejido de biopsia, y se transcribe inversamente para producir moléculas de ADNc. La amplificación por PCR que utiliza al menos un cebador específico genera una molécula de ADNc, que puede separarse y visualizarse utilizando, por ejemplo, electroforesis en gel. La amplificación puede realizarse en muestras biológicas tomadas de un paciente de ensayo y de un individuo que no padece cáncer. La reacción de amplificación puede realizarse en varias diluciones de ADNc separadas por dos órdenes de magnitud. Un incremento de dos veces o mayor de la expresión en varias diluciones de la muestra del paciente de ensayo comparado con las mismas diluciones de la muestra no cancerosa se considera típicamente positivo.
En otro aspecto de la presente invención, pueden utilizarse tecnologías de captura de células junto con, por ejemplo, PCR en tiempo real para proporcionar una herramienta más sensible para la detección de células matastásicas que expresan antígenos de tumor de pulmón. La detección de células de cáncer de pulmón en muestras biológicas, p. ej., muestras de médula ósea, sangre periférica, y muestras de aspiración con aguja fina es deseable para el diagnóstico y prognosis en pacientes con cáncer de pulmón.
Pueden utilizarse lechos inmunomagnéticos recubiertos con anticuerpos monoclonales específicos para marcadores de la superficie celular, o complejos de anticuerpo tetraméricos, para enriquecer en primer lugar o seleccionar positivamente células cancerosas en una muestra. Pueden utilizarse varios kits disponibles comercialmente, incluyendo Dynabeads® Epithelial Enrich (Dynal Biotech, Oslo Noruega), StemSep^{TM} (StemCell Technologies, Inc., Vancouver, BC), y RosetteSep (StemCell Technologies). Un experto en la técnica reconocerá que también pueden utilizarse otras metodologías y kits para enriquecer o seleccionar positivamente poblaciones celulares deseadas. Dynabeads® Epithelial Enrich contiene lechos magnéticos recubiertos con Abm específicos para dos antígenos glicoproteicos de membrana expresados en tejidos epiteliales normales y neoplásicos. Los lechos recubiertos pueden añadirse a una muestra y la muestra aplicarse a un imán, capturando de esta manera las células unidas a los lechos. Las células no deseadas se eliminan por lavado y las células aisladas magnéticamente se eluyen de los lechos y se utilizan en análisis adicionales.
RosetteSep puede utilizarse para enriquecer células directamente de una muestra de sangre y consiste en una mezcla de anticuerpos tetraméricos que tienen como diana una variedad de células no deseadas y las entrecruzan a glicoforina A en las células rojas de la sangre (RBC) presentes en la muestra, formando rosetas. Cuando se centrifugan en Ficoll, las células diana sedimentan junto con las RBC libres. La combinación de anticuerpos en la mezcla de depleción determina qué células se eliminarán y consecuentemente qué células se recuperarán. Los anticuerpos disponibles incluyen, pero no están limitados a: CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD10, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD24, CD25, CD29, CD33, CD34, CD36, CD38, CD41, CD45, CD45RA, CD45RO, CD56, CD66B, CD66e, HLA-DR, IgE y TCR\alpha\beta.
Adicionalmente, se contempla en la presente invención que pueden generarse y utilizarse de manera similar Abm específicos para antígenos de tumor de pulmón. Por ejemplo, Abm que se unen a antígenos de superficie celular específicos de tumores pueden conjugarse a lechos magnéticos, o formularse en un complejo de anticuerpo tetramérico, y utilizarse para enriquecer o seleccionar positivamente células de tumor de pulmón metastásicas de una muestra. Una vez que la muestra se ha enriquecido o seleccionado positivamente, las células pueden lisarse y aislarse el ARN. El ARN puede someterse a análisis por RT-PCR utilizando cebadores específicos de tumor de pulmón en un ensayo de PCR en tiempo real como se describe en la presente memoria. Un experto en la técnica reconocerá que las poblaciones de células enriquecidas o seleccionadas pueden analizarse por otros métodos (p. ej., hibridación in situ o citometría de flujo).
En otra realización, las composiciones descritas en la presente memoria pueden utilizarse como marcadores para la progresión del cáncer. En esta realización, los ensayos descritos anteriormente para el diagnóstico de un cáncer pueden realizarse durante el tiempo, y evaluarse el cambio en el nivel de polipéptido(s) o polinucleótido(s) reactivos. Por ejemplo, los ensayos pueden realizarse cada 24-72 horas durante un periodo de 6 meses a 1 año, y posteriormente realizarse según se necesite. En general, un cáncer progresa en aquellos pacientes en los que el nivel de polipéptido o polinucleótido detectado se incrementa con el tiempo. Por el contrario, el cáncer no progresa cuando el nivel de polipéptido o polinucleótido reactivo permanece constante o disminuye con el tiempo.
Determinados ensayos de diagnóstico in vivo pueden realizarse directamente en un tumor. Uno de dichos ensayos implica poner en contacto células tumorales con un agente de unión. El agente de unión unido puede detectarse directamente o indirectamente mediante un grupo informador. Dichos agentes de unión también pueden utilizarse en aplicaciones histológicas. Alternativamente, pueden utilizarse sondas polinucleotídicas en dichas aplicaciones.
Como se ha indicado anteriormente, para mejorar la sensibilidad, pueden ensayarse en una muestra dada múltiples marcadores de proteínas tumorales. Será evidente que los agentes de unión específicos para diferentes proteínas proporcionados en la presente memoria pueden combinarse en un único ensayo. Además, pueden utilizarse simultáneamente múltiples cebadores o sondas. La selección de marcadores de proteínas tumorales puede basarse en experimentos rutinarios para determinar las combinaciones que resultan en una sensibilidad óptima. Además, o alternativamente, los ensayos de proteínas tumorales proporcionados en la presente memoria pueden combinarse con ensayos para otros antígenos tumorales conocidos.
La presente invención proporciona además kits para utilizarse en cualquiera de los métodos de diagnóstico anteriores. Dichos kits comprenden típicamente dos o más componentes necesarios para realizar un ensayo de diagnóstico. Los componentes pueden ser compuestos, reactivos, contenedores y/o equipo. Por ejemplo, un contenedor en un kit puede contener un anticuerpo monoclonal o un fragmento de éste que se une específicamente a una proteína tumoral. Dichos anticuerpos o fragmentos pueden proporcionarse unidos a un material de soporte, como se ha descrito anteriormente. Uno o más contenedores adicionales pueden incluir elementos, tales como reactivos o tampones, para utilizarse en el ensayo. Dichos kits pueden contener también, o alternativamente, un reactivo de detección como se ha descrito anteriormente que contiene un grupo informador adecuado para la detección directa o indirecta de la unión del anticuerpo.
Alternativamente, puede diseñarse un kit para detectar el nivel de ARNm que codifica una proteína tumoral en una muestra biológica. Dichos kits comprenden generalmente al menos una sonda o cebador oligonucleotídico, como se ha descrito anteriormente, que híbrida con un polinucleótido que codifica una proteína tumoral. Dicho oligonucleótido puede utilizarse, por ejemplo, en un ensayo de PCR o de hibridación. Los componentes adicionales que pueden estar presentes en dichos kits incluyen un segundo oligonucleótido y/o reactivo de diagnóstico o contenedor para facilitar la detección de un polinucleótido que codifica una proteína tumoral.
Los ejemplos siguientes se ofrecen como ilustración y no como limitación.
Ejemplos
Ejemplo 1
Aislamiento y caracterización de secuencias de ADNc que codifican polipéptidos de tumor de pulmón
Este ejemplo ilustra el aislamiento de moléculas de ADNc que codifican polipéptidos específicos de tumor de pulmón a partir de bibliotecas de ADNc de tumor de pulmón.
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A. Aislamiento de secuencias de ADNc a partir de una biblioteca de carcinoma de células escamosas de pulmón
Se construyó una biblioteca de expresión de ADNc de carcinoma de células escamosas de pulmón humano a partir de ARN poli A^{+} de un conjunto de tejidos de dos pacientes utilizando un kit Superscript Plasmid System para la Síntesis de ADNc y Clonación en Plásmido (BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD) siguiendo el protocolo del fabricante. Específicamente, se homogeneizaron tejidos de carcinoma de pulmón con politrón (Kinermatica, Suiza) y el ARN total se extrajo utilizando reactivo Trizol (BRL Life Technologies) como indica el fabricante. El ARN poli A^{+} se purificó utilizando una columna de celulosa de oligo dT como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Se sintetizó la primera hebra de ADNc utilizando el cebador NotI/Oligo-dT18. Se sintetizó ADNc de doble hebra, se ligó con adaptadores BstXI/EcoRI (Invitrogen, San Diego, CA) y se digirió con NotI. Después de un fraccionamiento por tamaño con columnas de fraccionamiento por tamaño de ADNc (BRL Life Technologies), el ADNc se ligó en el sitio BstXI/NotI de pcDNA3.1 (Invitrogen) y se transformó en células E. coli ElectroMax DH10B (BRL Life Techonologies) por electroporación.
Utilizando el mismo procedimiento, se preparó una biblioteca de expresión de ADNc de pulmón humano normal a partir de un conjunto de cuatro especímenes de tejido. Las bibliotecas de ADNc se caracterizaron determinando el número de colonias independientes, el porcentaje de clones que contienen el inserto, el tamaño medio del inserto y por análisis de secuencia. La biblioteca de carcinoma de células escamosas de pulmón contenía 2,7 x 10^{6} colonias independientes, teniendo el 100% de los clones el inserto y siendo el tamaño medio del inserto 2.100 pares de bases. La biblioteca de ADNc de pulmón normal contenía 1,4 x 10^{6} colonias independientes, teniendo el 90% de los clones insertos y siendo el tamaño medio del inserto 1.800 pares de bases. Para ambas bibliotecas, el análisis de secuencia mostró que la mayoría de los clones tenía una secuencia de ADNc de longitud completa y se sintetizaron a partir de ARNm.
La sustracción de la biblioteca de ADNc se realizó utilizando las bibliotecas anteriores de ADNc de carcinoma de células escamosas de pulmón y ADNc de pulmón normal, como describen Hara et al. (Blood, 84:189-199, 1994) con algunas modificaciones. Específicamente, se generó una biblioteca de ADNc sustraída específica de carcinoma de células escamosas de pulmón como sigue. La biblioteca de ADNc de tejido normal (80 \mug) se digirió con BamHI y XhoI, seguido de una reacción de relleno con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa. Después de extraer con fenol-cloroformo y de precipitar con etanol, el ADN se disolvió en 133 \mul de H_{2}O, se desnaturalizó con calor y se mezcló con 133 \mul (133 \mug) de Photoprobe biotina (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Como recomienda el fabricante, la mezcla resultante se irradió con una lámpara solar de 270 W en hielo durante 20 minutos. Se añadió Photoprobe biotina adicional (67\mul) y se repitió la reacción de biotinilación. Después de extraer con butanol cinco veces, el ADN se precipitó con etanol y se disolvió en 23 \mul de H_{2}O para formar el ADN conductor.
Para formar el ADN indicador, se difirieron 10 \mug de biblioteca de ADNc de carcinoma de células escamosas de pulmón con NotI y SpeI, se extrajeron con fenol cloroformo y se pasaron a través de columnas Chroma spin-400 (Clontech, Palo Alto, CA). Típicamente, se recuperaron 5 \mug de ADNc después de la columna de tamaño. Después de precipitar con etanol, el ADN indicador se disolvió en 5 \mul de H_{2}O. El ADN indicador se mezcló con 15 \mul de ADN conductor y 20 \mul de 2 x tampón de hibridación (1,5 M NaCl/10 mM EDTA/50 mM HEPES pH 7,5/0,2% dodecil sulfato sódico), se cubrió con aceite mineral y se desnaturalizó completamente con calor. La muestra se transfirió inmediatamente a un baño de agua a 68ºC y se incubó durante 20 horas (hibridación larga [LH]). La mezcla de reacción se sometió a un tratamiento con estreptavidina seguido de extracción con fenol/cloroformo. Este proceso se repitió tres veces más. El ADN sustraído se precipitó, se disolvió en 12 \mul de H_{2}O, se mezcló con 8 \mul de ADN conductor y 20 \mul de 2 x tampón de hibridación, y se sometió a una hibridación a 68ºC durante 2 horas (hibridación corta [SH]). Después de eliminar el ADN de doble hebra biotinilado, el ADNc sustraído se ligó en el sitio NotI/SpeI de pBCSK^{+} resistente a cloranfenicol (Stratagene, La Jolla, CA) y se transformó en células E. coli ElectroMax DH10B por electroporación para generar una biblioteca de ADNc sustraída específica de carcinoma de células escamosas de pulmón (referida de aquí en adelante como "sustracción de pulmón I").
Se generó una segunda biblioteca de ADNc sustraída específica de carcinoma de células escamosas de pulmón (referida como "sustracción de pulmón II") de una manera similar a la biblioteca sustracción de pulmón I, excepto en que ocho genes recuperados frecuentemente de la sustracción de pulmón I se incluyeron en el ADN conductor, y se recuperaron 24.000 clones independientes.
Para analizar las bibliotecas de ADNc sustraídas, se preparó ADN plasmídico a partir de 320 clones independientes, tomados aleatoriamente de las bibliotecas sustraídas específicas de carcinoma de células escamosas de pulmón. Los clones de ADNc representativos se caracterizaron más por secuenciación de ADN con un Secuenciador Automatizado Modelo 373A y/o Modelo 377 de Perkin Elemer/Applied Biosystems Division (Foster City, CA). Las secuencias de ADNc para sesenta clones aislados se proporcionan en SEQ ID NO: 1-60. Estas secuencias se compararon con secuencias conocidas en el banco de genes utilizando las bases de datos EMBL y GenBank (publicación 96). No se encontraron homologías significativas con las secuencias proporcionadas en SEQ ID NO: 2, 3, 19, 38 y 46. Se encontró que las secuencias de SEQ ID NO: 1, 6-8, 10-13, 15, 17, 18, 20-27, 29, 30, 32, 34-37, 39-45, 47-49, 51, 52, 54, 55 y 57-59 mostraban alguna homología con las etiquetas de secuencia expresadas (EST) identificadas previamente. Se encontró que las secuencias de SEQ ID NO: 9, 28, 31 y 33 mostraban alguna homología con secuencias de genes no humanas identificadas previamente y se encontró que las secuencias de SEQ ID NO: 4, 5, 14, 50, 53, 56 y 60 mostraban alguna homología con secuencias de genes identificadas previamente en seres humanos.
El procedimiento de sustracción descrito anteriormente se repitió utilizando la biblioteca de ADNc de carcinoma de células escamosas de pulmón anterior como el ADN indicador, y la biblioteca de ADNc de tejido de pulmón normal anterior y una biblioteca de ADNc de hígado y corazón normales (construida a partir de un conjunto de una muestra de cada tejido como se ha descrito anteriormente) más veinte clones de ADNc distintos que se recuperaron frecuentemente en las sustracciones de pulmón I y II, como el ADN conductor (sustracción de pulmón III). La biblioteca de ADNc de hígado y corazón normales contenían 1,76 x 10^{6} colonias independientes, teniendo el 100% de los clones insertos y siendo el tamaño medio del inserto 1.600 pares de bases. Se aislaron diez clones adicionales (SEQ ID NO: 61-70). La comparación de estas secuencias de ADNc con las del banco de genes como se describe anteriormente, reveló que no había homologías significativas con las secuencias proporcionadas en SEQ ID NO:62 y 67. Se encontró que las secuencias de SEQ ID NO: 61, 63-66, 68 y 69 mostraban alguna homología con las EST aisladas previamente y se encontró que la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 70 mostraba alguna homología con un gen de rata identificado previamente.
En estudios adicionales, el procedimiento de sustracción descrito anteriormente se repitió utilizando la biblioteca de ADNc de carcinoma de células escamosas de pulmón anterior como el ADN indicador, y una biblioteca de ADNc de un conjunto de pulmón, riñón, colon, páncreas, cerebro, PBMC sin activar, corazón, piel y esófago normales como el ADN conductor, constituyendo el ADNc de esófago un tercio del material conductor. Como el esófago está enriquecido con células epiteliales normales, incluyendo células escamosas diferenciadas, es probable que este procedimiento enriquezca con genes que son específicos de tumor en lugar de específicos de tejido. Las secuencias de ADNc de 48 clones determinadas en esta sustracción se proporcionan en SEQ ID NO: 177-224. Las secuencias de SEQ ID NO: 177, 178, 180, 181, 183, 187, 192, 195-197, 208, 211, 212, 215, 216, 218 y 219 mostraron alguna homología con genes identificados previamente. Las secuencias de SEQ ID NO: 179, 182, 184-186, 188-191, 193, 194, 198-207, 209, 210, 213, 214, 217, 220 y 224 mostraron alguna homología con EST determinadas previamente. La secuencia de SEQ ID NO: 221-223 no mostró homología con ninguna secuencia determinada previamente.
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B. Aislamiento de secuencias de ADNc a partir de una biblioteca de adenocarcinoma de pulmón
Se construyó una biblioteca de expresión de ADNc de adenocarcinoma de pulmón humano como se ha descrito anteriormente. La biblioteca contenía 3,2 x 10^{6} colonias independientes, teniendo el 100% de los clones un inserto y siendo el tamaño medio del inserto 1.500 pares de bases. La sustracción de la biblioteca se realizó como se ha descrito anteriormente utilizando bibliotecas de expresión de ADNc de pulmón normal e hígado y corazón normales descritas anteriormente como el ADN conductor. Se recuperaron doscientos sesenta clones independientes.
El análisis inicial de la secuencia de ADNc de 100 clones independientes reveló muchos genes de proteínas ribosomales. Las secuencias de ADNc para quince clones aislados en esta sustracción se proporcionan en SEQ ID NO: 71-86. La comparación de estas secuencias con las del banco de genes como se ha descrito anteriormente reveló que no había homologías significativas con la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 84. Se encontró que las secuencias de SEQ ID NO: 71, 73, 74, 77, 78 y 80-82 mostraban alguna homología con EST aisladas previamente y se encontró que las secuencias de SEQ ID NO: 72, 75, 76, 79, 83 y 85 mostraban alguna homología con genes humanos identificados previamente.
En estudios adicionales, se construyó una biblioteca de ADNc (referida como mets3616A) a partir de un adenocarcinoma de pulmón metastásico. Las secuencias determinadas de ADNc de 25 clones secuenciadas aleatoriamente de esta biblioteca se proporcionan en SEQ ID NO: 255-279. La biblioteca de ADNc mets3616A se sustrajo frente a una biblioteca de ADNc preparada a partir de un conjunto de pulmón, hígado, páncreas, piel, riñón, cerebro y PBMC sin activar normales. Para incrementar la especificidad de la sustracción, se adicionaron al conductor genes que se había determinado que eran los más abundantes en la biblioteca de ADNc mets3616A, tales como EF1-alfa, integrina-beta y proteína anticoagulante PP4, así como con ADNc que se había encontrado previamente que se expresaban de manera diferente en bibliotecas de ADNc sustraídas de adenocarcinoma de pulmón. Las secuencias determinadas de ADNc de 51 clones aislados a partir de la biblioteca sustraída (referida como mets3616A-S1) se proporcionan en SEQ ID NO: 280-330.
La comparación de las secuencias de SEQ ID NO: 255-330 con las presentes en bases de datos públicas reveló que no había homologías significativas con las secuencias de SEQ ID NO: 255-258, 260, 262-264, 270, 272, 275, 276, 279, 281, 287, 291, 296, 300 y 310. Las secuencias de SEQ ID NO: 259, 261, 265-269, 271, 273, 274, 277, 278, 282-285, 288-290, 292, 294, 297-299, 301, 303-309, 313, 314, 316, 320-324 y 326-330 mostró alguna homología con secuencias de genes identificadas previamente, mientras que las secuencias de SEQ ID NO: 280, 286, 293, 302, 310, 312, 315, 317-319 y 325 mostraron alguna homología con etiquetas de secuencia expresadas (EST) aisladas previamente.
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Ejemplo 2
Determinación de la especificidad de tejido de polipéptidos de tumor de pulmón
Utilizando cebadores específicos de genes, se examinaron los niveles de expresión de ARNm para siete polipéptidos de tumor de pulmón representativos descritos en el Ejemplo 1 en una variedad de tejidos normales y tumorales utilizando RT-PCR.
Brevemente, se extrajo el ARN total de una variedad de tejidos normales y tumorales utilizando el reactivo Triazol como se ha descrito anteriormente. Se realizó una síntesis de la primera hebra utilizando 2 \mug de ARN total con la transcriptasa inversa SuperScript II (BRL Life Technologies) a 42ºC durante una hora. El ADNc se amplificó por PCR con cebadores específicos de genes. Para asegurar la naturaleza semi-cuantitativa de la RT-PCR, se utilizó \beta-actina como un control interno para cada uno de los tejidos examinados. Se empleó 1 \mul de una dilución 1:30 de ADNc para permitir la amplificación en un rango lineal del molde de \beta-actina y fue lo suficientemente sensible como para reflejar las diferencias en los números de copias iniciales. Utilizando estas condiciones, se determinaron los niveles de \beta-actina para cada reacción de transcripción inversa de cada tejido. La contaminación de ADN se minimizó por tratamiento con ADNasa y asegurando un resultado de PCR negativo cuando se utiliza ADNc de primera hebra que se preparó sin añadir transcriptasa inversa.
Los niveles de expresión de ARNm se examinaron en cinco tipos diferentes de tejido tumoral (carcinoma de células escamosas de pulmón de 3 pacientes, adenocarcinoma de pulmón, tumor de colon de 2 pacientes, tumor de mama y tumor de próstata) y trece tejidos normales diferentes (pulmón de 4 donantes, próstata, cerebro, riñón, hígado, ovario, músculo esquelético, piel, intestino delgado, estómago, miocardio, retina y testículos). Utilizando una cantidad de 10 veces de ADNc, se encontró que el antígeno LST-S1-90 (SEQ ID NO: 3) se expresaba a niveles altos en carcinoma de células escamosas de pulmón y en tumor de mama, y a niveles bajos a indetectables en los demás tejidos examinados.
El antígeno LST-S2-68 (SEQ ID NO: 15) parece ser específico de tumor de pulmón y de mama, sin embargo, también se detectó expresión en el riñón normal. Los antígenos LST-S1-169 (SEQ ID NO: 6) y LST-S1-133 (SEQ ID NO: 5) parecen menos abundantes en los tejidos de pulmón (tanto normales como tumorales), estando la expresión de estos dos genes disminuida en la mayoría de los tejidos normales ensayados. Tanto LST-S1-169 como LST-S1-133 también se expresaban en los tumores de mama y colon. Los antígenos LST-S1-6 (SEQ ID NO: 7) y LST-S2-I2-5F (SEQ ID NO: 47) no mostraron una expresión específica de tumor o de tejido, siendo la expresión de LST-S1-28 rara y sólo detectable en pocos tejidos. El antígeno LST-S3-7 (SEQ ID NO: 63) mostró una expresión específica de tumor de pulmón y de mama, detectándose su mensajero sólo en los testículos normales cuando la PCR se realizó durante 30 ciclos. Se detectó un nivel de expresión menor en algunos tejidos normales cuando el número de ciclos se incrementó a 35. Se encontró que el antígeno LST-S3-13 (SEQ ID NO: 66) se expresaba en 3 de 4 tumores de pulmón, un tumor de mama y en las dos muestras de tumor de colon. Su expresión en los tejidos normales fue menor comparada con los tumores, y sólo se detectó en 1 de los 4 tejidos de pulmón normales y en los tejidos normales de riñón, ovario y retina. La expresión de los antígenos LST-S3-4 (SEQ ID NO: 62) y LST-S3-14 (SEQ ID NO: 67) fue rara y no mostró ninguna especificidad de tejido o de tumor. Consistente con los análisis de transferencia Northern, los resultados de RT-PCR en el antígeno LAT-S1-A-10A (SEQ ID NO: 78) sugirieron que su expresión es alta en tejidos de pulmón, colon, estómago e intestino delgado, incluyendo los tumores de pulmón y de colon, mientras que su expresión fue baja o indetectable en otros tejidos.
Un total de 2.002 fragmentos de ADNc aislados en las sustracciones de pulmón I, II y III, descritas anteriormente, se amplificaron por PCR de colonia y sus niveles de expresión de ARNm en tejidos de tumor de pulmón, pulmón normal, y varios tejidos diferentes normales y tumorales se determinó utilizando tecnología de micromatriz (Synteni, Palo Alto, CA). Brevemente, los productos de la amplificación por PCR se motearon en portaobjetos en un formato de matriz, ocupando cada producto una única localización en la matriz. El ARNm se extrajo de la muestra de tejido que se iba a ensayar, se transcribió inversamente, y se generaron sondas de ADNc marcadas con fluorescencia. Las micromatrices se ensayaron con las sondas de ADNc marcadas, los portaobjetos se escanearon y se midió la intensidad de la fluorescencia. Esta intensidad se correlaciona con la intensidad de la hibridación. Diecisiete clones de ADNc no redundantes mostraron una sobreexpresión en tumores escamosos de pulmón, siendo la expresión en los tejidos normales ensayados (pulmón, piel, nódulo linfático, colon, hígado, páncreas, mama, corazón, médula ósea, intestino grueso, riñón, estómago, cerebro, intestino delgado, vejiga y glándula salival) indetectable, o 10 veces menor comparado con los tumores escamosos de pulmón. Las secuencias de ADNc determinadas para el clon L513S se proporcionan en SEQ ID NO: 87 y 88, las de L514S se proporcionan en SEQ ID NO: 89 y 90; las de L516S en SEQ ID NO: 91 y 92; la de L517S en SEQ ID NO: 93; la de L519S en SEQ ID NO: 94; las de L520S en SEQ ID NO: 95 y 96; las de L521S en SEQ ID NO: 97 y 98; la de L522S en SEQ ID NO: 99; la de L523S en SEQ ID NO: 100; la de L524S en SEQ ID NO: 101; la de L525S en SEQ ID NO: 102; la de L526S en SEQ ID NO: 103; la de L527S en SEQ ID NO: 104; la de L528S en SEQ ID NO: 105; la de L529S en SEQ ID NO: 106; y las de L530S en SEQ ID NO: 107 y 108. Adicionalmente, la secuencia de ADNc de longitud completa para L530S se proporciona en SEQ ID NO: 151, proporcionándose la secuencia de aminoácidos correspondiente en SEQ ID NO: 152. L530S muestra homología con una variante de corte y empalme de un homólogo del supresor de tumores p53, p63. Las secuencias de ADNc de 7 isoformas conocidas de p63 se proporcionan en SEQ ID NO: 331-337, proporcionándose las secuencias de aminoácidos correspondientes en SEQ ID NO: 338-344, respectivamente.
Debido a polimorfismos, el clon L531S parece tener dos formas. Una primera secuencia de ADNc de longitud completa determinada para L531S se proporciona en SEQ ID NO: 109, proporcionándose la secuencia de aminoácidos correspondiente en SEQ ID NO: 110. Una segunda secuencia de ADNc de longitud completa determinada para L531S se proporciona en SEQ ID NO: 111, proporcionándose la secuencia de aminoácidos correspondiente en SEQ ID NO: 112. La secuencia de SEQ ID NO: 111 es idéntica a la de SEQ ID NO: 109, excepto en que contiene una inserción de 27 pb. De manera similar, L514S tiene dos formas de corte y empalme alternativas; el primer ADNc variante se lista como SEQ ID NO: 153, proporcionándose la secuencia de aminoácidos correspondiente en SEQ ID NO: 155. El ADNc de longitud completa para la segunda forma variante de L514S se proporciona en SEQ ID NO: 154, proporcionándose la secuencia de aminoácidos correspondiente en SEQ ID NO: 156.
La clonación de longitud completa para L524S (SEQ ID NO: 101) rindió dos variantes (SEQ ID NO: 163 y 164) con las secuencias de aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 165 y 166, respectivamente. Se ha mostrado que ambas variantes codifican el péptido relacionado con la hormona paratiroidea.
Los intentos de aislar el ADNc de longitud completa para L519S, resultaron en el aislamiento de la secuencia de ADNc extendida proporcionada en SEQ ID NO: 173, que contiene un marco de lectura abierto potencial. La secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de SEQ ID NO: 173 se proporciona en SEQ ID NO: 174. Adicionalmente, la secuencia de ADNc de longitud completa para el clon de SEQ ID NO: 100 (conocido como L523S), un gen conocido, se proporciona en SEQ ID NO: 175,. proporcionándose la secuencia de aminoácidos correspondiente en SEQ ID NO: 176. En estudios adicionales, se aisló una secuencia de ADNc de longitud completa para L523S a partir de una biblioteca de ADNc tumoral positiva para L523S por amplificación por PCR utilizando cebadores específicos de genes diseñados a partir de la secuencia de SEQ ID NO: 175. La secuencia de ADNc de longitud completa determinada se proporciona en SEQ ID NO: 347. La secuencia de aminoácidos codificada por esta secuencia se proporciona en SEQ ID NO: 348. Esta secuencia proteica se diferencia de la secuencia proteica publicada previamente en dos posiciones de aminoácidos, concretamente en las posiciones 158 y 410.
La comparación de las secuencias de L514S y L531S (SEQ ID NO: 87 y 88, y 109, respectivamente) con las del banco de genes, como se ha descrito anteriormente, reveló que no había homologías significativas con secuencias conocidas. Se encontró que las secuencias de L513S, L516S, L517S, L519S, L520S y L530S (SEQ ID NO: 87 y 88, 91 y 92, 93, 94, 95 y 96, 107 y 108, respectivamente) mostraban alguna homología con EST identificadas previamente. Se encontró que las secuencias de L521S, L522S, L523S, L524S, L525S, L526S, L527S, L528S y L529S (SEQ ID NO: 97 y 98, 99, 101, 102, 103, 104, 105 y 106, respectivamente) representaban genes conocidos. La secuencia de ADNc de longitud completa determinada para L520S se proporciona en SEQ ID NO: 113, proporcionándose la secuencia de aminoácidos correspondiente en SEQ ID NO: 114. Análisis posteriores de micromatriz mostraron que L520S estaba sobreexpresado en los tumores de mama además de en los tumores escamosos de pulmón.
Análisis adicionales demostraron que L529S (SEQ ID NO: 106 y 115), L525S (SEQ ID NO: 102 y 120) y L527S (SEQ ID NO: 104) son componentes del citoesqueleto y potencialmente proteínas específicas de las células escamosas. L529S es conexina 26, una proteína de unión comunicante. Se encontró que estaba altamente expresada en un tumor escamoso de pulmón, referido como 9688T, y moderadamente sobreexpresada en dos más. Sin embargo, también es detectable un nivel de expresión menor de conexina 26 en la piel, colon, hígado y estómago normales. Se ha publicado la sobreexpresión de conexina 26 en algunos tumores de mama y una forma mutada de L529S puede resultar en la sobreexpresión en tumores de pulmón. L525S es placofilina 1, una proteína desmosomal encontrada en placas que presentan uniones adherentes de la piel. Los niveles de expresión para el ARNm de L525S estaban muy elevados en tres de los cuatro tumores escamosos de pulmón ensayados, y en la piel normal. L527S se ha identificado como la isoforma 6 de la queratina, queratina tipo II de 58 Kd y citoqueratina 13, y muestra sobreexpresión en tumores escamosos y baja expresión en tejidos normales de piel, mama y colon. Se han documentado ampliamente los genes de queratina y los relacionados con queratina como marcadores potenciales para el cáncer de pulmón incluyendo CYFRA2.1 (Pastor, A., et al, Eur. Respir. J., 10:603-609, 1997). L513S (SEQ ID NO: 87 y 88) muestra una sobreexpresión moderada en varios tejidos tumorales ensayados, y codifica una proteína que se aisló en primer lugar como un antígeno de pénfigo vulgar.
L520S (SEQ ID NO: 95 y 96) y L521S (SEQ ID NO: 97 y 98) están altamente expresados en los tumores escamosos de pulmón, estando L520S regulado al alza en la glándula salivar normal y estando L521S sobreexpresado en la piel normal. Ambos pertenecen a una familia de proteínas pequeñas ricas en prolina y representan marcadores para las células escamosas totalmente diferenciadas. L521S se ha descrito como un marcador específico para el tumor escamoso de pulmón (Hu, R., et al, Lung Cancer, 20:25-30, 1998). L515S (SEQ ID NO: 162) codifica IGF-\beta2 y L516S es un homólogo de la aldosa reductasa. Ambos están moderadamente expresados en los tumores escamosos de pulmón y en el colon normal. Notablemente, L516S (SEQ ID NO: 91 y 92) está regulado al alza en los tumores metastásicos pero no en adenocarcinoma de pulmón primario, una indicación de su papel potencial en las metástasis y un marcador prognóstico potencial. L522S (SEQ ID NO: 99) está moderadamente sobreexpresado en los tumores escamosos de pulmón con una expresión mínima en los tejidos normales. Se ha mostrado que L522S pertenece a la clase IV de una alcohol deshidrogenasa, ADH7, y su perfil de expresión sugiere que es un antígeno específico de las células escamosas. L523S (SEQ ID NO: 100) está moderadamente sobreexpresado en el tumor escamoso de pulmón, líneas celulares de cáncer pancreático humano y tejidos de cáncer pancreático, lo que sugiere que este gen puede ser un antígeno común entre el cáncer pancreático y el de las células escamosas de pulmón.
L524S (SEQ ID NO: 101) está sobreexpresado en la mayoría de los tumores escamosos ensayados y es homólogo al péptido relacionado con la hormona paratiroidea (PTHrP), que se sabe que causa hipercalcemia humoral asociada con tumores malignos tales como leucemia, cáncer de próstata y mama. También se cree que lo más habitual es que PTHrP está asociado con el carcinoma escamoso de pulmón y raramente con adenocarcinoma de pulmón (Davidson, L.A., et al, J. Pathol., 178:398-401, 1996). L528S (SEQ ID NO: 105) está altamente sobreexpresado en dos tumores escamosos de pulmón con una expresión moderada en dos tumores escamosos más, un adenocarcinoma de pulmón y algunos tejidos normales, incluyendo piel, nódulos linfáticos, corazón, estómago y pulmón. Codifica el gen NMB que es similar al precursor del gen específico de melanocitos Pmel17, que se ha publicado que se expresa preferentemente en líneas celulares de melanoma con un bajo potencial metastásico. Esto sugiere que L528S puede ser un antígeno común en melanoma y en carcinoma de células escamosas de pulmón. L526S (SEQ ID NO: 103) estaba sobreexpresado en todos los tejidos de tumor de células escamosas de pulmón ensayados y se ha mostrado que comparte homología con un gen (ATM) en el que una mutación causa ataxia telangiectasia, un trastorno genético en los seres humanos que causa una predisposición al cáncer, entre otros síntomas. ATM codifica una proteína que activa un punto de control del ciclo celular mediado por p53 a través de la unión directa y la fosforilación de la molécula de p53. Aproximadamente el 40% de los cánceres de pulmón está asociado con mutaciones en p53, y se especula que la sobreexpresión de ATM es un resultado de la compensación de la pérdida de la función de p53, pero no se sabe si la sobreexpresión es la causa o el resultado del carcinoma de células escamosas de pulmón. Adicionalmente, la expresión de L526S (ATM) también se detecta en metástasis pero no en adenocarcinoma de pulmón, lo que sugiere un papel en la metástasis.
La expresión de L523S (SEQ ID NO: 175), se examinó por RT-PCR en tiempo real como se ha descrito anteriormente. En un primer estudio utilizando un panel de tumores escamosos de pulmón, se encontró que L523S se expresaba en 4/7 tumores escamosos de pulmón, 2/3 tumores escamosos de cabeza y cuello y 2/2 adenocarcinomas de pulmón, observándose un bajo nivel de expresión en músculo esquelético, velo del paladar y amígdalas. En un segundo estudio utilizando un panel de adenocarcinoma de pulmón, la expresión de L523S se observó en 4/9 adenocarcinmas primarios, 2/2 efusiones pleurales de pulmón, 1/1 adenocarcinomas de pulmón metastásicos y 2/2 tumores escamosos de pulmón, observándose una pequeña expresión en los tejidos normales.
La expresión de L523S en tumores de pulmón y en varios tejidos normales también se examinó por análisis de transferencia Northern, utilizando técnicas estándar. En un primer estudio, se encontró que L523S se expresaba en varios adenocarcinomas de pulmón y carcinomas de células escamosas de pulmón, así como en amígdalas normales. No se observó expresión en el pulmón normal. En un segundo estudio utilizando una transferencia de tejido normal (referida como HB-12) de Clontech, no se observó expresión en el cerebro, músculo esquelético, colon, timo, bazo, riñón, hígado, intestino delgado, pulmón o PBMC, aunque hubo una fuerte expresión en placenta.
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Ejemplo 3
Aislamiento y caracterización de polipéptidos de tumor de pulmón por sustracción basada en PCR
Se obtuvieron ochocientos cincuenta y siete clones de una biblioteca de sustracción de ADNc,que contiene ADNc de un conjunto de dos tumores escamosos de pulmón humano sustraído frente a ocho ADNc de tejidos humanos normales incluyendo pulmón, PBMC, cerebro, corazón, riñón, hígado, páncreas y piel (Clontech, Palo Alto, CA) y se sometieron a un primer ciclo de amplificación por PCR. Esta biblioteca se cometió a un segundo ciclo de amplificación por PCR, según el protocolo del fabricante. Los fragmentos de ADNc resultantes se subclonaron en el vector P7-Adv (Clontech, Palo Alto, CA) y se transformaron en E. coli DH5\alpha (Gibco, BRL). Se aisló el ADN de clones independientes y se secuenció utilizando un Secuenciador Automatizado Modelo 373A de Perkin Elmer/Applied Biosystems División.
Se secuenciaron ciento sesenta y dos clones positivos. La comparación de las secuencias de ADN de estos clones con las de las bases de datos EMBL y GenBank, como se ha descrito anteriormente, reveló que no había homologías significativas con 13 de estos clones, referidos de ahora en adelante en la presente memoria como Contigs 13, 16, 17, 19, 22, 24, 29, 47, 49, 56-59. Las secuencias de ADNc determinadas para estos clones se proporcionan en SEQ ID NO: 125, 127-129, 131-133, 142, 144, 148-150, y 157, respectivamente. Se encontró que los Contigs 1, 3-5, 7-10, 12, 11, 15, 20, 31, 33, 38, 39, 41, 43, 44, 45, 48, 50, 53, 54 (SEQ ID NO: 115-124, 126, 130, 134-141, 143, 145-147, respectivamente) mostraban algún grado de homología con secuencias de ADN identificadas previamente. Se encontró que el Contig 57 (SEQ ID NO: 149) representaba al clon L519S (SEQ ID NO: 94) descrito en la Solicitud de Patente de EEUU No. 09/123.912, presentada el 27 de Julio, 1998. Que el inventor sepa, no se ha mostrado previamente que ninguna de estas secuencias se sobreexpresa de manera diferencial en los tumores de pulmón.
Los niveles de expresión de ARNm para clones representativos en tejidos de tumor de pulmón, tejidos de pulmón normales (n=4), PBMC sin activar, glándula salivar, corazón, estómago, nódulos linfáticos, músculo esquelético, velo del paladar, intestino delgado, intestino grueso, bronquios, vejiga, amígdalas, riñón, esófago, médula ósea, colon, glándula adrenal, páncreas y piel (todos obtenidos de seres humanos) se determinaron por RT-PCR como se ha descrito anteriormente. Los niveles de expresión utilizando tecnología de micromatrices, como se ha descrito anteriormente, se examinaron en una muestra de cada tipo de tejido a no ser que se indique otra cosa.
Se encontró que el Contig 3 (SEQ ID NO: 116) estaba altamente expresado en todos los tumores de células escamosas de cabeza y cuello ensayados (17/17), y estaba expresado en la mayoría (8/12) de los tumores escamosos de pulmón (expresión alta en 7/12, moderada en 2/12 y baja en 2/12), mientras mostraba una expresión negativa para 2/4 tejidos de pulmón normales y baja expresión en las dos muestras restantes. El Contig 3 mostró una expresión moderada en piel y velo del paladar, y unos niveles de expresión disminuidos en PBMC sin activar, intestino grueso, glándula salivar, amígdalas, páncreas, esófago, y colon. Se encontró que el Contig 11 (SEQ ID NO: 124) estaba expresado en todos los tumores de células escamosas de cabeza y cuello ensayados (17/17), observándose unos niveles altos de expresión en 14/17 tumores, y observándose unos niveles moderados de expresión en 3/17 tumores. Adicionalmente, se observó una expresión alta en 3/12 tumores escamosos de pulmón y expresión moderada en 4/12 tumores escamosos de pulmón. El Contig 11 fue negativo para 3/4 de las muestras de pulmón normal, teniendo la muestra restante sólo una baja expresión. El Contig 11 mostró baja a moderada reactividad frente a glándula salivar, velo del paladar, vejiga, amígdalas, piel, esófago e intestino grueso. Se encontró que el Contig 13 (SEQ ID NO: 125) estaba expresado en todos los tumores de células escamosas de cabeza y cuello ensayados (17/17), con expresión alta en 12/17, y expresión moderada en 5/17. El Contig 13 estaba expresado en 7/12 tumores escamosos de pulmón, con expresión alta en 4/12 y expresión moderada en tres muestras. El análisis de las muestras de pulmón normal mostró una expresión negativa para 2/4 y expresión baja a moderada en las dos muestras restantes. El Contig 13 mostró una reactividad baja a moderada frente a PBMC sin activar, glándula salivar, vejiga, páncreas, amígdalas, piel, esófago, e intestino grueso, así como una expresión alta en velo del paladar. Los trabajos de clonación de longitud completa posteriores revelaron que Contig 13 (también conocido como L761P) se localiza en la región 3' no traducida del gen hSec10p. La secuencia de longitud completa para este gen se muestra en SEQ ID NO: 368, y codifica la proteína mostrada en SEQ ID NO: 369.
Se encontró que el Contig 16 (SEQ ID NO: 127) estaba expresado moderadamente en varios tumores de células escamosas de cabeza y cuello (6/17) y un tumor escamoso de pulmón, mientras que no mostraba expresión en ninguna de las muestras de pulmón normal ensayadas. El Contig 16 mostró una reactividad baja frente a PBMC sin activar, intestino grueso, piel, glándula salivar, y velo del paladar. Se mostró que el Contig 17 (SEQ ID NO: 128) se expresaba en todos los tumores de células escamosas de cabeza y cuello ensayados (17/17) (altamente expresado en 5/17, y moderadamente expresado en 12/17). La determinación de los niveles de expresión en los tumores escamosos de pulmón mostró una muestra de tumor con una expresión alta y 3/12 con niveles moderados. El Contig 17 fue negativo para 2/4 de las muestras de pulmón normal, teniendo las muestras restantes sólo una expresión baja. Adicionalmente, se encontró un nivel bajo de expresión en esófago y velo del paladar. Se encontró que el Contig 19 (SEQ ID NO: 129) estaba expresado en la mayoría de los tumores de células escamosas de cabeza y cuello ensayados (11/17), teniendo dos muestras unos niveles de expresión altos, mostrando 6/17 expresión moderada y encontrándose una expresión baja en 3/17. El ensayo en los tumores escamosos de pulmón reveló sólo expresión moderada en 3/12 muestras. Los niveles de expresión en 2/4 de las muestras de pulmón normal fueron negativos, teniendo las dos muestras restantes sólo expresión baja. El Contig 19 mostró unos niveles de expresión bajos en esófago, PBMC sin activar, glándula salivar, vejiga, velo del paladar y páncreas.
Se mostró que el Contig 22 (SEQ ID NO: 131) estaba expresado en la mayoría de los tumores de células escamosas de cabeza y cuello ensayados (13/17) con expresión alta en cuatro de estas muestras, expresión moderada en 6/17 y expresión baja en 3/17. Se encontró que los niveles de expresión en los tumores escamosos de pulmón eran moderados a altos para 3/12 tejidos ensayados, con una expresión negativa en dos muestras de pulmón normal y expresión baja en dos muestras más (n=4). El Contig 22 mostró expresión baja en la piel, glándula salivar y velo del paladar. De manera similar, se encontró que el Contig 24 (SEQ ID NO: 132) estaba expresado en la mayoría de los tumores de células escamosas de cabeza y cuello ensayados (13/17) con expresión alta en tres de estas muestras, expresión moderada en 6/17 y expresión baja en 4/17. Se encontró que los niveles de expresión en los tumores escamosos de pulmón eran moderados a altos para 3/12 tejidos ensayados, con una expresión negativa para tres muestras de pulmón normal y expresión baja en una muestra (n=4). El Contig 24 mostró expresión baja en piel, glándula salivar y velo del paladar. El Contig 29 (SEQ ID NO: 133) estaba expresado en casi todos los tumores de células escamosas de cabeza y cuello ensayados (16/17), altamente expresado en 4/17, moderadamente expresado en 11/17, con expresión baja en una muestra. También, estaba moderadamente expresado en 3/12 tumores escamosos de pulmón, mientras que era negativo para 2/4 muestras de pulmón normal. El Contig 29 mostró una expresión baja a moderada en intestino grueso, piel, glándula salivar, páncreas, amígdalas, corazón y velo del paladar. El Contig 47 (SEQ ID NO: 142) estaba expresado en la mayoría de los tumores de células escamosas de cabeza y cuello ensayados (12/17): expresión moderada en 10/17, y expresión baja en dos muestras. En los tumores escamosos de pulmón, estaba altamente expresado en una muestra y moderadamente expresado en dos más (n=13). El Contig 47 fue negativo para 2/4 de las muestras de pulmón normal, teniendo las dos muestras restantes una expresión moderada. También, el Contig 47 mostró una expresión moderada en intestino grueso, y páncreas, y expresión baja en piel, glándula salivar, velo del paladar, estómago, vejiga, PBMC sin activar, y amígdalas.
El Contig 48 (SEQ ID NO: 143) estaba expresado en todos los tumores de células escamosas de cabeza y cuello ensayados (17/17), altamente expresado en 8/17 y moderadamente expresado en 7/17, con expresión baja en dos muestras. Los niveles de expresión en los tumores escamosos de pulmón fueron altos a moderados en tres muestras (n=13). El Contig 48 fue negativo para una de cuatro muestras de pulmón normal, mostrando las restantes una expresión baja a moderada. El Contig 48 mostró una expresión moderada en velo del paladar, intestino grueso, páncreas y vejiga, y expresión baja en esófago, glándula salivar, PBMC sin activar y corazón. El Contig 49 (SEQ ID NO: 144) estaba expresado a niveles bajos a moderados en 6/17 de tumores de células escamosas de cabeza y cuello ensayados. Los niveles de expresión en los tumores escamosos de pulmón fueron moderados en tres muestras (n=13). El Contig 49 fue negativo para 2/4 muestras de pulmón normal, mostrando las muestras restantes expresión baja. Se mostraron niveles de expresión moderados en piel, glándula salivar, intestino grueso, páncreas, vejiga y PBMC sin activar, así como expresión baja en velo del paladar, nódulos linfáticos y amígdalas. El Contig 56 (SEQ ID NO: 148) estaba expresado en niveles bajos a moderados en 3/17 tumores de células escamosas de cabeza y cuello ensayados, y en tumores escamosos de pulmón, mostrando unos niveles bajos a moderados en tres de trece muestras. Notablemente, se detectaron unos niveles de expresión bajos en una muestra de adenocarcinoma de pulmón (n=2). El Contig 56 fue negativo para 3/4 muestras de pulmón normal y mostró unos niveles de expresión moderados sólo en intestino grueso, y expresión baja en glándula salivar, velo del paladar, páncreas, vejiga y PBMC sin activar. El Contig 58, también conocido como L769P, (SEQ ID NO: 150) estaba expresado a niveles moderados en 11/17 tumores de células escamosas de cabeza y cuello ensayados y baja expresión en una muestra adicional. La expresión en tumores escamosos de pulmón mostró niveles bajos a moderados en tres de trece muestras. El Contig 58 fue negativo en 3/4 muestras de pulmón normal, teniendo una muestra una expresión baja. Se demostraron niveles de expresión moderados en piel, intestino grueso, y PBMC sin activar, así como expresión baja en glándula salivar, velo del paladar, páncreas y vejiga. El Contig 59 (SEQ ID NO: 157) estaba expresado en algunos tumores escamosos de cabeza, cuello y pulmón. También se detectó un nivel de expresión bajo de Contig 59 en glándula salvar e intestino grueso.
La secuencia de ADNc de longitud completa para Contig 22, también referido como L763P, se proporciona en SEQ ID NO: 158, proporcionándose la secuencia de aminoácidos correspondiente en SEQ ID NO: 159. El análisis por RT-PCR en tiempo real de L763P reveló que está altamente expresado en 3/4 tumores escamosos de pulmón así como 4/4 tumores escamosos de cabeza y cuello, observándose un nivel de expresión bajo en cerebro, piel, velo del paladar y tráquea normales. Las búsquedas en bases de datos posteriores revelaron que la secuencia de SEQ ID NO: 158 contiene una mutación, que resulta en un cambio de marco en la secuencia de proteína correspondiente. Una segunda secuencia de ADNc para L763P se proporciona en SEQ ID NO: 345, proporcionándose la secuencia de aminoácidos correspondiente en SEQ ID NO: 346. Las secuencias de SEQ ID NO: 159 y 346 son idénticas con la excepción de los 33 aminoácidos C-terminales de SEQ ID NO: 159.
La secuencia de ADNc de longitud completa que incorpora los Contig 17, 19 y 24, referida como L762P, se proporciona en SEQ ID NO: 160, proporcionándose la secuencia de aminoácidos correspondiente en SEQ ID NO: 161. Análisis posteriores de L762P han determinado que es una proteína de membrana de tipo I y se han secuenciado dos variantes adicionales. La variante I (SEQ ID NO: 167, con la secuencia de aminoácidos correspondiente en SEQ ID NO: 169) es una forma con un corte y empalme alternativo de SEQ ID NO: 160 que resulta en la deleción de 503 nucleótidos, así como deleción de un segmento corto de la proteína expresada. La variante 2 (SEQ ID NO: 168, con la secuencia de aminoácidos correspondiente en SEQ ID NO: 170) tiene una deleción de dos nucleótidos en la región codificadora 3' en comparación con la SEQ ID NO: 160, lo que resulta en una forma secretada de la proteína expresada. El análisis por RT-PCR en tiempo real de L762P reveló que estaba sobreexpresado en 3/4 tumores escamosos de pulmón y 4/4 tumores de cabeza y cuello, observándose un nivel de expresión bajo en piel, velo del paladar y tráquea normales.
Se identificó que un epítopo de L762P tenía la secuencia KPGHWTYTLNNTHHSLQALK (SEQ ID NO: 382), que corresponde a los aminoácidos 571-590 de SEQ ID NO: 161.
La secuencia de ADNc de longitud completa para el contig 56 (SEQ ID NO: 148), también referido como L773P, se proporciona en SEQ ID NO: 171, con la secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO: 172. Se encontró que L773P es idéntico a dihidroxil deshidrogenasa en la parte 3' del gen, con una secuencia 5' divergente. Como resultado de esto, los 69 aminoácidos N-terminales son únicos. La secuencia de ADNc que codifica los 69 aminoácidos N-terminales se proporciona en SEQ ID NO: 349, proporcionándose la secuencia de aminoácidos N-terminal en SEQ ID NO: 350. La PCR en tiempo real reveló que L773P estaba altamente expresado en tumor escamoso de pulmón y adenocarcinoma de pulmón, con una expresión no detectable en los tejidos normales. El análisis por transferencia Northern posterior de L773P demostró que este transcrito está sobreexpresado diferencialmente en tumores escamosos y se detectó a aproximadamente 1,6 Kb en tejido de tumor de pulmón primario y aproximadamente 1,3 Kb en tejido de tumor de cabeza y cuello primario.
El análisis por micromatriz posterior ha mostrado que Contig 8, también referido como L769S (SEQ ID NO: 150), estaba sobreexpresado en tumores de mama además de tumores escamosos de pulmón.
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Ejemplo 4
Aislamiento y caracterización de polipéptidos de tumor de pulmón por sustracción basada en PCR
Se obtuvieron setecientos sesenta clones de una biblioteca sustracción de ADNc, que contiene ADNc de un conjunto de dos adenocarcinomas primarios de pulmón humano sustraídos frente a un conjunto de nueve ADNc de tejido humano normal incluyendo piel, colon, pulmón, esófago, cerebro, riñón, bazo, páncreas e hígado (Clontech, Palo Alto, CA) y se sometieron a un primer ciclo de amplificación por PCR. Esta biblioteca (referida como ALT-1) se sometió a un segundo ciclo de amplificación por PCR, según el protocolo del fabricante. Los niveles de expresión de estos 760 clones de ADNc en tejidos de tumor de pulmón, pulmón normal, y varios tejidos normales y de tumor adicionales se examinaron utilizando tecnología de micromatriz (Incyte, Palo Alto, CA). Brevemente, los productos de amplificación de PCR se dotted en portaobjetos en un formato de matriz, ocupando cada producto una única localización en la matriz. Se extrajo el ARNm de cada muestra de tejido que se va a ensayar, se transcribió inversamente y se generaron sondas de ADNc fluorescentes. Las micromatrices se ensayaron con las sondas de ADNc marcadas, se escanearon los portaobjetos y se midió la intensidad de la florescencia. Esta intensidad se correlaciona con la intensidad de la hibridación. Se encontró que un total de 118 clones, de los cuales 55 eran únicos, estaban sobreexpresados en tejido de tumor de pulmón, siendo las expresión en los tejidos normales ensayados (pulmón, piel, nódulos linfáticos, colon, hígado, páncreas, mama, corazón, médula ósea, intestino grueso, riñón, estómago, cerebro, intestino delgado, vejiga y glándula salivar) bien indetectable o a niveles significativamente menores. Uno de estos clones, que tiene la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 420 (clon #19014) muestra homología con un clon identificado previamente, L773P. El clon L773P tiene la secuencia de ADNc de longitud completa proporcionada en SEQ ID NO: 171 y la secuencia de aminoácidos proporcionada en SEQ ID NO: 172. El aislamiento del clon #19014 también se describe en la solicitud de Patente de EEUU en tramitación con la presente 09/285.479, presentada el 2 de Abril, 1999.
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Ejemplo 5
Síntesis de polipéptidos
Los polipéptidos pueden sintetizarse en un sintetizador de péptidos 430A de Perkin Elmer/Applied Biosystems Division utilizando química FMOC con activación con HPTU (hexafluorofosfato de benzotriazol-N,N,N',N'-tetrametiluronio). Una secuencia Gly-Cys-Gly puede unirse al extremo amino del péptido para proporcionar un método de conjugación, unión a una superficie inmovilizada, o marcaje del péptido. La escisión de los péptidos del soporte sólido se realiza utilizando la mezcla de escisión siguiente: ácido trifluoroacético:etanoditiol:tioanisol:agua:fenol (40:1:2:2:3). Después de escindir durante 2 horas, los péptidos se precipitan en éter t-metil-butílico frío. Los sedimentos de péptidos se disuelven en agua que contiene 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA) y se liofilizan antes de purificarlos por HPLC de fase reversa en C18. Para eluir los péptidos puede utilizarse un gradiente de 0%-60% de acetonitrilo (que contiene 0,1% de TFA) en agua (que contiene 0,1% de TFA). Después de liofilizar las fracciones puras, los péptidos se caracterizan utilizando electropulverización u otros tipos de análisis de espectrometría de masas y por análisis de aminoácidos.
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Ejemplo 6
Preparación de anticuerpos frente a antígenos de cáncer de pulmón
Se prepararon anticuerpos policlonales frente a los antígenos de cáncer de pulmón L514S, L528S, L531S, L523 y L773P (SEQ ID NO: 155, 225, 112, 176 y 171, respectivamente) como sigue.
Se inmunizaron conejos con proteína recombinante expresada en y purificada de E. coli como se describe más adelante. Para la inmunización inicial, se inyectaron subcutáneamente (S.C.) 400 \mug de antígeno combinado con muramil dipéptido (MDP). Los animales se reforzaron S.C. 4 semanas después con 200 \mug de antígeno mezclado con Adyuvante de Freund incompleto (IFA). Los refuerzos posteriores de 100 \mug de antígeno mezclado con IFA se inyectaron S.C. según fue necesario para inducir respuestas con una alta titulación de anticuerpos. Los sangrados de sueros de conejos inmunizados se ensayaron para detectar reactividad específica de antígeno utilizando ensayos ELISA con proteína purificada. Los anticuerpos policlonales frente a L514S, L528S, L531S, L523S y L773P se purificaron por afinidad a partir de sueros con una alta titulación de policlonales utilizando proteína purificada unida a un soporte sólido.
El análisis inmunohistoquímico utilizando anticuerpos policlonales frente a L514S se realizó en un panel de 5 muestras de tumor de pulmón, 5 muestras de tejido de pulmón normal y colon, riñón, hígado, cerebro y médula ósea normales. Específicamente, las muestras de tejido se fijaron en disolución de formalina durante 24 horas y se incluyeron en parafina antes de cortarlas en secciones de 10 micrómetros. Las secciones de tejido se permeabilizaron y se incubaron con anticuerpo durante 1 h. Se utilizó anti-ratón marcado con HRP seguido de incubación con cromógeno DAB para visualizar la inmunoreactividad de L514S. Se encontró que L514S está altamente expresado en tejido de tumor de pulmón observándose una expresión pequeña o ninguna en pulmón, cerebro o médula ósea normales. Se observó una tinción débil en colon (células epiteliales de la cripta positivas) y riñón (túbulos positivos). Se observó tinción en hígado normal pero no se ha detectado ARNm en este tejido lo que hace que este resultado sea sospechoso.
Utilizando el mismo procedimiento, el análisis inmunohistoquímico utilizando anticuerpos policlonales frente a L528S demostró tinción en muestras de tumor de pulmón y de pulmón normal, tinción débil en colon y riñón y sin tinción en hígado y corazón.
El análisis inmunohistoquímico utilizando anticuerpos policlonales frente a L531S demostró tinción en muestras de tumor de pulmón, tinción de membrana débil en la mayoría de las muestras de pulmón normal, tinción epitelial en colon, tinción tubular en riñón, tinción epitelial ductal en hígado y sin tinción en corazón.
El análisis inmunohistoquímico utilizando anticuerpos policlonales frente a L523S demostró tinción en todas las muestras de cáncer de pulmón ensayadas pero sin tinción en pulmón, riñón, hígado, colon, médula ósea o cerebelo normales.
La generación de anti-sueros policlonales frente a L762P (SEQ ID NO: 169 y 170) se realizó como sigue. Se combinaron 400 microgramos de antígeno de pulmón con 100 microgramos de muramildipéptido (MDP). Se añadió un volumen igual de Adyuvante de Freund Incompleto (IFA) y se mezcló hasta que se formó una emulsión. Se inyectó a los ratones subcutáneamente (S.C.). Después de cuatro semanas, se inyectaron S.C. a los animales 200 microgramos de antígeno mezclado con un volumen igual de IFA. Cada cuatro semanas los animales se reforzaron con 100 microgramos de antígeno. Siete días después de cada refuerzo se sangró el animal. Se generaron sueros incubando la sangre a 4ºC durante 12-24 horas seguido de centrifugación.
La caracterización de los antisueros policlonales se realizó como sigue. Se recubrieron placas de noventa y seis pocillos con antígeno incubando con 50 microlitros (típicamente 1 microgramo) a 4ºC durante 20 h. Se añadieron 250 microlitros de tampón BSA de bloqueo a los pocillos y se incubó a temperatura ambiente durante 2 h. Las placas se lavaron 6 veces con PBS/0,01% Tween. Los sueros de conejo se diluyeron en PBS y se añadieron 50 microlitros de suero diluido a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 30 min. Las placas se lavaron como se ha descrito anteriormente antes de la adición de 50 microlitros de peroxidasa de rábano (HRP) anti-conejo de cabra a una dilución de 1:10.000 e incubación a temperatura ambiente durante 30 min. Las placas se lavaron como se ha descrito anteriormente y se añadieron 100 \mul de Sustrato de Peroxidasa TMB a cada pocillo. Después de una incubación de 15 minutos en oscuridad a temperatura ambiente, la reacción colorimétrica se paró con 100 \mul de 1N H_{2}SO_{4} y se leyó inmediatamente a 450 nm. Los antisueros mostraron una fuerte reactividad frente al antígeno
L762P.
El análisis inmunohistoquímico utilizando anticuerpos policlonales frente a L762P demostró tinción en todas las muestras de cáncer de pulmón ensayadas, algún tinción débil en el epitelio bronquial de pulmón normal, tinción tubular en riñón, tinción epitelial débil en colon y sin tinción en corazón o hígado.
Con el fin de evaluar la expresión de la proteína L773P en varios tejidos, se realizó un análisis inmunohistoquímico (IHC) utilizando un anticuerpo policlonal frente a L773P purificado por afinidad. Brevemente, se fijaron muestras de tejido en disolución de formalina durante 12-24 horas y se incluyeron en parafina antes de cortarlas en secciones de 8 micrómetros. La recuperación de epítopos inducida por calor por vapor (SHIER) en tampón 0,1M citrato de sodio (pH 6,0) se utilizó para condiciones de marcaje óptimas. Las secciones se incubaron con 10% suero/PBS durante 5 minutos. Se añadió anticuerpo primario a cada sección durante 25 minutos a concentraciones indicadas seguido de una incubación de 25 minutos bien con anticuerpo biotinilado anti-conejo o anti-ratón. La actividad peroxidasa endógena se bloqueó mediante tres incubaciones de 1,5 minutos con peroxidasa de hidrógeno. El sistema complejo avidina biotina/peroxidasa de rábano (ABC/HRP) se utilizó junto con cromógeno DAB para visualizar la expresión de L773P. Los portaobjetos se contratiñeron con hematoxilina para visualizar los núcleos de las células. Utilizando este método, la proteína L773P se detectó en 6/8 tumores de pulmón, 4/6 muestras de pulmón normal (tinción muy débil en algunos casos), 1/1 muestras de riñón (tinción muy débil), 0/1 muestras de corazón, 1/1 muestras de colon (tinción muy débil) y 0/1 muestras de hígado.
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Ejemplo 7
Cebado de ratones con péptido y propagación de líneas CTL
Los péptidos inmunogénicos del antígeno de cáncer de pulmón L762P (SEQ ID NO: 161) para células T CD8^{+} restringidas para HLA-A2/K^{b} se identificaron como sigue.
La localización de los péptidos de unión a HLA-A2 en el antígeno de cáncer de pulmón L762P (SEQ ID NO: 161) se predijo utilizando un programa informático que predice secuencias peptídicas que probablemente sean HLA-A*0201 ajustando al resto de unión del péptido conocido a HLA-A*0201 (Rupert et al. (1993) Cell 74:929; Rammensee et al. (1995) Immunogenetics 41:178-228). Se preparó una serie de 19 péptidos sintéticos correspondientes a un subconjunto seleccionado de los péptidos de unión HLA-A*0201 predicho como se ha descrito anteriormente.
Se inmunizaron ratones que expresan el transgén para HLA A2/K^{b} humano (proporcionados por el Dr. L. Sherman, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA) con los péptidos sintéticos, como describen Theobald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11993-11997, 1995, con las modificaciones siguientes. Los ratones se inmunizaron con 50 \mug de péptido L726P y 120 \mug de un péptido de unión I-A^{b} obtenido de la proteína del virus de la hepatitis B emulsionado en adyuvante de Freund incompleto. Tres semanas después, estos ratones se sacrificaron y se prepararon suspensiones únicas de células. Las células se resuspendieron a 7 x 10^{6} células/ml en medio completo (RPMI-640; Gibco BRL, Gaithersburg, MD) que contiene 10% FCS, 2 mM Glutamina (Gibco BRL), piruvato de sodio (Gibco BRL), aminoácidos no esenciales (Gibco BRL), 2 x 10^{-5} M 2-mercaptoetanol, 50 U/ml de penicilina y estreptomicina, y se cultivaron en presencia de células inmaduras irradiadas (3.000 rads) de péptido L762P- (5 \mug/ml) y 10 mg/ml B_{2}-microglobulina- (3 \mug/ml) LPS (células de bazo transgénicas A2 cultivadas en presencia de 7 \mug/ml sulfato de dextrano y 25 \mug/ml LPS durante 3 días). Después de seis días, las células (5 x 10^{5}/ml) se volvieron a estimular con 2,5 x 10^{6}/ml células EL4A2Kb pulsadas con péptidos irradiadas (20.000 rads) (Sherman et al., Science 258:815-818, 1992) y 5 x 10^{6}/ml células de soporte de bazo transgénicas A2/K^{b} irradiadas (3.000 rads). Las células se cultivaron en presencia de 10 U/ml IL-2. Las células se volvieron a estimular semanalmente como se ha descrito, como preparación para la clonación de la línea.
Las líneas celulares específicas de péptido se clonaron por análisis de dilución limitante con células tumorales EL 4 A2Kb pulsadas con péptido L762P irradiadas (20.000 rads) (1 x 10^{4} células/pocillo) como estimuladores y células de bazo transgénicas A2/K^{b} irradiadas (3.000 rads) como células de soporte (5 x 10^{5} células/pocillo) crecidas en presencia de 10 U/ml IL-2. En el día 7, las células se volvieron a estimular como anteriormente. En el día 14, los clones que estaban creciendo se aislaron y se mantuvieron en cultivo.
Las líneas celulares específicas para los péptidos L762P-87 (SEQ ID NO: 226; que corresponde a los aminoácidos 87-95 de SEQ ID NO: 161), L762P-145 (SEQ ID NO: 227; que corresponde a los aminoácidos 145-153 de SEQ ID NO: 161), L762P-585 (SEQ ID NO: 228; que corresponde a los aminoácidos 585-593 de SEQ ID NO: 161), L762P-425 (SEQ ID NO: 229; que corresponde a los aminoácidos 425-433 de SEQ ID NO: 161), L762P(10)-424 (SEQ ID NO: 230; que corresponde a los aminoácidos 424-433 de SEQ ID NO: 161) y L762P(10)-458 (SEQ ID NO: 231; que corresponde a los aminoácidos 458-467 de SEQ ID NO: 161), demostraron una reactividad significativamente mayor (medida por porcentaje de lisis específica) frente a las células tumorales diana EL4-A2/K^{b} pulsadas con el péptido L762P que las células tumorales diana EL4-A2/K^{b} pulsadas con péptido control.
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Ejemplo 8
Identificación de epítopos de células T CD4 inmunogénicas obtenidos del antígeno de cáncer de pulmón L762P
Las líneas de células T CD4 específicas para el antígeno L762P (SEQ ID NO: 161) se generaron como sigue.
Se sintetizó una serie de 28 péptidos superpuestos que abarcaban aproximadamente 50% de la secuencia de L762P. Para el cebado, los péptidos se combinaron en conjuntos de 4-5 péptidos, pulsados a 20 microgramos/ml en células dendríticas durante 24 horas. Las células dendríticas se lavaron y se mezclaron con células T CD4+ seleccionadas positivamente en placas con fondo en U de 96 pocillos. Se generaron cuarenta cultivos para cada conjunto de péptidos. Los cultivos se volvieron a estimular semanalmente con células dendríticas frescas cargadas con conjuntos de péptidos. Después de un total de 3 ciclos de estimulación, las células se dejaron durante una semana adicional y se ensayaron para detectar especificidad frente a células presentadoras de antígenos (APC) pulsadas con conjuntos de péptidos utilizando ensayos de ELISA con interferón gamma y de proliferación. Para estos ensayos, se utilizaron como APC monocitos adherentes cargados con el conjunto de péptidos relevante o un péptido irrelevante. Para cada conjunto se identificaron las líneas de células T que reconocían específicamente los conjuntos de péptidos L762P tanto por liberación de citoquinas como proliferación. Se puso énfasis en la identificación de células T con respuestas proliferativas. Las líneas de células T que demostraron tanto secreción de citoquinas como proliferación específica de L762P, o una fuerte proliferación sólo, se expandieron más para ensayarse para detectar reconocimiento de péptidos individuales de los conjuntos, así como reconocimiento de L762P recombinante. La fuente de L762P recombinante fue E. coli, y el material se purificó parcialmente y fue positivo para endotoxina. Estos estudios emplearon 10 microgramos de péptidos individuales, 10 ó 2 microgramos de un péptido irrelevante, y 2 ó 0,5 microgramos de proteína L762P o una proteína recombinante generada igualmente en E. coli impura e irrelevante. Se indujo una producción significativa de interferón gamma y de proliferación de células T CD4 por varios péptidos derivados de L762P en cada conjunto. Las secuencias de aminoácidos para estos péptidos se proporcionan en SEQ ID NO: 232-251. Estos péptidos corresponden a los aminoácidos 661-680, 676-696, 526-545, 874-893, 811-830, 871-891, 856-875, 826-845, 795-815, 736-755, 706-725, 706-725, 691-710, 601-620, 571-590, 556-575, 616-635, 646-665, 631-650, 541-560 y 586-605, respectivamente, de SEQ ID NO: 161.
Las líneas de células T CD4 que demostraron especificidad para péptidos individuales obtenidos de L762P se expandieron más por estimulación con el péptido relevante a 10 microgramos/ml. Dos semanas después de la estimulación, las líneas de células T se ensayaron utilizando tanto ensayos de proliferación como ELISA IFN-gamma para el reconocimiento del péptido específico. Varias de las células T identificadas previamente continuaron demostrando una actividad específica del péptido L762P. Cada una de estas líneas se expandió más en el péptido relevante y, después de dos semanas de expansión, se ensayaron para detectar el reconocimiento específico del péptido L762P en experimentos de titulación, así como el reconocimiento de la proteína L762P recombinante obtenida de E. coli. Para estos experimentos, se pulsaron monocitos autólogos adherentes con el péptido obtenido de L762P relevante, un péptido obtenido de mamaglobina irrelevante, L762P recombinante obtenido de E. coli (aproximadamente 50% puro) o una proteína obtenida de E. coli irrelevante. Se encontró que la mayoría de las líneas de células T mostraban una baja afinidad por el péptido relevante, ya que las proporciones de proliferación e IFN-gamma específicas disminuyeron dramáticamente al diluir el péptido L762P. Sin embargo, se identificaron cuatro líneas que demostraron una actividad significativa incluso a 0,1 microgramos/ml de péptido. Cada una de estas líneas (referidas como A/D5, D/F5, E/A7 y E/B6) también proliferaba específicamente en respuesta a la preparación de proteína L762P obtenida de E. coli, pero no en respuesta a la preparación de proteína irrelevante. Las secuencias de aminoácidos de los péptidos obtenidos de L762P reconocidos por estas líneas se proporcionan en SEQ ID NO: 234, 249, 236 y 245, respectivamente. No se detectó IFN-gamma específico de proteína para ninguna de las líneas. Las líneas A/D5, E/A7 y E/B6 se clonaron en monocitos autólogos adherentes pulsados con el péptido relevante a 0,1 (A/D5 y E/A7) ó 1 (D/F5) microgramos/ml. Después del crecimiento, los clones se ensayaron para detectar especificidad para el péptido relevante. Se identificaron varios clones específicos para el péptido relevante para las líneas A/D5 y
E/A7.
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Ejemplo 9
Expresión de proteínas de antígenos específicos de tumor de pulmón a) Expresión de L514S en E. coli
El antígeno de tumor de pulmón L514S (SEQ ID NO: 89) se subclonó en el vector de expresión pE32b en los sitios NcoI y NotI y se transformó en E. coli utilizando técnicas estándar. La proteína se expresó desde los restos 3-153 de SEQ ID NO: 89. La secuencia de aminoácidos expresada y la secuencia de ADN correspondiente se proporcionan en SEQ ID NO: 252 y 253, respectivamente.
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b) Expresión de L762P
Los aminoácidos 32-944 del antígeno de tumor de pulmón L762P (SEQ ID NO: 161), con una Etiqueta de His 6X, se subclonaron en un vector de expresión pET28 modificado, utilizando resistencia a kanamicina, y se transformaron en BL21 CodonPlus utilizando técnicas estándar. Se observaron niveles de expresión bajos a moderados. La secuencia de ADN determinada de la construcción de expresión de L762P se proporciona en SEQ ID NO: 254.
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Ejemplo 10
Identificación del alelo de restricción MHC clase II para respuestas específicas del péptido L762P
Se utilizó un panel de células presentadoras de antígenos (APC) con HLA no coincidentes para identificar el alelo de restricción MHC clase II para las respuestas específicas del péptido L762P de clones de células T CD4 obtenidos de las líneas que reconocen el péptido L762P y la proteína recombinante. Los clones de dos líneas, AD-5 y EA-7, se ensayaron como se describe más adelante. Se encontró que los clones obtenidos de AD-5 estaban restringidos por el alelo HLA-DRB-1101 y se encontró que un clon obtenido de EA-7 estaba restringido por el alelo HLA-DRB-0701 o el alelo DQB1-0202. La identificación del alelo de restricción permite el direccionamiento de las terapias de vacuna utilizando el péptido definido en individuos que expresan el alelo de clase II relevante. El conocimiento del alelo de restricción relevante también permitirá la monitorización clínica de las respuestas al péptido definido ya que sólo se monitorizarán los individuos que expresan el alelo relevante.
Los clones de células T CD4 obtenidos de las líneas AD-5 y EA-7 se estimularon en APC autólogas pulsadas con el péptido específico a 10 \mug/ml, y se ensayaron para detectar el reconocimiento de APC autólogas (del donante D72) así como frente a un panel de APC parcialmente coincidentes con D72 en los alelos de la clase II. La Tabla 2 muestra el tipado de la clase HLA de las APC ensayadas. En estos experimentos, se utilizaron como APC monocitos adherentes (generados por adherencia de 2 horas) de cuatro donantes diferentes, referidos como D45, D187, D208 y D326. Las APC autólogas no se incluyeron en el experimento. Cada una de las APC se pulsó con el péptido relevante (5a para AD-5 y 3e para 3A-7) o el péptido de mamoglobina irrelevante a 10 \mug/ml, y se establecieron los cultivos para 10.000 células T y aproximadamente 20.000 APC/pocillo. Como se muestra en la Tabla 3, pudieron detectarse una proliferación y producción de citoquinas específicas sólo cuando se utilizaron como APC células donantes parcialmente coincidentes. Tomando como base el análisis de tipado de MHC, estos resultados sugieren fuertemente que el alelo de restricción para la respuesta específica de L762P de los clones obtenidos de AD-5 es HLA-DRB-1101 y para el clon obtenido de EA-7 el alelo de restricción es HLA-DRB-0701 o
DQB1-0202.
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TABLA 2 Tipado de HLA de APC
2
3
Ejemplo 11
Proteínas de fusión de partes N-terminales y C-terminales de L763P
En otra realización, un polinucleótido obtenido de Mycobacterium tuberculosis, referido como Ra12, se une al menos a una parte inmunogénica de un polinucleótido de esta invención. Las composiciones de Ra12 y los métodos para su utilización en el incremento de la expresión de secuencias de polinucleótidos heterólogas se describen en la Patente de EEUU 6.627.198. Brevemente, Ra12 se refiere a una región de polinucleótido que es una subsecuencia de un ácido nucleico de MTB32A de Mycobacterium tuberculosis. MTB32A es una proteasa de serina con un peso molecular de 32 KD codificada por un gen en cepas virulentas y avirulentas de M. tuberculosis. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de MTB32A se han descrito (por ejemplo, Solicitud de Patente de EEUU 60/158.585; véase también, Skeiky et al., Infection and Immun. (1999) 67:3998-4007. Sorprendentemente, se descubrió que un fragmento C-terminal de 14 KD de la secuencia codificadora de MTB32A se expresa a altos niveles por sí mismo y permanece como una proteína soluble a lo largo del proceso de purificación. Además, este fragmento puede incrementar la inmunogenicidad de polipéptidos antigénicos heterólogos con los que se fusiona. Este fragmento C-terminal de 14 KD de MTB32A se refiere en la presente memoria como Ra12 y representa un fragmento que comprende parte o todos los restos de aminoácidos 192 a 323 de MTB32A.
Pueden construirse fácilmente ácidos nucleicos recombinantes que codifican un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido Ra12 y un polipéptido de tumor de pulmón heterólogo de interés por técnicas de ingeniería genética convencionales. Los ácidos nucleicos recombinantes se construyen de manera que, preferiblemente, una secuencia de polinucleótido Ra12 está localizada en 5' respecto a una secuencia de polinucleótido de tumor de pulmón heteróloga seleccionada. También puede ser apropiado poner una secuencia de polinucleótido Ra12 en 3' respecto a una secuencia de polinucleótido heteróloga seleccionada o insertar una secuencia de polinucleótido heteróloga en un sitio dentro de una secuencia de polinucleótido Ra12.
Además, puede utilizarse cualquier polinucleótido adecuado que codifica Ra12 o una parte u otra variante de ésta para construir polinucleótidos de fusión recombinantes que comprenden Ra12 y uno o más polinucleótidos de tumor de pulmón descritos en la presente memoria. Los polinucleótidos Ra12 preferidos comprenden generalmente al menos aproximadamente 15 nucleótidos consecutivos, al menos aproximadamente 30 nucleótidos, al menos aproximadamente 60 nucleótidos, al menos aproximadamente 100 nucleótidos, al menos aproximadamente 200 nucleótidos, o al menos aproximadamente 300 nucleótidos que codifican una parte de un polipéptido Ra12.
Los polinucleótidos Ra12 pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifica un polipéptido Ra12 o una parte de éste) o pueden comprender una variante de dicha secuencia. Las variantes del polinucleótido Ra12 pueden contener una o más sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones de manera que la actividad biológica del polipéptido de fusión codificado no disminuya sustancialmente, respecto a un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido Ra12 nativo. Las variantes presentan preferiblemente al menos aproximadamente 70% de identidad, más preferiblemente al menos aproximadamente 80% de identidad y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 90% de identidad con una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido Ra12 nativo o una parte de éste.
En este ejemplo se describen dos realizaciones específicas de fusiones entre Ra12 y antígenos de la presente invención.
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A. Parte N-Terminal de L763P
Se expresó una proteína de fusión de Ra12 de longitud completa y la parte N-terminal de L763P (referida como L763P-N; restos de aminoácidos 1-130 de SEQ ID NO: 159) como una proteína recombinante única en E.coli. El ADNc para la parte N-terminal se obtuvo por PCR con un ADNc para el L763P de longitud completa y los cebadores L763F3 (5' CGGCGAATTCATGGATTGGGGGACGCTGC; SEQ ID NO: 383) y L763RV3 (5' CGGCCTCGAGT
CACCCCTCTATCCGAACCTTCTGC; SEQ ID NO: 384). El producto de PCR con el tamaño esperado se recuperó del gel de agarosa, se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y XhoI, y se clonó en los sitios correspondientes en el vector de expresión pCRX1. La secuencia para la fusión de Ra12 de longitud completa y L763P-N se confirmó por secuenciación de ADN. La secuencia de ADNc determinada se proporciona en SEQ ID NO: 351, proporcionándose la secuencia de aminoácidos correspondiente en SEQ ID NO: 352).
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B. Parte C-Terminal de L763P
Se expresó una proteína de fusión de Ra12 de longitud completa y la parte C-terminal de L763P (referida como L763P-C; restos de aminoácidos 100-262 de SEQ ID NO: 159) como una proteína recombinante única en E.coli. El ADNc de la parte C-terminal de L763P se obtuvo por PCR con un ADNc para el L763P de longitud completa y los cebadores L763F4 (5' CGGCGAATTCCACGAACCACTCGCAAGTTCAG; SEQ ID NO: 385) y L763RV4 (5' CGGCTCGAG-TTAGCTTGGGCCTGTGATTGC; SEQ ID NO: 386). El producto de PCR con el tamaño esperado se recuperó del gel de agarosa, se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y XhoI, y se clonó en los sitios correspondientes en el vector de expresión pCRX1. La secuencia para la fusión de Ra12 de longitud completa y L763P-C se confirmó por secuenciación de ADN. La secuencia de ADN determinada se proporciona en SEQ ID NO: 353, proporcionándose la secuencia de aminoácidos correspondiente en SEQ ID NO: 354.
Las proteínas recombinantes descritas en este ejemplo son útiles para la preparación de vacunas, para terapéuticos de anticuerpos y para el diagnóstico de tumores de pulmón.
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Ejemplo 12
Expresión en E. coli de la proteína de fusión L762P con etiqueta de HIS
Se realizó PCR en la región codificadora de L762P con los cebadores siguientes:
Cebador directo empezando en el aminoácido 32.
PDM-278 5'ggagtacagcttcaagacaatggg 3' (SEQ ID NO: 355) Tm 57ºC.
Cebador inverso incluyendo el codon de parada natural después del aminoácido 920, creando un sitio EcoRI.
PDM-280 5' ccatgggaattcattataataattttgttcc 3' SEQ ID NO: 356) Tm 55ºC.
El producto de PCR se digirió con la enzima de restricción EcoRI, se purificó en gel y se clonó en pPDM His, un vector pET28 modificado con una etiqueta de His en marco, que había sido digerido con las enzimas de restricción Eco72I y EcoRI. La construcción correcta se confirmó por análisis de secuencia de ADN y se transformó en los anfitriones de expresión BL21 (DE3) pLys S y BL21 (DE3) CodonPlus RIL.
La secuencia de la proteína del L762P recombinante expresado se muestra en SEQ ID NO: 357, y la secuencia de ADN se muestra en SEQ ID NO: 358.
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Ejemplo 13
Expresión en E. coli de una proteína de fusión L773PA con etiqueta de HIS
La región codificadora de L773PA (que codifica los aminoácidos 2-71 de SEQ ID NO: 172) se amplificó por PCR utilizando los cebadores siguientes:
Cebador directo para L773PA empezando en el aminoácido 2:
PDM-299 5' tggcagcccctcttcttcaagtggc 3' (SEQ ID NO: 359) Tm 63ºC.
Cebador inverso para L773PA creando un codon de parada artificial después del aminoácido 70:
PDM-355 5' cgccagaattcatcaaacaaatctgttagcacc 3' (SEQ ID NO: 360) Tm 62ºC.
El producto de PCR resultante se digirió con la enzima de restricción EcoRI, se purificó en gel y se clonó en pPDM His, un vector pET28 modificado con una etiqueta His en marco, que había sido digerido con las enzimas de restricción Eco72I y EcoRI. La construcción correcta se confirmó por análisis de la secuencia de ADN y se transformó en los anfitriones de expresión BL21 (DE3) pLys S y BL21 (DE3) CodonPlus RIL.
La secuencia de la proteína de L773PA recombinante expresado se muestra en SEQ ID NO: 361, y la secuencia de ADN se muestra en SEQ ID NO: 362.
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Ejemplo 14
Identificación de epítopos obtenidos a partir de polipéptidos específicos de tumor de pulmón
Se sintetizó una serie de péptidos a partir de la secuencia de aminoácidos de L773P (SEQ ID NO: 172) y se utilizó en experimentos de cebado in vitro para generar células T CD4 específicas de péptido. Estos péptidos eran 20-mer que se superponían en 15 aminoácidos y correspondían a los aminoácidos 1-69 de la proteína L773P. Se ha demostrado que esta región es específica de tumor. Después de tres estimulaciones in vitro, se identificaron las líneas de células T CD4 que producían IFN\gamma en respuesta al péptido estimulante pero no al péptido control. Algunas de estas líneas de células T demostraron reconocimiento de las proteínas L773P y L773PA (región específica de tumor)
recombinantes.
Para realizar los experimentos, se generó por procedimientos estándar un total de once péptidos 20-mer (SEQ ID NO: 363, 365 y 387-395) que se superponían en 15 aminoácidos y obtenidos a partir de la región N-terminal específica de tumor de L773P (correspondiente a los aminoácidos 1-69 de SEQ ID NO: 172). Las células dendríticas se obtuvieron a partir de PBMC de un donante normal utilizando GMCSF e IL-4 mediante un protocolo estándar. Se generaron células T CD4 purificadas a partir del mismo donante que las células dendríticas utilizando lechos MACS y selección negativa de PBMC. Las células dendríticas se pulsaron toda la noche con los péptidos 20-mer individuales a una concentración de 10 \mug/ml. Las células dendríticas pulsadas se lavaron y se plaquearon a 1 x 10^{4}/pocillo de una placa con fondo en U de 96 pocillos, y se añadieron células CD4 purificadas a 1 x 10^{5}/pocillo. Los cultivos se suplementaron con 10 ng/ml IL-6 y 5 ng/ml IL-12 y se incubaron a 37ºC. Los cultivos se volvieron a estimular como anteriormente semanalmente utilizando como APC las células dendríticas generadas y pulsadas como anteriormente, suplementadas con 5 ng/ml IL-7 y 10 \mug/ml IL-2. Después de 3 ciclos de estimulación in vitro, las líneas celulares (cada una correspondiente a un pocillo) se ensayaron para detectar la producción de citoquinas en respuesta al péptido estimulante frente a un péptido irrelevante.
Un pequeño número de líneas de células T CD4 individuales (9/528) demostró liberación de citoquinas (IFN\gamma) en respuesta al péptido estimulante pero no al péptido control. Las líneas de células T CD4 que demostraron una actividad específica se volvieron a estimular con el péptido L773P apropiado y se volvieron a ensayar utilizando células dendríticas autólogas pulsadas con 10 \mug/ml del péptido L773P apropiado, un péptido control irrelevante, proteína L773P recombinante (aminoácidos 2-364, obtenida en E. coli), L773PA recombinante (aminoácidos 2-71, obtenida en E. coli), o una proteína control apropiada (L3E, obtenida en E. coli). Tres de las nueve líneas ensayadas (1-3C, 1-6G, y 4-12B) reconocieron el péptido L773P apropiado así como L773P y L773PA recombinantes. Cuatro de las líneas ensayadas (4-8A, 4-8E, 4-12D, y 4-12E) reconocieron sólo el péptido L773P apropiado. Dos de las líneas ensayadas (5-6F y 9-3B) demostraron una actividad no específica.
Estos resultados demuestran que las secuencias peptídicas MWQPLFFKWLLSCCPGSSQI (aminoácidos 1-20 de SEQ ID NO: 172; SEQ ID NO: 363) y GSSQIAAAASTQPEDDINTQ (aminoácidos 16-35 de SEQ ID NO: 172; SEQ ID NO: 365) pueden representar epítopos de L773P procesados de forma natural, que son capaces de estimular respuestas de células T CD4 restringidas por MHC clase II humano.
En estudios posteriores, el experimento de mapeo de epítopos anterior se repitió utilizando un donante diferente. De nuevo, se encontró que algunas de las líneas de células T resultantes respondían al péptido y a la proteína recombinante. Se encontró que un péptido adicional se procesaba de forma natural. Específicamente, las células CD4 purificadas se estimularon con un total de once péptidos 20-mer que se superponían en 15 aminoácidos (SEQ ID NO: 363, 387, 388, 365 y 389-395, respectivamente). El cebado se realizó como se ha descrito anteriormente, excepto en que se empleó una concentración de péptido de 0,5 \mug/mL en lugar de 10 \mug/mL. En el cribado inicial de las líneas celulares 9 de las 528 líneas liberaron al menos un nivel tres veces mayor de IFN-gamma con el péptido estimulante frente al péptido control. Estas 9 líneas se volvieron a estimular con el péptido apropiado y se ensayaron en células dendríticas pulsadas con una titulación del péptido apropiado (10 \mug/mL, 1 \mug/ml y 0,1 \mug/mL) y 10 \mug/mL de un péptido control. Seis de las 9 líneas reconocieron L773P recombinante así como péptido. Las seis líneas referidas como 1-1E, 1-2E, 1-4H, 1-6A, 1-6G y 2-12B reconocieron L773PA y el péptido apropiado. Estos resultados demuestran que los péptidos de SEQ ID NO: 363 y 387 representan epítopos de L773P procesados de forma
natural.
Utilizando los procedimientos descritos anteriormente, se generaron respuestas de células T CD4+ de PBMC de donantes normales utilizando células dendríticas pulsadas con péptidos 20-mer superpuestos (SEQ ID NO: 396-419) que abarcan la secuencia del polipéptido L523S (SEQ ID NO: 176). Varias de las células T CD4+ demostraron reactividad con los péptidos de cebado así como con la proteína L523S recombinante, estando la reactividad dominante de estas líneas en los péptidos 4, 7 y 21 (SEQ ID NO: 399, 402 y 416; correspondientes a los aminoácidos 30-39, 60-79 y 200-219, respectivamente, de SEQ ID NO: 176).
Los epítopos en el ámbito de la invención incluyen epítopos restringidos por otras moléculas MHC de clase II. Además, pueden producirse variantes del péptido en las que uno o más aminoácidos están alterados de manera que no hay efecto en la capacidad de los péptidos de unirse a las moléculas MHC, no hay efecto en su capacidad de incitar respuestas de células T, y no hay efecto en la capacidad de las células T incitadas de reconocer la proteína recombinante.
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Ejemplo 15
Expresión en superficie de L762P y epítopos de anticuerpo de éste
Se inmunizaron conejos con proteína L762P de longitud completa etiquetada con histidina generada en E. coli. Se aislaron los sueros de los conejos y se cribaron para el reconocimiento específico de L762P en ensayos ELISA. Se identificó un suero policlonal, referido como 2692L, que reconocía específicamente la proteína L762P recombinante. Los anticuerpos policlonales 2692L anti-L762P se purificaron a partir del suero por purificación de afinidad utilizando columnas de afinidad para L762P. Aunque L762P se expresa en un subconjunto de muestras de tumor de pulmón primario, la expresión se pierde en líneas celulares de tumor de pulmón establecidas. Por lo tanto, para caracterizar la expresión en superficie de L762P, se utilizó una construcción de retrovirus que expresa L762P para transducir fibroblastos humanos primarios así como 3 líneas celulares de tumor de pulmón (522-23, HTB, y 343T). Las líneas transducidas se seleccionaron y expandieron para examinar la expresión en superficie de L762P por análisis FACS. Para este análisis, se recogieron células no transducidas y transducidas utilizando medio de disociación celular y se incubaron con 10-50 microgramos/ml de anti-L762P purificado por afinidad o antisueros irrelevantes. Después de una incubación de 30 minutos en hielo, las células se lavaron y se incubaron con un anticuerpo IgG secundario anti conejo conjugado con FITC como anteriormente. Las células se lavaron, se resuspendieron en tampón con Yoduro de Propidio (PI) y se examinaron por FACS utilizando un separador de células activado por fluorescencia Excalibur. Para el análisis FACS, se excluyeron las células PI-positivas (es decir, células muertas/permeabilizadas). Los sueros policlonales anti-L762P reconocieron y se unieron específicamente a la superficie de células transducidas con L762P pero no a los equivalentes no transducidos. Estos resultados demuestran que L762P está localizado en la superficie celular tanto de fibroblastos como de células de tumor de
pulmón.
Para identificar los epítopos del péptido reconocidos por 2692L, se persiguió un método de mapeo de epítopos. Se sintetizó una serie de 19-21 mer superpuestos (superposición de 5 aminoácidos) que abarcaba la parte C terminal de L762P (aminoácidos 481-894 de SEQ ID NO: 161). En un experimento inicial, los péptidos se ensayaron en conjuntos. Se observó una reactividad específica con el antisuero L762P con los conjuntos A, B, C y E. Para identificar los péptidos específicos reconocidos por el antisuero, se recubrieron placas de microtitulación de 96 pocillos con péptidos individuales a 10 microgramos/ml durante 2 horas a 37ºC. Los pocillos se aspiraron y bloquearon con disolución salina tamponada con fosfato que contiene 5% (p/v) de leche durante 2 horas a 37ºC y se lavaron posteriormente en PBS que contiene 0,1% de Tween 20 (PBST). El suero anti-L762P de conejo 2692L purificado se añadió a 200 ó 20 ng/pocillo a pocillos triplicados en PBST y se incubó toda la noche a temperatura ambiente. Esto se siguió de lavado 6 veces con PBST e incubación posterior con fragmento F(ab') de IgG (H+L)Puro por afinidad de burro anti conejo conjugado con HRP a 1:2.000 durante 60 minutos. Las placas se lavaron y se incubaron en sustrato tetrametil bencidina. Las reacciones se pararon por la adición de ácido sulfúrico 1N y las placas se leyeron a 450/570 nm utilizando un lector de placas ELISA.
Los datos resultantes, presentados en la Tabla 4 a continuación, demuestran que los antisueros L762P reconocieron al menos 6 epítopos distintos en el péptido desde la mitad 3' de L762P.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 4 Actividad ELISA (DO 450-570)
4 
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Se identificaron los péptidos individuales de cada uno de los conjuntos y se identificó adicionalmente una reactividad débil con el péptido BB del conjunto F. Los epítopos del péptido relevantes se resumen en la Tabla 5 a continuación. Las secuencias de aminoácidos para los péptidos BB, O, L, I, A y C se proporcionan en SEQ ID NO: 376-381, respectivamente, proporcionándose las secuencias de ADNc correspondientes en SEQ ID NO: 373, 370, 372, 374, 371 y 375, respectivamente.
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TABLA 5 Actividad ELISA (DO 450-570) 
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5 
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Ejemplo 16
Detección de anticuerpos frente a antígenos de tumor de pulmón en sueros de pacientes
Se mostró que estaban presentes anticuerpos específicos para los antígenos de tumor de pulmón L773PA (SEQ ID NO: 361), L514S (SEQ ID NO: 155 y 156), L523S (SEQ ID NO: 176), L762P (SEQ ID NO: 161) y L763P (SEQ ID NO: 159) en el líquido de efusión o sueros de pacientes con cáncer de pulmón pero no en los donantes normales. Más específicamente, la presencia de anticuerpos frente a L773A, L514S, L523S, L762P y L763P en el líquido de efusión obtenido de pacientes con cáncer de pulmón y en sueros de donantes normales se detectó por ELISA utilizando proteínas recombinantes e IgG anti-humana conjugada con HRP. Brevemente, cada proteína (100 ng) se utilizó para recubrir una placa de 96 pocillos a pH 9,5. Paralelamente, BSA (albúmina de suero bovino) se utilizó para recubrir como proteína control. Se determinaron las señales ([S], absorbancia medida a 405 nm) frente a BSA ([N]). Los resultados de estos estudios se muestran en la Tabla 6, en la que - representa [S]/[N] < 2; \pm representa [S]/[N] > 2; ++ representa [S]/[N] > 3; y +++ representa [S]/[N] > 5.
TABLA 6 Detección de Anticuerpos Frente a Antígenos de Tumor de Pulmón
6 
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Utilizando análisis de transferencia Western, se encontró que los anticuerpos frente a L523S estaban presentes en 3 de 4 muestras del líquido de efusión de pacientes con cáncer de pulmón, no detectándose anticuerpos L523S en las tres muestras de sueros normales ensayadas.
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Ejemplo 17
Expresión en E. coli de una proteína de fusión L514S con etiqueta de HIS
Se realizó PCR en la región codificadora de L514S 13160 con los cebadores siguientes:
Cebador directo PDM-278 5' cacactagtgtccgcgtggcggcctac 3' (SEQ ID NO: 421) Tm 67ºC.
Cebador inverso PDM-280 5' catgagaattcatcacatgcccttgaaggctcc 3' (SEQ ID NO: 422) Tm 66ºC.
Las condiciones de PCR fueron las siguientes:
10 \mul 10X tampón Pfu
1,0 \mul 10 mM dNTP
2,0 \mul 10 \muM de cada cebador
83 \mul agua estéril
1,5 \mul Pfu ADN polimerasa (Stratagene, La Jolla, CA)
50 ng ADN
96ºC durante 2 minutos, 96ºC durante 20 segundos, 66ºC durante 15 segundos, 72ºC durante 1 minuto con 40 ciclos y después 72ºC durante 4 minutos.
El producto de PCR se digirió con la enzima de restricción EcoRI, se purificó en gel y se clonó en pPDM His, un vector pET28 modificado con una etiqueta His en marco, que se había digerido con las enzimas de restricción Eco72I y EcoRI. La construcción correcta se confirmó por análisis de la secuencia de ADN y se transformó en células BL21 CodonPlus (Stratagene, La Jolla, CA) para expresión.
La secuencia de aminoácidos de L514S recombinante expresada se muestra en SEQ ID NO: 423, y la secuencia de la región codificadora de ADN se muestra en SEQ ID NO: 424.
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Ejemplo 18
Expresión en E. coli de una proteína de fusión L523S con etiqueta de HIS
Se realizó PCR en la región codificadora de L523S con los cebadores siguientes:
Cebador directo PDM-414 5' aacaaactgtatatcggaaacctcagcgagaa 3' (SEQ ID NO: 425) Tm 62ºC.
Cebador inverso PDM-415 5' ccatagaattcattacttccgtcttgactgagg 3' (SEQ ID NO: 426) Tm 62ºC.
Las condiciones de PCR fueron las siguientes:
10 \mul 10X tampón Pfu
1,0 \mul 10 mM dNTP
2,0 \mul 10 \muM de cada cebador
83 \mul agua estéril
1,5 \mul Pfu ADN polimerasa (Stratagene, La Jolla, CA)
50 ng ADN
96ºC durante 2 minutos, 96ºC durante 20 segundos, 62ºC durante 15 segundos, 72ºC durante 4 minutos con 40 ciclos y después 72ºC durante 4 minutos.
El producto de PCR se digirió con la enzima de restricción EcoRI, se purificó en gel y se clonó en pPDM His, un vector pET28 modificado con una etiqueta His en marco, que se había digerido con las enzimas de restricción Eco72I y EcoRI. La construcción correcta se confirmó por análisis de la secuencia de ADN y se transformó en células BL21 CodonPlus (Stratagene, La Jolla, CA) para expresión.
La secuencia de aminoácidos de L523S recombinante expresada se muestra en SEQ ID NO: 427, y la secuencia de la región codificadora de ADN se muestra en SEQ ID NO: 428.
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Ejemplo 19
Expresión en E. coli de una proteína de fusión L762PA con etiqueta de HIS
Se realizó PCR en la región codificadora de L762PA (L762PA carece de la secuencia señal, el dominio transmembrana C-terminal y la cola citoplásmica) con los cebadores siguientes:
Cebador directo PDM-278 5' ggagtacagcttcaagacaatggg 3' (SEQ ID NO: 355) Tm 57ºC.
Cebador inverso PDM-279 5' ccatggaattcattatttcaatataagataatctc 3' (SEQ ID NO: 429) Tm 56ºC.
Las condiciones de PCR fueron las siguientes:
10 \mul 10X tampón Pfu
1,0 \mul 10 mM dNTP
2,0 \mul 10 \muM de cada cebador
83 \mul agua estéril
1,5 \mul Pfu ADN polimerasa (Stratagene, La Jolla, CA)
50 ng ADN
96ºC durante 2 minutos, 96ºC durante 20 segundos, 55ºC durante 15 segundos, 72ºC durante 5 minutos con 40 ciclos y después 72ºC durante 4 minutos.
El producto de PCR se digirió con la enzima de restricción EcoRI, se purificó en gel y se clonó en pPDM His, un vector pET28 modificado con una etiqueta His en marco, que se había digerido con las enzimas de restricción Eco72I y EcoRI. La construcción correcta se confirmó por análisis de la secuencia de ADN y se transformó en células BL21 pLys S (Novagen, Madison, WI) para expresión.
La secuencia de aminoácidos de L762PA recombinante expresada se muestra en SEQ ID NO: 430, y la secuencia de la región codificadora de ADN se muestra en SEQ ID NO: 431.
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Ejemplo 20
Expresión en E. coli de una proteína de fusión L773P con etiqueta de HIS
Se realizó PCR en la región codificadora de L773P con los cebadores siguientes:
Cebador directo PDM-299 5' tggcagcccctcttcttcaagtggc 3' (SEQ ID NO: 359) Tm 63ºC.
Cebador inverso PDM-300 5' cgcctgctcgagtcattaatattcatcagaaaatgg 3' (SEQ ID NO: 432) Tm 63ºC.
Las condiciones de PCR fueron las siguientes:
10 \mul 10X tampón Pfu
1,0 \mul 10 mM dNTP
2,0 \mul 10 \muM de cada cebador
83 \mul agua estéril
1,5 \mul Pfu ADN polimerasa (Stratagene, La Jolla, CA)
50 ng ADN
96ºC durante 2 minutos, 96ºC durante 20 segundos, 63ºC durante 15 segundos, 72ºC durante 2 minutos 15 segundos con 40 ciclos y después 72ºC durante 4 minutos.
El producto de PCR se digirió con la enzima de restricción EcoRI, se purificó en gel y se clonó en pPDM His, un vector pET28 modificado con una etiqueta His en marco, que se había digerido con las enzimas de restricción Eco72I y EcoRI. La construcción correcta se confirmó por análisis de la secuencia de ADN y se transformó en células BL21 pLys S (Novagen, Madison, WI) y BL21 CodonPlus (Stratagene, La Jolla, CA) para expresión.
La secuencia de aminoácidos de L773P recombinante expresada se muestra en SEQ ID NO: 433, y la secuencia de la región codificadora de ADN se muestra en SEQ ID NO: 434.
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Ejemplo 21
Clonación y secuenciación de un clon de receptor de célula T para el antígeno L762P específico de pulmón
Las cadenas alfa y beta del receptor de células T (TCR) de un clon de células T CD4 específico para el antígeno L762P específico de pulmón se clonaron y se secuenciaron. Básicamente, se aisló ARNm total de 2 X 10^{6} células del clon 4H6 CTL utilizando reactivo Trizol y se sintetizó el ADNc utilizando kits listos para usar (Pharmacia). Para determinar las secuencias Valfa y Vbeta de este clon, se sintetizó un panel de cebadores específicos del subtipo Valfa y Vbeta y se utilizó en reacciones RT-PCR con ADNc generado a partir de cada uno de los clones. Las reacciones RT-PCR demostraron que cada uno de los clones expresaba una secuencia Vbeta común que correspondía a la subfamilia Vbeta8 y una secuencia Valfa que correspondía a la subfamilia Valfa8. Para clonar las cadenas alfa y beta de TCR completas a partir del clon 4H6, se diseñaron cebadores que abarcaban los nucleótidos de TCR que codificaban el iniciador y terminador. Los cebadores fueron los siguientes:
\quad
cebador directo para Valfa8 de TCR 5' ggatccgccgccaccatgacatccattcgagctgta 3' (SEQ ID NO: 435; tiene un sitio BamHI insertado);
\quad
cebador inverso Kozak para Valfa 8 de TCR (antisentido) 5' gtcgactcagctggaccacagccgcag 3' (SEQ ID NO: 436, tiene un sitio SalI insertado más la secuencia constante alfa de TCR);
\quad
cebador directo para Vbeta 8 de TCR (sentido) 5' ggatccgccgccaccatggactcctggaccttctgct 3' (SEQ ID NO: 437; tiene un sitio BamHI insertado); y
\quad
cebador inverso Kozac para Veta de TCR 5' gtcgactcagaaatcctttctcttgac 3' (SEQ ID NO: 438; tiene un sitio SalI insertado más la secuencia constante beta de TCR). Se establecieron reacciones de RT-PCR de 35 ciclos estándar utilizando ADNc sintetizado a partir del clon CTL y los cebadores anteriores utilizando la polimerasa termoestable capaz de corregir errores, PWO (Roche). La banda de PCCR resultante, aproximadamente 850 pb para Valfa y aproximadamente 950 para Vbeta, se ligó en un vector de PCR de extremos romos (Invitrogen) y se transformó en E. coli. Se identificaron las E.coli transformadas con plásmidos que tenían las cadena alfa y beta de longitud completa. Se generaron preparaciones a gran escala de los plásmidos correspondientes y estos plásmidos se secuenciaron. Por alineamiento de la secuencia de nucleótidos se mostró que la secuencia Valfa (SEQ ID NO: 439) era homóloga a Valfa8.1 mientras que por alineamiento de la secuencia de nucleótidos se mostró que la secuencia Vbeta (SEQ ID NO: 440) era homóloga a Vbeta8.2
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Ejemplo 22
Expresión recombinante de L762P de longitud completa en células de mamífero
El ADNc de L762P de longitud completa se subclonó en los vectores de expresión de mamíferos VR1012 y pCEP4 (Invitrogen). Ambos vectores de expresión se habían modificado previamente para contener una etiqueta de epítopo FLAG. Estas construcciones se transfectaron en células HEK293 y CHL-1 (ATCC) utilizando reactivo Lipofectamina 2000 (Gibco). Brevemente, las células HEK y CHL-1 se plaquearon a una densidad de 100.000 células/ml en DMEM (Gibco) que contiene 10% FBS (Hyclone) y se crecieron toda la noche. Al día siguiente, se añadieron 4 \mul de Lipofectamina 2000 a 100 \mul de DMEM que no contiene FBS y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. La mezcla Lipofectamina/DMEM se añadió a 1 \mug de ADN plasmídico L762P Flag/pCEP4 o L762P Flag/VR1012 resuspendido en 100 \mul de DMEM y se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. La mezcla Lipofectamina/ADN se añadió a las células HEK293 y CHL-1 y se incubó durante 48-72 horas a 37ºC con 7% CO_{2}. Las células se lavaron con PBS, se recogieron y se sedimentaron por centrifugación. La expresión de L672P se detectó en los lisados de las células HEK293 y CHL-1 transfectadas por análisis de transferencia Western y se detectó en la superficie de las células HEK transfectadas por análisis de citometría de flujo.
Para el análisis por transferencia Western, se generaron lisados de células completas incubando las células en tampón de lisis que contiene Tritón-X100 durante 30 minutos en hielo. Los lisados se aclararon por centrifugación a 10.000 rpm durante 5 minutos a 4ºC. Las muestras se diluyeron con tampón de carga de SDS-PAGE que contiene beta-mercaptoetanol y se hirvieron durante 10 minutos antes de cargar el gel de SDS-PAGE. La proteína se transfirió a nitrocelulosa y se ensayó utilizando 1 \mug/ml de suero policlonal de conejo purificado anti-L762P (lote #690/73) o sobrenadante de mAb 153.20.1 no diluido anti-L762P. Las transferencias se revelaron utilizando Ig de cabra anti-conejo acoplada a HRP o Ig de cabra anti-ratón acoplada a HRP seguido de incubación en sustrato ECL.
Para el análisis de citometría de flujo, las células se lavaron más con tampón de tinción enfriado en hielo (PBS+
1%BSA+Azida). Después, las células se incubaron durante 30 minutos en hielo con 10 \mug/ml de suero policlonal purificado anti-L762P (lote #690/73) o una dilución 1:2 de sobrenadante de mAb 153.20.1 anti-L762P. Las células se lavaron 3 veces con tampón de tinción y se incubaron con una dilución 1:100 de reactivo Ig(H+L) de cabra anti-conejo-FITC o Ig(H+L) de cabra anti-ratón-FITC (Southern Biotechnology) durante 30 minutos en hielo. Después de 3 lavados, las células se resuspendieron en tampón de tinción que contiene yoduro de propidio (PI), una tinción vital que permite excluir las células permeables, y se analizó por citometría de flujo.
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Ejemplo 23
Generación de anticuerpos policlonales frente a antígenos de tumor de pulmón
Se expresaron y purificaron tres antígenos de pulmón, L523S (SEQ ID NO: 176), L763P (SEQ ID NO: 159) y péptido #2684 de L763 (SEQ ID NO: 441) para utilizarse en la generación de anticuerpos.
L523S y L763P se expresaron en un sistema de expresión recombinante de E. coli y se crecieron toda la noche en Medio LB con los antibióticos apropiados a 37ºC en un incubador con agitación. A la mañana siguiente, se añadieron 10 ml del cultivo de la noche a 500 ml de 2x YT con los antibióticos apropiados en un matraz Erlenmeyer de 2L con deflectores. Cuando la densidad óptica del cultivo alcanzó 0,4-0,6 a 560 nanometros, las células se indujeron con IPTG (1 mM). Cuatro horas después de la inducción con IPTG, las células se recogieron por centrifuga-
ción.
Las células se lavaron con disolución salina tamponada con fosfato y se centrifugaron de nuevo. El sobrenadante se desechó y las células se congelaron para una futura utilización o se procesaron inmediatamente. Se añadieron veinte mililitros de tampón de lisis a los sedimentos celulares y se agitó con vórtex. Para romper las células de E. coli, esta mezcla se procesó en una prensa de French a una presión de 16.000 psi. Las células se centrifugaron de nuevo y el sobrenadante y el sedimento se analizaron por SDS-PAGE para detectar la migración de la proteína
recombinante.
Para las proteínas localizadas en el sedimento celular, el sedimento se resuspendió en Tris 10 mM pH 8,0, 1% CHAPS y el sedimento de los cuerpos de inclusión se lavó y se centrífugo de nuevo. Este procedimiento se repitió dos veces más. El sedimento de los cuerpos de inclusión lavado se solubilizó con urea 8M o guanidina HCl 6M que contiene Tris 10 mM pH 8,0 más imidazol 10 mM. La proteína solubilizada se añadió a 5 ml de resina de quelato de níquel (Qiagen) y se incubó durante 45 minutos a 1 hora a temperatura ambiente con agitación continua.
Después de la incubación, la mezcla de resina y proteína se vertió en una columna desechable y se recogió el flujo saliente. La columna se lavó con 10-20 volúmenes de columna del tampón e solubilización. El antígeno se eluyó de la columna utilizando urea 8M, Tris 10 mM pH 8,0 e imidazol 300 mM y se recogió en fracciones de 3 ml. Se corrió un gel de SDS-PAGE para determinar qué fracciones combinar para una purificación adicional.
Como etapa final de la purificación, se equilibró una resina de intercambio aniónico fuerte, en este caso Hi-Prep Q (BioRad) con el tampón apropiado y las fracciones combinadas de antes se cargaron en la columna. Cada antígeno se eluyó de la columna con un gradiente creciente de sal. Las fracciones se recogieron al correr la columna y se corrió otro gel de SDS-PAGE para determinar qué fracciones combinar de la columna.
Las fracciones combinadas se dializaron frente a Tris 10 mM pH 8,0. Los criterios de liberación fueron pureza determinada por SDS-PAGE o HPLC, concentración determinada por ensayo de Lowry o Análisis de Aminoácidos, identidad determinada por secuencia de proteína amino terminal, y nivel de endotoxina determinado por el ensayo de Limulus (LAL). Las proteínas se pusieron en viales después de filtrarlas a través de un filtro de 0,22 micrómetros y los antígenos se congelaron hasta que se necesitaran para inmunización.
El péptido #2684 de L763 se sintetizó y se conjugó a KLH y se congeló hasta que se necesitara para inmuni-
zación.
Los antisueros policlonales se generaron utilizando 400 microgramos de cada antígeno de pulmón combinados con 10 microgramos de muramildipéptido (MDP). Se añadió un volumen igual de Adyuvante Incompleto de Freund (IFA) y se mezcló y se inyectó subcutáneamente (S.C.) a un conejo. Después de cuatro semanas, el conejo se reforzó S.C. con 200 mirogramos de antígeno mezclado con un volumen igual de IFA. Posteriormente, el conejo se reforzó I.V. con 100 microgramos de antígeno. El animal se sangró siete días después de cada refuerzo. La sangre se incubó a 4ºC durante 12-24 horas seguido de centrifugación para generar el suero.
Los antisueros policlonales se caracterizaron utilizando placas de 96 pocillos recubiertas con antígeno y se incubaron con 50 microlitros (típicamente 1 microgramo/mililitro) de los antisueros policlonales a 4ºC durante 20 horas. Básicamente, se añadieron 250 microlitros de tampón bloqueante de BSA a los pocillos y se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas. Las placas se lavaron 6 veces con PBS/0,1% Tween. Los sueros de conejo se diluyeron en PBS/0,1%Tween/0,1% BSA. Se añadieron 50 microlitros de suero diluido a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las placas se lavaron como se ha descrito anteriormente, y se añadieron 50 microlitros de anti-conejo de cabra con peroxidasa de rábano (HRP) a una dilución 1:10.000 y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Las placas se lavaron como se ha descrito anteriormente, y se añadieron 100 microlitros de Sustrato de Peroxidasa TMB a cada pocillo. Después de una incubación de 15 minutos en oscuridad a temperatura ambiente, la reacción colorimétrica se paró con 100 microlitros de H_{2}SO_{4} 1N y se leyó inmediatamente a 450 nm. Todos los anticuerpos policlonales mostraron inmunoreactividad frente al antígeno apropiado. Las Tablas 7-9 muestran la reactividad de los anticuerpos de los antisueros de conejo en dilución seriada frente a los tres antígenos de pulmón L523S, L763P y el péptido #2684 de L763. La primera columna muestra las diluciones del anticuerpo. Las columnas "Sueros pre-inmunes" indican los datos de ELISA de dos experimentos utilizando sueros pre-inmunes. Estos resultados están promediados en la cuarta columna. Las columnas "anti-L523S, L763P o #2684" indican los datos de ELISA de dos experimentos utilizando sueros de conejos inmunizados como se ha descrito en este Ejemplo, utilizando el antígeno respectivo, referidos como L523S, L763P o #2684 en las tablas.
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TABLA 7 
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7
TABLA 8
9 
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TABLA 9
10 
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Las tablas 10-12 muestran la purificación por afinidad de los anticuerpos respectivos frente a los tres antígenos de pulmón L523S, L763P y el péptido #2684 de L763.
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TABLA 10
11 
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TABLA 11
12
13 
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TABLA 12
14 
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Ejemplo 24
Secuencia de ADNc de longitud completa que codifica L529S
El aislamiento de una secuencia parcial (SEQ ID NO: 106) para el antígeno de pulmón L529S se ha proporcionado previamente en el Ejemplo 2. Esta secuencia parcial se utilizó como una cuestión para identificar potenciales secuencias de ADNc y de proteína de longitud completa buscando en bases de datos disponibles públicamente. La secuencia de ADNc de longitud completa predicha para la secuencia aislada clonada de SEQ ID NO: 106 se proporciona en SEQ ID NO: 442. La secuencia de aminoácidos deducida del antígeno codificada por SEQ ID NO: 442 se proporciona en SEQ ID NO: 443. Se ha descrito previamente en el Ejemplo 2 que L529S muestra similitud con conexina 26, una proteína de unión comunicante.
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Ejemplo 25
Expresión en megaterium de una proteína de fusión L523S sin etiqueta de histidina
Se realizó PCR en la región codificadora de L523S con los cebadores siguientes:
Cebador directo PDM-734 5' caatcaggcatgcacaacaaactgtatatcggaaac 3' (SEQ ID NO: 444) Tm 63ºC.
Cebador inverso PDM-735 5' cgtcaagatcttcattacttccgtcttgac 3' SEQ ID NO: 445) Tm 60ºC.
Las condiciones de PCR fueron las siguientes:
10 \mul 10X tampón Pfu
1,0 \mul 10 mM dNTP
2,0 \mul 10 \muM de cada cebador
83 \mul agua estéril
1,5 \mul Pfu ADN polimerasa (Stratagene, La Jolla, CA)
50 ng ADN
96ºC durante 2 minutos, 96ºC durante 20 segundos, 62ºC durante 15 segundos, 72ºC durante 4 minutos con 40 ciclos y después 72ºC durante 4 minutos.
El producto de PCR se digirió con las enzimas de restricción SphI y BgIII, se purificó en gel y se clonó en pMEG-3, que se había digerido con las enzimas de restricción SphI y BgIII. La construcción correcta se confirmó por análisis de la secuencia de ADN y se transformó en células Megaterium para expresión.
La secuencia de aminoácidos de L523S recombinante expresada se muestra en SEQ ID NO: 446, y la secuencia de la región codificadora de ADN se muestra en SEQ ID NO: 447.
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Ejemplo 26
Expresión en E. coli de una proteína de fusión L523S sin etiqueta de histidina
Se realizó PCR en la región codificadora de L552S con los cebadores siguientes:
Cebador directo PDM-733 5' cgtactagcatatgaacaaactgtatatcggaaac 3' (SEQ ID NO: 448) Tm 64ºC.
Cebador inverso PDM-415 5' ccatagaattcattacttccgtcttgactgagg 3' (SEQ ID NO: 426) Tm 62ºC.
Las condiciones de PCR fueron las siguientes:
10 \mul 10X tampón Pfu
1,0 \mul 10 mM dNTP
2,0 \mul 10 \muM de cada cebador
83 \mul agua estéril
1,5 \mul Pfu ADN polimerasa (Stratagene, La Jolla, CA)
50 ng ADN
96ºC durante 2 minutos, 96ºC durante 20 segundos, 62ºC durante 15 segundos, 72ºC durante 4 minutos con 40 ciclos y después 72ºC durante 4 minutos.
El producto de PCR se digirió con las enzimas de restricción NdeI y EcoRI, se purificó en gel y se clonó en pPDM, un vector pET28 modificado, que se había digerido con las enzimas de restricción NdeI y EcoRI. La construcción correcta se confirmó por análisis de la secuencia de ADN y se transformó en células BLR pLys S y HMS 174 pLys S para expresión.
La secuencia de aminoácidos de L523S recombinante expresada se muestra en SEQ ID NO: 449, y la secuencia de la región codificadora de ADN se muestra en SEQ ID NO: 450.
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Ejemplo 27
Análisis de epítopos de los anticuerpos específicos para L514S y L523S
Los péptidos de los antígenos candidatos pueden utilizarse para la evaluación de respuestas de anticuerpos tanto en estudios preclínicos como clínicos. Estos datos permiten confirmar más la respuesta de anticuerpo frente a un determinado antígeno candidato. Puede utilizarse ELISA basado en proteínas con y sin péptidos competitivos y ELISA basado en péptidos para evaluar estas respuestas de anticuerpos. El ELISA de péptidos es especialmente útil ya que puede excluir más los falsos positivos de la titulación de anticuerpos observados en el ELISA basado en proteínas así como proporcionar el sistema de ensayo más simple para ensayar respuestas de anticuerpos frente a antígenos candidatos. En este ejemplo, se obtuvieron datos utilizando tanto péptidos de L514S como de L523S que muestran que los pacientes con cáncer individuales producen anticuerpos específicos de L514S y L523S. Los anticuerpos específicos de L514S reconocen principalmente el epítopo siguiente de L514S:
aa86-110: LGKEVRDAKITPEAFEKLGFPAAKE (SEQ ID NO: 451).
\newpage
Este epítopo es el epítopo habitual en los seres humanos. Un anticuerpo de conejo específico de L514S reconoce dos epítopos más de L514S:
(1)
aa21-45: KASDGDYYTLAVPMGDVPMDGISVA (SEQ ID NO: 452)
(2)
aa121-135: PDRDVNLTHQLNPKVK (SEQ ID NO: 453).
Se encontró además que la SEQ ID NO: 452 es común a ambas isoformas de L514S, L514S-13160 y L514S-13166, mientras que los otros epítopos, SEQ ID NO: 451 y SEQ ID NO: 453, son probablemente específicos de la isoforma, L514S-13160.
Los anticuerpos específicos de L523S reconocen principalmente el epítopo siguiente de L523S:
aa440-460: KIAPAEAPDAKVRMVIITGP (SEQ ID NO: 454).
Este epítopo es el epítopo habitual en los seres humanos. Un anticuerpo de conejo específico de L523S reconoce dos epítopos más:
(1)
aa156-175 PDGAAQQNNNPLQQPRG (SEQ ID NO: 455)
(2)
aa326-345: RTTTVKGNVETCAKAEEEIM (SEQ ID NO: 456).
En estudios adicionales, se determinó por ELISA basado en péptidos que ocho epítopos adicionales de L523S eran reconocidos por anticuerpos específicos de L523S:
\vskip1.000000\baselineskip
1001 
\vskip1.000000\baselineskip
De estos, seis epítopos son comunes tanto en muestras de líquido de efusión plural de pulmón como en los sueros de los pacientes de pulmón. De estos seis, SEQ ID NO: 459 y SEQ ID NO: 463 no tienen homología con otras proteínas de la familia de L523S tales como las proteínas de unión a ARNm 1 y 2 de IGF-II. De acuerdo con esto, esto indica que estos dos péptidos pueden utilizarse como un sistema de ensayo para determinar la respuesta de anticuerpos frente a L523S.
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Ejemplo 28
Generación de líneas CTL específicas de L523S utilizando cebado de gen completo in vitro
Para determinar si L523S es capaz de generar una respuesta inmune de células T CD8^{+}, se generaron CTL utilizando metodologías de cebado de gen completo in vitro con antígeno de tumor-DC infectadas con vaccinia (Yee et al, The Journal of Immunology, 157(9):4079-86, 1996), se obtuvieron líneas CTL humanas que reconocen específicamente fibroblastos autólogos transducidos con el antígeno de tumor L552S, según se determina por análisis ELISPOT con interferón-gamma. Específicamente, se diferenciaron células dendríticas (DC) a partir de monocitos purificados por Percoll obtenidos de PBMC de donantes humanos normales por adherencia a plástico y crecimiento durante cinco días en medio RPMI que contiene 10% suero humano, 50 ng/ml GM-CSF humano y 30 ng/ml IL-4 humana. Después de los cinco días de cultivo, las DC se infectaron toda la noche con un adenovirus recombinante que expresa L523S a una multiplicidad de infección (M.O.I) de 33, 66 y 100, y se maduraron toda la noche por la adición de 2 \mug/ml de ligando CD40. El virus se inactivó por irradiación UV. Con el fin de generar una línea CTL, se aislaron PBMC autólogos y se enriquecieron células T CD8+ por selección negativa utilizando lechos magnéticos conjugados con células CD4+, CD14+, CD16+, CD19+, CD34+ y CD56+. Las células T CD8+ específicas para L523S se establecieron en placas de fondo redondo de 96 pocillos utilizando 10.000 DC que expresan L523S y 100.000 células T CD8+ por pocillo en RPMI suplementado con 10% suero humano, 10 ng/ml de IL-6 y 5 ng/ml de IL-12. Los cultivos se volvieron a estimular cada 7-10 días utilizando fibroblastos primarios autólogos transducidos con retrovirus con L523S, y la molécula coestimuladora CD80 en presencia de IL-2. Las células también se estimularon con IFN-gamma para regular al alza MHC Clase I. El medio se suplementó con 10 U/ml de IL-2 en el momento de la estimulación así como en los días 2 y 5 después de la estimulación. Después de tres ciclos de estimulación, se identificaron diez líneas de células T CD8+ específicas de L523S utilizando análisis ELISPOT con interferón-gamma que producen específicamente interferón-gamma cuando se estimulan con los fibroblastos autólogos transducidos con el antígeno de tumor L523S, pero no con un antígeno control.
Una línea, 6B1, se clonó utilizando células anti-CD3 y de soporte. Los clones se ensayaron para especificidad en fibroblastos transducidos con L523S. Además, utilizando un panel de líneas con HLA no coincidentes transducidas con un vector que expresa L523S y midiendo la producción de interferón-gamma por esta línea CTL en un ensayo ELISPOT, se determinó que este clon 6B1.4B8 está restringido por HLA-A0201.
Utilizando células Cos transfectadas, también se mostró que el clon 6B1.4B8 reconoce las células Cos transfectadas con pcDNA3 HLA A0201/L523S de una manera restringida por HLA y específica de antígeno.
Un estudio de mapeo de epítopos demostró que el clon 6B1.4B8 reconoce HLA-A201 LCL cargado con el conjunto de péptidos 3 (un polipéptido correspondiente a las posiciones de aminoácidos 33-59 de L523S).
Un estudio de desglose del conjunto de péptidos demostró que el clon 6B1.4B8 reconoce B-LCL autólogos cargados con péptidos 15-mer de las posiciones de aminoácidos 37-55 de L523S, TGYAFVCPDESWALKAIE (SEQ ID NO: 465). Un estudio más de desglose de péptidos demostró que el clon 6B1.4B8 reconoce células T2 cargadas con los mismos péptidos 15-mer.
Un estudio de reconocimiento de péptidos demostró que el clon 6B1.4B8 prefiere células T2 cargadas con el péptido FVDCPESWAL (SEQ ID NO: 466) que corresponde a la secuencia de aminoácidos en las posiciones 41-51 de L523S y está codificado por la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 467.
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Ejemplo 29
Expresión de L523S en otros cánceres humanos
Se ha descrito previamente en el Ejemplo 2 que L523S se expresa en cánceres de pulmón incluyendo carcinoma escamoso, adenocarcinoma y de células pequeñas. Para evaluar más el perfil de expresión de este antígeno se realizó una co-ocurrencia electrónica exprés. Esto se hizo buscando una secuencia específica de L523S en una base de datos EST pública. Los resultados de esta co-ocurrencia indican que L523S también puede estar presente en adenocarcinomas de colon, adenocarcinomas de próstata, CML, AML, Linfoma de Burkitt, tumores de cerebro, retinoblastomas, tumores de ovario, teratocarcinomas, miosarcomas de útero, tumores de células germinales así como líneas celulares de tumor pancreático y cervical.
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Ejemplo 30
Análisis inmunohistoquímico de L523S
Con el fin de determinar qué tejidos expresan el antígeno de tumor de pulmón L523S, se realizó un análisis inmunohistoquímico (IHC) en una gama diversa de tipos de tejido. Se generaron anticuerpos policlonales específicos de L523S (SEQ ID NO: 176) como se describe en el Ejemplo 23. Se realizó IHC esencialmente como se describe en el Ejemplo 6. Brevemente, se fijaron muestras de tejido en disolución de formalina durante 12-24 horas y se incluyeron en parafina antes de cortarlas en secciones de 8 micrómetros. La recuperación de epítopos inducida por calor por vapor (SHIER) en tampón 0,1M citrato de sodio (pH 6,0) se utilizó para condiciones de tinción óptimas. Las secciones se incubaron con 10% suero en PBS durante 5 minutos. Se añadió anticuerpo primario de L523S a cada sección durante 25 minutos seguido de una incubación de 25 minutos con anticuerpo biotinilado anti-conejo. La actividad peroxidasa endógena se bloqueó mediante tres incubaciones de 1,5 minutos con peroxidasa de hidrógeno. El sistema complejo avidina biotina/peroxidasa de rábano (ABC/HRP) se utilizó junto con cromógeno DAB para visualizar la expresión del antígeno. Los portaobjetos se contratiñeron con hematoxilina para visualizar los núcleos de las células.
El análisis IHC de la expresión de L523S reveló que de los tejidos de cáncer de pulmón ensayados más del 90% de las muestras de tejido demostraron una alta sobreexpresión del antígeno de tumor de pulmón (10/11 adenocarcinomas y 8/9 escamosos). De los tejidos normales ensayados, todos fueron negativos para la expresión de L523S, con la excepción de una tinción débil en bronquios, testículos, hígado y tráquea normales.
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Ejemplo 31
Generación y caracterización de anticuerpos monoclonales humanos frente a L762
Los sobrenadantes celulares de fusiones de hibridoma de la cepa de Xenomouse de ratones transgénicos se cribaron para detectar su capacidad de unirse a L762P. Todos los resultados se muestran en la Tabla 13. El cribado primario fue ensayar sobrenadantes monoclonales para reactividad frente a L762P por análisis ELISA utilizando proteína recombinante expresada en bacterias. Después, ensayamos los sobrenadantes humanos para reactividad frente a L762P expresado en la superficie por ELISA de células completas utilizando análisis fluorimétrico. La reactividad específica de los sobrenadantes humanos se confirmó realizando un análisis FACS en células transfectadas con un plásmido irrelevante o con un plásmido que expresa L762P. FI/CFI es el número de veces de incremento relativo de la intensidad de fluorescencia (FI) del anticuerpo primario humano anti-L762P respecto a un anticuerpo primario humano irrelevante. FI/CFI/A20 es el número de veces de incremento relativo de la intensidad de fluorescencia (FI) del anticuerpo primario humano anti-L762P respecto a un anticuerpo primario humano irrelevante sobre la FI del anticuerpo monoclonal de ratón anti-L762P, 153A20.1. FI/CFI/R690 es el número de veces de incremento relativo de la intensidad de fluorescencia (FI) del anticuerpo primario humano anti-L762P respecto a un anticuerpo primario humano irrelevante sobre la FI del anticuerpo policlonal de conejo anti-L762P. FACS VRL762 es el porcentaje de células transfectadas con el plásmido que expresa L762P que fueron positivas después de la tinción con el anticuerpo monoclonal indicado. FACS VR(-) es el porcentaje de células transfectadas con el plásmido irrelevante que fueron positivas después de la tinción con el anticuerpo monoclonal indicado. ELISA es los valores de D.O. del anticuerpo monoclonal indicado frente a la proteína L762P recombinante. Las filas sombreadas en la Tabla 13 indican aquellos anticuerpos que se clonarán y caracterizarán adicionalmente.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 13 Anticuerpos Monoclonales Humanos Frente a L762P
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25 
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26
Ejemplo 32
Mapeo de epítopos y purificación de anticuerpos específicos de hL523S
Este Ejemplo describe la purificación de anticuerpos de L523S que pueden distinguir entre homólogos humanos y de ratón de L523S y que probablemente distinguirán entre hL523S y miembros de la familia de hL523S tales como hIMP-1 y hIMP-2.
L523S (secuencia de longitud completa de ADNc y de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 347 y 348, respectivamente) es una de una familia de proteínas que incluye hIMP-1 y hIMP-2. Los miembros de esta familia de proteínas tienen un alto grado de similitud entre sí y también son altamente similares entre especies. Así, ha sido problemático el generar anticuerpos que reconozcan específicamente L523S humano (hL523S) y no otros miembros de la familia de proteínas en los seres humanos o los homólogos de ratón. Sin embargo, con el fin de evaluar vacunas preclínicas y clínicas ADN de L523S/Adenovirales mediante la detección de la expresión de la proteína L523S, son críticos los anticuerpos específicos de L523S humano.
Se generaron anticuerpos policlonales específicos de hL523S como se describe en el Ejemplo 23. Estos anticuerpos se utilizaron para mapear epítopos. El análisis de los epítopos mostró 2 péptidos particulares de hL523S que fueron reconocidos, péptido 16/17 y péptido 32.
Se compararon las secuencias de aminoácidos del péptido 16/17 y el péptido 32 de hL523S y L523S de ratón (mL523S). El péptido 32/33 es idéntico entre hL523S y mL523S. Sin embargo, como indica el alineamiento siguiente, el péptido 16/17 tiene 5 diferencias en los aminoácidos entre los homólogos humanos y de ratón (subrayadas).
1000 
\newpage
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Además, los ELISA basados en péptidos mostraron que el péptido 17 es reconocido específicamente por el suero #197 de pacientes con cáncer de pulmón, y una búsqueda de homología del péptido 17 entre los miembros de la familia humana IMP (hIMP) muestra que existe una pequeña similitud en esta región entre los miembros de la familia. El péptido 17 (y 16/17) de hL523S tiene menos del 50% de similitud respecto a miembros de la familia de hL523S tales como hIMP-1 y hIMP-2.
Tomando como base el mapeo de epítopos de los anticuerpos específicos de L523S y los datos de la búsqueda de homología, se utilizaron ligandos conjugados al péptido 16/17 de hL523S o mL523S para purificar anticuerpos humanos o de ratón específicos de L523S a partir de anticuerpos policlonales de conejo generados frente a la proteína hL523S como se describe en el Ejemplo 23. Los datos de los anticuerpos purificados por cromatografía de afinidad utilizando ligandos conjugados con el péptido 16/17 de hL523S o el péptido 16/17 de mL523S sugirieron que la afinidad de los anticuerpos específicos del péptido 16/17 de hL523S es mucho mayor que la de los anticuerpos frente al péptido 16/17 de mL523S ya que se unen más fuertemente al péptido 16/17 de hL523S que al péptido 16/17 de mL523S. La diferencia de afinidad entre los anticuerpos purificados frente al péptido 16/17 de L523S humano y de ratón se confirmó por ELISA basado en péptidos. Los anticuerpos purificados por péptido 16/17 de hL523S se unen selectivamente al péptido 16/17 de L523S humano y se unen mucho menos o nada al péptido 16/17 de
mL523S.
Con el fin de caracterizar más los anticuerpos policlonales originales y los anticuerpos purificados por el péptido 16/17 de hL523S, se realizó un análisis por inmunotransferencia utilizando tanto una línea de adenocarcinoma de pulmón humano como fuente de la proteína hL523S como un embrión de cuerpo completo (día 17 de gestación) de ratón como fuente de la proteína mL523S. Este análisis mostró que los anticuerpos policlonales específicos de hL523S reconocen la proteína hL523S expresada en la línea de células de tumor así como la proteína mL523S expresada en los embriones de cuerpo completo del día 17 de gestación. Sin embargo, la adición del péptido 32/33 de hL523S bloquea la unión de los anticuerpos a las proteínas L523S humanas y de ratón. Así, la reactividad cruzada de los anticuerpos policlonales frente a la proteína mL523S se debe a la existencia de anticuerpos específicos del péptido 32/33 de hL523S. Por el contrario, los anticuerpos purificados específicos del péptido 16/17 de hL523S no se unen a la proteína mL523S expresada en embriones de ratón pero sí reconocen la proteína hL523S expresada en células de adenocarcinoma de pulmón humano. Estos datos confirman los datos de ELISA utilizando el péptido 16/17 de hL523S y el péptido 16/17 de mL523S descritos anteriormente.
La secuencia de aminoácidos del péptido 16/17 de hL523S utilizado para purificar los anticuerpos es aproximadamente 60-70% similar a la del péptido 16/17 de mL523S que no es reconocido por los anticuerpos específicos de hL523S por análisis de transferencia Western y ELISA basado en péptidos. El péptido 16/17 de hL523S tiene menos de 5% de similitud respecto a miembros de la familia de hL523S tales como hIMP-1 y hIMP-2. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que es altamente probable que los anticuerpos purificados por el péptido 16/17 de hL523S descritos en la presente memoria también distinguirán la proteína hL523S frente a otros miembros de la familia de hL523S.
En resumen, los anticuerpos purificados con el péptido 16/17 de hL523S no reconocen el L523S homólogo de ratón. La secuencia de aminoácidos del péptido 16/17 entre los miembros de la familia hL523S es menos similar que entre L523S humano y de ratón. Así, los anticuerpos específicos de L523S descritos anteriormente pueden utilizarse para distinguir entre L523S humano y de ratón y entre los miembros de la familia hL523S de proteínas y, por lo tanto, pueden utilizarse para la detección precisa de la expresión de la proteína hL523S en animales y seres
humanos.
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Ejemplo 33
Inmunogenicidad in vivo del antígeno de tumor de pulmón L523
Este ejemplo describe dos estudios de inmunogenicidad in vivo para evaluar la vacunación de ratones bien con un adenovirus que contiene L523 o con ADN desnudo de L523 seguido de una segunda inmunización con un adenovirus que contiene L523.
El primer estudio implicó la inmunización de dos cepas de ratones con adenovirus L523. La cepa C57B16 de ratones es homocigota para el tipo de HLA H-2^{b}, mientras que la cepa B6D2(F1) es heterocigota para el tipo de HLA, H-2^{b/d}. La Tabla 14 describe la estrategia inicial de inmunización empleada.
TABLA 14 Inmunización con Adenovirus L523 solo: Diseño Experimental
27
PFU=unidad formadora de placas; GFP=proteína verde fluorescente; Ad=adenovirus.
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Los ratones se inmunizaron intradérmicamente con 10^{8} PFU de L-523-adenovirus ó 10^{7} PFU de un adenovirus irrelevante (hrGFP). Tres semanas después de la inmunización, se examinaron las respuestas de anticuerpo IgG1 e IgG2a frente a L523 en todos los grupos de ratones. Brevemente, L523 recombinante de longitud completa (rL523) se utilizó para recubrir placas de ELISA y, a diluciones múltiples, se añadió suero a los pocillos. Después de una incubación de 60 minutos, el suero se eliminó por lavado de los pocillos y se añadió a las placas un anticuerpo secundario, bien específico de una IgG1 o IgG2a. Ambos anticuerpos se conjugaron directamente a peroxidasa de rábano (HRP). En todos los grupos se midieron los niveles de anticuerpos L523, bien IgG1 o IgG2a. En los ratones C57BL6, se detectaron pocos o ningún anticuerpo específico de L523 después de la inmunización. Sin embargo, en la cepa B6D2(F1) de ratones inmunizados con adenovirus L523, se detectaron tanto anticuerpos IgG1 como IgG2a específicos de L523 a una dilución de suero tan baja como 1/1.000.
Además de detectar anticuerpos específicos de L523 en el suero, se ensayaron respuesta de interferón-gamma (IFN-\gamma) de células inmunes de bazo después de la estimulación in vitro con la proteína rL523. Brevemente, se recogieron células de bazo de todos los grupos de ratones y se cultivaron durante 3 días en placas de 96 pocillos. Las condiciones de cultivo incluyeron, medio solo, 1 ó 10 \mug/ml de proteína rL523, ó 5 \mug/ml de concanavalina A (Con A). Después de 3 días, los sobrenadantes se recogieron y se ensayaron para detectar niveles de IFN-\gamma en los sobrena-
dantes.
La inmunización con L523 adenovirus, pero no un adenovirus irrelevante, incitó una respuesta IFN-\gamma fuerte de las células de bazo que se estimularon con rL523. En general, las respuestas fueron mayores en la cepa de ratones B6D2(F1), como se manifiesta por un nivel mayor de producción de IFN-\gamma, así como por el hecho de que la estimulación con una concentración de antígeno menor (1 \mug/ml) incitó una respuesta igual de fuerte que la observada con la concentración de antígeno más alta (10 \mug/ml).
Finalmente, se ensayaron respuestas de proliferación de células T de células de bazo por estimulación in vitro con la proteína rL523. Brevemente, las células de bazo se cultivaron durante 4 días en placas de 96 pocillos con, medio solo, 1 ó 10 \mug/ml de proteína rL523, o Con A. Los cultivos se pulsaron con 3H-timidina durante las 8 horas finales de cultivo. Los resultados se representan como el índice de estimulación (SI) en presencia de antígeno respecto a la estimulación con medio solo. Los resultados fueron consistentes con los obtenidos en el ensayo de IFN-\gamma. La inmunización con L523-adenovirus, pero no un adenovirus irrelevante, incitó una respuesta de proliferación en las células de bazo estimuladas con rL523. Se observó un SI alto (media > 20) en las células de bazo recogidas de la cepa de ratón B6D2(F1), con niveles similares de proliferación observados a ambas concentraciones de proteína. En la cepa de ratón C57BL6, se observó poca o ninguna proliferación de células
T.
Un segundo estudio implicó la inmunización de dos cepas de ratones inicialmente con ADN desnudo de L523 seguido de una segunda inmunización con L523 adenovirus dos semanas después. Los ratones se recogieron 3 semanas después del refuerzo. La Tabla 15 describe el régimen de inmunización del segundo estudio.
TABLA 15 Inmunización con ADN de L523 seguido de una segunda inmunización con L523-Adenovirus: Diseño Experimental
28
PFU=unidad formadora de placas; GFP=proteína verde fluorescente; Ad=adenovirus.
Como se ha descrito en el primer estudio, se observaron respuestas de anticuerpo IgG1 e IgG2a fuertes en los ratones B6D2(F1) después de la inmunización con L523-adenovirus. La inmunización con ADN de L523 incrementó la respuesta global de anticuerpo específica de L523 comparada con las respuestas obtenidas con la inmunización con L523-adenovirus solo. Los ratones C57BL6 produjeron poca o ninguna respuesta de anticuerpos específicos de L523 después de la inmunización con L523-adenovirus, pero se detectaron respuestas ligeramente positivas en ratones inmunizados con ADN de L523 seguido de una segunda inmunización con L523-adenovirus.
Se ensayaron respuestas de IFN-\gamma de células inmunes de bazo por estimulación in vitro con la proteína rL523. Estos resultados confirman los observados en el estudio inicial lo que demuestra la inmunogenicidad de L523 en los animales. Los resultados también sugieren que la inmunización inicial de los animales con ADN de L523, antes de la inmunización con L523-adenovirus, no incrementa significativamente la respuesta CD4. Al igual que en el estudio inicial, las respuestas parecen más fuertes en la cepa de ratones B6D2(F1) que en la cepa C57BL6.
Al igual que en el estudio inicial, se ensayaron respuestas de proliferación de células T de células inmunes de bazo por estimulación in vitro con la proteína rL523. Los resultados de utilizar dos ciclos de inmunización son consistentes con los obtenidos en el primer estudio. La inmunización con ADN de L523 antes de un segundo ciclo de inmunización con L523-adenovirus no incrementó significativamente las respuestas de proliferación generadas en los ratones. Al igual que en el primer estudio, las respuestas fueron más fuertes en la cepa de ratones B6D2(F1) que en la cepa C57BL6.
La diferencia en los tipos de HLA entre las dos cepas de ratones podría explicar las variaciones en la magnitud de las respuestas inmunes detectadas. Como se ha descrito anteriormente, la cepa C57B16 es homocigota para H-2^{b}, mientras que la cepa B6D2(F1) es heterocigota para H-2^{b/d}. La diversidad incrementada del tipo HLA de las cepas B6D2(F1) permite que se presente un número mayor de epítopos obtenidos de la proteína L523. En esta cepa, pueden presentarse los epítopos específicos tanto para H-2^{b} como para H-2^{d}, mientras que la cepa C57B16 sólo puede presentar los epítopos H-2^{b}.
A partir de lo anterior se apreciará que, aunque se han descrito en la presente memoria realizaciones específicas de la invención para propósitos de ilustración, pueden hacerse varias modificaciones sin apartarse del alcance de la invención, que no está limitada excepto por las reivindicaciones adjuntas.
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<110> Corixa Corporation
\hskip1cm
Wang, Tongtong 
\hskip1cm
Wang, Aijun 
\hskip1cm
Skeiky, Yasir A.W. 
\hskip1cm
Li, Samual X. 
\hskip1cm
Kalos, Michael D. 
\hskip1cm
Henderson, Robert A. 
\hskip1cm
McNeill, Patricia D. 
\hskip1cm
Fanger, Neil 
\hskip1cm
Retter, Marc W. 
\hskip1cm
Durham, Margarita 
\hskip1cm
Fanger, Gary R. 
\hskip1cm
Vedvick, Thomas S. 
\hskip1cm
Carter, Darrick 
\hskip1cm
Watanabe, Yoshihiro 
\hskip1cm
Peckman, David W. 
\hskip1cm
Cai, Feng 
\hskip1cm
Foy, Teresa M. 
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA LA TERAPIA Y EL DIAGNÓSTICO DE CÁNCER DE PULMÓN.
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> 210121.45503PC
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<140> PCT
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<141> 2001-11-30
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 469
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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
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<210> 1
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<211> 315
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> característica miscelánea
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<222> 236, 241
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<223> n = A,T,C o G
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<400> 1
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29 
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<210> 2
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<211> 380
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<400> 2
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30 
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<211> 346
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> característica miscelánea
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<222> 316, 317, 318, 322, 323, 326, 329, 330, 331, 336, 337, 339, 340, 342, 343
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<223> n = A,T,C o G
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31 
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<211> 372
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 297, 306, 332
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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<400> 4
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32 
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> característica miscelánea
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<222> 8, 345, 422, 430, 433, 436, 438, 472, 481, 486, 515, 521, 536, 549, 553, 556, 557, 559, 568, 593, 597, 605, 611, 613, 616, 618, 620, 628, 630, 632, 634, 635, 639, 643, 647, 648, 649, 652, 654, 658, 664, 690
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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<400> 5
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33 
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<211> 740
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> característica miscelánea
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<222> 82, 406, 426, 434, 462, 536, 551, 558, 563, 567, 582, 584, 592, 638, 651, 660, 664, 673, 675, 697, 706, 711, 715, 716, 717, 723, 724, 725, 733
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<223> n = A,T,C o G
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<400> 6
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\hskip0,8cm
34 
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<211> 670
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
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<222> 265, 268, 457, 470, 485, 546, 553, 566, 590, 596, 613, 624, 639, 653, 659, 661
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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<400> 7
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\hskip0,8cm
35 
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<211> 689
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 253, 335, 410, 428, 448, 458, 466, 479, 480, 482, 483, 485, 488, 491, 492, 495, 499, 500, 502, 503, 512, 516, 524, 525, 526, 527, 530, 540, 546, 550, 581, 593, 594, 601, 606, 609, 610, 620, 621, 622, 628, 641, 646, 656, 673
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<223> n = A,T,C o G
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<400> 8
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\hskip0,8cm
36 
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 602, 632, 639, 668
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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<400> 9
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37 
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<211> 346
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
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<222> 320, 321, 322, 325, 326, 328, 329, 330, 332, 333, 334, 335, 342
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
38 
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<210> 11
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<211> 602
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<400> 11
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39 
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<210> 12
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<211> 685
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 170, 279, 318, 321, 322, 422, 450, 453, 459, 467, 468, 470, 473, 475, 482, 485, 486, 491, 498, 503, 506, 509, 522, 526, 527, 528, 538, 542, 544, 551, 567, 568, 569, 574, 576, 582, 587, 588, 589, 590, 592, 593, 598, 599, 603, 605, 608
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 633, 634, 635, 644, 646, 648, 651, 655, 660, 662, 663, 672, 674, 675, 682, 683
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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<400> 12
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\hskip0,8cm
40 
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<210> 13
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<211> 694
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 503, 546, 599, 611, 636, 641, 643, 645, 656, 658, 662, 676, 679, 687
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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<400> 13
\hskip0,8cm
41 
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<210> 14
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<211> 679
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 29, 68, 83, 87, 94, 104, 117, 142, 145, 151, 187, 201, 211, 226, 229, 239, 241, 245, 252, 255, 259, 303, 309, 359, 387, 400, 441, 446, 461, 492, 504, 505, 512, 525, 527, 533, 574, 592, 609, 610, 618, 620, 626, 627, 633, 639, 645, 654
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
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\hskip0,8cm
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 695
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 105, 172, 176, 179, 189, 203, 212, 219, 221, 229, 231, 238, 242, 261, 266, 270, 278, 285, 286, 298, 311, 324, 337, 350, 363, 384, 391, 395, 405, 411, 424, 427, 443, 448, 453, 455, 458, 463, 467, 470, 479, 482, 484, 493, 499, 505, 518
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 520, 523, 531, 540, 584, 595, 597, 609, 611, 626, 628, 651, 652, 657, 661, 665, 669, 672, 681, 683, 691, 693
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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<400> 15
\hskip0,8cm
43 
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<210> 16
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<211> 669
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 299, 354, 483, 555, 571, 573, 577, 642, 651, 662, 667
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
44 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 697
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 33, 48, 50, 55, 59, 60, 76, 77, 78, 90, 113, 118, 130, 135, 141, 143, 150, 156, 166, 167, 170, 172, 180, 181, 190, 192, 194, 199, 201, 209, 212, 224, 225, 226, 230, 233, 234, 236, 242, 244, 251, 253, 256, 268, 297, 305, 308, 311, 314
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 315, 317, 322, 324, 327, 333, 337, 343, 362, 364, 367, 368, 373, 384, 388, 394, 406, 411, 413, 423, 429, 438, 449, 450, 473, 476, 479, 489, 491, 494, 499, 505, 507, 508, 522, 523, 527, 530, 533, 535, 538, 539, 545, 548, 550, 552, 555
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
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<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 562, 563, 566, 568, 572, 577, 578, 580, 581, 591, 594, 622, 628, 632, 638, 642, 644, 653, 658, 662, 663, 665, 669, 675, 680, 686, 689
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\newpage
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<400> 17
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<210> 18
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<211> 670
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 234, 292, 329, 437, 458, 478, 487, 524, 542, 549, 550, 557, 576, 597, 603, 604, 646, 665
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 18
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46 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 606
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 506
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
47 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 449
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
48 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 409
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
49 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 649
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 263, 353, 610, 635, 646
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
50 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 669
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 642, 661
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
51 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 442
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
52 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 656
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 330, 342, 418, 548, 579, 608
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
53 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 434
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 395
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
54 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 654
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 505, 533, 563, 592, 613, 635, 638
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
55 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 670
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 101, 226, 274, 330, 385, 392, 397, 402, 452, 473, 476, 532, 534, 538, 550, 583, 595, 604, 613, 622, 643, 669
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
56 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 551
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 336, 474, 504, 511, 522, 523, 524, 540, 547
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
57 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 684
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 545, 570, 606, 657, 684
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
58 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 654
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 326, 582, 651
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
59 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 673
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 376, 545, 627
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
60 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 673
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 325, 419, 452, 532, 538, 542, 571, 600, 616, 651, 653, 672
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
61 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 684
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 414, 472, 480, 490, 503, 507, 508, 513, 523, 574, 575, 598, 659, 662, 675
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
62 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 614
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 17, 20, 152, 223, 267, 287, 304, 306, 316, 319, 321, 355, 365, 382, 391, 407, 419, 428, 434, 464, 467, 477, 480, 495, 499, 505, 515, 516, 522, 524, 527, 542, 547, 549, 567, 572, 576, 578
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
63 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 686
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 222, 224, 237, 264, 285, 548, 551, 628, 643, 645, 665, 674
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
64 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 681
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 7, 10, 11, 19, 25, 32, 46, 53, 77, 93, 101, 103, 109, 115, 123, 128, 139, 157, 175, 180, 192, 193, 194, 212, 218, 226, 227, 233, 240, 241, 259, 260, 267, 289, 296, 297, 298, 312, 313, 314, 320, 325, 330, 337, 345, 346, 352, 353, 356
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 382, 385, 400, 427, 481, 484, 485, 491, 505, 515, 533, 542, 544, 554, 557, 560, 561, 564, 575, 583, 589, 595, 607, 619, 628, 634, 641, 645, 658, 670
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
65 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 687
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 3, 30, 132, 151, 203, 226, 228, 233, 252, 264, 279, 306, 308, 320, 340, 347, 380, 407, 429, 437, 440, 445, 448, 491, 559, 567, 586, 589, 593, 596, 603, 605, 606, 609, 626, 639, 655, 674, 682
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
66 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 695
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 300, 401, 423, 429, 431, 437, 443, 448, 454, 466, 492, 515, 523, 524, 536, 538, 541, 552, 561, 566, 581, 583, 619, 635, 636, 641, 649, 661, 694
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
67 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 674
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 403, 428, 432, 507, 530, 543, 580, 583, 591, 604, 608, 621, 624, 626, 639, 672
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
68 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 657
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 243, 247, 251, 261, 267, 272, 298, 312, 315, 421, 432, 434, 501, 524, 569, 594, 607, 650
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
69 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 389
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 179, 317, 320
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
70 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 279
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
71 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 449
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 245, 256, 264, 266, 273, 281, 323, 325, 337, 393
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
72 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 559
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 263
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
73 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 731
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 270, 467, 477, 502, 635, 660, 671, 688, 695, 697, 725
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
74 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 640
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 5, 28, 106, 153, 158, 173, 176, 182, 189, 205, 210, 214, 225, 226, 229, 237, 260, 263, 269, 277, 281, 282, 322, 337, 338, 354, 365, 428, 441, 443, 456, 467, 476, 484, 503, 508, 554, 567, 575, 579, 588, 601, 606, 609, 611, 621, 636
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
75 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 257
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
76 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 652
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 410, 428, 496, 571, 647
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
77 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 650
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 237, 270, 311, 443, 454, 488, 520, 535, 539, 556, 567, 594, 603, 634
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
78 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 545
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_featnre
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 66, 159, 195, 205, 214, 243, 278, 298, 306, 337, 366, 375, 382, 405, 446, 477, 492, 495, 503, 507, 508, 521, 537
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
79 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 678
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 98, 119, 121, 131, 136, 139, 140, 142, 143, 163, 168, 172, 176, 184, 189, 190, 191, 200, 201, 205, 207, 221, 223, 229, 230, 237, 240, 241, 255, 264, 266, 267, 276, 280, 288, 289, 291, 297, 301, 306, 308, 314, 315, 326, 332, 335, 337
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 339, 341, 343, 344, 345, 347, 350, 355, 356, 358, 362, 363, 372, 379, 395, 397, 398, 400, 403, 412, 414, 421, 423, 431, 435, 438, 439, 450, 457, 463, 467, 471, 474, 480, 483, 484, 487, 490, 491, 492, 493, 499, 500, 504, 508, 518, 536
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 538, 549, 551, 552, 554, 556, 557, 562, 563, 567, 571, 572, 576, 579, 590, 592, 595, 598, 606, 609, 613, 620, 622, 624, 626, 631, 634, 638, 641, 647, 654, 660, 661, 674
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
80 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 502
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 139, 146, 215, 217, 257, 263, 289, 386, 420, 452, 457, 461, 466, 482, 486
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
81 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 494
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 431, 442, 445
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
82 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 606
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 375, 395, 511, 542, 559, 569, 578, 581
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
83 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
84 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 622
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 358, 368, 412, 414, 425, 430, 453, 455, 469, 475, 495, 499, 529, 540, 564, 575, 590
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
85 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 433
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
86 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 649
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 22, 190, 217, 430, 433, 484, 544, 550, 577, 583, 594
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
87 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 423
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 209, 222, 277, 389, 398
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\hskip0,8cm
88 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 423
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 195, 285, 295, 329, 335, 340, 347, 367, 382, 383, 391, 396, 418
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
89 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 683
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 218, 291, 305, 411, 416, 441, 443, 453, 522, 523, 536, 542, 547, 566, 588, 592, 595, 603, 621, 628, 630, 632, 644, 645, 648, 655, 660, 672, 674, 676, 677, 683
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
90 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 731
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 237, 249, 263, 288, 312, 317, 323, 326, 337, 352, 362, 370, 377, 400, 411, 414, 434, 436, 446, 457, 473, 486, 497, 498, 502, 512, 531, 546, 554, 563, 565, 566, 588, 597, 608, 611, 613, 615, 627, 632, 640, 641, 644, 654, 660, 663, 665
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 671, 678, 692, 697, 698, 699, 704, 705, 712, 714, 717, 718, 719, 723, 725, 730, 731
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
91 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 313
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 240
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
92 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 420
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 400, 402, 403, 404, 405, 406, 409, 411, 412, 414, 415, 416
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\hskip0,8cm
93 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 676
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 328, 454, 505, 555, 586, 612, 636, 641
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\hskip0,8cm
94 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 620
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 419, 493, 519, 568, 605, 610
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\hskip0,8cm
95 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 551
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 286, 464, 480, 501, 502, 518, 528, 533, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 543, 544, 545, 547, 548, 549
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
96 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 396
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 235, 310, 323, 381
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
97 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 536
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 388, 446, 455
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
98 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 865
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 22, 35, 39, 56, 131, 138, 146, 183, 194, 197, 238, 269, 277, 282, 297, 316, 331, 336, 340, 341, 346, 349, 370, 376, 381, 382, 392, 396, 397, 401, 433, 444, 445, 454, 455, 469, 472, 477, 480, 482, 489, 497, 499, 511, 522, 526, 527
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 545, 553, 556, 567, 574, 580, 610, 613, 634, 638, 639, 663, 672, 689, 693, 694, 701, 704, 713, 723, 729, 732, 743, 744, 749, 761, 765, 767, 769, 772, 774, 780, 783, 788, 792, 803, 810, 824, 840, 848
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
99 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 560
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 83, 173, 183, 186, 209, 211, 215, 255, 321, 322, 323, 335, 344, 357, 361, 368, 394, 412, 415, 442, 455, 469, 472, 475, 487, 513, 522, 528, 531, 534, 546
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
100 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 379
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 8, 17, 18, 21, 26, 29, 30, 32, 53, 56, 67, 71, 81, 102, 104, 111, 112, 114, 119, 122, 124, 125, 134, 144, 146, 189, 190, 214, 215, 219, 220, 235, 237, 246, 280, 288, 302, 310, 313, 319, 322, 343, 353, 354
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
101 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 437
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 145, 355
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
102 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 579
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 440, 513, 539, 551
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
103 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 666
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 411, 470, 476, 491, 506, 527, 560, 570, 632, 636, 643, 650, 654, 658
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
104 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 396
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 31, 54, 125, 128, 136, 163, 168, 198
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
105 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 793
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 309, 492, 563, 657, 660, 703, 708, 710, 711, 732, 740, 748, 758, 762, 765, 787
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
106 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 456
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 89, 195, 255, 263, 266, 286, 353, 384, 423, 425, 436, 441
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
107 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 284
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 283
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\hskip0,8cm
108 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 671
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 388, 505, 600, 603, 615, 642, 644, 660
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
109 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 217
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
110 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 460
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 104, 118, 172, 401, 422, 423, 444, 449
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\hskip0,8cm
111 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 323
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 70, 138, 178, 197, 228, 242, 244, 287, 311
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\hskip0,8cm
112 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 771
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 63, 426, 471, 497, 521, 554, 583, 586, 606, 609, 615, 652, 686, 691, 694, 695, 706, 713, 730, 732, 743, 751
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
113 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 628
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 162, 249, 266, 348, 407, 427, 488, 518, 545, 566, 569, 597, 598, 611, 617, 621, 624
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
114 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 518
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 384, 421, 486
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
115 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1844
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
116 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 523
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 288, 352, 369, 398, 475, 511, 513
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
117 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 604
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 563
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
118 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 858
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 570, 591, 655, 664, 667, 683, 711, 759, 760, 765, 777, 787, 792, 794, 801, 804, 809, 817, 820
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
119 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 585
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 317, 319, 320, 321, 325, 327, 328, 330, 331, 332, 460, 462, 483, 485, 487, 523, 538, 566, 584
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
120 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 567
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 82, 158, 230, 232, 253, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 295, 303, 307, 314, 349, 352, 354, 356, 366, 369, 379, 382, 386, 393, 404, 427, 428, 446, 450, 452
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 453, 454, 459, 462, 480, 481, 483, 488, 493, 501, 509, 511, 512, 518, 520, 525, 526, 532, 541, 557
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 93
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
121 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 620
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 169, 171, 222, 472, 528, 559, 599
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
122 
\hskip0,8cm
123 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 470
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 61, 67, 79, 89, 106, 213, 271, 281, 330, 354, 387, 432, 448
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 95
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
124 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 660
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 299, 311, 360, 426, 538, 540, 542, 553, 563, 565, 592, 603, 604, 618, 633, 647, 649, 651, 653
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 96
\hskip0,8cm
125 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 441
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 12, 308
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 97
\hskip0,8cm
126 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 600
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 295, 349, 489, 496, 583
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 98
\hskip0,8cm
127 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 667
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 345, 562, 635
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 99
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
128 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 583
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 404, 506, 514, 527, 528, 538, 548, 556, 568, 569
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 100
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
129 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 592
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 218, 497, 502, 533, 544, 546, 548, 550, 555
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 101
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
130 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 587
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 91, 131, 256, 263, 332, 392, 400, 403, 461, 496, 497, 499, 510, 511, 518, 519, 539, 554, 560, 576
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 102
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
131 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 496
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 2, 17, 66, 74, 82, 119, 164, 166, 172, 200, 203, 228, 232, 271, 273, 415, 423, 445, 446, 473
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 103
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
132 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 575
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 18, 19, 45, 68, '77, 132, 155, 174, 219, 226, 238, 259, 263, 271, 273, 306, 323, 339, 363, 368, 370, 378, 381, 382, 436, 440, 449, 450, 456, 481, 485, 496, 503, 510, 512, 515, 528, 542, 552
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 104
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
133 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 619
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 260, 527, 560, 564, 566, 585, 599
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 105
\hskip0,8cm
134 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 506
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 8, 21, 31, 32, 58, 75, 89, 96, 99, 103, 122, 126, 147, 150, 158, 195, 210, 212, 219, 226, 246, 248, 249, 255, 258, 261, 263, 265, 275, 304, 317, 321, 331, 337, 340, 358, 371, 377, 380, 396, 450, 491
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 106
\hskip0,8cm
135 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 289, 317, 378
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 107
\hskip0,8cm
136 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 502
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 22, 31, 126, 168, 183, 205, 219, 231, 236, 259, 283, 295, 296, 298, 301, 340, 354, 378, 383, 409, 433, 446, 455, 466, 488
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 108
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
137 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 109
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 109
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\hskip0,8cm
138 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 110
\hskip0,8cm
139 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
141 
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip0,8cm
144 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 115
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<211> 506
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 8, 21, 31, 32, 58, 75, 89, 96, 99, 103, 122, 126, 147, 150, 158, 195, 210, 212, 219, 226, 246, 248, 249, 255, 258, 261, 263, 265, 275, 304, 317, 321, 331, 337, 340, 358, 371, 377, 380, 396, 450, 491
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip0,8cm
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<213> Homo sapiens 
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\hskip0,8cm
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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151 
\hskip0,8cm
152 
\hskip0,8cm
153 
\hskip0,8cm
154 
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 120
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 91, 131, 256, 263, 332, 392, 400, 403, 461, 496, 497, 499, 510, 511, 518, 519, 539, 554, 560, 576
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 619
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 260, 527, 560, 564, 566, 585, 599
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 121
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
156 
\hskip0,8cm
157 
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\vskip1.000000\baselineskip
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158 
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\vskip1.000000\baselineskip
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159 
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> DNA
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\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
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<222> 16
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<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 125
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\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip0,8cm
161 
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip0,8cm
162 
\hskip0,8cm
163 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 127
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
164 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 128
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 374
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 128
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
165 
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\vskip1.000000\baselineskip
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
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167 
\hskip0,8cm
168 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 131
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 671
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 131
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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169 
\hskip0,8cm
170 
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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172 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 134
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4797
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 135, 501, 4421, 4467, 4468, 4698
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 134
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
173 
\hskip0,8cm
174 
\hskip0,8cm
175 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 135
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2856
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 135
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176 
\hskip0,8cm
177 
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<210> 136
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<211> 356
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<212> DNA
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 174
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<211> 238
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip0,8cm
227 
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 175
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<211> 4181
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 3347, 3502, 3506, 3520, 3538, 3549, 3646, 3940, 3968, 3974, 4036, 4056, 4062, 4080, 4088, 4115
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 175
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
228 
\hskip0,8cm
229 
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<210> 176
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 579
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 176
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\hskip0,8cm
230 
\hskip0,8cm
231 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 177
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 401
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<400> 177
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232 
\hskip0,8cm
233 
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<210> 178
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 178
\hskip0,8cm
234 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 179
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 521
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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235 
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 401
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 182
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\hskip0,8cm
238 
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<210> 183
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 325
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<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
239 
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<210> 184
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 370
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip0,8cm
240 
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
241 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 186
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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<400> 186
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
242 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip0,8cm
243 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 220
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 188
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
244 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 189
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 417
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 76, 77
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 189
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
245 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 190
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 497
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 190
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
246 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 191
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 175
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 191
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
247 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 192
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 526
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 192
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
248 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 193
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 553
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 290, 300, 411, 441
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 193
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
249 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 194
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 320
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 194
\hskip0,8cm
250 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 195
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 320
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 203, 218
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 195
\hskip0,8cm
251 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 196
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 357
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 196
\hskip0,8cm
252 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 197
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 565
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 197
\hskip0,8cm
253 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 198
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 484
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 198
\hskip0,8cm
254 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 199
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 429
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 77, 88, 134, 151, 189, 227, 274, 319
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 199
\hskip0,8cm
255 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 200
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 279
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 200
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
256 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 201
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 569
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 201
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
257 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 202
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 501
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 202
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
258 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 203
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 261
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 36, 96
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 203
\hskip0,8cm
259 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 204
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 421
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 204
\hskip0,8cm
260 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 205
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 460
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 205
\hskip0,8cm
261 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 206
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 481
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 206
\hskip0,8cm
262 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 207
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 605
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 20, 21, 61
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 210
\hskip0,8cm
263 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 211
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 451
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 211
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
264 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 471
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 212
\hskip0,8cm
265 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 213
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 511
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 27, 63, 337, 442
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 207
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
266 
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 208
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 655
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 208
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\hskip0,8cm
267 
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 209
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<211> 621
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<400> 209
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\hskip0,8cm
268 
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<210> 210
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<211> 533
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 213
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
269 
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<210> 214
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 521
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<400> 214
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\hskip0,8cm
270 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 215
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<211> 381
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 17, 20, 60, 61, 365
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 215
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
271 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
272 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 217
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
273 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip0,8cm
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 207, 210
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 219
\hskip0,8cm
275 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 220
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 380
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 220
\hskip0,8cm
276 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 398
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 221
\hskip0,8cm
277 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 222
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 301
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 49, 64
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 222
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\hskip0,8cm
278 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 223
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
279 
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 224
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\hskip0,8cm
280 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 225
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
281 
\hskip0,8cm
282 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 226
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 226
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
283 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<213> Homo sapiens 
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\hskip0,8cm
284 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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\hskip0,8cm
285 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
286 
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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\hskip0,8cm
287 
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<210> 231
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
288 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 232
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
289 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 233
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 233
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
290 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 234
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
291 
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
292 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
293 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
294 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
295 
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\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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\hskip0,8cm
296 
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
298 
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
299 
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<213> Homo sapiens 
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
301 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip0,8cm
302 
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
303 
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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304 
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\vskip1.000000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 250
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
307 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 251
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 251
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
308 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 252
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 153
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 252
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
309 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 253
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 462
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 253
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
310 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 254
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8031
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 254
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
311 
\hskip0,8cm
312 
\hskip0,8cm
313 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 255
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 401
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 9, 67, 247, 275, 277, 397
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 255
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
314 
\hskip0,8cm
315 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 256
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 401
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 7, 37, 51, 79, 96, 98, 103, 104, 107, 116, 167, 181, 183, 194, 206, 276, 303, 307, 308, 310, 323, 332, 341, 353, 374, 376
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 256
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
316 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 257
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 401
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 382, 387
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 257
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
317 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 258
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 401
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 258
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
318 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 259
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 401
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 259
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
319 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 260
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 363
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 7, 9, 19, 41, 63, 73, 106, 111, 113, 116, 119, 156, 158, 162, 187, 247, 288, 289, 290, 292, 298, 299, 300, 340
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 260
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
320 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 261
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 401
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 114, 152
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 261
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
321 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 262
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 401
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 7, 26, 258, 305, 358, 373, 374, 378
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 262
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
322 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 263
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 401
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 232, 290, 304, 326, 383
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 263
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
323 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 264
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 401
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 264
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
324 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 265
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 271
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 265
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
325 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 266
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 401
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 266
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
326 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 267
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 401
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 116, 247, 277, 296, 307, 313, 322, 323, 336, 342, 355, 365, 377, 378, 397
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 267
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
327 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 268
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 223
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 268
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
328 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 269
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 401
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 269
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
329 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 270
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 401
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 240, 382
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 270
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
330 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 271
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 329
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 271
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
3300 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 272
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 401
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1, 7, 12, 21, 61, 62, 66, 72, 78, 88, 90, 92, 98, 117, 119, 128, 130, 134, 142, 144, 151, 159, 162, 164, 168, 169, 177, 184, 185, 188, 194, 202, 204, 209, 213, 218, 223, 231, 260, 272, 299, 300, 306, 321, 322, 323, 331, 335, 336, 338
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 341, 342, 343, 345, 346, 351, 358, 360, 362, 363, 387, 390, 392
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 272
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
331 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 273
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 401
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 399
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 273
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
332 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 274
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 401
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 274
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
333 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 275
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 401
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 275
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
334 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 276
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 401
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 276
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
335 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 277
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 401
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 227, 333
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 277
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
336 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 278
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 401
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 322, 354
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 278
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
337 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 279
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 401
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 30, 35, 81, 88, 180, 212, 378, 384, 391
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 279
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
338 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 280
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 326
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 280
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
339 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 281
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 374
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 281
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
340 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 282
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 404
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 26, 27, 51, 137, 180, 222
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 282
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
341 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 283
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 184
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 283
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
342 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 284
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 421
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 147, 149
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 284
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
343 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 285
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 361
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 34, 188
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 285
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
344 
\hskip0,8cm
345 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 286
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 336
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 40, 68, 75, 127, 262
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 286
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
346 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 287
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 301
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15, 33, 44, 53, 76, 83, 107, 117, 154, 166, 192, 194, 207, 215, 241, 246
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 287
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
347 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 288
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 358
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 39, 143, 226
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 288
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
348 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 289
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 462
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 87, 141, 182, 220, 269, 327
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 289
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
349 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 290
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 481
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 44, 57, 122, 158, 304, 325, 352, 405
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 290
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
350 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 291
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 381
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 79, 166, 187, 208, 219, 315
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 291
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
351 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 292
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 371
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 32, 55, 72, 151, 189, 292
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 292
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
352 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 293
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 361
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 75, 196, 222
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 293
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
353 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 294
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 391
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 26, 77, 96, 150, 203, 252, 254, 264, 276
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 294
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
354 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 295
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 343
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 145, 174, 205, 232
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 295
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
355 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 296
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 241
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 96, 98, 106, 185
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 296
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
356 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 297
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 391
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 12, 130
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 297
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
357 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 298
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 321
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 14, 30, 76, 116, 201; 288, 301
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 298
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
358 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 299
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 401
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 104, 268, 347
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 299
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
359 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 300
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 188
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 300
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
360 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 301
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 291
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 301
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
361 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 302
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 341
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 302
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
362 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 303
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 361
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15, 27, 92, 124, 127, 183, 198, 244, 320
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 303
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
363 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 304
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 301
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 23, 104, 192
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
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<223> n = A,T,C o G
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412 
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415 
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417 
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<212> PRT
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<212> PRT
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\hskip0,8cm
431 
\hskip0,8cm
432 
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\hfill
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\hskip0,8cm
439 
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
440 
\hskip0,8cm
441 
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtcaatcact ctcccagcat aagcacccca gcccactcta ttccagggag tcatgctatg 
\hfill
60 
\newpage
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 371
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agtagaattt cctctggaac tggagacatt ttccagcaac atattcagct tgaaagtaca 
\hfill
60 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 372
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 372
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccagagactg gagatcctgt tacgctgaga ctccttgatg atggagcagg tgctgatgtt 
\hfill
60 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 373
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 373
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttacagtctg ctgtatctaa cattgcccag gcgcctctgt ttattccccc caattctgat 
\hfill
60 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 374
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 374
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctgtgcccc cagccactgt ggaagccttt gtggaaagag acagcctcca ttttcctcat 
\hfill
60 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 375
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 375
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaaaacacag tgactgtgga taatactgtg ggcaacgaca ctatgtttct agttacgtgg 
\hfill
60 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 376
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 376
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
442 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 377
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 377
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\hskip0,8cm
443 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 378
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip0,8cm
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<212> DNA
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\vskip0.400000\baselineskip
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ggatccgccg ccaccatgga ctcctggacc ttctgct 
\hfill
37 
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<212> DNA
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\vskip0.400000\baselineskip
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gtcgactcag aaatcctttc tcttgac 
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27 
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<213> Homo sapiens 
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\vskip1.000000\baselineskip
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497 
\hskip0,8cm
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36 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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500 
\hskip0,8cm
501 
\hskip0,8cm
502 
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<213> Homo sapiens 
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\hskip0,8cm
503 
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cgtactagca tatgaacaaa ctgtatatcg gaaac 
\hfill
35 
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<211> 579
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<212> PRT
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\vskip0.400000\baselineskip
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504 
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\hskip0,8cm
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<212> PRT
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508 
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509 
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510 
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<210> 454
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<211> 20
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 454
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511 
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<210> 455
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<211> 20
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 455
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512 
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<210> 456
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<211> 20
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 456
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513 
\hskip0,5cm
514 
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<210> 457
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<211> 20
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 457
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515 
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<210> 458
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<211> 20
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<213> Homo sapiens 
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516 
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<210> 459
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 459
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517 
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<210> 460
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<211> 20
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 460
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518 
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<210> 461
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<211> 20
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<213> Homo sapiens 
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<400> 461
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519 
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<211> 20
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<213> Homo sapiens 
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520 
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<210> 463
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<211> 20
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 463
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521 
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<210> 464
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522 
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<210> 465
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<211> 18
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523 
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<210> 466
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<211> 11
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<213> Homo sapiens 
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<400> 466
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\hskip0,8cm
524 
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<210> 467
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<211> 33
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<212> DNA
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\hskip-.1em\dddseqskip
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33 
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525 
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<210> 469
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<211> 24
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 469
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526

Claims (17)

1. Un polipéptido aislado que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 468 o una variante inmunológicamente reactiva de éste que presenta una identidad de secuencia de al menos 91% a lo largo de su longitud completa con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 468.
2. Un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido según la reivindicación 1.
3. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido de la reivindicación 2 unido de manera operativa a una secuencia de control de la expresión.
4. Una célula anfitriona transformada o transfectada con un vector de expresión según la reivindicación 3.
5. Un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígenos de éste, que se une específicamente al polipéptido de la reivindicación 1.
6. El anticuerpo de la reivindicación 5, en el que el anticuerpo puede distinguir entre L523S humano y L523S de ratón.
7. El anticuerpo de la reivindicación 5 en el que el anticuerpo puede distinguir entre hL523S y ARNm de la proteína de unión 1 de IGF-II (hIMP-1) o ARNm de la proteína de unión 2 de IGF-II (hIMP-2).
8. El anticuerpo de la reivindicación 5, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
9. Un método para detectar la presencia de un cáncer de pulmón en un paciente, que comprende las etapas de:
a)
poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo que se une al polipéptido de la reivindicación 1;
b)
detectar en la muestra una cantidad de polipéptido que se une al anticuerpo; y
c)
comparar la cantidad de polipéptido con un valor de corte predeterminado y determinar a partir de esto la presencia de un cáncer en el paciente.
10. El método de la reivindicación 9, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
11. Una proteína de fusión que comprende el polipéptido según la reivindicación 1.
12. Una composición que comprende un primer componente seleccionado del grupo que consiste en vehículos e inmunoestimulantes fisiológicamente aceptables, y un segundo componente seleccionado del grupo que consiste en:
a)
el polipéptido según la reivindicación 1;
b)
el polinucleótido según la reivindicación 2;
c)
el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 5-8; y
d)
la proteína de fusión según la reivindicación 11.
13. La composición de la reivindicación 12 para utilizarse en la estimulación de una respuesta inmune en un paciente con cáncer de pulmón.
14. La composición de la reivindicación 12 para utilizarse en el tratamiento de un paciente con cáncer de pulmón.
15. La composición de la reivindicación 12 para utilizarse en terapia.
16. La utilización de la composición de la reivindicación 12 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer de pulmón.
17. Un kit de diagnóstico que comprende el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 5-8.
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