ES2303525T3 - Compuestos y metodos para el tratamiento y diagnostico de infeccion por chlamydia. - Google Patents

Compuestos y metodos para el tratamiento y diagnostico de infeccion por chlamydia. Download PDF

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ES2303525T3 ES01928775T ES01928775T ES2303525T3 ES 2303525 T3 ES2303525 T3 ES 2303525T3 ES 01928775 T ES01928775 T ES 01928775T ES 01928775 T ES01928775 T ES 01928775T ES 2303525 T3 ES2303525 T3 ES 2303525T3
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Abstract

Una composición que comprende: (a) un polipéptido que comprende: (i) la secuencia de aminoácidos de restos 8 a 660 de la Seq ID No:139, o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con ella, determinada comparando las dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación de restos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139; o (ii) una porción inmunogénica de los restos aminoacídicos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139 que tiene, al menos, 15 aminoácidos de longitud; o (b) un polinucleótido que codifica el polipéptido de (a); para uso en la diagnosis, tratamiento o prevención de infección por clamidia.

Description

Compuestos y métodos para el tratamiento y diagnóstico de infección por Chlamydia.
Campo técnico
La presente invención generalmente se refiere a la detección y tratamiento de la infección por Chlamydia. En particular, la invención se refiere a composiciones que contienen polipéptidos que comprenden un antígeno de Chlamydia y el uso de dichos polipéptidos para la serodiagnosis y el tratamiento de infección por Chlamydia.
Antecedentes de la invención
Las Chlamydias son patógenos bacterianos intracelulares responsables de una amplia variedad de importantes infecciones humanas y animales. Chlamydia trachomatis es una de las causas más comunes de enfermedades de transmisión sexual y pueden llevar a enfermedad inflamatoria pélvica (PID), dando como resultado obstrucción tubárica e infertilidad. Chlamydia trachomatis también puede jugar un papel en infertilidad masculina. En 1990, se estimó en 4 mil millones de dólares el coste para tratar la PID en los Estados Unidos. El tracoma, debido a infección ocular por Chlamydia trachomatis, es la primera causa de ceguera evitable a nivel mundial. Chlamydia pneumonia es la principal causa de infecciones agudas del tracto respiratorio en seres humanos y también se cree que juega un papel en la patogénesis de la ateraesclerosis y, en particular, en la enfermedad coronaria. Se ha visto que los individuos con un alto título de anticuerpos de Chlamydia pneumonia, tienen, al menos, el doble de probabilidad de sufrir enfermedades coronarias que los individuos seronegativos. Por ello, las infecciones por Chlamydia constituyen un importante problema de salud tanto en Estados Unidos como en el resto del mundo.
La base de datos EMBL, nº de acceso AE001333 (22 Julio 1998), por Stephens y cols., de la base de datos del EMBL, describe la sección 60 de 87 del genoma completo de Chlamydia trachomatis.
La infección por Chlamydia es a menudo asintomática. Por ejemplo, cuando una mujer buscar atención médica por PID, ya puede haberse dado un daño irreversible, dando como resultado infertilidad. Por ello, continúa la necesidad en la materia, de perfeccionar vacunas y composiciones farmacéuticas para la prevención y el tratamiento de infecciones por Chlamydia. La presente invención satisface esta necesidad y adicionalmente proporciona otras ventajas relacionadas.
Compendio de la invención
La presente invención proporciona composiciones para el diagnóstico y la terapia de la infección por Chlamydia. En un aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende:
(a)
un polipéptido que comprende:
(i)
la secuencia de aminoácidos de restos 8 a 660 de la Seq ID No:139, o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con ella, determinada comparando las dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación de restos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139; o
(ii)
una porción inmunogénica de restos aminoacídicos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139 que tiene, al menos, 15 aminoácidos de longitud; o
(b)
un polinucleótido que codifica el polipéptido de (a);
para uso en el diagnóstico, tratamiento o prevención de infección por Chlamydia.
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Ciertas porciones y otras variantes son inmunogénicas, de tal forma que la habilidad de la variante para reaccionar con antisuero específico de antígeno no está sustancialmente reducida.
En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones que comprenden una proteína de fusión que comprende un polipéptido que comprende:
(i)
la secuencia de aminoácidos de restos 8 a 660 de la Seq ID No:139, o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con ella, determinada comparando las dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación de restos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139; o
(ii)
una porción inmunogénica de restos aminoacídicos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139 que tiene, al menos, 15 aminoácidos de longitud;
para uso en el diagnóstico, tratamiento o prevención de infección por Chlamydia.
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Dentro de otros aspectos, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una composición que comprende:
(a)
un polipéptido que comprende:
(i)
la secuencia de aminoácidos de restos 8 a 660 de la Seq ID No:139, o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con ella, determinada comparando las dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación de restos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139; o
(ii)
una porción inmunogénica de restos aminoacídicos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139 que tiene, al menos, 15 aminoácidos de longitud; o
(b)
un polinucleótido que codifica el polipéptido de (a); y un vehículo fisiológicamente aceptable.
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La invención también proporciona vacunas para propósitos profilácticos y terapéuticos que comprenden una composición que comprende:
(a)
un polipéptido que comprende:
(i)
la secuencia de aminoácidos de restos 8 a 660 de la Seq ID No:139, o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con ella, determinada comparando las dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación de restos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139; o
(ii)
una porción inmunogénica de restos aminoacídicos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139 que tiene, al menos, 15 aminoácidos de longitud; o
(b)
un polinucleótido que codifica el polipéptido de (a); y un inmunoestimulante, por ejemplo, un adyuvante.
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También se proporciona el uso de:
(a)
un polipéptido que comprende:
(i)
la secuencia de aminoácidos de restos 8 a 660 de la Seq ID No:139, o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con ella, determinada comparando las dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación de restos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139; o
(ii)
una porción inmunogénica de restos aminoacídicos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139 que tiene, al menos, 15 aminoácidos de longitud; o
(b)
un polinucleótido que codifica el polipéptido de (a);
en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de infección por Chlamydia, en la detección de infección por Chlamydia en un paciente y en la fabricación de un kit de diagnóstico para la detección de infección por Chlamydia en un paciente.
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Identificadores de secuencia
SEQ ID NO:1
representa una secuencia de ADN identificada para el clon E4-A2-39 (CT10 positivo) que tiene 1311 pares de bases y contiene el ORF completo para CT460 (SWIB) y un ORF parcial para CT461 (yaeI).
SEQ ID NO:2
representa una secuencia de ADN para el clon E2-B10-52 (CT10 positivo) que tiene un inserto de 1516 pares de bases que contiene ORFs parciales para los genes CT827 (cadena grande de nrdA-ribonucleósido reductasa) y CT828 (cadena pequeña de ndrB-ribonucleósido reductasa). Estos genes tal como nos se identificaron en un escrutinio con un banco de Ct L2.
SEQ ID NO:3
representa una secuencia de ADN para el clon El-Bl-80 (CT10 positivo) (2397pares de bases) que contiene ORFs parciales para varios genes, CT812 (pmpD), CT015 (phoH ATPasa), CT016 (proteína hipotética) y pGpl-D (gen del plásmido C. trachomatis).
SEQ ID NO:4
representa una secuencia de ADN para el clon E4-F9-4 (CT10, CL8, CT1, CT5, CT13, y CHH037 positivo) que contiene un inserto de 1094 pares de bases que tiene un ORF parcial para el gen CT316 (proteína ribisómica L7/L12) así como un ORF parcial para el gen CT315 (RNA polimerasa beta).
SEQ ID NO:5
como se representa en una secuencia de ADN para el clon E2-H6-40 (CT3 positivo) que tiene un inserto de 2129 pares de bases que contiene el ORF completo para el gen CT288 y fragmentos muy pequeños de genes CT287 y CT289. Los genes en este clon no han sido identificados por escrutinio en un banco de Ct L2.
SEQ ID NO:6
representa una secuencia de ADN para el clon E5-D4-2 (CT3, CT10, CT1, CT5, CT12, y CHH037 positivo) que tiene un inserto de 1828 pares de bases que contiene un ORF parcial para el gen CT378 (pgi), un ORF completo para el gen CT377 (ltuA) y un ORF completo para el gen CT376 (malato deshidrogenasa). Además, las líneas de pacientes CT10, CT1, CT5, CT12, y CHH037 también identificaron este clon.
SEQ ID NO:7
representa una secuencia de ADN para el clon E6-C1-31 (CT3 positivo) que tiene un inserto de 861 pares de bases que contiene un ORF parcial para el gen CT858.
SEQ ID NO:8
representa una secuencia de ADN para el clon E9-E11-76 (CT3 positivo) que contiene un inserto de 763 pares de bases que es una región amino terminal del gen para CT798 (Glucógeno sintasa). Este gen no ha sido identificado en un escrutinio previo con un banco de Ct L2.
SEQ ID NO:9
representa una secuencia de ADN para el clon E2-A9-26 (CT1-positivo) que contiene parte del gen para ORF-3 que se encuentra en el plásmido en Chlamydia trachomatis.
SEC ID Nº 10
representa una secuencia de ADN para el clon E2-G8-94 (CT1-positivo) que tiene el extremo carboxilo terminal del gen Lpda, así como un ORF parcial para CT556.
SEC ID Nº 11
representa una secuencia de ADN para el clon El-Hl-14 (CT1 positivo) que tiene un inserto de 1474 pares de bases que contiene la parte amino terminal de un ORF Lpda en la hebra complementaria.
SEC ID Nº 12
representa una secuencia de ADN para el clon E1-A5-53 (CT1 positivo) que contiene un inserto de 2017 pares de bases que tiene una porción amino terminal del ORF para el gen dnaK en la hebra complementaria, un ORF parcial para el gen grpE gene (CT395) y un ORF parcial para CT166.
SEC ID Nº 13
representa una secuencia de ADN para el clon E3-A1-50 (positivo en la línea CT1) quetiene1199 pares de bases y contiene la porción carboxi terminal del ORF para CT622.
SEC ID Nº 14
representa una secuencia de ADN para el clon E3-E2-22 que tiene 877 pares de bases, que contiene un ORF completo para CT610 en la hebra complementaria, y era positivo en ambas líneas CT3 y CT10.
SEC ID Nº 15
representa la secuencia de ADN para el clon E5-E2-10 (CT10 positivo) quetiene427 pares de bases y contiene un ORF parcial para la proteína principal de superficie de membrana omp1.
SEC ID Nº 16
representa la secuencia de ADN para el clon E2-D5-89 (516 pares de bases) que es un clon CT10 positivo que contiene un ORF parcial para el gen pmpD (CT812).
SEC ID Nº 17
representa la secuencia de ADN para el clon E4-G9-75 (CT10 positivo) quetiene723 pares de bases y contiene un ORF parcial para la región amino terminal del gen pmpH (CT872).
SEC ID Nº 18
representa la secuencia de ADN para el clon E3-F2-37 (inserto de 1377 pares de bases CT10, CT3, CT11, y CT13 positivo) que contiene un ORF parcial para el gen tRNA-Trp (CT322) y un ORF completo para el gen secE (CT321).
SEC ID Nº 19
representa la secuencia de ADN para el clon E5-A11-8 (de 1736 pares de bases CT10 positivo) que contiene el ORF completo para groES (CT111) y la mayoría del ORF para groEL (CT110).
SEC ID Nº 20
representa la secuencia de ADN para el clone E7-H11-61 (de 1135 pares de bases CT3 positivo) que tiene insertos parciales para fliA (CT061), tyrS (CT062), TSA CT603) y una proteína hipotética(CT602).
SEC ID Nº 21
representa una secuencia de ADN para el clon E6-C8-95 que contiene un inserto de 731 pares de bases que se identificó utilizando líneas donantes CT3, CT1, y la línea CT12. Este inserto tiene una mitad carboxi terminal para el gen para el ORF de 60 kDa.
SEC ID Nº 22
representa la secuencia de ADN para el clon (CT3 positivo) que contiene un inserto de 1181 pares de bases que es un ORF parcial para el gen nrdA. El ORF para este gen también se identificó del clon E2-B10-52 (CT10 positivo).
SEC ID Nº 23
representa la secuencia de ADN para el clon E1-F9-79 (167 pares de bases; CT11 positivo) que contiene un ORF parcial para el gen CT133 en la hebra complementaria. CT133 es una rRNA metilasa predicha.
SEC ID Nº 24
representa la secuencia de ADN para el clon E2-G12-52 (1265 pares de bases; CT11 positivo) que contiene un ORF parcial para clpB, una proteasa ATPasa.
SEC ID Nº 25
representa la secuencia de ADN para el clon E4-H3-56 (inserto de 463 pares de bases; CT1 positivo) que contiene un ORF parcial para el gen TSA (CT603) en la hebra complementaria.
SEC ID Nº 26
representa la secuencia de ADN para el clon E5-E9-3 (CT1 positivo) que contiene un inserto de 636 pares de bases codificando parcialmente el ORF para el gen de tipo dnaK. Parte de esta secuencia también se identificó en el clon E1-A5-53.
SEQ ID NO:27
representa la secuencia de ADN serovar E de longitud completa de CT875.
SEQ ID NO:28
representa la secuencia de ADN serovar E de longitud completa de CT622.
SEQ ID NO:29
representa la secuencia de ADN para el clon E3-B4-18 (CT1 positivo) que contiene un inserto de 1224 pares de bases que contiene 4 ORFs. El ORF completo para CT772, y los ORFs parciales de CT771, CT191, y CT190.
SEQ ID NO:30
representa la secuencia de ADN para el clon E9-E10-51 (CT10 positivo) que contiene un inserto de 883 pares de bases que contiene dos ORF parciales, CT680 y CT679.
SEQ ID NO:31
representa la secuencia de ADN del clon E9-D5-8 (CT10, CT1, CT4, y CT11 positivo) que contiene un inserto de 393 pares de bases que contiene el ORF parcial para CT680.
SEQ ID NO:32
representa la secuencia de ADN del clon E7-B1-16 (CT10, CT3, CT5, CT11, CT13, y CHH037 positivo) que contiene un inserto de 2577 pares de bases que contiene tres ORFs, dos ORFs de longitud completa para CT694 y CT695 y el tercero contiene la porción N-terminal de CT969.
SEQ ID NO:33
representa la secuencia de ADN del clon E9-G2-93 (CT10 positivo) que contiene un inserto de 554 pares de bases que contiene un ORF parcial para CT178.
SEQ ID NO:34
representa la secuencia de ADN del clon E5-A8-85 (CT1 positivo) que contiene un inserto de 1433 pares de bases que contiene dos ORFs parciales para CT875 y CT001.
SEQ ID NO:35
representa la secuencia de ADN del clon E10-C6-45 (CT3 positivo) que contiene un inserto de 196 pares de bases que contiene un ORF parcial para CT827.
SEQ ID NO:36
representa la secuencia de ADN del clon E7-H11-10 (CT3 positivo) que contiene un inserto de 1990 pares de bases que contiene los ORFs parciales de CT610 y CT613 y los ORFs completos de CT611 y CT612.
SEQ ID NO:37
representa la secuencia de ADN del clon E2-F7-11 (CT3 y CT10 positivo) que contiene un inserto de2093 pares de bases. Este contiene una amplia región de CT609, un ORF completo para CT610 y un ORF parcial para CT611.
SEQ ID NO:38
representa la secuencia de ADN del clon E3-A3-31 (CT1 positivo) que contiene un inserto de 1834 pares de bases que contiene una amplia región de CT622.
SEQ ID NO:39
representa la secuencia de ADN del clon E1-G9-23 (CT3 positivo) que contiene un inserto de 1180 pares de bases que contiene casi la totalidad del ORF para CT798.
SEQ ID NO:40
representa la secuencia de ADN del clon E4-D6-21 (CT 3 positivo) que contiene un inserto de 1297 pares de bases que contiene los ORFs parciales de CT329 y CT327 y el ORF completo de CT328.
SEQ ID NO:41
representa la secuencia de ADN del clon E3-F3-18 (CT1 positivo) que contiene un inserto de 1141 pares de bases que contiene el ORF parcial de CT871.
SEQ ID NO:42
representa la secuencia de ADN del clon E10-B2-57 (CT10 positivo) que contiene un inserto de 822 pares de bases que contiene el ORF completo de CT066.
SEQ ID NO:43
representa la secuencia de ADN del clon E3-F3-7 (CT1 positivo) que contiene un inserto de 1643 pares de bases que contiene los ORFs parciales de CT869 y CT870.
SEQ ID NO:44
representa la secuencia de ADN del clon E10-H8-1 (CT3 y CT10 positivo) que contiene un inserto de 1862 pares de bases que contiene los ORFs parciales de CT871 y CT872.
SEQ ID NO:45
representa la secuencia de ADN del clon E3-D10-46 (CT1, CT3, CT4, CT11, y CT12 positivo) que contiene un inserto de 1666 pares de bases que contiene los ORFs parciales para CT770 y CT773 y el ORF completo para CT771 y CT722.
SEQ ID NO:46
representa la secuencia de ADN del clon E2-D8-19 (CT1 positivo) que contiene un inserto de 2010 pares de bases que contiene ORFs parciales, ORF3 y ORF6, y ORFs completos, ORF4 y ORGF5.
SEQ ID NO:47
representa la secuencia de ADN del clon E4-C3-40 (CT10 positivo) que contiene un inserto de 2044 pares de bases que contiene el ORF parcial para CT827 y un ORF completo para CT828.
SEQ ID NO:48
representa la secuencia de ADN del clon E3-H6-10 (CT12 positivo) que contiene un inserto de 3743 pares de bases que contiene los ORFs parciales para CT223 y CT229 y los ORFs completos para CT224, CT225, CT226, CT227, y CT228.
SEQ ID NO:80
representa la secuencia de ADN serovar D de longitud completa del gen CT872 de Chlamydia trachomatis.
SEC ID Nº 81
representa la secuencia de ADN serovar D de longitud completa del gen CT828 de Chlamydia trachomatis.
SEC ID Nº 82
representa la secuencia de ADN serovar D de longitud completa del gen CT827 de Chlamydia trachomatis.
SEQ ID NO:83
representa la secuencia de ADN serovar D de longitud completa del gen CT812 de Chlamydia trachomatis.
SEQ ID NO:84
representa la secuencia de ADN serovar D de longitud completa del gen CT798 de Chlamydia trachomatis.
SEC ID Nº 85
representa la secuencia de ADN serovar D de longitud completa del gen CT681 (MompF) de Chlamydia trachomatis.
SEQ ID NO:86
representa la secuencia de ADN serovar D de longitud completa del gen CT603 de Chlamydia trachomatis.
SEQ ID NO:87
representa la secuencia de ADN serovar D de longitud completa del gen CT460 de Chlamydia trachomatis.
SEQ ID NO:88
representa la secuencia de ADN serovar D de longitud completa del gen CT322 de Chlamydia trachomatis.
SEQ ID NO:89
representa la secuencia de ADN serovar D de longitud completa del gen CT321 de Chlamydia trachomatis.
SEQ ID NO:90
representa la secuencia de ADN serovar D de longitud completa del gen CT289 de Chlamydia trachomatis.
SEQ ID NO:91
representa la secuencia de ADN serovar D de longitud completa del gen CT288 de Chlamydia trachomatis.
SEQ ID NO:92
representa la secuencia de ADN serovar D de longitud completa del gen CT287 de Chlamydia trachomatis.
SEQ ID NO:93
representa la secuencia de ADN serovar D de longitud completa del gen CT133 de Chlamydia trachomatis.
SEQ ID NO:94
representa la secuencia de ADN serovar D de longitud completa del gen CT113 de Chlamydia trachomatis.
SEQ ID NO:95
representa la secuencia de aminoácidos serovar D de longitud completa del gen CT872 de Chlamydia trachomatis.
SEQ ID NO:96
representa la secuencia de aminoácidos serovar D de longitud completa del gen CT828 de Chlamydia trachomatis.
SEQ ID NO:97
representa la secuencia de aminoácidos serovar D de longitud completa del gen CT827 de Chlamydia trachomatis.
SEQ ID NO:98
representa la secuencia de aminoácidos serovar D de longitud completa del gen CT812 de Chlamydia trachomatis.
SEQ ID NO:99
representa la secuencia de aminoácidos serovar D de longitud completa del gen CT798 de Chlamydia trachomatis.
SEQ ID NO:100
representa la secuencia de aminoácidos serovar D de longitud completa del gen CT681 de Chlamydia trachomatis.
SEQ ID NO:101
representa la secuencia de aminoácidos serovar D de longitud completa del gen CT603 de Chlamydia trachomatis.
SEQ ID NO:102
representa la secuencia de aminoácidos serovar D de longitud completa del gen CT460 de Chlamydia trachomatis.
SEQ ID NO:103
representa la secuencia de aminoácidos serovar D de longitud completa del gen CT322 de Chlamydia trachomatis.
SEQ ID NO:104
representa la secuencia de aminoácidos serovar D de longitud completa del gen CT321 de Chlamydia trachomatis.
SEQ ID NO:105
representa la secuencia de aminoácidos serovar D de longitud completa del gen CT289 de Chlamydia trachomatis.
SEQ ID NO:106
representa la secuencia de aminoácidos serovar D de longitud completa del gen CT288 de Chlamydia trachomatis.
SEQ ID NO:107
representa la secuencia de aminoácidos serovar D de longitud completa del gen CT287 de Chlamydia trachomatis.
SEQ ID NO:108
representa la secuencia de aminoácidos serovar D de longitud completa del gen CT133 de Chlamydia trachomatis.
SEQ ID NO:109
representa la secuencia de aminoácidos serovar D de longitud completa del gen CT113 de Chlamydia trachomatis.
SEQ ID NO:114
representa la secuencia de ADN del clon E7-B12-65 (CHH037 positivo) que contiene un inserto de 1179 pares de bases que contiene un ORF completo para 376.
SEQ ID NO:115
representa la secuencia de ADN del clon E4-H9-83 (CHH037 positivo) que contiene el ORF parcial para la proteína de choque térmico GroEL (CT110).
SEQ ID NO:116
representa la secuencia de ADN del clon E9-B10-52 (CHH037 positivo) que contiene el ORF parcial para el gen yscC (CT674).
SEQ ID NO:117
representa la secuencia de ADN del clon E7-A7-79 (CHH037 positivo) que contiene el ORF completo para el gen de desarrollo tipo histona hctA (CT743) y un ORF parcial para el gen del rRNA de metiltransferasa ygcA (CT742).
SEQ ID NO:118
representa la secuencia de ADN del clon E2-D11-18 (CHH037 positivo) que contiene el ORF parcial para hctA(CT743).
SEQ ID NO:119
representa la secuencia de ADN para la proteína hipotética serovar E CT694 de Chlamydia trachomatis.
SEQ ID NO:120
representa la secuencia de ADN para la proteína hipotética serovar E CT695 de Chlamydia trachomatis.
SEQ ID NO:121
representa la secuencia de ADN para la proteína L1 ribosomal serovar E de Chlamydia trachomatis.
SEQ ID NO:122
representa la secuencia de aminoácidos para la proteína hipotética serovar E CT694 de Chlamydia trachomatis.
SEQ ID NO:123
representa la secuencia de aminoácidos para la proteína hipotética serovar E CT695 de Chlamydia trachomatis.
SEQ ID NO:124
representa la secuencia de aminoácidos para la proteína L1 ribosomal serovar E CT695 de Chlamydia trachomatis.
SEQ ID NO:125
representa la secuencia de ADN del clon E9-H6-15 (CT3 positivo) que contiene el ORF parcial para el gen pmpB (CT413).
SEQ ID NO:126
representa la secuencia de ADN del clon E3-D10-87 (CT1 positivo) que contiene los ORFs parciales para los genes hipotéticos CT388 y Ct389.
SEQ ID NO:127
representa la secuencia de ADN del clon E9-D6-43 (CT3 positivo) que contiene el ORF parcial para el CT858.
SEQ ID NO:128
representa la secuencia de ADN del clon E3-D10-4 (CT1 positivo) que contiene El ORF parcial para pGP3-D, un ORF codificado en el plásmido pCHL1.
SEQ ID NO:129
representa la secuencia de ADN del clon E3-G8-7 (CT1 positivo) que contiene los ORFs parciales para el CT557 (LpdA) y CT558 (LipA).
SEQ ID NO:130
representa la secuencia de ADN del clon E3-F11-32 (CT1 positivo) que contiene el ORF parcial para pmpD (CT812).
SEQ ID NO:131
representa la secuencia de ADN del clon E2-F8-5 (CT12 positivo) que contiene el ORF completo para el ORF de 15 kDa (CT442) y un ORF parcial para el ORF de 60 kDa.
SEQ ID NO:132
representa la secuencia de ADN del clon E2-G4-39 (CT12 positivo) que contiene el ORF parcial para el ORF de 60 kDa (CT443).
SEQ ID NO:133
representa la secuencia de ADN del clon E9-D1-16 (CT10 positivo) que contiene el ORF parcial para pmpH (CT872).
SEQ ID NO:134
representa la secuencia de ADN del clonE3-F3-6 (CT1 positive) que contiene los ORFs parciales de los genes genes accB (CT123), L1 ribosomal (CT125) y S9 ribosomal (CT126).
SEQ ID NO:135
representa la secuencia de ADN del clon E2-D4-70 (CT12 positivo) que contiene el ORF parcial para el gen pmpC (CT414).
SEQ ID NO:136
representa la secuencia de ADN del clon E5-A1-79 (CT1 positivo) que contiene el ORF parcial para ydhO (CT127), un ORF completo para el gen ribosomal S9 (CT126), un ORF completo para el gen L1 ribosomal (CT125) y un ORF parcial para accC (CT124).
SEQ ID NO:137
representa la secuencia de ADN del clon E1-F7-16 (CT12, CT3, y CT11 positivo) que contiene el ORF parcial para el gen ftsH (CT841) y el ORF entero para el gen pnp (CT842).
SEQ ID NO:138
representa la secuencia de ADN del clon E1-D8-62 (CT12 positivo) que contiene el ORF parcial para el gen ftsH (CT841) y para el gen pnp (CT842).
SEQ ID NO:139
representa la secuencia de aminoácidos para la proteína serovar E CT622.
SEQ ID NO:140
representa la secuencia de aminoácidos para la proteína serovar E CT875.
Descripción de las realizaciones ilustrativas
Como se ha indicado más arriba, la presente invención está generalmente dirigida a composiciones para el diagnóstico y tratamiento de infección por Chlamydia. En un aspecto, las composiciones de la invención incluyen polipéptidos que comprenden ((i) la secuencia de aminoácidos de restos 8 a 660 de la Seq ID No:139, o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con ella, determinada comparando las dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación de restos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139; o (ii) una porción inmunogénica de restos aminoacídicos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139 que tiene, al menos, 15 aminoácidos de longitud.
Composiciones de polinucleótidos
Tal como se utiliza aquí, los términos "segmento de ADN" y "polinucleótido" se refieren a una molécula de ADN que ha sido aislada libre de ADN genómico total de unas especies en particular. Por tanto, un segmento de ADN que codifica un polipéptido se refiere a un segmento de ADN que contiene una o más secuencias codificantes es aún sustancialmente asilada de, o purificada libre de, ADN genómico total de las especies de las que el segmento de ADN es obtenido. Incluídos dentro de los términos "segmento de ADN" y "polinucleótido" están los segmentos de ADN y los fragmentos más pequeños de dichos segmentos, y también vectores recombinantes, incluyendo, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagémidos, fagos, virus, y similares.
Tal como se entetenderá por aquellos expertos en la materia, los segmentos de ADN de uso en esta invención pueden incluir secuencias genómicas, secuencias extra-genómicas y secuencias codificadas por plásmidos y segmentos génicos manipulados más pequeños que expresan, o pueden estar adaptados para expresar, proteínas, polipéptidos, péptidos y similares. Dichos segmentos pueden ser aislados naturalmente, o modificados sintéticamente por la mano del hombre.
"Aislado," tal como se utiliza aquí, significa que un polinucleótido está sustancialmente lejos de otras secuencias codificantes, y que el segmento de ADN no contiene grandes porciones de ADN codificante no relacionado, como grandes fragmentos cromosómicos u otros genes funcionales o regiones codificantes de polipéptidos. Por supuesto, esto se refiere al segmento de ADN tal como se aisló originalmente, y no excluye genes o regiones codificantes añadidas más tarde al segmento por la mano del hombre.
Tal como se reconocerá por el experto en la materia, los polinucleótidos pueden ser de hebra sencilla (codificantes o antisentido) o de doble hebra, y pueden ser moléculas de ADN (genómico, cDNA o sintético) o de ARN. Las moléculas de ARN incluyen moléculas HnRNA, que contienen intrones y corresponden a una molécula de ADN en una manera uno-a-uno, y moléculas de ARNm, que no contienen intrones. Las secuencias codificantes o no codificantes adicionales pueden, pero no tienen por qué, estar presentes dentro de un polinucleótido de uso en la presente invención, y un polinucleótido puede, pero no tiene por qué, estar unido a otras moléculas y/o materiales de soporte.
Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia nativa de Chlamydia o pueden comprender una variante, o un equivalente funcional biológico o antigénico de dicha secuencia. Las variantes de polinucleótido pueden contener una o más sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones, tal como se describe más abajo, preferiblemente de tal forma que la inmunogenicidad del polipéptido codificado no está reducida, en relación a una proteína nativa de Chlamydia. El efecto en la inmunogenicidad del péptidos codificado, generalmente puede valorarse como aquí se describe. El término "variantes" también abarca genes homólogos de origen xenogénico.
Cuando se comparan secuencias de polinucleótido o polipéptido, se dice que dos secuencias son "idénticas" si la secuencia de nucleótidos o aminoácidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinean para la máxima correspondencia, tal como se describe abajo. Las comparaciones entre dos secuencias se realizan típicamente por comparación de las secuencias sobre una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similaridad de secuencia. Una "ventana de comparación" tal como aquí se utiliza, se refiere a un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, usualmente 30 a aproximadamente 75, 40 a aproximadamente 50, en la que una secuencia puede ser comparada a una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias estén óptimamente alineadas.
El alineamiento óptimo de las secuencias para su comparación puede ser realizado utilizando el programa Megalign en el conjunto Lasergene del software de bioinformática software (DNASTAR, Inc., Madison, WI), utilizando parámetros por defecto. Este programa realiza varios esquemas de alineamiento descritos en las siguientes referencias: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. En Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. y Sharp, P.M. (1989) CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. y Muller W. (1988) CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D. (1971) Comb. Theor 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R. (1973) Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J. (1983) Proc. Natl. Acad., Sci. USA 80:726-730.
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De forma alternativa, el alineamiento óptimo de secuencias para su comparación puede ser realizado por el algoritmo de identidad local de Smith y Waterman (1981) Add. APL. Math 2:482, por el algoritmo de identidad de alineamiento de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, por los métodos de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, por implementaciones computerizada de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en el paquete de Genetics Software de Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI), o por reconocimiento.
Un ejemplo preferido de algoritmos que son apropiados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que están descritos en Altschul y cols. (1977) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402 y Altschul y cols. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. BLAST and BLAST 2.0 pueden ser usados, por ejemplo con los parámetros aquí descritos, para determinar el porcentaje de identidad de secuencia para los polinucleótidos y polipéptidos de uso en la invención. El Software para realizar los análisis por BLAST se encuentra disponible públicamente en el Centro Nacional para la Información Biotecnológica. En un ejemplo ilustrativo, los resultados acumulados pueden ser calculados utilizando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (resultado recompensa para un par de restos emparejados; siempre >0) y N (resultado de sanción para restos no emparejados; siempre <0). Para secuencias de aminoácidos, puede ser utilizada una matriz de puntuación para calcular el resultado acumulativo. La extensión del golpe de palabra en cada dirección se para cuando: el resultado de alineamiento acumulativo se cae por la cantidad X de su valor máximo alcanzado; el valor acumulativo tiende a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de restos de resultado negativo; o cuando se alcanza el fin de cada secuencia. Los parámetros W, T y X del algoritmo de BLAST determinan la sensibilidad y rapidez del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, y una esperanza (E) de 10, y los alineamientos de la matriz de resultado BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915), (B) de 50, experanza (E) de 10,M=5, N=-4 y una comparación de ambas hebras.
Preferiblemente, el "porcentaje de identidad de secuencia" se determina por comparación de dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación de al menos 20 posiciones, donde la porción de la secuencia del polinucleótido o polipéptido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, espacios) del 20 por ciento o menos, usualmente del 5 al 15 por ciento, o del 10 al 12 por ciento, en comparación con las secuencias de referencia (que no comprenden adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando del número de posiciones donde ocurre la identidad de bases de ácido nucleico o restos de aminoácido en ambas secuencias para producir el número de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones emparejadas por el número total de posiciones en la secuencia de referencia (es decir, el tamaño de ventana) y multiplicando los resultados por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.
Por tanto, la presente invención usa secuencias de polinucleótidos y polipéptidos que tienen identidad sustancial con las secuencias aquí descritas, es decir aquellas que comprenden al menos el 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más, de identidad de secuencia comparadas con una secuencia de polinucleótidos o polipéptido de uso en esta invención, utilizando los métodos aquí descritos, (por ejemplo, análisis BLAST usando parámetros clásicos, tal como se describe abajo). Una persona experta en la materia reconocerá que estos valores pueden ser ajustados de forma apropiada para determinar la identidad equivalente de proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos, teniendo en cuenta la degeneración del codón, la similaridad de aminoácidos, el posicionamiento del marco de lectura y similares.
En realizaciones adicionales, la presente invención utiliza polinucleótidos y polipéptidos aislados que comprenden varias longitudes de tramos contiguos de secuencias idénticas a o complementarias a una o más de las secuencias aquí reveladas. Por ejemplo, los polinucleótidos son aportados por esta invención que comprende al menos, aproximadamente 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 o 1000 o más nucleótidos contiguos de una o más de las secuencias aquí reveladas así como todas las longitudes intermedias entre ellas. Se entendería fácilmente que "longitudes intermedias", en este contexto, significa cualquier longitud entre los valores citados, como 50, 51, 52, 53, etc.; 100, 101, 102, 103, etc.; 150, 151, 152, 153, etc.; incluyendo todos los números enteros a través de 200-500; 500-1,000, y similares.
Los polinucleótidos de uso en la presente invención, o fragmentos de los mismos, a pesar de la longitud de la secuencia codificante en sí misma, pueden ser combinados con otras secuencias de ADN, como promotores, señales de poliadenilación, sitios adicionales para enzimas de restricción, múltiples sitios de clonaje, otros segmentos codificantes, y similares, de tal forma que su longitud total puede variar considerablemente. Por ello, está contemplado el que se pueda emplear un fragmento de ácido nucleico de casi cualquier longitud, con la longitud total preferiblemente estando limitada por la facilidad de preparación y uso en el protocolo previsto de ADN recombinante. Por ejemplo, segmentos ilustrativos de ADN con longitudes totales de aproximadamente 10.000, aproximadamente 5.000, aproximadamente 3.000, aproximadamente 2.000, aproximadamente 1.000, aproximadamente 500, aproximadamente 100 aproximadamente 50 pares de bases de longitud, y similares (incluyendo todas las longitudes intermedias) están contemplados para ser útiles en muchas implementaciones de esta invención.
Los segmentos o fragmentos pequeños de polinucleótidos pueden ser preparados fácilmente por, por ejemplo, síntesis directa del fragmento por medios químicos, tal como se practica de forma común utilizando un sintetizador automatizado de oligonucleótidos. También, los fragmentos se pueden obtener por aplicación de tecnología de reproducción de ácido nucleico, como la tecnología PCR^{TM} de la Patente de EE.UU 4,683,202, introduciendo secuencias seleccionadas dentro de vectores recombinantes para la producción recombinante, y por otras técnicas de ADN recombinante conocidas por aquellos expertos en la materia de la biología molecular.
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Caracterización e identificación de polinucleótidos
Los polinucleótidos pueden ser identificados, preparados y/o manipulados utilizando cualquiera de las variadas técnicas bien establecidas. Por ejemplo, un polinucleótido puede ser identificado, por escrutinio de una micromatriz de cDNAs para la expresión en Chlamydia. Dichos escrutinios pueden realizarse, por ejemplo, utilizando una micromatriz Synteni (Palo Alto, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (y esencialmente como se describe por Schena y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619, 1996 y Heller y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155, 1997). De forma alternativa, los polinucleótidos pueden ser amplificados a partir de cDNA preparado de células que expresan las proteínas aquí descritas. Dichos polinucleótidos pueden ser amplificados vía reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Para esta propuesta, los cebadores específicos de secuencia se pueden diseñar basándose en las secuencias aquí proporcionadas, y pueden ser comprados o sintetizados.
Una porción amplificada de un polinucleótido de uso en la presente invención puede ser utilizada para aislar, de un banco apropiado, un gen en toda su longitud (por ejemplo, banco de cDNA de Chlamydia) utilizando técnicas bien conocidas. Dentro de dichas técnicas, un banco (de cDNA o genómica) ses escrutado usando una o más sondas de polinucleótido o cebadores apropiados para la amplificación. Preferiblemente, un banco se selecciona en tamaño para incluir moléculas más grandes. Los principales bancos al azar también pueden ser preferidos para identificar regiones 5' y río arriba de genes. Se prefieren los bancos genómicos para obtener intrones y extender secuencias 5'.
Para las técnicas de hibridación, una secuencia parcial puede ser marcada (por ejemplo, por nick-traslation o marcado final con ^{32}P) utilizando técnicas bien conocidas. Luego, generalmente se escruta un banco bacteriano o de bacteriófagos hibridando filtros que contienen colonias bacterianas desnaturalizadas (o césped de cultivo de bacterias que contienen placas de fagos) con la sonda marcada (ver Sambrook y cols., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Las colonias hibridadas se seleccionan y expanden, y se aísla el ADN para su posterior análisis. Los clones de cDNA deben ser analizados para determinar la cantidad de secuencia adicional por, por ejemplo, PCR usando un cebador a partir de la secuencia parcial y un cebador del vector. Los mapas de restricción y las secuencias parciales pueden ser generadas para identificar uno o más clones solapados. Luego, la secuencia completa puede determinarse utilizando técnicas clásicas, que pueden implicar la generación de una serie de clones de deleción. Luego, las secuencias solapadas resultantes se pueden unir dentro de una sola secuencia contigua Una molécula de cDNA de longitud total puede generarse ligando fragmentos apropiados, utilizando técnicas bien conocidas.
De forma alternativa, existen numerosas técnicas de amplificación para obtener una secuencia codificante de longitud completa a partir de una secuencia parcial de cDNA. Dentro de dichas técnicas, la amplificación generalmente se realiza vía PCR. Se puede usar cualquier variedad de kits disponibles comercialmente para realizar el paso de amplificación. Los cebadores se pueden diseñar usando, por ejemplo, softwares bien conocidos en el estado de la técnica. Preferiblemente, los cebadores son de 22-30 nucleótidos de longitud, tienen un contenido en GC de al menos el 50% y solapa con la secuencia diana a temperaturas de aproximadamente 68ºC a 72ºC. La región amplificada puede ser secuenciada tal como se describe arriba, y las secuencias solapadas unidas dentro de una secuencia contigua.
Una de estas técnicas de amplificación es la PRC inversa (véase Triglia y cols., Nucl. Acids Res. 16:8186, 1988), que usa enzimas de restricción para generar un fragmento en la región conocida del gen. Luego, el fragmento es circularizado por ligación intramolecular y se usa como una plantilla para la PCR con cebadores divergentes derivados de la región conocida. Dentro de una propuesta alternativa, las secuencias adyacentes a una secuencia parcial pueden ser recuperadas por amplificación con un cebador con una secuencia enlace y un cebador específico de la región conocida. Las secuencias amplificadas están típicamente sujetas a una segunda ronda de amplificación con el mismo cebador enlazador y un segundo cebador específico de la región conocida. Una variación de este procedimiento, que emplea dos cebadores que inician la extensión en direcciones opuestas a partir de la secuencia conocida, se describe en WO 96/38591. Otra de estas técnicas es conocida como "amplificación rápida de los extremos de cDNA" o RACE. Esta técnica implica el uso de un cebador interno y un cebador externo, que hibridan con una región poliA o secuencia vector, para identificar secuencias que son 5' y 3' de una secuencia conocida. Técnicas adicionales incluyen PCR de captura (capture PCR) (Lagerstrom y cols., PCR Methods Applic. 1:111-19, 1991) y PCR de paseo (walking PCR) (Parker y cols., Nucl. Acids. Res. 19:3055-60, 1991). Otros métodos que emplean amplificación también se pueden emplear para obtener una secuencia de cDNA de longitud completa.
En ciertos casos, es posible obtener una secuencia de cDNA de longitud completa por análisis de secuencias proporcionadas en una base de datos de secuencias etiqueta expresadas (EST), como la que está disponible en GenBank. Las búsquedas para ESTs solapadas, generalmente se realizan utilizando programas bien conocidos (por ejemplo, búsquedas NCBI BLAST), y dichas ESTs pueden usarse para generar una secuencia continua de longitud completa. Las secuencias de ADN de longitud completa también pueden obtenerse por análisis de fragmentos genómicos.
Expresión de polinucleótidos en células hospedadoras
Las secuencias de polinucleótidos o fragmentos de las mismas que codifican polipéptidos de uso en la invención, o proteínas de fusión o equivalentes funcionales de las mismas, pueden ser usadas en moléculas de ADN recombinante para dirigir la expresión de un polipéptido en células hospedadoras apropiadas. Debido a la inherente degeneración del código genético, se pueden producir otras secuencias de ADN que sustancialmente codifican la misma o una secuencia de aminoácidos funcionalmente equivalente y estas secuencias pueden usarse para clonar y expresar un polipéptido dado.
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Tal como entenderán aquellos expertos en la materia, en algunos casos, será ventajoso producir secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos que poseen codones que no se dan naturalmente. Por ejemplo, se pueden seleccionar los codones preferidos por un hospedador procariota o eucariota en particular para aumentar la tasa de expresión proteica o para producir un tránscrito de ARN recombinante que tiene propiedades deseables, como una vida media que es mayor que aquella vida media de un tránscrito generado a partir de una secuencia que se da naturalmente.
Además, las secuencias de polinucleótidos de uso en la presente invención pueden ser manipuladas utilizando métodos conocidos generalmente en la materia, con el fin de alterar las secuencias que codifican el polipéptido por una variedad de razones, que incluyen, pero no se limitan a, alteraciones que modifican el clonaje, el procesamiento, y/o la expresión del producto génico. Por ejemplo, para manipular las secuencias de nucleótidos se puede utilizar el arrastre de ADN (DNA shuffling) por fragmentación al azar y montaje de fragmentos génicos y oligoncleótidos sintéticos por PCR. Además, se puede utilizar la mutagénesis dirigida a un lugar para insertar nuevos lugares de restricción, alterar pautas de glucosilación, cambiar la preferencia de codones, producir variantes de empalme, o producir mutaciones, y así sucesivamente.
En otra realización de la invención, se pueden ligar secuencias de ácido nucleico naturales, modificadas o recombinantes a una secuencia heteróloga para codificar una proteína de fusión. Una proteína de fusión también puede ser manipulada para contener un lugar de escisión localizado entre la secuencia codificante del polipéptido y la secuencia de la proteína heteróloga, de tal forma que el polipéptido puede ser escindido y purificado de la porción heteróloga.
Las secuencias que codifican un polipéptido deseado pueden ser sintetizadas, en su totalidad o en parte, utilizando métodos químicos bien conocidos en en la materia. (véase Caruthers, M. H. y cols. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, Horn, T. y cols. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232). De forma alternativa, la proteína en sí, puede ser producida utilizando métodos químicos para sintetizar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido, o una porción del mismo. Por ejemplo, la síntesis del péptido se puede realizar utilizando varias técnicas de fase sólida (Roberge, J. Y. y cols. (1995) Science 269:202-204) y se puede llevar a cabo la síntesis automatizada, por ejemplo, usando el sintetizador de péptidos ABI431A (Perkin Elmer, Palo Alto, CA).
Un péptido sintetizado nuevamente puede ser sustancialmente purificado por cromatografía líquida de alta afinidad (por ejemplo, Creighton, T. (1983) Proteins, Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, N.Y.) o por otras técnicas comparables disponibles en la materia. La composición de los péptidos sintéticos se puede confirmar por análisis de aminoácidos o por secuenciación (por ejemplo, el procedimiento de degradación de Edman). De forma adicional, la secuencia de aminoácidos de un polipéptido, o cualquier parte del mismo, se puede alterar durante la síntesis directa y/o combinar, usando métodos químicos, con secuencias de otras proteínas, o cualquier parte de la misma, para producir un polipéptido variante.
Con el fin de expresar un polipéptido deseado, las secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido, o equivalentes funcionales, pueden ser insertadas dentro de un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada. Se pueden usar métodos que son bien conocidos por aquellos expertos en la materia para construir vectores de expresión que contengan secuencias que codifican un polipéptido de interés y elementos de control transcripcional y de traducción apropiados. Estos métodos incluyen técnicas in vitro de ADN recombinante, técnicas sintéticas, y recombinación genética in vivo. Estas técnicas se describen en Sambrook, J. y cols. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., y Ausubel, F. M. y cols. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.
Se puede utilizar una variedad de sistemas de expresión vector/hospedador para contener y expresar secuencias polipeptídicas. Estas incluyen, pero no se limitan a, microorganismos como bacterias transformadas con un bacteriófago recombinante, plásmidos, o vectores cósmidos de expresión de ADN; levaduras transformadas con vectores de expresión de levaduras; sistemas celulares de insecto infectados con vectores de expresión viral (por ejemplo, baculovirus); sistemas celulares de plantas transformados con vectores de expresión viral (por ejemplo, el virus del mosaico de la coliflor, CaMV; el virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacteriana (por ejemplo, plásmidos Ti o pBR322); o sistemas celulares de animales.
Los "elementos de control" o "secuencias reguladoras" presentes en un vector de expresión son aquellas regiones no traducidas de los potenciadores del vector, promotores, regiones no traducidas 5' y 3' que interaccionan con proteínas celulares del hospedador para cumplir con la transcripción O la traducción. Dichos elementos pueden variar en su fuerza y especificidad. Dependiendo del sistema del vector y del hospedador utilizados, se puede usar cualquier número de elementos de transcripción y traducción apropiados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, se pueden usar promotores inducibles como el promotor híbrido lacZ del fagémido PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, Calif.) o el plásmido PSPORT1 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) y similares. En sistemas celulares de mamíferos, generalmente se prefieren promotores de genes de mamíferos o virus de mamíferos. Si es necesario generar una línea celular que contenga múltiples copias de la secuencia que codifica un polipéptido, se pueden usar, de forma ventajosa, vectores basados en SV40 o EBV con un marcador de selección apropiado.
En sistemas bacterianos, se puede seleccionar un número de vectores de expresión dependiendo de la intención del uso del polipéptido expresado. Por ejemplo, cuando se necesitan grandes cantidades, se pueden usar vectores que dirigen un alto nivel de expresión de proteínas de fusión que son fácilmente purificadas. Dichos vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores multifuncionales de clonaje y expresión de E. coli, como BLUESCRIPT (Stratagene), en el que la secuencia que codifica el polipéptido de interés puede ligarse dentro del vector en marco con secuencias para Met amino-terminal y los subsiguientes 7 residuos de .beta.-galactosidasa, de tal forma que se produce una proteína híbrida; vectores pIN (Van Heeke, G. y S. M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509); y similares. También se pueden utilizar Vectores pGEX (Promega, Madison, Wis.) para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con glutation S-transferasa (GST). En general, dichas proteínas de fusión son solubles y pueden ser fácilmente purificadas a partir de células lisadas por adsorción a partículas o bolas de glutation-agarosa seguido de elución en presencia de glutation libre. Las proteínas hechas en dichos sistemas pueden ser diseñadas para incluir heparina, trombina, o lugares escisión del factor XA proteasa, de tal forma que el polipéptido clonado de interés puede ser liberado a voluntad de la porción GST.
En levaduras, Saccharomyces cerevisiae, se puede usar un número de vectores que contengan promotores constitutivos o inducibles como factor alfa, alcohol oxidasa, y PGH. Para revisiones, véase Ausubel y cols. (supra) y Grant y cols. (1987) Methods Enzymol. 153:516-544.
En los casos donde se usan vectores de expresión de plantas, la expresión de las secuencias que codifican los polipéptidos puede ser dirigida por cualquiera de un número de promotores. Por ejemplo, se pueden usar promotores virales como promotores 35S y 19S de CaMV, solos o en combinación con la secuencia omega líder del TMV (Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311). De forma alternativa, se pueden usar los promotores de plantas tales como la subunidad pequeña de RUBISCO o los promotores de choque térmico (Coruzzi, G. y cols. (1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R. y cols. (1984) Science 224:838-843; y Winter, J. y cols. (1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105). Estas construcciones pueden introducirse dentro de células de plantas por transformación directa de ADN o por transformación mediada por patógeno. Dichas técnicas se describen en un número de revisiones generalmente disponibles (véase, por ejemplo, Hobbs, S. o Murry, L. E. en McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York, N.Y.; pp. 191-196).
También se puede usar un sistema de insectos para expresar un polipéptido de interés. Por ejemplo, en uno de dichos sistemas, se utiliza el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar genes extraños en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. Las secuencias que codifican el polipéptido pueden ser clonadas dentro de una región no esencial del virus, como el gen de polihedrina, y colocarlo bajo el control del promotor de polihedrina. La inserción exitosa de la secuencia que codifica el polipéptido hará inactivo el gen de polihedrina y producirá virus recombinantes carentes de proteína de la cubierta. Luego, los virus recombinantes se pueden usar para infectar, por ejemplo, células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en las que se puede expresar el polipéptido de interés (Engelhard, E. K. y cols. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:3224-3227).
En células hospedadoras de mamíferos, generalmente hay disponible un número de sistemas de expresión basados en virus. Por ejemplo, en casos donde se usa un adenovirus como vector de expresión, las secuencias que codifican un polipéptido de interés pueden ligarse dentro de un complejo transcripción/traducción de adenovirus, que consiste en el promotor tardío y una secuencia líder tripartida. Se puede utilizar la inserción en una región no esencial E1 o E3 del genoma viral para obtener un virus viable que es capaz de expresar el polipéptido en células hospedadoras infectadas (Logan, J. y Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Set 81:3655-3659). Además, los potenciadores de la transcripción, como el potenciador del virus del Sarcoma de Rous (RSV), pueden usarse para aumentar la expresión en células hospedadoras de mamíferos.
También se pueden utilizar señales de iniciación específicas para alcanzar una traducción más eficiente de las secuencias que codifican un polipéptido de interés. Dichas señales incluyen el codón de iniciación ATG y las secuencias adyacentes. En casos donde las secuencias que codifican el polipéptido, su codón de iniciación, y secuencias aguas arriba son insertadas dentro de un vector de expresión apropiado, no se necesitan señales control adicionales de transcripción o traducción. Sin embargo, en casos donde está insertada una secuencia codificante, o una porción de la misma, se deben proporcionar señales exógenas de control de traducción que incluyan el codón de iniciación ATG. Además, el codón de iniciación debe estar en el marco de lectura correcto para asegurar la traducción del inserto entero. Los elementos exógenos de traducción y los codones de iniciación pueden ser de varios orígenes, ambos naturales y sintéticos. La eficacia de expresión se puede potenciar con la inclusión de potenciadores que sean apropiados para el sistema celular en particular en uso, como aquellos descritos en la literatura (Scharf, D. y cols. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162).
Además, una variedad celular hospedadora se puede elegir por su habilidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar la proteína expresada de la manera deseada. Dichas modificaciones del polipéptido incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glucosilación, fosforilación, lipidación, y acilación. También se puede utilizar el procesamiento post-traduccional que rompe una forma "prepro" de la proteína para facilitar la correcta inserción, plegamiento y/o función. Se pueden utilizar diferentes células hospedadoras, como CHO, HeLa, MDCK, HEK293, y WI38, que tienen maquinaria celular específica y mecanismos característicos para dichas actividades post-traduccionales, para asegurar una correcta modificación y procesamiento de la proteína extraña.
Generalmente se prefiere la expresión estable para la producción continua y de alto rendimiento de proteínas recombinantes. Por ejemplo, se pueden transformar líneas celulares que expresen de forma estable un polinucleótido de interés, usando vectores de expresión que puedan contener orígenes de replicación virales y/o elementos de expresión endógenos y un gen marcador de selección en el mismo o en un vector separado. Tras la introducción del vector, se permite que las células crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de que se las cambie a un medio selectivo. El propósito del marcador selectivo es el de conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y la recuperación de las células que expresan de forma exitosa las secuencias introducidas. Los clones resistentes de las células estables transformadas se pueden hacer proliferar utilizando técnicas de cultivo apropiadas dependiendo del tipo celular.
Se puede usar cualquier número de sistemas de selección para recuperar las líneas celulares transformadas. Éstos incluyen, pero no se limitan a, los genes de la timidina quinasa y de la adenina fosforribosiltransferasa del virus herpes simplex (Wigler, M. y cols. (1977) Cell 11:223-32) (Lowy, I. y cols. (1990) Cell 22:817-23) que se pueden emplear en células tk.sup.- o aprt.sup.-, respectivamente. Además, se puede utilizar la resistencia a antimetabolitos, antibióticos o herbicidas como base para la selección; por ejemplo, dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler, M. y cols. (1980) Proc. Natl. Acad. Set 77:3567-70); npt, que confiere resistencia a los aminoglucósidos, a neomicina y a G-418 (Colbere-Garapin, F. y cols.(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14); y als o pat, que confieren resistencia aclorsulfuron y fosfinotricin acetiltransferasa, respectivamente (Murry, supra). Se han descrito genes de selección adicionales, por ejemplo, trpB, que permite a las células utilizar indol en lugar de triptófano, o hisD, que permite a las células utilizar histinol en lugar de histidina (Hartman, S. C. and R. C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51). Recientemente, ha ganado en popularidad el uso de marcadores visibles, siendo estos marcadores antocianinas, beta-glucuronidasa y su sustrato GUS, y luciferasa y su sustrato luciferina, que se usan ampliamente no sólo para identificar transformantes, sino también para cuantificar la cantidad de expresión transitoria o estable de proteínas atribuíble a un sistema de vector específico (Rhodes, C. A. y cols. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131).
Aunque la presencia/ausencia de la expresión del gen marcador sugiere que el gen de interés también está presente, se debe confirmar su presencia y expresión. Por ejemplo, si la secuencia que codifica un polipéptido está insertada dentro de una secuencia del gen marcador, las células recombinantes que contienen secuencias pueden ser identificadas por la ausencia de función del gen marcador. De forma alternativa, un gene marcador se puede situar en tandem con una secuencia que codifica un polipéptido, bajo el control de un sólo promotor. La expresión de un gen marcador en respuesta a inducción o selección, normalmente indica también la expresión del gen tandem.
De forma alternativa, se pueden identificar las células hospedadoras que contienen y expresan una secuencia polinucleotídica deseada, por una variedad de procedimientos conocidos por aquellos expertos en la materia. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, hibridaciones ADN-ADN o ADN-ARN y bioensayos de proteína o técnicas de inmunoensayo que incluyen tecnologías basadas en membrana, soluciones, o chips, para la detección y/o la cuantificación de ácido nucleico o proteína.
En el estado de la técnica, se conocen una variedad de protocolos para detectar y medir la expresión de productos codificados por polinucleótidos, que utilizan tanto anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para el producto. Los ejemplos incluyen ensayos inmunosorbentes unidos a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), y clasificación por fluorescencia de células activadas (FACS). Para algunas aplicaciones, se prefiere un inmunoensayo de doble lugar basado en anticuerpos monoclonales, que utiliza anticuerpos monoclonales reactivos a dos epítopos no interferentes sobre un polipéptido dado, pero también se puede emplear un ensayo de unión competitiva. Éstos y otros ensayos están descritos, además de en otros lugares, en Hampton, R. y cols. (1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul. Minn.) y Maddox, D. E. y cols. (1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216).
Aquellos expertos en la materia, conocen una amplia variedad de etiquetas y técnicas de conjugación que pueden ser utilizadas en varios ensayos de ácidos nucleidos y de aminoácidos. Los medios para producir hibridación marcada o sondas de PCR para detectar secuencias relacionadas con polinucleótidos incluyen oligomarcaje, nick-translation, marcaje en el extremo (end-labeling) o amplificación por PCR utilizando un nucleótido marcado. De forma alternativa, las secuencias, o cualquier porción de las mismas, puede clonarse dentro de un vector para la producción de una sonda de ARNm. Dichos vectores son conocidos en el estado de la técnica, están disponibles comercialmente, como T7, T3, o SP6 y nucleótidos marcados, y pueden usarse para sintetizar, in vitro, sondas de ARN por adición de una ARN polimerasa apropiada. Estos procedimientos se pueden conducir usando una variedad de kits disponibles comercialmente. Moléculas indicadoras apropiadas o etiquetas, que pueden utilizarse, incluyen radionúclidos, enzimas, fluorescencia, quimioluminiscencia, o agentes cromogénicos, así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas, y similares.
Las células transformadas con una secuencia polinucleotídica de interés, se pueden cultivar bajo condiciones apropiadas para la expresión y recuperación de la proteína a partir del cultivo celular. La proteína producida por una célula recombinante puede ser secretada o estar contenida dentro de la célula, dependiendo de la secuencia y/o del vector utilizado. Tal como se entiende por aquellos expertos en la materia, los vectores de expresión que contienen polinucleótidos deben ser diseñados para contener secuencias señal que dirigen la secrección del péptido codificado a través de la membrana celular eucariótica o procariótica. Se pueden utilizar otras construcciones recombinantes para unir secuencias que codifican un polipéptido de interés con secuencias nucleotídicas que codifican un dominio polipeptídico que facilitará la purificación de las proteínas solubles. Dichos dominios que facilitan la purificación incluyen, pero no se limitan a, péptidos quelantes de metales como módulos histidina-triptófano, que permiten la purificación en metales inmovilizados, dominios de proteína A, que permiten la purificación en inmunoglobulinas inmovilizadas, y el dominio utilizado en el sistema de extensión FLAGS/afinidad de purificación (Immunex Corp., Seattle, Wash.). Para facilitar la purificación, puede usarse la inclusión de secuencias enlazadoras de escisión, como aquellas específicas para el Factor XA o la enteroquinasa (Invitrogen. San Diego, Calif.), entre el dominio de purificación y el polipéptido codificado. Uno de dichos vectores de expresión mantiene la expresión de una proteína de expresión que contiene un polipéptido de interés y un ácido nucleico que codifica 6 residuos histidina precediendo a un lugar de escisión de tiorredoxina o enteroquinasa. Los residuos de histidina facilitan la purificación en IMIAC (cromatografía de afinidad de ión metálico inmovilizado) tal como se describen en Porath, J. y cols. (1992, Prot. Exp. Purif. 3:263-281), mientras que el sitio de escidión de enteroquinasa proporciona un medio para purificar el polipéptido deseado a partir de la proteína de fusión. En Kroll, D. J. y cols. (1993; DNA Cell Biol. 12:441-453) se proporciona una discusión de los vectores que contienen proteínas de fusión.
Además de los métodos de producción de recombinantes, los polipéptidos, y fragmentos de los mismos se pueden producir por síntesis peptídica directa, utilizando técnicas de fase sólida (Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154). La síntesis de proteínas se puede realizar utilizando técnicas manuales o por automatización. Por ejemplo, la síntesis automatizada se puede realizar utilizando el sistetizador peptídico 432A de Applied Biosystems (Perkin Elmer). De forma alternativa, se pueden sintetizar químicamente varios fragmentos, de forma separada o combinada, utilizando métodos químicos para producir le molécula de longitud completa.
Mutagénesis específica de lugar
La mutagénesis específica de lugar es una técnica útil en la preparación de péptidos individuales, o péptidos funcionales biológicamente equivalentes, a través de mutagénesis específica de los polinucleótidos subyacentes que los codifican. La técnica, bien conocida por aquellos expertos en la materia, proporciona además una habilidad lista para preparar y probar variantes de secuencias, por ejemplo, incorporando una o más de las consideraciones precedentes, introduciendo uno o más cambios en la secuencia nucleotídica dentro del ADN. La mutagénesis específica de lugar permite la producción de mutantes a través del uso de secuencias oligonucleotídidcas específicas que codifican la secuencia de ADN de la mutación deseada, así como un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proporcionar una secuencia cebador de tamaño y complejidad de secuencia suficiente para formar un dúplex estable a ambos lados del enlace de deleción que está siendo atravesado. Las mutaciones se deben emplear en secuencias polinucleotídicas selectas para mejorar, alterar, disminuir, modificar, o por el contrario, cambiar las propiedades del polinucleótido en sí, y/o alterar las propiedades, actividad, composición, estabilidad, o secuencia primaria del polipéptido codificado.
Las técnicas de mutagénesis espedífica de lugar son bien conocidas en el estado de la técnica, y se utilizan ampliamente para crear variantes tanto de polipéptidos como de polinucleótidos. Por ejemplo, a menudo se utiliza la mutagénesis específica de lugar para alterar una porción específica de una molécula de ADN. Se emplea un cebador que típicamente comprende aproximadamente de 14 a aproximadamente 25 nucleótidos, más o menos, de longitud, con aproximadamente de 5 a aproximadamente 10 restos a ambos lados del enlace de la secuencia que está siendo alterada.
Tal como se apreciará por aquellos expertos en la materia, las técnicas de mutagénesis específica de lugar normalmente han empleado un vector fágico que existe tanto en forma de hebra sencilla como en forma de doble hebra. Los típicos vectores útiles en mutagénesis dirigida a lugar incluyen vectores como el fago M13. Estos fagos están disponibles comercialmente y, generalmente, su uso se conoce por aquellos expertos en la materia. También se emplean, de forma rutinaria, en mutagénesis dirigida a lugar, plásmidos de doble hebra que eliminan el paso de transferir el gen de interés de un plásmido a un fago.
En general, la mutagénesis dirigida a lugar, de acuerdo a lo adjunto, se realiza obteniendo primero un vector de hebra sencilla o fundiendo dos hebras de un vector de doble hebra que incluye, en el interior de su secuencia, la secuencia de ADN que codifica el péptido deseado. Se prepara, generalmente de forma sintética, un cebador oligonucleotídico que lleve la secuencia mutada deseada. Luego, este cebador se solapa (annealing) con el vector de hebra sencilla, y se somete a enzimas polimerizantes de ADN, como el fragmento de la polimerasa I Klenow de E. coli, con el fin de completar la síntesis de la hebra que lleva la mutación. Asi, se forma un heterodúplex donde una hebra codifica la secuencia original no mutada y la segunda hebra lleva la mutación deseada. Luego, este vector heterodúplex se utiliza para transformar células apropiadas, como células de E. coli, y se seleccionan los clones que incluyen vectores recombinantes que lleven el arreglo de la secuencia mutada.
La preparación de variantes de secuencias de segmentos selectos de ADN que codifican para péptidos, utilizando la mutagénesis dirigida a lugar, proporciona un medio de producción de especies potencialmente útiles y no se pretende limitar a que haya otras vías en las que se puedan obtener variantes de secuencias de péptidos y las secuencias de ADN que los codifican. Por ejemplo, los vectores recombinantes que codifican la secuencia peptídica deseada pueden tratarse con agentes mutagénicos, como hidroxilamina, para obtener variantes de secuencia. Detalles específicos respecto a estos métodos y protocolos se encuentran en las enseñanzas de Maloy y cols., 1994; Segal, 1976; Prokop y Bajpai, 1991; Kuby, 1994; y Maniatis y cols., 1982.
Tal como se utiliza aquí, el término "procedimiento de mutagénesis dirigida a oligonucleótido" se refiere a procesos dependientes de plantilla y a propagación mediada por vector, que resulta en un aumento en la concentración de una molécula específica de ácido nucleico relacionada con su concentración inicial, o en un aumento en la concentración de una señal detectable, como amplificación. Tal como se utiliza aquí, el término "procedimiento de mutagénesis dirigida a nucleótido" pretende referirse a un proceso que implica la extensión dependiente de plantilla de una molécula cebadora. El término proceso dependiente de plantilla se refiere a síntesis de ácido nucleico de una molécula de ARN o de ADN, donde la secuencia de la hebra de ácido nucleico sintetizada nuevamente está impuesta por las bien conocidas reglas de apareamiento complementario de bases (véase, por ejemplo, Watson, 1987). De forma típica, las metodologías mediadas por vectores implican la introducción de un fragmento de ácido nucleico dentro del vector de ADN o ARN, la amplificación clonal del vector, y la recuperación del fragmento de ácido nucleico amplificado. Ejemplos de estas metodologías se proporcionan en la Patente de EE.UU No. 4,237,224.
Técnicas de amplificación de polinucleótidos
Hay disponible un número de procesos dependientes de plantilla para amplificar las secuencias diana de interés presentes en una muestra. Uno de los métodos de amplificación mejor conocidos es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR^{TM}), descrita en detalle en las Patentes de EE.UU Nos. 4,683,195, 4,683,202 y 4,800,159. De forma breve, en la PCR^{TM}, las dos secuencias cebadoras se preparan para ser complementarias a regiones en hebras complementarias opuestas de la secuencia diana. Se añade un exceso de desoxinucleótidos trifosfato a la mezcla de reacción, junto con una ADN polimerasa (por ejemplo, Tap polimerasa). Si la secuencia diana está presente en la muestra, los cebadores se unirán a la diana y la polimerasa hará que los cebadores se extiendan a la largo de la secuencia diana por adición de nucleótidos. Aumentando y disminuyendo la temperatura de la mezcla de reacción, los cebadores ampliados se disociarán de la diana para formar los productos de reacción, el exceso de cebadores se unirá a la diana y a los productos de reacción, con lo que el proceso se repite. Preferiblemente, el procedimiento de amplificación por transcripción reversa y por PCR^{TM} se pueden realizar para cuantificar la cantidad de ARNm amplificado. Las metodologías de reacción en cadena de la polimerasa son bien conocidas en el estado de la técnica.
Otro método de amplificación es la reacción en cadena de la ligasa (llamada LCR), que se describe en la publicación de solicitud de Patente europea No. 320,308. En la LCR, se perparan dos pares de sondas complementarios, y en presencia de la secuencia diana, cada par se unirá a hebras complementarias opuestas de la diana, de tal forma que colindan. En presencia de una ligasa, los dos pares de sondas se unirán para formar una sola unidad. Como en la PCR^{TM}, con los ciclos de temperatura, las unidades ligadas unidas se disocian de la diana y luego sirven como "secuencias diana" para la ligación del exceso de pares de sondas. La Patente de EE.UU No. 4,883,750 describe un método de amplificación alternativo similar a LCR para unir pares de sondas a una secuencia diana.
La Replicasa Qbeta, descrita en la solicitud publicada de la Patente internacional PCT No. PCT/US87/00880, también puede usarse como otro método de amplificación en la presente invención. En este método, una secuencia replicativa de ARN que tiene una región complementaria con aquella diana, se añade a la muestra en presencia de una ARN polimerasa. La polimerasa copiará la secuencia replicativa, que luego podrá ser detectada.
También puede ser útil en la amplificación de ácidos nucleicos un método de amplificación isotérmico, en el que se utilizan endonucleasas de restricción y ligasas para conseguir la amplificación de moléculas diana que contienen nucleótidos 5'-[\alpha-tio]trifosfatos en una hebra de un lugar de restricción (Walker y cols., 1992).
La Amplificación de Hebra por Desplazamiento (Strand Displacement Amplification o SDA) es otro método para llevar a cabo la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos, que implica múltiples rondas de desplazamiento de hebra y síntesis, es decir, nick translation. Un método similar que puede ser útil es el llamado método de Reacción de Reparación de Cadena (RCR), que es otro método de amplificación que implica solapar varias sondas a lo largo de la región marcada para su amplificación, seguido de una reacción de reparación en la que sólo están presentes dos de las cuatro bases. Las otras dos bases se pueden añadir como derivados biotinilados para una fácil detección. Un enfoque similar se utiliza en la SDA.
Las secuencias también pueden ser detectadas utilizando una reacción cíclica de sondas (CPR). En la CPR, se híbrida una sonda que tiene secuencias 3' y 5' de ADN no marcado y una secuencia interna o "media" del ARN diana de la proteína específica, con ADN que está presente en la muestra. En la hibridación, la reacción se trata con RNasaH, y los productos de la sonda se identifican como productos distintivos, generando una señal que se libera tras la digestión. La plantilla original se solapa a otra sonda cíclica y se repite la reacción. Así, la CPR implica amplificar una señal generada por hibridación de una sonda a un ácido nucleico diana específico expresado por un gen.
También se pueden utilizar otros métodos de amplificación descritos en la solicitud de Patente de Gran Bretaña No. 2 202 328, y en la solicitud publicada de la Patente internacional PCT PCT/US89/01025. En la primera solicitud, se utilizan cebadores "modificados" en una síntesis de tipo PCR, dependiente de plantilla y enzima. Los cebadores se pueden modificar por etiquetado con un resto de captación (por ejemplo, biotina) y/o un resto detector (por ejemplo, enzima). En la segunda solicitud, se añade a la muestra un exceso de sondas marcadas. En presencia de la secuencia diana, la sonda se une y se escinde de forma catalítica. Tras la escisión, la secuencia diana se libera intacta para poder unirse por el exceso de sonda. La escisión de la sonda marcada señaliza la presencia de la secuencia diana.
Otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos incluyen sistemas de amplificación basados en transcripción (TAS) (Kwoh y cols., 1989; solicitud publicada de la Patente internacional PCT No. WO 88/10315), que incluye amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico (NASBA) y 3SR. En NASBA, los ácidos nucleicos se pueden preparar para la amplificación por extracción clásica fenol/cloroformo, desnaturalización de la muestra por calor, tratamiento con solución de lisis amortiguadora y columnas minispin para aislamiento de ADN y ARN o par extracción de ARN con cloruro de guanidinio. Estas técnicas de amplificación implican solapar un cebador que tiene secuencias específicas de la secuencia diana. Tras la polimerización, los híbridos ADN/ARN se digieren con RNasa H mientras las moléculas de ADN de doble hebra se vuelven a desnaturalizar por calor. En cualquiera de los casos, el ADN de cadena sencilla se hace totalmente de doble cadena al añadir un segundo cebador específico de diana, seguido de polimerización. Luego, las moléculas de ADN de doble cadena se transcriben de forma múltiple por una polimerasa como T7 o SP6. En una reacción cíclica isotérmica, los ARNs se transcriben de forma reversa a ADN, y una vez más, se transcriben con una polimerasa como T7 o SP6. Los productos resultantes, sean truncados a completos, marcan las secuencias específicas de diana.
La solicitud publicada de la Patente europea No. 329,822 describe un proceso de amplificación de ácidos nucleicos, que puede ser utilizado y que implica la síntesis, de forma cíclica, de ARN de cadena sencilla ("ssRNA"), ssDNA, y ADN de doble cadena. El ssRNA es una primera plantilla para un primer oligonucleótido cebador, que se elonga por transcriptasa reversa (ADN polimerasa dependiente de ARN). Luego, el ARN se elimina del dúplex ADN:ARN resultante por la acción de ribonucleasa H (RNasa H, una RNasa específica para ARN en un dúplex con ADN o ARN). El ssDNA resultante es la segunda plantilla para el segundo cebador, que también incluye las secuencias de un promotor de ARN polimerasa (ejemplificado por la ARN polimerasa T7) 5' con su homología a su plantilla. Luego, este cebador se extiende por una ADN polimerasa (ejemplificada por el fragmento grande "Klenow" de la ADN polimerasa I de E. coli), dando como resultado una molécula de ADN de doble cadena ("dsDNA"), que tiene una secuencia idéntica a aquella del ARN original entre los cebadores y que, adicionalmente tiene, en un extremo, una secuencia promotor. Esta secuencia promotor se puede utilizar por la ARN polimerasa apropiada para hacer muchas copias de ARN del ADN. Luego, estas copias pueden re-entrar en el ciclo, dirigiendo una amplificación muy rápida. Con la elección de enzimas apropiadas, se puede realizar esta amplificación de forma isotérmica, sin adición de enzimas en cada ciclo. Debido a la naturaleza cíclica de este proceso, se puede elegir la secuencia iniciadora tanto en forma de ADN como de ARN.
La solicitud de Patente internacional publicada PCT No. WO 89/06700 describe un esquema de amplificación de ácidos nucleicos basado en la hibridación de una secuencia promotor/cebador a un ADN diana de cadena sencilla ("ssDNA"), seguido de transcripción de muchas copias de ARN de la secuencia. Este esquema no es cíclico; es decir, no se producen nuevas plantillas a partir de los transcritos de ARN resultante. Otros métodos de amplificación incluyen "RACE" (Frohman, 1990), y "PRC de un sólo lado" ("one-sided PCR") (Ohara, 1989) que son bien conocidos por aquellos expertos en la materia.
También se pueden utilizar, en la amplificación de secuencias de ADN, métodos basados en ligación de dos (o más) oligonucleótidos en presencia de ácido nucleico que tiene la secuencia del "di-oligonucleótido" resultante, de tal forma que amplifican el di-oligonucleótido (Wu y Dean, 1996).
Equivalentes biológicos funcionales
Se pueden hacer cambios y modificaciones en la estructura de los polinucleótidos y polipéptidos y todavía se obtiene una molécula funcional que codifica un polipéptido con características deseables. Como se mencionó arriba, a menudo se desea introducir una o más mutaciones dentro de la secuencia de un polinucleótido específico. En ciertas circunstancias, la secuencia polipeptídica codificada resultante se altera por esta mutación, o en otros casos, la secuencia del polipéptido no se cambia por una o más mutaciones en el polinucleótido codificado.
Cuando se desea alterar la secuencia aminoacídica de un polipéptido, para crear un equivalente, o incluso una molécula de segunda generación mejorada, los cambios de aminoácidos se pueden realizar cambiando no o más codones de la secuencia de ADN codificante, de acuerdo con la Tabla 1.
Por ejemplo, se pueden sustituir ciertos aminoácidos por otros aminoácidos en una estructura proteica, sin que se aprecie pérdida de actividad de unión interactiva con estructuras como, por ejemplo, regiones de unión a antígeno de anticuerpos o lugares de unión en moléculas sustrato. Desde que la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína definen la actividad biológica funcional de la proteína, se pueden realizar ciertas sustituciones en la secuencia aminoacídica en una secuencia proteica, y, por supuesto, a su subyacente secuencia de ADN codificante, y sin embargo, se obtiene una con propiedades parecidas. Por ello, los inventores contemplan que se pueden hacer varios cambios en la secuencia peptídica de las composiciones reveladas, o en las correspondientes secuencias de ADN que codifican dichos péptidos, sin pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica.
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TABLA 1
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Al hacer dichos cambios, se debe tener en cuenta el índice hidropático de los aminoácidos. Generalmente, la importancia del índice hidropático de los aminoácidos, para conferir una función biológica interactiva en una proteína, se entiende en el estado de la técnica. (Kyte y Doolittle, 1982). Está aceptado que el carácter hidropático relativo del aminoácido, contribuye a la estructura secuenciaria de la proteína resultante que, a su vez, define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos, y similares. Cada aminoácido tiene asignado un índice hidropático en base a sus características de hidrofobicidad y carga (Kyte y Doolittle, 1982). Estos valores son: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteína/cistina (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptófano (-0.9); tirosina (-1.3); prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5); glutamina (-3.5); aspartato (-3.5); asparagina (-3.5); lisina (-3.9); y arginina (-4.5).
Se conoce en el estado de la técnica que ciertos aminoácidos pueden ser sustituídos por otros aminoácidos que tienen un índice o marca hidropática similar y que dan lugar a una proteína con actividad biológica similar, es decir, todavía se obtiene una proteína biológica funcionalmente equivalente. Al hacer dichos cambios, se prefiere la sustitución de los aminoácidos cuyos índices hidropáticos sean \pm2, son particularmente preferidos aquellos que sean \pm1, y particularmente mucho más preferidos aquellos que sean +0.5. También se entiende en el estado de la técnica que la sustitución de los aminoácidos parecidos se puede hacer de forma efectiva en base a la hidrofobicidad. La Patente de EE.UU 4,554,101, publica que el promedio local de hidrofobicidad mayor de una proteína, tal como está gobernada por la hidrofobicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína.
Tal como se detalla en la Patente de EE.UU 4,554,101, los siguientes valores de hidrofobicidad se han asignado a los restos aminoacídicos: arginina (+3.0); lisina (+3.0); aspartato (+3.0 + 1); glutamato (+3.0 \pm 1); serina (+0.3); asparagina (+0.2); glutamina (+0.2); glicina (0); treonina (-0.4); prolina (-0.5 \pm1); alanina (-0.5); histidina (-0.5); cisteína (-1.0); metionina (-1.3); valina (-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5); triptófano (-3.4). Se entiende que un aminoácido pueda ser sustituído por otro que tenga un valor de hidrofobicidad similar y todavía obtener un equivalente biológico, y en particular, una proteína inmunológicamente equivalente. En dichos cambios, se refiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofobicidad estén dentro de +2, particularmente preferidos aquellos que estén dentro de \pm1, y mucho más preferidos aquellos que estén dentro de \pm0.5.
Como se resumió arriba, las sustituciones de aminoácidos, generalmente se basan en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral del aminoácido, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilia, carga, tamaño, y similares. Sustituciones ejemplo que se dan en varias de las características precedentes tomadas en consideración son conocidas por los expertos en la materia e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.
Además, cualquier polinucleótido puede ser modificado para aumentar la estabilidad in vivo. Las posibles modificaciones incluyen, pero no se limitan a, la adición de secuencias flanqueantes en los extremos 5' y/o 3'; el uso de fosforotioato o 2' O-metilo, mejor que enlaces fosforodiesterasa en la estructura; y/o la inclusión de bases no tradicionales como inosina, queosina, y wibutosina, así como acetil-metil-, tio-, y otras formas modificadas de adenina, citidina, guanina, timina y uridina.
Técnicas de administración de polinucleótidos in vivo
Las construcciones genéticas que comprenden uno o más polinucleótidos se introducen dentro de las células in vivo. Esto se puede conseguir usando cualquier variedad de propuestas bien conocidas, muchas de las cuales se resumen abajo con propósito ilustrativo.
1. Adenovirus
Uno de los métodos preferidos para la administración in vivo de una o más secuencias de ácido nucleico, implica el uso de un vector de expresión adenoviral. "Vector de expresión adenoviral" significa incluir aquellas construcciones que contienen secuencias adenovíricas suficientes para (a) soportar el empaquetamiento de la construcción y (b) expresar un polinucleótido que ha sido clonado ahí en una orientación sentido o antisentido. Por supuesto, en el contexto de una construcción antisentido, la expresión no requiere que el producto génico sea sintetizado.
El vector de expresión comprende una forma genéticamente manipulada de un adenovirus. El conocimiento de la organización genética del adenovirus, un virus de ADN de doble cadena lineal de 36 kb, permite la sustitución de grandes piezas del ADN adenoviral por secuencias extrañas de más de 7 kb (Grunhaus y Horwitz, 1992). En contraste con los retrovirus, la infección adenovírica de células hospedadoras no da lugar a integración cromosómica, debido a que el ADN adenoviral se puede replicar de una forma episomal sin genotoxicidad potencial. Además, los adenovirus son estructuralmente estables, y no se han detectado arreglos genómicos tras una extensa amplificación. Los adenovirus pueden infectar virtualmente todas las células epiteliales sin importar su estado en el ciclo celular. Además, parece que la infección adenoviral está unida sólo a un ligero desarreglo o enfermedad, como la enfermedad respiratoria aguda en seres humanos.
Los adenovirus son particularmente apropiados para su uso como vector de transfección génica debido a su tamaño genómico medio, su fácil manipulación, alto título, amplio rango de diana celular y alta infección. Ambos extremos del genoma viral contienen 100-200 repeticiones invertidas de pares de bases (ITRs), que son elementos cis necesarios para la replicación y el empaquetamiento del ADN viral. Las regiones tempranas (E) y tardías (L) del genoma contienen diferentes unidades de transcripción, que están divididas por el comienzo de replicación del ADN viral. La región E1 (E1A y E1B) codifica proteínas responsables de la regulación de la transcripción del genoma viral y unos pocos genes celulares. La expresión de la región E2 (E2A y E2B) da lugar a la síntesis de las proteínas para la replicación del ADN viral. Estas proteínas están implicadas en la replicación del ADN, la expresión tardía de genes y el aislamiento de la célula hospedadora. (Renan, 1990). Los productos de los genes tardíos, incluyendo la mayoría de las proteínas de la cápsida viral, se expresan sólo tras el procesamiento significativo de un sólo tránscrito primario emitido por el promotor tardío principal (MLP). El MLP, (localizado a 16.8 m.u.) es particularmente eficaz durante la fase tardía de la infección, y todos lor ARNm emitidos a partir de este promotor poseen una secuencia líder 5'-tripartito (TPL) que les hace ser los ARNm preferidos para la traducción.
En un sistema actual, el adenovirus recombinante se genera a partir de recombinación homóloga entre el vector lanzadera y el vector proviral. Debido a la posible recombinación entre los dos vectores provirales, se debe generar un adenovirus de tipo salvaje a partir de este proceso. Por tanto, es crítico aislar un sólo clon del virus a partir de una colonia individual y examinar su estructura genómica.
La generación y propagación de los actuales vectores adenovirales, que son deficientes en la replicación, depende una única línea celular ayudante, llamada 293, la cual se transformó a partir de células de riñón embrionario humano por fragmentos de ADN Ad5 y que expresa constitutivamente proteínas E1 (Graham y cols., 1977). Desde que la región E3 es prescindible en el genoma adenoviral (Jones y Shenk, 1978), los vectores adenovirales actuales, con la ayuda de las células 293, llevan ADN extraño tanto en regiones E1, como D3 o en ambas (Graham y Prevec, 1991). En la naturaleza, el adenovirus puede empaquetar aproximadamente el 105% del genoma de tipo salvaje (Ghosh-Choudhury y cols., 1987), proporcionando capacidad para aproximadamente 2 Kb de ADN extra. Combinado con el ADN de aproximadamente 5,5 Kb que se puede reemplazar en las regiones E1 y E3, la máxima capacidad de los vectores adenovirales actuales está por debajo de las 7,5 Kb, o aproximadamente del 15% de la longitud total del vector. Más del 80% del genoma viral del adenovirus permanece en la estructura del vector y es la fuente de la citotoxicidad terminal del vector. Además, la deficiencia de replicación del virus al que se ha delecionado E1 es incompleta. Por ejemplo, se ha observado un flujo de expresión de genes virales con los actuales vectores disponibles, a altas multiplicidades de infección (MOI) (Mulligan, 1993).
Las líneas celulares ayudantes pueden derivar de células humanas como células de riñón embrionario, células musculares, células hematopoyéticas u otras células mesenquimales o epiteliales embriónicas humanas. De forma alternativa, las células ayudantes pueden derivar de células de otras especies de mamíferos que sean permisibles a adenovirus humanos. Dichas células incluyen, por ejemplo, células Vero u otras células mesenquimales o epiteliales embrionarias de mono. Tal como se indicó arriba, la actual línea celular ayudante preferida es 293.
Recientemente, Racher y cols. (1995) describieron métodos mejorados para cultivar células 293 y propagar los adenovirus. En un formato, los agregados de células naturales se crecen inoculando células individuales dentro de frascos centrifugadores siliconados de 1 litro (Techne, Cambridge, UK) que contienen 100-200 ml de medio. Tras la centrifugación a 40 rpm, se estima la viabilidad celular con trypan blue. En otro formato, se emplean micro-transportadores de Fibra-CellIn (Bibby Sterlin, Stone, UK) (5 g/l) de la siguiente forma. Un inóculo celular, resuspendido en 5 ml de medio, se añade al transportador (50 ml) en un frasco Erlenmeyer de 250 ml y se deja inmóvil, con agitación ocasional, durante 1 a 4 horas. Luego, se reemplaza el medio con 50 ml de medio fresco y se inicia la agitación. Para la producción de virus, se permite crecer a las células hasta aproximadamente un 80% de confluencia, tras ese tiempo, se reemplaza el medio (a un 25% del volumen final) y se añaden los adenovirus a una MOI de 0.05. Los cultivos se dejan estacionarios durante toda la noche, tras lo cual, el volumen se incrementa al 100% y se comienza a agitar durante otras 72 horas.
Excepto el requerimiento de que el vector adenoviral sea defectuoso en la replicación, o al menos condicionalmente defectuoso, no se cree que la naturaleza del vector adenoviral sea crucial para la práctica exitosa de la invención. El adenovirus puede ser cualquiera de los diferentes 42 serotipos o subgrupos A-F conocidos. El material de partida preferido para obtener el vector adenoviral defectuoso en la replicación para uso en la presente invención es el Adenovirus tipo 5 del subgrupo C, ya que el Adenovirus tipo 2 es un adenovirus humano cuyo trato de información genética y bioquímica es conocido, e históricamente se ha utilizado para muchas construcciones en las que se ha empleado un adenovirus como vector.
Como se indicó arriba, el vector típico es deficiente en la replicación y no tendrá una región E1 adenoviral. Así, será más conveniente introducir el polinucleótido codificado del gen de interés en la posición a partir de la cual se han eliminado las secuencias que codifican E1. Sin embargo, la posición de inserción de la construcción dentro de las secuencias del adenovirus, no es crucial en la invención. El polinucleótido codificado del gen de interés T también puede insertarse en vez de la región delecionada E3 en vectores E3 reemplazados, tal como describieron Karlsson y cols. (1986) o en la región E4 donde una línea celular ayudante o un virus ayudante complementa el defecto de E4.
Los adenovirus son fáciles de crecer y manipular y exhiben una amplia gama de hospedadores in vitro e in vivo. Este grupo de virus se pueden obtener en altos títulos, por ejemplo, 10^{9}-10^{11} unidades formadoras de placa por ml, y son altamente infectivos. El ciclo de vida del adenovirus no requiere integración dentro del genoma de la célula hospedadora. Los genes extraños administrados por vectores adenovirales son episomales y, por tanto, tienen baja genotoxicidad en las células hospedadoras. No se han demostrado efectos secundarios en estudios de vacunación con adenovirus de tipo salvaje (Couch y cols., 1963; Top y cols., 1971), demostrando su seguridad y potencial terapéutico como vectores de transfección in vivo.
Los vectores adenovirales se han utilizado en expresión de genes eucarióticos (Levrero y cols., 1991; Gomez-Foix y cols., 1992) y en desarrollo de vacunas (Grunhaus y Horwitz, 1992; Graham y Prevec, 1992). Recientemente, estudios animales han sugerido que los adenovirus recombinantes pueden usarse para terapia génica (Stratford-Perricaudet y Perricaudet, 1991; Stratford-Perricaudet y cols., 1990; Rich y cols., 1993). Estudios de administración de adenovirus recombinantes a diferentes tejidos incluyen instalación de la tráquea (Rosenfeld y cols., 1991; Rosenfeld y cols., 1992), inyección muscular (Ragot y cols., 1993), inyecciones intravenosas periféricas (Herz y Gerard, 1993) e inoculación estereotáctica dentro del cerebro (Le Gal La Salle y cols., 1993).
2. Retrovirus
Los retrovirus son un grupo de virus de ARN de hebra sencilla caracterizados por su habilidad para convertir su ARN a ADN de doble hebra en las células infectadas, por un proceso de transcripción reversa (Coffin, 1990). Luego, el ADN resultante se integra de forma estable dentro de los cromosomas celulares como provirus y dirige la síntesis de proteínas virales. La integración da lugar a la retención de secuencias génicas viruales en la célula recipiente y sus desencadenantes. El genoma retroviral contiene tres genes, gag, pol y env, que codifican proteínas de la cápsida, la enzima polimerasa, y los componentes de la envuelta, respectivamente. Una secuencia, que se encuentra aguas arriba del gen gag, contiene una señal para el empaquetamiento del genoma dentro de viriones. En los extremos 5' y 3' del genoma viral están presentes dos largas secuencias terminales repetidas (LTR). Éstas contienen fuertes secuencias promotoras y potenciadoras y se requieren para la integración en el genoma de la célula hospedadora. (Coffin, 1990).
Con el fin de construir un vector retroviral, se inserta, dentro del genoma viral, un ácido nucleico que codifica una o más secuencias de oligonucleótidos o polinucleótidos de interés, en el lugar de ciertas secuencia virales, para producir un virus que es deficiente en la replicación. Con el fin de producir viriones, se construye una línea celular empaquetadora que contiene los genes gag, pol, y env pero sin LTR y los componentes empaquetadores (Mann y cols., 1983). Cuando un plásmido recombinante que contiene un cDNA, junto con LTR retroviral y las secuencias empaquetadoras, se introduce dentro de esta línea celular (por ejemplo, por precipitación con fosfato cálcico), la secuencia empaquetadora permite que se empaquete, dentro de partículas virales, el tránscrito de ARN del plásmido recombinante, las cuales son secretadas dentro del medio de cultivo (Nicolas y Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann y cols., 1983). Luego, se recoge, opcionalmente concentrado, el medio que contiene los retrovirus recombinantes y se utiliza para transferencia génica. Los vectores retrovirales son capaces de infectar una amplia variedad de tipos celulares. Sin embargo, la integración y la expresión estable requieren la división de las células hospedadoras (Paskind y cols., 1975).
Recientemente, se desarrolló un nuevo enfoque, basado en la modificación química de un retrovirus por adición química de restos de lactosa a la cubierta viral, diseñado para permitir el marcaje específico de vectores retrovirales. Esta modificación podía permitir la infección específica de hepatocitos via receptores de sialoglucoproteína.
Se diseñó un enfoque diferente para marcar retrovirus recombinantes, en el que se usaban anticuerpos biotinilados contra una proteína de la cubierta retroviral y contra un receptor celular específico. Los anticuerpos se acoplaron, via los componentes de biotina, usando streptavidina (Roux y cols., 1989). Usando anticuerpos contra antígenos del complejo histocompatibilidad principal de clase I y clase II, demostraron la infección de una variedad de células humanas que llevaban aquellos antígenos de superficie con un virus ectópico in vitro (Roux y cols., 1989).
3. Virus adeno-asociados
AAV (Ridgeway, 1988; Hermonat y Muzycska, 1984) es un parovirus, descubierto en contaminaciones de reservas adenovirales. Es un virus ubícuo (sus anticuerpos están presentes en el 85% de la población humana norteamericana) que no se ha relacionado con ninguna enfermedad. También se clasificó como un dependovirus, debido a que su replicación es dependiente de la presencia de un virus ayudante, como adenovirus. Se han aislado cinco serotipos, de los que AAV-2 es el mejor caracterizado. AAV tiene un ADN lineal de hebra sencilla que está encapsulado dentro de proteínas de la cápsida VP1, VP2 y VP3 para formar un virión icosahédrico de 20 a24 nm de diámetro (Muzyczka y McLaughlin, 1988).
El ADN de AAV DNA se de aproximadamente 4,7 kilobases de longitud. Éste contiene dos marcos de lectura abierta y está flanqueado por dos ITRs. Estos son los principales genes en el genoma de AAV: rep y cap. El gen rep codifica para proteínas responsables de las replicaciones virales, mientras que cap codifica para la proteína de la cápida VP1-3. Cada ITR forma una estructura horquilla en forma T. Estas repeticiones terminales son los únicos componentes cis esenciales del AAV para la integración cromosómica. Por ello, el AAV se puede usar como vector con todas las secuencias virales eliminadas y reemplazadas para administrar el cassette de genes. Se han identificado tres promotores virales y se han nombrado p5, p19, y p40, de acuerdo a su posición en el mapa. La transcripción a partir p5 y p19 da lugar a la producción de proteínas rep, y la transcripción a partir de p40 produce las proteínas de la cápsida (Hermonat y Muzyczka, 1984).
Existen varios factores que provocaron que los investigadores estudiaran la posibilidad de usar rAAV como un vector de expresión, uno es que, los requerimientos para administrar un gen para integrarlo dentro del cromosoma hospedador son sorprendentemente pocos. Es necesario tener los ITRs de 145 pares de bases, que son sólo el 6% del genoma de AAV. Esto deja sitio en el vector para juntar un inserto de ADN de 4,5 kb. Mientras que esta capacidad transportadora puede prevenir a AAV de administrar grandes genes, es ampliamente idóneo para administrar construcciones antisentido.
AAV también es una buena elección para administrar vehículos, debido a su seguridad. Existe un mecanismo de rescate relativamente complicado: no sólo los adenovirus de tipo salvaje se requieren para movilizar rAAV, sino también los genes de AAV. Asimismo, el AAV no es patogénico y no está asociado con ninguna enfermedad. La eliminación de secuencias virales codificantes minimiza las reacciones inmunes a la expresión de genes virales, y por ello, rAAV no evoca una respuesta inflamatoria.
4. Otros vectores virales como construcciones de expresión
Se pueden emplear otros vectores virales como construcciones de expresión, en la presente invención, para administrar secuencias oligonucleotídicas o polinucleotídicas a una célula hospedadora. Se pueden emplear vectores derivados de virus, como el virus vaccinia (Ridgeway, 1988; Coupar y cols., 1988), lentivirus, virus de la polio y herpes virus. Éstos ofrecen varias características atractivas para varias células hospedadoras de mamíferos (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Coupar y cols., 1988; Horwich y cols., 1990).
Con el reconocimiento de virus de la hepatitis B deficientes, se han conseguido nuevos motivos en la relación estructura-función de distintas secuencias virales. Estudios in vitro han mostrado que el virus puede mantener la habilidad de empaquetamiento dependiente de ayudante y de transcripción reversa, a pesar de la deleción de más del 80% de su genoma (Horwich y cols., 1990). Esto sugiere que grandes porciones del genoma se puede reemplazar por material genético extraño. El hepatotropismo y la persistencia (integración) fueron particularmente atractivos para la transferencia génica dirigida al hígado. Chang y cols. (1991) introdujeron el gen de la cloramfenicol acetiltransferasa (CAT) dentro del genoma del virus de la hepatitis B de pato, en lugar de las secuencias que codificaban para la polimerasa, para la superficie, y para la pre-superficie. Se co-transfectó con virus de tipo salvaje dentro de una línea celular de hepatoma de aves. Se usó un medio de cultivo que contenía altos títulos del virus recombinante para infectar hepatocitos primarios de pato. Se detectó expresión estable del gen CAT durante al menos 24 días tras la transfección (Chang y cols., 1991).
5. Vectores no virales
Con el fin de llevar a cabo la expresión de secuencias de oligonucleótidos o polinucleótidos, el constructo de expresión se debe administrar dentro de la célula,. Esta administración se debe realizar in vitro, como en procedimientos de laboratorio para transformar líneas celulares, o in vivo o ex vivo, como en el tratamiento de ciertos estados de enfermedad. Tal como se describió arriba, un mecanismo preferido de administración es via infección viral, donde el constructo de expresión está encapsulado en una partícula viral infecciosa.
Una vez que el constructo de expresión ha sido administrado dentro de la célula, el ácido nucleico que codifica las secuencias del oligonucleótido o polinucleótido deseados debe ser posicionado y expresado en distintos lugares. El ácido nucleico que codifica la construcción debe estar integrado de forma estable dentro del genoma de la célula. Esta integración puede estar en una localización y orientación específicas via recombinación homóloga (reemplazamiento génico) o puede estar integrado en una localización al azar no específica (aumento génico). El ácido nucleico se puede mantener de forma estable en la célula, como un segmento de ADN episomal separado. Dichos segmentos de ácidos nucleicos o "episomas" codifican suficientes secuencias para permitir el mantenimiento y replicación independiente de, o en sincronización con, el ciclo de la célula hospedadora. Cómo la expresión de la construcción es administrada a una célula y dónde permanece el ácido nucleico en la célula es dependiente del tipo de constructo de expresión empleado.
El constructo de expresión que comprende una o más secuencias oligonucleotídicas o polínucleotidicas, simplemente puede consistir en ADN recombinante desnudo o plásmidos. La transferencia de la construcción puede ser realizada por cualquiera de los métodos mencionados arriba, que permeabilicen la membrana celular de forma química o física. Esto es particularmente aplicable para la transferencia in vitro pero también puede aplicarse al uso in vivo. Dubensky y cols. (1984) inyectaron, de forma exitosa, ADN de poliomavirus, en forma de precipitados de fosfato cálcico, dentro del hígado y el bazo de ratones adultos y recién nacidos, demostrando replicación viral activa e infección aguda. Benvenisty y Reshef (1986) también demostraron que la inyección intraperitoneal directa de plásmidos precipitados con fosfato cálcico da como resultado la expresión de los genes transfectados. Se prevé que el ADN que codifica un gen de interés también pueda ser transfectado de una forma similar in vivo y expresar el producto génico.
Otro método para transfectar, dentro de las células, un constructo de expresión de un ADN desnudo puede implicar bombardeo de partículas. Este método depende de la habilidad para acelerar micro-proyectiles cubiertos de ADN a una alta velocidad para permitir que agujereen las membranas celulares y entren a las células sin matarlas (Klein y cols., 1987). Se han desarrollado varios mecanismos para acelerar pequeñas partículas. Uno de estos mecanismos depende de una descarga de alto voltaje para generar una corriente eléctrica, que proporciona la fuerza motriz (Yang y cols., 1990). Se ha considerado que los micro-proyectiles utilizados sean sustancias biológicamente inertes, como partículas de tungsteno u oro.
Se han bombardeado in vivo órganos seleccionados, incluyendo el hígado, piel, y tejido muscular de ratas y ratones (Yang y cols., 1990; Zelenin y cols., 1991). Esto puede requerir exposición a quirúrgica del tejido o las células, para eliminar cualquier tejido intermedio entre la pistola y el órgano diana, es decir, tratamiento ex vivo. De nuevo, el ADN que codifica un gen en particular, puede ser administrado via este método y todavía ser incorporado.
Composiciones polipeptídicas y usos
En otros aspectos, la presente invención proporciona composiciones polipeptídicas para uso en el diagnóstico, tratamiento o prevención de infección por Chlamydia. Generalmente, un polipéptido será un polipéptido aislado (o un epítopo, variante, o fragmento activo del mismo) derivado de especies de mamíferos. Así mismo, una composición polipeptídica de la presente invención se entiende que comprende uno o más polipéptidos que son capaces de obtener anticuerpos que son inmunológicamente reactivos con un polipéptido que comprende:
(i)
la secuencia de aminoácidos de restos 8 a 660 de la Seq ID No:139, o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con ella, determinada comparando las dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación de restos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139; o
(ii)
una porción inmunogénica de restos aminoacídicos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139, que tiene, al menos, 15 aminoácidos de longitud.
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Tal como se utiliza aquí, un fragmento activo de un polipéptido incluye la totalidad o una porción de un polipéptido que está modificado por técnicas convencionales, por ejemplo, mutagénesis, o por adición, deleción, o sustitución, pero dicho fragmento activo exhibe, sustancialmente, la misma estructura, función, antigenicidad, etc., que el polipéptido tal como aquí se describe.
En ciertas realizaciones ilustrativas, los polipéptidos de uso en la invención comprenderán, al menos, una porción inmunogénica de una proteína de Chlamydia o una variante de la misma, tal como aquí se describe. Las proteínas que son proteínas de Chlamydia, generalmente también reaccionan de forma detectable dentro de un inmuno ensayo (como ELISA) con antisuero de un paciente con una infección por Chlamydia. Los polipéptidos, tal como aquí se describen, serán de al menos 15 aminoácidos de longitud. Pueden estar presentes secuencias adicionales derivadas de la proteína nativa y/o secuencias heterólogas. y dichas secuencias pueden (pero no tienen por qué) poseer otras propiedades inmunogénicas o antigénicas.
Una "porción inmunogénica", tal como se utiliza aquí, es una porción de una proteína que es reconocida (es decir, unida de forma específica) por un receptor de superficie antigénico de una célula T y/o célula B. Dichas porciones inmunogénicas, preferiblemente comprenden, al menos, 20 restos de aminoácidos de una proteína de Chlamydia o una variante de la misma. Ciertas porciones inmunogénicas preferidas incluyen péptidos en los que se ha delecionado una secuencia N-terminal líder y/o un dominio transmembrana. Otras porciones inmunogénicas preferidas pueden contener una pequeña deleción N- y/o C-terminal (por ejemplo, 1-30 aminoácidos, preferiblemente 5-15 aminoácidos), en relación a la proteína madura.
Generalmente, las porciones inmunogénicas pueden ser identificadas utilizando técnicas bien conocidas, como aquellas resumidas en Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., 243-247 (Raven Press, 1993) y en referencias ahí citadas. Dichas técnicas incluyen escrutinio de polipéptidos para su habilidad para reaccionar con anticuerpos específicos de antígeno, antisuero, y/o líneas o clones de célula T. Tal como se utiliza aquí, los antisueros y anticuerpos son "específicos de antígeno" si se unen de forma específica a un antígeno (es decir, reaccionan con la proteína en un ELISA o en otro inmunoensayo, y no reaccionan de forma detectable con otras proteínas no relacionadas). Dichos antisueros y anticuerpos pueden prepararse tal como aquí se describe, y utilizando técnicas bien conocidas. Una porción inmunogénica de una proteína nativa de Chlamydia es una porción que reacciona con dichos antisueros y/o células T a un nivel que sustancialmente no es menor que la reactividad del polipéptido de tamaño completo (por ejemplo, en un ensayo ELISA y/o ensayo de reactividad de célula T). Dichas porciones inmunogénicas deben reaccionar con dichos ensayos a un nivel que es similar a, o mayor que la reactividad del polipéptido de tamaño completo. Generalmente, dichas revisiones se pueden realizar utilizando métodos bien conocidos por aquellos expertos en la materia, como aquellos descritos en Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Por ejemplo, un polipéptido puede estar inmovilizado sobre un soporte sólido y estar en contacto con el suero de un paciente para permitir la unión de anticuerpos, en el suero, al polipéptido inmovilizado. Luego, el suero no unido puede ser eliminado y unir anticuerpos detectados utilizando, por ejemplo, Proteína A marcada con ^{125}I.
Como se mencionó arriba, una composición puede comprender una variante de una proteína nativa de Chlamydia. Una "variante" de polipéptido, tal como se utiliza aquí, es un polipéptido que difiere de la proteína nativa de Chlamydia en una o más sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones, de tal forma que la inmunogenicidad del polipéptido no está sustancialmente disminuida. En otras palabras, la habilidad de una variante para reaccionar con un anticuerpo específico de antígeno, puede estar potenciada o no cambiada, en relación a la proteína nativa, o puede estar disminuida por menos del 50%, y preferiblemente menos del 20%, en relación a la proteína nativa. Generalmente, dichas variantes pueden ser identificadas modificando una de las secuencias polipeptídicas de arriba, y evaluando la reactividad del polipéptido modificado con anticuerpos específicos de antígeno o antisuero, tal como aquí se describe. Variantes preferidas incluyen aquellas en las que han sido eliminadas una o más porciones, como una secuencia N-terminal líder o un dominio transmembrana. Otras variantes preferidas incluyen variantes en las que se ha eliminado una pequeña porción N- y/o C-terminal de la proteína madura (por ejemplo, 1-30 aminoácidos, preferiblemente 5-15 aminoácidos).
Las variantes polipeptídicas englobadas por la presente invención incluyen aquellas que exhiben, al menos, un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% o más de identidad (determinada como se describió arriba) con los restos 8 a 660 de la secuencia de aminoácidos de Seq ID No:139.
Preferiblemente, una variante contiene sustituciones conservadas. Una "sustitución conservada" es una en la que un aminoácido es sustituído por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de tal forma que un experto en la materia de la química peptídica podría esperar que la estructura secuenciaria y la naturaleza hidropática del polipéptido no cambia sustancialmente. Generalmente, las sustituciones de aminoácidos pueden hacerse en base a la similitud en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad y/o la naturaleza anfipática de los restos. Por ejemplo, los aminoácidos de carga negativa incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; aminoácidos de carga positiva incluyen lisina y arginina; y aminoácidos con grupos cabeza polares sin carga que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen leucina, isoleucina y valina; glicina y alanina; asparagina y glutamina; y serina, treonina, fenilalanina y tirosina. otros grupos de aminoácidos que pueden representar cambios conservados incluyen: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his. Una variante también puede, o de forma alternativa, contener cambios no conservados. En una realización preferida, los polipéptidos variantes difieren de la secuencia nativa por sustitución, deleción, o adición de cinco o menos aminoácidos. Las variantes también pueden (o de forma alternativa) ser modificadas por, por ejemplo, la deleción o adición de aminoácidos que tienen mínima influencia en la inmunogenicidad, estructura secuenciaria y naturaleza hidropática del polipéptido.
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Tal como se mencionó arriba, los polipéptidos pueden comprender una secuencia señal (o líder) en el extremo N-terminal de la proteína, la cual dirige, de forma co-traduccional o post-traduccional, el traslado de la proteína. El polipéptido también puede estar conjugado a un enlazador u otra secuencia para facilitar la síntesis, purificación o identificación del polipéptido (por ejemplo, poli-His), o para potenciar la unión del polipéptido a un soporte sólido. Por ejemplo, un polipéptido puede estar conjugado a una región de inmunoglobulina Fc.
Los polipéptidos se pueden preparar utilizando cualquier variedad de técnicas bien conocidas. Los polipéptidos recombinantes codificados por secuencias de ADN, tal como se describió arriba, pueden se preparados fácilmente a partir de secuencias de ADN, utilizando cualquier variedad de vectores de expresión conocidos por aquellos expertos en el estado de la técnica. La expresión se puede alcanzar en cualquier célula hospedadora apropiada que haya sido transformada o transfectada con un vector de expresión que contenga una molécula de ADN que codifica un polipéptido recombinante. Células hospedadoras apropiadas incluyen procariotas, levaduras, y células eucariotas superiores, como células de mamíferos y células de plantas. Preferiblemente, las células hospedadoras empleadas son E. coli, levaduras o una línea celular de mamífero como COS o CHO. Los sobrenadantes de los sistemas hospedadores/vectores apropiados, que secretan proteína recombinante o polipéptido al medio de cultivo, primero pueden ser concentrados usando un filtro disponible comercialmente. Tras la concentración, el concentrado puede ser aplicado a una matriz de purificación apropiada, como una matriz de afinidad o una resina de intercambio iónico. Finalmente, se pueden emplear una o más etapas de HPLC en fase reversa para purificar aún mas un polipéptido recombinante.
Las porciones y otras variantes que tengan menos de 100 aminoácidos, y generalmente menos de aproximadamente 50 aminoácidos, también pueden ser generadas por medios sintéticos, utilizando técnicas bien conocidas por expertos en el estado de la técnica. Por ejemplo, dichos polipéptidos pueden ser sintetizados utilizando cualquier técnica de fase sólida disponible comercialmente, como el método de síntesis en fase sólida de Merrifield, donde se añaden los aminoácidos, de forma secuencial, a una cadena creciente de aminoácidos. Véase Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963. El equipo para la síntesis de polipéptidos está disponible comercialmente por proveedores como Perkin Elmer/Applied BioSystems Division (Foster City, CA), y puede ser realizada de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
Dentro de ciertas realizaciones específicas, un polipéptido puede ser una proteína de fusión que comprende múltiples polipéptidos, tal como se ha descrito aquí, o que comprende al menos un polipéptido, tal como se ha describo aquí, y una secuencia no relacionada, como una proteína conocida de Chlamydia. Una pareja de fusión puede, por ejemplo, ayudar proporcionando epítopos T ayudantes (una pareja de fusión inmunológica), preferiblemente epítopos T ayudantes reconocidos por humanos, o puede ayudar expresando la proteína (un potenciador de expresión) a mayores rendimientos que la proteína recombinante nativa. Ciertas parejas de fusión preferidas son parejas de fusión potenciadoras de expresión e inmunológicas. Otras parejas de fusión pueden ser seleccionadas para aumentar la solubilidad de la proteína o para permitir que la proteína sea marcada o etiquetada a compartimentos celulares deseados. Otras parejas de fusión incluyen etiquetas de afinidad, que facilitan la purificación de la proteína.
Generalmente, las proteínas de fusión se pueden preparar utilizando técnicas clásicas, que incluyen conjugación química. Preferiblemente, una proteína de fusión está expresada como una proteína recombinante, que permite la producción, en relación a la proteína no fusionada, de niveles aumentados en un sistema de expresión. Brevemente, las secuencias de ADN que codifican componentes polipeptídicos, pueden ser unidas de forma separada, y ligadas dentro de un vector de expresión apropiado. El extremo 3' de una secuencia de ADN que codifica un componente polipeptídico es ligado, con o sin un enlazador peptídico, al extremo 5' de una secuencia de ADN que codifica un segundo componente polipeptídico, de tal forma que los marcos de lectura de las secuencias están en fase. Esto permite la traducción a una sola proteína de fusión que conserva la actividad biológica de ambos componentes polipeptídicos.
Se puede emplear una secuencia peptídica enlazadora para separar el primer y segundo componente por una distancia suficiente para asegurar que cada polipéptido se pliega en sus estructuras secundaria y terciaria. Dicha secuencia polipeptídica enlazadora está incorporada dentro de la proteína de fusión, utilizando técnicas bien conocidas en le estado de la técnica. Se pueden elegir secuencias peptídicas enlazadores apropiadas basándose en los siguientes factores: (1) su habilidad para adoptar una conformación extendida flexible; (2) su incapacidad para adoptar una estructura secundaria que podría interaccionar con epítopos funcionales en los polipéptidos primero y segundo; y (3) la falta de restos hidrofóbicos o cargados que podrían reaccionar con los epítopos funcionales del polipéptido. Las secuencias peptídicas enlazadoras preferidas contienen restos Gly, Asn y Ser. También pueden utilizarse, en la secuencia enlazadora, otros aminoácidos neutros cercanos, como Thr y Ala. Las secuencias de aminoácidos que se pueden emplear, de forma útil, como enlazadores incluyen aquellos revelados en Maratea y cols., Gene 40:39-46, 1985; Murphy y cols., Proc. Natl. Acad. Set USA 83:8258-8262, 1986; en la Patente de EE.UU No. 4,935,233 y en la Patente de EE.UU No. 4,751,180. Generalmente, la secuencia enlazadora puede ser desde aproximadamente 1 a aproximadamente 50 aminoácidos de longitud. No se requieren secuencias enlazadoras cuando los polipéptidos primero y segundo tienen regiones N-terminales no esenciales, que pueden ser utilizadas para separar los dominios funcionales y prevenir interferencia estérica.
Las secuencias ligadas de ADN, están unidas, de forma operativa, a elementos reguladores transcripcionales y traduccionales apropiados. Los elementos reguladores responsables de la expresión del ADN sólo están situados en 5' de la secuencia de ADN que codifica el primer polipéptido. De forma similar, los codones de parada requeridos para terminar la traducción y las señales de terminación de transcripción sólo están presentes en 3' de la secuencia de ADN que codifica el segundo polipéptido.
También se proporcionan a composiciones que comprenden proteínas de fusión, para uso de acuerdo a la presente invención. Dichas proteínas comprenden un polipéptido que comprende:
(i) la secuencia de aminoácidos de restos 8 a 660 de la Seq ID No:139, o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con ella, determinada comparando las dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación de restos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139; o
(ii) una porción inmunogénica de restos aminoacídicos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139 que tiene, al menos, 15 aminoácidos de longitud; junto con una proteína inmunogénica no relacionada. Preferiblemente, la proteína inmunogénica es capaz de obtener una respuesta de recuerdo. Ejemplo de dichas proteínas incluyen proteínas de tétanos, tuberculosis y hepatitis (ver, por ejemplo, Stoute y cols. New Engl. J. Med., 336:86-91,1997).
Dentro de realizaciones preferidas, una pareja de fusión inmunológica deriva de la proteína D, una proteína de superficie de la bacteria gram-negativa Haemophilus influenza B (WO 91/18926). Preferiblemente, un derivado de proteína D comprende, aproximadamente el primer tercio de la proteína (por ejemplo, los primeros 100-110 aminoácidos N-terminales), y un derivado de proteína D debe estar lipidado. Dentro de ciertas realizaciones, los primeros 109 restos de una pareja de fusión de Lipoproteína D están incluidos en N-terminal para proveer al polipéptido con epítopos exógenos adicionales de célula T y para aumentar el nivel de expresión en E. coli (funcionando, así, como un potenciador de expresión). La cola lipídica asegura la óptima presentación del antígeno a células presentadoras de antígeno. Otras parejas de fusión incluyen la proteína no estructural del virus influenza, NS1 (hemaglutinina). Típicamente, se usan los 81 aminoácidos N-terminales, aunque se pueden usar diferentes fragmentos que incluyen epítopos ayudantes de T.
En otra realización, la pareja de fusión inmunológica es la proteína conocida como LYTA, o una porción de la misma (preferiblemente una porción C-terminal). LYTA deriva de Streptococcus pneumoniae, que sintetiza una N-acetil-L-alanina amidasa conocida como amidasa LYTA (codificada por el gen LytA; Gene 43:265-292, 1986). LYTA es una autolisina que degrada, de forma específica, ciertos enlaces en la estructura del peptidoglucano. El dominio C-terminal de la proteína LYTA es responsable de la afinidad a la colina o a algunos análogos de la colina como DEAE. Esta propiedad ha sido explotada para el desarrollo de plásmidos que expresan C-LYTA de E. coli útiles para la expresión de proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento C-LYTA en el aminoácido terminal (véase Biotechnology 10:795-798, 1992). Dentro de una realización preferida, puede estar incorporada una porción repetida de LYTA dentro de una proteína de fusión. Una porción repetida se encuentra en la región C-terminal que empieza en el residuo 178. Una porción repetida particularmente preferida incorpora restos 188-305.
En general, los polipéptidos (incluyendo proteínas de fusión) y los polinucleótidos, tal como aquí se describen, están aislados. Un polipéptido o polinucleótido "aislado" es uno que está extraído de su ambiente original. Por ejemplo, una proteína de la naturaleza está aislada si está separada a partir de algunos o todos los materiales que co-existen en el sistema natural. Preferiblemente, dichos polipéptidos son, al menos, aproximadamente del 90% puros, más preferiblemente, al menos, aproximadamente del 95% puros y más preferiblemente, al menos. aproximadamente del 99% puros. Un polinucleótido está considerado aislado si, por ejemplo, está clonado dentro de un vector que no es parte del ambiente natural.
Composiciones terapéuticas ilustrativas y usos
En otro aspecto, la presente invención proporciona una o más de las proteínas de fusión o polipéptidos de arriba (o polinucleótidos codificantes de dichos polipéptidos o proteínas de fusión) para uso para inducir, en un paciente, inmunidad protectora contra infección por Chlamydia. Tal como se utiliza aquí, un "paciente" se refiere a cualquier animal de sangre caliente, preferiblemente un humano. Un paciente puede estar afectado con una enfermedad, o puede estar libre de enfermedad y/o infección detectable. En otras palabras, la inmunidad protectora puede estar inducida para prevenir o tratar infección por Chlmydia.
En este aspecto, generalmente, la molécula de polipéptido, proteína de fusión o polinucleótido está presente dentro de una composición farmacéutica o vacuna. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender Uno o más polipéptidos, cada uno de los cuales pueden contener una o más de las secuencias (i) la secuencia de aminoácidos de restos 8 a 660 de la Seq ID No:139, o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con ella, determinada comparando las dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación de restos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139; o (ii) una porción inmunogénica de los restos aminoacídicos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139 que tiene, al menos, 15 aminoácidos de longitud, y un vehículo fisiológicamente aceptable. Las vacunas pueden comprender uno o más polipéptidos que comprenden (i) la secuencia de aminoácidos de restos 8 a 660 de la Seq ID No:139, o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con ella, determinada comparando las dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación de restos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139; o (ii) una porción inmunogénica de los restos aminoacídicos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139 que tiene, al menos, 15 aminoácidos de longitud; y un inmunoestimulante, como un adyuvante o liposoma (dentro del cual está incorporado el polipéptido). Dichas composiciones farmacéuticas y vacunas también pueden contener otros antígenos de Chlamydia, tanto incorporados dentro de una combinación polipeptídica o presentes dentro del polipéptido separado.
De forma alternativa, una vacuna puede contener polinucleótidos que codifican uno o más polipéptidos o proteínas de fusión tal como se describen arriba, de tal forma que el polipéptido es generado in situ. En dichas vacunas, los polinucleótidos pueden estar presentes dentro de alguna variedad de sistemas de administración conocidos por expertos en la materia, incluyendo sistemas de expresión de ácidos nucleicos, sistemas de expresión bacterianos y víricos. Los sistemas de expresión de ácidos nucleicos apropiados contienen las secuencias polinucleotídicas necesarias para la expresión en el paciente (como un promotor apropiado y una señal de terminación). Los sistemas de administración bacterianos implican la administración de una bacteria (como Bacillus-Calmette-Guerrin) que exprese una porción inmunogénica del polipéptido en su superficie celular. En una realización preferida, los polinucleótidos pueden ser introducidos utilizando un sistema de expresión viral (por ejemplo, vaccinia u otros pox virus, retrovirus, o adenovirus), que pueden implicar el uso de un virus no patogénico (defectuoso). Las técnicas para incorporar polinucleótidos dentro de dichos sistemas de expresión son bien conocidos por aquellos expertos en la materia. Los polinucleótidos también pueden ser administrados como vectores plasmídicos "desnudos" tal como se describió, por ejemplo Ulmer y cols., Science 259:1745-1749, 1993 y revisó por Cohen, Science 259:1691-1692, 1993. Las técnicas para incorporar ADN dentro de dichos vectores son bien conocidos por aquellos expertos en la materia. Adicionalmente, un vector retroviral puede transferir o incorporar un gen para un marcador selectivo (para ayudar en la identificación o selección de células trasducidas) y/o marcar una porción, de forma que un gen que codifica un ligando para un receptor en una célula diana específica, presente el vector diana específico. El marcaje también puede realizarse utilizando un anticuerpo, por métodos conocidos por aquellos expertos en la materia.
Otras formulaciones para propósitos terapéuticos incluyen sistemas de dispersión coloidal, como complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, bolitas, y sistemas basados en lípidos, incluyendo emulsiones aceite-en-agua, micelas, micelas mixtas, y liposomas. Un sistema coloidal preferido para uso como vehículo de administración in vitro e in vivo es un liposoma (es decir,una vesícula de membrana artificial). La captación de polinucleótidos desnudos puede estar aumentada por la incorporación de polinucleótidos dentro y/o en bolitas biodegradables, que son transportadas de forma eficaz dentro de las células. La preparación y uso de dichos sistemas es bien conocido en el estado de la técnica.
En un aspecto relacionado, una vacuna de polinucleótido como se describió arriba, puede ser administrada simultáneamente con, o secuencialmente tanto con un polipéptido de la presente invención como con un antígeno conocido de Chlamydia. Por ejemplo, la administración de polinucleótidos que codifican un polipéptido, tanto "desnudo" como en un sistema de administración tal como se describe arriba, puede ir seguido de la administración de un antígeno con el fin de potenciar el efecto inmunoprotector de la vacuna.
Un inmunoestimulante puede ser cualquier sustancia que potencie una respuesta inmune frente a un antígeno exógeno. Ejemplos de inmunoestimulantes incluyen adyuvantes, microesferas biodegradables (por ejemplo, galactida poliláctica) y liposomas (dentro de los cuales está incorporado el compuesto; véase por ejemplo, Fullerton, la Patente de EE.UU No. 4,235,877). Generalmente, la preparación de la vacuna está descrita en, por ejemplo, M.F. Powell y M.J. Newman, eds., "Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach)", Plenum Press (NY, 1995). Las composiciones farmacéuticas y vacunas dentro del alcance de la presente invención, también pueden contener otros compuestos, que pueden ser biológicamente activos o inactivos. Por ejemplo, pueden estar presentes una o más porciones inmunogénicas de otros antígenos de Chlamydia, tanto incorporados dentro de un polipéptido de fusión o como un compuesto separado, dentro de la composición o vacuna.
Una composición farmacéutica o vacuna puede contener ADN que codifica uno o más de los polipéptidos tal como se describen arriba, de tal forma que el polipéptido es generado in situ. Como se mencionó arriba, el ADN puede estar presente dentro de cualquier variedad de sistemas de administración conocidos por aquellos expertos en la materia, incluyendo sistemas de expresión de ácidos nucleicos, sistemas de expresión bacterianos y virales. En el estado de la técnica se conocen numerosas técnicas de administración de genes, como aquellos descritos por Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198, 1998, y referencias ahí citadas. Los sistemas de expresión de ácidos nucleicos apropiados contienen las secuencias de ADN necesarias para la expresión en el paciente (como un promotor apropiado y una señal de terminación). Los sistemas de administración bacterianos implican la administración de una bacteria (como Bacillus-Calmette-Guerrin) que exprese una porción inmunogénica del polipéptido en su superficie celular o secrete dicho epítopo.
En una realización preferida, el ADN debe ser introducido utilizando un sistema de expresión viral (por ejemplo, vaccinia u otro pox virus, retrovirus, adenovirus, baculovirus, togavirus, bacteriófago, y similares), que frecuentemente implique el uso de un virus no patogénico (deficiente) competente en la replicación.
Por ejemplo, muchos vectores de expresión viral derivan de virus de la familia retroviridae. Esta familia incluye los virus de leucemia de múridos, los virus del tumor mamario de ratón, los virus espumosos humanos, el virus del sarcoma de Rous, y los virus inmunodeficientes, incluyendo los de humano, simio, y los felinos. Las consideraciones, cuando se diseñan vectores de expresión retroviral, se discuten en Comstock y cols. (1997).
Kim y cols. (1998) han desarrollado excelentes vectores de expresión virales basados en el virus de leucemia de múridos (MLV). En la creación de los vectores MLV, Kim y cols. encontraron que podía ser delecionada toda la secuencia gag, junto con la región inmediata aguas arriba, sin afectar de forma significativa el empaquetamiento viral o la expresión génica. Además, se encontró que casi la totalidad de la región U3 puede ser reemplazada por el promotor inmediatamente temprano del citomegalovirus humano sin efectos deletéreos. De forma adicional, se pueden añadir MCR y lugares internos de entrada de ribosomas (IRES) sin efectos adversos. Basado en estas observaciones, Kim y cols. han diseñado una serie de vectores de expresión basados en MLV que comprenden una o más de las características arriba descritas.
Con respecto a lo que se ha aprendido de los virus espumosos humanos (HFV), se han descubierto características de HFV que son favorables para su uso como vector de expresión. Estas características incluyen la expresión de pol por empalme y comienzo de la traducción en un codón de iniciación definido. Otros aspectos de los vectores de expresión viral de HFV están revisados en Bodem y cols. (1997).
Murakami y cols. (1997) describen vectores retrovirales de aves competentes en la replicación basados en el virus del sarcoma de Rous (RSV), IR1 e IR'', para expresar, a un alto nivel, un gen heterólogo. En estos vectores, los IREs derivados del virus de la encefalomiocarditis (EMCV) se insertaron entre el gen env y el gen heterólogo. El vector IR1 retiene el lugar empalme-aceptor que está presente aguas abajo del gen env mientras que el vector IR2 lo elimina. Murakami y cols. han demostrado, por estos vectores, altos niveles de expresión de varios genes heterólogos diferentes.
Recientemente, se han desarrollado un número de vectores de expresión retroviral basados en lentivirus. Kafri y cols. (1997) han demostrado expresión sostenida de genes administrados directamente dentro del hígado y del músculo por un vector de expresión basado en un virus de la inmunodeficiencia humana (HIV). Un beneficio del sistema es la inherente habilidad del HIV para transducir células que no están en división. Debido a que los virus de Kafri y cols. están pseudotipados o pseudocaracterizados con la glucoproteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSVG), éstos pueden transducir a una amplia gama de tejidos y tipos celulares.
Se ha desarrollado un gran número de vectores de expresión basados en adenovirus, ante todo, debido a las ventajas que ofrecen estos vectores en las aplicaciones de terapia génica. Los vectores de expresión de adenovirus y los métodos de uso de dichos vectores son sujeto de varias patentes de EE.UU, que incluyen la Patente de EE.UU No. 5,698,202, la Patente de EE.UU No. 5,616,326, la Patente de EE.UU No. 5,585,362, y la Patente de EE.UU No. 5,518,913.
Se han descrito construcciones adenovirales adicionales en Khatri y cols. (1997) y Tomanin y cols. (1997). Khatri y cols. describen nuevos vectores de expresión de adenovirus ovinos y su habilidad para infectar los cornetes nasales bovinos y las células renales en conejos, así como una gama de tipos celulares en seres humanos, que incluyen fibroblastos de pulmón y de prepucio, así como líneas hepáticas, prostáticas, de pecho, de colon y de retina. Tomanin y cols. describen vectores de expresión de adenovirus que contienen el gen de la ARN polimerasa T7. Los vectores eran capaces de dirigir la expresión génica a partir del promotor T7 cuando se les introdujo dentro de células que contenían un gen heterólogo unido de forma operativa al promotor T7. Los autores sugieren que este sistema puede ser útil para el clonaje y la expresión de genes que codifican proteínas citotóxica.
Los poxvirus son ampliamente utilizados para la expresión de genes heterólogos en células de mamífero. A lo largo de los años, los vectores se han mejorado para permitir una alta expresión del gen heterólogo y para simplificar la integración de múltiples genes heterólogos dentro de una sola molécula. En un esfuerzo por disminuir los efectos citopáticos y por aumentar la seguridad, los virus mutantes de vaccinia y otros poxvirus que producen infecciones abortivas en células de mamíferos están recibiendo una especial atención (Oertli y cols., 1997). El uso de poxvirus como vectores de expresión está examinado en Carroll y Moss (1997).
Se han utilizado vectores de expresión togaviral, que incluyen vectores de expresión alfaviral, para estudiar la estructura y función de proteínas y para propósitos de producción de proteínas. Las características atractivas de los vectores de expresión togaviral son la rápida y eficaz expresión génica, la amplia gama de hospedadores, y genomas de ARN (Huang, 1996). Además, las vacunas recombinantes basadas en vectores de expresión alfaviral han mostrado que inducen una fuerte respuesta inmune humoral y celular, con una buena memoria inmunológica y efectos protectores (Tubulekas y cols., 1997). Los vectores de expresión alfaviral y su uso se discuten, por ejemplo, en Lundstrom (1997).
En un estudio, Li y Garoff (1996) utilizaron vectores de expresión del virus del Bosque Semliki (Semliki Forest virus) (SFV) para expresar genes retrovirales y para producir partículas retrovirales en células BHK-21. Las partículas producidas por este método tenían actividad proteasa y transcriptasa reversa y eran infecciosas. Además, no se pudo detectar virus ayudante en la reserva de virus. Además, este sistema tiene características atractivas para su uso en protocolos de terapia génica.
Los vectores de expresión baculoviral, se han usado tradicionalmente para expresar proteínas heterólogas en células de insecto. Ejemplos de proteínas incluyen receptores de quimioquinas de mamífero (Wang y cols., 1997), proteínas indicadoras como la proteína verde fluorescente (Wu y cols., 1997), y las proteínas de fusión FLAG (Wu y cols., 1997; Koh y cols., 1997). Avances recientes en tecnología de vectores de expresión baculovirales, que incluyen su uso en vectores de exposición de viriones y la expresión en células de mamífero, están revisados por Possee (1997). Otras revisiones de vectores de expresión baculoviral incluyen Jones y Morikawa (1996) y O'Reilly (1997).
Otros sistemas de expresión viral apropiados se describen, por ejemplo, en Fisher-Hoch y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317-321, 1989; Flexner y cols., Ann. N.Y. Acad. Sci. 569:86-103, 1989; Flexner y cols., Vaccine 8:17-21, 1990; Patentes de EE.UU Nos. 4,603,112, 4,769,330, y 5,017,487; WO 89/01973; Patente de EE.UU Nº 4,777,127; GB 2,200,651; EP 0,345,242; WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 6:616-627, 1988; Rosenfeld y cols., Science 252:431-434, 1991; Kolls y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219, 1994; Kass-Eisler y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11498-11502; 1993; Guzman y cols., Circulation 88:2838-2848, 1993; y Guzman y cols., Cir. Res. 73:1202-1207, 1993. Las técnicas para incorporar ADN dentro de dichos sistemas de expresión son bien conocidos por aquellos expertos en la materia. En otros sistemas, el ADN puede introducirse como ADN "desnudo", tal como está descrito, por ejemplo, en Ulmer y cols., Science 259:1745-1749, 1993 y revisado por Cohen, Science 259:1691-1692, 1993. La captación de ADN desnudo puede ser aumentado cubriendo, de ADN, bolitas biodegradables, que se transportan de forma eficaz dentro de las células.
Será evidente que una vacuna pueda comprender un componente polinucleotídico y/o polipeptídico, tal y como se desee. También será evidente que una vacuna pueda contener sales farmacéuticamente aceptables de los polinucleótidos y/o polipéptidos aquí proporcionados. Dichas sales pueden estar preparadas a partir de bases no tóxicas farmacéuticamente aceptables, incluyendo bases orgánicas (por ejemplo, sales de aminas primarias, secundarias y terciarias y aminoácidos básicos) y bases inorgánicas (por ejemplo, sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio y magnesio). Mientras que se puede emplear cualquier vehículo conocido por aquellos expertos en la materia en las composiciones farmacéuticas de esta invención, el tipo de vehículo variará dependiendo del modo de administración. Las composiciones de la presente invención pueden ser formuladas para cualquier forma de administración apropiada, incluyendo por ejemplo, administración tópica, oral, nasal, intravenosa, intracraneal, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. Para la administración parenteral, como inyección subcutánea, el vehículo preferido comprende agua, salino, alcohol, una grasa, una cera o una solución amortiguadora (buffer). Para la administración oral, se puede emplear cualquiera de los vehículos de arriba o un vehículo sólido, como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sucrosa, y carbonato de magnesio. También se pueden emplear, como vehículos para las composiciones farmacéuticas de esta invención, microesferas biodegradables (por ejemplo, polilactato poliglucolato). Microesfe-
ras biodegradables apropiadas están reveladas, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU Nos. 4,897,268 y 5,075,109.
Dichas composiciones también pueden comprender soluciones amortiguadoras (buffers) (por ejemplo, solución amortiguadora salina neutra, o solución amortiguadora salina de fosfato), carbohidratos (por ejemplo, glucosa, manosa, sucrosa o dextranos), manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos como glicina, antioxidantes, bacteriostáticos, agentes quelantes como EDTA o glutation, adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio), solutos que hacen la formulación isotónica, hipotónica o débilmente hipertónica con la sangre de un receptor, agentes de suspensión, agentes espesantes y/o conservantes. De forma alternativa, las composiciones de la presente invención pueden ser formuladas como liofilizados. Los compuestos también pueden estar encapsulados dentro de liposomas, utilizando tecnología bien conocida.
Se puede emplear cualquier variedad de inmunoestimulantes en las vacunas de la invención. Por ejemplo, puede incluirse un adyuvante. Muchos adyuvantes contienen una sustancia diseñada para proteger al antígeno de un rápido catabolismo, como un hidróxido de aluminio o un aceite mineral, y un estimulador de respuestas inmunes, como el lípido A, proteínas derivadas de Bortadella pertussis o Mycobacterium tuberculosis. Adyuvantes apropiados están disponibles comercialmente como, por ejemplo, Adyuvante Incompleto y Completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, MI); Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); sales de aluminio como gel de hidróxido de aluminio (alum) o fosfato de aluminio; sales de calcio, hierro o zinc; una suspensión insoluble de tirosina acilada; azúcares acilados; polisacáridos derivatizados catiónicamente o aniónicamente; polifosfazenos; microesferas biodegradables; también pueden usarse como adyuvantes citoquinas monofosforil lípido A y quil A., como GM-CSF o interleuquina-2, -7, o -12.
Dentro de las vacunas aquí proporcionadas, bajo circunstancias selectas, la composición adyuvante puede estar diseñada para inducir una respuesta inmune predominantemente del tipo Th1 o del tipo Th2. Los altos niveles de citoquinas de tipo Th1 (por ejemplo, IFN-\gamma, TNF\alpha, IL-2 e IL-12) tienden a favorecer la indución de respuestas inmunes mediadas por células a un antígeno administrado. En contraste, los altos niveles de citoquinas de tipo Th2 (por ejemplo, IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10) tienden a favorecer la indución de respuestas inmunes humorales. Tras la aplicación de una vacuna tal como aquí se proporciona, un paciente sostendrá una respuesta inmune que incluye respuestas de tipo Th1 y Th2. Dentro de una realización preferida, en la que la respuesta es predominantemente de tipo Th1, el nivel de citoquinas de tipo Th1 aumentará en mayor medida con respecto al nivel de citoquinas de tipo Th2. Los niveles de estas citoquinas pueden ser rápidamente valorados utilizando ensayos clásicos. Para una revisión de las familias de citoquinas, ver Mosmann y Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173,1989.
Adyuvantes preferidos para uso en la obtención de una respuesta predominantemente de tipo Th1 incluyen, por ejemplo, una combinación de monofosofril lípido A, preferiblemente monofosforil lípido A 3-de-O-acilado (3D-MPL), junto con una sal de aluminio. Los adyuvantes MPL están disponibles a partir de Corixa Corporation (Seattle, WA; ver Patentes de EE.UU Nos. 4,436,727; 4,877,611; 4,866,034 y 4,912,094). Los oligonucleótidos que contienen CpG (en los que el dinucleótido CpG no está metilado) también inducen una respuesta predominantemente Th1. Dichos aligonucleótidos son bien conocidos y están descritos, por ejemplo, en WO 96/02555 y WO 99/33488. También están descritas las secuencias de ADN inmunoestimuladoas, por ejemplo, por Sato y cols., Science 273:352, 1996. Otro adyuvante preferido es una saponina, preferiblemente QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA), que puede usarse sola o en combinación con otros adyuvantes. Por ejemplo, un sistema potenciado implica la combinación de un monofosforil lípido A y un derivado de saponina, como la combinación de QS21 y 3D-MPL tal como se describe en WO 94/00153, o una composición menos reactiva donde QS21 se atenúa con colesterol, tal como se describe en WO 96/33739. Otras formulaciones preferidas comprenden una emulsión aceite-en-agua y tocoferol. Una formulación adyuvante particularmente potente que implica QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión aceite-en-agua está descrita en WO 95/17210.
Otros adyuvantes preferidos incluyen Montanide ISA 720 (Seppic, France), SAF (Chiron, California, United States), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), las series de adyuvantes SBAS (por ejemplo, SBAS-2 o SBAS-4, disponibles a partir de SmithKline Beecham, Rixensart, Belgium), Detox (Corixa Corporation; Seattle, WA), RC-529 (Corixa Corporation; Seattle, WA) y otros aminoalquil glucosaminida 4-fosfatos (AGPs), como aquellos descritos en las Series de Solicitudes norteamericanas pendientes Nos. 08/853,826 y 09/074,720.
Cualquier vacuna aquí proporcionada puede ser preparada utilizando métodos bien conocidos que dan lugar a una combinación de antígeno, inmunoestimulante y un vehículo o excipiente apropiado. Las composiciones aquí descritas pueden ser administradas como parte de una formulación de liberación sostenida (es decir, una formulación como una cápsula, esponja o gel (por ejemplo, compuesta de polisacáridos) que lleva a cabo una liberación lenta del compuesto tras la administración). Dichas formulaciones, generalmente pueden ser preparadas utilizando tecnología bien conocida (véase, por ejemplo, Coombes y cols., Vaccine 14:1429-1438, 1996) y administradas por, por ejemplo, implantación oral, rectal o subcutánea, o por implantación en el lugar diana deseado. Las formulaciones de liberación sostenida pueden contener un polipéptido, polinucleótido o anticuerpo disperso en una matriz vehículo y/o estar contenidas en un reservorio rodeado por una membrana de control de velocidad.
Los vehículos para uso dentro de dichas formulaciones son biocompatibles, y también pueden ser biodegradables; Preferiblemente, la formulación proporciona un nivel relativamente constante de liberación del componente activo. Dichos vehículos incluyen micropartículas de poli(lactida-co-glucolida), así como poliacrilato, látex, almidón, celulosa y dextrano. Otros vehículos de liberación retrasada incluyen biovectores supramoleculares, que comprenden un núcleo hidrofílico no líquido (por ejemplo, un polisacárido u oligosacárido entre-cruzado) y, opcionalmente, una capa externa que comprende un compuesto anfifílico, como un fosfolípido (véase por ejemplo, la Patente de EE.UU No. 5,151,254 y las solicitudes PCT WO 94/20078, WO/94/23701 y WO 96/06638). La cantidad de compuesto activo contenido dentro de la formulación de liberación sostenida depende del lugar de implantación, la tasa y duración de liberación esperada y la naturaleza de la condición para ser tratado o prevenido.
Se puede emplear cualquier variedad de vehículos de administración dentro de las composiciones farmacéuticas y vacunas para facilitar la producción de una respuesta inmune específica de antígeno que marca células infectadas con Chlamydia.
Las rutas y frecuencia de administración de las composiciones farmacéuticas y vacunas, así como la dosis, variarán de un sujeto a otro. En general, las composiciones farmacéuticas y vacunas pueden ser administradas por inyección (por ejemplo, intracutánea, intramuscular, intravenosa o subcutánea), intranasalmente (por ejemplo, por aspiración) u oralmente. Se pueden administrar entre 1 y 3 dosis durante un periodo de 1-36 semanas. Preferiblemente, serán administradas 3 dosis, a intervalos de 3-4 meses, y las vacunas de refuerzo pueden darse de forma periódica a partir de entonces. Protocolos alternativos pueden ser apropiados para pacientes individuales. Una dosis apropiada es una cantidad de polipéptido o ADN que, cuando se administra tal y como se describió arriba, es capaz de aumentar una respuesta inmune, en un paciente inmunizado, lo suficiente como para proteger al paciente de infección por Chlamydia durante al menos 1-2 años. En general, la cantidad de polipéptido presente en una dosis (o producida in situ por el ADN en una dosis) está en el intervalo de aproximadamente 1 pg a aproximadamente 100 mg por kg del hospedador, típicamente desde aproximadamente 10 pg a aproximadamente 1 mg, y preferiblemente desde aproximadamente 100 pg a aproximadamente 1 \mug. Los tamaños de dosis apropiados variarán con el tamaño del paciente, pero, típicamente, estarán en el intervalo de aproximadamente 0.1 mL a aproximadamente 5 mL.
Si bien se puede emplear cualquier vehículo conocido por aquellos expertos en la materia en las composiciones farmacéuticas de esta invención, el tipo de vehículo variará dependiendo del modo de administración. Para la administración parenteral, como inyección subcutánea, el vehículo preferido comprende agua, salino, alcohol, una grasa, una cera o una solución amortiguadora (buffer). Para la administración oral, se puede emplear cualquiera de los vehículos de arriba o un vehículo sólido, como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sucrosa, y carbonato de magnesio. También se pueden emplear como vehículo para las composiciones farmacéuticas de esta invención las microesferas biodegradables (por ejemplo, polilactic galactida). Microesferas biodegradables apropiadas están reveladas, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU Nos. 4,897,268 y
5,075,109.
En general, una dosis y régimen de tratamiento apropiados proporcionan el/los compuesto(s) activo(s) en una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico y/o profiláctico. Dicha respuesta puede ser monitorizada estableciendo resultados clínicos mejorados en pacientes tratados en comparación con pacientes no tratados. Generalmente, los aumentos en respuestas inmunes pre-existentes a una proteína de Chlamydia se correlaciona con un resultado clínico mejorado. Generalmente, dichas respuestas inmunes pueden ser evaluadas utilizando ensayos clásicos de proliferación, citotoxicidad o de citoquinas, los cuales puedes ser realizados utilizando muestras obtenidas del paciente antes y después del tratamiento.
Detección y diagnóstico
En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para usar los polipéptidos arriba descritos para diagnosticar infección por Chlamydia. En este aspecto, los métodos se proporcionan para detectar infección por Chlamydia en una muestra biológica, utilizando uno o más de los péptidos de arriba, tanto solos como en combinación. Para aclarar, el término "polipéptido" será usado cuando se describen realizaciones específicas de los métodos diagnósticos inventivos. Sin embargo, quedará claro para un experto en la técnica que las proteínas de fusión de la presente invención también pueden ser empleadas en dichos métodos.
Tal como se utiliza aquí, una "muestra biológica" es cualquier muestra que contiene anticuerpos, obtenida de un paciente. Preferiblemente, la muestra es sangre total, esputo, suero, plasma, saliva, fluido cerebro-espinal u orina. Más preferiblemente, la muestra es una muestra de sangre, suero o plasma, obtenida de un paciente. Los polipéptidos se usan en un ensayo, tal como se describe abajo, para determinar la presencia o ausencia de anticuerpos para el/los polipéptido(s) en la muestra, en relación a un valor límite predeterminado. La presencia de dichos anticuerpos indica sensibilización previa a antígenos de Chlamydia que puede ser indicativo de infección por Chlamydia.
En realizaciones en las que se emplea más de un polipéptido, los polipéptidos utilizados son, preferiblemente, complementarios (es decir, un componente polipeptídico tenderá a detectar la infección en muestras donde la infección no sería detectada por otro componente polipeptídico). Generalmente, los polipéptidos complementarios pueden ser identificados usando cada polipéptido de forma individual, para evaluar muestras de suero obtenidas de una serie de pacientes que se conoce están infectados con Chlamydia. Tras determinar qué muestras dan positivo (tal como se describe abajo) con cada polipéptido, se pueden formular combinaciones de dos o más polipéptidos que son capaces de detectar la infección en la mayoría, o en todas, las muestras probadas.
Los expertos en la materia conocen una variedad de formatos de ensayos para usar uno o más polipéptidos para detectar anticuerpos en una muestra. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. En una realización preferida, el ensayo implica el uso de un polipéptido inmovilizado sobre un soporte sólido para unir y eliminar el anticuerpo de la muestra. Luego, el anticuerpo unido puede ser detectado utilizando un reactivo de detección que contiene un grupo indicador. Reactivos de detección apropiados incluyen anticuerpos que se unen al complejo anticuerpo/polipéptido y polipéptidos libres marcados con un grupo indicador (por ejemplo, en un ensayo semi-competitivo). De forma alternativa, puede ser utilizado un ensayo competitivo, en el que un anticuerpo que se une al polipéptido, está marcado con un grupo indicador se le permite unirse al antígeno inmovilizado tras la incubación del antígeno con la muestra. La extensión con la que los componentes de la muestra inhiben la unión del anticuerpo marcado al polipéptido, es indicativo de la reactividad de la muestra con el polipéptido inmovilizado.
El soporte sólido puede ser cualquier material sólido conocido por aquellos expertos en la materia, al que el antígeno puede estar pegado. Por ejemplo, el soporte sólido puede ser un pocillo de prueba en un plato de microtítulo, o una nitrocelulosa u otra membrana apropiada. De forma alternativa, el soporte puede ser una bolita o disco, como cristal, fibra de cristal o un material plástico como poliestireno o polivinilcloruro. El soporte también puede ser una partícula magnética o un sensor de fibra óptica, como aquellos revelados, por ejemplo, en la Patente de EE.UU No. 5,359,681.
Los polipéptidos pueden estar unidos a un soporte sólido utilizando una variedad de técnicas conocidas por aquellos expertos en la materia. En el contexto de la presente invención, el término "enlace" se refiere tanto a asociación no covalente, como adsorción, como a unión covalente (que puede ser una unión directa entre el antígeno y los grupos funcionales sobre el soporte o puede ser una unión por vía de un agente de entre-cruzamiento). Es preferida la unión por adsorción a un pocillo en un plato de micro título o a una membrana. En dichos casos, la adsorción se puede conseguir contactando el polipéptido, en una solución amortiguadora, con el soporte sólido durante una cantidad de tiempo apropiada. El tiempo de contacto varía con la temperatura, pero típicamente está entre 1 hora y 1 día. En general, el contactar un pocillo de un plato de microtítulo de plástico (como poliestireno o polivinilcloruro) con una cantidad de polipépetido con intervalos entre aproximadamente 10 ng a aproximadamente 1 \mug, y preferiblemente aproximadamente 100 ng, es suficiente para unir una cantidad adecuada de antígeno.
Generalmente, la unión covalente de polipéptido a un soporte sólido puede alcanzarse primero, haciendo reaccionar el soporte con un reactivo bifuncional que reaccionará tanto con el soporte como con el grupo funcional, como un grupo hidroxilo o amino, sobre el polipéptido. Por ejemplo, el polipéptido puede estar unido a soportes que tienen una cobertura de polímero apropiada, utilizando benzoquinona o por condensación de un grupo aldehído sobre el soporte con una amina y un hidrógeno activo sobre el polipéptido (véase, por ejemplo, Pierce Immunotechnology Catalog y Handbook, 1991, at A12-A13).
En ciertas realizaciones, el ensayo es un ensayo inmunosorbente unido a enzima (ELISA). Este ensayo puede ser realizado, primero contactando un antígeno polipeptídico, que ha sido inmovilizado sobre un soporte sólido, comúnmente el pocillo de un plato de midrotítulo, con la muestra, de tal forma que se permite la unión de anticuerpos del polipéptido dentro de la muestra con el polipéptido inmovilizado. Luego, la muestra no unida es eliminada del polipéptido inmovilizado y se añade un reactivo de detección capaz de unirse al complejo inmovilizado anticuerpo-polipéptido. Luego, se determina la cantidad de reactivo de detección que permanece unido al soporte sólido, utilizando un método apropiado para el reactivo de detección específico.
Más específicamente, una vez que el polipéptido está inmovilizado sobre el soporte tal como se describió arriba, típicamente se bloquean los lugares de unión de la proteína restante sobre el soporte. Se puede emplear cualquier agente bloqueante apropiado conocido por aquellos expertos en la materia, como albúmina sérica bovina (BSA) o Tween 20^{TM} (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Luego, el polipéptido inmovilizado se incuba con la muestra, y se permite la unión del anticuerpo al antígeno. Previamente a la incubación, la muestra puede ser diluída con un diluyente apropiado, como solución amortiguadora salina de fosfato (PBS). En general, un tiempo de contacto apropiado (es decir, tiempo de incubación) es aquel periodo de tiempo que es suficiente para detectar la presencia de anticuerpo dentro de una muestra infectada con HGE. Preferiblemente, el tiempo de contacto es suficiente para alcanzar un nivel de inión que es de al menos el 95% de aquel alcanzado a un equilibrio entre anticuerpo unido y no unido. Aquellos expertos en la materia reconocerán que el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio puede ser fácilmente determinado ensayando el nivel de unión que ocurre en un periodo de tiempo. A temperatura ambiente, generalmente un tiempo de incubación de aproximadamente 30 minutos es suficiente.
Luego, la muestra no unida puede ser eliminada lavando el soporte sólido con una solución amortiguadora apropiada, como PBS que contiene un 0,1% de Tween 20^{TM}. Luego, se puede añadir, al soporte sólido, el reactivo de detección. Un reactivo de detección apropiado es cualquier compuesto que se una al complejo inmovilizado anticuerpo-polipéptido y que pueda ser detectado por cualquier variedad de medios conocidos por aquellos expertos en la materia. Preferiblemente, el reactivo de detección contiene un agente de unión (como, por ejemplo, Proteína A, Proteína G, inmunoglobulina, lectina o antígeno libre) conjugado con un grupo indicador. Grupos indicadores preferidos incluyen enzimas (como peroxidasa de rábano picante), sustratos, cofactores, inhibidores, tintes, radionúclidos, grupos luminescentes, grupos fluorescentes y biotina. La conjugación de agentes de unión a un grupo indicador pueden ser realizadas usando métodos clásicos conocidos por aquellos expertos en la materia. Los agentes de unión comunes también pueden comprarse conjugados a una variedad de grupos indicadores a partir de muchas fuentes comerciales (por ejemplo, Zymed Laboratories, San Francisco, CA, y Pierce, Rockford, IL).
Luego, el agente de detección se incuba con el complejo inmovilizado anticuerpo-polipéptido durante una cantidad de tiempo suficiente para detectar el anticuerpo unido. Generalmente, una cantidad de tiempo apropiada puede ser determinada a partir de las instrucciones del fabricante o ensayando el nivel de unión que ocurre en un periodo de tiempo. Luego, el agente de detección no unido es eliminado y el reactivo de detección unido se detecta usando el grupo indicador. El método empleado para detectar el grupo indicador depende de la naturaleza del grupo indicador. Generalmente, para grupos radiactivos, los métodos apropiados son el contaje de destellos o los métodos autorradiográficos. Los métodos espectroscópicos pueden ser usados para detectar tinciones, grupos luminiscentes y grupos fluorescentes. La biotina puede ser detectada usando avidina, acoplada a un grupo indicador distinto (comúnmente un grupo radiactivo o fluorescente o una enzima). Generalmente, los grupos indicadores enzimáticos pueden ser detectados por la adición de sustrato (generalmente durante un periodo específico de tiempo), seguido de análisis espectroscópico u otro análisis de los productos de reacción.
Para determinar la presencia o ausencia de anticuerpo anti-Chlamydia en la muestra, generalmente se compara la señal detectada del grupo indicador, que permanece unido al soporte sólido, con una señal que corresponde a un valor límite predeterminado. En una realización preferida, el valor límite es la señal media promedio obtenida cuando el antígeno inmovilizado es incubado con muestras de un paciente no infectado. En general, una muestra que genera una señal que está tres valores de desviación por encima del valor límite predeterminado se considera positiva para infección por Chlamydia. En una realización alternativa preferida, el valor límite es determinado usando una Curva Receptor Operador, de acuerdo al método de Sackett y cols., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, pp. 106-107. Brevemente, en esta realización, el valor límite puede ser determinado a partir de una trama de pares de tasas de verdaderos positivos (es decir, sensibilidad) y tasas de falsos positivos (100% de especificidad) que corresponden a cada posible valor límite para el resultado del examen diagnóstico. El valor límite en la trama que es el más cercano a la esquina superior izquierda (es decir, el valor que engloba el área mayor) es el valor límite más exacto, y una muestra que genera una señal que es mayor que este valor límite, determinado por este método, se puede considerar positivo. De forma alternativa, el valor límite puede ser cambiado a la izquierda a lo largo de la trama, para minimizar la tasas de falsos positivos, o a la derecha, para minimizar la tasa de falsos negativos. En general, una muestra que genera una señal que es mayor que el valor límite determinado por este método, se considera positiva para infección por Chlamydia.
En una realización relacionada, el ensayo se realiza en un formato de prueba a través de flujo rápido o de tira, donde el antígeno está inmovilizado en una membrana, como nitrocelulosa. En la prueba a través de flujo, los anticuerpos contenidos en la muestra se unen al polipéptido inmovilizado mientras la muestra pasa a través de la membrana. Luego, al complejo anticuerpo-polipépetido se une un reactivo de detección (por ejemplo, proteína A-oro coloidal) mientras la solución que contiene el reactivo de detección fluye a través de la membrana. Luego, tal como se describió arriba, se puede realizar la detección del reactivo de detección unido. En el formato de prueba de tira, un extremo de la membrana, al que está unido el polipéptido, se sumerge en una solución que contiene la muestra. La muestra migra a lo largo de la membrana a través de una región que contiene reactivo de detección y al área del polipéptido inmovilizado. La concentración de reactivo de detección en el polipéptido indica la presencia de anticuerpos Chlamydia en la muestra. Típicamente, la concentración de reactivo de detección en ese lugar, genera un patrón, como una línea, que puede ser leído visualmente. La ausencia de dicho patrón indica un resultado negativo. En general, la cantidad de polipéptido inmovilizado sobre la membrana está elegido para generar un patrón visual discernible cuando la muestra biológica contiene un nivel de anticuerpos que puede ser suficiente para generar una señal positiva en un ELISA, tal como se discutió arriba. Preferiblemente, la cantidad de polipéptido inmovilizado sobre la membrana está en el intervalo de aproximadamente 25 ng a aproximadamente 1 \mug, y más preferiblemente desde aproximadamente 50 ng a aproximadamente 500 ng. Estas pruebas, pueden ser realizadas, típicamente, con una cantidad muy pequeña (por ejemplo, una gota) de suero o sangre del paciente.
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Por supuesto, existen otros muchos protocolos de ensayos que son apropiados para uso con el polipéptido de la presente invención. Las descripciones de arriba sólo pretenden ser ejemplares. Un ejemplo de un protocolo de ensayo alternativo, que puede ser útilmente empleado es dichos métodos, es el Western Blot, donde las proteínas presentes en una muestra biológica son separadas en un gel, previamente a la exposición a un agente de unión. Estas condiciones son muy conocidas por los expertos en la materia.
Los reactivos de diagnóstico de la presente invención también pueden comprender secuencias de ADN que codifican uno o más de los polipéptidos de arriba, o una o más de las porciones de los mismos. Por ejemplo, se pueden emplear, al menos, dos cebadores oligonucleotídicos en un ensayo basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)para amplificar un cDAN específico de Chlamydia derivado de una muestra biológica, donde, al menos uno de los cebadores oligonucleotídicos es específico para una molécula de ADN que codifica un polipéptido de la presente invención. Luego, la presencia del cDNA amplificado se detecta utilizando técnicas bien conocidas en la materia, como electroforesis en gel. De forma similar, se pueden utilizar sondas oligonucleotídicas específicas para una molécula de ADN que codifica un polipéptido de la presente invención, en un ensayo de hibridación para detectar la presencia de un polipéptido inventivo en una muestra biológica.
Se ofrecen los siguientes ejemplos como forma de ilustración y no como forma de limitación.
Ejemplo 1 Clonaje de la expresión de célula T CD4 para la identificación de antígenos estimulantes de Célula T de Chlamydia trachomatis serovar E
En este ejemplo, se utilizó la estrategia de clonaje de expresión de célula T CD4+ para identificar antígenos de Chlamydia trachomatis reconocidos por pacientes alistados en el programa de donantes de sangre de Corixa Corporation. Se construyó y escrutó un banco genómico de Chlamydia trachomatis serovar E con líneas de células T específicas de Chlamydia, generadas por estimulación de PBMCs de estos donantes. El Donante CT1 es un hombre de 27 años cuya manifestación clínica era uretritis no gonocócica y su orina fue analizada positiva para Chlamydia por la reacción en cadena de la ligasa. El Donante CT3 es un hombre de 43 años asintomático y está infectado con serovar J. El Donante CT10 es una mujer de 24 años asintomática y que fue expuesta a Chlamydia por su pareja, pero no desarrolló la enfermedad. El Donante CT11 es una mujer de 24 años con múltiples infecciones (serovar J, F y E).
A partir de donantes con infección por Chlamydia del tracto genital o donantes expuestos a Chlamydia que no desarrollaron la enfermedad, se generaron líneas de células T específicas para Chlamydia. Las líneas de células T de los donantes CT-1, CT-3 CT-10 se generaron estimulando los PBMC's con cuerpos reticulados de C. trachomatis serovar E. Las líneas de células T del donante CT-11 se generó estimulando los PBMC's tanto con cuerpos reticulados como con cuerpos elementales de C. trachomatis serovar E. Se construyó un banco genómico preparado al azar de C. trachomatis serovar E en un vector lambda Zap II y un banco amplificado plaqueado en platos de microtítulo de 96 pocillos a una densidad de 25 clones/pocillo. Las bacterias se indujeron para expresar la proteína recombinante en presencia de 2 mM IPTG durante 2horas, luego, se plaqueó y resuspendió en 200ul RPMI/10% FBS. 10 \mul de la suspensión bacteriana inducida se transfirió a platos de 96 pocillos que contenían células dendríticas derivadas de monocitos autólogos. Tras 2 horas de incubación, las células dendríticas se lavaron para eliminar E. coli y se añadieron las células T. Se identificó un conjunto de E. coli determinando la producción de IFN gamma y la proliferación de células T en los conjuntos. El número de conjuntos identificados en cada línea de células T es el siguiente: línea CT1: conjuntos 30/480; línea CT3: conjuntos 91/960; línea CT10: conjuntos 40/480; línea CT11: conjuntos 51/480. Los clones identificados utilizando este enfoque se exponen en la SEQ ID NO: 1-14.
En otro ejemplo que utiliza sustancialmente el mismo enfoque arriba descrito, identificamos 12 clones célula T reactivos adicionales del escrutinio de expresión de Chlamydia trachomatis serovar E. El Clon E5-E9-3 (CT1 positivo) contiene un inserto de 636 pares de bases que codifica de forma parcial el ORF para el gen de tipo dnaK. Parte de esta secuencia también se identificó en el clon E1-A5-53. El Clon E4-H3-56 (CT1 positivo, inserto de 463 pares de bases) contiene un ORF parcial para el gen TSA (CT603) en la hebra complementaria El inserto para el Clon E2-G12-52 (1265 pares de bases) se identificó con la línea CT11. Éste contiene un ORF parcial para clpB, una proteasa ATPasa. Otro clon identificado con la línea CT11, E1-F9-79 (167 pares de bases), contiene un ORF parcial para el gen CT133 en la hebra complementaria. CT133 es una rRNA metilasa predicha. El Clon E4-D2-79 (CT3 positivo) contiene un inserto de 1181 pares de bases que es un ORF parcial para el gen nrdA. El ORF para este gen también se identificó en le clon E2-B10-52 (CT10 positivo). El Clon E6-C8-95 contiene un inserto de 731 pares de bases que se identificó utilizando las líneas de los donantes CT3, CT1, y CT12. Este inserto tiene una mitad carboxi-terminal para el gen para el ORF de 60 kDa. El Clon E7-H11-61 (CT3 positivo de 1135 pares de bases) tiene insertos parciales para fliA (CT061), tyrS (CT062), TSA (CT603) y una proteína hipotética (CT602). El inserto para el clon E5-A11-8 (CT10 positivo de 1736 pares de bases) contiene el ORF completo para groES (CT111) y una mayoría del ORF para groEL (CT110). El Clon E3-F2-37 (CT10, CT3, CT11, y CT12 positivo-inserto de 1377pares de bases) contiene un ORF parcial para el gen tRNA-Trp (CT322) y un ORF completo para el gen secE (CT321). E4-G9-75 es otro clon de CT10 que contiene un ORF parcial (inserto de 723 pares de bases) para la región amino-terminal del gen pmpH (CT872). El Clon E2-D5-89 (516pares de bases) también es un clon CT10 positivo que contiene un ORF parcial para el gen pmpD (12). El inserto para el clon E5-E2-10 (CT10 positivo)tiene427 pares de bases y contiene un ORF parcial para la proteína principal de membrana externa omp1.
Ejemplo 2 Clonaje adicional de la expresión de célula T CD4 para la identificación de antígenos estimulantes de célula T de Chlamydia trachomatis serovar E
Se aislaron veinte secuencias a partir de clones individuales utilizando un método de escrutinio de bancos de expresión de Chlamydia trachomatis serovar E (Ct E). Las descripciones de cómo se han generado los clones y líneas están en el Ejemplo 1.
Se encontró que el Clon E5-A8-85 (identificado usando la línea del paciente CT1) contiene un inserto de 1433pares de bases. Este inserto contiene una gran región de la mitad C-terminal del CT875, un gen hipotético específico de Chlamydia trachomatis que se describe en SEQ ID NO:34. También está presente en el clon un marco de lectura abierto parcial (ORF) de la proteína hipotética CT001, que está en la hebra complementaria.
El clon E9-G2-93 (identificado usando la línea del paciente C10) mostró que contiene un inserto de 554 pares de bases, cuya secuencia está revelada en SEQ ID NO:33. Esta secuencia codifica un ORF parcial para CT178, una proteína CT hipotética.
El Clon E7-B1-16 (identificado usando las líneas de los pacientes CT10, CT3, CT5, CT11, CT13, y CHH037) tiene un inserto de 2577 pares de bases, cuya secuencia se describe en SEQ ID NO:32. Se encontró que este clon contiene tres ORFs. El primer ORF contiene casi todo el ORF para CT694, una proteína hipotética específica de Chlamydia trachomatis (CT). El segundo ORF es un ORF de longitud completa para CT695, otra proteína CT hipotética. El tercer ORGF es una porción N-terminal de CT696.
El Clon E9-D5-8 (identificado usando las líneas de los pacientes CT10, CT1, CT4, y CT11) contiene un inserto de 393 pares de bases, que se describe en SEQ ID NO:31. Se encontró que codifica un ORF parcial para CT680, la proteína ribosomal s2.
El Clon E9-E10-51 (identificado usando la línea del paciente CT10) contiene un inserto de 883 pares de bases, cuya secuencia se describe en SEQ ID NO:30. Este clon contiene dos ORF parciales. El primero de estos es para la mitad C-terminal de CT680, el cual puede mostrar algún solapamiento con el inserto presente en el clon E9-D5-8. El segundo ORF es el N-terminal del ORF parcial para CT679, que es el factor de elongación TS.
El Clon E3-B4-18 (identificado usando la línea del paciente CT1) contiene un inserto de 1224 pares de bases, cuya secuencia se describe en SEQ ID NO:29. Este clon contiene 4 ORFs. En el extremo N-terminal del clon está el ORF completo para CT772, que codifica para pirofosfato inorgánico. El segundo ORF es una pequeña porción del extremo C-terminal de CT771, en el marco complementario. El tercero, es un ORF parcial de la proteína hipotética CT191 y el cuarto es un ORF parcial para CT90, ADN girasa-B.
El Clon E10-B2-57 (identificado usando la línea del paciente CT10) contiene un inserto de 822 pares de bases, cuya secuencia se describe en SEQ ID NO:42. Este clon contiene el ORF completo para CT066, una proteína hipotética, en la hebra complementaria.
El Clon E3-F3-18 (identificado usando la línea del paciente CT1) contiene un inserto de 1141 pares de bases, cuya secuencia se describe en SEQ ID NO:41. Este contiene un ORF parcial para pmpG (CT871) en marco con el gen \beta-gal.
El Clon E4-D6-21 (identificado usando la línea del paciente CT3) contiene un inserto de 1297 pares de bases, cuya secuencia se describe en SEQ ID NO:40. Este clon contiene una porción muy pequeña de xseA (CT329), el ORF completo para tpiS (CT328) en la hebra complementaria, y un ORF parcial amino-terminal para trpC (CT327) en el marco cabeza.
El Clon E1-G9-23 (identificado usando la línea del paciente CT3) contiene un inserto de 1180 pares de bases, cuya secuencia se describe en SEQ ID NO:39. Este clon contiene casi la totalidad del ORF para la glucógeno sintasa (CT798).
El Clon E3-A3-31 (identificado usando la línea del paciente CT1) contiene un inserto de 1834 pares de bases, cuya secuencia se describe en SEQ ID NO:38. Este clon contiene una gran región del gen hipotético CT622.
El Clon E2-F7-11 (identificado usando las líneas de los pacientes CT3 y CT10) contiene un inserto de 2093 pares de bases, cuya secuencia se describe en SEQ ID NO:37. Este clon contiene una gran región del gen rpoN (CT609) en marco con \beta-gal y el ORF completo para el gen hipotético CT610 en la hebra complementaria. Además, también contiene el extremo carboxi-terminal de CT611, otro gen hipotético.
El Clon E7-H11-10 (identificado usando la línea del paciente CT3) contiene un inserto de 1990 pares de bases, cuya secuencia se describe en SEQ ID NO:36. Este clon contiene el ORF parcial amino-terminal para CT610, un ORF completo para CT611, otro ORF completo para CT612, y una porción carboxi-terminal de CT613. Todos estos genes son hipotéticos y todos están presentes en la hebra complementaria
El Clon E10-C6-45 (identificado usando la línea del paciente CT3) contiene un inserto de 196 pares de bases, cuya secuencia se describe en SEQ ID NO:35. Este clon contiene un ORF parcial para nrdA (CT827) en marco con el gen \beta-gal. Este clon contiene un inserto relativamente pequeño y tiene particular utilidad en la determinación del epítopo de este gen, que contribuye a la inmunogenicidad de Serovar E.
El Clon E3-H6-10 (identificado usando la línea del paciente CT12) contiene un inserto de 3734 pares de bases, cuya secuencia se describe en SEQ ID NO:48. Este clon contiene ORFs para una serie de proteínas hipotéticas. Este contiene los ORFs parciales para CT223 y CT229 y los ORFs completos para CT224, CT225, CT226, CT227, y CT228.
El Clon E4-C3-40 (identificado usando la línea del paciente CT10) contiene un inserto de 2044 pares de bases, cuya secuencia se describe en SEQ ID NO:47. Este clon contiene un ORF parcial para nrdA (CT827) y el ORF completo para nrdB (CT828).
El Clon E2-D8-19 (identificado usando la línea del paciente CT1) contiene un inserto de 2010 pares de bases, cuya secuencia se describe en SEQ ID NO:46. Este clon contiene ORF del plásmido de Chlamydia trachomatis, así como ORFs parciales para ORF3 y ORF6, y ORFs completos para ORF4 y ORF5.
El Clon E3-D10-46 (identificado usando las líneas de los pacientes CT1, CT3, CT4, CT11, y CT12) contiene un inserto de 1666 pares de bases, cuya secuencia se describe en SEQ ID NO: 45. Este clon contiene un ORF parcial para CT770 (fab F), un ORF completo para CT771 (homólogo de hidrolasa/fosfatasa), un ORF completo para CT772 (ppa, fosfatasa inorgánica), y un ORF parcial para CT773 (Idh, Leucina deshidrogenasa).
El Clon E10-H8-1 (identificado usando las líneas de los pacientes CT3 y CT10) contiene un inserto de 1862 pares de bases, cuya secuencia se describe en SEQ ID NO:44. Este contiene los ORFs parciales para CT871 (pmpG) así como para CT872 (pmpH).
El Clon E3-F3-7 (identificado usando la línea del paciente CT1) contiene un inserto de 1643 pares de bases, cuya secuencia está identificada en SEQ ID NO:43. Este contiene ORFs parciales para CT869 (pmpE) y CT870 (pmpF).
Ejemplo 3 Clonaje adicional de la expresión de célula T CD4 para la identificación de antígenos estimulantes de célula T de Chlamydia trachomatis serovar E
La línea de célula T Se generó a partir de una mujer sana de 22 años seronegativa para Chlamydia. Esta línea se utilizó para escrutar el banco de Chlamydia trachomatis serovar E library. Se identificaron diecinueve clones a partir de este rastreo, tal como se describe abajo.
El Clon E7-B12-65, contiene un inserto de 1179 pares de bases, cuya secuencia se describe en SEQ ID NO:114. Este contiene el ORF completo del gen para la Malato deshidrogenasa (CT376) en la hebra complementaria.
El Clon E4-H9-83, contiene un inserto de 772 pares de bases, cuya secuencia está identificada en SEQ ID NO:115. Este contiene el ORF parcial para la proteína de choque térmico GroEL(CT110).
El Clon E9-B10-52, contiene un inserto de 487 pares de bases, cuya secuencia está identificada en SEQ ID NO:116. Este contiene un ORF parcial para el gen yscC (CT674), una proteína de ruta de secreción general.
El Clon E7-A7-79, contiene un inserto de 1014 pares de bases, cuya secuencia se describe en SEQ ID NO:117. Este contiene el ORF completo para el gen de desarrollo de tipo histona, hctA (CT743) y una ORF parcial para el gen ygcA de la ARNr metiltransferasa (CT742).
El Clon E2-D11-18, contiene un inserto de 287 pares de bases, cuya secuencia se describe en SEQ ID NO:118. Este contiene el ORF parcial para hctA (CT743).
El Clon E9-H6-15, identificado usando la línea CT13, contiene un inserto de 713 pares de bases, cuya secuencia se describe en SEQ ID NO:125. Este contiene el ORF parcial del gen pmpB (CT413).
El Clon E3-D10-87, identificado usando la línea CT1, contiene un inserto de 780 pares de bases, cuya secuencia se describe en SEQ ID NO:126. Este contiene el ORF parcial para CT388, un gen hipotético, en la hebra complementaria, y un ORF parcial para CT389, otra proteína hipotética.
El Clon E9-D6-43, identificado usando la línea CT13, contiene un inserto de 433 pares de bases, cuya secuencia se describe en SEQ ID NO:127. Este contiene un ORF parcial para CT858.
El Clon E3-D10-4, identificado usando la línea CT1, contiene un inserto de 803 pares de bases, cuya secuencia se describe en SEQ ID NO:128. Este contiene un ORF parcial para pGP3-D, un ORF codificado en el plásmido pCHL1.
El Clon E3-G8-7, identificado usando la línea CT1, contiene un inserto de 842 pares de bases, cuya secuencia se describe en SEQ ID NO:129. Este contiene ORFs parciales para CT557 (Lpda) y CT558 (LipA).
El Clon E3-F11-32, identificado usando la línea CT1, contiene un inserto de 813 pares de bases, cuya secuencia se describe en SEQ ID NO:130. Este contiene un ORF parcial para pmpD(CT812).
El Clon E2-F8-5, identificado usando la línea CT12, contiene un inserto de 1947pares de bases, cuya secuencia se describe en SEQ ID NO:131.Este contiene un ORF completo para el ORF de 15 kDa (CT442) y un ORF parcial para el ORF de 60 kDa (CT443).
El Clon E2-G4-39, identificado usando la línea CT12, contiene un inserto de 1278 pares de bases, cuya secuencia se describe en SEQ ID NO:132. Este contiene el ORF parcial del ORF de 60 kDa (CT443).
El Clon E9-D1-16, identificado usando la línea CT10, contiene un inserto de 916 pares de bases, cuya secuencia se describe en SEQ ID NO:133. Este contiene el ORF parcial para pmpH (CT872).
El Clon E3-F3-6, identificado usando la línea CT1, contiene un inserto de 751 pares de bases, cuya secuencia se describe en SEQ ID NO:134. Este contiene los ORFs parciales, todos ellos en la hebra complementaria, para los genes accB (CT123), L13 ribosomal (CT125), y S9 ribosomal (CT126).
El Clon E2-D4-70, identificado usando la línea CT12, contiene un inserto de 410 pares de bases, cuya secuencia se describe en SEQ ID NO:135. Este contiene el ORF parcial para el gen pmpC (CT414).
El Clon E5-A1-79, identificado usando la línea CT1, contiene un inserto de 2719 pares de bases, cuya secuencia se describe en SEQ ID NO:136. Este contiene un ORF parcial para ydhO (CT127), un ORf completo para el gen S9 ribosomal (CT126 en la hebra complementaria), un ORF completo para el gen L13 ribosomal (CT125 en la hebra complementaria) y un ORF parcial para accC (CT124 en la hebra complementaria).
El Clon E1-F7-16, identificado usando las líneas CT12, CT3, y CT11, contiene un inserto de 2354 pares de bases, cuya secuencia se describe en SEQ ID NO:137. Este contiene un ORF parcial del gen ftsH (CT841) y el ORF completo para el gen pnp (CT842) en la hebra complementaria.
El Clon E1-D8-62, identificado usando la línea CT12, contiene un inserto de 898 pares de bases, cuya secuencia se describe en SEQ ID NO:138. Este contiene ORFs parciales para el gen ftsH (CT841) y para el gen pnp (CT842).
Ejemplo 4 Expresión de proteínas recombinantes de Chlamydia tracomatis
Se clonaron varios genes específicos de Chlamydia trachomatis serovar E dentro de pET17b. Este plásmido incorpora una etiqueta 6X histidina en N-terminal para permitir la expresión y purificación de proteína recombinante.
Se expresaron en E. coli dos proteínas recombinantes de longitud completa, CT622 y CT875. Ambos genes se identificaron usando el rastreo de expresión de CtLGVII, pero se expresaron los homólogos del serovar E. Los cebadores utilizados para amplificar estos genes estaban basados en secuencias de serovar D. Estos genes se amplificaron usando ADN genómico de serovar E como plantilla. Una vez amplificados, los fragmentos se clonaron en pET-17b con una etiqueta 6X-His N-terminal. Tras transformar el plásmido recombinante en células XL-I blue, se preparó el ADN y se secuenciaron totalmente los clones. Luego, el ADN se transformó dentro de las células hospedadoras de expresión BL21-pLysS (Novagen) para la producción de proteínas recombinantes. Las proteínas se indujeron con IPTG y purificaron en agarosa Ni-NTA, usando métodos clásicos. Las secuencias de ADN para CTE622 y CTE875 se describen en SEQ ID NO:28 y 27 respectivamente, y sus secuencias de aminoácidos se describen en SEQ ID NO: 139 y 140, respectivamente.
Se clonaron genes de Chlamydia trachomatis adicionales. La proteína específica de Chlamydia trachomatis CT694, la proteína CT695, y la proteína L1 ribosomal, cuyas secuencias de ADN se describen en SEQ ID NO: 119, 120 y 121 respectivamente. Las secuencias proteicas de estas proteínas recombinantes de 6X-histidina se describen en SEQ ID NO: 122 (CT694), 123 (CT695), y 124 (proteína L1 ribosomal). También se clonaron los genes CT875 y CT622, de serovar E, usando pET17b como proteínas de fusión 6X-His. Estas proteínas recombinantes se expresaron y purificaron y sus secuencias aminoacídicas están reveladas en SEQ ID NO:140 y 139, respectivamente.
Ejemplo 5 Antígenos recombinantes de Chlamydia reconocidos por líneas de célula T
Se generaron líneas de células T de paciente a partir de los siguientes donantes: CT1, CT2, CT3, CT4, CT5, CT6, CT7, CT8, CT9, CT10, CT11, CT12, CT13, CT14, CT15, y CT16. Se incluye un resumen de sus detalles en la Tabla II.
2
Se completaron las PBMC a partir de una segunda serie de donantes y se han generado líneas de células T a partir de un sub-grupo de éstos. En la tabla de abajo se enumera un resumen de los detalles para tras líneas de células T.
4
El donante CHH011 es una mujer de 49 años donante sana sero-negativa para C. trachomatis. PBMC produjeron altas cantidades de IFN-gamma en respuesta a anticuerpos básicos de C. trachomatis al compararlos con anticuerpos básicos de C. pneumoniae, indicando una respuesta específica de C. trachomatis. El donante CHH037 es una mujer de 22 años donante sana sero-negativa para C. trachomatis. PBMC produjeron altas cantidades de IFN-gamma en respuesta a anticuerpos básicos de C. trachomatis al compararlos con anticuerpos básicos de C. pneumoniae, indicando una respuesta específica de C. trachomatis. CHH042 es una mujer de 25 años donante sana con un título de IgG de 1:16 para C. pneumoniae. PBMC produjeron altas cantidades de IFN-gamma en respuesta a anticuerpos básicos de C. trachomatis al compararlos con anticuerpos básicos de C. pneumoniae, indicando una respuesta específica de C. trachomatis.
Tal como se describe arriba, se generaron proteínas recombinantes para varios genes de Chlamydia trachomatis. Las secuencias para MOMP derivaban de serovar F. Los genes CT875, CT622, pmp-B-2, pmpA, y CT529 derivaban de serovar E y las secuencias de los genes gro-EL, Swib, pmpD, pmpG, TSA, CT610, pmpC, pmpE, S13, lpdA, pmpI, y pmpH-C derivaban de LII.
Se examinaron algunas líneas de los pacientes y donantes descritos arriba frente a la proteína recombinante de Chlamydia. La tabla IV resume los resultados de las respuestas de célula T a las proteínas recombinantes de Chlamydia.
5
6
Aunque la presente invención ha sido descrita en algún detalle en forma de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, se pueden realizar cambios y modificaciones sin apartarse del alcance de la invención, la cual tiene la intención de estar limitada sólo por el alcance de las reivindicaciones añadidas.
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<110> Corixa Corporation
\hskip1cm
Bhatia, Ajay 
\hskip1cm
Probst, Peter 
\hskip1cm
Stromberg, Erika Jean 
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<120> COMPUESTOS Y MÉTODOS PARA EL TRATAMIENTO Y DIAGNÓSTICO DE INFECCIÓN POR
CHLAMYDIA.
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<130> 210121.515PC
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<140> PCT
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<141> 2001-04-23
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<160> 140
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<210> 1
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<211> 1311
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<212> ADN
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<400> 1
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7 
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
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8 
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<210> 3
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 3
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9 
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<211> 1094
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 4
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10 
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<210> 5
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<211> 2129
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 5
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11
12 
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<211> 1828
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
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13 
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<210> 7
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<211> 861
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
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14 
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<211> 763
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
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15 
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
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16 
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<210> 10
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<211> 843
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 10
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17 
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<210> 11
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<211> 1474
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 11
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18 
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<210> 12
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<211> 2017
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 12
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19
20 
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<210> 13
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<211> 1171
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 13
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21 
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<210> 14
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<211> 877
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 14
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22 
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<210> 15
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<211> 396
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis serovar E
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<400> 15
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23 
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<210> 16
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<211> 516
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis serovar E
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<400> 16
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24 
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<210> 17
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<211> 723
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis serovar E
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<400> 17
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25 
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<210> 18
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<211> 1377
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis serovar E
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<400> 18
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<210> 19
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<211> 1736
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis serovar E
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<400> 19
27 
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<210> 20
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<211> 1135
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis serovar E
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<400> 20
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28 
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<210> 21
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<211> 731
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis serovar E
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<400> 21
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29 
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<211> 1181
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis serovar E
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<210> 23
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis serovar E
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<400> 23
31 
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<213> Chlamydia trachomatis serovar D
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 103
\vskip1.000000\baselineskip
93 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Proteína
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis serovar D
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 104
\vskip1.000000\baselineskip
94 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 379
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Proteína
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis serovar D
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 105
\vskip1.000000\baselineskip
95 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 563
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Proteína
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis serovar D
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 106
96
97 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 358
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Proteína
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis serovar D
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 107
98
980 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 267
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Proteína
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis serovar D
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 108
\vskip1.000000\baselineskip
99 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 867
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Proteína
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis serovar D
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 109
100
102 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1179
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 114
103 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 772
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 115
104 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 487
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 116
105
106 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 117
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1014
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 117
107 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 287
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 118
108 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1002
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 119
109
1090 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 120
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1218
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 120
110 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 121
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 726
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 121
111 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 122
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 330
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Proteína
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 122
\vskip1.000000\baselineskip
112
113 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 123
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 405
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Proteína
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 123
114 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 124
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 238
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Proteína
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 124
115 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 125
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 713
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 125
116 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 126
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 780
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 126
\vskip1.000000\baselineskip
117 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 127
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 433
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 127
\vskip1.000000\baselineskip
118 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 128
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 803
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 128
\vskip1.000000\baselineskip
119 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 842
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 129
\vskip1.000000\baselineskip
120 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 130
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 813
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 130
\vskip1.000000\baselineskip
121 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 131
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1947
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 131
\vskip1.000000\baselineskip
122 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1278
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 132
\vskip1.000000\baselineskip
123 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 133
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 916
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 133
\vskip1.000000\baselineskip
124 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 134
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 751
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica variada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(751)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C ó G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 134
\vskip1.000000\baselineskip
125 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 135
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 410
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 135
\vskip1.000000\baselineskip
126 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 136
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2719
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 136
\vskip1.000000\baselineskip
127 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 137
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2354
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 137
\vskip1.000000\baselineskip
128 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 138
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 898
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 138
\vskip1.000000\baselineskip
129 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 139
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 660
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Proteína
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 139
\vskip1.000000\baselineskip
130
131 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 140
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 598
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Proteína
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 140
133
134

Claims (19)

1. Una composición que comprende:
(a)
un polipéptido que comprende:
(i)
la secuencia de aminoácidos de restos 8 a 660 de la Seq ID No:139, o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con ella, determinada comparando las dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación de restos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139; o
(ii)
una porción inmunogénica de los restos aminoacídicos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139 que tiene, al menos, 15 aminoácidos de longitud; o
(b)
un polinucleótido que codifica el polipéptido de (a);
para uso en la diagnosis, tratamiento o prevención de infección por clamidia.
2. Una composición según la reivindicación 1, que comprende un polipéptido que comprende:
(i)
la secuencia de aminoácidos de restos 8 a 660 de la Seq ID No:139, o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con ella, determinada comparando las dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación de restos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139; o
(ii)
una porción inmunogénica de restos aminoacídicos 8 a 660 de secuencia de Seq ID No:139, que tiene, al menos, 15 aminoácidos de longitud.
3. Una composición según la reivindicación 2, que comprende un polipéptido que consiste en:
(i)
la secuencia de aminoácidos de restos 8 a 660 de Seq ID No:139, o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con ella, determinada comparando las dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación de restos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139; o
(ii)
una porción inmunogénica de restos aminoacídicos 8 a 660 de secuencia de Seq ID No:139, que tiene, al menos, 15 aminoácidos de longitud.
4. Una composición según cualquiera de la reivindicación 2 o la reivindicación 3, donde el polipéptido comprende la secuencia aminoacídica de restos 8 a 660 de Seq ID No:139, o una variante de la misma que tiene, al menos, 90% de identidad de secuencia con ella, determinada comparando las dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación de restos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139.
5. Una composición según la reivindicación 4, donde el polipéptido comprende la secuencia aminoacídica de restos 8 a 660 de Seq ID No:139, o una variante de la misma que tiene, al menos, 95% de identidad de secuencia con ella, determinada comparando las dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación de restos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139.
6. Una composición según la reivindicación 5, donde el polipéptido comprende la secuencia aminoacídica de restos 8 a 660 de Seq ID No:139.
7. Una composición según la reivindicación 6, donde el polipéptido comprende la secuencia aminoacídica de Seq ID No:139.
8. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, donde el polipéptido comprende una porción inmunogénica de los restos aminoacídicos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139 que tiene, al menos, 15 aminoácidos de longitud.
9. Una composición según la reivindicación 8, donde la porción inmunogénica tiene, al menos, 20 aminoácidos de longitud.
10. Una composición según la reivindicación 1, que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de restos 8 a 660 de Seq ID No:139, o una variante de la misma que tiene, al menos, 90% de identidad de secuencia con ella, determinada comparando las dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación de restos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139.
11. Una composición según la reivindicación 10, que comprende un polinucleótido que tiene la secuencia de Seq ID No:28.
12. Una composición según la reivindicación 1, que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una porción inmunogénica de los restos aminoacídicos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139 que tiene, al menos, 15 aminoácidos de longitud.
13. Una composición según la reivindicación 1, donde el polipéptido de (a) es una proteína de fusión.
14. Una composición farmacéutica que comprende una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y un vehículo fisiológicamente aceptable.
15. Una vacuna que comprende una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y un inmunoestimulante.
16. Una vacuna según la reivindicación 15 donde el inmunoestimulante es un adyuvante.
17. Uso de:
(a)
un polipéptido que comprende:
(i)
la secuencia de aminoácidos de restos 8 a 660 de la Seq ID No:139, o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con ella, determinada comparando las dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación de restos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139; o
(ii)
una porción inmunogénica de restos aminoacídicos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139 que tiene, al menos, 15 aminoácidos de longitud; o
(b)
un polinucleótido que codifica el polipéptido de (a);
en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o de infección por Chlamydia.
18. Uso de:
(a)
un polipéptido que comprende:
(i)
la secuencia de aminoácidos de restos 8 a 660 de la Seq ID No:139, o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con ella, determinada comparando las dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación de restos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139; o
(ii)
una porción inmunogénica de restos aminoacídicos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139 que tiene, al menos, 15 aminoácidos de longitud; o
(b)
un polinucleótido que codifica el polipéptido de (a);
en la detección de infección por Chlamydia en un paciente.
19. Uso de:
(a)
un polipéptido que comprende:
(i)
la secuencia de aminoácidos de restos 8 a 660 de la Seq ID No:139, o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con ella, determinada comparando las dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación de restos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139; o
(ii)
una porción inmunogénica de restos aminoacídicos 8 a 660 de la secuencia de Seq ID No:139 que tiene, al menos, 15 aminoácidos de longitud; o
(b)
un polinucleótido que codifica el polipéptido de (a);
en la fabricación de un kit de diagnóstico para la detección de infección por Chlamydia en un paciente.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5629167A (en) * 1994-04-19 1997-05-13 Biocine S.P.A. Detection of antibodies against Chlamydia trachomatis pgp3 antigen in patient sera by enzyme-linked immunosorbent assay
EP1105489A1 (en) 1998-08-20 2001-06-13 Aventis Pasteur Limited Nucleic acid molecules encoding pomp91a protein of chlamydia
CA2340330A1 (en) 1998-08-20 2000-03-02 Aventis Pasteur Limited Nucleic acid molecules encoding inclusion membrane protein c of chlamydia
US6686339B1 (en) 1998-08-20 2004-02-03 Aventis Pasteur Limited Nucleic acid molecules encoding inclusion membrane protein C of Chlamydia
US6649370B1 (en) 1998-10-28 2003-11-18 Aventis Pasteur Limited Chlamydia antigens and corresponding DNA fragments and uses thereof
US6607730B1 (en) 1998-11-02 2003-08-19 Aventis Pasteur Limited/Aventis Pasteur Limitee Chlamydia antigens and corresponding DNA fragments and uses thereof
WO2000032784A1 (en) 1998-12-01 2000-06-08 Aventis Pasteur Limited Chlamydia antigens and corresponding dna fragments and uses thereof
JP2002531129A (ja) 1998-12-08 2002-09-24 コリクサ コーポレイション クラミジア感染の処置および診断のための化合物および方法
US20080213264A1 (en) * 1998-12-08 2008-09-04 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
US20020061848A1 (en) 2000-07-20 2002-05-23 Ajay Bhatia Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
GB9828000D0 (en) 1998-12-18 1999-02-10 Chiron Spa Antigens
US7297341B1 (en) 1998-12-23 2007-11-20 Sanofi Pasteur Limited Chlamydia antigens and corresponding DNA fragments and uses thereof
JP2002541766A (ja) 1998-12-28 2002-12-10 アベンティス、パストゥール、リミテッド クラミジア抗原および対応するｄｎａ断片ならびにその使用
US6808713B1 (en) 1998-12-28 2004-10-26 Aventis Pasteur Limited Chlamydia antigens and corresponding DNA fragments and uses thereof
GB9902555D0 (en) 1999-02-05 1999-03-24 Neutec Pharma Plc Medicament
DE60041042D1 (de) 1999-03-12 2009-01-22 Aventis Pasteur Chlamydia antigene und deren korrespondierende dna fragmente und verwendungen davon
CA2373021A1 (en) 1999-05-03 2000-11-09 Aventis Pasteur Limited Chlamydia antigens and corresponding dna fragments and uses thereof
AU783547B2 (en) 1999-09-20 2005-11-10 Sanofi Pasteur Limited Chlamydia antigens and corresponding DNA fragments and uses thereof
US6632663B1 (en) 1999-09-22 2003-10-14 Aventis Pasteur Limited DNA immunization against chlamydia infection
ATE463575T1 (de) 1999-12-22 2010-04-15 Aventis Pasteur Chlamydia antigene, entsprechende dns fragmente und ihre verwendungen
EP1278855B1 (en) 2000-04-21 2008-03-12 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
US6919187B2 (en) * 2000-04-21 2005-07-19 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
DE60125350T2 (de) 2000-05-08 2007-07-12 Sanofi Pasteur Ltd., Toronto Chlamydia-antigene, entsprechende dns-fragmente und ihre verwendungen
ATE440861T1 (de) 2000-07-03 2009-09-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Immunisierung gegen chlamydia pneumoniae
NZ562929A (en) 2001-12-12 2009-07-31 Novartis Vaccines & Diagnostic Immunisation against chlamydia trachomatis
GB0203403D0 (en) 2002-02-13 2002-04-03 Chiron Spa Chlamydia cytotoxic-T cell epitopes
WO2004073492A2 (en) * 2003-02-14 2004-09-02 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Chlamydia pneumoniae associated chronic intraocular disorders and treatment thereof
US8541007B2 (en) 2005-03-31 2013-09-24 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccines against chlamydial infection
KR20070121814A (ko) 2005-03-31 2007-12-27 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 클라미디아 감염에 대비한 백신
WO2007082105A2 (en) * 2006-01-16 2007-07-19 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chlamydia vaccine
AU2008331800A1 (en) * 2007-12-03 2009-06-11 President And Fellows Of Harvard College Chlamydia antigens
CN107011415A (zh) 2008-10-20 2017-08-04 光州科学技术院 双齿肽结合物
JP2012519482A (ja) 2009-03-06 2012-08-30 ノバルティス アーゲー クラミジア抗原
US9458513B2 (en) * 2010-03-23 2016-10-04 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Primer and probe for detecting chlamydia trachomatis, and method for detecting chlamydia trachomatis using same
US8892184B2 (en) 2010-10-18 2014-11-18 Siemens Medical Solutions Usa, Inc. Systems and methods for reducing interference in a dual modality imaging system
KR20140088108A (ko) * 2011-09-30 2014-07-09 더 유니버시티 오브 브리티시 콜롬비아 클라미디아 항원 조성물 및 이의 용도

Family Cites Families (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4237224A (en) 1974-11-04 1980-12-02 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Process for producing biologically functional molecular chimeras
US4118469A (en) 1976-04-27 1978-10-03 Research Corporation Antigen for trachoma lymphogranuloma venereum (LGV) and non-gonococcal urethritis (NGU)
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
US4603112A (en) 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
US4497899A (en) 1982-04-12 1985-02-05 Abbott Laboratories Immunoassay for Chlamydia trachomatis antigens
US4436727A (en) 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
US4866034A (en) 1982-05-26 1989-09-12 Ribi Immunochem Research Inc. Refined detoxified endotoxin
US4883750A (en) 1984-12-13 1989-11-28 Applied Biosystems, Inc. Detection of specific sequences in nucleic acids
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
GB8508845D0 (en) 1985-04-04 1985-05-09 Hoffmann La Roche Vaccinia dna
US4777127A (en) 1985-09-30 1988-10-11 Labsystems Oy Human retrovirus-related products and methods of diagnosing and treating conditions associated with said retrovirus
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US4877611A (en) 1986-04-15 1989-10-31 Ribi Immunochem Research Inc. Vaccine containing tumor antigens and adjuvants
US5075109A (en) 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
GB8702816D0 (en) 1987-02-07 1987-03-11 Al Sumidaie A M K Obtaining retrovirus-containing fraction
AU622104B2 (en) 1987-03-11 1992-04-02 Sangtec Molecular Diagnostics Ab Method of assaying of nucleic acids, a reagent combination and kit therefore
IL86724A (en) 1987-06-19 1995-01-24 Siska Diagnostics Inc Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences
US4897268A (en) 1987-08-03 1990-01-30 Southern Research Institute Drug delivery system and method of making the same
WO1989001973A2 (en) 1987-09-02 1989-03-09 Applied Biotechnology, Inc. Recombinant pox virus for immunization against tumor-associated antigens
AU624601B2 (en) 1988-01-21 1992-06-18 Genentech Inc. Amplification and detection of nucleic acid sequences
CA1340807C (en) 1988-02-24 1999-11-02 Lawrence T. Malek Nucleic acid amplification process
AP129A (en) 1988-06-03 1991-04-17 Smithkline Biologicals S A Expression of retrovirus gag protein eukaryotic cells
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
EP0348725A3 (en) 1988-06-29 1990-10-24 Miles Inc. Species-specific epitode of chlamydia trachomatis and antibodies that recognize the same
US5869608A (en) * 1989-03-17 1999-02-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Nucleotide and amino acid sequences of the four variable domains of the major outer membrane proteins of Chlamydia trachomatis
CA2066053C (en) 1989-08-18 2001-12-11 Harry E. Gruber Recombinant retroviruses delivering vector constructs to target cells
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
KR920007887B1 (ko) 1989-08-29 1992-09-18 스즈키 지도오샤 고오교오 가부시키가이샤 내연기관의 배기가스 정화장치
US5616326A (en) 1990-01-25 1997-04-01 The University Court Of The University Of Glasgow Recombinant canine adenovirus 2 (CAV-2)
US5166053A (en) 1990-02-23 1992-11-24 Miles Inc. Specimen adequacy control for chlamydia assays
JP3018553B2 (ja) 1990-05-08 2000-03-13 日立化成工業株式会社 クラミジア・トラコマティス抗体測定方法及びクラミジア・トラコマティス感染症診断用製剤
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
US5725863A (en) 1991-09-06 1998-03-10 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Polypeptides useful in prevention of chlamydia infection
US5518913A (en) 1991-10-10 1996-05-21 National Research Council Of Canada High level recombinant protein production using conditional helper-free adenovirus vector
ATE188613T1 (de) 1992-06-25 2000-01-15 Smithkline Beecham Biolog Adjuvantien enthaltende impfstoffzusammensetzung
CA2144882A1 (en) 1992-09-18 1994-03-31 Harlan D. Caldwell Synthetic peptide vaccine for chlamydia trachomatis
FR2702160B1 (fr) 1993-03-02 1995-06-02 Biovecteurs As Vecteurs particulaires synthétiques et procédé de préparation.
FR2704145B1 (fr) 1993-04-21 1995-07-21 Pasteur Institut Vecteur particulaire et composition pharmaceutique le contenant.
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
EP1167379A3 (en) 1994-07-15 2004-09-08 University Of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
FR2723849B1 (fr) 1994-08-31 1997-04-11 Biovector Therapeutics Sa Procede pour augmenter l'immunogenicite, produit obtenu et composition pharmaceutique
ES2321346T3 (es) 1994-09-20 2009-06-04 Hitachi Chemical Co., Ltd. Polinucleotidos que codifican un polipeptido antigenico de chlamydia pneumoniae.
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
WO1996038591A1 (en) 1995-06-02 1996-12-05 Incyte Pharmaceuticals, Inc. IMPROVED METHOD FOR OBTAINING FULL-LENGTH cDNA SEQUENCES
US5698202A (en) 1995-06-05 1997-12-16 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a rabies vaccine carrier
GB9516293D0 (en) 1995-08-09 1995-10-11 Immunova Ltee Novel peptides and their use as vaccines
BR9712971A (pt) 1996-07-12 2002-05-07 Univ Manitoba Método para produção de uma vacina para proteção de um hospedeiro contra doença causada com uma cadeia de chlamydia e composição imunológica
US6464979B1 (en) 1996-09-12 2002-10-15 Aventis Pasteur Limited Chlamydial vaccines and methods of preparation thereof
US7459524B1 (en) 1997-10-02 2008-12-02 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. Chlamydia protein, sequence and uses thereof
ATE352624T1 (de) 1997-11-21 2007-02-15 Serono Genetics Inst Sa Chlamydia pneumoniae genomische sequenzen und polypeptiden, fragmenten und anwendungen davon für nachweis, prevention und heilung
EP2218731A1 (en) 1997-11-28 2010-08-18 Merck Serono Biodevelopment Chlamydia trachomatis genomic sequence and polypeptides, fragments thereof and uses thereof, in particular for the diagnosis, prevention and treatment of infection
GB9727262D0 (en) 1997-12-24 1998-02-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
AU753995B2 (en) 1998-04-07 2002-10-31 Corixa Corporation Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses
CA2350775A1 (en) 1998-11-12 2000-05-18 The Regents Of The University Of California Chlamydia pneumoniae genome sequence
JP2002531129A (ja) 1998-12-08 2002-09-24 コリクサ コーポレイション クラミジア感染の処置および診断のための化合物および方法
US6565856B1 (en) * 1998-12-08 2003-05-20 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
US6166177A (en) 1998-12-08 2000-12-26 Corixa Corporation Compounds and methods for the treatment and diagnosis of chlamydial infection
US6448234B1 (en) 1998-12-08 2002-09-10 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
US6432916B1 (en) * 1998-12-08 2002-08-13 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
US20020061848A1 (en) 2000-07-20 2002-05-23 Ajay Bhatia Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
GB9828000D0 (en) 1998-12-18 1999-02-10 Chiron Spa Antigens
GB9902555D0 (en) 1999-02-05 1999-03-24 Neutec Pharma Plc Medicament
CA2373021A1 (en) 1999-05-03 2000-11-09 Aventis Pasteur Limited Chlamydia antigens and corresponding dna fragments and uses thereof
AU783547B2 (en) 1999-09-20 2005-11-10 Sanofi Pasteur Limited Chlamydia antigens and corresponding DNA fragments and uses thereof
US6632663B1 (en) 1999-09-22 2003-10-14 Aventis Pasteur Limited DNA immunization against chlamydia infection
ATE463575T1 (de) 1999-12-22 2010-04-15 Aventis Pasteur Chlamydia antigene, entsprechende dns fragmente und ihre verwendungen
US7472098B2 (en) 2000-02-14 2008-12-30 Ubs Financial Services, Inc. System and method for execution of trades made pursuant to stock option and purchase plans
EP1278855B1 (en) 2000-04-21 2008-03-12 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
DE60125350T2 (de) 2000-05-08 2007-07-12 Sanofi Pasteur Ltd., Toronto Chlamydia-antigene, entsprechende dns-fragmente und ihre verwendungen
ATE440861T1 (de) 2000-07-03 2009-09-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Immunisierung gegen chlamydia pneumoniae
US8312249B1 (en) 2008-10-10 2012-11-13 Apple Inc. Dynamic trampoline and structured code generation in a signed code environment
FR2957821B1 (fr) 2010-03-24 2014-08-29 Inst Francais Du Petrole Nouvelle zone de regeneration du catalyseur divisee en secteurs pour unites catalytiques regeneratives

Also Published As

Publication number Publication date
CA2407114A1 (en) 2001-11-01
AU2001255596A1 (en) 2001-11-07
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ATE389020T1 (de) 2008-03-15
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DE60133190D1 (de) 2008-04-24
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EP2192128A2 (en) 2010-06-02
WO2001081379A2 (en) 2001-11-01
WO2001081379A3 (en) 2002-09-19
US7384638B2 (en) 2008-06-10
US20040137007A1 (en) 2004-07-15

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