JP4180919B2 - 肺癌の治療および診断のための組成物および方法 - Google Patents

肺癌の治療および診断のための組成物および方法 Download PDF

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Description

（発明の技術分野）
本発明は、一般に、肺癌のような癌の治療および診断に関する。本発明は、より具体的には、肺腫瘍タンパク質の少なくとも一部を含むポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。このようなポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、薬学的組成物（例えば、ワクチン）および肺癌の診断および処置のための他の組成物において有用である。
（発明の背景）
（発明の分野）
癌は、世界中で顕著な健康の問題である。癌の検出および治療において進展が見られているが、予防および／または処置のためのワクチンまたは他の普遍的に首尾よい方法は、現在利用可能ではない。現在の治療は一般に、化学療法または手術および照射の組合せに基づいているが、これは依然として、大部分の患者において不十分であることが判明している。
（関連技術の記載）
肺癌は、米国における男性および女性の両方における癌での死亡の主な原因であり、１９９４年には１７２，０００件の新しい症例が報告されたと見積もられた。全ての肺癌患者における５年間の生存率は、診断時における疾患の病期に関わらず、わずかに１３％のみである。これは、検出されるがなおこの疾患が局在化されている症例における４６％の５年間生存率と対照的である。しかし、肺癌のわずかに１６％のみが、この疾患が広がる前に発見される。
これらおよび他の癌の治療のためのかなりの研究にもかかわらず、肺癌は、有効に診断および処置するのが困難なままである。従って、このような癌を検出および処置するための改善された方法についての必要性が、当該分野に存在する。本発明は、これらの必要性を満たし、そしてさらに、他の関連する利点を提供する。
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、以下からなる群より選択される配列を含むポリヌクレオチド組成物を提供する：
（ａ）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）１〜３、６〜８、１０〜１３、１５〜２７、２９、３０、３２、３４〜４９、５１、５２、５４、５５、５７〜５９、６１〜６９、７１、７３、７４、７７、７８、８０〜８２、８４、８６〜９６、１０７〜１０９、１１１、１１３、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１〜１３３、１４２、１４４、１４８〜１５１、１５３、１５４、１５７、１５８、１６０、１６７、１６８、１７１、１７９、１８２、１８４〜１８６、１８８〜１９１、１９３、１９４、１９８〜２０７、２０９、２１０、２１３、２１４、２１７、２２０〜２２４、２５３〜３３７、３４５、３４７、３４９、３５８、３６２、３６４、３６５、３６８、３７０〜３７５、４２０、４２４、４２８、４３１、４３４、４４２、４４７、４５０および４６７に提供される配列；
（ｂ）配列番号１〜３、６〜８、１０〜１３、１５〜２７、２９、３０、３２、３４〜４９、５１、５２、５４、５５、５７〜５９、６１〜６９、７１、７３、７４、７７、７８、８０〜８２、８４、８６〜９６、１０７〜１０９、１１１、１１３、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１〜１３３、１４２、１４４、１４８〜１５１、１５３、１５４、１５７、１５８、１６０、１６７、１６８、１７１、１７９、１８２、１８４〜１８６、１８８〜１９１、１９３、１９４、１９８〜２０７、２０９、２１０、２１３、２１４、２１７、２２０〜２２４、２５３〜３３７、３４５、３４７、３４９、３５８、３６２、３６４、３６５、３６８、３７０〜３７５、４２０、４２４、４２８、４３１、４３４、４４２、４４７、４５０および４６７に提供される配列の相補体；
（ｃ）配列番号１〜３、６〜８、１０〜１３、１５〜２７、２９、３０、３２、３４〜４９、５１、５２、５４、５５、５７〜５９、６１〜６９、７１、７３、７４、７７、７８、８０〜８２、８４、８６〜９６、１０７〜１０９、１１１、１１３、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１〜１３３、１４２、１４４、１４８〜１５１、１５３、１５４、１５７、１５８、１６０、１６７、１６８、１７１、１７９、１８２、１８４〜１８６、１８８〜１９１、１９３、１９４、１９８〜２０７、２０９、２１０、２１３、２１４、２１７、２２０〜２２４、２５３〜３３７、３４５、３４７、３４９、３５８、３６２、３６４、３６５、３６８、３７０〜３７５、４２０、４２４、４２８、４３１、４３４、４４２、４４７、４５０および４６７に提供される配列の、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５および１００連続する残基からなる配列；
（ｄ）配列番号１〜３、６〜８、１０〜１３、１５〜２７、２９、３０、３２、３４〜４９、５１、５２、５４、５５、５７〜５９、６１〜６９、７１、７３、７４、７７、７８、８０〜８２、８４、８６〜９６、１０７〜１０９、１１１、１１３、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１〜１３３、１４２、１４４、１４８〜１５１、１５３、１５４、１５７、１５８、１６０、１６７、１６８、１７１、１７９、１８２、１８４〜１８６、１８８〜１９１、１９３、１９４、１９８〜２０７、２０９、２１０、２１３、２１４、２１７、２２０〜２２４、２５３〜３３７、３４５、３４７、３４９、３５８、３６２、３６４、３６５、３６８、３７０〜３７５、４２０、４２４、４２８、４３１、４３４、４４２、４４７、４５０および４６７に提供される配列に、中程度または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列；
（ｅ）配列番号１〜３、６〜８、１０〜１３、１５〜２７、２９、３０、３２、３４〜４９、５１、５２、５４、５５、５７〜５９、６１〜６９、７１、７３、７４、７７、７８、８０〜８２、８４、８６〜９６、１０７〜１０９、１１１、１１３、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１〜１３３、１４２、１４４、１４８〜１５１、１５３、１５４、１５７、１５８、１６０、１６７、１６８、１７１、１７９、１８２、１８４〜１８６、１８８〜１９１、１９３、１９４、１９８〜２０７、２０９、２１０、２１３、２１４、２１７、２２０〜２２４、２５３〜３３７、３４５、３４７、３４９、３５８、３６２、３６４、３６５、３６８、３７０〜３７５、４２０、４２４、４２８、４３１、４３４、４４２、４４７、４５０および４６７の配列に対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する配列；ならびに
（ｆ）配列番号１〜３、６〜８、１０〜１３、１５〜２７、２９、３０、３２、３４〜４９、５１、５２、５４、５５、５７〜５９、６１〜６９、７１、７３、７４、７７、７８、８０〜８２、８４、８６〜９６、１０７〜１０９、１１１、１１３、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１〜１３３、１４２、１４４、１４８〜１５１、１５３、１５４、１５７、１５８、１６０、１６７、１６８、１７１、１７９、１８２、１８４〜１８６、１８８〜１９１、１９３、１９４、１９８〜２０７、２０９、２１０、２１３、２１４、２１７、２２０〜２２４、２５３〜３３７、３４５、３４７、３４９、３５８、３６２、３６４、３６５、３６８、３７０〜３７５、４２０、４２４、４２８、４３１、４３４、４４２、４４７、４５０および４６７に提供される配列の縮重改変体。
１つの好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチド組成物は、試験した肺腫瘍サンプルの少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約３０％、そして最も好ましくは少なくとも約５０％において、正常組織よりも少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約５倍、そして最も好ましくは少なくとも約１０倍高いレベルで発現される。
別の局面において、本発明は、上記ポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド組成物を提供する。
本発明はさらに、配列番号１５２、１５５、１５６、１６５、１６６、１６９、１７０、１７２、１７４、１７６、２２６〜２５２、３３８〜３４４、３４６、３５０、３５７、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７６〜３８２、３８７〜４１９、４２３、４２７、４３０、４３３、４４１、４４３、４４６、４４９、４５１〜４６６および４６８〜４６９に列挙される配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド組成物を提供する。
特定の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、免疫原性である。すなわち、これらは、本明細書中でさらに記載されるように、免疫応答、特に体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を誘発し得る。
本発明は、さらに、開示されたポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド配列のフラグメント、改変体および／または誘導体を提供し、ここで、このフラグメント、改変体および／または誘導体は、好ましくは、配列番号１５２、１５５、１５６、１６５、１６６、１６９、１７０、１７２、１７４、１７６、２２６〜２５２、３３８〜３４４、３４６、３５０、３５７、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７６〜３８２、３８７〜４１９、４２３、４２７、４３０、４３３、４４１、４４３、４４６、４４９および４５１〜４６６に示されるポリペプチド配列、または配列番号１〜３、６〜８、１０〜１３、１５〜２７、２９、３０、３２、３４〜４９、５１、５２、５４、５５、５７〜５９、６１〜６９、７１、７３、７４、７７、７８、８０〜８２、８４、８６〜９６、１０７〜１０９、１１１、１１３、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１〜１３３、１４２、１４４、１４８〜１５１、１５３、１５４、１５７、１５８、１６０、１６７、１６８、１７１、１７９、１８２、１８４〜１８６、１８８〜１９１、１９３、１９４、１９８〜２０７、２０９、２１０、２１３、２１４、２１７、２２０〜２２４、２５３〜３３７、３４５、３４７、３４９、３５８、３６２、３６４、３６５、３６８、３７０〜３７５、４２０、４２４、４２８、４３１、４３４、４４２、４４７、４５０および４６７に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列の免疫原性活性のレベルの、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％の免疫原性活性レベルを有する。
本発明は、さらに、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドを含む発現ベクター、およびこのような発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
他の局面において、本発明は、上記のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、および生理学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。
本発明の関連の局面において、予防適用または治療適用のための薬学的組成物（例えば、ワクチン組成物）が提供される。このような組成物は、一般に、本発明の免疫原性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとアジュバントのような免疫刺激剤とを含む。
本発明はさらに、以下を含む薬学的組成物を提供する：（ａ）本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントに対して特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメント；ならびに（ｂ）生理学的に受容可能なキャリア。
さらなる局面において、本発明は、以下を含む薬学的組成物を提供する：（ａ）上記ポリペプチドを発現する抗原提示細胞、および（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤。例示的な抗原提示細胞としては、樹状細胞、マクロファージ、単球、線維芽細胞およびＢ細胞が挙げられる。
関連の局面において、以下を含む薬学的組成物が提供される：（ａ）上記のポリペプチドを発現する抗原提示細胞および（ｂ）免疫刺激剤。
他の局面において、本発明は、さらに、少なくとも１つの上記ポリペプチドを含む融合タンパク質、ならびにこのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、代表的には薬学的組成物（例えば、生理学的に受容可能なキャリアおよび／または免疫刺激剤を含むワクチン組成物）の形態で、提供する。この融合タンパク質は、本明細書に記載される複数の免疫原性ポリペプチドまたはその部分／改変体を含み得、そしてそのポリペプチドの発現、精製および／または免疫原性を促進するための１以上のポリペプチドセグメントをさらに含み得る。
さらなる局面において、本発明は、患者における免疫応答、好ましくはヒト患者におけるＴ細胞応答を刺激するための方法を提供し、この方法は、本明細書中に記載される薬学的組成物を投与する工程を包含する。この患者は、肺癌に罹患し得（この場合、この方法は、その疾患の処置を提供する）か、またはこのような疾患の危険性があるとみなされる患者は、予防的に処置され得る。
さらなる局面において、本発明は、患者における癌の発達を阻害するための方法を提供し、この方法は、上に列挙されるような薬学的組成物を患者に投与する工程を包含する。この患者は、肺癌に罹患し得（この場合、この方法は、その疾患の処置を提供する）か、またはこのような疾患の危険性があるとみなされる患者は、予防的に処置され得る。
他の局面において、本発明は、さらに、生物学的サンプルから腫瘍細胞を除去するための方法を提供し、この方法は、生物学的サンプルを、本発明のポリペプチドと特異的に反応するＴ細胞と接触させる工程を包含し、ここで、この接触させる工程は、このサンプルから、このタンパク質を発現する細胞を除去するに十分な条件および時間で実施される。
関連の局面において、患者における癌の発達を阻害するための方法が提供され、この方法は、上記のように処理された生物学的サンプルを患者に投与する工程を包含する。
他の局面において、本発明のポリペプチドに特異的なＴ細胞を刺激および／または増殖させるための方法がさらに提供され、この方法は、Ｔ細胞を、１以上の以下：（ｉ）上記ポリペプチド；（ｉｉ）このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および／または（ｉｉｉ）このようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞と、Ｔ細胞の刺激および／または増殖を可能にするに十分な条件下および時間で、接触させる工程を包含する。上記のように調製されたＴ細胞を含む単離されたＴ細胞集団もまた、提供される。
さらなる局面において、本発明は、患者において癌の発達を阻害するための方法を提供し、この方法は、有効量の上記Ｔ細胞集団を患者に投与する工程を包含する。
本発明はさらに、患者における癌の発達を阻害するための方法を提供し、この方法は、（ａ）患者から単離されたＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を、１つ以上の以下：（ｉ）本明細書中に開示されるポリペプチドの少なくとも免疫原性部分を含むポリペプチド；（ｉｉ）このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および（ｉｉｉ）このようなポリペプチドを発現した抗原提示細胞、とインキュベートする工程；ならびに（ｂ）患者に有効量の増殖したＴ細胞を投与し、それによって患者における癌の発達を阻害する工程、を包含する。増殖された細胞は、患者への投与の前にクローン化されていてもよいし、そうでなくてもよい。
さらなる局面において、本発明は、患者における癌（好ましくは、肺癌）の存在または非存在を決定するための方法を提供し、この方法は：（ａ）患者から得られた生物学的サンプルを上記のようなポリペプチドに結合する結合剤と接触させる工程；（ｂ）サンプル中の、この結合剤に結合するポリペプチドの量を検出する工程；および（ｃ）ポリペプチドの量を予備決定したカットオフ値と比較し、それにより患者における癌の存在または非存在を決定する工程、を包含する。好ましい実施形態において、この結合剤は抗体であり、より好ましくはモノクローナル抗体である。
他の局面において、本発明はまた、患者における癌の進行をモニタリングするための方法を提供する。このような方法は：（ａ）第一の時点で患者から得られた生物学的サンプルを上記のようなポリペプチドに結合する結合剤と接触させる工程；（ｂ）サンプル中の、この結合剤に結合するポリペプチドの量を検出する工程；（ｃ）以後の時点でこの患者から得られた生物学的サンプルを使用して工程（ａ）および（ｂ）を反復する工程；ならびに（ｄ）工程（ｃ）で検出されたポリペプチドの量を、工程（ｂ）で検出された量と比較し、それによりこの患者における癌の進行をモニタリングする工程、を包含する。
他の局面において、本発明はさらに、患者における癌の存在または非存在を決定するための方法を提供し、この方法は：（ａ）患者から得られた生物学的サンプルを、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｂ）サンプル中の、このオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（好ましくは、ｍＲＮＡ）のレベルを検出する工程；および（ｃ）このオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドのレベルを、予備決定したカットオフ値と比較し、それにより患者における癌の存在または非存在を決定する工程、を包含する。特定の実施形態において、ｍＲＮＡの量は、例えば、上記のようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはこのようなポリヌクレオチドの相補鎖にハイブリダイズする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を介して検出される。他の実施形態において、ｍＲＮＡの量は、上記のようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはこのようなポリヌクレオチドの相補鎖にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを使用するハイブリダイゼーション技術を用いて検出される。
関連する局面において、患者における癌の進行をモニタリングするための方法が提供され、この方法は（ａ）患者から得られた生物学的サンプルを、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｂ）サンプル中の、このオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を検出する工程；（ｃ）以後の時点でこの患者から得られた生物学的サンプルを使用して工程（ａ）および（ｂ）を反復する工程；ならびに（ｄ）工程（ｃ）で検出されたポリヌクレオチドの量を、工程（ｂ）で検出された量と比較し、それによりこの患者における癌の進行をモニタリングする工程を包含する。
さらなる局面において、本発明は、上記のようなポリペプチドに結合する抗体（例えば、モノクローナル抗体）、ならびにこのような抗体を含む診断キットを提供する。上記のような１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを含む診断キットもまた、提供される。
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明を参照することによって明らかになる。本明細書中に開示される全ての参考文献は、あたかも各々が個々に援用されるように、その全体が参考として本明細書中に援用される。
（配列識別子（ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＩＤＥＮＴＩＦＩＥＲ））
配列番号１は、ＬＳＴ−Ｓ１−２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２は、ＬＳＴ−Ｓ１−２８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３は、ＬＳＴ−Ｓ１−９０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４は、ＬＳＴ−Ｓ１−１４４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５は、ＬＳＴ−Ｓ１−１３３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６は、ＬＳＴ−Ｓ１−１６９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７は、ＬＳＴ−Ｓ２−６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８は、ＬＳＴ−Ｓ２−１１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９は、ＬＳＴ−Ｓ２−１７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０は、ＬＳＴ−Ｓ２−２５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１は、ＬＳＴ−Ｓ２−３９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２は、ＬＳＴ−Ｓ２−４３に対して決定された第一のｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３は、ＬＳＴ−Ｓ２−４３に対して決定された第二のｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４は、ＬＳＴ−Ｓ２−６５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５は、ＬＳＴ−Ｓ２−６８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６は、ＬＳＴ−Ｓ２−７２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７は、ＬＳＴ−Ｓ２−７４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８は、ＬＳＴ−Ｓ２−１０３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｎ１−１Ｆに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２０は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｎ１−２Ａに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｎ１−４Ｈに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｎ１−５Ａに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｎ１−６Ｂに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｎ１−７Ｂに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｎ１−７Ｈに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｎ１−８Ａに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｎ１−８Ｄに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｎ１−９Ａに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｎ１−９Ｅに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｎ１−１０Ａに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｎ１−１０Ｇに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｎ１−１１Ａに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｎ１−１２Ｃに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｎ１−１２Ｅに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｂ１−３Ｄに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｂ１−６Ｃに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３７は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｂ１−５Ｄに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｂ１−５Ｆに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｂ１−６Ｇに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｂ１−８Ａに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｂ１−８Ｄに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｂ１−１０Ａに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４３は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｂ１−９Ｂに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｂ１−９Ｆに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｂ１−１２Ｄに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｉ２−２Ｂに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｉ２−５Ｆに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４８は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｉ２−６Ｂに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４９は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｉ２−７Ｆに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５０は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｉ２−８Ｇに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５１は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｉ２−９Ｅに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５２は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｉ２−１２Ｂに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５３は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｈ２−２Ｃに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５４は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｈ２−１Ｇに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５５は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｈ２−４Ｇに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５６は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｈ２−３Ｈに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５７は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｈ２−５Ｇに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５８は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｈ２−９Ｂに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５９は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｈ２−１０Ｈに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６０は、ＬＳＴ−Ｓ２−Ｈ２−１２Ｄに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６１は、ＬＳＴ−Ｓ３−２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６２は、ＬＳＴ−Ｓ３−４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６３は、ＬＳＴ−Ｓ３−７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６４は、ＬＳＴ−Ｓ３−８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６５は、ＬＳＴ−Ｓ３−１２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６６は、ＬＳＴ−Ｓ３−１３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６７は、ＬＳＴ−Ｓ３−１４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６８は、ＬＳＴ−Ｓ３−１６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６９は、ＬＳＴ−Ｓ３−２１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７０は、ＬＳＴ−Ｓ３−２２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７１は、ＬＳＴ−Ｓ１−７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７２は、ＬＳＴ−Ｓ１−Ａ−１Ｅに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７３は、ＬＳＴ−Ｓ１−Ａ−１Ｇに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７４は、ＬＳＴ−Ｓ１−Ａ−３Ｅに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７５は、ＬＳＴ−Ｓ１−Ａ−４Ｅに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７６は、ＬＳＴ−Ｓ１−Ａ−６Ｄに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７７は、ＬＳＴ−Ｓ１−Ａ−８Ｄに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７８は、ＬＳＴ−Ｓ１−Ａ−１０Ａに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７９は、ＬＳＴ−Ｓ１−Ａ−１０Ｃに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８０は、ＬＳＴ−Ｓ１−Ａ−９Ｄに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８１は、ＬＳＴ−Ｓ１−Ａ−１０Ｄに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８２は、ＬＳＴ−Ｓ１−Ａ−９Ｈに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８３は、ＬＳＴ−Ｓ１−Ａ−１１Ｄに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８４は、ＬＳＴ−Ｓ１−Ａ−１２Ｄに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８５は、ＬＳＴ−Ｓ１−Ａ−１１Ｅに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８６は、ＬＳＴ−Ｓ１−Ａ−１２Ｅに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８７は、Ｌ５１３Ｓ（Ｔ３）に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８８は、Ｌ５１３Ｓコンティグ１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８９は、Ｌ５１４Ｓに対して決定された第一のｃＤＮＡ配列である。
配列番号９０は、Ｌ５１４Ｓに対して決定された第二のｃＤＮＡ配列である。
配列番号９１は、Ｌ５１６Ｓに対して決定された第一のｃＤＮＡ配列である。
配列番号９２は、Ｌ５１６Ｓに対して決定された第二のｃＤＮＡ配列である。
配列番号９３は、Ｌ５１７Ｓに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９４は、ＬＳＴ−Ｓ１−１６９（Ｌ５１９Ｓとしてもまた公知）についての伸長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号９５は、Ｌ５２０Ｓに対して決定された第一のｃＤＮＡ配列である。
配列番号９６は、Ｌ５２０Ｓに対して決定された第二のｃＤＮＡ配列である。
配列番号９７は、Ｌ５２１Ｓに対して決定された第一のｃＤＮＡ配列である。
配列番号９８は、Ｌ５２１Ｓに対して決定された第二のｃＤＮＡ配列である。
配列番号９９は、Ｌ５２２Ｓに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１００は、Ｌ５２３Ｓに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０１は、Ｌ５２４Ｓに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０２は、Ｌ５２５Ｓに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０３は、Ｌ５２６Ｓに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０４は、Ｌ５２７Ｓに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０５は、Ｌ５２８Ｓに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０６は、Ｌ５２９Ｓに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０７は、Ｌ５３０Ｓに対して決定された第一のｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０８は、Ｌ５３０Ｓに対して決定された第二のｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０９は、Ｌ５３１Ｓ短形態に対して決定された全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１０は、配列番号１０９によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１１１は、Ｌ５３１Ｓ長形態に対して決定された全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１２は、配列番号１１１によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１１３は、Ｌ５２０Ｓに対して決定された全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１４は、配列番号１１３によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１１５は、コンティグ１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１６は、コンティグ３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１７は、コンティグ４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１８は、コンティグ５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１９は、コンティグ７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２０は、コンティグ８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２１は、コンティグ９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２２は、コンティグ１０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２３は、コンティグ１２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２４は、コンティグ１１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２５は、コンティグ１３（Ｌ７６１Ｐとしても公知）に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２６は、コンティグ１５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２７は、コンティグ１６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２８は、コンティグ１７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２９は、コンティグ１９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３０は、コンティグ２０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３１は、コンティグ２２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３２は、コンティグ２４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３３は、コンティグ２９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３４は、コンティグ３１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３５は、コンティグ３３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３６は、コンティグ３８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３７は、コンティグ３９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３８は、コンティグ４１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３９は、コンティグ４３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４０は、コンティグ４４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４１は、コンティグ４５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４２は、コンティグ４７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４３は、コンティグ４８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４４は、コンティグ４９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４５は、コンティグ５０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４６は、コンティグ５３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４７は、コンティグ５４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４８は、コンティグ５６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４９は、コンティグ５７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５０は、コンティグ５８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５１は、Ｌ５３０Ｓに対する全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５２は、配列番号１５１によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１５３は、Ｌ５１４Ｓの第一改変体の全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５４は、Ｌ５１４Ｓの第二改変体の全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５５は、配列番号１５３によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１５６は、配列番号１５４によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１５７は、コンティグ５９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５８は、Ｌ７６３Ｐ（コンティグ２２ともまたいわれる）に対する全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５９は、配列番号１５８によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１６０は、Ｌ７６２Ｐ（コンティグ１７ともまたいわれる）に対する全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６１は、配列番号１６０によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１６２は、Ｌ５１５Ｓに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６３は、Ｌ５２４Ｓの第一改変体の全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６４は、Ｌ５２４Ｓの第二改変体の全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６５は、配列番号１６３によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１６６は、配列番号１６４によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１６７は、Ｌ７６２Ｐの第一改変体の全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６８は、Ｌ７６２Ｐの第二改変体の全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６９は、配列番号１６７によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１７０は、配列番号１６８によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１７１は、Ｌ７７３Ｐ（コンティグ５６ともまたいわれる）に対する全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７２は、配列番号１７１によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１７３は、Ｌ５１９Ｓの伸長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７４は、配列番号１７４によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１７５は、Ｌ５２３Ｓに対する全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７６は、配列番号１７５によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１７７は、ＬＳＴ−ｓｕｂ５−７Ａに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７８は、ＬＳＴ−ｓｕｂ５−８Ｇに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７９は、ＬＳＴ−ｓｕｂ５−８Ｈに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８０は、ＬＳＴ−ｓｕｂ５−１０Ｂに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８１は、ＬＳＴ−ｓｕｂ５−１０Ｈに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８２は、ＬＳＴ−ｓｕｂ５−１２Ｂに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８３は、ＬＳＴ−ｓｕｂ５−１１Ｃに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８４は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−１ｃに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８５は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−２ｆに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８６は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−２Ｇに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８７は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−４ｄに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８８は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−４ｅに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８９は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−４ｆに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９０は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−３ｈに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９１は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−５ｄに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９２は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−５ｈに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９３は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−６ｈに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９４は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−７ａに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９５は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−８ａに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９６は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−７ｄに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９７は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−７ｅに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９８は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−８ｅに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９９は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−７ｇに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２００は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−９ｆに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２０１は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−９ｈに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２０２は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−１１ｂに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２０３は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−１１ｃに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２０４は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−１２ｃに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２０５は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−１２ｅに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２０６は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−１２ｆに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２０７は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−１１ｇに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２０８は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−１２ｇに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２０９は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−１２ｈに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１０は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−ＩＩ−１ａに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１１は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−ＩＩ−２ｂに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１２は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−ＩＩ−２ｇに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１３は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−ＩＩ−１ｈに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１４は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−ＩＩ−４ａに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１５は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−ＩＩ−４ｂに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１６は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−ＩＩ−３ｅに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１７は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−ＩＩ−４ｆに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１８は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−ＩＩ−４ｇに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１９は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−ＩＩ−４ｈに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２０は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−ＩＩ−５ｃに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２１は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−ＩＩ−５ｅに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２２は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−ＩＩ−６ｆに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２３は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−ＩＩ−５ｇに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２４は、ＬＳＴ−ｓｕｂ６−ＩＩ−６ｇに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２５は、Ｌ５２８Ｓに対するアミノ酸配列である。
配列番号２２６〜２５１は、Ｌ７６２Ｐ由来の合成ペプチドである。
配列番号２５２は、Ｌ５１４Ｓの発現されたアミノ酸配列である。
配列番号２５３は、配列番号２５２に対応するＤＮＡ配列である。
配列番号２５４は、Ｌ７６２Ｐ発現構築物のＤＮＡ配列である。
配列番号２５５は、クローン２３７８５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５６は、クローン２３７８６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５７は、クローン２３７８８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５８は、クローン２３７９０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５９は、クローン２３７９３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６０は、クローン２３７９４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６１は、クローン２３７９５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６２は、クローン２３７９６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６３は、クローン２３７９７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６４は、クローン２３７９８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６５は、クローン２３７９９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６６は、クローン２３８００に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６７は、クローン２３８０２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６８は、クローン２３８０３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６９は、クローン２３８０４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７０は、クローン２３８０５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７１は、クローン２３８０６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７２は、クローン２３８０７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７３は、クローン２３８０８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７４は、クローン２３８０９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７５は、クローン２３８１０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７６は、クローン２３８１１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７７は、クローン２３８１２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７８は、クローン２３８１３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７９は、クローン２３８１５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８０は、クローン２５２９８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８１は、クローン２５２９９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８２は、クローン２５３００に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８３は、クローン２５３０１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８４は、クローン２５３０４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８５は、クローン２５３０９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８６は、クローン２５３１２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８７は、クローン２５３１７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８８は、クローン２５３２１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８９は、クローン２５３２３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９０は、クローン２５３２７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９１は、クローン２５３２８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９２は、クローン２５３３２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９３は、クローン２５３３３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９４は、クローン２５３３６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９５は、クローン２５３４０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９６は、クローン２５３４２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９７は、クローン２５３５６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９８は、クローン２５３５７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９９は、クローン２５３６１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３００は、クローン２５３６３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０１は、クローン２５３９７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０２は、クローン２５４０２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０３は、クローン２５４０３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０４は、クローン２５４０５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０５は、クローン２５４０７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０６は、クローン２５４０９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０７は、クローン２５３９６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０８は、クローン２５４１４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０９は、クローン２５４１０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１０は、クローン２５４０６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１１は、クローン２５３０６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１２は、クローン２５３６２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１３は、クローン２５３６０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１４は、クローン２５３９８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１５は、クローン２５３５５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１６は、クローン２５３５１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１７は、クローン２５３３１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１８は、クローン２５３３８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１９は、クローン２５３３５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２０は、クローン２５３２９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２１は、クローン２５３２４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２２は、クローン２５３２２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２３は、クローン２５３１９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２４は、クローン２５３１６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２５は、クローン２５３１１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２６は、クローン２５３１０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２７は、クローン２５３０２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２８は、クローン２５３１５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２９は、クローン２５３０８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３０は、クローン２５３０３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３１〜３３７は、ｐ５３癌抑制因子ホモログ、ｐ６３（Ｌ５３０Ｓともまたいわれる）のアイソフォームのｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３８〜３４４は、それぞれ配列番号３３１〜３３７によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号３４５は、抗原Ｌ７６３Ｐに対する第二のｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４６は、配列番号３４５の配列によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号３４７は、Ｌ５２３Ｓに対して決定された全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４８は、配列番号３４７によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号３４９は、Ｌ７７３ＰのＮ末端部分をコードするｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５０は、Ｌ７７３ＰのＮ末端部分のアミノ酸配列である。
配列番号３５１は、Ｒａｌ２とＬ７６３ＰのＮ末端部分との融合物のＤＮＡ配列である。
配列番号３５２は、Ｒａｌ２とＬ７６３ＰのＮ末端部分との融合物のアミノ酸配列である。
配列番号３５３は、Ｒａｌ２とＬ７６３ＰのＣ末端部分との融合物のＤＮＡ配列である。
配列番号３５４は、Ｒａｌ２とＬ７６３ＰのＣ末端部分との融合物のアミノ酸配列である。
配列番号３５５は、プライマーである。
配列番号３５６は、プライマーである。
配列番号３５７は、発現された組換えＬ７６２Ｐのタンパク質配列である。
配列番号３５８は、発現された組換えＬ７６２ＰのＤＮＡ配列である。
配列番号３５９は、プライマーである。
配列番号３６０は、プライマーである。
配列番号３６１は、発現された組換えＬ７７３Ｐ Ａのタンパク質配列である。
配列番号３６２は、発現された組換えＬ７７３Ｐ ＡのＤＮＡ配列である。
配列番号３６３は、クローンＬ７７３Ｐポリペプチド由来のエピトープである。
配列番号３６４は、配列番号３６３のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
配列番号３６５は、クローンＬ７７３Ｐポリペプチド由来のエピトープである。
配列番号３６６は、配列番号３６５のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
配列番号３６７は、配列番号１６１、クローンＬ７６２Ｐのアミノ酸５７１〜５９０からなるエピトープである。
配列番号３６８は、コンティグ１３（配列番号１２５）（Ｌ７６１Ｐとも称される）の全長ＤＮＡ配列である。
配列番号３６９は、配列番号３６８のＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質配列である。
配列番号３７０は、ヌクレオチド２０７１〜２１３０由来のＬ７６２Ｐ ＤＮＡ配列である。．
配列番号３７１は、ヌクレオチド１４４１〜１５００由来のＬ７６２Ｐ ＤＮＡ配列である。
配列番号３７２は、ヌクレオチド１９３６〜１９５５由来のＬ７６２Ｐ ＤＮＡ配列である。
配列番号３７３は、ヌクレオチド２６２０〜２６７９由来のＬ７６２Ｐ ＤＮＡ配列である。
配列番号３７４は、ヌクレオチド１８０１〜１８６０由来のＬ７６２Ｐ ＤＮＡ配列である。
配列番号３７５は、ヌクレオチド１５３１〜１５９１由来のＬ７６２Ｐ ＤＮＡ配列である。
配列番号３７６は、配列番号３７３によってコードされるＬ７６２Ｐペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号３７７は、配列番号３７０によってコードされるＬ７６２Ｐペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号３７８は、配列番号３７２によってコードされるＬ７６２Ｐペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号３７９は、配列番号３７４によってコードされるＬ７６２Ｐペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号３８０は、配列番号３７１によってコードされるＬ７６２Ｐペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号３８１は、配列番号３７５によってコードされるＬ７６２Ｐペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号３８２は、Ｌ７６２Ｐのエピトープのアミノ酸配列である。
配列番号３８３〜３８６は、ＰＣＲプライマーである。
配列番号３８７〜３９５は、Ｌ７７３Ｐペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号３９６〜４１９は、Ｌ５２３Ｓペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号４２０は、クローン番号１９０１４の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２１は、Ｌ５１４Ｓ−１３１６０コード領域の順方向プライマーＰＤＭ−２７８である。
配列番号４２２は、Ｌ５１４Ｓ−１３１６０コード領域の逆方向プライマーＰＤＭ−２７８である。
配列番号４２３は、発現された組換えＬ５１４Ｓのアミノ酸配列である。
配列番号４２４は、組換えＬ５１４ＳのＤＮＡコード配列である。
配列番号４２５は、Ｌ５２３Ｓコード領域の順方向プライマーＰＤＭ−４１４である。
配列番号４２６は、Ｌ５２３Ｓコード領域の逆方向プライマーＰＤＭ−４１４である。
配列番号４２７は、発現された組換えＬ５２３Ｓのアミノ酸配列である。
配列番号４２８は、組換えＬ５２３ＳのＤＮＡコード配列である。
配列番号４２９は、Ｌ７６２ＰＡコード領域の逆方向プライマーＰＤＭ−２７９である。
配列番号４３０は、発現された組換えＬ７６２ＰＡのアミノ酸配列である。
配列番号４３１は、組換えＬ７６２ＰＡのＤＮＡコード配列である。
配列番号４３２は、Ｌ７７３Ｐコード領域の逆方向プライマーＰＤＭ−３００である。
配列番号４３３は、発現された組換えＬ７７３Ｐのアミノ酸配列である。
配列番号４３４は、組換えＬ７７３ＰのＤＮＡコード配列である。
配列番号４３５は、ＴＣＲ Ｖα８の順方向プライマーである。
配列番号４３６は、ＴＣＲ Ｖα８の逆方向プライマーである。
配列番号４３７は、ＴＣＲ Ｖβ８の順方向プライマーである。
配列番号４３８は、ＴＣＲ Ｖβ８の逆方向プライマーである。
配列番号４３９は、肺抗原Ｌ７６２Ｐに特異的なＴＣＲクローンのＴＣＲ ＶαＤＮＡ配列である。
配列番号４４０は、肺抗原Ｌ７６２Ｐに特異的なＴＣＲクローンのＴＣＲ ＶαＤＮＡ配列である。
配列番号４４１は、Ｌ７６３ペプチド番号２６８４のアミノ酸配列である。
配列番号４４２は、クローンＬ５２９Ｓ（配列番号１０６）のクローニングされた部分的配列の、予測された全長ｃＤＮＡである。
配列番号４４３は、配列番号４４２によってコードされる推定アミノ酸配列である。
配列番号４４４は、クローンＬ５２３Ｓのコード領域の順方向プライマーＰＤＭ−７３４である。
配列番号４４５は、クローンＬ５２３Ｓのコード領域の逆方向プライマーＰＤＭ−７３５である。
配列番号４４６は、発現された組換えＬ５２３Ｓのアミノ酸配列である。
配列番号４４７は、組換えＬ５２３ＳのＤＮＡコード配列である。
配列番号４４８は、クローンＬ５２３Ｓのコード領域の別の順方向プライマーＰＤＭ−７３３である。
配列番号４４９は、第二の発現された組換えＬ５２３Ｓのアミノ酸配列である。
配列番号４５０は、第二の組換えＬ５２３ＳのＤＮＡコード配列である。
配列番号４５１は、抗体の生成におけるＬ５１４Ｓ特異的エピトープであるアミノ酸８６〜１１０に対応する。
配列番号４５２は、抗体の生成におけるＬ５１４Ｓ特異的エピトープであるアミノ酸２１〜４５に対応する。
配列番号４５３は、抗体の生成におけるＬ５１４Ｓ特異的エピトープであるアミノ酸１２１〜１３５に対応する。
配列番号４５４は、抗体の生成におけるＬ５２３Ｓ特異的エピトープであるアミノ酸４４０〜４６０に対応する。
配列番号４５５は、抗体の生成におけるＬ５２３Ｓ特異的エピトープであるアミノ酸１５６〜１７５に対応する。
配列番号４５６は、抗体の生成におけるＬ５２３Ｓ特異的エピトープであるアミノ酸３２６〜３４５に対応する。
配列番号４５７は、抗体の生成におけるＬ５２３Ｓ特異的エピトープであるアミノ酸４０〜５９に対応する。
配列番号４５８は、抗体の生成におけるＬ５２３Ｓ特異的エピトープであるアミノ酸８０〜９９に対応する。
配列番号４５９は、抗体の生成におけるＬ５２３Ｓ特異的エピトープであるアミノ酸１６０〜１７９に対応する。
配列番号４６０は、抗体の生成におけるＬ５２３Ｓ特異的エピトープであるアミノ酸１８０〜１９９に対応する。
配列番号４６１は、抗体の生成におけるＬ５２３Ｓ特異的エピトープであるアミノ酸３２０〜３３９に対応する。
配列番号４６２は、抗体の生成におけるＬ５２３Ｓ特異的エピトープであるアミノ酸３４０〜３５９に対応する。
配列番号４６３は、抗体の生成におけるＬ５２３Ｓ特異的エピトープであるアミノ酸３７０〜３８９に対応する。
配列番号４６４は、抗体の生成におけるＬ５２３Ｓ特異的エピトープであるアミノ酸３８０〜３９９に対応する。
配列番号４６５は、Ｌ５２３Ｓ特異的ＣＴＬ株６Ｂ１によって認識されるＬ５２３Ｓのエピトープであるアミノ酸３７〜５５に対応する。
配列番号４６６は、Ｌ５２３Ｓ特異的ＣＴＬ株６Ｂ１によって認識されるＬ５２３Ｓの、マッピングされた抗原性エピトープであるアミノ酸４１〜５１に対応する。
配列番号４６７は、配列番号４６６をコードするＤＮＡ配列に対応する。
配列番号４６８は、ｈＬ５２３Ｓのペプチド１６、１７のアミノ酸に対応する。
配列番号４６９は、ｍＬ５２３Ｓのペプチド１６、１７のアミノ酸に対応する。
(発明の詳細な説明)
本発明は、一般的に、癌（特に肺癌）の治療および診断における組成物およびこれらの使用に関する。以下にさらに記載されるように、本発明の例示的な組成物としては、ポリペプチド、特に免疫原性ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、抗体および他の結合因子、抗原提示細胞(ＡＰＣ）および免疫系細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられるが、これらに制限されない。
本発明の実施は、特にそれと逆であることを示さない限り、当該分野の技術範囲であるウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学、および組換えＤＮＡ技術の従来の方法（これらの多くは、例示目的で以下に記載される）を使用する。このような技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照のこと。
上記または下記にかかわらず、本明細書中で引用される、全ての刊行物、特許および特許出願は、それらの全体が参考として本明細書によって援用される。
本明細書中および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数の参照を含む。
（ポリペプチド組成物）
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、その従来の意味、すなわちアミノ酸の配列として使用される。これらのポリペプチドは、特定の長さの生成物に限定されず；従って、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質は、このポリペプチドの定義に含まれ、そしてこのような用語は、別段に示さない限り、本明細書中で交換可能に使用され得る。この用語はまた、このポリペプチドの発現後修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに天然および非天然の両方の、当該分野で公知の他の改変）を言及しないかまたは除外する。ポリペプチドは、タンパク質全体でもあり、またはその部分配列でもあり得る。本発明の状況において特定の目的のポリペプチドは、エピトープ、すなわち、ポリペプチドの免疫原特性の実質的な原因となり、かつ免疫応答を誘起し得る抗原決定基を含むアミノ酸部分配列である。
特に、本発明の例示的なポリペプチドは、以下：配列番号１〜３、６〜８、１０〜１３、１５〜２７、２９、３０、３２、３４〜４９、５１、５２、５４、５５、５７〜５９、６１〜６９、７１、７３、７４、７７、７８、８０〜８２、８４、８６〜９６、１０７〜１０９、１１１、１１３、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１〜１３３、１４２、１４４、１４８〜１５１、１５３、１５４、１５７、１５８、１６０、１６７、１６８、１７１、１７９、１８２、１８４〜１８６、１８８〜１９１、１９３、１９４、１９８〜２０７、２０９、２１０、２１３、２１４、２１７、２２０〜２２４、２５３〜３３７、３４５、３４７、３４９、３５８、３６２、３６４、３６５、３６８、３７０〜３７５、４２０、４２４、４２８、４３１、４３４、４４２、４４７、４５０および４６７のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列；または中程度にストリンジェントな条件下、あるいは、高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１〜３、６〜８、１０〜１３、１５〜２７、２９、３０、３２、３４〜４９、５１、５２、５４、５５、５７〜５９、６１〜６９、７１、７３、７４、７７、７８、８０〜８２、８４、８６〜９６、１０７〜１０９、１１１、１１３、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１〜１３３、１４２、１４４、１４８〜１５１、１５３、１５４、１５７、１５８、１６０、１６７、１６８、１７１、１７９、１８２、１８４〜１８６、１８８〜１９１、１９３、１９４、１９８〜２０７、２０９、２１０、２１３、２１４、２１７、２２０〜２２４、２５３〜３３７、３４５、３４７、３４９、３５８、３６２、３６４、３６５、３６８、３７０〜３７５、４２０、４２４、４２８、４３１、４３４、４４２、４４７、４５０および４６７のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする配列によりコードされるポリペプチドを含む。本発明の特定の例示的なポリペプチドは、配列番号１５２、１５５、１５６、１６５、１６６、１６９、１７０、１７２、１７４、１７６、２２６〜２５２、３３８〜３４４、３４６、３５０、３５７、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７６〜３８２、３８７〜４１９、４２３、４２７、４３０、４３３、４４１、４４３、４４６、４４９、４５１〜４６６および４６８〜４６９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。
本発明のポリペプチドは、時々、それらの同定が、肺腫瘍サンプルにおけるそれらの増大した発現レベルに少なくとも部分的に基づいていたことの指示として、肺腫瘍タンパク質または肺腫瘍ポリペプチドといわれる。従って、「肺腫瘍ポリペプチド」または「肺腫瘍タンパク質」とは、一般的に、本発明のポリペプチド配列、またはそのようなポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列をいい、このポリペプチド配列は、肺腫瘍サンプルの実質的な割合（例えば、試験される肺腫瘍サンプルのうち、好ましくは２０％より多く、より好ましくは約３０％より多く、最も好ましくは約５０％以上）において、本明細書中に提供される代表的なアッセイを用いて測定される場合に、正常な組織における発現のレベルより少なくとも２倍高く、好ましくは少なくとも５倍高いレベルで発現される。本発明の肺腫瘍ポリペプチド配列は、腫瘍細胞における増大した発現レベルに基づいて、以下にさらに記載される診断マーカーおよび治療の標的の両方として、特定の有用性を有する。
特定の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、免疫原性（すなわち、これらは、肺癌を有する患者由来の抗血清および／またはＴ細胞との免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡまたはＴ細胞刺激アッセイのような）において検出可能に反応する）である。免疫原性活性についてのスクリーニングは、当業者に周知の技術を用いて行われ得る。例えば、そのようなスクリーニングは、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８に記載されるような方法を用いて行われ得る。１つの例示的な例において、ポリペプチドは、固体支持体に固定され得、そして患者の血清と接触され、その血清中の抗体をその固定されたポリペプチドに結合させ得る。次いで、結合されなかった血清は、除去され得、結合された抗体が、例えば、１２５Ｉ標識化プロテインＡを使用して検出され得る。
当業者に認識されているように、本明細書中に開示されるポリペプチドの免疫原性部分もまた、本発明により包含される。本明細書中に使用される場合、「免疫原性部分」とは、本発明の免疫原性ポリペプチドのフラグメントであって、それ自体が、このポリペプチドを認識するＢ細胞および／またはＴ細胞の表面の抗原レセプターと免疫学的に反応する（すなわち、特異的に結合する）、ポリペプチドのフラグメントである。免疫原性部分は、一般的にＰａｕｌ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版、２４３−２４７（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，１９９３）およびそこに引用される参考文献に要約されるような周知技術を使用して、同定され得る。このような技術は、抗原特異的な抗体、抗血清および／あるいはＴ細胞株またはＴ細胞クローンと反応する能力についてポリペプチドをスクリーニングする工程を含む。本明細書中で使用される場合、抗血清および抗体は、それらが抗原に特異的に結合する（すなわち、これらが、ＥＬＩＳＡまたは他の免疫アッセイにおいてそのタンパク質と反応し、無関係なタンパク質とは検出可能に反応しない）場合、「抗原特異的」である。このような抗血清および抗体は、本明細書中に記載されるように、そして周知技術を使用して調製され得る。
１つの好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドの免疫原性部分は、実質的に、全長ポリペプチドの反応性に勝るとも劣らないレベルで（例えば、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴ細胞反応性アッセイにおいて）、抗血清および／またはＴ細胞と反応する部分である。好ましくは、この免疫原性部分の免疫原性活性のレベルは、全長ポリペプチドについての免疫原性の、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、最も好ましくは約９０％より高い。いくつかの例において、対応する全長ポリペプチドの免疫原性活性レベルより高い免疫原性活性レベルを有する（例えば、約１００％または１５０％より高いかあるいはそれ以上の免疫原性活性を有する）好ましい免疫原性部分が、同定される。
特定の他の実施形態において、例示的な免疫原性部分は、Ｎ末端リーダー配列および／または膜貫通ドメインが欠失されたペプチドを含み得る。他の例示的な免疫原性部分は、成熟タンパク質と比較して、少ないＮ末端欠失および／またはＣ末端欠失（例えば、１〜３０アミノ酸、好ましくは５〜１５アミノ酸）を含む。
別の実施形態において、本発明のポリペプチド組成物はまた、Ｔ細胞および／または本発明のポリペプチドに対して作製された抗体と免疫学的に反応する１つ以上のポリペプチド（特に、本明細書中に開示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはそれらの免疫原性フラグメントもしくは改変体）も含む。
本発明の別の実施形態において、本明細書中に記載される１以上のポリペプチド、あるいは本明細書中に開示されるポリヌクレオチド配列に含まれる連続する核酸配列またはそれらの免疫原性フラグメントもしくは改変体、あるいは中程度〜高いストリンジェンシーの条件下でこれらの配列の１つ以上とハイブリダイズする１つ以上の核酸配列によりコードされる１つ以上のポリペプチドと免疫学的に反応性であるＴ細胞および／または抗体を誘発し得る、１つ以上のポリペプチドを含むポリペプチドが、提供される。
別の局面において、本発明は、例えば、配列番号１５２、１５５、１５６、１６５、１６６、１６９、１７０、１７２、１７４、１７６、２２６〜２５２、３３８〜３４４、３４６、３５０、３５７、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７６〜３８２、ならびに３８７〜４１９、４４１、４４３、４４６、４４９、４５１〜４６６および４６８〜４６９で示されるポリペプチド組成物または配列番号１〜３、６〜８、１０〜１３、１５〜２７、２９、３０、３２、３４〜４９、５１、５２、５４、５５、５７〜５９、６１〜６９、７１、７３、７４、７７、７８、８０〜８２、８４、８６〜９６、１０７〜１０９、１１１、１１３、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１〜１３３、１４２、１４４、１４８〜１５１、１５３、１５４、１５７、１５８、１６０、１６７、１６８、１７１、１７９、１８２、１８４〜１８６、１８８〜１９１、１９３、１９４、１９８〜２０７、２０９、２１０、２１３、２１４、２１７、２２０〜２２４、２５３〜３３７、３４５、３４７、３４９、３５８、３６２、３６４、３６５、３６８、３７０〜３７５、４２０、４２４、４２８、４３１、４３４、４４２、４４７、４５０および４６７の配列で示されるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド組成物のような、本明細書中に示されるポリペプチド組成物の少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、５０、もしくは１００、またはそれより多い、連続するアミノ酸（全ての中間の長さを含む）含むポリペプチドフラグメントを提供する。
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるポリペプチド組成物の改変体を提供する。本発明により一般的に包含されるポリペプチド改変体は、代表的に、その長さに沿って、本明細書中に示されるポリペプチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の同一性（以下に記載されるように決定される）を示す。
１つの好ましい実施形態において、本発明により提供されるポリペプチドフラグメントおよび改変体は、本明細書中に詳細に示される全長ポリペプチドと反応する抗体および／またはＴ細胞と免疫学的に反応する。
別の好ましい実施形態において、本発明により提供されるポリペプチドフラグメントおよび改変体は、本明細書中に詳細に示される全長ポリペプチド配列により示される免疫原性活性の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも約９０％またはそれより高いレベルの免疫原的活性を示す。
ポリペプチド「改変体」とは、その用語が本明細書中に使用される場合、代表的に、１つ以上の置換、欠失、付加、および／または挿入が、本明細書中に詳細に開示されるポリペプチドと異なるポリペプチドである。そのような改変体は天然に存在し得るか、または例えば、上記の本発明のポリペプチド配列の１つ以上を改変し、そして本明細書中に記載されるようにそれらの免疫原性活性を評価し、そして／もしくは当該分野における多くの周知技術のいずれかを用いることにより合成的に作製され得る。
例えば、本発明のポリペプチドの特定の例示的な改変体は、１つ以上の部分（例えば、Ｎ末端リーダー配列または膜貫通ドメイン）が除去されたポリペプチド改変体を含む。他の例示的な改変体は、成熟タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端から小さな部分（例えば、１〜３０アミノ酸、好ましくは５〜１５アミノ酸）が除去された改変体を含む。
多くの例において、改変体は、保存的置換を含む。「保存的置換」とは、あるアミノ酸が、類似の特性を有する別のアミノ酸と置換されている置換であり、その結果、ペプチド化学の当業者は、そのポリペプチドの二次構造および疎水性親水性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ）性質が、実質的に変化されないことを予測する。上記のように、改変は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造中に作製され得、そしてなお所望の特徴（例えば、免疫原性の特徴）を有する改変体ポリペプチドまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能性分子を得る。ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させて、本発明のポリペプチドの等価またはさらには改善された免疫原性改変体または免疫原性部分を作製することが所望される場合、当業者は、代表的に、表１に従って、ＤＮＡ配列をコードする１つ以上のコドンを変化させる。
例えば、特定のアミノ酸は、例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子の結合部位のような構造との相互作用的な結合能力の測定可能な損失を伴うことなく、タンパク質構造中の他のアミノ酸と置換され得る。タンパク質の生物学的な機能的活性を規定するのは、そのタンパク質の相互作用の能力および性質であるので、特定のアミノ酸配列置換が、タンパク質配列中および、当然、その根底にあるＤＮＡコード配列に作製され得るが、それにもかかわらず同様の特性を有するタンパク質を得ることが可能である。従って、これらの生物学的な有用性または活性の測定可能な損失を伴うことなく、開示される組成物のペプチド配列、またはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列に種々の変化がなされ得ることが企図される。
Figure 0004180919
 そのような変化を作製するために、アミノ酸の疎水性親水性インデックスが、考慮され得る。タンパク質への相互作用的な生物学的機能の付与における、疎水性親水性アミノ酸インデックスの重要性は、一般的に、当該分野において理解されている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２（本明細書中に参考として援用される））。アミノ酸の相対的な疎水性親水性の特徴が、生じるタンパク質の二次構造に寄与し、次いで、この特徴が、タンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）の相互作用を規定することが認められている。各々のアミノ酸は、その疎水性および電荷の特徴に基づき疎水性親水性インデックスを与えられている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）。これらの値は以下：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
特定のアミノ酸が、類似する疎水性親水性インデックスまたはスコアを有する他のアミノ酸により置換され得、そしてなお類似する生物学的活性を有すタンパク質を生じ得ること（すなわち、なお生物学的な機能が等価なタンパク質を得ること）は、当該分野において公知である。そのような変化の作製において、それらの疎水性親水性インデックスが±２以内であるアミノ酸の置換が、好ましく、±１以内である置換が特に好ましく、そして±０．５以内である置換がさらにより特に好ましい。類似のアミノ酸の置換が、親水性に基づき効果的に作製され得ることもまた、当該分野において理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号（その全体が、本明細書中に参考として詳細に援用される）は、隣接するアミノ酸の親水性により決定されるような、タンパク質の最も高い局所的な平均親水性が、このタンパク質の生物学的特性に関連することを示す。
米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、以下の親水性値が、アミノ酸残基に与えられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸が類似の親水性値を有する別のアミノ酸の代わりに置換され得、そしてなお生物学的に等価であり、そして特に免疫学的に等価なタンパク質を生じ得ることは理解される。そのような変化において、それらの親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が、好ましく、±１以内である置換が特に好ましく、そして±０．５以内である置換がさらにより特に好ましい。
従って、上で概説されるように、アミノ酸置換は、一般的に、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性（例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、大きさなど）に基づく。種々の前述の特徴を考慮した例示的な置換は、当業者に周知であり、そして以下を含む：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびトレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン。
さらに、任意のポリヌクレオチドは、インビボでの安定性を増加させるためにさらに改変され得る。可能な改変はとしては、５’末端および／または３’末端での隣接する配列の付加；骨格におけるホスホジエステラーゼ結合以外のホスホロチオエートもしくは２’Ｏ−メチルの使用；および／または従来のものでない塩基（例えば、イノシン、キューオシン、およびワイブトシンならびにアデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンのアセチル形態、メチル形態、チオ形態、および他の改変形態）の含有が挙げられるが、これらに限定されない。
アミノ酸置換は、その残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性特性における類似性に基づいて、さらに作製され得る。例えば、ネガティブに荷電されたアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ；ポジティブに荷電されたアミノ酸としては、リジンおよびアルギニンが挙げられ；そして類似の親水性値を有する荷電されていない極性ヘッド基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、およびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。保存的変化を表し得るアミノ酸の他の群としては、以下：（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓが挙げられる。改変体はまた、またはあるいは、非保存的変化を含み得る。好ましい実施形態において、改変体ポリペプチドは、５以下のアミノ酸の置換、欠失または付加によって、ネイティブの配列とは異なる。改変体はまた（またはあるいは）、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造および疎水性親水性性質に最小限の影響しか有さないアミノ酸の欠失または付加によって、改変され得る。
上記のように、ポリペプチドは、タンパク質のＮ末端にシグナル（または、リーダー）配列を含み得、これは、翻訳と同時に、または翻訳後に、そのタンパク質の転移を指向する。このポリペプチドはまた、このポリペプチドの合成、精製または同定を容易にするために（例えば、ポリＨｉｓ）、またはこのポリペプチドの固体支持体への結合を増強するために、リンカー配列または他の配列に結合体化され得る。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃ領域に結合体化され得る。
ポリペプチド配列を比較する場合、２つの配列は、以下に記載のように最大の対応でアラインするときに２つの配列中のアミノ酸の配列が同じである場合、「同一」であるといわれる。２つの配列間の比較は、代表的には、比較ウインドウにわたって配列を比較して、配列類似性の局所的領域を同定および比較することによって行われる。本明細書中で使用される「比較ウインドウ」とは、少なくとも約２０の連続する位置、通常は３０〜約７５、４０〜約５０の連続する位置のセグメントをいう。ここで、配列は、２つの配列が最適にアラインされた後、連続する位置の同じ番号の参照配列に対して比較され得る。
比較のための配列の最適なアラインメントは、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ ｓｕｉｔｅ ｏｆ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを用い、デフォルトパラメーターを使用して行われ得る。このプログラムは、以下の参考文献に記載されるいくつかのアラインメントスキームを含む：
Figure 0004180919
 あるいは、比較のための配列の最適なアラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｄ.ＡＰＬ．Ｍａｔｈ ２：４８２の局所同一性アルゴリズムによってか、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の同一性アラインメントアルゴリズムによってか、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性についての検索方法によってか、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実行によってか（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）または検査によって実施され得る。
配列同一性％、および配列類似性の決定に適するアルゴリズムの１つの好ましい例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズム（これらは、各々、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０に記載される）である。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０は、例えば、本明細書中に記載されるパラメーターを用いて使用され得、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドについての配列同一性％を決定し得る。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公的に入手可能である。アミノ酸配列に関して、スコアリングマトリクスは、蓄積スコアを算出するために用いられ得る。各々の方向のワードヒット（ｗｏｒｄ ｈｉｔ）の拡張は、以下の場合に、停止される：この蓄積アラインメントスコアが、その最大達成値より量Ｘだけ落ちる場合；１つ以上のネガティブにスコアリングする残基のアラインメントの蓄積に起因して、この蓄積スコアが、０以下になる場合；または各々の配列の末端に達する場合。このＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、このアラインメントの感度および速度を決定する。
１つの好ましいアプローチにおいて、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０の位置の比較ウインドウにわたり、２つの最適にアラインされた配列を比較することによって決定される。ここで、比較ウインドウ中のポリペプチド配列の一部は、２つの配列の最適なアラインメントについて参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、２０％以下、通常は５〜１５％、または１０〜１２％の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。このパーセンテージは、同一のアミノ酸残基が両方の配列で生じて、マッチした位置の数を得る位置の数を決定し、参照配列中の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）でそのマッチした位置の数を割り、そして結果に１００をかけて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
他の例示的な実施形態において、ポリペプチドは、本明細書中に記載の複数のポリペプチドを含むか、または本明細書に記載の少なくとも１つのポリペプチドおよび関連しない配列（例えば、公知の腫瘍タンパク質）を含む融合ポリペプチドであり得る。例えば、融合パートナーは、Ｔヘルパーエピトープ（免疫学的融合パートナー）、好ましくはヒトによって認識されるＴヘルパーエピトープを提供する際に補助し得るか、またはネイティブの組換えタンパク質より高い収量でタンパク質を発現する際に補助し得る（発現エンハンサー）。特定の好ましい融合パートナーは、免疫学的融合パートナーおよび発現増強融合パートナーの両方である。他の融合パートナーは、ポリペプチドの溶解性を増加するようにか、またはポリペプチドが所望の細胞内コンパートメントに標的化されることを可能にするように選択され得る。なおさらなる融合パートナーには、親和性タグ（これは、ポリペプチドの精製を容易にする）が挙げられる。
融合ポリペプチドは、一般に、標準的な技術（化学的結合体化を含む）を使用して調製され得る。好ましくは、融合ポリペプチドは、発現系において、組換えポリペプチドとして発現され、非融合ポリペプチドと比較して、増加したレベルの産生を可能にする。手短に言うと、このポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列は、別々にアセンブルされ得、そして適切な発現ベクターに連結され得る。１つのポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の３’末端は、ペプチドリンカーを用いてまたは用いずに、第２のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の５’末端に、これらの配列のリーディングフレームが同じ相にあるように連結される。このことが、両方の成分ポリペプチドの生物学的活性を保持する単一の融合ポリペプチドへの翻訳を可能にする。
ペプチドリンカー配列は、各ポリペプチドがその二次構造および三次構造へと折り畳まれるのを保証するために十分な距離で第一および第二のポリペプチド構成要素を隔てるために用いられ得る。このようなペプチドリンカー配列は、当該分野で周知の標準的な技術を用いて融合ポリペプチド中に組み込まれる。適切なペプチドリンカー配列は、以下の因子に基づいて選択され得る：（１）フレキシブルな伸長したコンホメーションを採る能力；（２）第一および第二のポリペプチド上の機能的なエピトープと相互作用し得る二次構造を採ることができないこと；および（３）ポリペプチドの機能的なエピトープと反応し得る疎水性または荷電した残基の無いこと。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒ残基を含む。ＴｈｒおよびＡｌａのような中性に近い他のアミノ酸もまた、リンカー配列に用いられ得る。リンカーとして有用に用いられ得るアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ ４０：３９−４６、１９８５；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８２５８−８２６２、１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されるアミノ酸配列を含む。リンカー配列は、一般的に１から約５０アミノ酸長であり得る。リンカー配列は、第一および第二のポリペプチドが、機能的ドメインを分離するため、および立体的な干渉を防ぐために用いられ得る非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有する場合、必要とされない。
連結されたＤＮＡ配列は、適切な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結される。ＤＮＡの発現を担う調節エレメントは、第一のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’側にのみ位置する。同様に、翻訳および転写終結シグナルを終了するために必要とされる終止コドンは、第二のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３’側にのみ存在する。
融合タンパク質は、本発明に記載されるポリペプチドを関係のない免疫原性タンパク質（例えば、リコール（ｒｅｃａｌｌ）応答を惹起し得る免疫原性タンパク質）をともに含み得る。このようなタンパク質の例としては、破傷風タンパク質、結核タンパク質および肝炎タンパク質が挙げられる（例えば、Ｓｔｏｕｔｅら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３６：８６−９１（１９９７）を参照のこと）。
１つの好ましい実施形態において、この免疫学的融合パートナーは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．に由来する（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来Ｒａ１２フラグメント）。Ｒａ１２組成物および異種ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列の発現および／または免疫原性の増強におけるこれらの使用のための方法は、米国特許出願第６０／１５８，５８５号（この開示は、その全体が、本明細書中に参考として援用される）に記載される。簡単には、Ｒａ１２は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＭＴＢ３２Ａ核酸の部分配列であるポリヌクレオチド領域を指す。ＭＴＢ３２Ａは、有毒性および無毒性のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株における遺伝子によりコードされる３２ＫＤの分子量のセリンプロテアーゼである。ＭＴＢ３２Ａのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、記載されている（例えば、米国特許出願第６０／１５８，５８５号；Ｓｋｅｉｋｙら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ．（１９９９）６７：３９９８〜４００７（本明細書中に参考として援用される）も参照のこと）。ＭＴＢ３２Ａコード配列のＣ末端フラグメントは、高いレベルで発現しそして精製プロセスを通して可溶性ポリペプチドのままである。さらに、Ｒａ１２は、それが融合される異種免疫原性ポリペプチドの免疫原性を増強させ得る。１つの好ましいＲａ１２融合ポリペプチドは、ＭＴＢ３２Ａのアミノ酸残基１９２〜３２３に対応する１４ＫＤのＣ末端フラグメントを含む。
他の好ましいＲａ１２ポリヌクレオチドは、一般的に、Ｒａ１２ポリペプチドの１部をコードする、少なくとも約１５の連続的ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、または少なくとも約３００ヌクレオチドを含む。
Ｒａ１２ポリヌクレオチドは、ネイティブの配列（すなわち、Ｒａ１２ポリペプチドをコードする内因性の配列またはその一部）を含み得るか、または、そのような配列の改変体を含み得る。Ｒａ１２ポリヌクレオチド改変体は、コードされる融合ポリペプチドの生物学的活性が、ネイティブなＲａ１２ポリペプチドを含む融合ポリペプチドと比較して、実質的に減少しないような１つ以上の置換、付加、欠失、および／または挿入を含み得る。改変体は、ネイティブなＲａ１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびその一部に対して、好ましくは少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性を示す。
他の好ましい実施形態において、免疫学的融合パートナーは、グラム陰性の細菌Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂの表面タンパク質である、プロテインＤ（ＷＯ ９１／１８９２６）に由来する。好ましくは、プロテインＤ誘導体は、ほぼ３分の１の最初のタンパク質（例えば、最初のＮ末端１００〜１１０アミノ酸）を含み、そしてプロテインＤ誘導体は、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）され得る。特定の好ましい実施形態において、リポタンパク質Ｄ融合パートナーの最初の１０９残基は、さらなる外因性Ｔ細胞エピトープを有するポリペプチドを提供するように、そしてＥ．ｃｏｌｉ中の発現レベルを増加する（従って、発現エンハンサーとして機能する）ように、Ｎ末端に含まれる。脂質テールは、抗原提示細胞への抗原の最適な提示を保証する。他の融合パートナーは、インフルエンザウイルス由来の非構造タンパク質、ＮＳ１（血球凝集素）を含む。代表的に、Ｎ末端の８１アミノ酸が用いられるが、Ｔヘルパーエピトープを含む異なるフラグメントが用いられてもよい。
別の実施形態において、免疫学的融合パートナーは、ＬＹＴＡとして公知のタンパク質、またはその部分（好ましくはＣ末端部分）である。ＬＹＴＡは、アミダーゼＬＹＴＡ（ＬｙｔＡ遺伝子によりコードされる；Ｇｅｎｅ ４３：２６５〜２９２，１９８６）として公知のＮ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼを合成するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来である。ＬＹＴＡは、ペプチドグリカン骨格中の特定の結合を特異的に分解する自己溶解素である。ＬＹＴＡタンパク質のＣ末端ドメインは、コリンまたはいくつかのコリンアナログ（例えば、ＤＥＡＥ）に対する親和性を担う。この性質は、融合タンパク質の発現のために有用なＥ．ｃｏｌｉ Ｃ−ＬＹＴＡ発現プラスミドの開発のために利用されてきた。アミノ末端にＣ−ＬＹＴＡフラグメントを含むハイブリッドタンパク質の精製が、記載されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７９５〜７９８，１９９２を参照のこと）。好ましい実施形態において、ＬＹＴＡの反復部分は、融合ポリペプチドに組み込まれ得る。反復部分は、残基１７８で開始するＣ末端領域中に見出される。特に好ましい反復部分は、残基１８８〜３０５を組み込む。
なお別の例示的な実施形態は、融合ポリペプチド、およびそれらをコードするポリヌクレオチドを含み、ここでこの融合パートナーは、米国特許第５，６３３，２３４号に記載のようにポリペプチドをエンドソーム／リソソームコンパートメントへ指向させ得る標的化シグナルを含む。本発明の免疫原性ポリペプチドは、この標的化シグナルと融合する場合、より効率的にＭＨＣクラスＩＩ分子と結合し、これによってこのポリペプチドに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞のインビボでの増強された刺激が提供される。
本発明のポリペプチドは、周知の種々の合成技術および／または組換え技術のいずれかを使用して調製される。これらの技術の後者を以下でさらに記載する。約１５０アミノ酸未満のポリペプチド、部分および他の改変体は、一般的に、当業者に周知の技術を使用して、合成手段により作製され得る。例示的な１つの実施例において、このようなポリペプチドは、市販される固相技術のいずれか（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成方法）を使用して合成され、ここでアミノ酸は、成長しているアミノ酸鎖に連続的に付加される。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１４６、１９６３を参照のこと。ポリペプチドの自動化された合成のための機器が、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）などの供給業者から市販され、そして製造者の指示に従って操作され得る。
一般に、本発明のポリペプチド組成物（融合ポリペプチドを含む）が単離される。「単離された」ポリペプチドは、その元来の環境から取り出されたものである。例えば、天然に存在するタンパク質またはポリペプチドは、それが天然の系において共存する物質のいくつかまたは全てから分離されている場合、単離されている。好ましくは、このようなポリペプチドはまた、精製され、例えば、少なくとも約９０％純粋、より好ましくは少なくとも約９５％純粋、そして最も好ましくは少なくとも約９９％純粋である。
（ポリヌクレオチド組成物）
他の局面において、本発明は、ポリヌクレオチド組成物を提供する。用語「ＤＮＡ」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書中で実質的に交換可能に使用され、特定の種の全ゲノムＤＮＡを含まない単離されたＤＮＡ分子をいう。本明細書中で使用される場合、「単離された」は、ポリヌクレオチドが、他のコード配列から実質的に分離されており、そしてＤＮＡ分子が、無関係のコードＤＮＡの大部分（例えば、大きな染色体フラグメントまたは他の機能的遺伝子またはポリペプチドコード領域）を含まないことを意味する。当然のことながら、これは、もともと単離されたＤＮＡ分子をいい、後で人為的にセグメントを付加された遺伝子またはコード領域を除外しない。
当業者に理解されるように、本発明のポリヌクレオチド組成物は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどを発現するか、または発現し得るように適応されたゲノム配列、ゲノム外配列およびプラスミドにコードされる配列、ならびにより小さな操作された遺伝子セグメントを含み得る。このようなセグメントは、自然に単離され得るか、または人の手によって合成的に改変され得る。
当業者に認識されるように、本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖（コードもしくはアンチセンス）または二本鎖であり得、そしてＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成）またはＲＮＡ分子であり得る。ＲＮＡ分子は、ＨｎＲＮＡ分子（これはイントロンを含み、そしてＤＮＡ分子に１対１の様式で対応する）、およびｍＲＮＡ分子（これは、イントロンを含まない）を含み得る。さらなるコード配列または非コード配列は、本発明のポリヌクレオチド内に存在し得るがその必要はなく、そしてポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持体材料に連結され得るがその必要はない。
ポリヌクレオチドは、ネイティブの配列（すなわち、本発明のポリペプチド／タンパク質、またはその部分をコードする内因性配列）を含み得るか、あるいはこのような配列の改変体または誘導体、そして好ましくは免疫原性改変体または誘導体をコードする配列を含み得る。
従って、本発明の別の局面に従い、配列番号１〜３、６〜８、１０〜１３、１５〜２７、２９、３０、３２、３４〜４９、５１、５２、５４、５５、５７〜５９、６１〜６９、７１、７３、７４、７７、７８、８０〜８２、８４、８６〜９６、１０７〜１０９、１１１、１１３、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１〜１３３、１４２、１４４、１４８〜１５１、１５３、１５４、１５７、１５８、１６０、１６７、１６８、１７１、１７９、１８２、１８４〜１８６、１８８〜１９１、１９３、１９４、１９８〜２０７、２０９、２１０、２１３、２１４、２１７、２２０〜２２４、２５３〜３３７、３４５、３４７、３４９、３５８、３６２、３６４、３６５、３６８、３７０〜３７５、４２０、４２４、４２８、４３１、４３４、４４２、４４７、４５０および４６７のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列、配列番号１〜３、６〜８、１０〜１３、１５〜２７、２９、３０、３２、３４〜４９、５１、５２、５４、５５、５７〜５９、６１〜６９、７１、７３、７４、７７、７８、８０〜８２、８４、８６〜９６、１０７〜１０９、１１１、１１３、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１〜１３３、１４２、１４４、１４８〜１５１、１５３、１５４、１５７、１５８、１６０、１６７、１６８、１７１、１７９、１８２、１８４〜１８６、１８８〜１９１、１９３、１９４、１９８〜２０７、２０９、２１０、２１３、２１４、２１７、２２０〜２２４、２５３〜３３７、３４５、３４７、３４９、３５８、３６２、３６４、３６５、３６８、３７０〜３７５、４２０、４２４、４２８、４３１、４３４、４４２、４４７、４５０および４６７のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列の相補体、ならびに配列番号１〜３、６〜８、１０〜１３、１５〜２７、２９、３０、３２、３４〜４９、５１、５２、５４、５５、５７〜５９、６１〜６９、７１、７３、７４、７７、７８、８０〜８２、８４、８６〜９６、１０７〜１０９、１１１、１１３、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１〜１３３、１４２、１４４、１４８〜１５１、１５３、１５４、１５７、１５８、１６０、１６７、１６８、１７１、１７９、１８２、１８４〜１８６、１８８〜１９１、１９３、１９４、１９８〜２０７、２０９、２１０、２１３、２１４、２１７、２２０〜２２４、２５３〜３３７、３４５、３４７、３４９、３５８、３６２、３６４、３６５、３６８、３７０〜３７５、４２０、４２４、４２８、４３１、４３４、４４２、４４７、４５０および４６７のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列の縮重改変体のいくつかまたは全てを含むポリヌクレオチド組成物が提供される。特定の好ましい実施形態において、本明細書中に示されるポリヌクレオチド配列は、上記のような免疫原性ポリペプチドをコードする。
他の関連する実施形態において、本発明は、本明細書中で配列番号１〜３、６〜８、１０〜１３、１５〜２７、２９、３０、３２、３４〜４９、５１、５２、５４、５５、５７〜５９、６１〜６９、７１、７３、７４、７７、７８、８０〜８２、８４、８６〜９６、１０７〜１０９、１１１、１１３、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１〜１３３、１４２、１４４、１４８〜１５１、１５３、１５４、１５７、１５８、１６０、１６７、１６８、１７１、１７９、１８２、１８４〜１８６、１８８〜１９１、１９３、１９４、１９８〜２０７、２０９、２１０、２１３、２１４、２１７、２２０〜２２４、２５３〜３３７、３４５、３４７、３４９、３５８、３６２、３６４、３６５、３６８、３７０〜３７５、４２０、４２４、４２８、４３１、４３４、４４２、４４７、４５０および４６７に開示される配列に対して実質的な同一性を有するポリヌクレオチド改変体を提供する。例えば、これらは、本明細書中で記載の方法（例えば、以下に記載のような標準的なパラメータを使用するＢＬＡＳＴ分析）を使用して、本発明のポリヌクレオチド配列と比較して、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％より高い配列同一性を含む。当業者は、これらの値が、コドンの縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置などを考慮することによって、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するために、適切に調整され得ることを認識する。
代表的には、ポリヌクレオチド改変体は、１つ以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含み、好ましくは、その結果、改変体ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの免疫原性が、本明細書中に具体的に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドに対して実質的に減少されない。用語「改変体」はまた、異種起源の相同遺伝子を包含することが理解されるべきである。
さらなる実施形態において、本発明は、本明細書中に開示された配列の１つ以上に同一であるかまたは相補的な配列の、種々の長さの連続したストレッチを含むポリヌクレオチドフラグメントを提供する。例えば、本明細書中に開示される配列の１つ以上の、少なくとも約１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００または１０００以上連続したヌクレオチド、ならびにその間の全ての中間の長さの連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが、本発明によって提供される。この状況において、「中間の長さ」が、示された値の間の任意の長さ（例えば、１６、１７、１８、１９など；２１、２２、２３など；３０、３１、３２など；５０、５１、５２、５３など；１００、１０１、１０２、１０３など；１５０、１５１、１５２、１５３など；２００〜５００；５００〜１，０００などの間の全ての整数を含む）を意味することが容易に理解される。
本発明の別の実施形態において、本明細書において提供されるポリヌクレオチド配列もしくはそのフラグメントまたはその相補的な配列に対して、中程度〜高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチド組成物が提供される。ハイブリダイゼーション技術は、分子生物学の当該分野において周知である。例示の目的であるが、他のポリヌクレオチドと本発明のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを試験するために適切な中程度にストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中の事前洗浄；５０℃〜６０℃、５×ＳＳＣでの、一晩のハイブリダイゼーション；続いて、０．１％ＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣのそれぞれを用いた、６５℃で２０分間の２回の洗浄を含む。当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが、例えば、ハイブリダイゼーション溶液の塩含量および／またはハイブリダイゼーションが実施される温度を変更することによって、容易に操作され得ることを理解する。例えば、別の実施形態において、適切な高いストリンジェントのハイブリダイゼーション条件としては、ハイブリダイゼーションの温度が、例えば、６０〜６５℃または６５〜７０℃に増大される点を除いて、上記の条件が挙げられる。
特定の好ましい実施形態において、上記のポリヌクレオチド（例えば、ポリヌクレオチド改変体、フラグメント、およびハイブリダイズする配列）は、本明細書中に具体的に示されるポリペプチド配列と免疫学的に交差反応するポリペプチドをコードする。他の好ましい実施形態において、このようなポリヌクレオチドは、本明細書中に具体的に示されるポリペプチド配列の免疫原性活性の、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、そしてより好ましくは少なくとも約９０％の免疫原性活性レベルを有するポリペプチドをコードする。
本発明のポリヌクレオチド、またはそのフラグメントは、そのコード配列自体の長さに関わらず、他のＤＮＡ配列（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、マルチクローニング部位、他のコードセグメントなど）と組合わされ得、その結果、その全体の長さは、相当変化し得る。従って、ほとんどいずれの長さの核酸フラグメントも使用され得ることが意図され、その全長は、好ましくは意図した組換えＤＮＡプロトコルにおける調製および使用の容易さによって制限される。例えば、約１０，０００、約５０００、約３０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、約５０塩基対長など（全ての中間の長さを含む）の全長を有する例示的なポリヌクレオチドセグメントが、本発明の多くの実行において有用であることが意図される。
ポリヌクレオチド配列を比較する場合、２つの配列におけるヌクレオチドの配列が、以下に記載されるように最大一致について整列された場合に同じである場合、２つの配列が「同一」であるといわれる。２つの配列の間の比較は、代表的には、配列類似性の局部領域を同定および比較するために、比較ウインドウにわたって配列を比較することによって行われる。本明細書中で使用される場合、「比較ウインドウ」は、少なくとも約２０、通常は３０〜約７５、４０〜約５０連続した位置のセグメントをいい、ここで、２つの配列が最適に整列された後に、配列は、連続した位置の同じ番号の参照配列と比較され得る。
比較のための配列の最適な整列は、バイオインフォマティクスソフトウエアのＬａｓｅｒｇｅｎｅ ｓｕｉｔｅにおけるＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、デフォルトパラメーターを用いて行われ得る。このプログラムは、以下の参考文献に記載のいくつかの整列スキームを統合する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ 第５巻、補遺３、３４５〜３５８頁；Ｈｅｉｎ Ｊ．（１９９０）Ｕｎｉｆｉｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ ６２６〜６４５頁 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 第１８３巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ Ｗ．（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．（１９７１）Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ １１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．Ｎｅｓ，Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．（１９７３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ−ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：７２６−７３０。
あるいは、比較のための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ ２：４８２の局部同定アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の同定整列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または検査によって行われ得る。
配列同一性および配列類似性の割合を決定するために適切なアルゴリズムの１つの好ましい例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載される。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、本発明のポリヌクレオチドについての配列同一性の割合を決定するために、例えば、本明細書中に記載のパラメータを用いて使用され得る。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎを通して公に利用可能である。１つの例示的な例において、累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（一致する残基の対についての報酬スコア（ｒｅｗａｒｄ ｓｃｏｒｅ）；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を使用して算出され得る。各指示におけるワードヒットの拡大は、以下の場合に停止する：累積整列スコアが、その最大到達値から量Ｘだけ低下した場合；累積スコアが、１以上の負のスコアの残基整列の累積に起因してゼロ以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。このＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、整列の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、ワード長（Ｗ）１１、および期待値（Ｅ）１０をデフォルトとして使用し、そしてＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照のこと）アラインメントは、（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。
好ましくは、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０の位置の比較ウインドウにわたって２つの最適に整列した配列を比較することによって決定され、ここで比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列の一部は、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、２つの配列の最適な整列について２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。このパーセンテージは、両方の配列で同一の核酸塩基が生じる位置の数を決定して一致する位置の数を得、この一致する位置の数を参照配列中の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算し、そしてこの結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。
遺伝コードの縮重の結果として、本明細書中に記載されるようなポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが、当業者に理解される。これらのポリヌクレオチドのうちいくつかは、任意のネイティブな遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドンの用法における差異に起因して変化するポリヌクレオチドは、本発明によって具体的に意図される。さらに、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、１以上の変異（例えば、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換）の結果として変化する内因性遺伝子である。得られたｍＲＮＡおよびタンパク質は、変化した構造または機能を有し得るが、有さなくてもよい。対立遺伝子は、標準的な技術（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較）を用いて、同定され得る。
従って、本発明の別の実施形態において、変異誘発アプローチ（例えば、部位特異的変異誘発）は、本明細書中に記載のポリペプチドの免疫原性改変体および／または誘導体の調製のために使用される。このアプローチによって、ポリペプチド配列における特定の改変が、これらをコードする、基礎となるポリヌクレオチドの変異誘発を介してなされ得る。これらの技術は、例えば、ポリヌクレオチド中に１つ以上のヌクレオチド配列変化を導入することによって先の考慮の１つ以上を具体化する、配列改変体を調製および試験するための直接的なアプローチを提供する。
部位特異的変異誘発は、所望の変異のＤＮＡ配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列ならびに十分な数の隣接ヌクレオチドの使用を介して変異体の生成を可能にし、相対する欠失連結部の両側に安定な二重鎖を形成するために、十分なサイズおよび配列複雑性を有するプライマー配列を提供する。変異は、ポリヌクレオチド自体の特性を改善するか、変更するか、減少させるか、改変するか、さもなければ変化させるため、そして／またはコードされたポリペプチドの特性、活性、組成、安定性または一次配列を変更するために、選択されたポリヌクレオチド配列において使用され得る。
本発明の特定の実施形態において、本発明者らは、コードされたポリペプチドの１つ以上の特性（例えば、ポリペプチドワクチンの免疫原性）を変更するための、開示されたポリヌクレオチド配列の変異誘発を意図する。部位特異的変異誘発の技術は、当該分野に周知であり、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの両方の改変体を作製するために広範に使用される。例えば、部位特異的変異誘発は、しばしば、ＤＮＡ分子の特定部分を変更するために使用される。このような実施形態において、代表的に約１４ヌクレオチド長〜約２５ヌクレオチド長程度の長さを含むプライマーが使用され、配列の連結部の両側にある、約５残基〜約１０残基が変更される。
当業者によって理解されるように、部位特異的変異誘発技術は、しばしば、一本鎖形態および二本鎖形態の両方で存在するファージベクターを使用してきた。部位特異的変異誘発において有用である代表的なベクターとしては、例えば、Ｍ１３ファージのようなベクターが挙げられる。これらのファージは、容易に商業的に入手可能であり、そしてそれらの使用は、一般的に当業者に周知である。二本鎖プラスミドもまた、目的の遺伝子をプラスミドからファージに転移する工程を除去する部位特異的変異誘発において慣用的に使用される。
一般的に、本明細書に従う部位特異的変異誘発は、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列をその配列中に含む一本鎖ベクターを最初に入手する工程、または二本鎖ベクターの２本の鎖を融解して分ける工程によって実行される。所望の変異配列を保有するオリゴヌクレオチドプライマーは、一般的に、合成的に調製される。次いで、このプライマーは、一本鎖ベクターとアニーリングされ、そして変異を保有する鎖の合成を完了するために、ＤＮＡ重合酵素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩ Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）に供される。それによって、ヘテロ二重鎖が形成され、ここで一方の鎖が変異を有さない元々の鎖をコードし、そして２つ目の鎖は所望の変異を保有する。次いで、このヘテロ二重鎖ベクターは、適切な細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）を形質転換するために使用され、そして、変異した配列配置を保有する組換えベクターを含むクローンが選択される。
部位特異的変異誘発を使用する、選択されたペプチドコードＤＮＡセグメントの配列改変体の調製は、潜在的に有用な種を産生する手段を提供し、そしてこれは、限定を意味するものではない。なぜなら、ペプチドの配列改変体およびそれらをコードするＤＮＡ配列を入手し得る他の方法が存在するからである。例えば、所望のペプチド配列をコードする組換えベクターは、変異誘発剤（例えば、ヒドロキシルアミン）で処理されて、配列改変体を入手し得る。これらの方法およびプロトコルに関する具体的な詳細は、Ｍａｌｏｙら、１９９４；Ｓｅｇａｌ、１９７６；ＰｒｏｋｏｐおよびＢａｊｐａｉ、１９９１；Ｋｕｂｙ、１９９４；およびＭａｎｉａｔｉｓら、１９８２（各々がその目的のために本明細書中に参考として援用される）の教示において見出され得る。
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発手順」とは、鋳型依存的プロセスおよびベクター媒介性増殖をいい、これは、その初期の濃度と比較して、特定の核酸分子の濃度の増加を生じるか、または検出可能なシグナルの濃度の増加（例えば、増幅）を生じる。本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発手順」は、プライマー分子の鋳型依存的な伸長を含むプロセスをいうことが意図される。用語、鋳型依存的プロセスとは、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子の核酸合成をいい、ここで新規に合成された核酸の鎖の配列は、相補的塩基対形成の周知の規則によって指示される（例えば、Ｗａｔｓｏｎ、１９８７を参照のこと）。代表的には、ベクター媒介性の方法論は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターへの核酸フラグメントの導入、ベクターのクローン増幅、および増幅した核酸フラグメントの回収を包含する。これらの方法論の例は、その全体が具体的に参考として本明細書中に援用される、米国特許第４，２３７，２２４号によって提供される。
本発明のポリペプチド改変体の生成のための別のアプローチにおいて、米国特許第５，８３７，４５８号に記載のような、再帰的な配列組換えが使用され得る。このアプローチにおいて、組換えおよびスクリーニングまたは選択の反復性のサイクルが実施されて、例えば、増強された免疫原性活性を有する本発明の個々のポリヌクレオチド改変体を「展開させる」。
本発明の他の実施形態において、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列は、核酸ハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして、有利に使用され得る。このように、本明細書中に開示される１５ヌクレオチド長の連続配列と同じ配列か、またはこれに相補的な配列を有する、少なくとも約１５ヌクレオチド長の連続配列の配列領域を含むか、またはその領域からなる核酸セグメントが特定の有用性を見出すことが、意図される。例えば、約２０、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１０００（全ての中間の長さを含む）およびまさに全長配列までの、より長い連続した同一配列または相補的な配列がまた、特定の実施形態において使用される。
このような核酸プローブが目的の配列に特異的にハイブリダイズする能力は、所定のサンプル中の相補的配列の存在を検出する際にこれらが使用されることを可能にする。しかし、他の用途（例えば、変異種プライマーまたは他の遺伝的構築物の調製の際の使用のためのプライマーを調製するための配列情報の使用）がまた意図される。
１０〜１４、１５〜２０、３０、５０、または１００〜２００ヌクレオチド程度（同様に中間の長さを含む）の連続したヌクレオチドストレッチからなる配列領域を有し、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド配列と同一または相補的なポリヌクレオチド分子は、例えばサザンブロッティングまたはノーザンブロッティングにおける使用のためのハイブリダイゼーションプローブとして特に意図される。これは、遺伝子産物またはそのフラグメントの、多様な細胞型およびまた種々の細菌細胞の両方における分析を可能とする。フラグメントの全サイズ、ならびに相補的ストレッチのサイズは、究極的には、特定の核酸セグメントの意図される用途または適用に依存する。より小さなフラグメントは、一般にハイブリダイゼーション実施形態における用途を見出し、ここで連続した相補領域の長さが変化され得る（例えば、約１５ヌクレオチドと約１００ヌクレオチドとの間）が、検出を望む相補配列の長さに従って、より長い連続した相補ストレッチが使用され得る。
約１５〜２５ヌクレオチド長のハイブリダイゼーションプローブの使用は、安定で選択的な二重鎖分子の形成を可能にする。しかし、１５塩基長より長いストレッチの連続した相補配列を有する分子が、ハイブリッドの安定性および選択性を増加するために一般に好ましく、それによって、得られる特異的ハイブリッド分子の質および程度が改善される。１５〜２５の連続したヌクレオチド、または望まれる場合にはより長い遺伝子相補的ストレッチを有する核酸分子を設計するのが一般には好ましい。
ハイブリダイゼーションプローブは、本明細書中に開示される配列のいずれかの、任意の部分から選択され得る。必要とされることの全ては、本明細書中に記載の配列、あるいはプローブまたはプライマーとしての利用を望む場合は、約１５〜２５ヌクレオチド長から全長配列まで、および全長配列を含む配列の任意の連続した部分までを再検討することである。プローブおよびプライマー配列の選択は、種々の要因によって支配され得る。例えば、全配列の末端に向かってプライマーを使用することが望まれ得る。
小さなポリヌクレオチドセグメントまたはフラグメントは、通常は自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して行われるので、例えば化学的手段によってフラグメントを直接合成することによって、容易に調製され得る。また、フラグメントは、核酸複製技術（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号（本明細書中に参考として援用される）のＰＣＲＴＭ技術）の適用によって、組換え産物のために選択配列を組換えベクターに導入することによって、および一般に分子生物学の分野の当業者に公知の他の組換えＤＮＡ技術によって、得られ得る。
本発明のヌクレオチド配列は、目的の完全遺伝子または遺伝子フラグメントのいずれかの相補的ストレッチと、二重鎖分子を選択的に形成するその能力のために使用され得る。想定される適用に依存して、代表的には、標的配列に対するプローブの選択性の種々の程度に達するために、ハイブリダイゼーションの種々の条件を使用することが望ましい。高い選択性を必要とする適用について、代表的には、ハイブリッドを形成するための比較的ストリンジェントな条件（例えば、比較的低濃度の塩、および／または高温の条件（例えば、約５０℃〜約７０℃の温度で、約０．０２Ｍ〜約０．１５Ｍの塩の塩濃度によって提供されるような）を使用することが望ましい。このような選択条件は、プローブとテンプレートまたは標的鎖との間のミスマッチに、存在するとしても、ほとんど許容性がなく、そして関連する配列の単離のために特に適切である。
当然のことながら、いくつかの適用（例えば、潜在的なテンプレートにハイブリダイズする変異体プライマー鎖を使用する、変異体の調製が望ましい場合）について、低ストリンジェント（減少したストリンジェンシー）のハイブリダイゼーション条件は、ヘテロ二重鎖を形成するために代表的に必要とされる。これらの状況において、約２０℃〜約５５℃の温度範囲で約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍの塩の条件のような塩条件を使用することが望ましくあり得る。これによって、交差ハイブリダイズ種は、コントロールハイブリダイゼーションに関して、陽性ハイブリダイズシグナルとして容易に同定され得る。任意の場合において、ホルムアミド（これは、増加した温度と同じ様式で、ハイブリッド二重鎖を不安定化するように作用する）の増加した量の添加によって、条件がよりストリンジェントになり得ることが一般に理解される。従って、ハイブリダイゼーション条件は、容易に操作され得、従って、一般に、所望の結果に依存する最良の方法である。
本発明の別の実施形態に従って、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチド組成物が、提供される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、タンパク質合成の効果的かつ標識化インヒビターであることが実証され、そして治療的なアプローチを結果的に提供し、そのアプローチにより、疾患は、その疾患に起因するタンパク質の合成を阻害することによって処置され得るこ。タンパク質合成を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの効力は、十分に確立されている。例えば、ポリガラクタウロナーゼ（ｐｏｌｙｇａｌａｃｔａｕｒｏｎａｓｅ）の合成およびムスカリン２型アセチルコリンレセプターは、そのそれぞれのｍＲＮＡ配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害される（米国特許第５，７３９，１１９号および米国特許第５，７５９，８２９号）。さらに、アンチセンス阻害の例が、核タンパク質サイクリン、多剤耐性遺伝子（ＭＤＧ１）、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、ＳＴＫ−１、線条体ＧＡＢＡＡレセプターおよびヒトＥＧＦを用いて示されている（Ｊａｓｋｕｌｓｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８ Ｊｕｎ １０；２４０（４８５８）：１５４４−６；ＶａｓａｎｔｈａｋｕｍａｒおよびＡｈｍｅｄ、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｍｍｕｎ．１９８９；１（４）：２２５−３２；Ｐｅｒｉｓら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１９９８ Ｊｕｎ １５；５７（２）３１０−２０；米国特許第５，８０１，１５４号；同第５，７８９，５７３号；同第５，７１８，７０９号および同第５，６１０，２８８号）。種々の異常な細胞増殖（例えば、癌）を阻害しそして処置するために使用され得る、アンチセンス構築物もまた、記載されている（米国特許第５，７４７，４７０号；同第５，５９１，３１７号および同第５，７８３，６８３号）。
従って、特定の実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド配列に特異的に結合し得る任意の配列もしくはその相補体の全てまたは一部を含む、オリゴヌクレオチド配列を提供する。１つの実施形態において、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはその誘導体を含む。別の実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはその誘導体を含む。第３の実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート改変骨格を含む、改変ＤＮＡである。第４の実施形態において、そのオリゴヌクレオチド配列は、ペプチド核酸またはその誘導体を含む。各場合において、好ましい組成物は、本明細書中に開示されるポリヌクレオチドのうちの１つ以上の部分に相補的な、より好ましくは実質的に相補的な、そしてさらにより好ましくは完全に相補的な、配列領域を含む。所定の遺伝子配列に特異的なアンチセンス組成物の選択は、選択された標的配列の分析に基づき、そして二次構造、Ｔｍ、結合エネルギー、および相対的安定性の決定に基づく。アンチセンス組成物は、二量体、ヘアピン、または宿主細胞において標的ｍＲＮＡへの特異的結合を減少または妨げる他の二次構造をそれらが形成できない相対的能力に基づいて選択され得る。ｍＲＮＡの非常に好ましい標的領域は、ＡＵＧ翻訳開始コドンの領域またはその付近の領域、およびｍＲＮＡの５’領域と実質的に相補的な配列である。これらの二次構造分析および標的部位選択の考慮は、例えば、ＯＬＩＧＯプライマー分析ソフトウエアのｖ．４およびＢＬＡＳＴＮ ２．０．５アルゴリズムソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７，２５（１７）：３３８９−４０２）を使用して実施され得る。
短いペプチドベクター（ＭＰＧ（２７残基）と称する）を使用するアンチセンス送達法の使用もまた意図される。このＭＰＧペプチドは、ＨＩＶ ｇｐ４１の融合配列由来の疎水性ドメインと、ＳＶ４０ Ｔ抗原の核局在化配列由来の親水性ドメインとを含む（Ｍｏｒｒｉｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７ Ｊｕｌ １５；２５（１４）：２７３０−６）。このＭＰＧペプチドのいくつかの分子がアンチセンスオリゴヌクレオチドをコートし、そして比較的高効率（９０％）で１時間未満で培養哺乳動物細胞へと送達され得ることが示された。さらに、ＭＰＧとの相互作用は、ヌクレアーゼに対するそのオリゴヌクレオチドの安定性および形質膜を横切る能力の両方を強力に増加させる。
本発明の別の実施形態に従って、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド組成物は、腫瘍ポリヌクレオチドおよび腫瘍細胞における本発明のタンパク質の発現を阻害するためのリボンザイム分子の設計および調製に使用される。リボザイムは、部位特異的様式で核酸を切断するＲＮＡ−タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を保有する特異的触媒ドメインを有する（ＫｉｍおよびＣｅｃｈ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９８７ Ｄｅｃ；８４（２４）：８７８８−９２；ＦｏｒｓｔｅｒおよびＳｙｍｏｎｓ、Ｃｅｌｌ．１９８７ Ａｐｒ ２４；４９（２）２１１−２０）。例えば、多数のリボザイムが、高い程度の特異性でホスホエステル転移反応を促進し、しばしば、オリゴヌクレオチド基質中の数個のホスホエステルのうちの１つだけを切断する（Ｃｅｃｈら、Ｃｅｌｌ．１９８１ Ｄｅｃ；２７（３ Ｐｔ ２）：４８７−９６；ＭｉｃｈｅｌおよびＷｅｓｔｈｏｆ、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９０ Ｄｅｃ ５；２１６（３）：５８５−６１０；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−ＨｕｒｅｋおよびＳｈｕｂ、Ｎａｔｕｒｅ．１９９２ Ｍａｙ １４；３５７（６３７４）：１７３−６）。この特異性は、この基質が、化学反応の前にリボザイムの内部ガイド配列（「ＩＧＳ」）との特異的塩基対形成相互作用を介して結合するという要件に帰する。
天然に存在する酵素的ＲＮＡの６つの基本的変種が、現在公知である。各々が、生理学的条件下で、イントランスで、ＲＮＡホスホジエステル結合の加水分解を触媒し得る（従って、他のＲＮＡ分子を切断し得る）。一般に、酵素的核酸は、まず、標的ＲＮＡへの結合によって作用する。このような結合は、標的ＲＮＡを切断するように作用する分子の酵素的部分に近接して保持される、酵素的核酸の標的結合部分を介して生じる。従って、その酵素的核酸はまず、標的ＲＮＡを認識し、次いで相補的塩基対形成を介してその標的ＲＮＡに結合し、そして一旦正確な部位に結合すると、その標的ＲＮＡを酵素的に切断するように作用する。このような標的ＲＮＡの戦略的切断は、コードされるタンパク質を直接合成する標的ＲＮＡの能力を破壊する。酵素的核酸がそのＲＮＡ標的に結合しそして切断した後、その酵素的核酸は、別の標的を探索するためにそのＲＮＡから離れ、そして繰り返し、新しい標的に結合しそして切断し得る。
リボザイムの酵素特性は、多くの技術（例えば、アンチセンス技術（ここで、核酸分子は、翻訳を阻害するために核酸標的に簡単に結合する））に対して有利である。なぜなら、治療的処置に影響を与えるのに必要であるリボザイムの濃度は、アンチセンスオリゴヌクレオチの濃度よりも低いからである。この利点は、酵素学的に作用するリボザイムの能力を反映する。従って、単一のリボザイム分子は、標的ＲＮＡの多くの分子を切断し得る。さらに、このリボザイムは、高度に特異的なインヒビターであり、この阻害の特異性は、標的ＲＮＡに結合する塩基対形成の機構に依存するだけでなく、標的ＲＮＡの切断の機構にも依存する。切断部位付近の１個のミスマッチまたは塩基置換により、リボザイムの触媒活性が完全になくなり得る。アンチセンス分子内の同様のミスマッチでは、それらの作用は妨げられない（Ｗｏｏｌｆら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９２ Ａｕｇ １５；８９（１６）：７３０５−９）。従って、リボザイムの作用の特異性は、同じＲＮＡ部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用の特異性よりも高い。
この酵素学的核酸分子は、ハンマーヘッド（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）モチーフ、ヘアピンモチーフ、δ型肝炎ウイルスモチーフ、Ｉ群イントロンモチーフまたはＲＮａｓｅＰ ＲＮＡモチーフ（ＲＮＡ誘導配列に関連する）あるいはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡモチーフに形成され得る。ハンマーヘッドモチーフの例は、Ｒｏｓｓｉら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９２ Ｓｅｐ １１；２０（１７）：４５５９−６５に記載される。ヘアピンモチーフの例は、Ｈａｍｐｅｌら（欧州特許出願公開番号ＥＰ ０３６０２５７）、ＨａｍｐｅｌおよびＴｒｉｔｚ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８９ Ｊｕｎ １３；２８（１２）：４９２９−３３）、Ｈａｍｐｅｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９０ Ｊａｎ ２５；１８（２）：２９９−３０４および米国特許第５，６３１，３５９号に記載される。δ型肝炎ウイルスモチーフの例は、ＰｅｒｒｏｔｔａおよびＢｅｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９２ Ｄｅｃ １；３１（４７）：１１８４３−５２に記載される；ＲＮａｓｅＰモチーフの例は、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａら，Ｃｅｌｌ．１９８３ Ｄｅｃ；３５（３ Ｐｔ ２）：８４９−５７に記載される；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡリボザイムモチーフは、Ｃｏｌｌｉｎｓ（ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ，Ｃｅｌｌ．１９９０ Ｍａｙ １８；６１（４）：６８５−９６；ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９１ Ｏｃｔ １；８８（１９）：８８２６−３０；ＣｏｌｌｉｎｓおよびＯｌｉｖｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９３ Ｍａｒ ２３；３２（１１）：２７９５−９）に記載される；そしてＩ群イントロンの例は、米国特許第４，９８７，０７１号に記載される。本発明の酵素学的核酸分子において重要であることは、１以上の標的遺伝子ＲＮＡ領域に相補的である特定の基質結合部位を有すること、およびこの分子にＲＮＡ切断活性を付与する、基質結合部位内のヌクレオチド配列またはこの基質結合部位の周囲のヌクレオチド配列を有することだけである。従って、リボザイム構築物は、本明細書中に記載される特定のモチーフに限定する必要はない。
リボザイムは、国際特許出願公開番号ＷＯ ９３／２３５６９および国際特許出願公開番号ＷＯ ９４／０２５９５（各々は、本明細書中で参考として詳細に援用される）に記載されるように設計され得、そして記載されるようにインビトロおよびインビボにおいて試験するために合成され得る。このようなリボザイムはまた、送達するために最適化され得る。特定の例が提供されるが、当業者は、他の種において等価なＲＮＡ標的が、必要な場合に利用され得ることを理解する。
リボザイムの活性は、リボザイムの結合アームの長さを変更することにより、または血清リボヌクレアーゼによる分解を防ぐ改変（例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ ９２／０７０６５；国際特許出願公開番号ＷＯ ９３／１５１８７；国際特許出願公開番号ＷＯ ９１／０３１６２；欧州特許出願公開番号９２１１０２９８．４；米国特許第５，３３４，７１１号、および国際特許出願公開番号ＷＯ ９４／１３６８８（これには、酵素学的ＲＮＡ分子の糖部分に対して成され得る、種々の化学的修飾が記載される）を参照のこと）、細胞中でのリボザイムの有効性を増強する改変、ならびにＲＮＡの合成時間を短縮および化学的必要性を低下させるための幹（ｓｔｅｍ）ＩＩ塩基を除去して、リボザイムを化学的に合成することによって最適化され得る。
Ｓｕｌｌｉｖａｎら（国際特許出願公開番号ＷＯ ９４／０２５９５）は、酵素学的ＲＮＡ分子の送達のための一般的な方法を記載する。リボザイムは、当業者に公知の種々の方法によって細胞に投与され得、これらには、リポソームへのカプセル化、イオン泳動法、あるいは、他のビヒクル（例えば、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセルおよび生体接着性ミクロスフィア）への取り込みによるもの、が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの徴候のために、リボザイムは、エキソビボで細胞または組織に、上記のビヒクルを使用してか、または使用せずに直接送達され得る。あるいは、ＲＮＡ／ビヒクルの組合せは、直接的な吸入、直接的な注射、またはカテーテル、注入ポンプまたはステントの使用により、局所的に送達され得る。他の送達経路としては、血管内注射、筋内注射、皮下注射または関節注射、エアロゾル吸入、経口送達（錠形態または丸薬形態）、局所送達、全身送達、眼送達、腹腔内送達および／またはくも膜下腔内送達が挙げられるが、これらに限定されない。リボザイム送達および投与のより詳細な記載は、国際特許出願公開番号ＷＯ ９４／０２５９５および国際特許出願公開番号ＷＯ ９３／２３５６９（各々は、本明細書中で参考として詳細に援用される）に提供される。
高濃度のリボザイムを細胞内に蓄積する別の手段は、リボザイムコード配列をＤＮＡ発現ベクターに組み込むことである。リボザイム配列の転写は、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ Ｉ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ ＩＩ）、またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）のためのプロモーターにより駆動される。ｐｏｌ ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターからの転写物は、全ての細胞内で高レベルで発現される；所定の細胞型における所定のｐｏｌ ＩＩプロモーターのレベルは、近くに存在する遺伝子調節配列（エンハンサー、サイレンサーなど）の性質に依存する。原核生物のＲＮＡポリメラーゼプロモーターもまた使用され得るが、但し、原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素は、適切な細胞において発現される。このようなプロモーターから発現するリボザイムは、哺乳動物細胞において機能することが示された。このような転写ユニットは、哺乳動物細胞内への導入のための種々のベクター（プラスミドＤＮＡベクター、ウイルスＤＮＡベクター（例えば、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ベクター）、またはウイルスＲＮＡベクター（例えば、レトロウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター）が挙げられるがこれらに限定されない）に組み込まれ得る。
本発明の別の実施形態において、ペプチド核酸（ＰＮＡ）組成物が提供される。ＰＮＡは、ＤＮＡ模倣物であり、核酸塩基は、偽ペプチド骨格に結合される（ＧｏｏｄおよびＮｉｅｌｓｅｎ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．１９９７ ７（４）４３１〜３７）。ＰＮＡは、ＲＮＡまたはＤＮＡを伝統的に使用した多くの方法において利用され得る。しばしば、ＰＮＡ配列は、対応するＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列よりも技術的により良く実施され、そしてＲＮＡにもＤＮＡにも固有でない有用性を有する。産生方法、特徴、および使用方法を含むＰＮＡの総説は、Ｃｏｒｅｙ（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９７ ６月；１５（６）：２２４〜９）によって提供される。このように、特定の実施形態において、ＡＣＥ ｍＲＮＡ配列の１以上の部分に相補的であるＰＮＡ配列を調製し得、そしてこのようなＰＮＡ組成物は、ＡＣＥ−特異的ｍＲＮＡの翻訳を調節、変更、減少、または低下させるために使用され得、これにより、このようなＰＮＡ組成物が投与された宿主細胞におけるＡＣＥ活性のレベルを変更する。
ＰＮＡは、ＤＮＡの正常なホスホジエステル骨格を置換する２−アミノエチル−グリシン連結を有する（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１ １２月 ６；２５４（５０３７）：１４９７〜５００；Ｈａｎｖｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９２ １１月 ２７；２５８（５０８７）：１４８１〜５；ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．１９９６ １月；４（１）：５〜２３）。この化学は、３つの重要な結果を有する。第１に、ＤＮＡまたはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドと比較して、ＰＮＡは、中性の分子であり；第２に、ＰＮＡは、アキラル（立体選択的な合成を開発する必要を避ける）であり；そして第３に、ＰＮＡ合成は、標準的なＢｏｃプロトコルまたはＦｍｏｃプロトコルを、固相ペプチド合成に使用する。一方、改良型Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法を含む他の方法が使用されている。
ＰＮＡモノマーまたは既製のオリゴマーは、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）から市販されている。ＢｏｃプロトコルまたはＦｍｏｃプロトコルのいずれかによるＰＮＡの合成は、手動プロトコルまたは自動プロトコルを使用して簡単に実施される（Ｎｏｒｔｏｎら、Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．１９９５ ４月；３（４）：４３７〜４５）。このマニュアルプロトコルは、それ自体で、化学的に修飾されたＰＮＡの産生または密接に関係するＰＮＡのファミリーの同時合成を導く。
ペプチドの合成に関して、特定のＰＮＡ合成の成功は、選択した配列の特性に依存する。例えば、理論上、ＰＮＡは、ヌクレオチド塩基の任意の組合せを取り込み得るが、隣接するプリンの存在は、産物中に１以上の残基の欠失を導き得る。この困難性の見込みにおいて、隣接するプリンを有するＰＮＡを産生する際に、非効率的に加えられているようである残基の連結を繰り返すべきであることを提案する。この後、ペプチド合成の間に観測されるのと類似する産物の収率および純度を提供する逆相高圧液体クロマトグラフィーによってＰＮＡを精製するべきである。
所与の適用のためのＰＮＡの修飾が、固相合成の間にアミノ酸を連結することによって、または露出されたＮ末端アミンにカルボン酸基を含む化合物を付加することによって達成され得る。あるいは、ＰＮＡは、導入されたリジンまたはシステインに連結することによって合成した後に修飾され得る。ＰＮＡが修飾され得る簡便さにより、より良い溶解度または特定の機能的必要条件の最適化を容易にする。一旦合成されると、ＰＮＡおよびそれらの誘導体の同定は、質量分析法によって確認され得る。いくつかの研究が、ＰＮＡの修飾物を作製および利用した（例えば、Ｎｏｒｔｏｎら、Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．１９９５ ４月；３（４）：４３７〜４５；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｊ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ．１９９５ ５〜６月；１（３）１７５〜８３；Ｏｒｕｍら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．１９９５ ９月；１９（３）：４７２〜８０；Ｆｏｏｔｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９６ ８月 ２０；３５（３３）：１０６７３〜９；Ｇｒｉｆｆｉｔｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９９５ ８月 １１；２３（１５）：３００３〜８；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９５ ６月 ６；９２（１２）：５５９２〜６；Ｂｏｆｆａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９５ ３月 １４；９２（６）：１９０１〜５；Ｇａｍｂａｃｏｒｔｉ−Ｐａｓｓｅｒｉｎｉら、Ｂｌｏｏｄ、１９９６ ８月 １５；８８（４）：１４１１〜７；Ａｒｍｉｔａｇｅら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１９９７ １１月 １１；９４（２３）：１２３２０〜５；Ｓｅｅｇｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９７ ９月；２３（３）：５１２〜７）。米国特許第５，７００，９２２号は、ＰＮＡ−ＤＮＡ−ＰＮＡキメラ分子および診断におけるその分子の使用、生物におけるタンパク質の調節、ならびに治療に対して影響を受け易い状態の処置について議論する。
ＰＮＡのアンチセンス結合特性を特徴づけする方法は、Ｒｏｓｅ（Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ、１９９３ １２月 １５；６５（２４）：３５４５〜９）およびＪｅｎｓｅｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９７ ４月 ２２；３６（１６）：５０７２〜７）において議論される。Ｒｏｓｅは、キャピラリーゲル電気泳動を使用して、相対的な結合速度論および化学量論を測定することで、ＰＮＡのそれらの相補的オリゴヌクレオチドに対する結合を決定する。同様のタイプの測定が、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ 技術を使用してＪｅｎｓｅｎらによって成された。
記載され、そして当業者に明らかであるＰＮＡの他の適用には、ＤＮＡ鎖の侵入、アンチセンス阻害、変異分析、転写のエンハンサー、核酸の精製、転写活性遺伝子の単離、転写因子結合の阻害、ゲノムの切断、バイオセンサー、インサイチュハイブリダイゼーションなどにおける使用が挙げられる。
（ポリヌクレオチドの同定、特徴づけおよび発現）
本発明のポリヌクレオチド組成物は、種々の十分に確立された技術のいずれかを使用して、同定、調製および／または操作され得る（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９、および他の類似の参考文献を参照のこと）。例えば、ポリヌクレオチドは、腫瘍に関連する発現（すなわち、本明細書中で提供される代表的なアッセイを使用して決定する場合、正常な組織における発現よりも、腫瘍における少なくとも２倍高い発現）についてｃＤＮＡのマイクロアレイをスクリーニングすることによって、下でさらに詳細に記載されるように。同定され得る。このようなスクリーニングは、例えば、製造者の指示に従って、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）のマイクロアレイ技術を使用して、（そして本質的にＳｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１０６１４〜１０６１９，１９９６およびＨｅｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：２１５０〜２１５５，１９９７に記載されるように）、行われ得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるタンパク質を発現する細胞（例えば、腫瘍細胞）から調製されるｃＤＮＡから増幅され得る。
多数の鋳型依存性プロセスが、サンプル中に存在する目的の標的配列を増幅するために利用可能である。最もよく知られた増幅方法の１つは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲＴＭ）であり、これは、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号に詳細に記載され、これらの各々はその全体が本明細書中に参考として援用される。手短に言えば、ＰＣＲＴＭにおいては、標的配列の向かい合った相補鎖上の領域に対して相補的な２つのプライマー配列が調製される。過剰のデオキシヌクレオシド三リン酸を、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）とともに反応混合液に添加する。標的配列がサンプル中に存在する場合、プライマーはその標的に結合し、そしてポリメラーゼは、ヌクレオチドを付加することによって標的配列に沿ってプライマーを伸長させる。反応混合液の温度を上昇および下降させることによって、伸長したプライマーは、標的から解離して反応生成物を形成し、過剰のプライマーは標的および反応生成物に結合し、そしてこのプロセスが反復される。好ましくは、逆転写およびＰＣＲＴＭ増幅手順が、増幅されたｍＲＮＡの量を定量するために実行され得る。ポリメラーゼ連鎖反応方法論は、当該分野で周知である。
多くの他の鋳型依存性プロセスのいずれか（この多くは、ＰＣＲＴＭ増幅技術のバリエーションである）は、当該分野で容易に知られており、利用可能である。例示として、いくつかのこのような方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲともいわれる）（欧州特許出願公開番号３２０，３０８号、米国特許第４，８８３，７５０号において記載される）；Ｑβレプリカーゼ（ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０に記載される）；鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）および修復鎖反応（Ｒｅｐａｉｒ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＲＣＲ）が挙げられる。なお他の増幅法は、英国特許出願番号２ ２０２ ３２８号およびＰＣＴ国際特許出願公開番号ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５において記載される。他の核酸増幅手順には、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）（ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ ８８／１０３１５）が挙げられ、これには、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）および３ＳＲが含まれる。欧州特許出願公開番号３２９，８２２は、一本鎖ＲＮＡ（「ｓｓＲＮＡ」）、ｓｓＤＮＡ、および二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）をサイクル的に合成する工程を包含する核酸増殖プロセスを記載する。ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ ８９／０６７００は、プロモーター／プライマー配列の標的一本鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）へのハイブリダイゼーションに基づく核酸配列増幅スキーム、引き続くこの配列の多くのＲＮＡコピーの転写を記載する。「ＲＡＣＥ」（Ｆｒｏｈｍａｎ、１９９０）および「片側（ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ）ＰＣＲ」（Ｏｈａｒａ、１９８９）のような他の増幅方法はまた、当業者に周知である。
本発明のポリヌクレオチドの増幅した部分を使用して、適切なライブラリー（例えば、腫瘍ｃＤＮＡライブラリー）から周知の技術を使用して全長遺伝子を単離し得る。このような技術において、増幅に適した１以上のポリヌクレオチドプローブまたはプライマーを使用して、ライブラリー（ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリー）をスクリーニングする。好ましくは、ライブラリーはより大きな分子を含むようにサイズが選択される。無作為に準備されたライブラリー（ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｄ ｌｉｂｒａｒｙ）もまた、遺伝子の５’領域および上流領域の同定ために好ましくあり得る。ゲノムライブラリーは、イントロンを入手することおよび５’配列を伸長させることについて好ましい。
ハイブリダイゼーション技術に関して、部分配列は、周知の技術を使用して標識（例えば、ニックトランスレーションまたは３２Ｐでの末端標識）され得る。次いで、細菌ライブラリーまたはバクテリオファージライブラリーは、一般に、標識プローブと、変性した細菌コロニー（またはファージプラークを含む菌叢）を含むフィルターとをハイブリダイズすることによってスクリーニングされる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）。ハイブリダイズするコロニーまたはプラークを選択し、そして増殖させる。そしてそのＤＮＡをさらなる分析のために単離する。ｃＤＮＡクローンを、付加配列の量を決定するために、例えば、部分配列由来のプライマーおよびそのベクター由来のプライマーを使用するＰＣＲによって分析し得る。制限地図および部分配列を作製して、１以上の重複クローンを同定し得る。次いで、標準的な技術（これは、一連の欠失クローンを作製することを包含し得る）を使用して完全配列を決定し得る。次いで、得られた重複配列を１つの連続配列中に構築し得る。周知の技術を使用して、適切なフラグメントに連結することにより全長ｃＤＮＡ分子を生成し得る。
あるいは、上記のような増幅技術は、部分的なｃＤＮＡ配列から全長コード配列を得るために有用であり得る。このような増幅技術の１つは、インバースＰＣＲである（Ｔｒｉｇｌｉａら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：８１８６，１９８８を参照のこと）。この技術は、制限酵素を使用して、その遺伝子の既知の領域内のフラグメントを生成する。次いで、このフラグメントを分子内連結により環状化し、そして既知の領域に由来する多岐したプライマーを用いたＰＣＲのための鋳型として使用する。代替のアプローチにおいて、部分配列に隣接した配列を、リンカー配列に対するプライマーおよび既知の領域に特異的なプライマーを使用する増幅により取り出し得る。この増幅した配列を、代表的に、同じリンカープライマーおよび既知の領域に特異的な第２のプライマーを使用する２回目の増幅に供する。既知の配列から反対方向に伸長を開始する２つのプライマーを使用するこの手順についての改変は、ＷＯ ９６／３８５９１に記載される。そのような別の技術は、「迅速なｃＤＮＡ末端の増幅」またはＲＡＣＥとして公知である。この技術は、公知配列の５’および３’である配列を同定するために、内側プライマーおよび外側プライマー（これらは、ポリＡ領域またはベクター配列にハイブリダイズする）の使用を含む。さらなる技術としては、キャプチャーＰＣＲ（Ｌａｎｇｅｒｓｔｒｏｍら，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ．１：１１１−１９，１９９１）およびウォーキングＰＣＲ（Ｐａｒｋｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９：３０５５−６０，１９９１）が挙げられる。増幅を利用する他の方法もまた使用して、全長ｃＤＮＡ配列を入手し得る。
特定の場合において、発現配列タグ（ＥＳＴ）データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋより入手可能のもの）に提供される配列の分析により、全長ｃＤＮＡ配列を入手することが可能である。重複ＥＳＴの検索は、一般に、周知のプログラム（例えば、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ検索）を使用して行われ得、そしてこのようなＥＳＴを使用して連続した全長配列を生成し得る。全長ＤＮＡ配列はまた、ゲノムフラグメントの分析により入手され得る。
本発明の他の実施形態において、本発明のポリペプチドまたはその融合タンパク質もしくは機能的等価物をコードするポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントは、適切な宿主細胞におけるポリペプチドの発現に方向付けるように組換えＤＮＡ分子において使用され得る。遺伝コードの固有の縮重に起因して、実質的に同じか、または機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が産生され得、そしてこれらの配列を使用して所定のポリペプチドをクローン化し、そして発現させ得る。
当業者によって理解されるように、いくつかの場合において、天然に存在しないコドンを所有するポリペプチドコードヌクレオチド配列を作製することが有利であり得る。例えば、特定の原核生物宿主または真核生物宿主に好まれるコドンは、タンパク質発現の速度を増加させるためか、または所望の特性（例えば、天然に存在する配列から生成される転写物の半減期よりも長い半減期）を有する組換えＲＮＡ転写物を産生するように選択され得る。
さらに、本発明のポリヌクレオチド配列は、種々の理由（遺伝子産物のクローニング、プロセシング、および／または発現を変更する改変が挙げられるが、それらに限定されない）のためにポリペプチドコード配列を変更するために、当該分野において一般的に公知の方法を使用して操作され得る。例えば、無作為切断によるＤＮＡシャッフリングならびに遺伝子フラグメントおよび合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再アセンブリを使用して、ヌクレオチド配列を操作し得る。さらに、部位指向性変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を使用して、新たな制限部位を挿入し得るか、グリコシル化パターンを改変し得るか、コドン優先（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を変化させ得るか、スプライス改変体を作製し得るか、または変異を導入したりなどし得る。
本発明の別の実施形態において、天然の核酸配列、改変された核酸配列、または組換え核酸配列は、異種配列に連結されて融合タンパク質をコードし得る。例えば、ポリペプチド活性のインヒビターについてペプチドライブラリーをスクリーニングするために、市販の抗体により認識され得るキメラタンパク質をコードすることが有用であり得る。融合タンパク質はまた、ポリペプチドコード配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含むように操作され得、その結果そのポリペプチドは、切断されて、そして異種部分から切り出されて精製され得る。
所望のポリペプチドをコードする配列が、当該分野において周知の化学的方法を使用して、全体または部分的に合成され得る（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．ら、（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２１５〜２２３、Ｈｏｒｎ，Ｔ．ら、（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２２５〜２３２を参照のこと）。あるいは、タンパク質自体は、ポリペプチドまたはその一部のアミノ酸配列を合成するための化学的方法を使用して産生され得る。例えば、ペプチド合成は、種々の固相技術を使用して実施され得（Ｒｏｂｅｒｇｅ，Ｊ．Ｙ．ら、（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２〜２０４）、そして自動化合成は、例えば、ＡＢＩ ４３１Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して達成され得る。
新たに合成されたペプチドは、分取用高速液体クロマトグラフィー（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．（１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）または当該分野において利用可能な他の同等技術により実質的に精製され得る。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列決定（例えば、エドマン分解手順）により確認され得る。さらに、ポリペプチドまたはその任意の部分のアミノ酸配列は、直接合成の間改変されて、そして／または化学的方法を使用して、他のタンパク質もしくはその任意の部分に由来する配列と組み合わせられて、改変体ポリペプチドを産生し得る。
所望のポリペプチドを発現させるために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または機能的等価物は、適切な発現ベクター（すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含むベクター）内に挿入され得る。当業者に周知である方法を使用して、目的のポリペプチドをコードする配列および適切な転写制御エレメントおよび翻訳制御エレメントを含む発現ベクターを構築し得る。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。そのような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．，およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．Ｎ．Ｙ．に記載される。
種々の発現ベクター／宿主系が、ポリヌクレオチド配列を含み、そして発現させるように利用され得る。これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：微生物（例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌）；酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉもしくはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；あるいは動物細胞系。
発現ベクター内に存在する「制御エレメント」または「調節配列」は、転写および翻訳を実行するように宿主細胞タンパク質と相互作用する、それらのベクターの非翻訳領域（エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域）である。そのようなエレメントは、その強さおよび特異性を変更し得る。利用されるベクター系および宿主に依存して、多数の適切な転写エレメントおよび翻訳エレメント（構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む）が使用され得る。例えば、細菌系においてクローニングする場合、誘導性プロモーター（例えば、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）などのハイブリッドｌａｃＺプロモーターが使用され得る。哺乳動物細胞系において、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターが、一般的に好ましい。ポリペプチドをコードする配列の複数のコピーを含む細胞株を生成することが必要とされる場合、ＳＶ４０またはＥＢＶベースのベクターが、適切な選択マーカーと共に有利に使用され得る。
細菌系において、多数の発現ベクターのいずれかが、発現されるポリペプチドに対して意図される使用に依存して選択され得る。例えば、大量に必要とされる場合（例えば、抗体の誘導のために）、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を指向するベクターが使用され得る。そのようなベクターとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：多機能性Ｅ．ｃｏｌｉクローニングベクターおよび発現ベクター（例えば、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ここでは目的のポリペプチドをコードする配列が、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔおよびそれに引続く７残基についての配列とインフレームでベクター内に連結され得、その結果、ハイブリッドタンパク質が産生される）；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ，Ｇ．およびＳ．Ｍ．Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３−５５０９）など。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）もまた、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために使用され得る。一般的に、そのような融合タンパク質は、可溶性であり、そしてグルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、次に遊離のグルタチオンの存在下において溶出させることによって、溶解した細胞から容易に精製され得る。そのような系において作製されたタンパク質は、ヘパリン、トロンビン、または第ＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され得、その結果、クローニングされた目的のポリペプチドが、随意にＧＳＴ部分から放出され得る。
酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター（例えば、α因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨ）を含む多数のベクターが使用され得る。概説については、Ａｕｓｕｂｅｌら、（前出）およびＧｒａｎｔら、（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４を参照のこと。
植物発現ベクターを使用する場合において、ポリペプチドをコードする配列の発現は、多数のプロモーターのいずれかにより駆動され得る。例えば、ウイルスプロモーター（例えば、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターおよび１９Ｓプロモーター）は、単独でか、またはＴＭＶに由来するωリーダー配列と組み合わせて使用され得る（Ｔａｋａｍａｔｓｕ，Ｎ．（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：３０７−３１１）。あるいは、植物プロモーター（例えば、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットまたは熱ショックプロモーター）を使用し得る（Ｃｏｒｕｚｚｉ，Ｇ．ら、（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：１６７１−１６８０；Ｂｒｏｇｌｉｅ，Ｒ．ら、（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８−８４３；およびＷｉｎｔｅｒ，Ｊら、（１９９１）Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．１７：８５−１０５）。これらの構築物は、直接的ＤＮＡ形質転換または病原体媒介性トランスフェクションによって植物細胞内に導入され得る。そのような技術は、多数の一般的に入手可能な概説に記載されている（例えば、Ｈｏｂｂｓ，Ｓ．またはＭｕｒｒｙ，Ｌ．Ｅ．，ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；１９１−１９６頁を参照のこと）。
昆虫系はまた、目的のポリペプチドを発現させるために使用され得る。例えば、そのような１つの系において、オートグラファカリフォルニア核発汗病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＮＰＶ）は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｌａｒｖａｅにおいて外来遺伝子を発現させるベクターとして使用される。ポリペプチドをコードする配列は、ウイルスの非必須領域内（例えば、ポリへドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）遺伝子）にクローニングされ得て、ポリへドリンプロモーターの制御下に置かれ得る。ポリペプチドコード配列の首尾良い挿入は、ポリへドリン遺伝子を不活性化し、そしてコートタンパク質を欠損している組換えウイルスを産生する。次いで、この組換えウイルスを使用して、例えば、目的のポリペプチドが発現され得る、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｌａｒｖａｅに感染させ得る（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ｅ．Ｋ．ら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：３２２４−３２２７）。
哺乳動物宿主細胞において、多数のウイルスベースの発現系が一般的に利用可能である。例えば、アデノウイルスが、発現ベクターとして使用される場合において、目的のポリペプチドをコードする配列は、後期プロモーターおよび３部からなるリーダー配列から構成されるアデノウイルス転写／翻訳複合体内に連結され得る。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域における挿入を使用して、感染した宿主細胞においてポリペプチドを発現し得る、生存可能ウイルスを入手し得る（Ｌｏｇａｎ，Ｊ．およびＳｈｅｎｋ，Ｔ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：３６５５−３６５９）。さらに、転写エンハンサー（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー）を使用して、哺乳動物宿主細胞における発現を増加させ得る。
特定の開始シグナルはまた、目的のポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために使用され得る。そのようなシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。ポリペプチドをコードする配列、その開始コドンおよび上流配列が適切な発現ベクター内に挿入される場合において、さらなる転写制御シグナルまたは翻訳制御シグナルは必要とされなくとも良い。しかし、コード配列のみ、またはその一部のみが挿入される場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが提供されるべきである。さらに、開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために正確なリーディングフレーム内にあるべきである。外因性翻訳エレメントおよび開始コドンは、種々の起源（天然および合成の両方）に由来し得る。発現の効率は、使用される特定の細胞系に適切なエンハンサー（例えば、文献（Ｓｃｈａｒｆ，Ｄ．ら、（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５−１６２）に記載されるエンハンサー）の封入によって増大され得る。
さらに、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の様式において発現されたタンパク質をプロセシングするその能力について選択され得る。ポリペプチドのそのような改変としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、リピデーション（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）およびアシル化が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングはまた、正確な挿入、折り畳みおよび／または機能を促進させるために使用され得る。異なる宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３およびＷＩ３８）（これらは、そのような翻訳後活性についての特定の細胞機構（ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）および特徴的機構（ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ）を有する）は、正確な改変および外来タンパク質のプロセシングを確実にするように選択され得る。
長期間の組換えタンパク質の高収率の産生のために、安定な発現が一般的に好ましい。例えば、目的のポリヌクレオチドを安定に発現する細胞株が、ウイルス複製起点および／または内因性発現エレメントならびに同じかもしくは別個のベクター上の選択マーカー遺伝子を含み得る、発現ベクターを使用して形質転換され得る。そのベクターの導入後、細胞は、それらが選択培地に切換えられる前に、富化（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）培地において１〜２日間増殖され得る。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を与えることであり、そしてその存在は、導入された配列を首尾良く発現する細胞の増殖および回収を可能とする。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適切な組織培養技術を使用して、増殖され得る。
多数の選択系を使用して、形質転換細胞株を回収し得る。これらの選択系としては、それぞれ、ｔｋ−細胞またはａｐｒｔ−細胞において使用され得る、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ら、（１９７７）Ｃｅｌｌ １１：２２３−３２）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，Ｉ．ら、（１９９０）Ｃｅｌｌ ２２：８１７−２３）遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。また、代謝拮抗剤耐性、抗生物質耐性または除草剤耐性は、選択のための基礎として使用され得る；例えば、ｄｈｆｒ（これは、メトトレキセートに対する耐性を与える（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ら、（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７：３５６７−７０））；ｎｐｔ（これは、アミノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を与える（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，Ｆ．ら、（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１−１４））；ならびにａｌｓまたはｐａｔ（これらは、それぞれ、クロルスルフロンおよびホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を与える（Ｍｕｒｒｙ、前出））。さらなる選択遺伝子が記載されている。例えば、ｔｒｐＢ（これは、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にする）またはｈｉｓＤ（これは、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にする）（Ｈａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｃ．およびＲ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８０４７−５１）。可視マーカーの使用の人気が高くなっており、アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質のＧＵＳ、ならびにルシフェラーゼおよびその基質のルシフェリンのようなマーカーが、形質転換体を同定するためのみならず、特定のベクター系に起因し得る一過性のタンパク質発現または安定なタンパク質発現の量を定量するためにもまた広範に使用されている（Ｒｈｏｄｅｓ，Ｃ．Ａ．ら、（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：１２１−１３１）。
マーカー遺伝子発現の存在／非存在は、目的の遺伝子もまた存在するということを示唆しているが、その存在および発現は、確認されることを必要とし得る。例えば、ポリペプチドをコードする配列が、マーカー遺伝子配列内に挿入される場合、配列を含む組換え細胞は、マーカー遺伝子機能の非存在により同定され得る。あるいは、マーカー遺伝子は、１つのプロモーターの制御下でポリペプチドコード配列と直列に配置され得る。誘導または選択に応じてのマーカー遺伝子の発現は、通常、その直列遺伝子の発現も同様に示す。
あるいは、所望のポリヌクレオチド配列を含み、かつ発現する宿主細胞は、当業者に公知の種々の手順によって同定され得る。これらの手順としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：核酸またはタンパク質の検出および／または定量のための、例えば、膜ベースの技術、溶液ベースの技術、またはチップベースの技術を含む、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションもしくはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションおよびタンパク質バイオアッセイ技術またはイムノアッセイ技術。
ポリヌクレオチドにコードされた産物に特異的なポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体のいずれかを使用して、ポリヌクレオチドコード化産物の発現を検出および測定するための種々のプロトコルは、当該分野において公知である。例としては、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。所定のポリペプチド上の２つの非干渉性エピトープに対して反応性であるモノクローナル抗体を利用する２つの部位の、モノクローナルベースのイムノアッセイが、いくつかの適用のために好まれ得るが、競合的結合アッセイもまた、利用され得る。これらのアッセイおよび他のアッセイは、とりわけＨａｍｐｔｏｎ，Ｒ．ら、（１９９０；Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ Ｐａｕｌ．Ｍｉｎｎ．）およびＭａｄｄｏｘ，Ｄ．Ｅ．ら、（１９８３；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１−１２１６）に記載される。
広範な種々の標識技術および結合技術は、当業者に公知であり、そして種々の核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにおいて使用され得る。ポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識されたハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを作製するための手段としては、オリゴ標識（ｏｌｉｇｏｌａｂｅｌｉｎｇ）、ニックトランスレーション、末端標識または標識されたヌクレオチドを使用するＰＣＲ増幅が挙げられる。あるいは、ｍＲＮＡプローブの産生のために、配列またはその任意の部分が、ベクター内にクローニングされ得る。そのようなベクターは、当該分野において公知であり、市販されており、そして適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６）および標識されたヌクレオチドを添加することにより、ＲＮＡプローブをインビトロで合成するために使用され得る。これらの手順は、種々の市販キットを使用して実施され得る。使用され得る適切なレポーター分子または標識としては、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または色素形成剤ならびに基質、コファクター（補因子）、インヒビター、磁気粒子などが挙げられる。
目的のポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、発現および細胞培養からタンパク質を回収するのに適した条件下で培養され得る。組換え細胞により産生されたタンパク質は、使用された配列および／またはベクターに依存して、細胞内に分泌または含まれ得る。当業者によって理解されるように、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜または真核細胞膜を介して、コードされたポリペプチドの分泌を指向するシグナル配列を含むように設計され得る。他の組換え構築物を使用して、目的のポリペプチドをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合させ得る。そのような精製促進ドメインとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：固定された金属上での精製を可能にする金属キレート化ペプチド（例えば、ヒスチジン−トリプトファンモジュール）、固定された免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）において利用されるドメイン。精製ドメインとコードされるポリペプチドとの間に切断可能なリンカー配列（例えば、第ＸＡ因子またはエンテロキナーゼに対して特異的な配列（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．））を含めることを使用して、精製を促進させ得る。そのような発現ベクターの１つは、目的のポリペプチドおよびチオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位の前に６つのヒスチジン残基をコードする核酸を含む融合タンパク質の発現を提供する。ヒスチジン残基は、Ｐｏｒａｔｈ，Ｊ．ら、（１９９２、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．３：２６３−２８１）に記載されるように、ＩＭＩＡＣ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）上での精製を促進する一方で、エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質から所望のポリペプチドを精製するための手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターの考察は、Ｋｒｏｌｌ，Ｄ．Ｊ．ら、（１９９３；ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｏｉｌ，１２：４４１−４５３）に提供される。
組換え産生方法に加えて、本発明のポリペプチドおよびそのフラグメントは、固相技術（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｊ．（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４）を使用する、直接的ペプチド合成によって産生され得る。タンパク質合成は、手動技術を使用してか、または自動化によって実施され得る。自動化合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、達成され得る。あるいは、種々のフラグメントは、別々に化学的に合成されて、そして全長分子を産生するために化学的方法を使用して合わせられ得る。
（抗体組成物、そのフラグメントおよび他の結合因子）
別の局面に従って、本発明はさらに、本明細書中に開示される腫瘍ポリペプチド、またはその一部、改変体もしくは誘導体への免疫学的結合を示す、結合因子（例えば、抗体およびその抗原結合フラグメント）を提供する。抗体またはその抗原結合フラグメントは、それが本発明のポリペプチドと検出可能なレベルで（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて）反応し、そして類似の条件下で無関係のポリペプチドと検出可能に反応しない場合、本発明のポリペプチドに「特異的に結合する」、「免疫学的に結合する」および／または「免疫学的に反応性である」と言われる。
この文脈で使用される場合、免疫学的結合は、一般に、免疫グロブリン分子と、この免疫グロブリンが特異的な抗原との間で起こるタイプの非共有結合的な相互作用をいう。免疫学的結合相互作用の強度または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）の観点から表現され得、ここで、より小さいＫｄは、より大きな親和性を示す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該分野で周知の方法を使用して、定量され得る。１つのこのような方法は、抗原結合部位／抗原複合体の形成および解離の速度を測定する工程を必要とし、ここで、これらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方向の速度に等しく影響を与える幾何学的パラメータに依存する。従って、「会合速度定数（ｏｎ ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ）」（Ｋｏｎ）および「解離速度定数（ｏｆｆ ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ）」（Ｋｏｆｆ）の両方が、濃度ならびに会合および解離の実際の速度を計算することによって決定され得る。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比は、親和性に関係しない全てのパラメータの排除を可能にし、そして従って、解離定数Ｋｄに等しい。一般的には、Ｄａｖｉｅｓら（１９９０） Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９−４７３を参照のこと。
抗体の「抗原結合部位」または「結合部分」は、抗原結合に関係する免疫グロブリン分子の一部分をいう。この抗原結合部位は、重鎖（「Ｈ」）および軽鎖（「Ｌ」）のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に分岐したストレッチが、「超可変領域」といわれ、これは、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として公知のより保存された隣接ストレッチの間に挿入される。従って、用語「ＦＲ」は、免疫グロブリンの超可変領域の間であり、かつそれに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列をいう。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域が、３次元空間において互いに相対的に配置されて、抗原結合表面を形成する。この抗原結合表面は、結合した抗原の３次元表面に相補的であり、そして重鎖および軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」といわれる。
結合因子は、本明細書中に提供される代表的なアッセイを使用して、癌（例えば、肺癌）を有する患者と有さない患者との間をさらに区別し得る。例えば、腫瘍タンパク質に結合する抗体または他の結合因子は、好ましくは、この疾患を有する患者の少なくとも約２０％、より好ましくは患者の少なくとも約３０％において、癌の存在を示すシグナルを生成する。あるいは、または加えて、この抗体は、癌を有さない個体の少なくとも約９０％において、この疾患の非存在を示す陰性シグナルを生成する。結合因子が、この要求を満たすか否かを決定するために、癌（標準的な臨床試験によって決定されるような）を有する患者および有さない患者からの生物学的サンプル（例えば、血液、血清、痰、尿および／または腫瘍生検）が、この結合因子に結合するポリペプチドの存在について、本明細書に記載されるようにアッセイされ得る。好ましくは、疾患を有するサンプルおよび有さないサンプルの統計的に有意な数が、アッセイされる。各結合因子は、上記の基準を満足すべきである；しかし、当業者は、結合因子が、組合せて使用されて、感度を改善し得ることを認識する。
上記の要求を満足する任意の薬剤が、結合因子であり得る。例えば、結合因子は、ペプチド成分を含むか含まないリボソーム、ＲＮＡ分子またはポリペプチドであり得る。好ましい実施形態において、結合因子は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。抗体は、当業者に公知の種々の技術のいずれかによって、調製され得る。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。一般に、抗体は、細胞培養技術（本明細書に記載されるようなモノクローナル抗体の生成を含む）によって、または組換え抗体の生成を可能にするために、適切な細菌細胞宿主または哺乳動物細胞宿主への抗体遺伝子のトランスフェクションを介して、生成され得る。１つの技術において、このポリペプチドを含む免疫原が、最初に、広範な種々の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジまたはヤギ）のいずれかに注射される。この工程において、本発明のポリペプチドは、改変を有さない免疫原として機能し得る。あるいは、特に、比較的短いポリペプチドについて、優れた免疫応答が、このポリペプチドがキャリアタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニン）に結合される場合に、惹起され得る。この免疫原は、好ましくは、１回以上のブースト免疫を組み込む所定のスケジュールに従って、動物宿主に注射され、そしてこれらの動物が、定期的に採血される。このポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体は、次いで、例えば、適切な固体支持体に結合されたポリペプチドを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって、このような抗血清から精製され得る。
目的の抗原性ポリペプチドに特定なモノクローナル抗体が、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９，１９７６の技術およびその改良型を使用して、調製され得る。簡潔には、これらの方法は、所望の特異性（すなわち、目的のポリペプチドとの反応性）を有する抗体を生成し得る不死細胞株の調製を含む。このような細胞株は、例えば、上記のように免疫された動物から得られる脾臓細胞から生成され得る。次いで、この脾臓細胞が、例えば、骨髄腫細胞融合パートナー（好ましくは、免疫された動物と同系であるもの）との融合によって不死化される。種々の融合技術が使用され得る。例えば、脾臓細胞および骨髄腫細胞は、数分間、非イオン性界面活性剤とあわされ、次いで、ハイブリッド細胞の増殖は支持するが、骨髄腫細胞の増殖は支持しない選択培地に低密度でプレートされ得る。好ましい選択技術は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を使用する。十分な時間の後、通常、約１〜２週間の後、ハイブリッドのコロニーが観察される。単一コロニーを選択し、そしてそれらの培養上清を、このポリペプチドに対する結合活性について試験する。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが好ましい。
モノクローナル抗体は、増殖ハイブリドーマコロニーの上清から単離され得る。さらに、種々の技術が、収量を増加させるために使用され得、この技術は、例えば、適切な脊椎動物宿主（例えば、マウス）の腹腔へのハイブリドーマ細胞株の注入である。次いで、モノクローナル抗体が、腹水または血液から回収され得る。夾雑物が、従来の技術（例えば、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈澱、および抽出）によって抗体から除去され得る。本発明のポリペプチドは、例えば、アフィニティートクロマトグラフィー工程における精製プロセスにおいて使用され得る。
抗体分子の免疫学的結合特性を示し得る抗原結合部位を含む多くの治療的に有効な分子が、当該分野で公知である。このタンパク質分解性酵素パパインは、優先的に、ＩｇＧ分子を切断して、いくつかのフラグメントを生じさせ、これら（「Ｆ（ａｂ）」フラグメント）のうちの２つの各々は、インタクトな抗原結合部位を含む共有結合ヘテロダイマーを含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、いくつかのフラグメント（両方の抗原結合部位を含む「Ｆ（ａｂ’）２」フラグメントを含む）を提供し得る。「Ｆｖ」フラグメントは、ＩｇＭ、および稀有な場合にはＩｇＧまたはＩｇＡ免疫グロブリン分子の優先的なタンパク質分解的切断によって生成され得る。しかし、Ｆｖフラグメントは、当該分野で公知の組換え技術を使用して、より一般的に誘導される。Ｆｖフラグメントは、非共有結合的なＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーを含み、このへテロダイマーは、ネイティブな抗体分子の抗原認識能力および抗原結合能力のほとんどを保持する抗原結合部位を含む。Ｉｎｂａｒら（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２６５９−２６６２；Ｈｏｃｈｍａｎら（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍ １５：２７０６−２７１０；およびＥｈｒｌｉｃｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ １９：４０９１−４０９６。
単鎖Ｆｖ（「ｓＦｖ」）ポリペプチドは、共有結合されたＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーであり、このヘテロダイマーは、ペプチドをコードするリンカーによって連結されたＶＨをコードする遺伝子およびＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合物から発現される。Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（１６）：５８７９−５８８３。抗体Ｖ領域からの天然に凝集する（しかし、化学的には分離された）軽鎖ポリペプチドおよび重鎖ポリペプチドを、ｓＦｖ分子に転換するための化学構造を識別するための多くの方法が記述され、このｓＦｖは、抗原結合部位の構造に実質的に類似する３次元構造に折り畳まれる。例えば、米国特許第５，０９１，５１３号および同第５，１３２，４０５号（Ｈｕｓｔｏｎら）；ならびに米国特許第４，９４６，７７８号（Ｌａｄｎｅｒら）を参照のこと。
上記分子の各々は、重鎖および軽鎖ＣＤＲセットを含み、各々は、ＣＤＲＳへの支持を提供し、そして互い対してＣＤＲの空間的関係を規定する重鎖および軽鎖ＦＲセットの間に挿入される。本明細書中で使用される場合、用語「ＣＤＲセット」は、重鎖または軽鎖Ｖ領域の３つの超可変領域をいう。重鎖または軽鎖のＮ末端から進んで、これらの領域は、各々、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」および「ＣＤＲ３」と表記される。従って、抗原結合部位は、６つのＣＤＲを含み、この６つのＣＤＲは、重鎖および軽鎖Ｖ領域の各々からのＣＤＲセットを含む。単一ＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）を含むポリペプチドは、本明細書中で「分子認識ユニット」といわれる。多くの抗原−抗体複合体の結晶学的分析により、ＣＤＲのアミノ酸残基は、結合した抗原との広範な接触を形成することが立証され、ここで、最も広範な抗原接触は、重鎖ＣＤＲ３とである。従って、分子認識ユニットは、主に、抗原結合部位の特異性の原因である。
本明細書中で使用される場合、用語「ＦＲセット」は、重鎖または軽鎖のＶ領域のＣＤＲセットのＣＤＲを構成する、４つの隣接アミノ酸配列をいう。いくつかのＦＲ残基は、結合抗原と接触し得る；しかし、ＦＲは、主に、Ｖ領域を抗原結合部位、特にＣＤＲＳに直接隣接するＦＲ残基に折り畳む原因となる。ＦＲにおいて、特定のアミノ酸残基および特定の構造特徴が、非常に高度に保存される。この点において、全てのＶ領域配列は、約９０アミノ酸残基の内部ジスルフィドループを含む。Ｖ領域が、結合部位に折り畳まれる場合、このＣＤＲは、抗原結合表面を形成する突出したループモチーフとして表示される。正確なＣＤＲアミノ酸配列に関わらず、特定の「正準」構造に折り畳まれるＣＤＲループの形状に影響を与えるＦＲの保存された構造領域が存在することが一般的に認識される。さらに、特定のＦＲ残基は、抗体重鎖および軽鎖の相互作用を安定化する非共有結合的なドメイン間接触に関与することが知られている。
非ヒト免疫ブログリン由来の抗原結合部位を含む、多くの「ヒト化」抗体分子が記載され、この抗体分子には、げっ歯類Ｖ領域およびヒト定常ドメインに融合されたそれらの会合ＣＤＲ（Ｗｉｎｔｅｒら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９；Ｌｏｂｕｇｌｉｏら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：４２２０−４２２４；Ｓｈａｗら（１９８７）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４−４５３８；およびＢｒｏｗｎら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：３５７７−３５８３）、適切なヒト抗体定常ドメインとの融合の前に、ヒト支持ＦＲに移植されたげっ歯類ＣＤＲ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６；およびＪｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５）、ならびに組換えベニアリングされた（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｙ ｖｅｎｅｅｒｅｄ）げっ歯類ＦＲによって支持されるげっ歯類ＣＤＲ（欧州特許公開番号５１９，５９６（１９９２年１２月２３日公開）を有するキメラ抗体が挙げられる。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントにおけるこれらの部分の治療的適用の持続期間および有効性を制限するげっ歯類抗ヒト抗体分子に対する所望されない免疫学的応答を最小化するように設計される。
本明細書中で使用される場合、用語「ベニアリングされたＦＲ」および「組換えベニアリングされたＦＲ」は、ネイティブのＦＲポリペプチド折り畳み構造の実質的に全てを保持する抗原結合部位を含む異種分子を提供するために、ヒトＦＲ残基で、例えば、げっ歯類重鎖または軽鎖のＶ領域に由来するＦＲ残基の選択的置換をいう。ベニアリング技術は、抗原結合部位のリガンド結合特徴が、主に、抗原結合表面内の重鎖および軽鎖のＣＤＲセットの構造および相対的な配置によって決定されるという理解に基づく。Ｄａｖｉｅｓら（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９−４７３。従って、抗原結合特異性は、ＣＤＲ構造、互いとのそれらの相互作用、およびＶ領域ドメインの残りとのそれらの相互作用が注意深く維持されるヒト化抗体のみにおいて保存され得る。ベニアリング技術を使用することによって、外部（例えば、溶媒が接触可能な）ＦＲ残基（これは、免疫系に容易に遭遇する）は、ヒト残基と選択的に置換されて、弱い免疫原性ベニアリング表面または実質的に非免疫原性のベニアリング表面のいずれかを含むハイブリッド分子を提供する。
ベニアリングのプロセスは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第４版（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅ，１９８７）において、Ｋａｂａｔらによって編集（ｃｏｍｐｉｌｅ）されたヒト抗体可変ドメインについての利用可能な配列データを使用し、Ｋａｂａｔデータベースに更新され、そして他の米国および海外のアクセス可能なデータベース（核酸およびタンパク質の両方）を使用する。Ｖ領域アミノ酸の溶媒接触可能性は、ヒトおよびマウス抗体フラグメントについての既知の３次元構造から推定され得る。マウス抗原結合部位をベニアリングする際に２つの一般的な工程が存在する。最初に、目的の抗体分子の可変ドメインのＦＲが、上記の供給源から得られたヒト可変ドメインの対応するＦＲ配列と比較される。次いで、最も相同的なヒトＶ領域が、対応するマウスアミノ酸と、残基ごとに比較される。ヒト対応物とは異なるマウスＦＲにおける残基は、当該分野において周知の組換え技術を使用して、ヒト部分に存在する残基によって置換される。残基スイッチングは、少なくとも部分的に露出した（溶媒接触可能である）部分を用いて実施されるのみであり、そしてＶ領域ドメインの三次構造に対する有意な効果を有し得るアミノ酸残基（例えば、プロリン、グリシンおよび荷電したアミノ酸）の置換において、注意がなされる。
この様式において、従って、得られた「ベニヤ化された（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）」マウス抗原結合部位は、以下を保持するように設計される：マウスＣＤＲ残基、ＣＤＲに実質的に隣接する残基、埋もれたかまたはほとんど埋もれた（溶媒接触不能）であるとして同定された残基、重鎖ドメインと軽鎖ドメインとの間の非共有結合（例えば、静電気的および疎水的）接触に関与すると考えられる残基、ならびにＣＤＲループの「カノニカル（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）」三次構造に影響すると考えられる、ＦＲの保存された構造的領域由来の残基。次いで、これらの設計基準を用いて、マウス抗原結合部位の重鎖および軽鎖の両方のＣＤＲをヒト様ＦＲ（マウス抗体分子の抗原特異性を示す組み換えヒト抗体の発現のために、哺乳動物細胞をトランスフェクトするために用いられ得る）に結合した組み換えヌクレオチド配列を調製する。
本発明の別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、１つ以上の治療薬剤に結合され得る。この点に関して適切な薬剤としては、放射性核種、分化誘導剤、薬物、毒素、およびその誘導体が挙げられる。好ましい放射性核種としては、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、および２１２Ｂｉが挙げられる。好ましい薬物としては、メトトレキセート、ならびにピリミジンアナログおよびプリンアナログが挙げられる。好ましい分化誘導剤としては、ホルボールエステルおよび酪酸が挙げられる。好ましい毒素としては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素、Ｓｈｉｇｅｌｌａ毒素、およびアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質が挙げられる。
治療剤は、直接的にかまたは間接的にか（例えば、リンカー基を介して）のいずれかで、適切なモノクローナル抗体にカップリング（例えば、共有結合によって）され得る。薬剤と抗体との間の直接的な反応は、各々が互いに反応し得る置換基を有する場合に可能である。例えば、一方の求核基（例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基）は、他方のカルボニル含有基（例えば、無水物もしくは酸ハロゲン化物）または良好な遊離基（例えば、ハロゲン化物）を含むアルキル基などと反応し得る。
あるいは、リンカー基を介して治療剤と抗体とをカップリングさせることが所望され得る。リンカー基は、抗体を薬剤から隔てるためのスペーサーとして機能して、結合の可能性を妨げることを回避し得る。リンカー基はまた、薬剤または抗体上の置換基の化学的反応性を増加させるために働き得、従ってカップリング効率を増大させる。化学的反応性の増大はまた、薬剤または薬剤上の官能基の使用を容易にし得、これは他の方法では可能ではない。
種々の二官能性または多官能性試薬、ホモ官能性とヘテロ官能性との両方（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬのカタログ中に記載されるもの）が、リンカー基として使用され得ることが当業者には明らかである。カップリングは、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、または酸化された炭水化物残基を介してもたらされ得る。このような方法論を記載する多数の参考文献（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌの米国特許第４，６７１，９５８号）が存在する。
本発明の免疫結合体の抗体部分がないときに治療剤がより強力である場合、細胞中へのインターナリゼーションの間に、またはその際に切断可能なリンカー基を使用することが望ましくあり得る。多数の異なる切断可能なリンカー基が記載されてきた。これらのリンカー基からの薬剤の細胞内放出についての機構としては、ジスルフィド結合の還元（例えば、Ｓｐｉｔｌｅｒへの米国特許第４，４８９，７１０号）、感光性（Ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ）結合の照射（例えば、Ｓｅｎｔｅｒらへの米国特許第４，６２５，０１４号）、誘導体化されたアミノ酸側鎖の加水分解（例えば、Ｋｏｈｎらへの米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体媒介性加水分解（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらへの米国特許第４，６７１，９５８号）、および酸触媒加水分解（例えば、Ｂｌａｔｔｌｅｒらへの米国特許第４，５６９，７８９号）による切断が挙げられる。
１つより多い薬剤を抗体にカップリングさせることが望ましくあり得る。１つの実施形態において、薬剤の複数の分子が１つの抗体分子にカップリングされる。別の実施形態において、１つより多い型の薬剤が１つの抗体にカップリングされ得る。特定の実施形態に関わらず、１つより多い薬剤を有する免疫結合体は、種々の方法で調製され得る。例えば、１つより多い薬剤が、抗体分子に直接的に結合され得るか、または付着のための複数の部位を提供するリンカーが使用され得る。あるいは、キャリアが使用され得る。
キャリアは、種々の方法（直接的にかまたはリンカー基を介するかのいずれかでの共有結合を含む）で薬剤を保有し得る。適切なキャリアとして、アルブミンのようなタンパク質（例えば、Ｋａｔｏらへの米国特許第４，５０７，２３４号）、ペプチド、およびアミノデキストランのような多糖類（例えば、Ｓｈｉｈらへの米国特許第４，６９９，７８４号）が挙げられる。キャリアはまた、非共有結合によってかまたは例えばリポソームベシクル内に、カプセル化することによって、薬剤を保有し得る（例えば、米国特許第４，４２９，００８号および同第４，８７３，０８８号）。放射性核種薬剤に特異的なキャリアは、放射性ハロゲン化低分子およびキレート化合物を含む。例えば、米国特許第４，７３５，７９２号は、代表的な放射性ハロゲン化低分子およびそれらの合成を開示する。放射性核種キレートは、金属、または金属酸化物、放射性核種を結合するためのドナー原子として窒素原子および硫黄原子を含むキレート化合物から形成され得る。例えば、Ｄａｖｉｓｏｎらへの米国特許第４，６７３，５６２号は、代表的なキレート化合物およびそれらの合成を開示する。
（Ｔ細胞組成物）
本発明は、別の局面において、本明細書に開示される腫瘍ポリペプチド、またはその改変体もしくは誘導体に特異的なＴ細胞を提供する。このような細胞は、一般的に標準的手順を使用して、インビトロまたはエキソビボで調製され得る。例えば、Ｔ細胞は、市販の細胞分離システム（例えば、ＩｓｏｌｅｘＴＭシステム（Ｎｅｘｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ；米国特許第５，２４０，８５６号；米国特許第５，２１５，９２６号；ＷＯ８９／０６２８０；ＷＯ９１／１６１１６およびＷＯ９２／０７２４３もまた参照のこと）から入手可能）を使用して、患者の骨髄、末梢血あるいは骨髄または末梢血の画分中から単離され得る。あるいは、Ｔ細胞は、関連または無関連のヒト、非ヒト哺乳動物、細胞株または培養物から誘導され得る。
Ｔ細胞は、ポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／またはそのようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いて刺激され得る。このような刺激は、目的のポリペプチドに特異的であるＴ細胞の生成を可能にする条件下および十分な時間、行われる。好ましくは、本発明の腫瘍ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、送達ビヒクル（例えば、ミクロスフェア）中に存在して、特異的Ｔ細胞の生成を容易にする。
Ｔ細胞は、このＴ細胞が、特異的に増殖するか、サイトカインを分泌するか、またはこのポリペプチドで被覆されるかもしくはこのポリペプチドをコードする遺伝子を発現する標的細胞を殺傷する場合に、本発明のポリペプチドに特異的であるとみなされる。Ｔ細胞特異性は、種々の標準的技術のいずれかを使用して評価され得る。例えば、クロム放出アッセイまたは増殖アッセイにおいて、ネガティブコントロールと比較した、溶解および／または増殖における２倍を超える増加の刺激指標が、Ｔ細胞特異性を示す。このようなアッセイは、例えば、Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：１０６５−１０７０，１９９４に記載されるように、実行され得る。あるいは、Ｔ細胞の増殖の検出は、種々の公知の技術によって達成され得る。例えば、Ｔ細胞増殖は、ＤＮＡ合成増加率を測定することによって検出され得る（これは、例えば、トリチウム化チミジンでＴ細胞の培養物をパルス標識し、そしてＤＮＡに取り込まれたトリチウム化チミジンの量を測定することによる）。３〜７日間の腫瘍ポリペプチド（１００ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは、２００ｎｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍｌ）との接触によって、代表的には、Ｔ細胞の増殖において少なくとも２倍の増加が生じる。２〜３時間の上記のような接触によって、標準的なサイトカインアッセイを使用して測定されるように、Ｔ細胞の活性化を生じるはずである。このアッセイにおいては、サイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＦＮ−γ）放出のレベルの２倍の増加が、Ｔ細胞の活性化を示す（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（Ｇｒｅｅｎｅ １９９８）を参照のこと）。腫瘍ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現ＡＰＣに応答して活性化されたＴ細胞は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋であり得る。腫瘍ポリペプチド特異的Ｔ細胞は、標準的な技術を使用して増殖され得る。好ましい実施形態において、Ｔ細胞は、患者、関連するドナーまたは無関連のドナーに由来し、そして刺激および増殖後にその患者に投与される。
治療目的で、腫瘍のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはＡＰＣに応答して増殖するＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、インビトロまたはインビボのいずれかで大量に増殖され得る。このようなＴ細胞のインビトロでの増殖は、種々の方法で達成され得る。例えば、Ｔ細胞は、Ｔ細胞増殖因子（例えば、インターロイキン−２）の添加を伴うか、または伴わずに、腫瘍ポリペプチド、またはこのようなポリペプチドの免疫原性部分に対応する短いペプチド、および／または腫瘍ポリペプチドを合成する刺激細胞に対して再曝露され得る。あるいは、腫瘍ポリペプチドの存在下で増殖する１つ以上のＴ細胞は、クローニングによって大量に増殖され得る。細胞をクローニングするための方法は、当該分野で周知であり、そしてこれらとしては、限界希釈が挙げられる。
（Ｔ細胞レセプター組成物）
Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）は、ジスルフィド結合によって連結されている、２つの異なる、非常に可変性のポリペプチド鎖（Ｔ細胞レセプターのα鎖およびβ鎖と呼ばれる）からなる（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｔｒａｖｅｒｓ、Ｗａｌｐｏｒｔ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．第４版、１４８〜１５９．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ／Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ．１９９９）。このα／βヘテロダイマーは、細胞膜で不変のＣＤ３鎖と複合体化する。この複合体は、ＭＨＣ分子に結合した特定の抗原性ペプチドを認識する。ＴＣＲ特異性の膨大な多様性は、体細胞遺伝子再配列により、まるで免疫グロブリンの多様性のように生成される。このβ鎖遺伝子は、５０を超える可変性領域（Ｖ）、２つの多様性領域（Ｄ）、１０を超える連結セグメント（Ｊ）、および２つの定常領域セグメント（Ｃ）を含む。α鎖遺伝子は、７０を超えるＶセグメント、および６０を超えるＪセグメントを含むが、Ｄセグメントを含まず、そして１つのＣセグメントを含む。胸腺におけるＴ細胞発達の間、β鎖のＤ〜Ｊ遺伝子再配列が生じ、続いて、Ｖ遺伝子セグメントのＤＪへの再配列が生じる。この機能的ＶＤＪβエキソンは、転写され、そしてスプライシングされてＣβに連結される。α鎖に関しては、Ｖα遺伝子セグメントは、Ｊα遺伝子セグメントに再配列して、機能的エキソンを形成し、これが次に転写され、Ｃαにスプライシングされてる。多様性は、さらにβ鎖のＶセグメントと、Ｄセグメントと、Ｊセグメントとの間、そしてα鎖のＶセグメントと、Ｊセグメントとの間のＰおよびＮ−ヌクレオチドの無作為な付加によって、組み換えプロセスの間にさらに増大する（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｗａｌｐｏｒｔ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．第４版、９８および１５０．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ／Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ．１９９９）。
本発明は、別の局面において、本明細書に開示のポリペプチド、またはその改変体もしくは誘導体に特異的なＴＣＲを提供する。本発明に従って、本明細書に記載の腫瘍ポリペプチドを認識する、Ｔ細胞レセプターのα鎖およびβ鎖について、Ｖ−ＪもしくはＶ−Ｄ−Ｊ接合領域、またはその部分について、ポリヌクレオチドおよびアミノ酸の配列が提供される。一般に、本発明のこの局面は、ＭＨＣとの関連で提示される腫瘍ポリペプチドを認識するか、またはそれに結合するＴ細胞レセプターに関する。好ましい実施形態において、Ｔ細胞レセプターによって認識される腫瘍抗原は、本発明のポリペプチドを含む。例えば、腫瘍ペプチドに特異的なＴＣＲをコードするｃＤＮＡは、標準的な分子生物学技術および組み換えＤＮＡ技術を用いて、腫瘍ポリペプチドに特異的なＴ細胞から単離され得る。
本発明はさらに、腫瘍ポリペプチドを認識するか、またはそれに結合する、本発明のＴ細胞レセプターと実質的に同じ機能または活性を有する、Ｔ細胞レセプターまたはそのアナログを包含する。このようなレセプターとしては、本明細書に提供されるＴ細胞レセプターの、レセプターフラグメント、または本明細書に提供されるＴ細胞レセプターの、置換、付加、もしくは欠失の変異体が挙げられるがこれらに限定されない。本発明はまた、本明細書に提供されるＴ細胞レセプターに実質的に相同であるか、または実質的に同じ活性を保持する、ポリペプチドまたはペプチドを包含する。用語「アナログ」とは、本明細書に提供されるＴ細胞レセプターと実質的に同一のアミノ酸残基配列（ここで、１つ以上の残基、好ましくは５残基以下、より好ましくは、２５残基以下が、機能的に類似の残基で保存的に置換されている）を有し、そして本明細書に記載のようなＴ細胞レセプターの機能的局面を示す、任意のタンパク質またはポリペプチドを含む。
本発明はさらに、適切な哺乳動物宿主細胞であって、本明細書に記載のポリペプチドに特異的なＴＣＲをコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされている（これによって、この宿主細胞はこのポリペプチドに特異的にされる）、適切な哺乳動物宿主細胞、例えば、非特異的Ｔ細胞を提供する。ＴＣＲのα鎖およびβ鎖は、別々の発現ベクターに含まれ得るか、または単一の発現ベクター（これはまた、リボソーム内侵入部位（ＩＲＥＳ）の下流の遺伝子のｃａｐ依存性翻訳のためにＩＲＥＳを含む）に含まれ得る。このポリペプチドに特異的なＴＣＲを発現するこの宿主細胞は、例えば、以下にさらに考察されるような卵巣癌の養子免疫療法のために、用いられ得る。
本発明のさらなる局面において、本明細書に挙げたポリペプチドに特異的なクローニングされたＴＣＲは、卵巣癌の診断のためのキットに用いられ得る。例えば、腫瘍特異的ＴＣＲの核酸配列またはその一部は、生物学的サンプル中で、特定のＴＣＲをコードする再配列された遺伝子の発現を検出するためのプローブまたはプライマーとして用いられ得る。従って、本発明はさらに、ポリペプチドに特異的なＴＣＲをコードするメッセンジャーＲＮＡまたはＤＮＡを検出するためのアッセイを提供する。
（薬学的組成物）
さらなる実施形態において、本発明は、細胞または動物に投与するための薬学的に受容可能なキャリアにおける、本明細書中に開示される１つ以上のポリヌクレオチド、ポリペプチド、Ｔ細胞および／または抗体組成物の処方物単独、または１つ以上の他の治療との組み合わせのいずれかに関する。
所望される場合、本明細書中に開示されるような組成物は、その上他の因子（例えば、他のタンパク質またはポリペプチド、あるいは種々の薬学的に活性な因子）と組み合わせて処方され得ることが理解される。実際に、このさらなる因子が、標的細胞または宿主組織と接触する際に重大な悪影響を引き起こさない場合、また含まれ得る他の成分に対して、実質的に制限はない。従って、この組成物は、特定の事例で必要とされる場合、種々の他の因子と一緒に送達され得る。このような組成物は、宿主細胞または他の生物学的供給源から精製され得るか、あるいは本明細書中に記載されるように化学的に合成され得る。同様に、このような組成物はさらに、置換されたＲＮＡ組成物もしくはＤＮＡ組成物または誘導体化されたＲＮＡ組成物もしくはＤＮＡ組成物を含み得る。
従って、本発明の別の局面において、生理学的に受容可能なキャリアと組み合わせて、本明細書中に記載される１つ以上のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体および／またはＴ細胞組成物を含む薬学的組成物が、提供される。特定の好ましい実施形態において、本発明の薬学的組成物は、予防的ワクチン適用および治療的ワクチン適用における使用のための本発明の免疫原性ポリヌクレオチド組成物および／または本発明のポリペプチド組成物を含む。ワクチン調製物は、一般的に、例えば、Ｍ．Ｆ．ＰｏｗｅｌｌおよびＭ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ編、「Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ（ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ）」、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ（ＮＹ、１９９５）に記載される。一般的に、このような組成物は、本発明の１つ以上のポリヌクレオチド組成物および／またはポリペプチド組成物を１つ以上の免疫興奮薬（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｎｔ）と組み合わせて含む。
本明細書中に記載される任意の薬学的組成物が、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの薬学的に受容可能な塩を含み得ることは、明らかである。このような塩は、例えば、薬学的に受容可能な非毒性塩基から調製され得、この非毒性塩基としては、有機塩基（例えば、一級アミンの塩、二級アミンの塩、もしくは三級アミンの塩および塩基性アミノ酸）ならびに無機塩基（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、およびマグネシウム塩）が挙げられる。
別の実施形態において、例示的な本発明の免疫原性組成物（例えば、ワクチン組成物）は、上記の１つ以上のポリペプチドをコードするＤＮＡを含み、その結果、そのポリペプチドはインサイチュで生成される。上記の場合、ポリヌクレオチドは、当業者に公知の種々の任意の送達系の範囲内で投与され得る。実際に、多くの遺伝子送達技術（例えば、Ｒｏｌｌａｎｄ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １５：１４３−１９８，１９９８、およびそこに引用される参考文献によって記載される技術）が当該分野において周知である。勿論、適切なポリヌクレオチド発現系は、患者における発現のために必要な調節ＤＮＡ調節配列を含む（例えば、適切なプロモーターおよび終止シグナル）。あるいは、細菌性送達系は、その細胞表面上でポリペプチドの免疫原性部分を発現するか、またはこのようなエピトープを分泌する細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｒｉｎ）の投与を含み得る。
従って、特定の実施形態において、本明細書中に記載される免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、多くの公知のウイルスベースの系のいずれかを用いる発現のために、適切な哺乳動物の宿主細胞中に組み込まれる。１つの例示的な実施形態において、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための簡便かつ効果的なプラットホーム（ｐｌａｔｆｏｒｍ）を提供する。本発明のポリペプチドをコードする、選択されたヌクレオチド配列は、ベクター内に挿入され得、そして当該分野で公知の技術を用いてレトロウイルス粒子中にパッケージングされ得る。次いで、組み換えウイルスは単離され得、そして被験体に送達され得る。多くの例示的なレトロウイルス系が、記載されている（例えば、米国特許第５，２１９，７４０号；ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｅｍａｎ（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９９０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５−１４；Ｓｃａｐａら（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８０：８４９−８５２；Ｂｕｒｎｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８０３３−８０３７；ならびにＢｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ（１９９３）Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：１０２−１０９）。
さらに、多くの例示的なアデノウイルスベースの系もまた、記載されている。宿主ゲノム内に組み込むレトロウイルスとは異なり、アデノウイルスは、染色体外に存続し、従って、挿入突然変異に関連する危険性を最小化する（Ｈａｊ−ＡｈｍａｄおよびＧｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７−２７４；Ｂｅｔｔら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９１１−５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７１７−７２９；Ｓｅｔｈら（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：９３３−９４０；Ｂａｒｒら（１９９４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５１−５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６−６２９；ならびにＲｉｃｈら（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：４６１−４７６）。
種々のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系はまた、ポリヌクレオチド送達のために開発された。ＡＡＶベクターは、当該分野で周知の技術を使用して容易に構築され得る。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号、および同第５，１３９，９４１号；国際公開番号ＷＯ９２／０１０７０およびＷＯ９３／０３７６９；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔら（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９０（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ（１９９４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１６５−１６９；ならびにＺｈｏｕら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８６７−１８７５を参照のこと。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの遺伝子導入による送達に有用な、さらなるウイルスベクターとしては、ポックスファミリーのウイルス（例えば、ワクシニアウイルスおよび鳥類のポックスウイルス）由来のものが挙げられる。例示の目的で、新規の分子を発現するワクシニアウイルス組換え体は、以下のように構築され得る。ポリペプチドをコードするＤＮＡは、最初に、ワクシニアプロモーターおよび側方の（ｆｌａｎｋｉｎｇ）ワクシニアＤＮＡ配列（例えば、チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする配列）に隣接するように、適切なベクター内に挿入される。次いで，このベクターは、ワクシニアとともに同時感染される細胞をトランスフェクトするために使用される。相同組換えは、ワクシニアプロモーターおよび目的のポリペプチドをコードする遺伝子をウイルスゲノム内に挿入するように働く。生じるＴＫ．ｓｕｐ．（−）組換え体は、５−ブロモデオキシウリジンの存在下で細胞を培養し、そしてそれに耐性のあるウイルスプラークを採集することにより選択され得る。
ワクシニアベースの感染／トランスフェクション系は、生物の宿主細胞において、誘導性の、本明細書中に記載される１つ以上のポリペプチドの、一過性の発現または同時発現を提供するために、簡便に使用され得る。この特定の系において、細胞は、最初に、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードするワクシニアウイルス組換え体を用いて、インビトロで最初に感染される。このポリメラーゼは、Ｔ７プロモーターを保持するテンプレートのみを転写する、優れた特異性を示す。感染後、目的のポリヌクレオチドを用いてトランスフェクトされて、Ｔ７プロモーターによって駆動される。細胞質中で発現される、ワクシニアウイルス組換え体由来のポリメラーゼは、トランスフェクトされたＤＮＡをＲＮＡに転写し、次いでそのＲＮＡは、宿主の翻訳機構によりポリペプチドに翻訳される。この方法は、大量のＲＮＡおよびその翻訳産物の、高レベルの、一過性の、細胞質産生を提供する。例えば、Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎおよびＭｏｓｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：６７４３−６７４７；Ｆｕｅｒｓｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：８１２２−８１２６を参照のこと。
あるいは、アビポックスウイルス（ａｖｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）（例えば、鶏痘ウイルスおよびカナリア痘ウイルス）はまた、目的のコード配列を送達するために使用され得る。哺乳動物の病原体由来の免疫原を発現する組換え体アビポックスウイルスが、非鳥類種に投与された場合、保護免疫を授与することは公知である。アビポックスベクターの使用は、ヒトおよび他の哺乳動物種において特に望ましい。なぜなら、アビポックス属のメンバーが、感受性を有する鳥類の種においてのみ増殖的に複製し得、従って、哺乳動物細胞において感染性ではないからである。組換え体アビポックスウイルスを産生するための方法は、ワクシニアウイルスの産生に関して上記されるように、当該分野において公知であり、そして遺伝的組換えを使用する。例えば、ＷＯ９１／１２８８２；ＷＯ８９／０３４２９；およびＷＯ９２／０３５４５を参照のこと。
任意の多数のアルファウイルスベクターもまた、本発明のポリヌクレオチド組成物の送達のために使用され得る。例えば、これらのベクターは、米国特許第５，８４３，７２３号；同第６，０１５，６８６号；同第６，００８，０３５号および同第６，０１５，６９４において記載される。ベネズエラウマ脳脊髄炎（ＶＥＥ）に基づく特定のベクター（米国特許第５，５０５，９４７号および同第５，６４３，５７６号において見出され得る例示的な実施例）もまた、使用され得る。
さらに、分子結合体化結合ベクター（例えば、アデノウイルスキメラベクター（Ｍｉｃｈａｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６８：６８６６−６８６９およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：６０９９−６１０３に記載される）もまた、本発明の下で、遺伝子送達のために使用され得る。
これらおよび他の公知のウィルスベースの送達系に対する、さらなる例示的な情報は、例えば、以下において見出され得る：Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：３１７−３２１，１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６９：８６−１０３，１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ ８：１７−２１，１９９０；米国特許第４，６０３，１１２号、同第４，７６９，３３０号および同第５，０１７，４８７号；ＷＯ８９／０１９７３；米国特許第４，７７７，１２７号；ＧＢ２，２００，６５１；ＥＰ０，３４５，２４２；ＷＯ９１／０２８０５；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６−６２７，１９８８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４，１９９１；Ｋｏｌｌｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：２１５−２１９，１９９４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１１４９８−１１５０２，１９９３；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８８：２８３８−２８４８，１９９３；およびＧｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３：１２０２−１２０７，１９９３。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、標的細胞のゲノム内に組み込まれ得る。この組み込みは、相同組換えを介して特定の位置および配位に存在し得る（遺伝子置換）か、またはランダムに、非特定の位置において組み込まれ得る（遺伝子増加）。なおさらなる実施形態において、ポリヌクレオチドは、別々の、ＤＮＡのエピソームセグメントとして細胞中に安定的に維持され得る。このようなポリヌクレオチドセグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞周期と独立してか、または宿主細胞周期と同調して維持または複製を可能にするに十分な配列をコードする。発現構築物が細胞に送達され、そして細胞中にポリヌクレオチドが残存する様式は、使用される発現構築物の型に依存する。
本発明の別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、「裸の」ＤＮＡとして（例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−１７４９，１９９３に記載されるように、そしてＣｏｈｅｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１６９１−１６９２，１９９３によって総説されるように）投与／送達される。裸のＤＮＡの取り込みは、細胞中に効果的に輸送される生分解性ビーズ上にそのＤＮＡをコーティングすることによって増加され得る。
なお別の実施形態において、本発明の組成物は、粒子ボンバードメント（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）アプローチを介して送達され得、この多くは記載されている。１つの例示的な例において、ガス駆動性粒子加速は、デバイス（例えば、Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＰＬＣ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）およびＰｏｗｄｅｒｊｅｃｔ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって製造されるデバイス）を用いて達成され得、このいくつかの例は、米国特許第５，８４６，７９６号；同第６，０１０，４７８号；同第５，８６５，７９６号；同第５，５８４，８０７号；ならびにＥＰ特許第０５００ ７９９に記載される。このアプローチは、針のない送達アプローチを提供し、ここで、微細粒子（例えば、ポリヌクレオチド粒子またはポリペプチド粒子）の乾燥粉末処方物は、手持ち（ｈａｎｄ ｈｅｌｄ）デバイスによって生じるヘリウムガス噴出内で高速に加速され、その粒子を目的の標的組織中に推進される。
関連の実施形態において、本発明のガス駆動性の、針の要らない、組成物の注入に有用であり得る他のデバイスおよび方法としては、Ｂｉｏｊｅｃｔ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）によって提供されるデバイスおよび方法が挙げられ、そのいくつかの例は、米国特許第４，７９０，８２４号；同第５，０６４，４１３号；同第５，３１２，３３５号；同第５，３８３，８５１号；同第５，３９９，１６３号；同第５，５２０，６３９号および同第５，９９３，４１２号に記載される。
別の実施形態に従って、本明細書中に記載される薬学的組成物は、本発明の、免疫原性のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、Ｔ細胞および／またはＡＰＣ組成物に加えて、１つ以上の免疫興奮薬を含む。免疫興奮薬とは、本質的に、外因性の抗原に対する免疫応答（抗体および／または細胞媒介性）を促進または増強させる任意の物質をいう。１つの好ましい型の免疫興奮薬は、アジュバンドを含む。多くのアジュバンドが、抗原を迅速な異化から防御するように設計された物質（例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油）および免疫応答の刺激因子（例えば、リピドＡ、Ｂｏｒｔａｄｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のタンパク質）を含む。特定のアジュバントは、例えば、フロイント不完全アジュバントおよびフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）；Ｍｅｒｃｋ Ａｄｊｕｖａｎｔ ６５（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ）；ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）；アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウム）；カルシウム、鉄、または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化した糖；カチオン性またはアニオン性に誘導体化された多糖；ポリフォスファーゼン；生分解性ミクロスフェア、モノホスホリルリピドＡおよびｑｕｉｌ Ａとして市販されている。サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦまたはインターロイキン−２、インターロイキン−７もしくはインターロイキン−１２、および他の類似増殖因子）もまた、アジュバントとして使用され得る。
本発明の特定の実施形態において、アジュバンド組成物は、好ましくは、Ｔｈ１型の免疫応答を優勢に誘導する組成物である。高レベルのＴｈ１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）は、投与された抗原に対する細胞媒介性免疫応答の誘導を好む傾向にある。対照的に、高レベルのＴｈ２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）は、体液性免疫応答の誘導を好む傾向にある。本明細書中に提供されるワクチンの適用に従って、患者は、Ｔｈ１型応答およびＴｈ２型応答を誘導する免疫応答を支持する。応答が優勢にＴｈ１型である好ましい実施形態において、Ｔｈ１型サイトカインのレベルは、Ｔｈ２型サイトカインのレベルよりもはるかに高い程度まで増加する。これらのサイトカインのレベルは、標準的アッセイを使用して容易に評価され得る。サイトカインのファミリーの総説については、ＭｏｓｍａｎｎおよびＣｏｆｆｍａｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１４５−１７３、１９８９を参照のこと。
Ｔｈ１型応答を優勢に誘発するための、特定の好ましいアジュバンドは、例えば、モノホスホリルリピドＡ、好ましくは３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡとアルミニウム塩との組み合わせを含む。ＭＰＬ（登録商標）アジュバンドは、Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ；例えば、米国特許第４，４３６，７２７号；同第４，８７７，６１１号；同第４，８６６，０３４号および同第４，９１２，０９４号を参照のこと）から入手可能である。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ここで、ＣｐＧジヌクレオチドはメチル化されていない）はまた、Ｔｈ１応答を優勢に誘導する。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、そして例えばＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９９／３３４８８ならびに米国特許第６，００８，２００号および同第５，８５６，４６２号に記載される。免疫興奮性のＤＮＡ配列はまた、例えば、Ｓａｔｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：３５２，１９９６によって記載される。別の好ましいアジュバンドは、以下を含むサポニン（例えば、Ｑｕｉｌ Ａ）、またはその誘導体を含む：ＱＳ２１およびＱＳ７（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）；エスシン（Ｅｓｃｉｎ）；ジギトニン；あるいはＧｙｐｓｏｐｈｉｌａまたはＣｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ｑｕｉｎｏａのサポニン。他の好ましい処方物としては、本発明のアジュバンドとの組み合わせ（例えば、ＱＳ２１、ＱＳ７、Ｑｕｉｌ Ａ、β−エスシン、またはジギトニンを含む群の少なくとも２つの組み合わせにおいて、１つより多いサポニンを含む。
あるいは、サポニン処方物は、以下から構成されるワクチンビヒクルと組み合わされ得る：キトサンまたは他のポリカチオン性ポリマー、ポリラクチドおよびポリラクチド−コ−グリコリド粒子、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンベースのポリマーマトリクス、ポリサッカリドまたは化学的に修飾されたポリサッカリドから構成される粒子、リポソームおよび脂質ベースの粒子、グリセロールモノエステルから構成される粒子など。サポニンはまた、粒状構造物（例えば、リポソームまたはＩＳＣＯＭ）を形成するために、コレステロールの存在下で処方され得る。さらに、サポニンは、非粒状溶液中または非粒状懸濁液中のいずれか、あるいは粒状構造物（例えば、わずかな薄膜の（ｐａｕｃｉｌａｍｅｌａｒ）リポソームまたはＩＳＣＯＭ）中で、ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステルと一緒に処方され得る。サポニンはまた、粘性を増加させるために、賦形剤（例えば、ＣａｒｂｏｐｏｌＲ）とともに処方され得るか、または粉末賦形剤（例えば、ラクトース）とともに乾燥粉末形態で処方され得る。
１つの好ましい実施形態において、アジュバンド系としては、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体との組み合わせ（例えば、ＷＯ９４／００１５３に記載されるような、ＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標）アジュバンドとの組み合わせ、またはＷＯ９６／３３７３９に記載されるような、Ｑ２１がコレステロールでクエンチされる、あまり反応発生的（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）でない組成物）が挙げられる。他の好ましい処方物は、水中油乳濁液およびトコフェロールを含む。水中油乳濁液中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標）アジュバンドおよびトコフェロールを使用する、別の特に好ましいアジュバンド処方物は、ＷＯ９５／１７２１０に記載される。
別の、促進されたアジュバンド系としては、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドとサポニン誘導体との組み合わせ（特に、ＷＯ００／０９１５９に記載される、ＣｐＧとＱＳ２１との組み合わせ）が挙げられる。好ましくは、処方物はさらに、水中油乳濁液およびトコフェロールを含む。
本発明の薬学的組成物における使用のための、さらなる例示的なアジュバンドとしては、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）、ＩＳＣＯＭＳ（ＣＳＬ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ）、アジュバンドのＳＢＡＳシリーズ（例えば、ＳＢＡＳ−２またはＳＢＡＳ−４（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ、Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから入手可能））、Ｄｅｔｏｘ（Ｅｎｈａｎｚｙｎ（登録商標））（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）、ＲＣ−５２９（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）および他のアミノアルキルグルコサミニド４−ホスフェート（ＡＧＰ）（例えば、係属中の米国特許出願番号第０８／８５３，８２６号および同第０９／０７４，７２０号（それらの開示は、その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されるもの）、ならびにポリオキシエチレンエーテルアジュバンド（例えば、ＷＯ９９／５２５４９ Ａ１に記載されるもの）が挙げられる。
他の好ましいアジュバンドとしては、以下の一般式のアジュバンド分子：
（Ｉ）ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒ
が挙げられ、
ここで、ｎは、１〜５０であり、Ａは、結合または−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｒは、Ｃ１〜５０アルキルまたはフェニルＣ１〜５０アルキルである。
本発明の１つの実施形態は、一般式（Ｉ）のポリオキシエチレンエーテルを含むワクチン処方物からなり、ここで、ｎは、１と５０との間であり、好ましくは４〜２４であり、最も好ましくは９であり；Ｒ成分は、Ｃ１〜５０であり、好ましくはＣ４〜Ｃ２０アルキルであり、そして最も好ましくはＣ１２アルキルであり、そしてＡは、結合である。ポリオキシエチレンエーテルの濃度は、０．１〜２０％で範囲であるべきであり、好ましくは０．１〜１０％、そして最も好ましくは、０．１〜１％の範囲である。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下からなる群より選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル）は、Ｍｅｒｃｋ ｉｎｄｅｘ（第１２版：エントリー ７７１７）に記載される。これらのアジュバンド分子は、ＷＯ９９／５２５４９に記載される。
上記の一般式（Ｉ）に従うポリオキシエチレンエーテルは、所望される場合、別のアジュバンドと組み合わされ得る。例えば、好ましいアジュバンドの組み合わせは、好ましくは、係属中のＵＫ特許出願ＧＢ ９８２０９５６．２に記載されるようなＣｐＧとの組み合わせである。
本発明の別の実施形態に従って、本明細書中に記載される免疫原性組成物は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、単球、およびＡＰＣを有効であるように操作され得る他の細胞）を介して、宿主に送達される。このような細胞は、抗原を提示する能力を増大するように、Ｔ細胞応答の活性化および／または維持を改善するように、それ自体で抗腫瘍効果を有するように、そして／あるいはレシーバー（すなわち、一致するＨＬＡハプロタイプ）と免疫学的に適合性であるように遺伝学的に改変され得るが、改変される必要はない。ＡＰＣは、一般に、種々の生物学的な流体および器官（腫瘍および腫瘍周辺組織を含む）のいずれかから単離され得、そして自己細胞、同種異系細胞、同系細胞、または異種細胞であり得る。
本発明の特定の好ましい実施形態は、抗原提示細胞として、樹状細胞またはその前駆細胞を使用する。樹状細胞は、高度に強力なＡＰＣであり（ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２４５−２５１、１９９８）、そして予防的または治療的な抗腫瘍免疫を誘発するための生理学的アジュバンドとして効果的であることが示されてきた（ＴｉｍｍｅｒｍａｎおよびＬｅｖｙ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５０：５０７−５２９、１９９９を参照のこと）。一般に、樹状細胞は、それらの代表的な形状（インサイチュでは星状、インビトロでは目に見える顕著な細胞質プロセス（樹枝状結晶）を有する）、高い効率で抗原を取り込み、処理し、そして提示するそれらの能力、および未処置の（ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞応答を活性化するそれらの能力に基づいて同定され得る。勿論、樹状細胞は、インビボまたはエキソビボで樹状細胞上に正常には見出されない特定の細胞表面レセプターまたはリガンドを発現するように操作され得、このように改変された樹状細胞は本発明によって意図される。樹状細胞の代替として、分泌小胞抗原負荷樹状細胞（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｏａｄｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）（エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）と呼ばれる）が、ワクチンにおいて使用され得る（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．４：５９４−６００，１９９８を参照のこと）。
樹状細胞および前駆細胞は、末梢血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周辺組織浸潤細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血、または他の任意の適切な組織もしくは流体から得られ得る。例えば、樹状細胞は、末梢血から収集された単球の培養物に、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３および／またはＴＮＦαのようなサイトカインの組み合わせを添加することによってエキソビボで分化され得る。あるいは、末梢血、臍帯血または骨髄から収集されたＣＤ３４陽性細胞は、培養培地にＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＴＮＦα、ＣＤ４０リガンド、ＬＰＳ、ｆｌｔ３リガンドならびに／または樹状細胞の分化、成熟、および増殖を誘導する他の成分の組み合わせを添加することによって、樹状細胞に分化され得る。
樹状細胞は、「未成熟」細胞および「成熟」細胞として都合良く分類され、このことは、十分に特徴付けられた２つの表現型の間を区別するための方法を可能にする。しかし、この学名は、あらゆる可能な分化の中間段階を排除するように解釈されるべきではない。未成熟な樹状細胞は、抗原の取り込みおよび処理について高い能力を有するＡＰＣとして特徴付けられ、この能力は、Ｆｃγレセプターおよびマンノースレセプターの高発現と相関する。成熟表現型は、代表的に、これらのマーカーのより低い発現、しかし、クラスＩ ＭＨＣおよびクラスＩＩ ＭＨＣ、接着分子（例えば、ＣＤ５４およびＣＤ１１）ならびに同時刺激性分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６および４−１ＢＢ）のようなＴ細胞活性化の原因である細胞表面分子の高度な発現によって特徴付けられる。
ＡＰＣは、一般に、本発明のポリヌクレオチド（またはその一部もしくは他の改変体）を用いてトランスフェクトされ得、その結果、そのコードされたポリペプチドまたはその免疫原性部分が、細胞表面上に発現される。このようなトランスフェクションは、エキソビボで生じ得、次いでこのようにトランスフェクトされた細胞を含む薬学的組成物は、本明細書中に記載されるように、治療目的のために使用され得る。あるいは、樹状細胞または他の抗原提示細胞を標的化する遺伝子送達ビヒクルが、患者に投与され得、インビボで起こるトランスフェクションを生じる。インビボおよびエキソビボでの樹状細胞のトランスフェクションは、例えば、当該分野で公知の任意の方法（例えば、ＷＯ９７／２７４４４７に記載される方法）、またはＭａｈｖｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７５：４５６−４６０、１９９７によって記載される遺伝子銃アプローチを使用して一般に実施され得る。樹状細胞の抗原負荷は、樹状細胞または前駆細胞を、腫瘍ポリペプチド、ＤＮＡ（裸のもしくはプラスミドベクター中の）またはＲＮＡとともに；あるいは抗原を発現する組換え体の細菌またはウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、アデノウイルスまたはレンチウイルスのベクター）とともにインキュベートすることによって達成され得る。負荷の前に、ポリペプチドは、Ｔ細胞補助（例えば、キャリア分子）を提供する免疫学的パートナーに共有結合的に結合体化され得る。あるいは、樹状細胞は、別々にかまたはポリペプチドの存在下で、結合体化していない免疫学的パートナーでパルスされ得る。
当業者に公知の任意の適切なキャリアが、本発明の薬学的組成物において使用され得るが、キャリアの型は、典型的に投与の様式に依存して変化する。本発明の組成物は、任意の適切な投与の様式（例えば、局所的投与、経口投与、経鼻投与、粘膜投与、静脈内投与、頭蓋内投与、腹腔内投与、皮下投与、または筋内投与を含む）のために処方され得る。
このような薬学的組成物中での使用のためのキャリアは、生体適合性であり、そしてまた生分解性であり得る。特定の実施形態において、この処方物は、好ましくは、比較的一定レベルの活性成分の放出を提供する。しかし、他の実施形態において、投与直後すぐに、より迅速な放出速度が、所望され得る。このような組成物の処方は、既知の技術を使用する当業者のレベルの十分に範囲内である。この点で有用な例示的なキャリアとしては、ポリ（ラクチド−コ−グルコリド）、ポリアクリレート、ラテックス、澱粉、セルロース、デキストランなどの微粒子が挙げられる。他の例示的な徐放性キャリアとしては、非液性（ｎｏｎ−ｌｉｑｕｉｄ）親水性コア（例えば、架橋ポリサッカリドまたはオリゴサッカリド）を含む超分子バイオベクター、ならびに、必要に応じて、両親媒性化合物を含む外部層（例えば、リン脂質）（例えば、米国特許第５，１５１，２５４号およびＰＣＴ出願ＷＯ９４／２００７８、ＷＯ／９４／２３７０１およびＷＯ９６／０６６３８を参照のこと）が挙げられる。徐放性処方物内に含まれる活性な化合物の量は、移植の部位、放出の速度および放出の予期される期間、ならびに処置または予防されるべき状態の性質に依存する。
別の例示的な実施形態において、生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリラクテートポリグリコレート）は、本発明の組成物のためのキャリアとして使用される。適切な生分解性ミクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号；同第５，０７５，１０９号；同第５，９２８，６４７号；同第５，８１１，１２８号；同第５，８２０，８８３号；同第５，８５３，７６３号；同第５，８１４，３４４号；同第５，４０７，６０９および同第５，９４２，２５２号に開示される。改変されたＢ型肝炎コアタンパク質キャリア系（例えば、ＷＯ／９９ ４０９３４およびそこに引用される参考文献に記載される）はまた、多くの適用に有用である。別の例示的なキャリア／送達系は、宿主内でのクラスＩ限定細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導し得る、粒子状（ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ）タンパク質複合体（例えば、米国特許第５，９２８，６４７号に記載されるもの）を含むキャリアを使用する。
しばしば、本発明の薬学的組成物はさらに、１つ以上の緩衝液（例えば、中性の緩衝化生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸（例えば、グリシン）、抗酸化剤、静菌剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、レシピエントの血液を用いて処方物を等張性、低張性または弱い高張性にする溶質、懸濁剤、濃厚剤（ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ ａｇｅｎｔ）および／または保存剤を含む。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥物として処方され得る。
本明細書中に記載される薬学的組成物は、単回用量容器または複数用量容器（例えば、シールされたアンプルまたはバイアル）中に存在され得る。このような容器は、代表的に、使用するまで、処方物の無菌性および安定性を保護するような方法でシールされる。一般に、処方物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクル中で、懸濁液、溶液または乳濁液として保存され得る。あるいは、薬学的組成物は、使用の直前に、滅菌液体キャリアの添加のみを必要とする、凍結乾燥状態で保存され得る。
種々の処置レジメン（例えば、経口投与および処方、非経口投与および処方、静脈内投与および処方、鼻孔間投与および処方ならびに筋肉内投与および処方を含む）における、本明細書中に記載される特定の組成物の使用のための適切な投薬および処置レジメンの開発は、当該分野で周知であり、そのいくつかは、一般的な例示の目的のために以下で簡単に考察される。
特定の適用において、本明細書中に開示される薬学的組成物は、経口投与を介して動物に送達され得る。このような場合、これらの組成物は、不活性な希釈剤または同化可能な食用に適するキャリアとともに処方され得るか、またはそれらは、殻の固いゼラチンカプセルまたは殻の軟らかいゼラチンカプセル中に封入され得るか、またはそれらは、錠剤中に加圧され得るか、またはそれらは、食事の食物とともに直接取り込まれ得る。
活性な化合物はさらに、賦形剤とともに取り込まれ得、そして接種可能な錠剤、
バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシェ剤などの形態で使用され得る（例えば、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ １９９７年３月２７日；３８６（６６２３）：４１０−４；Ｈｗａｎｇら、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ １９９８；１５（３）：２４３−８４；米国特許第５，６４１，５１５号；米国特許第５，５８０，５７９号および米国特許第５，７９２，４５１号を参照のこと）。錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などもまた、任意の種々のさらなる成分（例えば、結合剤（例えば、ゴムトラガカント、アカシア、コーンスターチ、またはゼラチン）；賦形剤（例えば、リン酸二カルシウム）；崩壊剤（例えば、コーンスターチ、ジャガイモ澱粉、アルギン酸など）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）；および甘味剤（例えば、スクロース、ラクトースまたはサッカリンが添加され得る）、あるいは香味剤（例えば、ペパーミント、ウインターグリーン油またはチェリー香味剤））を含み得る。投薬用量形態がカプセル剤である場合、上記の型の材料に加え、液体キャリアを含み得る。種々の他の材料は、コーティングとして存在し得るか、またはそうでなければ、投薬用量の物理的形態を変更するように存在し得る。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル剤は、シェラック、糖、またはそれら両方によりコートされ得る。勿論、任意の投薬形態の調製において使用される任意の材料は、薬学的に純粋であり、使用される量において実質的に非毒性であるべきである。さらに、この活性化合物は、徐放性調製物および徐放性処方物中に組み込まれ得る。
代表的に、これらの処方物は、少なくとも約０．１％以上の活性化合物を含むが、勿論、活性成分のパーセントは変化され得、そして、都合良く総処方物の重量または容量の約１％または２％と約６０％または７０％以上との間であり得る。本来、治療上有効な化合物の各々における活性化合物の量は、適切な投薬量が、任意の所定の単位用量の化合物中で得られるような方法で調製され得る。因子（例えば、溶解性、バイオアベイラビリティー、生物学的半減期、投与経路、産物の貯蔵寿命、ならびに他の薬理学的考察）は、このような薬学的処方物を調製する分野の当業者によって企図され、そしてこのような場合、種々の投薬量および処置レジメンが所望され得る。
経口投与に関して、本発明の組成物は、選択的に１つ以上の賦形剤とともに、うがい薬、歯みがき剤、バッカル錠、経口スプレー、または舌下で経口的に投与される処方物の形態内に組み込まれ得る。あるいは、活性成分は、経口溶液（例えば、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび炭酸水素カリウムを含むもの）中に組み込まれ得るか、または歯みがき剤中に分散され得るか、または治療有効量で水、結合剤、研磨剤、甘味剤、発泡剤、および湿潤剤を含み得る組成物に加えられ得る。あるいは、組成物は、舌下に配置され得る錠剤形態または溶液形態中に形成され得るか、またはさもなくば口内において溶解される
特定の環境において、本明細書中に開示される薬学的組成物を非経口的に、静脈内に、筋肉内に、またはさらに腹腔内に送達することが所望される。このようなアプローチは、当業者に周知であり、そのいくつかはさらに、例えば以下に記載されている：例えば、米国特許第５，５４３，１５８号；米国特許第５，６４１，５１５号および米国特許第５，３９９，３６３号。特定の実施形態において、活性化合物の溶液は、遊離塩基または薬学的に受容可能な塩として、水中で、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合して調製され得る。分散剤はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびこれらの混合物、ならびに油中で調製され得る。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、一般に、微生物の増殖を防止するために保存剤を含み得る。
注射可能な使用に適切な、例示的な薬学的形態としては、無菌の注射可能な溶液または分散剤の即時調製のための無菌水溶液または無菌分散剤、および無菌粉末が挙げられる（例えば、米国特許第５，４６６，４６８号を参照のこと）。あらゆる場合において、形態は、無菌でなければならず、そして容易な注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）で存在する範囲で流動性でなければならない。形態は、製造および保存の条件下で安定でなければならず、微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対し保護されねばならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）を含む溶媒または分散媒、それらの適切な混合物、および／または植物油であり得る。適切な流動性は、例えばコーティング（例えば、レシチン）の使用により、分散の場合に必要とされる粒子サイズの維持により、そして／または界面活性剤の使用により、維持され得る。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によって容易になされ得る。多くの場合、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注射可能な組成物の長期にわたる吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の組成物中での使用によってもたらされ得る。
１つの実施形態において、水溶液中での非経口投与のために、必要ならばその溶液は、適切に緩衝化されるべきであり、そして液体希釈剤は、最初に、十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされる。これらの特定の水溶液は、特に、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、および腹腔内投与に適切である。これに関連して、使用され得る滅菌水性媒体は、本発明の開示を考慮して、当業者に公知である。例えば、一投与量は、１ｍｌの等張のＮａＣｌ溶液に溶解され得、そして１０００ｍｌの皮下注入流体に添加され得るか、または注入予定部位で注入され得るかのいずれかである（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照のこと）。投薬量におけるいくらかの変化が、処置される患者の状態に依存して、必ず生じる。さらに、ヒト投与に対して、調製物は、もちろん、好ましくは、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ｓｔａｎｄａｒｄｓによって要求されるような、無菌性、発熱性、および一般的な安全性標準および純度標準を満たすべきである。
本発明の別の実施形態において、本明細書中に開示される組成物は、中性形態または塩形態で処方され得る。例示的な薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）が挙げられ、そしてこれらの塩は、無機酸（例えば、塩酸、もしくはリン酸）、または有機酸（酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）とともに形成される。遊離カルボキシル基とともに形成された塩もまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄）、および有機塩基（イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導され得る。処方の際に、溶液は、投薬処方物と適合する様式でかつ治療的に有効な量で投与される。
キャリアは、さらに、任意および全ての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収を遅延させる薬剤、緩衝液、キャリア溶液、懸濁液、コロイドなどが挙げられる。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性成分と不適合である場合を除いては、治療組成物におけるその使用が、企図される。補助的活性成分もまた、これらの組成物に組み込まれ得る。句「薬学的に受容可能な」とは、ヒトに投与される場合に、アレルギー反応または類似の厄介な反応を生成しない分子実体および組成物をいう。
特定の実施形態において、薬学的組成物は、鼻腔内スプレー、吸入、および／または他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達され得る。遺伝子、核酸、およびペプチド組成物を、鼻腔エアロゾルスプレーを介して肺へ送達する方法は、例えば、以下に記載される：米国特許第５，７５６，３５３号および同第５，８０４，２１２号中に記載される。同様に、鼻空微粒子樹脂を使用する薬物送達（Ｔａｋｅｎａｇａら、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １９９８ Ｍａｒ ２；５２（１〜２）：８１〜７）およびリゾフォスファチジル−グリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号）もまた、薬学分野で周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリクスの形態での例示的な経粘膜の薬物送達は、米国特許第５，７８０，０４５号中に記載される。
特定の実施形態において、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、脂質粒子、小胞などは、本発明の組成物を適切な宿主細胞／生物へ導入するために使用される。特に、本発明の組成物は、液体粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア−またはナノ粒子など中に包括されたいずれかの送達のために処方され得る。あるいは、本発明の組成物は、このようなキャリアビヒクルの表面に共有結合または非共有結合のいずれかをされ得る。
潜在的な薬物キャリアとしての、リポソームおよびリポソーム様調製物の処方および使用は、一般に、当業者に周知である（例えば、Ｌａｓｉｃ Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９８ Ｊｕｌ；１６（７）：３０７〜２１；Ｔａｋａｋｕｒａ，Ｎｉｐｐｏｎ Ｒｉｎｓｈｏ １９９８ Ｍａｒ；５６（３）：６９１〜５；Ｃｈａｎｄｒａｎら，Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ．１９９７ Ａｕｇ；３５（８）：８０１〜９；Ｍａｒｇａｌｉｔ，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．１９９５；１２（２〜３）：２３３〜６１；米国特許第５，５６７，４３４号；同第５，５５２，１５７号；同第５，５６５，２１３号；同第５，７３８，８６８号および同第５，７９５，５８７号（各々、その全体が、参考として本明細書中で特に援用される））。
リポソームは、Ｔ細胞懸濁液、初代肝細胞培養物およびＰＣ１２細胞を含む他の手順によって、通常トランスフェクトし難い多くの細胞型とともに、首尾よく使用されている（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９０ Ｓｅｐ ２５；２６５（２７）：１６３３７〜４２；Ｍｕｌｌｅｒら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９０ Ａｐｒ；９（３）：２２１〜９）。さらに、リポソームは、ウイルスベースの送達系に典型的なＤＮＡ長制限がない。リポソームは、遺伝子、種々の薬物、放射線治療剤、酵素、ウイルス、転写因子およびアロステリックエフェクターなどを、種々の培養された細胞株および動物に導入するために効果的に使用されている。さらに、リポソームの使用が、全身送達後の自己免疫応答、または受任できない毒性に関連しなさそうである。
特定の実施形態において、リポソームは、水性媒体中に分散されるリン脂質から形成され、そして多層の同心性二重層小胞（多層小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を自発的に形成する。
あるいは、他の実施形態において、本発明は、本発明の組成物の薬学的に受容可能なナノカプセル処方物を提供する。ナノカプセルは、一般に、安定な、そして再現性のある方法で化合物を包括し得る（例えば、Ｑｕｉｎｔａｎａｒ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏら、Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ Ｉｎｄ Ｐｈａｒｍ．１９９８ Ｄｅｃ；２４（１２）：１１１３〜２８を参照のこと）。細胞内高分子過負荷に起因する副作用を避けるために、このような超微細粒子（約０．１μｍの大きさ）は、インビボで分解され得る高分子を使用して設計され得る。このような粒子は、例えば、Ｃｏｕｖｒｅｕｒら、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．１９８８；５（１）：１〜２０；ｚｕｒ Ｍｕｈｌｅｎら、Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ．１９９８ Ｍａｒ；４５（２）：１４９〜５５；Ｚａｍｂａｕｘら、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ．１９９８ Ｊａｎ ２；５０（１〜３）：３１−４０；および米国特許第５，１４５，６８４号によって記載されるように生成され得る。
（癌治療法）
癌治療に対する免疫学的アプローチは、癌細胞が、異常なまたは異種の細胞および分子に対するしばしば身体防御を逃れ得、そして、これらの防御が失った領域を回復するように治療学的に刺激され得るという認識に基づく（６２３〜６４８頁、Ｋｌｅｉｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８２）。種々の免疫エフェクターが、腫瘍の増殖を直接的にかまたは間接的に阻害し得るという、最近の多数の知見は、癌治療に対するこのアプローチにおいて、新たな興味を引き出す（例えば、Ｊａｇｅｒら、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２００１；６０（１）：１〜７；Ｒｅｎｎｅｒら、Ａｎｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０００ Ｄｅｃ；７９（１２）：６５１〜９）。
４つの基本的な細胞型（その機能は、抗腫瘍細胞免疫および体由来の腫瘍細胞の排除に関する）は、以下である：ｉ）異物侵入細胞を同定し、そして標識するために、血液血漿へ免疫グロブリンを分泌する、Ｂリンパ球；ｉｉ）免疫グロブリンコート化標的侵入細胞の溶解およびプロセッシングを引き起こす補体タンパク質を分泌する、単球；ｉｉｉ）腫瘍細胞の破壊、抗体依存細胞毒性および自然死滅に関して２つの機構を有するナチュラルキラーリンパ球；およびｉｖ）抗原特異的レセプターおよび相補的マーカー分子を有する腫瘍細胞を認識する能力がある、Ｔ−リンパ球（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｈ．１９８９、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（編）Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ、９２３頁〜９５５頁）。
癌免疫治療は、一般に、体液免疫応答、細胞免疫応答、またはその両方を誘導することに重点を置く。さらに、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞の誘導が、抗体または細胞障害性のＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかを二次的に誘導するために必要である、ということが十分確立される。癌細胞（特に肺癌細胞）に選択的に、または理想的に特異的であるポリペプチド抗原は、肺癌に対する免疫応答を誘導するための強力なアプローチを提供し、そして、本発明の重要な局面である。
ゆえに、本発明のさらなる局面において、本明細書中で記載される薬学的組成物は、癌の治療（特に、肺癌の免疫治療）のために使用され得る。このような方法において、本明細書中で記載される薬学的組成物は、患者、代表的には温血動物、好ましくはヒトに投与される。患者は、癌に罹患され得るかまたはされない。従って、上記の薬学的組成物は、癌の進行を予防するため、または癌に罹患した患者を処置するために使用され得る。薬学的組成物およびワクチンは、原発腫瘍の外科的な除去および／または処置（例えば、放射線治療薬、または従来の化学療法薬の投与）の前または後のいずれかに、投与され得る。上記で議論したように、薬学的組成物の投与は、任意の適切な方法（静脈内投与、腹腔内投与、筋内投与、皮下投与、鼻腔内投与、皮内投与、肛門投与、膣投与、局所投与および経口投与を含む）によるものであり得る。
特定の実施形態において、免疫療法は、能動的免疫療法であり得、この療法において処置は、免疫応答改変剤（例えば、本明細書中で提供されるポリペプチドおよびポリヌクレオチド）の投与で腫瘍に対して反応する内因性宿主免疫系のインビボ刺激に依存する。
他の実施形態において、免疫療法は、受動的免疫療法であり得、この療法において処置は、確立された腫瘍免疫反応性を有する因子（例えば、効果細胞または抗体）の送達（抗腫瘍効果を直接的または間接的に媒介し得、そしてインタクトな宿主免疫系に依存する必要はない）に関する。効果細胞の例としては、上記のようなＴ細胞、本明細書中に提供されるポリペプチドを発現するＴリンパ球（例えば、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球およびＣＤ４＋Ｔヘルパー腫瘍浸潤性リンパ球）、キラー細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞およびリンホカイン活性化キラー細胞）、Ｂ細胞および抗原提示細胞（例えば、樹状細胞およびマクロファージ）が挙げられる。本明細書中に列挙されるポリペプチドに特異的なＴ細胞レセプターおよび抗体レセプターは、養子免疫療法のために他のベクターまたは効果細胞中にクローニングされ、発現され、そして移入され得る。本明細書に提供されるポリペプチドはまた、受動免疫療法のための抗体または抗イディオタイプ抗体（上記および米国特許第４，９１８，１６４号に記載される）を生成するために用いられ得る。
モノクローナル抗体は、検出、診断アッセイまたは治療適用における所望された選択的用法のために、種々の標識のいずれかで標識され得る（米国特許第６，０９０，３６５号；同第６，０１５，５４２号；同第５，８４３，３９８号；同第５，５９５，７２１号；および同第４，７０８，９３０号（各々が個々に援用されるように、その全体が本明細書中で参考として援用される））。各場合において、標識化モノクローナル抗体の、抗原の決定部位への結合は、非正常細胞上の抗原決定部位への特定の治療薬の検出または送達をシグナルする。本発明のさらなる目的は、それらのこのような所望された選択的用法を達成するために適切に標識された、特定のモノクローナル抗体を提供することである。
効果細胞は、一般に、本明細書中に記載されるように、インビトロでの増殖により養子免疫治療のために十分な量で得られ得る。単一の抗原特異的効果細胞を、インビボでの抗原認識を保持しながら数十億まで増殖させるための培養条件は、当該分野で周知である。このようなインビトロの培養条件は代表的に、しばしばサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）および分裂しない支持細胞の存在下で、抗原との間欠刺激を用いる。上で述べたように、本明細書中で提供される免疫反応性ポリペプチドは、抗原特異的Ｔ細胞培養を急速に増殖するために用いられ、免疫治療に十分な数の細胞を生成し得る。詳細には、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球、繊維芽細胞、またはＢ細胞）は、当該分野で周知の標準的技術を用いて、免疫反応性ポリペプチドでパルスされ得るか、または１つ以上のポリヌクレオチドでトランスフェクトされ得る。例えば、抗原提示細胞は、組換えウイルスまたは他の発現系における発現を増大するのに適切なプロモーターを有するポリヌクレオチドでトランスフェクトされ得る。治療において使用するための培養された効果細胞は、増殖されかつ広範に分配され得、そしてインビボで長期間生存され得なければならない。培養された効果細胞が、インビボで増殖し、そしてＩＬ−２を補充された抗原での反復刺激によって、長期間、多数生存しするように誘導され得ることが研究で示されている（例えば、Ｃｈｅｅｖｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １５７：１７７、１９９７を参照のこと）。
あるいは、本明細書において列挙されるポリペプチドを発現するベクターは、患者から得られた抗原提示細胞に導入され得、そして同じ患者に戻す移植のためにエキソビボでクローン的に増殖され得る。トランスフェクトされた細胞は、当該分野で公知の任意の手段（好ましくは、静脈投与、腔内投与、腹腔内投与、または腫瘍内投与による滅菌形態）を用いて患者に再導入され得る。
本明細書中に開示される治療的組成物の投与の経路および頻度、ならびに投薬量は、個々人で異なり、そして標準的技術を用いて容易に確立され得る。概して、薬学的組成物およびワクチンは、注射（例えば、皮内、筋肉内、静脈内、または皮下）により、経鼻的に（例えば、吸引により）または経口的に、投与され得る。好ましくは、５２週間にわたって１〜１０用量が投与され得る。好ましくは、１ヶ月の間隔で６用量が投与され、そしてブースター（追加）ワクチン接種がその後定期的に与えられ得る。交替のプロトコールが個々の患者に適切であり得る。適切な用量は、上記のように投与された場合、抗腫瘍免疫応答を促進し得、そして基底（すなわち、未処置）レベルより少なくとも１０〜５０％上である、化合物の量である。このような応答は、患者内の抗腫瘍抗体を測定することによってか、または患者の腫瘍細胞を殺傷し得る細胞溶解性効果細胞のワクチン依存性のインビトロでの生成によってモニターされ得る。このようなワクチンはまた、ワクチン処理されていない患者と比較すると、ワクチン処理された患者において、改善された臨床的結果（例えば、より頻繁な症状の軽減、完全もしくは部分的に疾患を有さないか、またはより長く疾患を有さない生存）を導く免疫応答を生じ得るはずである。一般に、１つ以上のポリペプチドを含む薬学的組成物およびワクチンについて、用量中に存在する各ポリペプチドの量は、宿主の体重（ｋｇ）あたり、約２５μｇ〜５ｍｇにわたる。適切な用量サイズは、患者の大きさで変化するが、代表的には約０．１ｍＬ〜約５ｍＬの範囲である。
一般に、適切な投薬量および処置レジメンは、治療的および／または予防的利点を提供するのに十分な量の活性化合物を提供する。このような応答は、処置されていない患者に比較して、処置された患者において、改善された臨床的結果（例えば、より頻繁な寛解、完全なまたは部分的な、あるいはより長い疾患なしでの生存）を確立することによってモニターされ得る。腫瘍タンパク質に対する既存の免疫応答における増加は、一般的に、改善された臨床的結果と関連する。このような免疫応答は、一般的に、標準的な増殖アッセイ、細胞障害性アッセイまたはサイトカインアッセイを使用して評価され得、これは、処置の前または後に患者から得られるサンプルを使用して行われ得る。
（癌の検出および診断の組成物、方法およびキット）
一般的に、癌は、患者から得られた生物学的サンプル（例えば、血液、血清、痰、尿、および／または腫瘍生検）における１つ以上の肺腫瘍タンパク質および／またはこのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在に基づいて患者において検出され得る。言い換えると、このようなタンパク質は、肺癌のような癌の存在または非存在を示すためのマーカーとして使用され得る。さらに、このようなタンパク質は、他の癌の検出に有用であり得る。本明細書に提供される結合剤が、一般的に、生物学的サンプル中の薬剤に結合する抗原のレベルの検出を可能にする。
ポリヌクレオチドプライマーおよびプローブは、腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを検出するために使用され得、これもまた、癌の存在または非存在を示す。一般に、腫瘍配列は、腫瘍細胞が生じた同一の細胞型の正常組織においてよりも、腫瘍細胞において、少なくとも２倍、好ましくは３倍およびより好ましくは５倍以上のレベルで存在し得る。腫瘍が生じた組織とは異なる組織型での特定の腫瘍配列の発現レベルは、腫瘍細胞の存在が、同一の型の正常組織における発現レベルに対する腫瘍組織における予め決定された差示的な発現レベル（例えば、２倍、５倍など）の観察によって確認され得るので、特定の診断的実施形態において適当でない。
他の差示的な発現パターンは、診断の目的で有利に利用され得る。例えば、本発明の１局面において、同一型の腫瘍組織および正常組織（他の正常な組織ではない）（例えば、ＰＢＭＣ）における腫瘍配列の過剰発現は、治療的に開発される。この場合、転移性腫瘍細胞の存在（例えば、腫瘍が発生した組織とは異なる循環組織、またはいくつかの他の組織部位）から選抜されたサンプルにおいて）は、サンプル中の腫瘍配列の発現を検出することによって同定され得、そして／または確認され得る（例えば、ＲＴ−ＰＣＲを使用して）。多くの場合、細胞捕獲または他の同様の技術を使用して、目的のサンプル中の腫瘍細胞（例えばＰＢＭＣ）を濃縮することが所望される。
サンプル中のポリペプチドマーカーを検出するために結合剤を使用するための、当業者に公知の種々のアッセイ型式が存在する。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。一般的に、患者における癌の存在または非存在は、（ａ）患者から得られた生物学的サンプルを結合剤と接触させる工程；（ｂ）結合剤に結合するポリペプチドのレベルをサンプルにおいて検出する工程；および（ｃ）ポリペプチドのレベルと所定のカットオフ値とを比較する工程によって決定され得る。
好ましい実施形態において、このアッセイは、結合するためおよびサンプルの残りからポリペプチドを除くために固体支持体上に固定化された結合剤の使用を含む。次いで、結合されたポリペプチドは、レポーター基を含み、結合剤／ポリペプチド複合体に特異的に結合する検出試薬を使用して検出され得る。このような検出試薬は、例えば、ポリペプチドまたは抗体に特異的に結合する結合剤、あるいは結合剤に特異的に結合する他の薬剤（例えば、抗免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテインＡまたはレクチン）を含み得る。あるいは、競合アッセイが、使用され得、ここで、ポリペプチドは、レポーター基で標識され、そしてサンプルと結合剤のインキュベーション後にその固定化結合剤に結合し得る。サンプルの成分が、標識ポリペプチドの結合剤への結合を阻害する程度は、サンプルの固定化結合剤との反応性を示す。このようなアッセイにおける使用に適切なポリペプチドは、上記のような、結合剤が結合する全長肺腫瘍タンパク質およびそのポリペプチド部分を含む。
固体支持体は、腫瘍タンパク質が付着され得る当業者に公知の任意の物質であり得る。例えば、固体支持体は、マイクロタイタープレートにおける試験ウェルあるいはニトロセルロースまたは他の適切な膜であり得る。あるいは、その支持体は、ビーズまたはディスク（例えば、ガラス、ファイバーグラス、ラテックス、またはプラスチック物質（例えば、ポリスチレン、またはポリ塩化ビニル））であり得る。その支持体はまた、磁気粒子または光ファイバーセンサー（例えば、米国特許第５，３５９，６８１号に記載のような）であり得る。結合剤は、当業者に公知の種々の技術を使用して固体支持体上に固定化され得、これは特許および科学文献に十分に記載されている。本発明の状況において、用語「固定化」とは、非共有結合的な会合（例えば、吸着）および共有結合的な付着（これは、薬剤と支持体上の官能基との間で直接連結され得るかまたは架橋剤を用いる連結であり得る）の両方をいう。マイクロタイタープレートのウェル、または膜への吸着による固定化は好ましい。このような場合、吸着は、適切な緩衝液中で固体支持体に適切な時間で結合剤を接触させることによって達成され得る。接触時間は、温度によって変化するが、代表的には、約１時間から約１日の間である。一般的には、約１０ｎｇ〜約１０μｇ、そして好ましくは約１００ｎｇ〜約１μｇの範囲の量の結合剤とプラスチックマイクロタイタープレート（例えば、ポリスチレンまたはポリ塩化ビニル）のウェルを接触させることは、適切な量の結合剤を固定化するのに十分である。
固体支持体への結合剤の共有結合的付着は、一般に、支持体および結合剤上の官能基（例えば、水酸基またはアミノ基）の両方と反応する二官能性試薬と支持体を最初に反応させることによって達成され得る。例えば、この結合剤は、ベンゾキノンを用いるかまたは結合パートナー上のアミンおよび活性水素と支持体上のアルデヒド基との縮合によって、適切なポリマーコーティングを有する支持体に、共有結合的に付着され得る（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９１、Ａ１２−Ａ１３を参照のこと）。
特定の実施形態において、このアッセイは、２抗体サンドイッチアッセイである。本アッセイは、最初に、固体支持体（通常、マイクロタイタープレートのウェル）上で固定化されている抗体をサンプルと接触させて、サンプル内のポリペプチドを固定化抗体に結合させることによって実施され得る。次いで、非結合サンプルは固定化ポリペプチド−抗体複合体から除去され、そして検出試薬（好ましくは、そのポリペプチド上の異なる部位に結合し得る第２の抗体）（レポーター基を含む）が添加される。次いで、固体支持体に結合したままである検出試薬の量が、特定のレポーター基に関して適切な方法を用いて決定される。
より詳細には、一旦抗体が上記のように支持体上に固定化されると、支持体上の残りのタンパク質結合部位は、代表的にはブロックされる。任意の適切なブロック剤（例えば、ウシ血清アルブミンまたはＴｗｅｅｎ２０ＴＭ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））は、当業者に公知である。固定化抗体は次いで、サンプルとインキュベートされ、そしてポリペプチドをこの抗体に結合させる。インキュベーションの前に、このサンプルは適切な希釈液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））で希釈され得る。概して、適切な接触時間（すなわち、インキュベーション時間）は、肺癌を有する個体から得られたサンプル内のポリペプチドの存在を検出するのに十分な時間である。好ましくは、この接触時間は、結合ポリペプチドと非結合ポリペプチドとの間の平衡で達成されたレベルの少なくとも約９５％である結合レベルを達成するのに十分な時間である。当業者は、ある時間にわたって起こる結合レベルをアッセイすることによって、平衡に達するまでに必要な時間が容易に決定され得ることを認識する。室温では、一般に、約３０分間のインキュベーション時間で十分である。
次いで、非結合サンプルが、適切な緩衝液（例えば、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭを含むＰＢＳ）を用いて固体支持体を洗浄することによって除去され得る。レポーター基を含む第２の抗体が次いで、固体支持体に添加され得る。好ましいレポーター基は、上記の基を含む。
次いで、検出試薬が、結合されたポリペプチドを検出するのに十分な量の時間、固定化抗体−ポリペプチド複合体とインキュベートされる。適切な量の時間は、一般に、ある時間にわたって起こる結合のレベルをアッセイすることによって決定され得る。次いで、非結合の検出試薬は除去され、そして結合した検出試薬は、レポーター基を用いて検出される。レポーター基を検出するために使用される方法は、レポーター基の性質に依存する。放射性基について、一般的には、シンチレーション計数法またはオートラジオグラフィー法が適切である。分光法は、色素、発光基および蛍光基を検出するために使用され得る。ビチオンは、異なるレポーター基（一般に、放射性もしくは蛍光基または酵素）に結合されたアビジンを使用して検出され得る。酵素レポーター基は、一般に、基質の添加（一般には、特定の時間の間）、続いて反応産物の分光分析または他の分析により検出され得る。
癌（例えば、肺癌）の存在または非存在を決定するために、固体支持体に結合したままのレポーター基から検出されるシグナルが、一般に、所定のカットオフ値と対応するシグナルと比較される。１つの好ましい実施形態において、癌の検出のためのカットオフ値は、固定化抗体を、癌を有さない患者由来のサンプルとインキュベートした際に得られた平均シグナル値である。概して、所定のカットオフ値を３標準偏差上回るシグナルを生じるサンプルが、癌に対して陽性とみなされる。代わりの好ましい実施形態において、このカットオフ値は、Ｓａｃｋｅｔｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｃｏ．，１９８５，１０６〜７頁の方法に従って、レシーバーオペレーターカーブ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｏｒ Ｃｕｒｖｅ）を使用して決定される。簡単に言うと、本実施形態において、このカットオフ値は、診断試験結果について各可能なカットオフ値に対応する真の陽性割合（すなわち、感度）および偽陽性割合（１００％−特異性）の対のプロットから決定され得る。プロット上の上方左手角に最も近いカットオフ値（すなわち、最大領域を囲む値）が、最も正確なカットオフ値であり、そして本方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生ずるサンプルが陽性と見なされ得る。あるいは、カットオフ値は、偽陽性割合を最小にするためにプロットに沿って左へシフトされ得るか、または偽陰性割合を最小にするために右へシフトされ得る。概して、本方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生じるサンプルが、癌に対して陽性と見なされる。
関連の実施形態において、このアッセイは、フロースルー試験形式またはストリップ試験形式で実行される（ここで、結合剤は、ニトロセルロースのような膜上で固定化される）。フロースルー試験では、サンプル内のポリペプチドは、サンプルが膜を通過するにつれて固定化抗体に結合する。次いで、第２の標識化された結合剤が、この第２の結合剤を含む溶液がその膜を介して流れるにつれて、結合剤−ポリペプチド複合体と結合する。次いで、結合した第２の結合剤の検出は、上記のように実行され得る。ストリップ試験形式では、結合剤が結合される膜の一端をサンプルを含む溶液中に浸す。このサンプルは、膜に沿って、第２の結合剤を含む領域を通って、そして固定化結合剤の領域まで移動する。固定化抗体の領域での第２の結合剤の濃度が、癌の存在を示す。代表的には、その部位での第２の結合剤の濃度は、視覚的に読みとられ得るパターン（例えば、線）を生成する。このようなパターンを示さないことは陰性の結果を示す。概して、この膜上に固定化される結合剤の量は、生物学的サンプルが、上記の形式において、２抗体サンドイッチアッセイにおいて陽性シグナルを生じるのに十分であるレベルのポリペプチドを含む場合、視覚的に識別可能なパターンを生じるように選択される。このようなアッセイにおける使用に好ましい結合剤は、抗体およびその抗原結合フラグメントである。好ましくは、膜上に固定化される抗体の量は、約２５ｎｇ〜約１μｇの範囲であり、そしてより好ましくは、約５０ｎｇ〜約５００ｎｇの範囲である。このような試験は、代表的には、非常に少ない量の生物学的サンプルを用いて実行され得る。
もちろん、本発明の腫瘍タンパク質または結合剤との使用に適する多数の他のアッセイ手順が存在する。上記の記載は、例示のみを意図する。例えば、上記手順が、腫瘍ポリペプチドを使用するために容易に改変され得て、生物学的サンプル内でこのようなポリペプチドに結合する抗体を検出し得ることが当業者に明かである。このような腫瘍タンパク質特異的抗体の検出は、癌の存在と相関し得る。
あるいは、癌はまた、生物学的サンプル中の腫瘍タンパク質と特異的に反応するＴ細胞の存在に基づいて検出され得る。特定の方法では、患者から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む生物学的サンプルは、腫瘍ポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはこのようなポリペプチドの少なくとも免疫原性部分を発現するＡＰＣとともにインキュベートされ、そしてＴ細胞の特異的活性化の存在または非存在が検出される。適切な生物学的サンプルとしては、単離されたＴ細胞が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｔ細胞は、慣用技術によって（例えば、末梢血リンパ球のＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離法によって）患者から単離され得る。Ｔ細胞は、２〜９日間（代表的に４日間）、３７℃にてポリペプチド（例えば、５〜２５μｇ／ｍｌ）とともにインビトロでインキュベートされ得る。別のアリコートのＴ細胞サンプルを、コントロールとして役立てるために、腫瘍ポリペプチドの非存在下でインキュベートすることが所望され得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞に関して、活性化は好ましくは、Ｔ細胞の増殖を評価することによって検出される。ＣＤ８＋Ｔ細胞に関しては、活性化は好ましくは、細胞溶解活性を評価することによって検出される。疾患のない患者におけるよりも少なくとも２倍高い増殖レベルおよび／または少なくとも２０％高い細胞溶解活性レベルは、患者における癌の存在を示す。
上記のように、癌はまた、あるいは、生物学的サンプル中の腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡレベルに基づいて検出され得る。例えば、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイにおいて用いて、生物学的サンプルに由来する腫瘍ｃＤＮＡの一部を増幅し得、ここで、オリゴヌクレオチドプライマーのうちの少なくとも１つは、腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的である（すなわち、ハイブリダイズする）。次いで、増幅されたｃＤＮＡが、当該分野で周知の技術（例えば、ゲル電気泳動）を用いて分離され、そして検出される。
同様に、腫瘍タンパク質をコードするヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブは、生物学的サンプル中の腫瘍たんぱく質をコードするポリヌクレオチドの存在を検出するハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用され得る。
アッセイ条件下でのハイブリダイゼーションを可能にするために、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、少なくとも１０ヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの長さである本発明の腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部に少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％、そしてより好ましくは少なくとも約９０％同一であるオリゴヌクレオチド配列を含むべきである。好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、上記で定義されるような中程度にストリンジェントな条件下で本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする。本明細書中に開示される診断方法において有効に用いられ得るオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、好ましくは、少なくとも１０〜４０ヌクレオチドの長さである。好ましい実施形態において、このオリゴヌクレオチドプライマーは、本明細書中に記載される配列を有するＤＮＡ分子の少なくとも１０の連続するヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む。ＰＣＲベースのアッセイおよびハイブリダイゼーションアッセイの両方についての技術は、当該分野において周知である（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５１：２６３，１９８７；Ｅｒｌｉｃｈ編，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）。
１つの好ましいアッセイは、ＲＴ−ＰＣＲを用い、ここでＰＣＲが、逆転写と組み合わせて適用される。代表的に、ＲＮＡは、生物学的サンプル（例えば、生体検査組織）から抽出され、そして逆転写されてｃＤＮＡ分子を生成する。少なくとも１つの特異的プライマーを用いるＰＣＲ増幅は、ｃＤＮＡ分子を生成し、これは例えば、ゲル電気泳動を用いて分離され得、そして可視化され得る。増幅は、試験患者および癌に羅患されていない個体から得られた生物学的サンプルにおいて実行され得る。増幅反応は、２桁の大きさに及ぶ様々なｃＤＮＡ希釈物について行われ得る。同じ希釈の癌でないサンプルと比較して、様々な希釈の試験患者のサンプルにおける発現の２倍以上の増加は、代表的に陽性であると考えられる。
本発明の別の局面において、細胞捕捉技術は、例えば、肺腫瘍抗原を発現する転移細胞の検出のためのより感度が高い手段を提供するリアルタイム ＰＣＲと組み合わせて使用され得る。生物学的サンプル（例えば、骨髄サンプル、末梢血、および小型針吸収サンプル）における肺癌細胞の検出は、肺癌患者における診断および予後について所望される。
表面細胞マーカーに対する特異的モノクローナル抗体でコートされる免疫磁気ビーズは、または四量体の抗体複合体、サンプル中の癌細胞の最初の富化または陽性を選択するために使用され得る。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈ（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）、ＳｔｅｍＳｅｐＴＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）およびＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む、種々の市販のキットが使用され得る。当業者は、他の方法論およびキットもまた、所望される細胞集団を富化するためか、または陽性を選択するために使用され得ることを認識する。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈは、正常な上皮組織上および新生物上皮組織上で発現される２つの糖タンパク質膜抗原に特異的なｍＡｂでコートされる磁気ビーズを含む。コートされたビーズは、サンプルに添加され得、次いでサンプルは、磁石に適用され、これによってビーズに結合された細胞を捕獲する。目的でない細胞は、洗い流され、そして磁気的に単離された細胞がビーズから溶出され、そしてさらなる分析に使用される。
ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐは、血液サンプルから直接細胞を富化するために使用され得、そして種々の目的でない細胞を標的にする四量体の抗体の反応混液を構成し、そしてサンプル中に存在する赤血球細胞（ＲＢＣ）上のグリコホリンＡと架橋し、ロゼットを形成する。Ｆｉｃｏｌｌで遠心分離する場合、標的化細胞は、遊離ＲＢＣと共にペレット化する。欠乏した反応混液中の抗体の組合せは、どの細胞が除去され、そしてその結果どの細胞が回収されるかを決定する。利用可能な抗体としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６、ＣＤ６６Ｂ、ＣＤ６６ｅ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩｇＥ、およびＴＣＲαβ。
さらに、肺腫瘍抗原に特異的なｍＡｂが、同様の様式で生成され得、そして使用され得ることが、本発明において企図される。例えば、腫瘍特異的細胞表面抗原に結合するｍＡｂは、磁気ビーズに結合され得るか、または四量体抗体複合体において処方され得、そしてサンプルから転移肺腫瘍細胞を富化するか、またはサンプルから転移肺腫瘍細胞の陽性を選択するために使用される。一旦サンプルが、富化または陽性を選択されると、細胞は溶解され得、そしてＲＮＡが単離され得る。次いで、ＲＮＡは、本明細書中に記載されるリアルタイムＰＣＲアッセイにおいて肺腫瘍特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ分析に供され得る。当業者は、富化または選択された細胞集団が、他の方法によって分析され得ることを認識する（例えば、インサイチュハイブリダイゼーション、またはフローサイトメトリー）。
別の実施形態において、本明細書中に記載される組成物は、癌の進行についてのマーカーとして使用され得る。この実施形態において、癌の診断について上記に記載されるようなアッセイが、経時的に実行され得、そして反応性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルにおける変化が評価され得る。例えば、このアッセイは、６ヶ月〜１年間の期間２４〜７２時間毎に実行され得、そしてその後、必要に応じて実行され得る。一般に、癌は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの検出されたレベルが、経時的に増加する患者において進行する。反対に、反応性のポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが、一定のままであるか、または時間とともに減少するかのいずれかの場合、癌は進行していない。
特定のインビボ診断アッセイが、腫瘍について直接実行され得る。このようなアッセイの１つは、腫瘍細胞を、結合剤と接触させる工程を含む。次いで、結合した結合剤が、レポーター基を介して直接的または間接的に検出され得る。このような結合剤はまた、組織学的適用において使用され得る。あるいは、ポリヌクレオチドプローブは、このような適用において使用され得る。
上記のように、感度を向上するために、複数の腫瘍タンパク質マーカーが、所定のサンプルに内でアッセイされ得る。本明細書中で提供される異なるタンパク質について特異的な結合剤が、単独のアッセイにおいて組合せられ得ることは、明らかである。さらに、複数のプライマーまたはプローブが、同時に使用され得る。腫瘍タンパク質マーカーの選択は、最適の感度を生じる組合せを決定する所定の実験に基づき得る。さらに、またはあるいは、本明細書中で提供される腫瘍タンパク質についてのアッセイは、他の公知の腫瘍抗原についてのアッセイと組み合わされ得る。
本発明は、任意の上記の診断方法における使用のためのキットをさらに提供する。このようなキットは、代表的に、診断アッセイを実行するために必要な２つ以上の構成要素を含む。構成要素は、化合物、試薬、容器および／または装置であり得る。例えば、キット内の１つの容器は、腫瘍タンパク質に特異的に結合するそのモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含み得る。このような抗体またはフラグメントは、上記のような支持材料に付着されて提供され得る。１つ以上のさらなる容器は、アッセイにおいて使用されるべきエレメント（例えば、試薬または緩衝液）を含み得る。このようなキットはまた、あるいは、抗体結合の直接的検出または間接的検出に適切なレポーター基を含む上記の検出試薬を含み得る。
あるいは、キットは、生物学的サンプル中の腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを検出するように設計され得る。このようなキットは、一般に、腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする、上記のような少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを含む。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲアッセイまたはハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用され得る。このようなキット内に存在し得るさらなる構成要素としては、第２のオリゴヌクレオチドおよび／または診断薬、または容器を含み、腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドの検出を容易にする。
以下の実施例は、例示として提供され、限定としてではない。
（実施例１）
（肺腫瘍ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列の単離および特徴づけ）
本実施例は、肺腫瘍ｃＤＮＡライブラリーからの、肺腫瘍特異的ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ分子の単離を例示する。
（Ａ．肺扁平上皮細胞癌ライブラリーからのｃＤＮＡ配列の単離）
ヒト肺扁平上皮細胞癌ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、製造業者のプロトコルに従ってＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して、２人の患者の組織のプール由来のポリＡ＋ ＲＮＡから構築した。詳細には、肺癌組織をポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）でホモジナイズし、そして総ＲＮＡを、製造業者により指示されるようにＴｒｉｚｏｌ試薬（ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して抽出した。次いで、ポリＡ＋ ＲＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９に記載されるように、オリゴｄＴセルロースカラムを使用して精製した。第１鎖ｃＤＮＡを、ＮｏｔＩ／Ｏｌｉｇｏ−ｄＴ１８プライマーを使用して合成した。二本鎖ｃＤＮＡを合成し、ＢｓｔＸＩ／ＥｃｏＲＩアダプター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と連結し、そしてＮｏｔＩで消化した。ｃＤＮＡサイズ分画カラム（ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でのサイズ分画の後、そのｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢｓｔＸＩ／ＮｏｔＩ部位に連結し、そしてエレクトロポレーションによって、ＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ細胞（ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換した。
同じ手順を使用して、正常ヒト肺ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、４つの組織標本のプールから調製した。ｃＤＮＡライブラリーを、独立コロニー数、インサートを保有するクローンの割合、平均インサートサイズを決定すること、および配列分析によって、特徴付けた。この肺扁平上皮細胞癌ライブラリーは、２．７×１０６個の独立コロニーを含み、１００％のクローンが、インサートを有し、そして平均インサートサイズは２１００塩基対であった。正常肺ｃＤＮＡライブラリーは、１．４×１０６個の独立コロニーを含み、９０％のクローンが、インサートを有し、そして平均インサートサイズは１８００塩基対であった。両方のライブラリーについて、配列分析は、大多数のクローンが全長ｃＤＮＡ配列を有し、ｍＲＮＡから合成されたことを示した。
ｃＤＮＡライブラリー減算（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）を、いくらかの改変とともにＨａｒａら（Ｂｌｏｏｄ、８４：１８９〜１９９、１９９４）により記載されるように、上記の肺扁平上皮細胞癌ｃＤＮＡライブラリーおよび正常肺ｃＤＮＡライブラリーを使用して実施した。詳細には、肺扁平上皮細胞癌特異的減算ｃＤＮＡライブラリーを、以下のように作製した。正常組織ｃＤＮＡライブラリー（８０μｇ）をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化し、続いてＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎｏｗフラグメントでの充填反応を行った。フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿の後、ＤＮＡを１３３μｌのＨ２Ｏに溶解し、熱変性し、そして１３３μｌ（１３３μｇ）のＰｈｏｔｏｐｒｏｂｅビオチン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）と混合した。製造業者により推薦されるように、生じた混合物を、２７０Ｗの太陽燈を用いて、氷上で２０分間照射した。さらなるＰｈｏｔｏｐｒｏｂｅビオチン（６７μｌ）を添加し、そしてビオチン化反応を反復した。ブタノールで５回抽出した後、そのＤＮＡをエタノール沈殿し、そして２３μｌのＨ２Ｏに溶解して、ドライバーＤＮＡを形成した。
トレーサーＤＮＡを形成するために、１０μｇの肺扁平上皮細胞癌ｃＤＮＡライブラリーを、ＮｏｔＩおよびＳｐｅＩで消化し、フェノールクロロホルム抽出し、そしてＣｈｒｏｍａ ｓｐｉｎ−４００カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を通した。代表的には、５μｇのｃＤＮＡをサイズ分別カラムの後に回収した。エタノール沈殿の後、トレーサーＤＮＡを５μｌのＨ２Ｏに溶解した。トレーサーＤＮＡを１５μｌのドライバーＤＮＡおよび２０μｌの２×ハイブリダイゼーション緩衝液（１．５Ｍ ＮａＣｌ／１０ｍＭ ＥＤＴＡ／５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５／０．２％ドデシル硫酸ナトリウム）と混合し、ミネラルオイルを重層し、そして完全に熱変性した。このサンプルをすぐに６８℃水浴中に移し、そして２０時間インキュベートした（ロングハイブリダイゼーション［ＬＨ］）。次いで、この反応混合物をストレプトアビジン処理に供し、続いてフェノール／クロロホルム抽出した。このプロセスを３回以上反復した。減算されたＤＮＡを沈殿し、１２μｌのＨ２Ｏに溶解し、８μｌのドライバーＤＮＡおよび２０μｌの２×ハイブリダイゼーション緩衝液と混合し、そして６８℃にて２時間のハイブリダイゼーションに供した（ショートハイブリダイゼーション［ＳＨ］）。ビオチン化二本鎖ＤＮＡの除去の後、減算されたｃＤＮＡを、クロラムフェニコール耐性ｐＢＣＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＮｏｔＩ／ＳｐｅＩ部位に連結し、そしてエレクトロポレーションによってＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ細胞に形質転換して、肺扁平上皮細胞癌特異的減算ｃＤＮＡライブラリー（本明細書中で以後、「肺差引きＩ」と呼ぶ）を作製した。
第２の肺扁平上皮細胞癌特異的差引きｃＤＮＡライブラリー（「肺差引きＩＩ」と呼ぶ）を、肺差引きライブラリーＩと類似する様式にて作製したが、但し例外として、肺差引きＩから頻繁に回収される８つの遺伝子がドライバーＤＮＡに含まれ、そして２４，０００個の独立クローンを回収した。
これらの差引きｃＤＮＡライブラリーを分析するために、プラスミドＤＮＡを、これら差引き肺扁平上皮細胞癌特異的ライブラリーから無作為に拾った３２０個の独立クローンから調製した。代表的なｃＤＮＡクローンを、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ Ｍｏｄｅｌ ３７３Ａおよび／またはＭｏｄｅｌ ３７７（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いるＤＮＡ配列決定によって、さらに特徴付けた。単離した６０個のクローンについてのｃＤＮＡ配列を、配列番号１〜６０にて提供する。これらの配列を、ＥＭＢＬデータベースおよびＧｅｎＢａｎｋデータベース（公開９６）を使用して、遺伝子バンク中の公知の配列と比較した。何の有意な相同性も、配列番号２、３、１９、３８および４６にて提供される配列に対して見出されなかった。配列番号１、配列番号６〜８、配列番号１０〜１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０〜２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４〜３７、配列番号３９〜４５、配列番号４７〜４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５７〜５９の配列が、以前に同定された発現配列タグ（ＥＳＴ）に対していくらかの相同性を示すことを見出した。配列番号９、配列番号２８、配列番号３１および配列番号３３の配列が、以前に同定された非ヒト遺伝子配列に対していくらかの相同性を示すことを見出し、そして配列番号４、配列番号５、配列番号１４、配列番号５０、配列番号５３、配列番号５６および配列番号６０の配列が、ヒトにおいて以前に同定された遺伝子配列に対していくらかの相同性を示すことを見出した。
上記の差引き手順を、トレーサーＤＮＡとして、上記の肺扁平上皮細胞癌ｃＤＮＡライブラリーを使用して反復し、そしてドライバーＤＮＡとして、上記正常肺組織ｃＤＮＡライブラリーならびに正常肝臓および心臓由来のｃＤＮＡライブラリー（上記のように各組織の１つのサンプルのプールから構築した）ならびに肺差引きＩおよびＩＩにて頻繁に回収された他の２０個のｃＤＮＡクローンを使用して反復した（肺差引きＩＩＩ）。正常肝臓および心臓のｃＤＮＡライブラリーは、１．７６×１０６個の独立コロニーを含み、１００％のクローンがインサートを有し、そして平均インサートサイズが１６００塩基対であった。さらなる１０個のクローンを単離した（配列番号６１〜７０）。上記のような遺伝子バンク中の配列とのこれらのｃＤＮＡ配列の比較は、配列番号６２および配列番号６７にて提供される配列に対して、何の有意な相同性も明らかにしなかった。配列番号６１、配列番号６３〜６６、配列番号６８および配列番号６９の配列が、以前に単離されたＥＳＴに対していくらかの相同性を示すことを見出し、そして配列番号７０にて提供される配列が、以前に同定されたラット遺伝子に対していくらかの相同性を示すことを見出した。
さらなる研究において、上記の差引き手順を、トレーサーＤＮＡとして、上記の肺扁平上皮細胞癌ｃＤＮＡライブラリーを使用して反復し、そしてドライバーＤＮＡとして、正常な肺、腎臓、結腸、膵臓、脳、休止ＰＢＭＣ、心臓、皮膚および食道のプール由来のｃＤＮＡライブラリーを使用して反復した。食道ｃＤＮＡが、このドライバー物質の１／３を構成した。食道は正常上皮細胞（分化した扁平上皮細胞を含む）が豊富なので、この手順は、組織特異的であるより腫瘍特異的である遺伝子を富化するようである。この差引きにて決定した４８個のクローンのｃＤＮＡ配列を、配列番号１７７〜２２４にて提供する。配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８７、配列番号１９２、配列番号１９５〜１９７、配列番号２０８、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１８、および配列番号２１９の配列は、以前に同定された遺伝子に対して、いくらかの相同性を示した。配列番号１７９、配列番号１８２、配列番号１８４〜１８６、配列番号１８８〜１９１、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９８〜２０７、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１７、配列番号２２０および配列番号２２４の配列は、以前に決定されたＥＳＴに対していくらかの相同性を示した。配列番号２２１〜２２３の配列は、以前に決定されたいずれの配列に対しても、何の相同性も示さなかった。
（Ｂ．肺腺癌ライブラリーからのｃＤＮＡ配列の単離）
ヒト肺腺癌ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、上記のように構築した。このライブラリーは、３．２×１０６個の独立コロニーを含み、１００％のクローンがインサートを有し、そして平均インサートサイズが１５００塩基対であった。ライブラリー差引きを上記のように実施し、ドライバーＤＮＡとして、上記の正常肺ｃＤＮＡ発現ライブラリーならびに正常肝臓および心臓のｃＤＮＡ発現ライブラリーを使用した。２，６００個の独立クローンを回収した。
１００個の独立クローンからの最初のｃＤＮＡ配列分析によって、多くのリボソームタンパク質遺伝子が明らかになった。この差引きにて単離した１５個のクローンについてのｃＤＮＡ配列を、配列番号７１〜８６にて提供する。上記のような遺伝子バンク中の配列とのこれらの配列の比較によって、配列番号８４にて提供される配列に対して何の有意な相同性も明らかにならなかった。配列番号７１、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７７、配列番号７８および配列番号８０〜８２の配列が、以前に単離されたＥＳＴに対していくらかの相同性を示すことを見出し、そして配列番号７２、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７９、配列番号８３、および配列番号８５の配列が、以前に同定されたヒト遺伝子に対していくらかの相同性を示すことを見出した。
さらなる研究において、ｃＤＮＡライブラリー（ｍｅｔｓ３６１６Ａと呼ぶ）を転移性肺腺癌から構築した。このライブラリーから無作為に配列決定した２５個のクローンの決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号２５５〜２７９にて提供する。ｍｅｔｓ３６１６Ａ ｃＤＮＡライブラリーを、正常肺、肝臓、膵臓、皮膚、腎臓、脳および休止ＰＢＭＣのプールから調製したｃＤＮＡライブラリーと対照して差引きした。この差引きの特異性を増加するために、ｍｅｔｓ３６１６Ａ ｃＤＮＡライブラリーにて最も豊富であると決定した遺伝子（例えば、ＥＦ１−α、インテグリン−βおよび抗凝固剤タンパク質ＰＰ４）ならびに差引き肺腺癌ｃＤＮＡライブラリーにて示差的に発現されることが以前に見出されたｃＤＮＡを、ドライバーに加えた。この差引きライブラリー（ｍｅｔｓ３６１６Ａ−Ｓ１と呼ぶ）から単離した５１個のクローンの決定されたｃＤＮＡ配列を、配列番号２８０〜３３０にて提供する。
公のデータベース中の配列との配列番号２５５〜３３０の配列の比較により、配列番号２５５〜２５８、配列番号２６０、配列番号２６２〜２６４、配列番号２７０、配列番号２７２、配列番号２７５、配列番号２７６、配列番号２７９、配列番号２８１、配列番号２８７、配列番号２９１、配列番号２９６、配列番号３００および配列番号３１０の配列に対して、何の有意な相同性も明らかにならなかった。配列番号２５９、配列番号２６１、配列番号２６５〜２６９、配列番号２７１、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７７、配列番号２７８、配列番号２８２〜２８５、配列番号２８８〜２９０、配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号２９７〜２９９、配列番号３０１、配列番号３０３〜３０９、配列番号３１３、配列番号３１４、配列番号３１６、配列番号３２０〜３２４、および配列番号３２６〜３３０の配列は、以前に同定された遺伝子配列に対して多少相同性を示したが、配列番号２８０、配列番号２８６、配列番号２９３、配列番号３０２、配列番号３１０、配列番号３１２、配列番号３１５、配列番号３１７〜３１９および配列番号３２５の配列は、以前に単離した発現された配列タグ（ＥＳＴ）に対して相同性を示した。
（実施例２）
（肺腫瘍ポリペプチドの組織特異性の決定）
遺伝子特異的プライマーを使用して、実施例１に記載される７つの代表的な肺腫瘍ポリペプチドについてのｍＲＮＡ発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、種々の正常組織および腫瘍組織にて試験した。
手短かには、総ＲＮＡを、上記のようなＴｒｉｚｏｌ試薬を使用して、種々の正常組織および腫瘍組織から抽出した。第１鎖合成を、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともに４２℃で１時間２μｇの総ＲＮＡを使用して、実行した。次いで、そのｃＤＮＡを、遺伝子特異的プライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。ＲＴ−ＰＣＲの半定量的性質を確実にするために、β−アクチンを、試験した組織の各々についての内部コントロールとして使用した。ｃＤＮＡの１：３０希釈物１μｌを使用して、β−アクチンテンプレートの線形範囲増幅を可能した。そしてこのｃＤＮＡの１：３０希釈物は、最初のコピー数での差異を反映するに十分感度が良かった。これらの条件を使用して、このβ−アクチンレベルを、各組織からの各逆転写反応について決定した。ＤＮＡ夾雑物を、ＤＮａｓｅ処理により、そして逆転写酵素を添加することなく調製した第１鎖ｃＤＮＡを使用する場合には、ネガティブなＰＣＲの結果を確実にすることによって、最小にした。
ｍＲＮＡ発現レベルを、５つの異なる型の腫瘍組織（３人の患者由来の肺扁平上皮細胞癌、肺腺癌、２人の患者由来の結腸腫瘍、乳房腫瘍および前立腺腫瘍）にて、ならびに１３個の異なる正常組織（４人のドナー由来の肺、前立腺、脳、腎臓、肝臓、卵巣、骨格筋、皮膚、小腸、胃、心筋層、網膜および精巣）にて試験した。１０倍量のｃＤＮＡを使用して、抗原ＬＳＴ−Ｓ１−９０（配列番号３）が、肺扁平上皮癌および乳房腫瘍において高レベルで発現され、そして試験した他の組織で低レベル〜検出不可能なレベルで発現されることを見出した。
抗原ＬＳＴ−Ｓ２−６８（配列番号１５）は、肺および乳房腫瘍に特異的であるようだが、発現を正常腎臓においてもまた検出した。抗原ＬＳＴ−Ｓ１−１６９（配列番号６）およびＬＳＴ−Ｓ１−１３３（配列番号５）は、肺組織（正常および腫瘍の両方）において非常に豊富であるようであり、これら２つの遺伝子の発現は、試験した正常組織のほとんどにおいて減少している。ＬＳＴ−Ｓ１−１６９およびＬＳＴ−Ｓ１−１３３の両方はまた、乳房腫瘍および結腸腫瘍において発現した。抗原ＬＳＴ−Ｓ１−６（配列番号７）およびＬＳＴ−Ｓ２−Ｉ２−５Ｆ（配列番号４７）は、腫瘍特異的発現または組織特異的発現を示さず、ＬＳＴーＳ１−２８の発現はまれであり、そして少数の組織でしか検出可能でなかった。抗原ＬＳＴ−Ｓ３−７（配列番号６３）は肺および乳房腫瘍特異的発現を示し、そのメッセージを、ＰＣＲを３０サイクル実施した場合に正常な精巣においてのみ検出した。より低レベルの発現を、サイクル数を３５回まで増加した場合にいくつかの正常組織にて検出した。抗原ＬＳＴ−Ｓ３−１３（配列番号６６）が、４つの肺腫瘍のうちの３つ、１つの乳房腫瘍および両結腸腫瘍サンプルにて発現されることを見出した。正常組織におけるその発現は、腫瘍と比較して低く、４つの正常肺組織のうちの１つ、ならびに腎臓、卵巣および網膜由来の正常組織でしか検出されなかった。抗原ＬＳＴ−Ｓ３−４（配列番号６２）およびＬＳＴ−Ｓ３−１４（配列番号６７）の発現はまれであり、そしていかなる組織特異性または腫瘍特異性も示さなかった。ノーザンブロット分析と一致して、抗原ＬＡＴ−Ｓ１−Ａ−１０Ａ（配列番号７８）に対するＲＴ−ＰＣＲの結果は、その発現が、肺組織、結腸組織、胃組織および小腸組織（肺腫瘍および結腸腫瘍を含む）において高いが、その発現は他の組織において低いかまたは検出不能であることを示唆した。
上記の肺減算Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩにて単離した合計２００２個のｃＤＮＡフラグメントを、コロニーＰＣＲ増幅し、そして肺腫瘍、正常肺、ならびに他の種々の正常組織および腫瘍組織におけるそれらのｍＲＮＡ発現レベルを、マイクロアレイ技術（Ｓｙｎｔｅｎｉ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用して決定した。手短かには、ＰＣＲ増幅産物をアレイの様式でスライド上に点で打ち、各産物がそのアレイ中で独自の位置を占めた。試験する組織サンプルからｍＲＮＡを抽出し、逆転写し、そして蛍光標識ｃＤＮＡプローブを作製した。このマイクロアレイをこの標識ｃＤＮＡプローブを用いてプローブし、スライドをスキャンし、そして蛍光強度を測定した。この強度は、ハイブリダイゼーション強度と相関する。１７個の非重複ｃＤＮＡクローンが肺扁平上皮細胞腫瘍での過剰発現を示し、試験した正常組織（肺、皮膚、リンパ節、結腸、肝臓、膵臓、乳房、心臓、骨髄、大腸、腎臓、胃、脳、小腸、膀胱および唾液腺）での発現は、検出不可能かまたは肺扁平上皮腫瘍と比較して１／１０のいずれかであった。クローンＬ５１３Ｓについて決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号８７および配列番号８８にて提供し；Ｌ５１４Ｓについて決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号８９および配列番号９０にて提供し；Ｌ５１６Ｓについて決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号９１および配列番号９２にて提供し；Ｌ５１７Ｓについて決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号９３にて提供し；Ｌ５１９Ｓについて決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号９４にて提供し；Ｌ５２０Ｓについて決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号９５および配列番号９６にて提供し；Ｌ５２１Ｓについて決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号９７および配列番号９８にて提供し；Ｌ５２２Ｓについて決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号９９にて提供し；Ｌ５２３Ｓについて決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号１００にて提供し；Ｌ５２４Ｓについて決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号１０１にて提供し；Ｌ５２５Ｓについて決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号１０２にて提供し；Ｌ５２６Ｓについて決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号１０３にて提供し；Ｌ５２７Ｓについて決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号１０４にて提供し；Ｌ５２８Ｓについて決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号１０５にて提供し；Ｌ５２９Ｓについて決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号１０６にて提供し；そしてＬ５３０Ｓについて決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号１０７および配列番号１０８にて提供する。さらに、Ｌ５３０Ｓについての全長ｃＤＮＡ配列を配列番号１５１にて提供し、対応するアミノ酸配列を配列番号１５２にて提供する。Ｌ５３０Ｓは、ｐ５３腫瘍サプレッサーホモログｐ６３のスプライス改変体に対して相同性を示す。ｐ６３の既知の７つのアイソフォームのｃＤＮＡ配列を、配列番号３３１〜３３７にて提供し、対応するアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号３３８〜３４４にて提供する。
多型に起因して、クローンＬ５３１Ｓは、２つの形態を有するようである。Ｌ５３１Ｓについて決定した第１の全長ｃＤＮＡ配列を配列番号１０９にて提供し、対応するアミノ酸配列を配列番号１１０にて提供する。Ｌ５３１Ｓについて決定した第２の全長ｃＤＮＡ配列を配列番号１１１にて提供し、対応するアミノ酸配列を配列番号１１２にて提供する。配列番号１１１の配列は、配列番号１０９の配列と同一であるが、例外として２７ｂｐの挿入を含む。同様に、Ｌ５１４Ｓは、２つの交互にスプライスされた形態を有し；第１の改変体ｃＤＮＡを配列番号１５３として列挙し、対応するアミノ酸配列を配列番号１５５にて提供する。Ｌ５１４Ｓ全長ｃＤＮＡの第２の改変体形態を配列番号１５４にて提供し、その対応するアミノ酸配列を配列番号１５６にて提供する。
Ｌ５２４Ｓ（配列番号１０１）についての全長クローニングは、それぞれ、配列番号１６５および配列番号１６６の対応するアミノ酸配列を伴った、２つの改変体（配列番号１６３および配列番号１６４）を生じた。両方の改変体は、甲状腺ホルモン関連ペプチドをコードすることが、示されている。
Ｌ５１９Ｓについての全長ｃＤＮＡを単離する試みは、配列番号１７３にて提供する伸長したｃＤＮＡ配列（１つの潜在的オープンリーディングフレームを含む）の単離を生じた。配列番号１７３の配列によりコードされるアミノ酸配列を、配列番号１７４にて提供する。さらに、配列番号１００のクローン（Ｌ５２３Ｓと呼ぶ）（既知の遺伝子）についての全長ｃＤＮＡ配列を、配列番号１７５にて提供し、対応するアミノ酸配列を配列番号１７６にて提供する。さらなる研究において、Ｌ５２３Ｓについての全長ｃＤＮＡ配列を、配列番号１７５の配列から設計した遺伝子特異的プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、Ｌ５２３Ｓ陽性腫瘍ｃＤＮＡライブラリーから単離した。決定した全長ｃＤＮＡ配列を、配列番号３４７にて提供する。この配列によりコードされるアミノ酸配列を、配列番号３４８にて提供する。このタンパク質配列は、２つのアミノ酸位置（すなわち、１５８位および４１０位）にて、以前に公開されたタンパク質配列と異なる。
上記のような、遺伝子バンク中の配列とのＬ５１４ＳおよびＬ５３１Ｓの配列（それぞれ、配列番号８７および配列番号８８、および配列番号１０９）の比較により、既知の配列に対して何の有意な相同性も明らかにならなかった。Ｌ５１３Ｓ、Ｌ５１６Ｓ、Ｌ５１７Ｓ、Ｌ５１９Ｓ、Ｌ５２０ＳおよびＬ５３０Ｓの配列（それぞれ、配列番号８７および配列番号８８、配列番号９１および配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５および配列番号９６、配列番号１０７および配列番号１０８）が、以前に同定されたＥＳＴに対していくらかの相同性を示すことを見出した。Ｌ５２１Ｓ、Ｌ５２２Ｓ、Ｌ５２３Ｓ、Ｌ５２４Ｓ、Ｌ５２５Ｓ、Ｌ５２６Ｓ、Ｌ５２７Ｓ、Ｌ５２８ＳおよびＬ５２９Ｓの配列（それぞれ、配列番号９７および配列番号９８、配列番号９９、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、および配列番号１０６）が、既知の遺伝子を示すことを見出した。Ｌ５２０Ｓについて決定した全長ｃＤＮＡ配列を配列番号１１３にて提供し、対応するアミノ酸配列を、配列番号１１４にて提供する。引き続くマイクロアレイ分析により、Ｌ５２０Ｓが、肺扁平上皮細胞腫瘍に加えて、乳房腫瘍においても過剰発現されることが示された。
さらなる分析は、Ｌ５２９Ｓ（配列番号１０６および１１５）、Ｌ５２５Ｓ（配列番号１０２および１２０）ならびにＬ５２７Ｓ（配列番号１０４）は、細胞骨格成分であり、そして潜在的に扁平上皮細胞特異的タンパク質であることを示した。Ｌ５２９Ｓは、コネキシン２６（ギャップ結合タンパク質）である。これは、肺扁平上皮腫瘍（９６８８Ｔとよぶ）において高度に発現し、そして他の２つにおいては中程度に過剰発現することを見出した。しかし、コネキシン２６のより低いレベルの発現はまた、正常な皮膚、結腸、肝臓および胃において検出可能である。いくつかの乳房腫瘍におけるコネキシン２６の過剰発現が報告されており、そしてＬ５２９Ｓの変異形態は、肺腫瘍において過剰発現を生じ得る。Ｌ５２５Ｓは、プラコフィリン（ｐｌａｋｏｐｈｉｌｉｎ）１、（皮膚の斑保有付着結合において見出されるデスモソームタンパク質）である。Ｌ５２５Ｓ ｍＲＮＡの発現レベルは、試験した４つの肺扁平上皮腫瘍のうち３つ、および正常な皮膚において非常に増大した。Ｌ５２７Ｓは、ケラチン６アイソフォーム、ＩＩ型５８Ｋｄケラチンおよびサイトケラチン１３と同定され、そして扁平上皮腫瘍において過剰発現を示し、そして正常な皮膚組織、乳房組織および結腸組織において低い発現を示す。特に、ケラチンおよびケラチン関連遺伝子は、ＣＹＦＲＡ２．１を含む肺癌の潜在的なマーカーとして広範に実証されてきた（Ｐａｓｔｏｒ，Ａ．ら、Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．，１０：６０３−６０９，１９９７）。Ｌ５１３Ｓ（配列番号８７および８８）は、試験されたいくつかの腫瘍組織において中程度の過剰発現を示し、そして尋常天然疱瘡抗原として最初に単離されたタンパク質をコードする。
Ｌ５２０Ｓ（配列番号９５および９６）およびＬ５２１Ｓ（配列番号９７および９８）は、肺扁平上皮腫瘍において高度に発現され、そしてＬ５２０Ｓは、正常な唾液腺において上方制御され、そしてＬ５２１Ｓは、正常な皮膚において過剰発現される。両方とも、プロリンリッチな小さいタンパク質のファミリーに属し、そして十分に分化した扁平上皮細胞に対してマーカーを示す。Ｌ５２１Ｓは、肺扁平上皮腫瘍に特異的なマーカーとして記載されている（Ｈｕ，Ｒ．ら、Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ，２０：２５−３０，１９９８）。Ｌ５１５Ｓ（配列番号１６２）は、ＩＧＦ−β２をコードし、そしてＬ５１６Ｓは、アルドースレダクターゼホモログである。両方とも肺扁平上皮腫瘍および正常な結腸において中程度に発現される。特に、Ｌ５１６Ｓ（配列番号９１および９２）は、転移性の腫瘍において上方制御されるが、原発性肺腺癌においては上方制御されず、これは転移（ｍｅｔａｔａｓｉｓ）および潜在的な予後マーカーにおけるその潜在的な役割の指標である。Ｌ５２２Ｓ（配列番号９９）は、肺扁平上皮腫瘍において中程度に過剰発現されるが、正常な組織においては最小限の発現である。Ｌ５２２Ｓは、クラスＩＶアルコールデヒドロゲナーゼ、ＡＤＨ７に属することが示されており、そしてその発現プロフィールはそれが扁平上皮細胞特異的抗原であることを示唆する。Ｌ５２３Ｓ（配列番号１００）は、肺扁平上皮腫瘍、ヒト膵臓癌細胞株および膵臓癌組織において中程度に過剰発現され、この遺伝子が膵臓癌と肺扁平上皮細胞癌との間の共通抗原であり得ることを示唆する。
Ｌ５２４Ｓ（配列番号１０１）は、試験した多くの扁平上皮腫瘍において過剰発現され、そして副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）と相同であり、これは悪性腫瘍（例えば、白血病、前立腺癌および乳癌）に関連する体液性高カルシウム血症を引き起こすことが最も良く知られている。ＰＴＨｒＰは、肺の扁平上皮癌に最も一般的に関連し、そしてまれに肺腺癌に関連することもまた考えられる（Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｌ．Ａ．ら、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１７８：３９８−４０１，１９９６）。Ｌ５２８Ｓ（配列番号１０５）は、２つの肺扁平上皮腫瘍において高度に過剰発現されるが、他の２つの扁平上皮腫瘍、１つの肺腺癌およびいくつかの正常な組織（皮膚、リンパ節、心臓、胃および肺を含む）において中程度に発現される。Ｌ５２８Ｓは、メラノサイト特異的遺伝子Ｐｍｅｌ１７の前駆体に似ているＮＭＢ遺伝子をコードし、これは、転移可能性の低い黒色腫細胞株において優先的に発現されることが報告されている。このことは、Ｌ５２８Ｓが、黒色腫および肺扁平上皮細胞癌の両方における共通抗原であり得ることを示唆する。Ｌ５２６Ｓ（配列番号１０３）は、試験されたすべての肺扁平上皮細胞腫瘍組織において過剰発現され、そして変異が、他の症状の中でも血管拡張性失調症（癌の素因を生じるヒトの遺伝的障害）を引き起こす遺伝子（ＡＴＭ）と相同性を共有することが示されてきた。ＡＴＭは、直接的な結合およびｐ５３分子のリン酸化を介してｐ５３媒介細胞周期チェックポイントを活性化するタンパク質をコードする。約４０％の肺癌が、ｐ５３変異に関連し、そしてＡＴＭの過剰発現は、ｐ５３機能の損失の補填の結果であることが推測されるが、過剰発現が、肺扁平上皮細胞癌の結果の原因であるかどうかは知られていない。さらに、Ｌ５２６Ｓ（ＡＴＭ）の発現はまた、転移において検出されるが、肺腺癌においては検出されず、転移における役割を示唆する。
Ｌ５２３Ｓ（配列番号１７５）の発現を、上記のようにリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって試験した。肺扁平上皮腫瘍のパネルを用いる第１の研究において、Ｌ５２３Ｓが、４／７の肺扁平上皮腫瘍、２／３の頭部および頸部扁平上皮腫瘍ならびに２／２の肺腺癌において発現され、骨格筋、軟口蓋および扁桃においては低レベルの発現が観察されることが見出された。肺腺癌パネルを用いる第２の研究において、Ｌ５２３Ｓの発現を、４／９の原発性腺癌、２／２の肺胸水、１／１の転移性肺腺癌および２／２の肺扁平上皮腫瘍において観察し、正常な組織においてはほとんど発現を観察しなかった。
肺腫瘍および種々の正常な組織におけるＬ５２３Ｓの発現もまた、ノーザンブロット分析によって標準的な技術を用いて試験した。第１の研究において、Ｌ５２３Ｓは、多くの肺腺癌および扁平上皮細胞癌腫、ならびに正常な扁桃において発現されることが見出された。正常な肺においては、発現が観察されなかった。Ｃｌｏｎｔｅｃｈからの正常な組織ブロット（ＨＢ−１２と称する）を用いる第２の研究においては、脳、骨格筋、結腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、肺またはＰＢＭＣにおいて発現が観察されなかったが、胎盤において強力な発現が存在した。
（実施例３）
（ＰＣＲに基づくサブトラクションによる肺腫瘍ポリペプチドの単離および特徴付け）
ｃＤＮＡサブトラクションライブラリー由来の８５７個のクローン（８つの正常なヒト組織ｃＤＮＡ（肺、ＰＢＭＣ、脳、心臓、腎臓、肝臓、膵臓および皮膚を含む）に対してサブトラクトされた２つのヒト肺扁平上皮腫瘍のプール由来のｃＤＮＡを含む）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を誘導し、第１回目のＰＣＲ増幅に供した。このライブラリーを、製造者のプロトコルに従って、第２回目のＰＣＲ増幅に供した。得られたｃＤＮＡフラグメントを、Ｐ７−Ａｄｖベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）にサブクローン化し、そしてＤＨ５α Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ）に形質転換した。ＤＮＡをそれぞれのクローンから単離し、そしてＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ Ｍｏｄｅｌ ３７３Ａを用いて配列決定した。
１６２個のポジティブクローンを配列決定した。上記のように、これらのクローンのＤＮＡ配列と、ＥＭＢＬおよびＧｅｎＢａｎｋデータベースにおけるＤＮＡ配列との比較は、これらのクローンのうちの１３に対して有意な相同性は示さず、この１３個のクローンを本明細書中以下、コンティグ１３、１６、１７、１９、２２、２４、２９、４７、４９、５６〜５９という。これらのクローンについての決定されたｃＤＮＡ配列は、配列番号１２５、１２７〜１２９、１３１〜１３３、１４２、１４４、１４８〜１５０および１５７においてそれぞれ提供される。コンティグ１、３〜５、７〜１０、１２、１１、１５、２０、３１、３３、３８、３９、４１、４３、４４、４５、４８、５０、５３、５４（それぞれ配列番号１１５〜１２４、１２６、１３０、１３４〜１４１、１４３、１４５〜１４７）は、先に同定されたＤＮＡ配列とある程度の相同性を示すことが見出された。コンティグ５７（配列番号１４９）は、米国特許出願第０９／１２３，９１２号（１９９８年７月２７日出願）において開示されるクローンＬ５１９Ｓ（配列番号９４）を示すことが見出された。本発明者らの知る限りにおいて、これらの配列が肺腫瘍において差次的に過剰発現されることは、以前に示されていなかった。
肺腫瘍組織、正常な肺組織（ｎ＝４）、休止ＰＢＭＣ、唾液腺、心臓、胃、リンパ節、骨格筋、軟口蓋、小腸、大腸、気管支、膀胱、扁桃、腎臓、食道、骨髄、結腸、副腎、膵臓および皮膚（すべてヒト由来）における代表的なクローンについてのｍＲＮＡ発現レベルは、上記のようにＲＴ−ＰＣＲによって決定した。マイクロアレイ技術を用いる発現レベルは、上記のように、他に示されない限り、各組織型の１つのサンプルにおいて試験した。
コンティグ３（配列番号１１６）は、試験したすべての頭部および頸部扁平上皮細胞腫瘍（１７／１７）で高度に発現され、そして多くの（８／１２）肺扁平上皮腫瘍において発現される（７／１２で高い発現、２／１２で中程度、そして２／１２において低い）が、２／４の正常な肺組織についてはネガティブの発現を示し、そして残る２つのサンプルにおいては低い発現を示すことが見出された。コンティグ３は、皮膚および軟口蓋において中程度の発現を示し、そして休止ＰＢＭＣ、大腸、唾液腺、扁桃、膵臓、食道、および結腸においては低下した発現レベルを示した。コンティグ１１（配列番号１２４）は、試験したすべての頭部および頸部扁平上皮細胞腫瘍（１７／１７）において発現され：１４／１７の腫瘍で高レベルで発現され、そして３／１７の腫瘍で中程度のレベルに発現されることが見出された。さらに、肺扁平上皮腫瘍における発現は、３／１２で高い発現および４／１２で中程度の発現を示した。コンティグ１１は、３／４の正常な肺サンプルについてはネガティブであり、残りのサンプルは、わずかに低い発現を有した。コンティグ１１は、唾液腺、軟口蓋、膀胱、扁桃、皮膚、食道および大腸に対して、低〜中程度の反応性を示した。コンティグ１３（配列番号１２５）は、試験したすべての頭部および頸部扁平上皮細胞腫瘍（１７／１７）において発現され：１２／１７で高度に発現され、そして５／１７で中程度に発現されることが見出された。コンティグ１３は、７／１２の肺扁平上皮腫瘍において発現され、４／１２で高度な発現、および３つのサンプル中で中程度の発現であった。正常な肺サンプルの分析は、２／４についてネガティブの発現を示し、そして残りの２つのサンプルにおいては、低〜中程度の発現を示した。コンティグ１３は、休止ＰＢＭＣ、唾液腺、膀胱、膵臓、扁桃、皮膚、食道および大腸に対して低〜中程度の反応性を、そして軟口蓋において高い発現を示した。その後に全長クローニングの努力によって、ｈＳｅｃ１０ｐ遺伝子の３’非翻訳領域に対するコンティング１３（Ｌ７６１Ｐとしても公知）マップが明らかになった。この遺伝子の全長配列を配列番号３６８に示し、そしてこの全長配列は、配列番号３６９に示すタンパク質をコードする。
コンティグ１６（配列番号１２７）は、いくつかの頭部および頸部扁平上皮細胞腫瘍（６／１７）および１つの肺扁平上皮腫瘍において中程度に発現されることが見出されたが；試験されたどの正常な肺サンプルにおいても発現を示さなかった。コンティグ１６は、休止ＰＢＭＣ、大腸、皮膚、唾液腺、および軟口蓋に対して低い反応性を示した。コンティグ１７（配列番号１２８）は、試験したすべての頭部および頸部扁平上皮細胞腫瘍（１７／１７）において発現される（５／１７で高度に発現され、そして１２／１７で中程度に発現される）ことが示された。肺扁平上皮腫瘍における発現レベルの決定は、高い発現を有する１つの腫瘍サンプルおよび中程度のレベルを有する３／１２のサンプルを示した。コンティグ１７は、２／４の正常な肺サンプルについてネガティブであり、残りのサンプルは、ごく低い発現のみを有した。さらに、低いレベルの発現が、食道および軟口蓋において見出された。コンティグ１９（配列番号１２９）は、試験したほとんどの頭部および頸部扁平上皮細胞腫瘍（１１／１７）において発現されることが見出され；２つのサンプルは高いレベルを有し、６／１７は、中程度の発現を示し、３／１７で低い発現が見出された。肺扁平上皮腫瘍における試験は、３／１２のサンプルにおける中程度の発現のみを示した。２／４の正常な肺サンプルにおける発現レベルはネガティブであり、他の２つのサンプルは、ごく低い発現を有した。コンティグ１９は、食道、休止ＰＢＭＣ、唾液腺、膀胱、軟口蓋および膵臓において低い発現レベルを示した。
コンティグ２２（配列番号１３１）は、試験されたほとんどの頭部および頸部の扁平上皮細胞腫瘍（１３／１７）において発現されることが示された（これらのサンプルの４つにおいて高い発現、６／１７において中程度の発現、および３／１７において低い発現を伴なう）。肺の扁平上皮腫瘍における発現レベルは、試験された３／１２組織について中程度〜高いレベルであることが見出された（２つの正常な肺サンプルにおいてネガティブな発現および２つの他のサンプルにおける低い発現を伴なう）（ｎ＝４）。コンティグ２２は、皮膚、唾液腺および軟口蓋において低い発現を示した。同様に、コンティグ２４（配列番号１３２）は、試験されたほとんどの頭部および頸部の扁平上皮細胞腫瘍（１３／１７）において発現されることが見出された（これらのサンプルのうちの３つにおいて高い発現、６／１７において中低度の発現、および４／１７において低い発現を伴なう）。肺の扁平上皮腫瘍における発現レベルは、試験された３／１２組織について中程度〜高いレベルであることが見出された（３つの正常な肺サンプルについてネガティブな発現および１つのサンプルにおける低い発現を伴なう）（ｎ＝４）。コンティグ２４は、皮膚、唾液腺および軟口蓋において低い発現を示した。コンティグ２９（配列番号１３３）は、試験されたほとんど全ての頭部および頸部の扁平上皮細胞腫瘍（１６／１７）において発現され、４／１７において高く発現され、１１／１７において中程度に発現され、１つのサンプルにおいて低い発現を伴なった。また、それは３／１２の肺の扁平上皮腫瘍において中程度に発現されたが、２／４の正常な肺サンプルについてはネガティブであった。コンティグ２９は、大腸、皮膚、唾液腺、膵臓、扁桃、心臓および軟口蓋において低い発現〜中程度の発現を示した。コンティグ４７（配列番号１４２）は、試験されたほとんどの頭部および頸部の扁平上皮腫瘍（１２／１７）において発現された（１０／１７において中低度の発現、および２つのサンプルにおいて低い発現）。肺の扁平上皮腫瘍において、それは、１つのサンプルにおいて高く発現され、そして２の他のサンプルにおいて中程度に発現された（ｎ＝１３）。コンティグ４７は、２／４の正常な肺サンプルについてネガティブであり、２つのサンプルが中程度の発現を有したままであった。また、コンティグ４７は、大腸および膵臓において中程度の発現を示し、そして皮膚、唾液腺、軟口蓋、胃、膀胱、休止ＰＢＭＣおよび扁桃において低い発現を示した。
コンティグ４８（配列番号１４３）は、試験された全ての頭部および頸部の扁平上皮細胞腫瘍（１７／１７）において発現され、８／１７において高く発現され、７／１７において中程度に発現され、２つのサンプルにおいて低い発現を有した。肺の扁平上皮腫瘍における発現レベルは、３つのサンプルにおいて高〜中程度であった（ｎ＝１３）。コンティグ４８は、４つの正常な肺サンプルのうちの１つについてネガティブであり、残りは、低いかまたは中程度の発現を示した。コンティグ４８は、軟口蓋、大腸、膵臓および膀胱において中程度の発現を示し、そして食道、唾液腺、休止ＰＢＭＣおよび心臓において低い発現を示した。コンティグ４９（配列番号１４４）は、試験された６／１７の頭部および頸部の扁平上皮細胞腫瘍において、低いレベル〜中低度のレベルにて発現された。肺の扁平上皮腫瘍における発現レベルは、３つのサンプルにおいて中程度であった（ｎ＝１３）。コンティグ４９は、２／４の正常な肺サンプルに対してネガティブであり、残りのサンプルは低い発現を示した。皮膚、唾液腺、大腸、膵臓、膀胱および休止ＰＢＭＣにおける中程度の発現レベルが示され、ならびに軟口蓋、リンパ節および扁桃において低い発現が示された。コンティグ５６（配列番号１４８）は、３／１７の試験された頭部および頸部の扁平上皮細胞腫瘍において低いレベル〜中低度のレベルで発現され、そして肺の扁平上皮腫瘍において、１３のサンプルのうちの３つが、低いレベル〜中程度のレベルを示した。特に、低い発現レベルが、１つの腺癌肺腫瘍サンプル（ｎ＝２）において検出された。コンティグ５６は、３／４の正常な肺サンプルについてネガティブであり、そして大腸においてのみ中程度の発現レベルを示し、そして唾液腺、軟口蓋、膵臓、膀胱および休止ＰＢＭＣにおいて低い発現を示した。コンティグ５８（Ｌ７６９Ｐとしても公知（配列番号１５０））は、試験された１１／１７の頭部および頸部の扁平上皮細胞腫瘍において中程度のレベルにて発現され、そして１つのさらなるサンプルにおいて低い発現が示された。肺の扁平上皮腫瘍における発現は、１３のサンプルのうち３つのサンプルにおいて低いレベル〜中程度のレベルを示した。コンティグ５８は、３／４の正常な肺サンプルについてネガティブであった（１つのサンプルは、低い発現を有した）。皮膚、大腸および休止ＰＢＭＣにおける中程度の発現レベルを実証し、ならびに唾液腺、軟口蓋、膵臓および膀胱における低い発現を実証した。コンティグ５９（配列番号１５７）は、いくつかの頭部、頸部および肺の扁平上皮腫瘍において発現された。コンティグ５９の低いレベルの発現がまた、唾液腺および大腸において検出された。
Ｌ７６３Ｐとしても言及されるコンティグ２２についての全長ｃＤＮＡ配列を、配列番号１５８において提供する（対応するアミノ酸配列を配列番号１５９において提供する）。Ｌ７６３ＰのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析は、これが３／４の肺扁平上皮腫瘍ならびに４／４の頭部および頸部扁平上皮腫瘍において高く発現され、正常の脳、皮膚、軟口蓋および気管において低いレベルの発現が観察されることを明らかにした。引き続くデータベース検索は、配列番号１５８の配列が変異を含み、対応するタンパク質配列においてフレームシフトを生じていることを明らかにした。Ｌ７６３Ｐについての第２のｃＤＮＡ配列が配列番号３４５において提供され、対応するアミノ酸配列は、配列番号３４６において提供される。配列番号１５９および３４６の配列は、配列番号１５９のＣ末端の３３個のアミノ酸以外は、同一である。
Ｌ７６２Ｐとして言及されるコンティグ１７、１９および２４を組込んだ全長ｃＤＮＡ配列を、配列番号１６０において提供し、対応するアミノ酸配列を配列番号１６１に提供する。Ｌ７６２Ｐのさらなる分析は、これがＩ型膜タンパク質であることを決定し、そして２つのさらなる改変体を配列決定した。改変体１（配列番号１６７、配列番号１６９における対応するアミノ酸配列を有する）は、配列番号１６０の選択的スプライシングされた形態であり、５０３個のヌクレオチドの欠失、ならびに発現されるタンパク質の短いセグメントの欠失を生じる。改変体２（配列番号１６８、配列番号１７０における対応するアミノ酸配列を有する）は、配列番号１６０と比較して３’コード領域における２個のヌクレオチド欠失を有し、発現されるタンパク質の分泌形態を生じる。Ｌ７６２ＰのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析は、３／４の肺扁平上皮腫瘍および４／４の頭部および頸部の腫瘍において過剰発現され、低いレベルの発現が、正常な皮膚、軟口蓋および気管において観察されるということを明らかにした。
Ｌ７６２Ｐのエピトープを、配列ＫＰＧＨＷＴＹＴＬＮＮＴＨＨＳＬＱＡＬＫ（配列番号３８２）（これは、配列番号１６１のアミノ酸５７１〜５９０に対応する）を有するとして同定された。
Ｌ７７３Ｐとしても言及されるコンティグ５６（配列番号１４８）についての全長ｃＤＮＡ配列が、配列番号１７１において提供され、配列番号１７２のアミノ酸配列を伴う。Ｌ７７３Ｐは、ジヒドロキシルデヒドロゲナーゼとその遺伝子の３’部分において同一であることが見出された（互いに異なる５’配列を有する）。結果として、その６９個のＮ末端アミノ酸は独特である。その６９個のＮ末端アミノ酸をコードするｃＤＮＡ配列が、配列番号３４９において提供され、Ｎ末端アミノ酸配列が配列番号３５０において提供される。リアルタイムＰＣＲは、Ｌ７７３Ｐが、正常な組織において検出可能な発現を伴わずに、肺扁平上皮腫瘍および肺の腺癌において高度に発現されるということを明らかにした。引き続くＬ７７３Ｐのノーザンブロット分析は、この転写物が、扁平上皮腫瘍において示差的に過剰発現されるということ、そして原発性の肺腫瘍組織においておよそ１．６Ｋｂおよび原発性の頭部および頸部腫瘍組織においておよそ１．３Ｋｂにて検出されることを実証した。
引き続くマイクロアレイ分析は、Ｌ７６９Ｓ（配列番号１５０）としても言及されるコンティグ５８が、肺の扁平上皮腫瘍に加えて乳房腫瘍において過剰発現されることを示した。
（実施例４）
（ＰＣＲに基づくサブトラクションによる肺腫瘍ポリペプチドの単離および特徴付け）
ｃＤＮＡサブトラクションライブラリー由来の７６０のクローン（９つの正常なヒト組織ｃＤＮＡ（皮膚、結腸、肺、食道、脳、腎臓、脾臓、膵臓、および肝臓を含む）のプールに対してサブトラクトされた２つのヒト肺原発性腺腫のプール由来のｃＤＮＡを含む）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を誘導し、第１回目のＰＣＲ増幅に供した。このライブラリー（ＡＬＴ−１と称する）を、製造者のプロトコルに従って、第２回目のＰＣＲ増幅に供した。肺腫瘍、正常肺、ならびに種々の他の正常な組織および腫瘍組織におけるこれら７６０個のｃＤＮＡクローンの発現レベルを、マイクロアレイ技術（Ｉｎｃｙｔｅ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて調べた。簡単に言うと、ＰＣＲ増幅産物を、アレイフォーマットにてスライドガラス上にドットし、各生成物がそのアレイにおいて特有の位置を占める。ｍＲＮＡを試験される組織サンプルから抽出し、逆転写させ、そして蛍光標識したｃＤＮＡプローブを生成する。マイクロアレイを、標識ｃＤＮＡプローブを用いてプローブし、そのスライドガラスをスキャンし、そして蛍光強度を測定した。この強度は、ハイブリダイゼーション強度と相関する。総数１１８個のクローンのうち５５個が特有であり、肺腫瘍組織において過剰発現することが見出され、試験した正常組織（肺、皮膚、リンパ節、結腸、肝臓、膵臓、胸部、心臓、骨髄、大腸、腎臓、胃、脳、小腸、膀胱および唾液腺）における検出は、いずれも検出不可能であるか、または非常に低いレベルであるかのいずれかであった。これらのクローンのうちの１つ（配列番号４２０に提供される配列を有する（クローン番号１９０１４））が、以前に同定されたクローンのＬ７７３Ｐと相同性を示す。クローンＬ７７３Ｐは、配列番号１７１に提供される全長ｃＤＮＡ配列および配列番号１７２に提供されるアミノ酸配列を有する。クローン番号１９０１４の単離もまた、同時係属中の米国特許出願０９／２８５，４７９（１９９９年４月２日出願）に記載される。
（実施例５）
（ポリペプチドの合成）
ポリペプチドは、ＨＰＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）活性化を伴うＦＭＯＣ化学反応を使用するＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ４３０Ａペプチドシンセサイザー上で合成され得る。Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ配列は、結合体化、固定された表面への結合、またはペプチドの標識化の方法を提供するためにそのペプチドのアミノ末端に付着され得る。固体支持体からのそのペプチドの切断は、以下の切断混合物を使用して実施され得る：トリフルオロ酢酸：エタンジチオール：チオアニソール：水：フェノール（４０：１：２：２：３）。２時間の切断の後、そのペプチドを、冷却メチル−ｔ−ブチル−エーテル中で沈殿させる。次いで、そのペプチドペレットを０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する水の中に溶解し、そしてＣ１８逆相ＨＰＬＣによる精製の前に凍結乾燥する。水中（０．１％ＴＦＡ含有）０％〜６０％のアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の勾配を使用して、ペプチドを溶出させ得る。純粋な画分の凍結乾燥後、そのペプチドを、エレクトロスプレーもしくは他の型の質量分析法を使用し、そしてアミノ酸分析によって特徴付ける。
（実施例６）
（肺癌抗原に対する抗体の調製）
肺癌抗原Ｌ５１４Ｓ、Ｌ５２８ＳおよびＬ５３１Ｓ、Ｌ５２３およびＬ７７３Ｐ（それぞれ、配列番号１５５、２２５、１１２、１７６および１７１）に対するポリクローナル抗体を以下のように調製した。
下記のようなＥ．ｃｏｌｉにおいて発現されて、そして精製された組換えタンパク質を用いて、ウサギを免疫した。初期の免疫のために、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）と結合された４００μｇの抗原を皮下注射した（Ｓ．Ｃ．）。４週後、動物を、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と共に混合された２００μｇの抗原を用いてＳ．Ｃ．でブーストした。高い抗体力価応答を誘導するために必要であるように、ＩＦＡと混合された１００μｇの抗原の引き続くブーストをＳ．Ｃ．で注射した。免疫されたウサギからの血清出血物を、精製されたタンパク質を用いるＥＬＩＳＡアッセイを使用して、抗原特異的反応性について試験した。Ｌ５１４Ｓ、Ｌ５２８Ｓ、Ｌ５３１Ｓ、Ｌ５２３ＳおよびＬ７７３Ｐに対するポリクローナル抗体を、固体支持体に付着した精製されたタンパク質を使用して、高力価ポリクローナル血清からアフィニティー精製した。
Ｌ５１４Ｓに対するポリクローナルを使用する免疫組織化学的分析を、５つの肺腫瘍サンプル、５つの正常肺組織サンプルおよび正常結腸、腎臓、肝臓、脳および骨髄のパネル上で実施した。詳細には、組織サンプルをホルマリン溶液中で２４時間固定し、そしてパラフィン中に包理し、次いで１０ミクロンの切片にスライスした。組織切片を透過化処理し、そして抗体と共に１時間インキュベートした。ＨＲＰ標識した抗マウスを次にＤＡＢ色素原とともにインキュベーションし、Ｌ５１４Ｓ免疫反応性を可視化するために使用した。Ｌ５１４Ｓは、肺腫瘍組織において高く発現されることが見出された（正常な肺、脳または骨髄においては発現がほとんど観察されないか、または全く観察されない）。光染色を、結腸（上皮陰窩細胞陽性）および腎臓（細管陽性）において観察した。染色は正常な肝臓において観察されたが、この組織においてｍＲＮＡは検出されなかったので、この結果は疑わしい。
同じ手順を用いて、Ｌ５２８Ｓに対するポリクローナル抗体を用いた免疫組織学的分析は、肺腫瘍サンプルおよび正常肺サンプルにおける染色、結腸および腎臓における光染色を実証し、そして肝臓および心臓に染色がなかった。
Ｌ５３１Ｓに対するポリクローナル抗体を用いた免疫組織学的分析は、肺腫瘍サンプルにおける染色、ほとんどの正常肺サンプルにおける光膜染色、結腸における上皮染色、腎臓における細管染色、肝臓における導管上皮染色を実証し、そして心臓に染色がなかった。
Ｌ５２３Ｓに対するポリクローナル抗体を用いた免疫組織学的分析は、試験した全ての肺腫瘍サンプルにおける染色を実証したが、正常な肺、腎臓、肝臓、結腸、骨髄または小脳に染色はなかった。
Ｌ７６２Ｐ（配列番号１６９および１７０）に対するポリクローナル抗血清の生成を以下のように実行した。４００μｇの肺抗原を１００μｇのムラミルペプチド（ＭＤＰ）とあわせた。等量の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を添加し、次いで乳濁液が形成されるまで混合した。ウサギを、皮下注射した（Ｓ．Ｃ．）。４週間後、その動物を、等量のＩＦＡと混合した２００μｇの抗原でＳ．Ｃ．注射した。４週間毎にその動物を、１００μｇの抗原を用いてブーストした。各ブーストの７日後に、その動物から採血した。血清を、その血液を４℃で１２〜２４時間インキュベートし、続いて、遠心分離することによって生成した。
ポリクローナル抗血清の特徴づけを、以下のように実行した。９６ウェルプレートを、抗原５０μｌ（代表的に、１μｇ）を４℃で２０時間インキュベートすることによってコーティングした。２５０μｌのＢＳＡブロッキング緩衝液をこのウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ／０．０１％ Ｔｗｅｅｎを用いて６回洗浄した。ウサギ血清をＰＢＳを用いて希釈し、そして５０μｌの希釈血清を各ウェルに添加し、そして室温で３０分間インキュベートした。プレートを、上記のように洗浄し、その後、５０μｌの１：１００００希釈のヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を添加し、そして室温で３０分間インキュベートした。プレートを、上記のように洗浄し、そして１００μｌのＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを各ウェルに添加した。暗闇で室温にて１５分間インキュベートした後、比色反応を１００μｌの１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を用いて停止し、４５０ｎｍにて直に読み取った。抗血清は、抗原Ｌ７６２Ｐに対する強力な反応性を示した。
Ｌ７６２Ｐに対するポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学分析は、試験した全ての肺癌サンプルにおける染色、正常な肺の気管支上皮におけるいくつかの光染色、腎臓における細管染色、結腸における光上皮染色を実証し、そして心臓または肝臓には染色がなかった。
種々の組織におけるＬ７７３Ｐタンパク質発現を評価するために、免疫組織化学（ＩＨＣ）分析を、アフィニティー精製したＬ７７３Ｐポリクローナル抗体を用いて実行した。簡単に言うと、組織サンプルをホルマリン溶液で１２〜２４時間固定し、そしてパラフィン中に包理し、次いで８ミクロンの切片にスライスした。クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中での蒸気加熱誘導性エピトープ修復（ｓｔｅａｍ ｈｅａｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）（ＳＨＩＥＲ）を、最適染色条件のために使用した。切片を１０％ 血清／ＰＢＳを用いて５分間インキュベートした。一次抗体を各切片に２５分間示された濃度にて添加し、続いて、抗ウサギビオチン化抗体または抗マウスビオチン化抗体のいずれかを用いて２５分間インキュベートした。内因性ペルオキシダーゼ活性を、過酸化水素と共に３回１．５分間インキュベートすることによってブロックした。アビジンビオチン複合体／西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＡＢＣ／ＨＲＰ）系をＤＡＢ色素原と共に使用して、Ｌ７７３Ｐ発現を可視化した。スライドガラスを、ヘマトキシリンを用いて対比染色し、細胞核を可視化した。このアプローチを用いて、Ｌ７７３Ｐタンパク質を、６／８肺腫瘍サンプル、４／６正常肺サンプル（いくつかの場合、高い光染色）、１／１腎臓サンプル（高い光染色）、０／１心臓サンプル、１／１結腸サンプル（高い光染色）および０／１肝臓サンプルにおいて検出した。
（実施例７：マウスを初回抗原刺激するペプチドおよびＣＴＬ株の増殖）
ＨＬＡ−Ａ２／Ｋｂ拘束されたＣＤ８＋Ｔ細胞に対する肺癌抗原Ｌ７６２Ｐ（配列番号１６１）からの免疫原性ペプチドを以下のように同定した。
肺癌抗原Ｌ７６２Ｐ（配列番号１６１）内のＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドの位置を、おそらくＨＬＡ−Ａ＊０２０１に対するペプチド配列を予測するコンピュータプログラムを用いて、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１についての公知のペプチド結合モチーフに対して適合させることによって予測した（Ｒｕｐｅｒｔら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７４：９２９；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４１：１７８−２２８）。推定されたＨＬＡ−Ａ＊０２０１結合ペプチドの選択されたサブセットに対応する一連の１９個の合成ペプチドを上記のように調製した。
ヒトＨＬＡ Ａ２／Ｋｂについての導入遺伝子を発現するマウス（Ｄｒ Ｌ．Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡにより提供された）を、Ｔｈｅｏｂａｌｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１１９９３−１１９９７，１９９５に記載されるように、以下の改変を伴って、合成ペプチドで免疫した。マウスを、不完全フロイントアジュバント中に乳化した、５０μｇのＬ７２６Ｐペプチドおよび１２０μｇの、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質由来のＩ−Ａｂ結合ペプチドで免疫した。３週間後、これらのマウスを屠殺し、そして単一の細胞懸濁物を調製した。次いで、細胞を、７×１０６細胞／ｍｌで完全培地（以下を含むＲＰＭＩ−１６４０；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ：１０％ ＦＣＳ、２ｍＭ グルタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、２×１０−５Ｍ ２−メルカプトエタノール、５０Ｕ／ｍｌ ペニシリンおよびストレプトマイシン）中に再懸濁し、そして以下の存在下で培養した：照射（３０００ラド）Ｌ７６２Ｐペプチド−（５μｇ／ｍｌ）および１０ｍｇ／ｍｌ Ｂ２−ミクログロブリン−（３μｇ／ｍｌ）ＬＰＳ ブラスト（ｂｌａｓｔ）（７μｇ／ｍＬ 硫酸デキストランおよび２５μｇ／ｍｌ ＬＰＳの存在下で３日間培養したＡ２トランスジェニック脾臓細胞）。６日後、細胞（５×１０５／ｍｌ）を、以下を用いて、再度刺激した：２．５×１０６／ｍｌペプチドパルス刺激した（２０，０００ラド）ＥＬ４Ａ２Ｋｂ細胞（Ｓｈｅｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：８１５−８１８，１９９２）および５×１０６／ｍｌ照射した（３０００ラド）Ａ２／Ｋｂトランスジェニック脾臓フィーダー細胞。細胞を、１０Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２の存在下で培養した。細胞を、その株をクローニングするための調製において記載されるように１週間ごとに再刺激した。
ペプチド特異的な細胞株を、照射された（２０，０００ラド）Ｌ７６２ＰペプチドパルスしたＥＬ４Ａ２Ｋｂ腫瘍細胞（１×１０４細胞／ウェル）を刺激因子として、および１０Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２存在下で増殖した照射された（３０００ラド）Ａ２Ｋｂトランスジェニック脾臓細胞をフィーダー（５×１０５細胞／ウェル）として用いて、限界希釈分析によってクローニングした。７日目に、細胞を参照のこと前回のように再刺激した。１４日目に、増殖しつつあるクローンを単離し、そして培養物中で維持した。
ペプチドＬ７６２Ｐ−８７（配列番号２２６、配列番号１６１のアミノ酸８７〜９５に対応する）、Ｌ７２６Ｐ−１４５（配列番号２２７；配列番号１６１のアミノ酸１４５〜１５３に対応する）、Ｌ７２６Ｐ−５８５（配列番号２２８；配列番号１６１のアミノ酸５８５〜５９３に対応する）、Ｌ７６２Ｐ−４２５（配列番号２２９、配列番号１６１のアミノ酸４２５〜４３３に対応する）、Ｌ７６２Ｐ（１０）−４２４（配列番号２３０；配列番号１６１のアミノ酸４２４〜４３３に対応する）およびＬ７６２Ｐ（１０）−４５８（配列番号２３１；配列番号１６１のアミノ酸４５８〜４６７に対応する）に対して特異的な細胞株は、Ｌ７６２ＰペプチドパルスされたＥＬ４−Ａ２／Ｋｂ腫瘍標的細胞に対して、コントロールペプチドパルスしたＥＬ４−Ａ２／Ｋｂ腫瘍標的細胞よりも有意により高い反応性を示した（特異的溶解のパーセントで測定される場合）。
（実施例８：肺癌抗原Ｌ７６２Ｐに由来するＣＤ４免疫原性Ｔ細胞エピトープの同定）
抗原Ｌ７６２Ｐ（配列番号１６１）について特異的なＣＤ４ Ｔ細胞株を以下のように生成した。
一連の２８の重複するペプチドを合成し、これらのペプチドは、Ｌ７６２Ｐ配列のおよそ５０％にわたる。初回抗原刺激のために、ペプチドを、４〜５のペプチドのプールと併せ、２０μｇ／ｍｌで樹状細胞を２４時間にわたって刺激した。次いで、この樹状細胞を洗浄し、そして９６ウェルのＵ底プレート中のポジティブで選択されたＣＤ４＋Ｔ細胞と混合した。４０の培養物を、各ペプチドプールについて生成した。培養物を、ペプチドプールが負荷された新鮮な樹状細胞を用いて１週間おきに再刺激した。合計３回の刺激サイクルの後、細胞を、さらに１週間にわたって静止させ、そしてインターフェロンγＥＬＩＳＡおよび増殖アッセイを用いて、ペプチドプールでパルス刺激された抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対する特異性について試験した。これらのアッセイについて、関連するペプチドプールまたは無関連のペプチドのいずれかが負荷された接着性単球をＡＰＣとして用いた。サイトカイン放出および増殖の両方によって、Ｌ７６２Ｐペプチドプールを特異的に認識するようであるＴ細胞株を、各プールについて同定した。強調を、増殖応答を有するＴ細胞を同定する際に配置した。Ｌ７６２Ｐ特異的サイトカイン分泌および増殖の両方、または強力な増殖のみのいずれかを示したＴ細胞株を、さらに拡張して、そのプールからの個々のペプチドの認識について試験し、そして、組換えＬ７６２Ｐの認識について試験した。組換えＬ７６２Ｐの供給源はＥ．ｃｏｌｉであり、そしてその材料を、部分的に精製し、そしてそれはエンドトキシンポジティブであった。これらの研究は、１０μｇの個々のペプチド、１０または２μｇの無関連のペプチド、およびＬ７６２Ｐタンパク質または無関連の等価に不純であるＥ．ｃｏｌｉが産生した組換えタンパク質のいずれかを２μｇもしくは０．５μｇで用いた。顕著なインターフェロンγ産生およびＣＤ４ Ｔ細胞増殖が、各プールにおいて、多数のＬ７６２Ｐ由来ペプチドによって誘導された。これらのペプチドについてのアミノ酸配列を、配列番号２３２から２５１に提供する。これらのペプチドは、それぞれ、配列番号１６１の以下のアミノ酸に対応する：６６１〜６８０、６７６〜６９６、５２６〜５４５、８７４〜８９３、８１１〜８３０、８７１〜８９１、８５６〜８７５、８２６〜８４５、７９５〜８１５、７３６〜７５５、７０６〜７２５、７０６〜７２５、６９１〜７１０、６０１〜６２０、５７１〜５９０、５５６〜５７５、６１６〜６３５、６４６〜６６５、６３１〜６５０、５４１〜５６０および５８６〜６０５。
Ｌ７６２Ｐに由来する個々のペプチドに対する特異性を示したＣＤ４ Ｔ細胞株を、１０μｇ／ｍｌの関連ペプチドでの刺激によってさらに拡張した。刺激後２週間で、Ｔ細胞株を、増殖アッセイおよびＩＦＮ−γＥＬＩＳＡアッセイの両方を用いて、特異的ペプチドの認識について試験した。多数のこれまでに同定されたＴ細胞は、Ｌ７６２Ｐペプチド比活性を継続して示した。これらの株の各々を、関連ペプチドにおいてさらに拡張し、そして拡張後２週間で、滴定実験におけるＬ７６２Ｐペプチドの特異的認識について、および組換えＥ．ｃｏｌｉ由来Ｌ７６２Ｐタンパク質の認識について試験した。これらの実験について、自己接着性単球を、関連Ｌ７６２Ｐ由来ペプチド、ガンマグロビン（ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ）由来ペプチド、組換えＥ．ｃｏｌｉ由来Ｌ７６２Ｐ（およそ５０％純粋）、または無関連のＥ．ｃｏｌｉ由来タンパク質のいずれかを用いてパルス刺激した。Ｔ細胞株の殆どは、関連ペプチドについて低親和性を示すことが見出された。なぜなら、特異的増殖およびＩＦＮγの比が、Ｌ７６２Ｐペプチドが希釈されるにつれ劇的に減少したからである。しかし、４つの株が０．１μｇ／ｍｌペプチドでさえ有意な活性を示すことが同定された。これらの株の各々（Ａ／Ｄ５、Ｄ／Ｆ５、Ｅ／Ａ７ および Ｅ／Ｂ６と称する）はまた、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＬ７６２Ｐタンパク質調製物に応答して特異的に増殖するようであったが、無関連のタンパク質調製物に応答しては増殖しないようであった。これらの株によって認識されるＬ７６２Ｐ由来ペプチドのアミノ酸配列を、配列番号２３４、２４９、２３６および２４５にそれぞれ提供する。ＩＦＮ−γ特異的なタンパク質は、どの株についても検出されなかった。Ａ／Ｄ５、Ｅ／Ａ７およびＥ／Ｂ６の株を、０．１μｇ／ｍｌ（Ａ／Ｄ５およびＥ／Ａ７）または１μｇ／ｍｌ（Ｄ／Ｆ５）の関連ペプチドでパルス刺激した自己接着性単球においてクローニングした。増殖後、クローンを、関連ペプチドに対する特異性について試験した。関連ペプチドに対して特異的な多数のクローンを、株Ａ／Ｄ５およびＥ／Ａ７について同定した。
（実施例９）
（肺腫瘍特異的抗原のタンパク質発現）
（ａ）Ｅ．ｃｏｌｉでのＬ５１４Ｓの発現）
肺腫瘍抗原Ｌ５１４Ｓ（配列番号８９）を、発現ベクターｐＥ３２ｂのＮｃｏＩ部位およびＮｏｔＩ部位にサブクローン化し、そして標準的な技術を使用してＥ．ｃｏｌｉの中に形質転換した。タンパク質を、配列番号８９の残基３〜１５３について発現した。発現されたアミノ酸配列および対応するＤＮＡ配列を、それぞれ配列番号２５２および２５３に与える。
（ｂ）Ｌ７６２Ｐの発現）
６×ヒスタグ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）を有する、肺腫瘍抗原Ｌ７６２Ｐ（配列番号１６１）のアミノ酸３２〜９４４を、カナマイシン耐性を用いて、改変されたｐＥＴ２８発現ベクターにサブクローンし、そして標準的な技術を用いてＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ中に形質転換した。低いレベルから中レベルの発現を、観察した。Ｌ７６２Ｐ発現構築物の決定されたＤＮＡ配列を、配列番号２５４に与える。
（実施例１０）
（Ｌ７６２Ｐペプチド特異的応答に対するＭＨＣクラスＩＩ制限対立遺伝子の同定）
ＨＬＡ不適合抗原提示細胞（ＡＰＣ）のパネルを使用して、Ｌ７６２ＰペプチドおよびＬ７６２Ｐ組換えタンパク質を認識した株に由来するＣＤ４ Ｔ細胞クローンのＬ７６２ペプチド特異的応答に対するＭＨＣクラスＩＩ制限対立遺伝子を同定した。ＡＤ−５およびＥＡ−７の２つの株由来のクローンを、以下に記載するように試験した。ＡＤ−５由来クローンが、ＨＬＡ−ＤＲＢ−１１０１対立遺伝子によって制限されることを見出し、そして、ＥＡ−７由来クローンが、ＨＬＡ ＤＲＢ−０７０１対立遺伝子またはＤＱＢ１−０２０２対立遺伝子によって制限されることを見出した。制限対立遺伝子の同定は、関連するクラスＩＩ対立遺伝子を発現する個体に対する、規定されたペプチドを使用するワクチン治療のターゲッティングを可能にする。関連する制限対立遺伝子についての知識はまた、関連する対立遺伝子を発現する個体のみを、モニタするので、規定されたペプチドに対する応答についての臨床上のモニタリングを可能とする。
ＡＤ−５およびＥＡ−７株由来のＣＤ４ Ｔ細胞クローンを、１０μｇ／ｍｌの特定のペプチドをパルスした自己ＡＰＣ上で刺激し、そして自己ＡＰＣ（ドナーＤ７２由来）の認識ならびにクラスＩＩ対立遺伝子のＤ７２と部分的にマッチしたＡＰＣのパネルに対して試験した。表２は、試験したＡＰＣのＨＬＡクラスの分類を示す。Ｄ４５、Ｄ１８７、Ｄ２０８およびＤ３２６と呼ばれる、４つの異なるドナーに由来する接着単球（２時間の接着により生じた）を、これらの実験においてＡＰＣとして使用した。自己由来のＡＰＣは、実験には含めなかった。ＡＰＣの各々に、１０μｇ／ｍｌの関連するペプチドを（ＡＤ−５に対して５ａおよび３Ａ−７に対して３ｅ）、または無関係なマモグロビン（ｍａｍｍｏｇｌｏｂｉｎ）ペプチドでパルスし、そして培養を、１ウェル当たり１０，０００個のＴ細胞および約２０，０００個のＡＰＣについて樹立した。表３に示されるように、部分的にマッチしたドナー細胞をＡＰＣとして使用した場合にのみ、特定の増殖およびサイトカインの産生を検出し得た。ＭＨＣ分類分析に基づいて、これらの結果は、ＡＤ−５由来クローンのＬ７６２特異的応答についての制限対立遺伝子が、ＨＬＡ−ＤＲＢ−１１０１であり、そしてＥＡ−７由来クローンについての制限対立遺伝子が、ＨＬＡ ＤＲＢ−０７０１またはＤＱＢ１−０２０２であることを、強く示唆する。
Figure 0004180919
Figure 0004180919
 （実施例１１）
（Ｌ７６３ＰのＮ−末端部分およびＣ−末端部分の融合タンパク質）
別の実施形態において、Ｒａ１２と呼ばれる、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のポリヌクレオチドを、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも免疫原性部分に連結する。Ｒａ１２組成物およびこれらを異種のポリヌクレオチド配列の発現増強に使用するための方法は、米国特許出願６０／１５８，５８５に記載され、その開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。簡単に言うと、Ｒａ１２とは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓｉｓ ＭＴＢ３２Ａ核酸の部分列であるポリヌクレオチド領域のことをいう。ＭＴＢ３２Ａは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの毒性株および非毒性株の遺伝子によってコードされる３２ＫＤの分子量のセリンプロテアーゼである。ＭＴＢ３２Ａのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、記載されている（例えば、米国特許出願６０／１５８，５８５；Ｓｋｗｉｋｙら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ．（１９９９）６７：３９９８−４００７もまた参考のこと、これらは本明細書中に参考として援用される）。驚くべきことに、ＭＴＢ３２Ａコード配列の１４ＫＤのＣ末端フラグメントは、そのままで高レベル発現し、そして、精製過程全体を通して、タンパク質は可溶性のままであることが発見された。さらに、このフラグメントは、それが融合されることにより異種抗原ポリペプチドの免疫原性を増強し得る。このＭＴＢ３２Ａの１４ＫＤ Ｃ末端フラグメントは、本明細書中でＲａ１２とよばれ、そしてＭＴＢ３２Ａのアミノ酸残基１９２〜３２３のいくつかまたは全てを含むフラグメントを表す。
Ｒａ１２ポリペプチドおよび目的の異種肺腫瘍ポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする組換え核酸は、従来の遺伝子工学技術によって、容易に構築され得る。組換え核酸を、好ましくはＲａ１２ポリヌクレオチド配列が、選択された異種肺腫瘍ポリヌクレオチド配列の５’側に位置するように構築する。Ｒａ１２ポリヌクレオチド配列を、選択された異種ポリヌクレオチド配列の３’側に配置することまたは異種ポリヌクレオチド配列をＲａ１２ポリヌクレオチド配列の範囲内の部位に挿入することもまた適切であり得る。
さらに、Ｒａ１２またはその一部あるいはその他の改変体をコードする適切な任意のポリヌクレオチドは、本明細書中に開示されるＲａ１２および１つ以上の肺腫瘍ポリヌクレオチドを含む、組換え融合ポリヌクレオチドの構築において使用し得され得る。好ましいＲａ１２ポリヌクレオチドは一般に、Ｒａ１２ポリペプチドの一部をコードする、少なくとも約１５の連続するヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、または少なくとも約３００ヌクレオチドを含む。
Ｒａ１２ポリヌクレオチドは、ネイティブ配列すなわち、Ｒａ１２ポリペプチドまたはその一部をコードする内在性配列）を含み得るか（またはこのような配列の改変体を含み得る。Ｒａ１２ポリヌクレオチド改変体は、ネイティブＲａ１２ポリペプチドを含む融合ポリペプチドと比較して、コードされる融合ポリペプチドの生物学的活性が実質的に低下しないような、１つ以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含み得る。改変体は、ネイティブＲａ１２ポリペプチドまたはその一部をコードするポリヌクレオチド配列に対し、好ましくは少なくとも約７０％の同一性を、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性を、そして最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性を示す。
Ｒａ１２と本発明の抗原との間の融合の２つの特定の実施形態が、この実施例に記載される。
（Ａ．Ｌ７６３ＰのＮ末端部分）
全長Ｒａ１２とＬ７６３ＰのＮ末端部分（Ｌ７６３Ｐ−Ｎとよばれる；配列番号１５９のアミノ酸残基１〜１３０）との融合タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで単一の組換えタンパク質として発現した。Ｎ末端部分についてのｃＤＮＡを、全長Ｌ７６３ＰについてのｃＤＮＡおよびプライマーＬ７６３Ｆ３ （５’
Figure 0004180919
 ；配列番号３８３）および１７６３ＲＶ３ （５’
Figure 0004180919
 ；配列番号３８４）を用いるＰＣＲによって得た。予想されるサイズを有するＰＣＲ産物を、アガロースゲルから回収し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩを用いて消化し、そして発現ベクターｐＣＲＸ１の対応する部位にクローン化した。Ｒａ１２およびＬ７６３Ｐ−Ｎの全長の融合物についての配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。決定されたｃＤＮＡ配列を、配列番号３５１に与える（対応するアミノ酸配列を配列番号３５２に与える）。
（Ｂ．Ｌ７６３ＰのＣ末端部分）
全長Ｒａ１２とＬ７６３ＰのＣ末端部分との融合タンパク質（Ｌ７６３Ｐ−Ｃとよばれる；配列番号１５９のアミノ酸残基１００〜２６２）を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で単一の組換えタンパク質として発現させた。Ｌ７６３ＰのＣ末端部分のｃＤＮＡを、Ｌ７６３Ｐの全長に対するｃＤＮＡ、およびプライマーＬ７６３Ｆ４（
Figure 0004180919
 ；配列番号３８５）、およびＬ７６３ＲＶ４（
Figure 0004180919
 ；配列番号３８６）を用いるＰＣＲによって得た。予想されるサイズのＰＣＲ産物を、アガロースゲルから回収し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩを用いて消化し、そして発現ベクターｐＣＲＸ１の対応する部位にクローン化した。全長Ｒａ１２およびＬ７６３Ｐ−Ｃの融合物についての配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。決定されたＤＮＡ配列を、配列番号３５３に与える（対応するアミノ酸配列を配列番号３５４に与える）。
この実施例に記載した組換えタンパク質は、ワクチンの調製、抗体治療、および肺腫瘍の診断のために有用である。
（実施例１２）
（Ｌ７６２Ｐヒスタグ融合タンパク質のＥ．Ｃｏｌｉ中での発現）
ＰＣＲを、Ｌ７６２Ｐコード領域について、以下のプライマーを用いて実施した：
順方向プライマーは、アミノ酸３２で開始する。
ＰＤＭ−２７８
Figure 0004180919
 （配列番号３５５）Ｔｍ５７℃。
逆方向プライマーは、アミノ酸９２０の後に天然の終止コドンを含み、ＥｃｏＲＩ部位を作成する。
ＰＤＭ−２８０
Figure 0004180919
 （配列番号３５６）ＴＭ５５℃。
ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化し、ゲル精製し、次いでｐＰＤＭ Ｈｉｓ（これは、Ｅｃｏ７２Ｉ制限酵素およびＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化されている、インフレームでヒスタグを有する改変されたｐＥＴ２８ベクターである）中にクローン化した。構築物が正確であることを、ＤＮＡ配列分析によって確認し、そして次いで、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ Ｓ発現宿主およびＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ ＲＩＬ発現宿主に形質転換した。
発現された組換えＬ７６２Ｐのタンパク質配列を、配列番号３５７に示し、そしてＤＮＡ配列を、配列番号３５８に示す。
（実施例１３）
（ヒスタグ融合タンパク質Ｌ７７３ＰＡのＥ．Ｃｏｌｉにおける発現）
Ｌ７７３ＰＡコード領域（配列番号１７２のアミノ酸２〜７１をコードする）を、以下のプライマーを使用してＰＣＲ増幅した：
Ｌ７７３ＰＡについての順方向プライマーはアミノ酸２で開始する：
ＰＤＭ−２９９
Figure 0004180919
 （配列番号３５９）Ｔｍ６３℃。
Ｌ７７３ＰＡについての逆方向プライマーは、人工の終止コドンをアミノ酸７０の後に作製する。
ＰＤＭ−３５５
Figure 0004180919
 （配列番号３６０）Ｔｍ６２℃。
得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化し、ゲル精製し、次いでｐＰＤＭ Ｈｉｓ（これは、Ｅｃｏ７２Ｉ制限酵素およびＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化されている、インフレームでのヒスタグを有する改変されたｐＥＴ２８ベクターである）中にクローン化した。構築物が正確であることを、ＤＮＡ配列分析によって確認し、そしてＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ Ｓ発現宿主およびＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ ＲＩＬ発現宿主に形質転換した。
発現した組換えＬ７７３ＰＡのタンパク質配列を、配列番号３６１に示し、そしてＤＮＡ配列を、配列番号３６２に示す。
（実施例１４）
（肺腫瘍特異的ポリペプチド由来のエピトープの同定）
Ｌ７７３Ｐアミノ酸配列（配列番号１７２）に由来する一連のペプチドを、合成し、そしてペプチド特異的ＣＤ４ Ｔ細胞を生成するためのインビトロプライミング実験において使用した。これらのペプチドは、１５アミノ酸までがオーバーラップする２０マーであり、そしてＬ７７３Ｐタンパク質のアミノ酸１〜６９に対応する。この領域を、腫瘍特異性について実証した。３つのインビトロ刺激に続き、刺激ペプチドに応答してＩＮＦγを産生するが、コントロールペプチドには応答しない、ＣＤ４ Ｔ細胞株を同定した。これらのＴ細胞株のいくつかは、組換えＬ７７３Ｐ（腫瘍特異的領域）タンパク質および組換えＬ７７３ＰＡ（腫瘍特異的領域）タンパク質の認識を実証した。
実験を行うために、全部で１１個の２０マーのペプチド（配列番号３６３、３６５および３８７〜３９５）（１５アミノ酸までオーバーラップし、そしてＬ７７３Ｐ（配列番号１７２のアミノ酸１〜６９に対応する）のＮ末端腫瘍特異的領域に由来する）を標準的な手順により作製した。ＧＭＣＳＦおよびＩＬ−４を使用する標準的なプロトコルによって、樹状細胞を、正常なドナーのＰＢＭＣから誘導した。精製したＣＤ４ Ｔ細胞を、ＭＡＣＳビーズおよびＰＢＭＣのネガティブ選択を使用して、樹状細胞と同一のドナーから生成した。樹状細胞に、個別の２０マーのペプチドを、１０μｇ／ｍｌの濃度で一晩パルスした。パルスした樹状細胞を、洗浄し、そして９６ウェルＵ底プレートに、１×１０４／ウェルでプレートし、そして精製したＣＤ４細胞を１×１０５ウェルで加えた。培養物に、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６および５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２を補充し、３７℃でインキュベートした。上記のように産生され、そしてパルスされたＡＰＣ樹状細胞を使用して、培養物を、週に１回の頻度で、上記のように再刺激し、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７および１０μｇ／ｍｌ ＩＬ−２を補充した。３つのインビトロ刺激サイクルに続き、細胞株（各々は、１つのウェルに対応する）を、刺激ペプチド対無関係なペプチドに応答するサイトカイン産生について試験した。
少数の個別のＣＤ４ Ｔ細胞株（９／５２８）は、刺激ペプチドに応答する、サイトカインの放出（ＩＦＮγ）を実証したが、コントロールペプチドでは実証されなかった。特異的な活性を実証したＣＤ４ Ｔ細胞株を、適切なＬ７７３Ｐペプチドによって再刺激し、そして１０μｇ／ｍｌの適切なＬ７７３Ｐペプチド、無関係なコントロールペプチド、組換えＬ７７３Ｐタンパク質（アミノ酸２〜３６４、Ｅ．ｃｏｌｉ中で産生した）、組換えＬ７７３ＰＡ（アミノ酸２〜７１、Ｅ．ｃｏｌｉ中で産生した）または適切なコントロールタンパク質（Ｌ３Ｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ中で産生した）でパルスした自己の樹状細胞を使用して再アッセイした。試験された９つの株のうちの３つ（１−３Ｃ、１−６Ｇおよび４−１２Ｂ）は、適切なＬ７７３Ｐペプチド、ならびに組換えＬ７７３ＰおよびＬ７７３ＰＡを認識した。試験した株のうち４つ（４−８Ａ、４−８Ｅ、４−１２Ｄおよび４−１２Ｅ）は、適切なＬ７７３Ｐペプチドのみを認識した。試験した株のうち２つ（５−６Ｆおよび９−３Ｂ）は、非特異的な活性を実証した。
これらの結果は、これらのペプチド配列
Figure 0004180919
 （配列番号１７２のアミノ酸１〜２０；配列番号３６３）および
Figure 0004180919
 （配列番号１７２のアミノ酸１６〜３５；配列番号３６５）は、ヒトクラスＩＩ ＭＨＣ限定的ＣＤ４ Ｔ細胞応答を刺激し得る、天然において処理されるＬ７７３Ｐのエピトープを表し得る。
続く研究において、上記のエピトープマッピング実験を、異なるドナーを使用して繰り返した。再び、得られたＴ細胞株のいくつかは、ペプチドおよび組換えタンパク質に対する応答がみられた。さらなるペプチドが、自然に処理されることが見出された。具体的には、精製されたＣＤ４細胞を、１５アミノ酸までがオーバーラップする全部で１１個の２０マーペプチド（それぞれ、配列番号は、３６３、３８７、３８８、３６５および３８９〜３９５）で刺激した。使用したペプチドの濃度が、１０ｕｇ／ｍＬではなくて０．５ｕｇ／ｍＬであることを除いて、プライミングを、上記のように実施した。はじめのスクリーニングにおいて、５２８細胞株のうち９細胞株が、刺激ペプチド対制御ペプチドにおいて、少なくとも３倍より大きなレベルのＩＦＮ−γを、放出した。これらの９つの株を、適切なペプチドを用いて再刺激し、次いで、適切なペプチド（１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬおよび０．１μｇ／ｍＬ）および１０ｕｇ／ｍＬの制御ペプチドの滴定を用いてパルスされた樹状細胞で試験した。９つのうち６つの株は、組換えＬ７７３Ｐならびにペプチドを認識した。このＬ７７３ＰＡおよび適切なペプチドを認識した６つの株を、１−１Ｅ、１−２Ｅ、１−４Ｈ、１−６Ａ、１−６Ｇおよび２−１２Ｂと呼んだ。これらの結果は、配列番号３６３および３８７のペプチドが、Ｌ７７３Ｐの天然で処理されたエピトープを示すことを実証する。
上記の手順を使用して、Ｌ５２３Ｓポリペプチド配列（配列番号１７６）にわたりオーバーラップする２０マーのペプチド（配列番号３９６〜４１９）を用いてパルスした、樹状細胞を使用して、ＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を、正常ドナーのＰＢＭＣから起こした。多数のＣＤ４＋ Ｔ細胞は、プライミングペプチドならびにＬ５２３Ｓ組換えタンパク質との反応性を実証した。これらの株の有意な反応性は、ペプチド４、７および２１（配列番号３９９、４０２および４１６；それぞれ配列番号１７６のアミノ酸３０〜３９、６０〜７９および２００〜２１９に対応する）にある
本発明の範囲内のエピトープは、他のクラスＩＩ ＭＨＣ分子によって制限されるエピトープを含む。さらに、ペプチドの改変体を産生し得、ここで１つ以上のアミノ酸は、ペプチドのＭＨＣ分子に結合する能力に影響せず、ペプチドのＴ細胞応答を惹起する能力に影響せず、そして惹起されたＴ細胞の組換えタンパク質を認識する能力に影響しないように変更される。
（実施例１５）
（Ｌ７６２Ｐおよびその抗体エピトープの表面発現）
ウサギを、Ｅ．ｃｏｌｉ中で産生された全長ヒスチジンタグ化Ｌ７６２Ｐタンパク質で免疫した。血清を、ウサギから単離し、そしてＥＬＩＳＡアッセイにおいてＬ７６２Ｐの特異的な認識についてスクリーニングした。組換えＬ７６２タンパク質を特異的に認識した、２６９２Ｌと呼ばれる１つのポリクローナル血清を、同定した。２６９２Ｌ抗Ｌ７６２Ｐポリクローナル抗体を、Ｌ７６２Ｐアフィニティーカラムを使用するアフィニティー精製によって、血清から精製した。Ｌ７６２Ｐは、原発性肺腫瘍サンプルのサブセットにおいて発現されるが、樹立した肺腫瘍細胞株においては、発現は、失われるようである。従って、Ｌ７６２Ｐの表面発現を特徴づけるために、Ｌ７６２Ｐを発現するレトロウイルス構築物を使用して、原発性ヒト繊維芽細胞ならびに３つの肺腫瘍細胞株（５２２−２３、ＨＴＢおよび３４３Ｔ）を形質転換した。形質転換された株を、選択し、そしてＦＡＣＳ分析によりＬ７６２Ｐの表面発現を試験するために増殖させた。この分析のために、形質転換されていない細胞および形質転換された細胞を、細胞分離培地を使用して回収し、そして１０〜５０μｇ／ｍｌのアフィニティー精製した抗Ｌ７６２Ｐまたは無関係な抗血清のいずれかを用いてインキュベートした。氷上での３０分のインキュベートに続き、細胞を、洗浄し、上記のようにＦＩＴＣを複合した抗ウサギＩｇＧ２次抗体と共にインキュベートした。細胞を、洗浄し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含む緩衝液中に再懸濁し、そしてＥｘｃａｌｉｂｕｒ蛍光活性化細胞選別機を使用するＦＡＣＳにより試験した。ＦＡＣＳ分析のために、ＰＩ陽性（すなわち、死んだ／透過した細胞）を除外した。ポリクローナル抗Ｌ７６２Ｐ血清は、Ｌ７６２Ｐ形質転換細胞の表面を、特異的に認識しそしてこれに結合したが、非形質転換対応物は、認識も結合もしなかった。これらの結果は、Ｌ７６２Ｐが、繊維芽細胞ならびに肺腫瘍細胞の両方の細胞表面に局在化することを実証する。
２６９２Ｌによって認識されるペプチドエピトープを同定するために、エピトープマッピングアプローチを行った。Ｌ７６２ＰのＣ末端部分（配列番号１６１のアミノ酸４８１〜８９４）にわたる一連のオーバーラップする１９〜２１マー（５アミノ酸オーバーラップ）を合成した。始めの実験において、ペプチドを、プールして試験した。Ｌ７６２Ｐ抗血清をとの特異的な反応性を、プールＡ、Ｂ、ＣおよびＥについて観察した。抗血清により認識される特異的なペプチドを同定するために、平底９６ウェルマイクロタイタープレートを、個別のペプチド１０μｇ／ｍｌを用いて、３７℃で２時間被覆した。次いで、ウェルを、吸引しそして５％（ｗ／ｖ）ミルクを含むリン酸緩衝化生理食塩水で、３７℃２時間で遮断し、次いで、０．１％のＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳ中で洗浄した。精製した、ウサギ抗Ｌ７６２Ｐ血清２６９２Ｌを、３連にしたＰＢＳＴを含むウェルに２００ｎｇ／ウェルまたは２０ｎｇ／ウェルで加え、一晩、室温でインキュベートした。この後に、ＰＢＳＴを用いて６回洗浄し、次いで、１：２，０００のＨＲＰ結合体化ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）フラグメントと共に、６０分間インキュベートする。次いで、プレートを、洗浄し、そしてテトラメチルベンジジン基質中でインキュベートした。１Ｎの硫酸の添加により反応を、停止し、そして、プレートを、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して４５０／５７０ｎｍで、読んだ。
以下の表４に示される、得られたデータは、Ｌ７６２Ｐ抗血清が、少なくとも６つの別個のペプチドエピトープを、Ｌ７６２Ｐの３’の半分から識別したことを実証する。
Figure 0004180919
 個別のペプチドを、プールの各々から同定し、そしてさらなる弱い反応性を、プールＦからペプチドＢＢを用いて同定した。適切なペプチドエピトープを、以下の表５に要約する。ペプチドＢＢ、Ｏ、Ｌ、Ｉ、ＡおよびＣについてのアミノ酸配列は、対応するｃＤＮＡ配列（それぞれ、配列番号３７３、３７０、３７２、３７４、３７１および３７５に提供される）とともに、配列番号３７６〜３８１に、それぞれ提供される。
Figure 0004180919
 （実施例１６）
（患者の血清中の肺腫瘍抗原に対する抗体の検出）
肺腫瘍抗原Ｌ７７３ＰＡ（配列番号３６１）、Ｌ５１４Ｓ（配列番号１５５および１５６）、Ｌ５２３Ｓ（配列番号１７６）、Ｌ７２６Ｐ（配列番号１６１）およよびＬ７６３Ｐ（配列番号１５９）に特異的な抗体は、肺癌患者の滲出液または血清中に存在するが、正常なドナー中には存在しないことを示した。さらに具体的には、肺癌患者から得られた滲出液および正常なドナー由来の血清におけるＬ７７３ＰＡ、Ｌ５１４Ｓ、Ｌ５２３Ｓ、Ｌ７６２ＰおよびＬ７６３Ｐに対する抗体の存在を、組換えタンパク質およびＨＲＰ結合体抗ヒトＩｇを使用するＥＬＩＳＡによって検出した。簡単に言うと、タンパク質の各々（１００ｎｇ）を、ｐＨ９．５で９６ウェルプレート中に被覆した。並行して、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）もまた、コントロールタンパク質として被覆した。ＢＳＡ（［Ｎ］）に対するシグナル（［Ｓ］，４０５ｎｍで観測される吸光度）を、決定した。これらの研究の結果を、表６に示し、ここで−は、［Ｓ］／［Ｎ］＜２を表し；＋／−は、［Ｓ］／［Ｎ］＞２を表し；＋＋は、［Ｓ］／［Ｎ］＞３を表し；そして＋＋＋は、［Ｓ］／［Ｎ］＞５を表す。
Figure 0004180919
 ウエスタンブロット分析を使用して、Ｌ５２３Ｓに対する抗体を、肺癌患者に由来する滲出液の４サンプルのうち３つに存在することを見い出したが、試験した正常な血清の３つのサンプル中においてはＬ５２３Ｓ抗体は検出されなかった。
（実施例１７）
（Ｌ５１４Ｓヒスタグ融合タンパク質のＥ．Ｃｏｌｉにおける発現）
ＰＣＲを、以下のプライマーを使用して、Ｌ５１４Ｓ−１３１６０コード領域について実施した。
順方向プライマーＰＤＭ−２７８
Figure 0004180919
 （配列番号４２１）Ｔｍ６７℃。
逆方向プライマーＰＤＭ−２８０
Figure 0004180919
 （配列番号４２２）ＴＭ６６℃。
ＰＣＲ条件は、以下の通り：
１０μｌ １０× Ｐｆｕ緩衝液
１．０μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰ
２．０μｌ １０μＭ 各プライマー
８３μｌ 滅菌水
１．５μｌ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）
５０ηｇ ＤＮＡ
９６℃で２分間、９６℃で２０秒間、６６℃で１５秒間、７２℃で１分間を４０サイクル、次いで７２℃で４分間。
ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化し、ゲル精製し、次いでｐＰＤＭ Ｈｉｓ（これは、Ｅｃｏ７２Ｉ制限酵素およびＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化されている、インフレームでヒスタグを有する改変されたｐＥＴ２８ベクターである）中にクローン化した。構築物が正確であることを、ＤＮＡ配列分析によって確認し、次いで発現のためにＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）細胞中に形質転換した。
発現された組換え体Ｌ５１４Ｓのアミノ酸配列を、配列番号４２３に示し、ＤＮＡコード領域の配列を、配列番号４２４に示す。
（実施例１８）
（Ｌ５２３Ｓ ＨＩＳタグ融合タンパク質のＥ．ｃｏｌｉでの発現）
ＰＣＲを、以下のプライマーを使用して、Ｌ５２３Ｓコード領域で行った：
順方向プライマー、ＰＤＭ−４１４
Figure 0004180919
 Ｔｍ６２℃。
逆方向プライマー、ＰＤＭ−４１５
Figure 0004180919
 Ｔｍ６２℃。
ＰＣＲ条件は、以下のとおりであった。
１０μｌの１０×Ｐｆｕ緩衝液
１．０μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ
２．０μｌの１０μＭ 各プライマー
８３μｌ滅菌水
１．５μｌのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）
５０ｎｇのＤＮＡ
９６℃で２分間、９６℃で２０秒間、６２℃で１５秒間、７２℃で４分間の４０サイクル、次いで７２℃で４分間。
ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、ゲル精製をし、次いで、Ｅｃｏ７２ＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化された、Ｈｉｓタグを有する改変ｐＥＴ２８ベクターであるｐＰＤＭ Ｈｉｓにインフレームでクローニングした。正しい構築物を、ＤＮＡ配列分析で確認し、次いで、発現のために、その構築物で、ＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を形質転換した。
発現される組換えＬ５２３Ｓのアミノ酸配列は、配列番号４２７に示され、ＤＮＡコード領域配列は、配列番号４２８に示される。
（実施例１９）
（Ｌ７６２ＰＡ ＨＩＳタグ融合タンパク質のＥ．ｃｏｌｉでの発現）
ＰＣＲを、以下のプライマーを使用して、Ｌ７６２ＰＡコード領域（Ｌ７６２ＰＡは、シグナル配列、Ｃ末端膜貫通ドメインおよび細胞質テイルを欠失する）で行った：
順方向プライマー ＰＤＭ−２７８
Figure 0004180919
 Ｔｍ５７℃。
逆方向プライマー ＰＤＭ−２７９
Figure 0004180919
 ＴＭ５６℃。
ＰＣＲ条件は、以下のとおりであった。
１０μｌの１０×Ｐｆｕ緩衝液
１．０μｌのｌ０ｍＭ ｄＮＴＰ
２．０μｌのｌ０μＭ 各プライマー
８３μｌ滅菌水
１．５μｌのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）
５０ｎｇのＤＮＡ
９６℃で２分間、９６℃で２０秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で５分間の４０サイクル、次いで、７２℃で４分間。
ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、ゲル精製をし、次いで、Ｅｃｏ７２ＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化された、Ｈｉｓタグを有する改変ｐＥＴ２８ベクターであるｐＰＤＭ Ｈｉｓにインフレームでクローニングした。正しい構築物を、ＤＮＡ配列分析で確認し、次いで、発現のために、その構築物で、ＢＬ２１ ｐＬｙｓ Ｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を形質転換した。
発現される組換えＬ７６２ＰＡのアミノ酸配列は、配列番号４３０に示され、ＤＮＡコード領域配列は、配列番号４３１に示される。
（実施例２０）
（Ｌ７７３Ｐ ＨＩＳタグ融合タンパク質のＥ．ｃｏｌｉでの発現）
ＰＣＲを、以下のプライマーを使用して、Ｌ７７３Ｐコード領域で行った：
順方向プライマー、ＰＤＭ−２９９
Figure 0004180919
 Ｔｍ６３℃。
逆方向プライマー、ＰＤＭ−３００
Figure 0004180919
 Ｔｍ６３℃。
ＰＣＲ条件は、以下のとおりであった。
１０μｌの１０×Ｐｆｕ緩衝液
１．０μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ
２．０μｌの１０μＭ 各プライマー
８３μｌ滅菌水
１．５μｌのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）
５０ｎｇのＤＮＡ
９６℃で２分間、９６℃で２０秒間、６３℃で１５秒間、７２℃で２分１５秒間の４０サイクル、次いで７２℃で４分間。
ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、ゲル精製をし、次いで、Ｅｃｏ７２ＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化された、Ｈｉｓタグを有する改変ｐＥＴ２８ベクターであるｐＰＤＭ Ｈｉｓにインフレームでクローニングした。正しい構築物を、ＤＮＡ配列分析で確認し、次いで、その構築物で、発現のために、ＢＬ２１ ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）およびＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を形質転換した。
発現される組換えＬ７７３Ｐのアミノ酸配列は、配列番号４３３に示され、ＤＮＡコード領域配列は、配列番号４３４に示される。
（実施例２１）
（肺特異性抗原Ｌ７６２Ｐに対するＴ細胞レセプタークローンのクローニングおよび配列決定）
肺特異性抗原Ｌ７６２Ｐに対して特異的なＣＤ４ Ｔ細胞クローン由来のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）α鎖およびＴ細胞レセプターβ鎖を、クローニングし、配列決定した。基本的に、ＣＴＬクローン４Ｈ６由来の２×１０６細胞由来の全ｍＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を使用して単離し、ｃＤＮＡを、Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｇｏキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して合成した。このクローンのＶα配列およびＶβ配列を決定するために、Ｖαサブタイプ特異的プライマーおよびＶβサブタイプ特異的プライマーのパネルを合成し、これを各クローンから産出されたｃＤＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ反応で使用した。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、各クローンが、Ｖβ８サブファミリーに対応した共通のＶβ配列、およびＶα８サブファミリーに対応した共通のＶα配列を発現したことを示した。クローン４Ｈ６から全長α鎖および全長β鎖クローニングするために、イニシエーターをコードするＴＣＲヌクレオチドおよびターミネーターをコードするＴＣＲヌクレオチドにまたがるプライマーを、設計した。プライマーは、以下のとおりであった：
ＴＣＲ Ｖα８に対する順方向プライマー
Figure 0004180919
 ＴＣＲ Ｖα８に対するＫｏｚａｋ逆方向プライマー（アンチセンス）
Figure 0004180919
 ＴＣＲ Ｖβ８に対する順方向プライマー（センス）
Figure 0004180919
 および
ＴＣＲ Ｖβ８に対するＫｏｚａｋ逆方向プライマー
Figure 0004180919
 標準的な３５サイクルのＲＴ−ＰＣＲ反応を、プルーフリーディング熱安定性ポリメラーゼ、ＰＷＯ（Ｒｏｃｈｅ）を利用して、ＣＴＬクローンから合成されたｃＤＮＡおよび上記プライマーを使用して確立した。結果として得られるＰＣＲバンド（Ｖαに対して約８５０ｂｐおよびＶβに対して約９５０ｂｐ）を、ＰＣＲブラントベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にライゲーションし、このベクターで、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換した。全長α鎖および全長β鎖を有するプラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉを同定した。対応するプラスミドの大スケール調製物を作製し、これらのプラスミドを配列決定した。Ｖα配列（配列番号４３９）は、ヌクレオチド配列アライメントによって、Ｖα８．１に相同であることが示され、一方で、Ｖβ配列（配列番号４４０）は、ヌクレオチド配列アライメントによって、Ｖβ８．２に相同であることが示された。
（実施例２２）
（哺乳動物細胞での全長Ｌ７６２Ｐの組換え発現）
全長Ｌ７６２Ｐ ｃＤＮＡを、哺乳動物発現ベクター、ＶＲ１０１２およびｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にサブクローニングした。両発現ベクターを、あらかじめ、ＦＬＡＧタグを含むように改変した。これらの構築物を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬（Ｇｉｂｃｏ）を使用して、ＨＥＫ２９３細胞およびＣＨＬ−１細胞（ＡＴＣＣ）にトランスフェクトした。簡単には、ＨＥＫ細胞およびＣＨＬ−１細胞の両方を、１０％ ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中に１００，０００細胞／ｍｌの密度でプレートし、一晩増殖した。翌日、４μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００をＦＢＳを含まない１００μｌのＤＭＥＭに加え、室温で５分間インキュベートした。次いで、このＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ／ＤＭＥＭ混合物を、１００μｌのＤＭＥＭに再懸濁された、１μｇのＬ７６２Ｐ Ｆｌａｇ／ｐＣＥＰ４またはＬ７６２Ｐ Ｆｌａｇ／ＶＲ１０１２プラスミドＤＮＡに加え、室温で１５分間インキュベートした。次いで、このＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ／ＤＭＥＭ混合物を、ＨＥＫ２９３細胞およびＣＨＬ−１細胞に加え、７％ ＣＯ２と共に、３７℃で４８〜７２時間インキュベートした。細胞をＰＢＳでリンスし、次いで回収し、そして遠心分離によってペレット化した。Ｌ６７２Ｐ発現を、ウエスタンブロット分析によって、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞溶解物およびＣＨＬ−１細胞溶解物中に検出し、フローサイトメトリー分析によって、トランスフェクトされたＨＥＫ細胞の表面上で検出した。
ウエスタンブロット分析について、全細胞溶解物を、溶解緩衝液を含むＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００中で細胞を、氷上で３０分間、インキュベーションすることによって生成した。次いで、溶解物を４℃で５分間、１０，０００ｒｐｍで遠心分離することによって、澄ませた。サンプルをβメルカプトエタノールを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ負荷緩衝液で希釈し、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷する前に、１０分間煮沸した。このタンパク質をニトロセルロースに転写し、１μｇ／ｍｌの精製された抗Ｌ７６２Ｐウサギポリクローナル血清（ロット、カタログ番号；６９０／７３）または希釈しない抗Ｌ７６２Ｐ ｍＡｂ １５３．２０．１上清を使用して探査した。ブロットを、ＨＲＰに結合したヤギ抗ウサギＩｇかＨＲＰに結合したヤギ抗マウスＩｇのいずれかを使用して明らかにされ、続いて、ＥＣＬ基質でインキュベーションした。
フローサイトメトリー分析に対して、細胞をさらに氷冷染色緩衝液（ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ＋アジド）で洗浄した。次に、細胞を、１０μｇ／ｍｌの精製された抗Ｌ７６２Ｐポリクローナル血清（ロット、カタログ番号；６９０／７３）または抗Ｌ７６２Ｐ ｍＡｂ １５３．２０．１上清の１：２希釈物と共に、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を染色緩衝液で３回洗浄し、次いで、ヤギ抗ウサギＩｇ（Ｈ＋Ｌ）ＦＩＴＣまたはヤギ抗マウスＩｇ（Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣ試薬（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に、氷上で３０分間インキュベートした。３回の洗浄後、細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、浸透性の細胞の排除を可能にする生体染色を含む染色緩衝液中に再懸濁し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。
（実施例２３）
（肺腫瘍抗原に対するポリクローナル抗体の産生）
３つの肺抗原（Ｌ５２３Ｓ（配列番号１７６）、Ｌ７６３Ｐ（配列番号１５９）およびＬ７６３ペプチド番号２６８４（配列番号４４１））を、発現し、抗体産生での使用のために精製した。
Ｌ５２３ＳおよびＬ７６３Ｐを、Ｅ．ｃｏｌｉ組換え体発現系中で発現し、適切な抗生物質を有するＬＢブロス中で、振盪培養器中で一晩増殖した。翌朝、１０ｍｌの一晩培養物を、２Ｌのバフル付きエルレンマイアーフラスコ中の適切な抗生物質を含む５００ｍｌの２×ＹＴに加えた。５６０ｎｍでの培養物の光学濃度が、０．４〜０．６に達したとき、細胞をＩＰＴＧ（１ｍＭ）で誘導した。ＩＰＴＧでの誘導の４時間後、細胞を遠心分離で回収した。
次いで、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、再度遠心分離した。上清を捨て、細胞を後の使用のために凍らせるか即座に処理するかのいずれかを行った。２０ｍｌの溶解物緩衝液を、細胞ペレットに加え、ボルテックスした。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を破砕するために、次いで、この混合物を、１６，０００ｐｓｉの圧力で、フレンチプレスを通した。次いで、細胞を再度遠心分離し、上清およびペレットを、組換えタンパク質の分配について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってチェックした。
細胞ペレットに局在化するタンパク質に対して、ペレットを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１％ ＣＨＡＰＳ中に再懸濁し、および封入体ペレットを、洗浄し、再度遠心分離した。この手順を２回以上繰り返した。洗浄された封入体ペレットを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）および１０ｍＭ イミダゾールを含む８Ｍ尿素または６Ｍ塩酸グアニジンを用いて可溶化した。この可溶化したタンパク質を、５ｍｌのニッケルキレートレジン（Ｑｉａｇｅｎ）に加え、連続的に振盪しながら、室温で４５分〜１時間インキュベーションした。
インキュベーションの後、レジンおよびタンパク質混合物を、使い捨てカラムに注ぎ、そのフロースルーを回収した。次いで、カラムを１０〜２０カラム容量の可溶化緩衝液で洗浄した。次いで、抗原を、８Ｍ尿素、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）および３００ｍＭイミダゾールを使用して、カラムから溶出し、３ｍｌ分画で回収した。どの画分を、さらなる精製のためにプールするべきかを決定するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを電気泳動した。
最終精製工程として、強力なアニオン交換樹脂（この場合はＨｉ−Ｐｒｅｐ Ｑ（Ｂｉｏｒａｄ））を、適切な緩衝液で平衡化し、上記からのプールされた画分を、カラムに充填した。各抗原を、増加する塩勾配で、カラムから溶出した。画分を、カラムを作動しながら回収し、別のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、カラムからのどの分画をプールするかどうかを決定するために電気泳動した。
プールされた画分を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）に対して透析した。遊離の基準は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＨＰＬＣによって決定される純度、ローリーアッセイまたはアミノ酸分析によって決定される濃度、アミノ末端タンパク質配列によって決定される同一性、およびＬｉｍｉｌｕｓ（ＬＡＬ）アッセイによって決定されるエンドトキシンのレベルであった。次いで、タンパク質を０．２２ミクロンフィルターを通して濾過した後、バイアル中に置き、抗原を免疫に必要になるまで凍結した。
Ｌ７６３ペプチド＃２６８４を合成し、それをＫＬＨに結合し、免疫に必要になるまで凍結した。
ポリクローナル抗血清を、１００μｇのムラミルジペプチド（ＭＤＰ）と合わせた４００μｇの各肺抗原を使用して作製した。等量のＩｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＩＦＡ）を加え、次いで、混合し、ウサギに皮下的に（Ｓ．Ｃ．）注射した。４週間後、ウサギを等量のＩＦＡと混合された２００μｇの抗原で、皮下的に追加抗原投与をした。その後、ウサギを、１００μｇの抗原で、追加抗原投与をした。各追加抗原投与の７日後に、動物を採血した。次いで、その血液を、４℃で１２〜２４時間インキュベートし、次いで血清を生成するために遠心分離した。
ポリクローナル抗血清を、抗原でコーティングされた９６ウェルプレートを使用して特徴付け、４℃で２０時間、５０μｌ（代表的には、１μｇ／１μｌ）のポリクローナル抗血清と共にインキュベーションした。基本的には、２５０μｌのＢＳＡブロック緩衝液をウェルに加え、室温で２時間インキュベーションした。プレートを、ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎで６回洗浄した。ウサギ血清を、ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ／０．１％ ＢＳＡで希釈した。５０μｌの希釈された血清を各ウェルに加え、室温で３０分間インキュベートした。プレートを上に記載されるように洗浄し、次いで、５０μｌのヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）１：１００００希釈物を加え、室温で３０分間インキュベートした。
プレートを上に記載されるように洗浄し、１００μｌのＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを各ウェルに加えた。室温で暗闇中での、１５分間のインキュベーションに続いて、比色反応を１００μｌの１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を用いて停止し、即座に４５０ｎｍで読み取った。全てのポリクローナル抗体は、適切な抗原に対する免疫反応性を示した。表７〜９は、３つの肺抗原（Ｌ５２３Ｓ、Ｌ７６３ＰおよびＬ７６３ペプチド＃２６８４）についての連続希釈溶液中での、ウサギ抗血清の抗体反応性を示す。第１列は、抗体希釈物を示す。列「前免疫血清」は、前免疫血清を使用した２つの実験に対するＥＬＩＳＡデータを示す。これらの結果は、第４のカラムで平均化される。列「抗Ｌ５２３Ｓ、Ｌ７６３Ｐまたは＃２６８４」は、表において、Ｌ５２３Ｓ、Ｌ７６３Ｐまたは＃２６８４のいずれかといわれるそれぞれの抗原を使用して、この実施例に記載されるように免疫されたウサギ由来の血清を使用する、２つの実験に対するＥＬＩＳＡデータを示す。
Figure 0004180919
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 表１０〜１２は、３つの肺抗原（Ｌ５２３Ｓ、Ｌ７６３ＰおよびＬ７６３ペプチド＃２６８４）に対するそれぞれの抗体の親和性精製を示す。
Figure 0004180919
Figure 0004180919
Figure 0004180919
 （実施例２４）
（Ｌ５２９Ｓをコードする全長ｃＤＮＡ配列）
肺抗原Ｌ５２９Ｓに対する部分配列（配列番号１０６）の単離は、前に実施例２において提供された。この部分配列は、公に利用可能なデータベースに対して検索することによって、潜在的な全長ｃＤＮＡ配列およびタンパク質配列を同定するために問い合わせとして使用された。配列番号１０６の単離されたクローン化された配列に対して予想された全長ｃＤＮＡ配列は、配列番号４４２に提供される。配列番号４４２によりコードされる抗原の推定アミノ酸配列は、配列番号４４３に提供される。Ｌ５２９Ｓがコネキシン２６（ギャップ結合タンパク質）に類似性を示すことは、前に実施例２において開示された。
（実施例２５）
（ヒスチジンタグを含まないＬ５２３Ｓ融合タンパク質のメガテリウム（ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）中での発現）
ＰＣＲを、以下のプライマーを使用して、Ｌ５２３Ｓコード領域で行った：
順方向プライマー ＰＤＭ−７３４
Figure 0004180919
 Ｔｍ６３℃。
逆方向プライマー ＰＤＭ−７３５
Figure 0004180919
 ＴＭ６０℃。
ＰＣＲ条件は、以下のとおりであった。
１０μｌの１０×Ｐｆｕ緩衝液
１．０μｌのｌ０ｍＭ ｄＮＴＰ
２．０μｌのｌ０μＭ 各プライマー
８３μｌ滅菌水
１．５μｌのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）
５０ｎｇのＤＮＡ
９６℃で２分間、９６℃で２０秒間、６２℃で１５秒間、７２℃で４分間の４０サイクル、次いで、７２℃で４分間。
ＰＣＲ産物を、ＳｐｈＩおよびＢｇｌＩＩ制限酵素で消化し、ゲル精製をし、次いで、ＳｐｈＩおよびＢｇｌＩＩ制限酵素で消化された、ｐＭＥＧ−３にクローニングした。正しい構築物を、ＤＮＡ配列分析で確認し、次いで、発現のために、その構築物で、Ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ細胞を形質転換した。
発現される組換えＬ５２３Ｓのアミノ酸配列は、配列番号４４６に示され、ＤＮＡコード領域配列は、配列番号４４７に示される。
（実施例２６）
（ヒスチジンタグを含まないＬ５２３Ｓ融合タンパク質のＥ．ｃｏｌｉ中での発現）
ＰＣＲを、以下のプライマーを使用して、Ｌ５５２Ｓコード領域で行った：
順方向プライマー ＰＤＭ−７３３
Figure 0004180919
 Ｔｍ６４℃。
逆方向プライマー ＰＤＭ−４１５
Figure 0004180919
 ＴＭ６２℃。
ＰＣＲ条件は、以下のとおりであった。
１０μｌの１０×Ｐｆｕ緩衝液
１．０μｌのｌ０ｍＭ ｄＮＴＰ
２．０μｌのｌ０μＭ 各プライマー
８３μｌ滅菌水
１．５μｌのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）
５０ｎｇのＤＮＡ
９６℃で２分間、９６℃で２０秒間、６２℃で１５秒間、７２℃で４分間の４０サイクル、次いで、７２℃で４分間。
ＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、ゲル精製をし、次いで、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化された、改変されたｐＥＴ２８ベクターであるｐＰＤＭにクローニングした。正しい構築物を、ＤＮＡ配列分析で確認し、次いで、発現のために、その構築物で、ＢＬＲ ｐＬｙｓＳ細胞およびＨＭＳ１７４ ｐＬｙｓＳ細胞を形質転換した。
発現される組換えＬ５２３Ｓのアミノ酸配列は、配列番号４４９に示され、ＤＮＡコード領域配列は、配列番号４５０に示される。
（実施例２７）
（Ｌ５１４Ｓ特異的抗体およびＬ５２３Ｓ特異的抗体のエピトープ分析）
候補抗原のペプチドは、前臨床的研究および臨床的研究の両方での抗体応答の評価のために使用され得る。これらのデータによって、特定の候補抗原に対する抗体応答をさらに確認することが可能になる。競合ペプチドを用いるタンパク質ベースのＥＬＩＳＡおよびそれを用いないタンパク質ベースのＥＬＩＳＡならびにペプチドベースのＥＬＩＳＡを、これらの抗体応答を評価するために使用し得る。ペプチドＥＬＩＳＡは、特に有用である。なぜなら、ペプチドＥＬＩＳＡは、タンパク質ベースのＥＬＩＳＡで観測される抗体力価の偽陽性をさらに排除し得、候補抗原に対する抗体応答を試験するために、最も単純なアッセイ系を提供するからである。この実施例において、データを、個々の癌患者がＬ５１４Ｓ特異的抗体およびＬ５２３Ｓ特異的抗体を産出することを示すＬ５１４Ｓ特異的ペプチドおよびＬ５２３Ｓ特異的ペプチドの両方を使用して得た。このＬ５１４Ｓ特異的抗体は、Ｌ５１４Ｓの以下のエピトープを主として認識する：
Figure 0004180919
 このエピトープは、ヒトにおいて共通のエピトープである。Ｌ５１４Ｓに特異的なウサギ抗体は、Ｌ５１４Ｓのさらなる２つのエピトープを認識する。
Figure 0004180919
 配列番号４５２が、Ｌ５１４Ｓ−１３１６０およびＬ５１４Ｓ−１３１６６の両Ｌ５１４Ｓアイソフォームに共通であることがさらに見出され、ここで、他のエピトープ（配列番号４５１および配列番号４５３）は、おそらくアイソフォームＬ５１４Ｓ−１３１６０に対して特異的である。
このＬ５２３Ｓ特異的抗体は、Ｌ５２３Ｓの以下のエピトープを主として認識する：
Figure 0004180919
 このエピトープは、ヒトにおいて共通のエピトープである。Ｌ５２３Ｓに特異的なウサギ抗体は、他の２つのエピトープを認識する：
Figure 0004180919
 さらなる研究において、８つのさらなるＬ５２３Ｓのエピトープが、Ｌ５２３Ｓ特異的抗体によって認識されたことは、ペプチドベースのＥＬＩＳＡによって決定された：
Figure 0004180919
 これらのうち、６つのエピトープは、肺複数滲出液サンプルおよび肺患者の血清の両方で共通である。これら６つのうち、配列番号４５９および配列番号４６３は、ＩＧＦ−ＩＩ ｍＲＮＡ結合タンパク質１および２のような、他のＬ５２３Ｓファミリータンパク質に相同性を有さない。従って、このことは、これら２つのペプチドが、Ｌ５２３Ｓに対する抗体応答を決定するためにアッセイ系として使用され得ることを示す。
（実施例２８ インビトロ全遺伝子プライミングを用いるＬ５２３Ｓ特異的ＣＴＬ株の生成）
Ｌ５２３Ｓが、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を生成し得るか否かを決定するために、ＣＴＬを、腫瘍抗原−ワクシニア感染ＤＣを用いるインビトロ全遺伝子プライミング法を使用して生成し（Ｙｅｅら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｌｏｌｇｙ、１５７（９）：４０７９−８６、１９９６）、インターフェロンγＥＬＩＳＰＯＴ分析により決定されるように、Ｌ５５２Ｓ腫瘍抗原で形質導入された自己線維芽細胞を特異的に認識するヒトＣＴＬ株を誘導した。詳細には、樹状細胞（ＤＣ）を、正常ヒトドナーのＰＢＭＣに由来するパーコール精製単球から、プラスチック接着、およびＲＰＭＩ培地（１０％ヒト血清、５０ｎｇ／ｍｌヒトＧＭ−ＣＳＦおよび３０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−４を含む）中で５日間培養することによって、分化させた。培養の５日後、ＤＣを感染多重度（Ｍ．Ｏ．Ｉ．）３３、６６および１００で、Ｌ５２３Ｓを発現する組換アデノウイルスで一晩感染し、そして２μｇ／ｍｌのＣＤ４０リガンドの添加により一晩成熟させた。次いで、このウイルスを、ＵＶ照射により不活性化した。ＣＴＬ株を生成するために、自己ＰＢＭＣを単離し、そしてＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ１６＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、ＣＤ３４＋細胞およびＣＤ５６＋細胞に結合した磁気ビーズを用いるネガティブ選択により富化した。Ｌ５２３Ｓに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を、１０％ヒト血清、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６および５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２を補填したＲＰＭＩ中でウェルあたり１０，０００個のＬ５２３Ｓ発現ＤＣおよび１００，０００個のＣＤ８＋Ｔ細胞を用い、丸底９６ウェルプレート中に樹立した。これら培養を、レトロウイルスによりＬ５２３Ｓで形質導入した自己由来初代線維芽細胞および同時刺激分子ＣＤ８０をＩＬ−２の存在下で用いて、７−１０日毎に再刺激した。細胞はまた、ＩＦＮγで刺激され、ＭＨＣクラスＩをアップレギュレートした。培地に、刺激のとき、および刺激後２日目および５日目にＩＬ−２の１０Ｕ／ｍｌを補填した。３回の刺激サイクルの後、Ｌ５２３Ｓ腫瘍抗原形質導入自己線維芽細胞で刺激したときインターフェロンγを特異的に産生するがコントロール抗原で刺激したときインターフェロンγを産生しない、１０個のＬ５２３Ｓ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞株を、インターフェロンγＥＬＩＳＰＯＴ分析を用いて同定した。
１つの株６Ｂ１を、抗ＣＤ３細胞およびフィーダー細胞を用いてクローン化した。このクローンを、Ｌ５２３Ｓ形質導入線維芽細胞に対する特異性について試験した。さらに、Ｌ５２３Ｓを発現するベクターで形質導入された一群のＨＬＡミスマッチ株を用い、そしてＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてこのＣＴＬ株によるインターフェロンγ産生を測定することにより、このクローン６Ｂ１．４Ｂ８は、ＨＬＡ−Ａ０２０１により拘束されていることを決定した。
また、トランスフェクトされたＣｏｓ細胞を用い、クローン６Ｂ１．４Ｂ８が、ＨＬＡ拘束および抗原特異的様式で、ｐｃＤＮＡ３ ＨＬＡ Ａ０２０１／Ｌ５２３ＳでトランスフェクトされたＣｏｓ細胞を認識することが示された。
エピトープマッピング研究は、クローン６Ｂ１．４Ｂ８が、ペプチドプール３（Ｌ５２３Ｓのアミノ酸位置３３−５９に対応するポリペプチド）を負荷したＨＬＡ−Ａ２０１ ＬＣＬを認識することを示した。
ペプチドプール分解研究は、クローン６Ｂ１．４Ｂ８が、Ｌ５２３Ｓのアミノ酸位置３７−５５の１５マーペプチドＴＧＹＡＦＶＣＰＤＥＳＷＡＬＫＡＩＥ（配列番号４６５）を負荷した自己Ｂ−ＬＣＬを認識することを示した。さらなるペプチド分解研究は、クローン６Ｂ１．４Ｂ８が、同じ１５マーペプチドを負荷したＴ２細胞を認識することを示した．
ペプチド認識研究は、クローン６Ｂ１．４Ｂ８が、Ｌ５２３Ｓの位置４１−５１におけるアミノ酸配列に対応しかつ配列番号４６７のＤＮＡ配列によりコードされる、ペプチドＦＶＤＣＰＥＳＷＡＬ（配列番号４６６）で負荷されたＴ２細胞を好むことを示した。
（実施例２９ 他のヒト癌におけるＬ５２３Ｓ発現）
Ｌ５２３Ｓが、扁平上皮癌、腺癌および小細胞癌腫を含む肺癌中で発現されることを実施例２において先に開示した。この抗原の発現プロフィールをさらに評価するために、電子的発現プロフィール作成を実施した。これは、Ｌ５２３Ｓ特異的配列を、公開ＥＳＴデータベースに対してサーチすることにより行った。このプロフィール形成は、Ｌ５２３Ｓが、結腸腺癌、前立腺腺癌、ＣＭＬ、ＡＭＬ、バーキットリンパ腫、脳腫瘍、網膜芽細胞腫、卵巣腫瘍、奇形癌、子宮筋肉種、生殖細胞腫瘍、ならびに膵腫瘍細胞株および頚部腫瘍細胞株にもまた存在し得ることを示す。
（実施例３０ Ｌ５２３Ｓの免疫組織化学的分析）
どの組織が肺腫瘍抗原Ｌ５２３Ｓを発現するか否かを決定するために、免疫組織化学的（ＩＨＣ）分析を多様な範囲の組織型について実施した。Ｌ５２３Ｓ（配列番号１７６）に特異的なポリクローナル抗体を、実施例２３に記載のように生成した。ＩＨＣは、本質的に実施例６に記載のように実施した。簡単に述べると、組織サンプルをホルマリン溶液中で１２−２４時間固定し、そして８ミクロン切片にスライスする前にパラフィン中に包埋した。０．１クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中の蒸気加熱誘導エピトープ検索（ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）（ＳＨＩＥＲ）を、最適染色条件のために用いた。切片を、ＰＢＳ中の１０％血清と５分間インキュベートした。一次Ｌ５２３Ｓ抗体を、各切片に２５分間添加し、次いで、抗ウサギビオチン化抗体と２５分間インキュベートした。内因性ペルオキシダーゼ活性を、水素ペルオキシダーゼとの３回の１．５分のインキュベーションによりブロックした。アビジンビオチン複合体／西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＡＢＣ／ＨＲＰ）系をＤＡＢ色原体とともに用い、抗原発現を可視化した。スライドをヘマトキシリンで対比染色し、細胞核を可視化した。
Ｌ５２３Ｓ発現のＩＨＣ分析は、試験された肺癌組織のうち、組織サンプルの９０％以上が、肺腫瘍抗原の高過剰発現を示したことを示した（１１個中１０個の腺癌および９個中８個の扁平上皮癌）。試験された正常組織のうち、正常気管支、精巣、肝臓および気管における弱い染色の例外を除き、すべてがＬ５２３Ｓの発現についてネガティブであった。
（実施例３１ Ｌ７６２ヒトモノクローナル抗体の生成および特徴付け）
トランスジェニックマウスのＸｅｎｏｍｏｕｓｅ株からのハイブリドーマ融合物由来の細胞上清液を、Ｌ７６２Ｐに結合する能力についてスクリーニングした。すべての結果を表１３に示す。一次スクリーニングは、組換え細菌発現されたタンパク質を用いるＥＬＩＳＡ分析によりＬ７６２Ｐに対する反応性についてモノクローナル上清液を試験することであった。本発明者らは、次いで、ヒト上清液を、蛍光定量分析を用い、全細胞ＥＬＩＳＡにより表面発現されたＬ７６２Ｐに対する反応性について試験した。ｈｕｍａｂ上清液の特異的反応性を、関係のないプラスミドまたはＬ７６２Ｐを発現するプラスミドのいずれかでトランスフェクトされた細胞についてＦＡＣＳ分析を実施することにより確認した。ＦＩ／ＣＦＩは、関係のないヒト一次抗体に対する抗Ｌ７６２Ｐ ｈｕｍａｂ一次抗体の蛍光強度（ＦＩ）における相対的倍数の増加である。ＦＩ／ＣＦＩ／Ａ２０は、抗Ｌ７６２Ｐマウスモノクローナル抗体１５３Ａ２０．１の蛍光強度（ＦＩ）に対する、関係のないヒト一次抗体に対する抗Ｌ７６２Ｐ ｈｕｍａｂ一次抗体の蛍光強度（ＦＩ）における相対的倍数の増加である。ＦＩ／ＣＦＩ／Ｒ６９０は、抗Ｌ７６２Ｐウサギポリクローナル抗体のＦＩを超える、関係のないヒト一次抗体に対する抗Ｌ７６２Ｐ ｈｕｍａｂ一次抗体の蛍光強度（ＦＩ）における相対的倍数の増加である。ＦＡＣＳ ＶＲＬ７６２は、示されたモノクローナル抗体での染色後ポジティブであった、Ｌ７６２Ｐを発現するプラスミドでトランスフェクトされた細胞の百分率である。ＦＡＣＳ ＶＲ（−）は、示されたモノクローナル抗体での染色後ポジティブであった、関係のないプラスミドでトランスフェクトされた細胞の百分率である。ＥＬＩＳＡは、組換えＬ７６２Ｐタンパク質に対する示されたモノクローナル抗体のＯ．Ｄ．値である。表１３中、影のある行は、さらにクローン化され、そして特徴付けられる抗体を示す。
Figure 0004180919
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（実施例３２ ＨＬ５２３Ｓ特異的抗体のエピトープマッピングおよび精製）
この実施例は、ヒトＬ５２３ＳホモログとマウスＬ５２３Ｓホモログとの間を識別し得、そして同様にｈＬ５２３ＳファミリーメンバーとｈＬ５２３Ｓファミリーメンバーとの間（例えば、ｈＩＭＰ−１とｈＩＭＰ−２との間）を区別する、Ｌ５２３Ｓ抗体の精製を記載する。
Ｌ５２３Ｓ（配列番号３４７および３４８にそれぞれ提示される、完全長ｃＤＮＡおよびアミノ酸配列）は、ｈＩＭＰ−１およびｈＩＭＰ−２を含むタンパク質のファミリーの１つである。タンパク質のこのファミリーのメンバーは、互いに高い程度の類似性を有し、そしてまた種間で高度に類似している。従って、ヒトＬ５２３Ｓ（ｈＬ５２３Ｓ）を特異的に認識しかつヒトにおけるこのタンパク質ファミリーの他のメンバーもマウスホモログも認識しない、抗体を生成することは、問題があった。しかし、Ｌ５２３Ｓのタンパク質発現を検出することによって臨床前Ｌ５２３Ｓ ＤＮＡ／アデノウイルスワクチンおよび臨床Ｌ５２３Ｓ ＤＮＡ／アデノウイルスワクチンを評価するために、ヒトＬ５２３Ｓ特異的抗体は重要である。
ｈＬ５２３Ｓに特異的なポリクローナル抗体は、実施例２３に記載のように生成された。これらの抗体を、エピトープをマッピングするために用いた。このエピトープ分析は、認識されたｈＬ５２３Ｓの２つの特定のペプチド（ペプチド１６／１７およびペプチド３２）を示した。
次いで、ｈＬ５２３ＳおよびマウスＬ５２３Ｓ（ｍＬ５２３Ｓ）ペプチド１６／１７およびペプチド３２の両方のアミノ酸配列を比較した。ペプチド３２／３３は、ｈＬ５２３ＳおよびｍＬ５２３Ｓ間で同一である。しかし、以下のアラインメントが示すように、ペプチド１６／１７は、ヒトおよびマウスホモログ間で５つのアミノ酸の相違を有する（下線を引いた）。
ｈＬ５２３Ｓ（１６／１７）（配列番号４６８）：
ＩＰＤＥＭＡＡＱＱＮＰＬＱＱＰＲＧＲＲＧＬＧＱＲ
ｍＬ５２３Ｓ（１６／１７）（配列番号４６９）：
ＩＰＤＥＴＡＡＱＱＮＰＳＰＱＬＲＧＲＲＧＰＧＱＲ
さらに、ペプチドを基礎にしたＥＬＩＳＡは、ペプチド１７が、肺癌患者血清＃１９７により特異的に認識され、もそしてヒトＩＭＰ（ｈＩＭＰ）ファミリーメンバー間のペプチド１７の相同性サーチは、ファミリーメンバー間でこの領域に類似性がほとんどないことを示す。ｈＬ５２３ペプチド１７（および１６／１７）は、ｈＩＭＰ−１およびｈＩＭＰ−２のようなｈＬ５２３Ｓファミリーメンバーに対し、５０％未満の類似性を有している。
次いで、Ｌ５２３Ｓ特異的抗体のエピトープマッピングおよび相同性サーチからのデータに基づき、ｈＬ５２３Ｓ結合リガンドまたはｍＬ５２３Ｓペプチド１６／１７結合リガンドを、実施例２３に記載されたように、ｈＬ５２３Ｓタンパク質に対して生成されたウサギポリクローナル抗体からヒト特異的抗体またはマウスＬ５２３Ｓ特異的抗体を精製するために用いた。ｈＬ５２３Ｓ−ペプチド１６／１７またはｍＬ５２３Ｓ−ペプチド１６／１７のいずれかと結合したリガンドを用いる親和性クロマトグラフィーにより精製された抗体からのデータは、ｈＬ５２３Ｓ−ペプチド１６／１７に特異的な抗体の親和性が、ｍＬ５２３Ｓ−ペプチド１６／１７に対する抗体の親和性よりかなり高いことを示唆した。なぜなら、それらは、ｍＬ５２３Ｓ−ペプチド１６／１７に対してより、ｈＬ５２３Ｓ−ペプチド１６／１７に対して強く結合するからである。ヒトＬ５２３Ｓ−ペプチド１６／１７およびマウスＬ５２３Ｓ−ペプチド１６／１７に対する精製された抗体間の親和性の差異は、ペプチドを基礎にしたＥＬＩＳＡにより確認された。ｈＬ５２３Ｓ−ペプチド１６／１７により精製された抗体は、ヒトＬ５２３Ｓ−ペプチド１６／１７に選択的に結合したが、ｍＬ５２３Ｓ−ペプチド１６／１７にかなりより少なくにしか結合しなかったかまたは全く結合しなかった。
当初のポリクローナル抗体およびｈＬ５２３Ｓ−ペプチド１６／１７により精製された抗体をさらに特徴付けるために、ｈＬ５２３Ｓタンパク質の供給源としてヒト肺癌腺癌株、およびｍＬ５２３Ｓタンパク質の供給源としてマウスの全体胎児（妊娠１７日目）の両方を用いてイムノブロット分析を行った。この分析は、ｈＬ５２３Ｓに特異的なポリクローナル抗体が、腫瘍細胞株で発現されたｈＬ５２３Ｓタンパク質および妊娠１７日目の全体胎児で発現されたｍＬ５２３Ｓタンパク質を認識することを示した。しかし、ｈＬ５２３Ｓペプチド３２／３３の添加は、ヒトおよびマウスＬ５２３Ｓタンパク質に対する抗体の結合をブロックする。従って、ｍＬ５２３Ｓタンパク質に対するポリクローナル抗体の交差反応性は、ｈＬ５２３Ｓペプチド３２／３３に特異的な抗体の存在に起因する。これとは著しく対照的に、ｈＬ５２３Ｓペプチド１６／１７に特異的な精製された抗体は、マウス胎児中で発現されたｍＬ５２３Ｓタンパク質を結合しないが、ヒト肺腺癌細胞中で発現されたｈＬ５２３Ｓタンパク質を認識する。これらのデータは、上記のｈＬ５２３Ｓ−ペプチド１６／１７およびｍＬ５２３Ｓ−ペプチド１６／１７を用いるＥＬＩＳＡデータを確認する。
抗体を精製するために用いたｈＬ５２３Ｓペプチド１６／１７のアミノ酸配列は、ウェスタンブロット分析およびペプチドを基礎にしたＥＬＩＳＡにより、ｈＬ５２３Ｓ特異的抗体によって認識されないｍＬ５２３Ｓ−ペプチド１６／１７のアミノ酸配列と、約６０−７０％類似である。ｈＬ５２３Ｓペプチド１６／１７は、ｈＩＭＰ−１およびｈＩＭＰ−２のようなｈＬ５２３Ｓファミリーのメンバーと５０％未満の類似性を有している。ともに考慮すると、これらのデータは、本明細書に記載のｈＬ５２３ペプチド１６／１７により精製された抗体はまた、他のｈＬ５２３ＳファミリーのメンバーからｈＬ５２３Ｓタンパク質を区別するという高い蓋然性があることを示唆する。
要約すれば、ｈＬ５２３Ｓペプチド１６／１７で精製された抗体は、マウスＬ５２３Ｓホモログを認識しない。ｈＬ５２３Ｓファミリーのメンバー間のペプチド１６／１７のアミノ酸配列は、ヒトＬ５２３ＳとマウスＬ５２３Ｓとの間より類似性が少ない。従って、上記に記載のｈＬ５２３Ｓ特異的抗体を、ヒトおよびマウスＬ５２３Ｓの間、およびｈＬ５２３Ｓファミリーのタンパク質のメンバーの間を区別するために使用し得、そしてそれ故、動物およびヒトにおけるｈＬ５２３Ｓタンパク質発現の正確な検出のために用い得る。
（実施例３３ 肺腫瘍抗原Ｌ５２３のインビボ免疫原性）
この実施例３３は、Ｌ５２３を含むアデノウイルスまたはＬ５２３の裸のＤＮＡいずれかを用いるマウスのワクチン接種、次いで、Ｌ５２３を含むアデノウイルスを用いる第２のワクチン接種を評価するための、２つのインビボ免疫原性研究を記載する。
第１番目の研究は、Ｌ５２３アデノウイルスを用いるマウスの２つの系統の免疫化を含めた。マウスのＣ５７Ｂ１６系統は、ＨＬＡ型についてホモ接合型Ｈ−２ｂであり、その一方、Ｂ６Ｄ２（Ｆ１）系統は、ＨＬＡ型についてヘテロ接合型Ｈ−２ｂ／ｄである。表１４は、採用された初期免疫化戦略を記載する。
Figure 0004180919
 マウスを、１０８ＰＦＵのＬ５２３−アデノウイルスまたは１０７ＰＦＵの関係のないアデノウイルス（ｈｒＧＦＰ）のいずれかで皮内免疫した。免疫化の３週間後、Ｌ５２３に対するＩｇＧ１抗体応答およびＩｇＧ２ａ抗体応答をマウスのすべての群で調べた。簡単に述べると、組換え完全長Ｌ５２３（ｒＬ５２３）を、ＥＬＩＳＡプレート上にコートし、そして血清を、複数希釈でウェルに添加した。６０分のインキュベーションの後、血清をウェルから洗浄し、そしてＩｇＧ１またはＩｇＧ２のいずれかに特異的な二次抗体をプレートに添加した。両方の抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に直接結合させた。ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａいずれかのＬ５２３抗体のレベルをすべての群で測定した。Ｃ５７ＢＬ６マウスでは、免疫化の後、Ｌ５２３特異的抗体はほとんどないかまったく検出されなかった。しかし、Ｌ５２３アデノウイルスで免疫化したマウスのＢ６Ｄ２（Ｆ１）系統では、ＩｇＧ１ Ｌ５２３特異的抗体およびＩｇＧ２ａ Ｌ５２３特異的抗体の両方が、１／１０００程度の血清希釈で検出された。
血清中のＬ５２３特異的抗体を検出することに加えて、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）応答を、ｒＬ５２３タンパク質を用いたインビトロ刺激の後、免疫脾臓細胞からアッセイした。簡単に述べれば、脾臓細胞を、すべてのマウス群から採集し、そして９６ウェルプレート中で３日間培養した。培養条件は、培地単独、１μｇ／ｍｌのｒＬ５２３タンパク質または１０μｇ／ｍｌのｒＬ５２３タンパク質、または５μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を含めた。３日後、上清液を採集し、そしてこの上清液中のＩＦＮ−γレベルをアッセイした。
関係のないアデノウイルスではなくＬ５２３−アデノウイルスを用いた免疫化は、ｒＬ５２３で刺激された脾臓細胞から強いＩＦＮ−γ応答を惹起した。一般に、応答は、ＩＦＮ−γ産生のより高いレベル、およびより低い抗原濃度（１μｇ／ｍｌ）での刺激がより高い抗原濃度（１０μｇ／ｍｌ）で観察されるような等しく強い応答を惹起したという事実の両方により証明されるように、Ｂ６Ｄ２（Ｆ１）マウス系統でより強かった。
最後に、Ｔ細胞増殖応答を、ｒＬ５２３タンパク質でのインビトロ刺激により免疫脾臓細胞からアッセイした。簡単に述べると、脾臓細胞を、４日間、９６ウェルプレート中で、培地単独、１μｇ／ｍｌのｒＬ５２３タンパク質または１０μｇ／ｍｌのｒＬ５２３タンパク質、またはＣｏｎＡを用いて培養した。次いで、培養を、培養の最後の８時間の間、３Ｈ−チミジンでパルス化した。結果を、培地単独での刺激に対する、抗原の存在下での刺激指標（ＳＩ）として表している。結果は、ＩＦＮ−γアッセイで得た結果と一致した。関係のないアデノウイルスではなくＬ５２３−アデノウイルスでの免疫化は、ｒＬ５２３で刺激した脾臓細胞における増殖応答を惹起した。強いＳＩ（平均＞２０）が、Ｂ６Ｄ２（Ｆ１）マウス系統から採集された脾臓細胞で観察され、類似のレベルの増殖が両方のタンパク質濃度で観察された。Ｃ５７ＢＬ６マウス系統では、Ｔ細胞増殖は、ほとんどないかまたは観察されなかった。
第２の研究は、最初、Ｌ５２３の裸のＤＮＡを用いた２つの系統のマウスの免疫化、次いで、２週間後、Ｌ５２３アデノウイルスを用いた第２の免疫化を含めた。追加免疫の３週間後マウスを回収した。表１５は、第２の研究の免疫化レジメンを記載する。
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 第１の研究で記載されたように、Ｌ５２３−アデノウイルスを用いた免疫化の後、強いＩｇＧ１抗体応答およびＩｇＧ２ａ抗体応答が、Ｂ６Ｄ２（Ｆ１）マウスにおいて観察された。Ｌ５２３ＤＮＡを用いた免疫化は、Ｌ５２３−アデノウイルス単独での免疫化で達成された応答と比較して、全体のＬ５２３特異的抗体応答を増加するように見えた。Ｃ５７ＢＬ６マウスは、Ｌ５２３−アデノウイルスを用いた免疫化の後、Ｌ５２３特異的抗体応答をほとんどまたはまったく惹起しなかったが、Ｌ５２３ ＤＮＡで免疫化し、次いでＬ５２３−アデノウイルスで第２の免疫化をしたマウスでは、ある程度のわずかにポジティブな応答が検出された。
ＩＦＮ−γ応答を、ｒＬ５２３タンパク質を用いたインビトロの刺激による免疫脾臓細胞からアッセイした。これらの結果は、動物におけるＬ５２３の免疫原性を示す初期研究で観察された結果を確認する。この結果はまた、Ｌ５２３−アデノウイルスを用いた免疫化の前に、Ｌ５２３ ＤＮＡで動物を最初免疫化することは、ＣＤ４応答を有意に増加しないことを示唆する。初期研究でのように、応答は、マウスのＣ５７ＢＬ６系統よりもＢ６Ｄ２（Ｆ１）系統中で強いようである。
初期研究でのように、Ｔ細胞増殖応答を、ｒＬ５２３タンパク質を用いたインビトロ刺激による脾臓細胞からアッセイした。２つのラウンドの免疫化を用いた結果は、第１の研究から得た結果と一致している。Ｌ５２３−アデノウイルスを用いた第２のラウンドの免疫化の前のＬ５２３ ＤＮＡを用いた免疫化は、マウスで生成される増殖応答を有意に増加しなかった。第１の研究でのように、応答は、マウスのＣ５７ＢＬ６系統よりもＢ６Ｄ２（Ｆ１）系統中で強かった。
マウスの２つの系統間のＨＬＡ型の差異は、検出された免疫応答の程度における変動を説明し得る。上記のように、Ｃ５７ＢＬ６系統は、Ｈ−２ｂについてホモ接合型であり、その一方、Ｂ６Ｄ２（Ｆ１）は、Ｈ−２ｂ／ｄについてヘテロ接合型である。このＢ６Ｄ２（Ｆ１）系統ＨＬＡ型の増加した多様性は、提示されるべきＬ５２３タンパク質由来のより多くのエピトープを許容する。この系統では、Ｈ−２ｂおよびＨ−２ｄ両者に特異的なエピトープが提示され得、その一方、Ｈ−２ｂエピトープのみが、Ｃ５７ＢＬ６系統により提示され得る。
先行する記載から、本発明の特定の実施形態が例示の目的で本明細書中に記載されているが、本発明の思想および範囲を逸脱することなく種々の改変がなされ得ることが、認識されるべきである。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲以外によっては、制限されるものではない。
 配列表
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Claims (14)

  1. 配列番号468に示すアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド、又は配列番号468に示すアミノ酸配列の全長に対し少なくとも90％の配列同一性を示し、かつ配列番号 468 に示すポリペプチドと反応する抗体と免疫学的に反応する、その免疫応答性変異体ポリペプチド。
  2. 請求項1に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
  3. 発現制御配列と機能的に連結された請求項2に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  4. 請求項3に記載の発現ベクターで形質転換又はトランスフェクトした宿主細胞。
  5. 請求項1に記載のポリペプチドと特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
  6. ヒトL523S及びマウスL523Sを識別することができる請求項5に記載の抗体。
  7. hL523SとIGF-II mRNA結合タンパク質1(hIMP-1)又はIGF-II mRNA結合タンパク質2(hIMP-2)とを識別することができる請求項5に記載の抗体。
  8. モノクローナル抗体である請求項5に記載の抗体。
  9. 患者における肺癌の存在の検出を支援する方法であって、以下の工程：
    (a) 患者由来の生物学的サンプルを得る工程；
    (b) 該生物学的サンプルと請求項1に記載のポリペプチドに結合する請求項5に記載の抗体とを接触させる工程；
    (c)請求項5に記載の抗体に結合するポリペプチド量をサンプル中で検出する工程；及び
    (d) 予想されるカットオフ値とポリペプチドの量を比較する工程
    を含む前記方法。
  10. 請求項1に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質。
  11. 肺癌患者における免疫応答の刺激に使用するために組成物であって、受容可能なキャリア及び免疫賦活薬からなる群から選択される第1の成分と、以下よりなる群から選択される第2の成分とを含む組成物：
    (a) 請求項1に記載のポリペプチド；
    (b) 請求項2に記載のポリヌクレオチド；
    (c) 請求項5〜8のいずれか1項に記載の抗体；及び
    (d) 請求項10に記載の融合タンパク質。
  12. 患者の肺癌の治療に使用するための請求項11に記載の組成物。
  13. 肺癌を治療するための医薬の製造のための請求項11に記載の組成物の使用。
  14. 請求項5〜8のいずれか1項に記載の抗体を含む診断キット。
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