ES2333579T3 - Proteinas de fusion de mycobacterium tuberculosis. - Google Patents

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Abstract

Un polipéptido de fusión que comprende (i) un antígeno MTB39 (SEC ID Nº 12 o 14), una variante de dicho antígeno MTB39 que tiene al menos un 90% de identidad con el mismo o un fragmento inmunogénico de dicho antígeno MTB39, y (ii) un antígeno MTB32A (SEC ID Nº 2 ó 4), una variante de dicho antígeno MTB32A que tiene al menos un 90% de identidad con el mismo o un fragmento inmunogénico de dicho antígeno MTB32A, caracterizado porque dicho antígeno MTB32A, variante o fragmento tiene una sustitución aminoacídica correspondiente a la posición 183 de la SEC ID Nº 4 o a la posición aminoacídica 208 de la SEC ID Nº 2, en la que el residuo de serina encontrado habitualmente en esta posición se ha reemplazado por otro aminoácido.

Description

Proteínas de fusión de Mycobacterium tuberculosis.
La presente invención se refiere a proteínas de fusión que contienen al menos dos antígenos de Mycobacterium sp. En particular, se refiere a ácidos nucleicos que codifican proteínas de fusión que incluyen dos o más antígenos individuales de M. tuberculosis que aumentan la sensibilidad serológica de los sueros de individuos infectados con tuberculosis, y a su uso en el diagnóstico, tratamiento y prevención de infección por tuberculosis.
Antecedentes de la invención
La tuberculosis es una enfermedad infecciosa crónica causada por infección con M. tuberculosis y otras especies de Mycobacterium. Es una enfermedad importante en los países en desarrollo, así como un problema creciente en las zonas desarrolladas del mundo, con aproximadamente 8 millones de casos nuevos y 3 millones de muertes cada año. Aunque la infección puede ser asintomática durante un periodo considerable de tiempo, la enfermedad se manifiesta lo más comúnmente como una inflamación aguda de los pulmones, dando como resultado fiebre y una tos improductiva. Si no se trata, da como resultado típicamente complicaciones graves y muerte.
Aunque la tuberculosis puede controlarse generalmente usando una terapia de antibióticos extendida, dicho tratamiento no es suficiente para prevenir la difusión de la enfermedad. Los individuos afectados pueden ser asintomáticos, pero contagiosos, durante algún tiempo. Además, aunque el cumplimiento del régimen de tratamiento es crítico, el comportamiento del paciente es difícil de monitorizar. Algunos pacientes no completan el curso del tratamiento, lo que puede conducir a un tratamiento ineficaz y al desarrollo de resistencia a fármacos.
Para controlar la difusión de la tuberculosis, la vacunación eficaz y el diagnóstico temprano exacto de la enfermedad son de la máxima importancia. Actualmente, la vacunación con bacterias vivas es el método más eficaz para inducir inmunidad protectora. La micobacteria más común empleada con este fin es el bacilo de Calmette-Guerin (BCG), una cepa avirulenta de M. bovis. Sin embargo, la seguridad y eficacia del BCG es fuente de controversia y algunos países, tales como los Estados Unidos, no vacunan al público general con este agente.
El diagnóstico de la tuberculosis se consigue comúnmente usando un ensayo cutáneo, que implica la exposición intradérmica a tuberculina DPP (derivado de proteína purificado). Las respuestas de linfocitos T específicas de antígeno dan como resultado una induración mensurable en el sitio de inyección durante 48-72 horas después de la inyección, que indica exposición a antígenos micobacterianos. Sin embargo, la sensibilidad y especificidad han sido problemáticos con este ensayo, y los individuos vacunados con BCG no pueden distinguirse de los individuos infectados.
Aunque se ha mostrado que los macrófagos actúan como los efectores principales de la inmunidad por Mycobacterium, los linfocitos T son los inductores predominantes de dicha inmunidad. El papel esencial de los linfocitos T en la protección frente a infección por Mycobacterium se ilustra por la frecuente aparición de infección por Mycobacterium en pacientes de SIDA, debido al agotamiento de linfocitos T CD4^{+} asociado a la infección por virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Se ha mostrado que los linfocitos T CD4^{+} reactivos con Mycobacterium son potentes productores de interferón \gamma (IFN-\gamma) que, a su vez, se ha mostrado que desencadena los efectos antimicobacterianos de los macrófagos en ratones. Aunque el papel del IFN-\gamma en seres humanos está menos claro, los estudios han mostrado que la 1,25-dihidroxivitamina D3, sola o en combinación con IFN-\gamma o factor alfa de necrosis tumoral, activa los macrófagos humanos para inhibir la infección por M. tuberculosis. Además, es conocido que el IFN-\gamma estimula a los macrófagos humanos a preparar 1,25-dihidroxivitamina D3. De forma similar, se ha mostrado que la interleucina-12 (IL-12) desempeña un papel en la estimulación de la resistencia a infección por M. tuberculosis. Para una revisión de la inmunología de infección por M. tuberculosis, véanse Chan y Kaufmann, "Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control" (Bloom ed., 1994) y "Harrison's Principles of Internal Medicine", volumen 1, pág. 1004-1014 y 1019-1023 (14ª ed., Fauci et al., eds., 1998).
En consecuencia, existe la necesidad de reactivos de diagnóstico mejorados y métodos mejorados para el diagnóstico, prevención y tratamiento de la tuberculosis.
Sumario de la invención
Por lo tanto, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión que comprende (i) un antígeno MTB39 (SEC ID Nº 12 ó 14), una variante de dicho antígeno MTB39 que tiene al menos un 90% de identidad con el mismo o un fragmento inmunogénico de dicho antígeno MTB39 y (ii) un antígeno MTB32A (SEC ID Nº 2 ó 4), una variante de dicho antígeno MTB32A que tiene al menos un 90% de identidad con el mismo o un fragmento inmunogénico de dicho antígeno MTB32A, caracterizado porque dicho antígeno MTB32A, variante o fragmento tiene una sustitución aminoacídica correspondiente a la posición 183 de la SEC ID Nº 4 o la posición aminoacídica 208 de la SEC ID Nº 2 en la que el residuo de serina encontrado habitualmente en esta posición se ha reemplazado por otro
aminoácido.
En una realización, la presente invención proporciona la proteína de fusión MTB72FMutSA, en la que el componente Ra35 de la proteína de fusión tiene una mutación de serina a alanina en la posición aminoacídica 710 de la secuencia de MTB72F. En otra realización, la presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión MTB72F, en la que el ácido nucleico que codifica el componente Ra35 se ha mutado, cambiando una T por una G, dando como resultado una mutación de serina a alanina en la posición aminoacídica 710 de la secuencia de MTB72F.
La presente invención está basada, en parte, en el descubrimiento por los inventores de que los polinucleótidos de fusión o polipéptidos de fusión que contienen al menos dos secuencias de codificación heterólogas de M. tuberculosis o antígenos son altamente antigénicos y, tras administración a un paciente, aumentan la sensibilidad a sueros de tuberculosis. Además, los polipéptidos y polinucleótidos de fusión son útiles como herramientas de diagnóstico en pacientes que pueden haberse infectado con Mycobacterium.
Los polipéptidos de fusión y ácidos nucleicos de la invención se usan en ensayos in vitro e in vivo para detectar anticuerpos humorales o inmunidad mediada por célula contra M. tuberculosis para el diagnóstico de infección o la monitorización de la progresión de la enfermedad. Por ejemplo, los polipéptidos pueden usarse como agente de diagnóstico in vivo en forma de un ensayo cutáneo intradérmico. Los polipéptidos pueden usarse también en ensayos in vitro tales como ELISA con suero de paciente. Como alternativa, los ácidos nucleicos y polipéptidos de fusión pueden usarse para crear anticuerpos anti-M. tuberculosis en un animal no humano. Los anticuerpos pueden usarse para detectar los antígenos diana in vivo e in vitro.
Los polipéptidos de fusión y ácidos nucleicos pueden usarse como inmunógenos para generar o provocar una respuesta inmunitaria protectora en un paciente. Se usan polinucleótidos aislados o purificados para producir antígenos de polipéptido recombinante de fusión in vitro, que se administran entonces en forma de vacuna. Como alternativa, los polinucleótidos pueden administrarse directamente a un sujeto en forma de vacunas de ADN para causar la expresión de antígeno en el sujeto y la posterior inducción de una respuesta inmunitaria anti-M. tuberculosis. Por tanto, los polipéptidos y ácidos nucleicos de M. tuberculosis aislados o purificados de la invención pueden formularse en forma de composiciones farmacéuticas para administración a un sujeto en la prevención y/o el tratamiento de infección por M. tuberculosis. La inmunogenicidad de la proteína de fusión o antígenos puede potenciarse mediante la inclusión de un coadyuvante, así como polipéptidos de fusión adicionales, de Mycobacterium u otros organismos, tales como polipéptidos bacterianos, víricos o de mamífero. Pueden incluirse también polipéptidos adicionales en las composiciones, ligados o no ligados al polipéptido de fusión.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra el porcentaje de supervivencia de conejillos de Indias vacunados con poliproteína MTB72F.
La Figura 2 muestra las UFC de células de bazo (Fig. 2A) y células pulmonares después de inmunización con MTB72F, MTB59F, ADN de MTB72F o una composición que comprende los antígenos Ra12, TbH9, y Ra35.
La Figura 3 muestra un diagrama esquemático de MTB72F.
La Figura 4 muestra la secuencia nucleotídica y aminoacídica de Ra35 (195 aminoácidos de la porción N-terminal de MTB32A).
La Figura 5 muestra un alineamiento de las secuencias aminoacídicas de MTB72F y la versión mutada
MTB72FMutSA.
La Figura 6 muestra un alineamiento de las secuencias aminoacídicas de Ra35/MTB32A madura (completa) y la versión mutada Ra35FLMutSA.
La Figura 7 muestra la supervivencia a largo plazo de conejillos de Indias vacunados con formulaciones de Mtb72F.
Descripción de realizaciones específicas
La presente invención se refiere a polipéptidos de fusión para el diagnóstico y el tratamiento de infección por Mycobacterium y a polinucleótidos que codifican dichos antígenos.
Los antígenos de la presente invención son polipéptidos de fusión de antígenos de Mycobacterium y fragmentos inmunogénicos de los mismos. Más específicamente, un polipéptido de fusión comprende (i) un antígeno MTB39 (SEC ID Nº 12 ó 14), una variante de dicho antígeno MTB39 que tiene al menos un 90% de identidad con el mismo o un fragmento inmunogénico de dicho antígeno MTB39 o variante, y (ii) un antígeno MTB32A (SEC ID Nº 2 ó 4), una variante de dicho antígeno MTB32A que tiene al menos un 90% de identidad con el mismo o un fragmento inmunogénico de dicho antígeno MTB32A o variante, caracterizado porque dicho antígeno MTB32A, variante o fragmento tiene una sustitución aminoacídica correspondiente a la posición 183 de la SEC ID Nº 4 o a la posición aminoacídica 208 de la SEC ID Nº 2, en la que el residuo de serina encontrado habitualmente en esta posición se ha reemplazado por otro aminoácido.
Estos polipéptidos de fusión y los ácidos nucleicos que los codifican son por lo tanto útiles para provocar una respuesta protectora en pacientes y para aplicaciones de diagnóstico.
Los antígenos de la presente invención pueden comprender adicionalmente otros componentes diseñados para potenciar la antigenicidad de los antígenos o para mejorar estos antígenos en otros aspectos, por ejemplo, el aislamiento de estos antígenos mediante la adición de una extensión de residuos de histidina a un extremo del antígeno. Los polipéptidos de fusión y ácidos nucleicos de la invención pueden comprender copias adicionales de antígenos o polipéptidos heterólogos adicionales de Mycobacterium sp., tales como antígeno MTB8.4, antígeno MTB9.8, antígeno MTB9.9, antígeno MTB40, antígeno MTB41, antígenos 38-1, TbRa3, 38 kDa, DPEP, TbH4, DPPD, antígeno ESAT-6, antígeno complejo MTB85 (por ejemplo, MTB85b) o antígeno \alpha cristalino y Erd14. Los polipéptidos de fusión y ácidos nucleicos de la invención pueden comprender también polipéptidos heterólogos adicionales de otras fuentes no Mycobacterium. Por ejemplo, las proteínas de fusión de la invención pueden incluir polipéptidos o ácidos nucleicos que codifican polipéptidos en los que el polipéptido potencia la expresión del antígeno, por ejemplo, NS 1, una proteína del virus de la gripe, o una porción inmunogénica de la misma (véanse, por ejemplo, los documentos WO99/4018 y WO93/04175). Los ácidos nucleicos de la invención pueden modificarse por ingeniería genética basándose en la preferencia de codón en la especie de elección, por ejemplo, seres humanos.
Las composiciones de la invención pueden ser ADN desnudo o las composiciones, por ejemplo polipéptidos, pueden comprender también coadyuvantes, por ejemplo, MPL, 3D-MPL, IFA, coadyuvantes AS tales como AS2, AS2', AS2'', AS4, AS6, ENHANZYN (Detox), QS21, CWS, TDM, AGP, CPG, Leif, saponina y miméticos de saponina y derivados de los mismos. Además, las composiciones de la invención pueden comprender BCG o Pvac como coadyuvante.
En la nomenclatura de la solicitud, Ra35 designa el extremo N de MTB32A (Ra35FL), que comprende al menos de aproximadamente 195 a 205 aminoácidos de MTB32A de M. tuberculosis, o la correspondiente región de otra especie de Mycobacterium. Ra12 designa el extremo C de MTB32A (Ra35FL), que comprende al menos aproximadamente los últimos 132 aminoácidos de MTB32A de M. tuberculosis, o la correspondiente región de otra especie de Mycobacterium.
A continuación, se proporcionan secuencias de algunos antígenos usados en las proteínas de fusión de la invención:
SEC ID Nº 1-4: MTB32A (Ra35FL o Ra35 madura), cuya secuencia se da a conocer también como SEC ID Nº 17 (ADNc) y SEC ID Nº 79 (proteína) en las solicitudes de patente de EE.UU. nº 08/523.436, 08/523.435, 08/658.800, 08/659.683, 08/818.112, 09/056.556 y 08/818.111 y en las solicitudes WO97/09428 y WO97/09429, véase también Skeiky et al., Infection and Immunity 7: 3998-4007 (1999). El término MTB32A incluye también secuencias aminoacídicas de MTB32A en que el residuo de serina en la posición aminoacídica 208 de la SEC ID Nº 2 o la posición aminoacídica 183 de la SEC ID Nº 4 se ha cambiado por otro aminoácido (por ejemplo, alanina, Ra35FLMutSA, véanse, por ejemplo, la Figura 6 y la SEC ID Nº 6).
SEC ID Nº 5 y 6: Ra35FLMut SA, la versión madura de RA35FL en la que el residuo de serina en la posición aminoacídica 183 de la SEC ID Nº 4 se ha cambiado por un residuo de alanina.
SEC ID Nº 7 y 8: Ra35, el extremo N de MTB32A (Ra35FL), que comprende al menos aproximadamente 195 aminoácidos del extremo N de MTB32A de M. tuberculosis, cuya secuencia nucleotídica y aminoacídica se dan a conocer en la Figura 4 (véanse también los aminoácidos 33-227 de la SEC ID Nº 2 y los aminoácidos 8 a 202 de la SEC ID Nº 4). El término Ra35 (N-terminal) incluye también secuencias aminoacídicas de Ra35 en que el sitio activo Ser se ha cambiado como se describe anteriormente.
SEC ID Nº 9 y 10: MTBRa12, el extremo C de MTB32A (Ra35FL), que comprende al menos aproximadamente 132 aminoácidos del extremo C de MTB32A de M. tuberculosis (véanse, por ejemplo, los aminoácidos 224 a 355 de la SEC ID Nº 2 y los aminoácidos 199 a 330 de la SEC ID Nº 4), cuya secuencia se da a conocer como SEC ID Nº 4 (ADN) y SEC ID Nº 66 (secuencia aminoacídica predicha) en la solicitud de patente de EE.UU. nº 09/072.967.
SEC ID Nº 11, 12, 13 y 14: MTB39 (TbH9), cuya secuencia se da a conocer como SEC ID Nº 106 (ADNc completo) y SEC ID Nº 107 (proteína completa) en las solicitudes de patente de EE.UU. nº 08/658.800, 08/659.683, 08/818.112 y 08/818.111 y en las solicitudes WO97/09428 y WO97/09429. La secuencia se da a conocer también como SEC ID Nº 33 (ADN) y SEC ID Nº 91 (aminoácido) en la solicitud de patente de EE.UU. nº 09/056.559.
A continuación, se proporcionan secuencias de algunas proteínas de fusión:
SEC ID Nº 15 y 16: MTB72F (Ra12-TbH9-Ra35), cuya secuencia se da a conocer como SEC ID Nº 1 (ADN) y SEC ID Nº 2 (proteína) en la solicitud de patente de EE.UU. nº 09/223.040 y en la solicitud PCT/US99/07717. El término MTB372F incluye también secuencias aminoacídicas de MTB72F en las que cualquiera de los tres aminoácidos en la triada de sitio activo en Ra35FL (concretamente, His, Asp o Ser) se ha cambiado como se describe anteriormente (véase, por ejemplo, MTB72FMutSA, Figura 5).
SEC ID Nº 17 y 18: MTB72FMutSA (Ra12-TbH9-Ra35MutSA), en la que, en el componente Ra35 de la proteína de fusión, la serina en la posición 710 se ha cambiado por alanina.
SEC ID Nº 19 y 20: TbH9-Ra35 (MTB59F), cuya secuencia se da a conocer como SEC ID Nº 23 (ADNc) y SEC ID Nº 24 (proteína) en la solicitud de patente de EE.UU. nº 09/287.849 y en la solicitud PCT/US99/07717.
A continuación, se proporcionan secuencias de algunos antígenos adicionales usados en las composiciones y proteínas de fusión de la invención:
SEC ID Nº 21 y 22: MTB8.4 (DPV), cuya secuencia se da a conocer como SEC ID Nº 101 (ADNc) y SEC ID Nº 102 (proteína) en las solicitudes de patente de EE.UU. nº 08/658.800, 08/659.683, 08/818.112 y 08/818.111 y en las solicitudes WO97/09428 y WO97/09429.
SEC ID Nº 23 y 24: MTB9.8 (MSL), cuya secuencia se da a conocer como SEC ID Nº 12 (ADN), SEC ID Nº 109 (secuencia aminoacídica predicha) y SEC ID Nº 110 a 124 (péptidos) en las solicitudes de patente de EE.UU. nº 08/859.381, 08/858.998, 09/073.009 y 09/073.010 y en las solicitudes PCT/US98/10407 y PCT/US98/10514.
SEC ID Nº 25, 26 y 27: MTB9.9A (MTI, también conocido como MTI-A), cuya secuencia se da a conocer como SEC ID Nº 3 y SEC ID Nº 4 (ADN) y SEC ID Nº 29 y SEC ID Nº 51 a 66 (péptido ORF para MTI) en las solicitudes de patente de EE.UU. nº 08/859.381, 08/858.998, 09/073.009 y 09/073.010 y en las solicitudes PCT/US98/10407 y PCT/US98/10514. Existen también otras dos variantes de MTI, llamadas MTI-B y MTI-C.
SEC ID Nº 28 y 29: MTB40 (HTCC nº 1), cuya secuencia se da a conocer como SEC ID Nº 137 (ADNc) y 138 (secuencia aminoacídica predicha) en las solicitudes de patente de EE.UU. nº 09/073.009 y 09/073.010 y en las solicitudes PCT/US98/10407 y PCT/US98/10514.
SEC ID Nº 30 y 31: MTB41 (MTCC nº 2), cuya secuencia se da a conocer como SEC ID Nº 140 (ADNc) y SEC ID Nº 142 (secuencia aminoacídica predicha) en las solicitudes de patente de EE.UU. nº 09/073.009 y 09/073.010 y en las solicitudes PCT/US98/10407 y PCT/US98/10514.
SEC ID Nº 32 y 33: ESAT-6, cuya secuencia se da a conocer como SEC ID Nº 103 (ADN) y SEC ID Nº 104 (secuencia aminoacídica predicha) en la solicitud de patente de EE.UU. nº 09/072.967. La secuencia de ESAT-6 se da a conocer también en la patente de EE.UU. nº 5.955.077.
SEC ID Nº 34 y 35: Tb38-1 o 38-1 (MTb11), cuya secuencia se da a conocer en la SEC ID Nº 46 (ADN) y SEC ID Nº 88 (aminoácido predicho) y en la solicitudes de patente de EE.UU. nº 09/072.96; 08/523.436; 08/523.435; 08/818,112 y 08/818.111 y en las solicitudes WO97/09428 y WO97/09429.
SEC ID Nº 36 y 37: TbRa3, cuya secuencia se da a conocer en la SEC ID Nº 15 (ADN) y la SEC ID Nº 77 (secuencia aminoacídica predicha) de las solicitudes WO 97/09428 y WO97/09429.
SEC ID Nº 38 y 39: 38 kDa, cuya secuencia se da a conocer en la SEC ID Nº 154 (ADN) y la SEC ID Nº 155 (secuencia aminoacídica predicha) en la solicitud de patente de EE.UU. nº 09/072.967. 38 kDa tiene dos formas alternativas con y sin el residuo de cisteína N-terminal.
SEC ID Nº 40 y 41: DPEP, cuya secuencia se da a conocer en la SEC ID Nº 52 (ADN) y la SEC ID Nº 53 (secuencia aminoacídica predicha) en las publicaciones WO97/09428 y WO97/09429.
SEC ID Nº 42 y 43: TbH4, cuya secuencia se da a conocer como la SEC ID Nº 43 (ADN) y la SEC ID Nº 81 (secuencia aminoacídica predicha) en las publicaciones WO97/09428 y WO97/09429.
SEC ID Nº 44 y 45: DPPD, cuya secuencia se da a conocer en la SEC ID Nº 240 (ADN) y la SEC ID Nº 241 (secuencia aminoacídica predicha) en el documento USSN 09/072.967 y en las solicitudes PCT/US99/03268 y PCT/US99/03265. Se muestra la forma secretada de DPPD de la presente memoria en la Figura 12 del documento PCT/US00/28095.
MTb82 (MTb867), cuya secuencia se da a conocer en las Figuras 8 (ADN) y 9 (aminoácido) del documento PCT/US00/2809.
Erd14 (MTb16), cuyas secuencias de ADNc y aminoacídica se dan a conocer en Verbon et al., J. Bacteriology 174: 1352-1359 (1992).
Antígeno \alpha cristalino, cuya secuencia se da a conocer en Verbon et al., J. Bact. 174: 1352-1359 (1992).
Antígeno complejo 85, por ejemplo antígeno 85b, cuya secuencia se da a conocer en Content et al., Infect. & Immunol. 59: 3205-3212 (1991).
A continuación, se proporcionan secuencias de algunas proteínas de fusión adicionales usadas en las composiciones y proteínas de fusión de la invención:
SEC ID Nº 48 y 49: DPV-MTI-MSL-MTCC nº 2 (MTb71F), cuya secuencia se da a conocer como SEC ID Nº 15 (ácido nucleico) y en la SEC ID Nº 16: (proteína) en la solicitud de patente de EE.UU. nº 09/287.849 y en la solicitud PCT/US99/07717.
SEC ID Nº 46 y 47: DPV-MTI-MSL (MTb31F), cuya secuencia se da a conocer en la SEC ID Nº 18 (ADNc) y la SEC ID Nº 19 (proteína) en la solicitud de patente de EE.UU. nº 09/287.849 y en la solicitud PCT/US99/07717.
Cada una de las secuencias anteriores se da a conocer también en Cole et al. Nature 393: 537 (1998) y puede encontrarse, por ejemplo, en http://www.sanger.ac.uk y http:/www.pasteur.fr/mycdb/. Las secuencias anteriores se dan a conocer en las solicitudes de patente de EE.UU. nº 08/523.435, 08/523.436, 08/658.800, 08/659.683, 08/818.111, 08/818.112, 08/942.341, 08/942.578, 08/858.998, 08/859.381, 09/056.556, 09/072.596, 09/072.967, 09/073.009,
09/073.010, 09/223.040, 09/1287.849 09/597.796 y en las solicitudes de patente PCT PCT/US00/28095;
PCT/US98/10407, PCT/US98/10514, PCT/US99/03265, PCT/US99/03268, PCT/US99/07717 y los documentos
WO97/09428 y WO97/09429, WO98/16645, WO98/16646.
Los antígenos descritos en la presente memoria incluyen variantes polimórficas y variaciones modificadas conservadoramente, así como homólogos de Mycobacterium entre cepas y entre especies. Además, los antígenos descritos en la presente memoria incluyen subsecuencias o secuencias truncadas. Las proteínas de fusión pueden contener también polipéptidos adicionales, opcionalmente péptidos heterólogos de Mycobacterium u otras fuentes. Estos antígenos pueden modificarse, por ejemplo, añadiendo secuencias peptídicas ligadoras como se describen a continuación. Estos péptidos ligadores pueden insertarse entre los uno o más polipéptidos que constituyen cada una de las proteínas de fusión.
Definiciones
"Polipéptido de fusión" o "proteína de fusión" designa una proteína que tiene al menos dos polipéptidos heterólogos de Mycobacterium sp. ligados covalentemente, directamente o mediante un ligador aminoacídico. Los polipéptidos que forman la proteína de fusión están típicamente ligados de extremo C a extremo N, aunque también pueden estar ligados de extremo C a extremo C, de extremo N a extremo N o de extremo N a extremo C. Los polipéptidos de la proteína de fusión pueden estar en cualquier orden. Este término designa también las variantes modificadas conservadoramente, variantes polimórficas, alelos, mutantes, subsecuencias, homólogos entre especies y fragmentos inmunogénicos de los antígenos que constituyen la proteína de fusión. Los antígenos de Mycobacterium tuberculosis se describen en Cole et al., Nature 393: 537 (1998), que da a conocer el genoma completo de Mycobacterium tuberculosis. La secuencia completa de Mycobacterium tuberculosis puede encontrarse también en http://www.sanger.ac.uk y en http://www.pasteur.fr/mycdb/ (MycDB). Pueden identificarse antígenos de otras especies de Mycobacterium que corresponden a los antígenos de M. tuberculosis, por ejemplo, usando algoritmos de comparación de secuencia como se describen en la presente memoria, u otros métodos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, ensayos de hibridación y ensayos de unión de anticuerpo. Las proteínas de fusión de la invención pueden comprender también copias adicionales de un componente antigénico o fragmento inmunogénico del mismo.
En algunas realizaciones, los polipéptidos individuales de la proteína de fusión están en orden (extremo N a C) de grande a pequeño. Los antígenos grandes son de aproximadamente 30 a 150 kDa de tamaño, los antígenos medianos son de aproximadamente 10 a 30 kDa de tamaño y los antígenos pequeños son de aproximadamente menos de 10 kDa de tamaño. La secuencia que codifica el polipéptido individual puede ser tan pequeña como, por ejemplo, un fragmento inmunogénico tal como un epítopo de LTC individual que codifica aproximadamente 8 a 9 aminoácidos o, por ejemplo, un epítopo de LTA o linfocito B. El fragmento puede incluir también múltiples epítopos. El fragmento inmunogénico puede representar también una parte mayor de la secuencia antigénica, por ejemplo, aproximadamente 50% o más de MTB39 y MTB32A, por ejemplo, las porciones N- y C-terminales de MTB32A. Los fragmentos inmunogénicos preferidos de MTB32A incluyen Ra12, Ra35 y Ra35 MutSA.
Un polipéptido de fusión de la invención se une específicamente a anticuerpos creados contra al menos dos polipéptidos antigénicos, seleccionándose cada polipéptido antigénico del grupo constituido por MTB39 o una porción inmunogénica o fragmento del mismo y MTB32A o una porción inmunogénica del mismo. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. Opcionalmente, el polipéptido de fusión se une específicamente a anticuerpos creados contra la unión por fusión de los antígenos cuyos anticuerpos no se unen a los antígenos individualmente, concretamente, cuando no son parte de una proteína de fusión. Los polipéptidos de fusión comprenden opcionalmente polipéptidos adicionales, por ejemplo, 3, 4, 5, 6 ó más polipéptidos, hasta aproximadamente 25 polipéptidos, opcionalmente polipéptidos heterólogos o polipéptidos homólogos repetidos, fusionados con al menos dos antígenos heterólogos. Los polipéptidos adicionales de la proteína de fusión derivan opcionalmente de Mycobacterium así como de otras fuentes, tales como otras fuentes bacterianas, víricas, invertebradas, vertebradas o de mamífero. Los polipéptidos individuales de la proteína de fusión pueden estar en cualquier orden. Como se describe en la presente memoria, la proteína de fusión puede estar también ligada a otras moléculas, incluyendo polipéptidos adicionales. Las composiciones de la invención pueden comprender también polipéptidos adicionales que no están ligados a las proteínas de fusión de la invención. Estos polipéptidos adicionales pueden ser polipéptidos heterólogos u homólogos.
El término "fusionado" designa el ligamiento covalente entre dos polipéptidos en una proteína de fusión. Los polipéptidos se unen típicamente mediante un enlace peptídico, directamente entre sí o mediante un ligador aminoacídico. Opcionalmente, los péptidos pueden unirse mediante ligamientos covalentes no peptídicos conocidos por los expertos en la materia.
"FL" designa completo, concretamente, un polipéptido que es de la misma longitud que el polipéptido de tipo silvestre.
El término "fragmento inmunogénico del mismo" designa un polipéptido que comprende un epítopo que es reconocido por linfocitos T citotóxicos, linfocitos T auxiliares o linfocitos B. Los fragmentos inmunogénicos preferidos, por ejemplo, de MTB32A, son RA35, Ra35MutSA o Ra12.
El término "especie de Mycobacterium del complejo de tuberculosis" incluye aquellas especies consideradas tradicionalmente como causantes de la enfermedad tuberculosis, así como especies de Mycobacterium ambientales y oportunistas que causan tuberculosis y enfermedad pulmonar en pacientes inmunocomprometidos, tales como pacientes con SIDA, por ejemplo, M. tuberculosis, M. bovis, o M. africanum, BCG, M. avium, M. intracellulare, M celatum, M. genavense, M. haemophilum, M. kansasii, M. simiae, M. vaccae, M. fortuitum y M. scrofulaceum (véase, por ejemplo, "Harrison's Principles of Internal Medicine", volumen 1, pág. 1004-1014 y 1019-1023 (14ª ed., Fauci et al., eds., 1998).
Un coadyuvante designa los componentes de una vacuna o composición terapéutica que aumentan la respuesta inmunitaria específica al antígeno (véase, por ejemplo, Edelman, AIDS Res. Hum Retroviruses 8: 1409-1411 (1992)). Los coadyuvantes inducen respuestas inmunitarias de respuesta de tipo Th1 y tipo Th2. Las citocinas de tipo Th1 (por ejemplo, IFN-\gamma, IL-2 e IL-12) tienden a favorecer la inducción de respuesta inmunitaria mediada por célula ante un antígeno administrado, mientras que las citocinas de tipo Th2 (por ejemplo, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 y TNF-\beta) tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunitarias humorales.
"Ácido nucleico" designa desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma mono- o bicatenaria. El término comprende ácidos nucleicos que contienen análogos nucleotídicos o residuos o ligamientos de cadena principal modificados conocidos que son sintéticos, de origen natural y de origen no natural, que tienen propiedades de unión similares al ácido nucleico de referencia y que se metabolizan de manera similar a los nucleótidos de referencia. Los ejemplos de dichos análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonatos de metilo, fosfonatos de metilo quirales, 2-O-metilrribonucleótidos y ácidos nucleicos peptídicos (ANP).
A menos que se indique otra cosa, una secuencia de ácido nucleico particular comprende también implícitamente variantes modificadas conservadoramente del mismo (por ejemplo, sustituciones de codón degeneradas) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, las sustituciones de codón degeneradas pueden conseguirse generando secuencias en que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye por residuos de base mixta y/o desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)). El término ácido nucleico se usa intercambiablemente con gen, ADNc, ARNm, oligonucleótido y polinucleótido.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan intercambiablemente en la presente memoria para designar un polímero de residuos aminoacídicos. Los términos se aplican a polímeros aminoacídicos en que uno o más residuos aminoacídicos son un mimético químico artificial de un correspondiente aminoácido de origen natural, así como a polímeros aminoacídicos de origen natural y polímeros aminoacídicos de origen no natural.
El término "aminoácido" designa aminoácidos de origen natural y aminoácidos sintéticos, así como análogos aminoacídicos y miméticos aminoacídicos que funcionan de manera similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos de origen natural son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que se modifican después, por ejemplo, hidroxiprolina, \gamma-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Análogos aminoacídicos designa compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural, concretamente, un carbono \alpha que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, metionina-sulfóxido o metionina-metilsulfonio. Dichos análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o cadenas principales peptídicas modificadas, pero retienen la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural. Miméticos aminoacídicos designa compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de manera similar a un aminoácido de origen natural.
Los aminoácidos pueden designarse en la presente memoria por cualquiera de los símbolos de tres letras o símbolos de una letra conocidos comúnmente recomendados por la IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Los nucleótidos, igualmente, pueden designarse por sus códigos de una letra comúnmente aceptados.
"Variantes modificadas conservadoramente" se aplica tanto a secuencias aminoacídicas como de ácido nucleico. Con respecto a secuencias de ácido nucleico particulares, las variantes modificadas conservadoramente designan aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias aminoacídicas idénticas o esencialmente idénticas, o cuando el ácido nucleico no codifica una secuencia aminoacídica, secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos el aminoácido alanina. Por tanto, en cualquier posición en que la alanina esté especificada por un codón, el codón puede alterarse a cualquiera de los correspondientes codones descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones modificadas conservadoramente. Cada secuencia de ácido nucleico en la presente memoria que codifica un polipéptido describe también cada variación silenciosa posible del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón de un ácido nucleico (excepto AUG, que normalmente es el único codón para metionina y TGG que normalmente es el único codón para triptófano) puede modificarse para proporcionar una molécula funcionalmente idéntica. En consecuencia, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.
En cuanto a las secuencias aminoacídicas, un experto reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales en un ácido nucleico, péptido, polipéptido o secuencia proteica que alteran, añaden o eliminan un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada son una "variante modificada conservadoramente", en que la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservadora que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la materia. Dichas variantes modificadas conservadoramente se añaden a y no excluyen variantes polimórficas, homólogos entre especies y alelos de la invención.
Los siguientes ocho grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí:
1) alanina (A), glicina (G);
2) ácido aspártico (D), ácido glutámico (E);
3) asparagina (N), glutamina (Q);
4) arginina (R), lisina (K);
5) isoleucina (I), leucina (L), metionina (M), valina (V);
6) fenilalanina (F), tirosina (Y), triptófano (W);
7) serina (S), treonina (T); y
8) cisteína (C), metionina (M)
(véase, por ejemplo, Creighton, "Proteins" (1984)).
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El término "heterólogo", cuando se usa con referencia a porciones de un ácido nucleico, indica que el ácido nucleico comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, el ácido nucleico se produce típicamente por recombinación, y tiene dos o más secuencias de genes no relacionadas dispuestas para preparar un nuevo ácido nucleico funcional, por ejemplo, un promotor de una fuente y una región de codificación de otra fuente. De forma similar, proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza (por ejemplo, una proteína de fusión).
La frase "hibrida selectiva (o específicamente) con" designa la unión, formación de dúplex o hibridación de una molécula sólo con una secuencia nucleotídica particular en condiciones de hibridación rigurosas cuando esa secuencia está presente en una mezcla compleja (por ejemplo, ADN o ARN celular total o de colección).
La frase "condiciones de hibridación rigurosas" designa condiciones en las que una sonda hibridará con su subsecuencia diana, típicamente en una mezcla compleja de ácidos nucleicos, pero no con otras secuencias. Las condiciones rigurosas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Las secuencias más largas hibridarán específicamente a temperaturas mayores. Se encuentra una guía extensa de la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen, "Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Generalmente, las condiciones estrictas se seleccionan para ser de aproximadamente 5-10ºC menores que el punto de fusión térmico (T_{m}) de la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La T_{m} es la temperatura (a fuerza iónica, pH y concentración de ácido nucleico definidos) a la que un 50% de las sondas complementarias con la diana hibridan con la secuencia diana en equilibrio (ya que las secuencias diana están presentes en exceso, a T_{m}, el 50% de las sondas están ocupadas en equilibrio). Las condiciones rigurosas serán aquellas en que la concentración salina sea menor de aproximadamente 1,0 M de ión sodio, típicamente de aproximadamente 0,01 a 1,0 M de concentración de ión sodio (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3 y la temperatura sea de al menos aproximadamente 30ºC para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y de al menos aproximadamente 60ºC para sondas largas (por ejemplo, mayores de 50 nucleótidos). Las condiciones rigurosas pueden conseguirse también con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. Para hibridación selectiva o específica, una señal positiva es al menos dos veces la hibridación de fondo, opcionalmente 10 veces. Las condiciones de hibridación rigurosas ejemplares pueden ser las siguientes: 50% de formamida, 5x SSC y 1% de SDS, incubación a 42ºC, o 5x SSC, 1% de SDS, incubación a 65ºC, con lavado con 0,2x SSC y 0,1% de SDS a 65ºC.
Los ácidos nucleicos que no hibridan entre sí en condiciones rigurosas son todavía sustancialmente idénticos si los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto ocurre, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico usando la degeneración de codón máxima permitida por el código genético. En dichos casos, los ácidos nucleicos hibridan típicamente en condiciones de hibridación moderadamente rigurosas. Las "condiciones de hibridación moderadamente rigurosas" ejemplares incluyen la hibridación en un tampón de 40% de formamida, NaCl 1 M, 1% de SDS a 37ºC y un lavado con 1xSSC a 45ºC. Una hibridación positiva es al menos dos veces la de fondo. Los expertos en la materia reconocerán fácilmente que pueden utilizarse condiciones de hibridación y lavado alternativas para proporcionar condiciones de rigor similar.
"Anticuerpo" designa un polipéptido que comprende una región marco de un gen de inmunoglobulina o fragmentos de la misma que se unen a y reconocen específicamente un antígeno. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de la región kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como la miríada de genes de región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.
Una unidad estructural de inmunoglobulina ejemplar (anticuerpo) comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). El extremo N de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsable principalmente del reconocimiento de antígeno. Los términos cadena ligera variable (V_{L}) y cadena pesada variable (V_{H}) designan estas cadenas ligera y pesada, respectivamente.
Los anticuerpos existen, por ejemplo, como inmunoglobulinas intactas o como una serie de fragmentos bien caracterizados producidos mediante la digestión con diversas peptidasas. Por tanto, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo por debajo de los ligamientos disulfuro en la región de bisagra produciendo F(ab)'_{2}, un dímero de Fab que es por sí solo una cadena ligera unida a V_{H}-C_{H}1 por un enlace disulfuro. El F(ab)'_{2} puede reducirse en condiciones suaves para romper el ligamiento disulfuro en la región de bisagra, convirtiendo así el dímero F(ab)'_{2} en un monómero Fab'. El monómero Fab' es esencialmente Fab con parte de la región de bisagra (véase "Fundamental Immunology" (Paul ed., 3ª ed. 1993). Aunque se definen diversos fragmentos de anticuerpo en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, un experto apreciará que dichos fragmentos pueden sintetizarse de novo químicamente o usando metodología de ADN recombinante. Por tanto, el término anticuerpo, como se usa en la presente memoria, incluye también fragmentos de anticuerpo producidos mediante la modificación de anticuerpos enteros o aquellos sintetizados de novo usando metodologías de ADN recombinante (por ejemplo F_{v} monocatenario) o aquellos identificados usando colecciones de expresión en fago (véase, por ejemplo, McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990)).
Para la preparación de anticuerpos monoclonales o policlonales, puede usarse cualquier técnica conocida en la materia (véanse, por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., pág. 77-96 en "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy" (1985)). Las técnicas para la producción de anticuerpos monocatenarios (patente de EE.UU. 4.946.778) pueden adaptarse para producir anticuerpos contra polipéptidos de esta invención. También pueden usarse ratones transgénicos, u otros organismos tales como otros mamíferos, para expresar anticuerpos humanizados. Como alternativa, puede usarse la tecnología de expresión en fago para identificar anticuerpos y fragmentos de Fab heteroméricos que se unen específicamente a antígenos seleccionados (véanse, por ejemplo, McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10: 779-783 (1992)).
La frase "se une específica (o selectivamente) a" un anticuerpo o "es específica (o selectivamente) inmunoreactivo con", cuando se designa una proteína o péptido, designa una reacción de unión que es indicativa de la presencia de la proteína en una población heterogénea de proteínas y otros productos biológicos. Por tanto, en las condiciones de inmunoensayo designadas, los anticuerpos especificados se unen a una proteína particular al menos a dos veces el fondo y no se unen sustancialmente en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra. La unión específica a un anticuerpo en dichas condiciones puede requerir un anticuerpo que se selecciona por su especificidad por una proteína particular. Por ejemplo, los anticuerpos policlonales creados contra proteínas de fusión pueden seleccionarse para obtener sólo aquellos anticuerpos policlonales que sean específicamente inmunoreactivos con la proteína de fusión y no con componentes individuales de las proteínas de fusión. Esta selección puede conseguirse quitando los anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con los antígenos individuales. Pueden usarse una variedad de formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos específicamente inmunoreactivos con una proteína particular. Por ejemplo, se usan rutinariamente inmunoensayos ELISA en fase sólida para seleccionar anticuerpos específicamente inmunoreactivos con una proteína particular (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual" (1988), para la descripción de formatos de inmunoensayo y condiciones que pueden usarse para determinar la inmunoreactividad específica). Típicamente, una reacción específica o selectiva será al menos dos veces la señal o ruido de fondo y más típicamente más de 10 a 100 veces el fondo.
Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia nativa (concretamente, una secuencia endógena que codifica un antígeno individual o una porción del mismo) o pueden comprender una variante de dicha secuencia. Las variantes polinucleotídicas pueden contener una o más sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones de tal modo que la actividad biológica del polipéptido de fusión codificado no se reduzca respecto a un polipéptido de fusión que comprende antígenos nativos. Las variantes exhiben preferiblemente al menos aproximadamente un 70% de identidad, más preferiblemente al menos aproximadamente un 80% de identidad y lo más preferiblemente al menos aproximadamente un 90% de identidad con una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido nativo o una porción del mismo.
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Los términos "idéntico" o "identidad" porcentual, en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas, designan dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de residuos aminoacídicos o nucleótidos que son iguales (concretamente, 70% de identidad, opcionalmente 75%, 80%, 85%, 90% ó 95% de identidad en una región especificada) cuando se comparan y alinean para correspondencia máxima en una ventana de comparación, o región designada, medida usando uno de los algoritmos de comparación de secuencia siguientes o mediante alineamiento manual e inspección visual. Dichas secuencias se dice que son "sustancialmente idénticas". Esta definición designa también el complemento de una secuencia de ensayo. Opcionalmente, existe identidad en una región que es de al menos aproximadamente 25 a aproximadamente 50 aminoácidos o nucleótidos de longitud. Opcionalmente, existe identidad en una región que es al menos de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 aminoácidos o nucleótidos de longitud, u opcionalmente en una región que es de 75-100 aminoácidos o nucleótidos de longitud.
Para comparación de secuencia, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencia, se introducen las secuencias de ensayo y referencia en un ordenador, se diseñan las coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se diseñan los parámetros del programa de algoritmo de secuencia. Pueden usarse los parámetros de programa por defecto, o pueden diseñarse parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencia calcula entonces las identidades de secuencia porcentuales para las secuencias de ensayo respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.
Una "ventana de comparación", como se usa en la presente memoria, incluye la referencia a un segmento de una cualquiera de la serie de posiciones contiguas seleccionadas del grupo constituido por 25 a 500, habitualmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más habitualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150, en las que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de alinear óptimamente las dos secuencias. Los métodos de alineamiento de secuencias para comparación son bien conocidos en la materia. El alineamiento óptimo de secuencias para comparación puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), por el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), mediante implementaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante alineamiento manual e inspección visual (véase, por ejemplo, "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel et al., ed. suplemento de 1995)).
Es un ejemplo de algoritmo útil PILEUP. El PILEUP crea un alineamiento de secuencia múltiple a partir de un grupo de secuencias relacionadas usando alineamientos pareados progresivos para mostrar la relación y la identidad de secuencia porcentual. Representa también un árbol o dendograma que muestra las relaciones de agrupamiento usadas para crear el alineamiento. El PILEUP usa una simplificación del método de alineamiento progresivo de Feng y Doolittle, J. Mol. Evol. 35: 351-360 (1987). El método usado es similar al método descrito por Higgins y Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989). El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una de una longitud máxima de 5.000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineamiento múltiple empieza con el alineamiento pareado de las dos secuencias más similares, produciendo un agrupamiento de dos secuencias alineadas. Este agrupamiento se alinea entonces con la siguiente secuencia o agrupamiento de secuencias alineadas más relacionado. Se alinean dos agrupamientos de secuencias mediante una sencilla extensión del alineamiento pareado de dos secuencias individuales. Se consigue el alineamiento final mediante una serie de alineamientos pareados progresivos. El programa se ejecuta diseñando secuencias específicas y sus coordenadas aminoacídicas o nucleotídicas para regiones de comparación de secuencia y diseñando los parámetros del programa. Usando PILEUP, se compara una secuencia de referencia con otras secuencias de ensayo para determinar la relación de identidad de secuencia porcentual usando los siguientes parámetros: ponderación del hueco por defecto (3,00), ponderación de la longitud del hueco por defecto (0,10) y huecos finales ponderados. PILEUP puede obtenerse en el paquete de software de análisis de secuencia GCG, por ejemplo, la versión 7.0 (Devereaux et al., Nuc. Acids Res. 12: 387-395 (1984).
Son otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar la identidad de secuencia porcentual y la similitud de secuencia, los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1977) y Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990), respectivamente. El software para efectuar análisis BLAST está públicamente disponible en el National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica en primer lugar identificar pares de secuencia de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que puede coincidir con o satisfacer alguna puntuación umbral de valor positivo T cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se designa como el umbral de puntuación de palabra vecina (Altschul et al., supra). Estos aciertos de palabra vecina iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largos que las contengan. Los aciertos de palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia en la medida en que la puntuación de alineamiento acumulativo pueda aumentarse. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, para secuencias nucleotídicas, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para residuos no coincidentes; siempre < 0). Para las secuencias aminoacídicas, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineamiento acumulativo cae por debajo de la cantidad X desde su valor máximo conseguido; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias nucleotídicas) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N= -4 y una comparación de ambas cadenas. Para secuencias aminoacídicas, el programa BLASTP usa por defecto una longitud de palabra de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)), alineamientos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M= 5, N= -4 y una comparación de ambas cadenas.
El algoritmo BLAST efectúa también un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)). Es una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST la suma menor de probabilidades (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad de que una coincidencia entre dos secuencias nucleotídicas o aminoacídicas ocurra por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la suma menor de probabilidades en una comparación del ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0,2, más preferiblemente menor de aproximadamente 0,01 y lo más preferiblemente menor de aproximadamente 0,001.
Composiciones polinucleotídicas
Como se usan en la presente memoria, los términos "segmento de ADN" y "polinucleótido" designan una molécula de ADN que se ha aislado exenta del ADN genómico total de una especie particular. Por lo tanto, un segmento de ADN que codifica un polipéptido designa un segmento de ADN que contiene una o más secuencias de codificación aunque está sustancialmente aislado, o purificado exento, del ADN genómico total de la especie de la que se obtiene el segmento de ADN. Se incluyen dentro de los términos "segmento de ADN" y "polinucleótido" los segmentos de ADN y fragmentos menores de dichos segmentos, y también vectores recombinantes, incluyendo, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagémidos, fagos, virus y similares.
Como se entenderá por los expertos en la materia, los segmentos de ADN de esta invención pueden incluir secuencias genómicas, secuencias extragenómicas y codificadas por plásmido y segmentos génicos modificados por ingeniería genética menores que expresan, o pueden adaptarse para expresar, proteínas, polipéptidos, péptidos y similares. Dichos segmentos pueden ser aislados naturalmente o modificados sintéticamente por la mano del hombre.
Los términos "aislado", "purificado" o "biológicamente puro" designan por lo tanto material que está sustancial o esencialmente exento de componentes que normalmente lo acompañan cuando se encuentra en su estado nativo. Por supuesto, esto designa el fragmento de ADN como se aísla originalmente, y no excluye otras proteínas aisladas, genes o regiones de codificación añadidos después a la composición por la mano del hombre. La pureza y homogeneidad se determinan típicamente usando técnicas de química analítica tales como electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía líquida de alta resolución. Se purifica sustancialmente una proteína que es la especie predominante presente en una preparación. Se separa un ácido nucleico aislado de los otros marcos abiertos de lectura que flanquean el gen y codifican proteínas distintas del gen.
Como se reconocerá por el experto, los polinucleótidos pueden ser monocatenarios (de codificación o no codificación) o bicatenarios, y pueden ser moléculas de ADN (genómico, ADNc o sintético) o ARN. Las moléculas de ARN incluyen moléculas de HnRNA, que contienen intrones y corresponden a una molécula de ADN de manera unívoca, y moléculas de ARNm que no contienen intrones. Las secuencias de codificación o no codificación adicionales pueden estar presentes, pero no es necesario, en un polinucleótido de la presente invención, y el polinucleótido puede estar ligado, pero no es necesario, a otras moléculas y/o materiales de soporte.
Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia nativa (concretamente, una secuencia endógena que codifica un antígeno de Mycobacterium o una porción del mismo) o pueden comprender una variante o un equivalente funcional biológico o antigénico de dicha secuencia. Las variantes polinucleotídicas pueden contener una o más sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones, como se describe adicionalmente a continuación, preferiblemente de tal modo que la inmunogenicidad del polipéptido codificado no se reduzca respecto a una proteína nativa. El efecto sobre la inmunogenicidad del polipéptido codificado puede evaluarse generalmente como se describe en la presente memoria. El término "variantes" comprende también genes homólogos de origen xenogénico.
En realizaciones adicionales, la presente invención proporciona polinucleótidos y polipéptidos aislados que comprenden diversas longitudes de extensiones contiguas de secuencia idénticas a o complementarias de una o más de las secuencias dadas a conocer en la presente memoria. Por ejemplo, se proporcionan polinucleótidos por esta invención que comprenden al menos aproximadamente 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 ó 1.000 o más nucleótidos contiguos de una o más de las secuencias dadas a conocer en la presente memoria, así como todas las longitudes intermedias entre éstas. Se entenderá fácilmente que "longitudes intermedias", en este contexto, significa cualquier longitud entre los valores indicados, tales como 16, 17, 18, 19, etc.; 21, 22, 23, etc.; 30, 31, 32, etc.; 50, 51, 52, 53, etc.; 100, 101, 102, 103, etc.; 150, 151, 152, 153, etc.; incluyendo todos los números enteros 200-500; 500-1.000 y similares.
Los polinucleótidos de la presente invención, o fragmentos de los mismos, independientemente de la longitud de la secuencia de codificación misma, pueden combinarse con otras secuencias de ADN tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios de enzima de restricción adicionales, sitios de clonación múltiple, otros segmentos de codificación y similares, de tal modo que su longitud global puede variar considerablemente. Por lo tanto, se contempla que puede emplearse un fragmento de ácido nucleico de casi cualquier longitud, estando limitada preferiblemente la longitud total por la facilidad de preparación y uso en el protocolo de ADN recombinante pretendido. Por ejemplo, se contempla que son útiles en muchas implementaciones de esta invención segmentos de ADN ilustrativos con longitudes totales de aproximadamente 10.000, aproximadamente 5.000, aproximadamente 3.000, aproximadamente 2.000, aproximadamente 1.000, aproximadamente 500, aproximadamente 200, aproximadamente 100, aproximadamente 50 pares de bases de longitud y similares (incluyendo todas las longitudes intermedias).
Además, se apreciará por los expertos en la materia que, como resultado de la degeneración del código genético, hay muchas secuencias nucleotídicas que codifican un polipéptido como se describe en la presente memoria. Algunos de estos polinucleótidos portan una homología mínima con la secuencia nucleotídica de cualquier gen nativo. No obstante, los polinucleótidos que varían debido a diferencias en el uso de codón se contemplan específicamente por la presente invención, por ejemplo polinucleótidos que están optimizados para selección de codón humana y/o de primate. Además, los alelos de los genes que comprenden las secuencias polinucleotídicas proporcionadas en la presente memoria están dentro del alcance de la presente invención. Los alelos son genes endógenos que se alteran como resultado de una o más mutaciones, tales como deleciones, adiciones y/o sustituciones de nucleótidos. El ARNm y proteína resultantes pueden tener, pero no es necesario, una estructura o función alterada. Los alelos pueden identificarse usando técnicas estándar (tales como hibridación, amplificación y/o comparación de secuencia de base de datos).
Identificación y caracterización de polinucleótidos
Los polinucleótidos pueden identificarse, prepararse y/o manipularse usando cualquiera de una variedad de técnicas bien establecidas.
Los polinucleótidos pueden amplificarse a partir de ADNc preparado a partir de células que expresan las proteínas descritas en la presente memoria, tales como células de M. tuberculosis. Dichos polinucleótidos pueden amplificarse mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Para este enfoque, pueden diseñarse cebadores específicos de secuencia basándose en las secuencias proporcionadas en la presente memoria, y pueden adquirirse o sintetizarse.
Puede usarse una porción amplificada de un polinucleótido de la presente invención para aislar un gen completo de una colección adecuada (por ejemplo, una colección de ADNc de M. tuberculosis) usando técnicas bien conocidas. En dichas técnicas, se examina una colección (de ADNc o genómico) usando una o más sondas o cebadores polinucleotídicos adecuados para amplificación. Preferiblemente, se selecciona por tamaño una colección para incluir moléculas grandes. Las colecciones cebadas aleatoriamente pueden preferirse también para identificar regiones 5' y cadena arriba de genes. Se prefieren las colecciones genómicas para obtener intrones y extender las secuencias 5'.
Para técnicas de hibridación, puede marcarse una secuencia parcial (por ejemplo, traslado de muesca o marcaje terminal con ^{32}P) usando técnicas bien conocidas. Se examina entonces generalmente una colección bacteriana o de bacteriófago hibridando filtros que contienen colonias bacterianas desnaturalizadas (o céspedes que contienen placas de fago) con la sonda marcada (véase Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989)). Se seleccionan y expanden las colonias o placas de hibridación y se aísla el ADN para análisis posterior. Los clones de ADNc pueden analizarse para determinar la cantidad de secuencia adicional, por ejemplo, mediante PCR usando un cebador de la secuencia parcial y un cebador del vector. Pueden generarse mapas de restricción y secuencias parciales para identificar uno o más clones superpuestos. Puede determinarse entonces la secuencia completa usando técnicas estándar, que pueden implicar generar una serie de clones de deleción. Las secuencias superpuestas resultantes pueden ensamblarse entonces en una sola secuencia contigua. Puede generarse una molécula de ADNc completa ligando fragmentos adecuados usando técnicas bien conocidas.
Como alternativa, existen numerosas técnicas de amplificación para obtener una secuencia de codificación completa a partir de una secuencia de ADNc parcial. En dichas técnicas, la amplificación se efectúa generalmente mediante PCR. Puede usarse cualquiera de una variedad de kits comercialmente disponibles para efectuar la etapa de amplificación. Los cebadores pueden diseñarse usando, por ejemplo, software bien conocido en la materia. Los cebadores son preferiblemente de 22-30 nucleótidos de longitud, tienen un contenido de GC de al menos un 50% y se asocian con la secuencia diana a temperaturas de aproximadamente 68 a 72ºC. La región amplificada puede secuenciarse como se describe anteriormente y ensamblarse las secuencias superpuestas en una secuencia contigua.
Una de dichas técnicas de amplificación es la PCR inversa (véase Triglia et al., Nucl. Acids Res. 16: 8186 (1988)), que usa enzimas de restricción para generar un fragmento en la región conocida del gen. El fragmento se circulariza entonces mediante ligadura intramolecular y se usa como molde para PCR con cebadores divergentes derivados de la región conocida. En un enfoque alternativo, las secuencias adyacentes a una secuencia parcial pueden recuperarse mediante amplificación con un cebador de una secuencia ligadora y un cebador específico de una región conocida. Las secuencias amplificadas se someten típicamente a una segunda ronda de amplificación con el mismo cebador ligador y un segundo cebador específico de la región conocida. Se describe una variación de este procedimiento, que emplea dos cebadores que inician la extensión en direcciones opuestas a partir de la secuencia conocida, en el documento WO 96/38591. Otra de dichas técnicas es conocida como "amplificación rápida de los extremos de ADNc" o RACE. Esta técnica implica el uso de un cebador interno y un cebador externo, que hibridan con una región poliA o una secuencia de vector, para identificar secuencias que están 5' y 3' de una secuencia conocida. Las técnicas adicionales incluyen PCR de captura (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1: 111-19 (1991)) y rastreo por PCR (Parker et al., Nucl. Acids. Res. 19: 3055-60 (1991)). Pueden emplearse también otros métodos que emplean amplificación para obtener una secuencia de ADNc completa.
En ciertos casos, es posible obtener una secuencia de ADNc completa mediante el análisis de secuencias proporcionadas en una base de datos de marcadores de secuencia expresada (EST), tales como las disponibles en GenBank. Las búsquedas de EST superpuestos puede efectuarse generalmente usando programas bien conocidos (por ejemplo, búsquedas en NCBI BLAST), y dichos EST pueden usarse para generar una secuencia completa contigua. Las secuencias de ADN completas pueden obtenerse también mediante el análisis de fragmentos genómicos.
Expresión polinucleotídica en células hospedadoras
En otras realizaciones de la invención, pueden usarse secuencias polinucleotídicas o fragmentos de las mismas que codifican polipéptidos de la invención, o proteínas de fusión o equivalentes funcionales de las mismas, en moléculas de ADN recombinantes para dirigir la expresión de un polipéptido en células hospedadoras apropiadas. Debido a la degeneración inherente del código genético, pueden producirse otras secuencias de ADN que codifican sustancialmente la misma secuencia aminoacídica o una funcionalmente equivalente y estas secuencias pueden usarse para clonar y expresar un polipéptido dado.
Como se entenderá por los expertos en la materia, puede ser ventajoso en algunos casos producir secuencias nucleotídicas que codifican un polipéptido que posean codones de origen no natural. Por ejemplo, pueden seleccionarse codones preferidos por un hospedador procariótico o eucariótico particular para aumentar la velocidad de expresión de proteína o para producir un transcrito de ARN recombinante que tenga propiedades deseables, tales como una semivida que sea más larga que la de un transcrito generado a partir de la secuencia de origen natural.
Además, las secuencias polinucleotídicas de la presente invención pueden modificarse por ingeniería genética usando métodos conocidos generalmente en la materia para alterar las secuencias de codificación de polipéptido por una variedad de razones, incluyendo pero sin limitación, alteraciones que modifican la clonación, procesamiento y/o expresión del producto génico. Por ejemplo, la transposición de ADN mediante fragmentación aleatoria y reensamblado por PCR de fragmentos génicos y oligonucleótidos sintéticos puede usarse para modificar por ingeniería genética las secuencias nucleotídicas. Además, la mutagénesis dirigida a sitio puede usarse para insertar nuevos sitios de restricción, alterar los patrones de glucosilación, cambiar la preferencia de codón, producir variantes de corte y empalme o introducir mutaciones y demás.
Las secuencias de ácido nucleico natural, modificado o recombinante pueden estar ligadas a una secuencia heteróloga para codificar una proteína de fusión.
Una proteína de fusión puede estar modificada también por ingeniería genética para contener un sitio de escisión localizado entre la secuencia que codifica polipéptido y la secuencia de proteína heteróloga, de modo que el polipéptido pueda escindirse y purificarse del resto heterólogo.
Pueden sintetizarse secuencias que codifican un polipéptido deseado, total o parcialmente, usando métodos químicos bien conocidos en la materia (véase Caruthers, M. H. et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. pág. 215-223 (1980), Horn et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. pág. 225-232 (1980)). Como alternativa, la proteína misma puede producirse usando métodos químicos para sintetizar la secuencia aminoacídica de un polipéptido, o una porción del mismo. Por ejemplo, la síntesis peptídica puede efectuarse usando diversas técnicas en fase sólida (Roberge et al., Science 269: 202-204 (1995)) y puede conseguirse la síntesis automatizada, por ejemplo, usando el sintetizador peptídico ABI 431A (Perkin Elmer, Palo Alto, CA).
Puede purificarse sustancialmente un péptido recién sintetizado mediante cromatografía líquida de alta resolución preparativa (por ejemplo, Creighton, "Proteins, Structures and Molecular Principles" (1983)) u otras técnicas comparables disponibles en la materia. La composición de los péptidos sintéticos puede confirmarse mediante análisis o secuenciación de aminoácidos (por ejemplo, el procedimiento de degradación de Edman). Adicionalmente, la secuencia aminoacídica de un polipéptido, o cualquier parte del mismo, puede alterarse durante la síntesis directa y/o combinarse usando métodos químicos con secuencias de otras proteínas, o cualquier parte de las mismas, para producir un polipéptido variante.
Para expresar un polipéptido deseado, las secuencias polipeptídicas que codifican el polipéptido, o equivalentes funcionales, pueden insertarse en un vector de expresión apropiado, concretamente, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia de codificación insertada. Pueden usarse métodos que son bien conocidos por los expertos en la materia para construir vectores de expresión que contienen secuencias que codifican un polipéptido de interés y elementos de control transcripcional y traduccional apropiados. Estos métodos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. Dichas técnicas se describen en Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" (1989) y Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology" (1989).
Puede utilizarse una variedad de sistemas de vector de expresión/hospedador que contienen y expresan secuencias polinucleotídicas. Estos incluyen, pero sin limitación, microorganismos tales como bacterias transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago, plásmido o cósmido recombinante; levadura transformada con vectores de expresión de levadura; sistemas de células de insecto infectados con vectores de expresión víricos (por ejemplo, baculovirus); sistemas de células de planta transformadas con vectores de expresión víricos (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmidos Ti o pBR322); o sistemas de células animales.
Los "elementos de control" o "secuencias reguladoras" presentes en un vector de expresión son aquellas regiones no traducidas del vector: potenciadores, promotores, regiones 5' y 3' no traducidas, que interaccionan con proteínas celulares hospedadoras para llevar a cabo la transcripción y traducción. Dichos elementos pueden variar en su potencia y especificidad. Dependiendo del sistema de vector y hospedador utilizado, puede usarse cualquier número de elementos de transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, pueden usarse promotores inducibles tales como el promotor lacZ híbrido del fagémido PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, Calif.) o el plásmido PSPORT1 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) y similares. En sistemas de células de mamífero, se prefieren generalmente promotores de genes de mamífero o de virus de mamífero. Si es necesario generar una estirpe celular que contenga múltiples copias de la secuencia que codifica un polipép-
tido, pueden usarse ventajosamente vectores basados en SV40 o EBV con un marcador seleccionable apropiado.
En sistemas bacterianos, puede seleccionarse una serie de vectores de expresión dependiendo del uso pretendido del polipéptido expresado. Por ejemplo, cuando se necesitan grandes cantidades, por ejemplo para la inducción de anticuerpos, pueden usarse vectores que dirigen un alto nivel de expresión de proteínas de fusión que se purifican fácilmente. Dichos vectores incluyen, pero sin limitación, los vectores de clonación y expresión multifuncionales de E. coli tales como BLUESCRIPT (Stratagene), en los que la secuencia que codifica el polipéptido de interés puede estar ligada al vector en fase con secuencias de Met aminoterminal y los posteriores 7 residuos de \beta-galactosidasa, de modo que se produzca una proteína híbrida; vectores pIN (Van Heeke y Schuster, J. Biol. Chem. 264: 5503-5509 (1989)); y similares. Los vectores pGEX (Promega, Madison, Wis.) pueden usarse también para expresar polipéptidos ajenos en forma de proteínas de fusión con glutation S-transferasa (GST). En general, dichas proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de células lisadas mediante adsorción sobre perlas de glutation-agarosa seguida de elución en presencia de glutation libre. Las proteínas preparadas en dichos sistemas pueden diseñarse para incluir sitios de escisión de heparina, trombina o factor XA de modo que el polipéptido clonado de interés pueda liberarse del resto GST a voluntad.
En la levadura Saccharomyces cerevisiae, pueden usarse una serie de vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles tales como factor alfa, alcohol oxidasa y PGH. Para revisiones, véase Ausubel et al. (supra) y Grant et al., Methods Enzymol. 153: 516-544 (1987).
En los casos en que se usan vectores de expresión de planta, la expresión de secuencias que codifican polipéptidos puede activarse por cualquiera de una serie de promotores. Por ejemplo, los promotores víricos tales como promotores 35S y 19S de CaMV pueden usarse solos o en combinación con la secuencia líder omega de TMV (Takamatsu, EMBO J. 6: 307-311 (1987)). Como alternativa, pueden usarse promotores de planta tales como la subunidad pequeña de RUBISCO o promotores de choque térmico (Coruzzi et al., EMBO J. 3: 1671-1680 (1984); Broglie et al., Science 224: 838-843 (1984) y Winter et al., Results Probl. Cell Differ. 17: 85-105 (1991)). Estos constructos pueden introducirse en células de planta mediante transformación de ADN directa o transfección mediada por patógeno. Dichas técnicas se describen en una serie de revisiones generalmente disponibles (véase, por ejemplo, Hobbs en "McGraw Hill Yearbook of Science and Technology" pág. 191-196 (1992)).
Puede usarse también un sistema de insecto para expresar un polipéptido de interés. Por ejemplo, en uno de dichos sistemas, se usa el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar genes ajenos en células de Spodoptera frugiperda o en Trichoplusia larvae. Las secuencias que codifican el polipéptido pueden clonarse en una región no esencial del virus, tal como el gen de poliedrina, y disponerse bajo el control del promotor de poliedrina. La inserción exitosa de la secuencia de codificación de polipéptido volverá al gen de poliedrina inactivo y producirá un virus recombinante que carece de la proteína de cubierta. Los virus recombinantes pueden usarse entonces para infectar, por ejemplo, células de S. frugiperda o Trichoplusia larvae en las que pueden expresarse el polipéptido de interés (Engelhard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 3224-3227 (1994)).
En células hospedadoras de mamífero, son generalmente viables una serie de sistemas de expresión basados en virus. Por ejemplo, en los casos en que se usa un adenovirus como vector de expresión, las secuencias que codifican un polipéptido de interés pueden ligarse con un complejo de transcripción/traducción adenovírico consistente en el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. La inserción en una región E1 o E3 no esencial del genoma vírico puede usarse para obtener un virus viable que sea capaz de expresar el polipéptido en células hospedadoras infectadas (Logan y Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 3655-3659 (1984)). Además, pueden usarse potenciadores de la transcripción tales como potenciador del virus de sarcoma de Rous (RSV) para aumentar la expresión en células hospedadoras de mamífero.
Pueden usarse también señales de iniciación específicas para conseguir una traducción más eficaz de secuencias que codifican un polipéptido de interés. Dichas señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. En los casos en que las secuencias que codifican el polipéptido, su codón de iniciación y secuencias cadena arriba estén insertadas en el vector de expresión apropiado, pueden no ser necesarias señales de control transcripcional o traduccional adicionales. Sin embargo, en los casos en que se inserte sólo la secuencia de codificación, o una porción de la misma, deben proporcionarse señales de control traduccional exógenas incluyendo el codón de iniciación ATG. Además, el codón de iniciación debe estar en el marco de lectura correcto para asegurar la traducción del inserto completo. Los elementos traduccionales exógenos y codones de iniciación pueden ser de diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de la expresión puede potenciarse mediante la inclusión de potenciadores que son apropiados para el sistema celular particular que se usa, tales como los descritos en la bibliografía (Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20: 125-162 (1994)).
Además, puede elegirse una cepa de célula hospedadora por su capacidad de modular la expresión de las secuencias insertadas o de procesar la proteína expresada de la forma deseada. Dichas modificaciones del polipéptido incluyen, pero sin limitación, acetilación, carboxilación, glucosilación, fosforilación, lipidación y acilación. El procesamiento postraduccional que escinde una forma "prepro" de la proteína puede usarse también para facilitar una correcta inserción, plegamiento y/o función. Pueden elegirse diferentes células hospedadoras tales como CHO, HeLa, MDCK, HEK293 y WI38, que tienen una maquinaria celular específica y mecanismos característicos para dichas actividades postraduccionales, para asegurar la correcta modificación y procesamiento de la proteína ajena.
Para la producción a largo plazo con alto rendimiento de proteínas recombinantes, se prefiere generalmente la expresión estable. Por ejemplo, las estirpes celulares que expresan establemente un polinucleótido de interés pueden transformarse usando vectores de expresión que pueden contener orígenes de replicación víricos y/o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable en el mismo o en un vector separado. Después de la introducción del vector, pueden dejarse crecer las células durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de cambiarse a medio selectivo. El fin del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y recuperación de células que expresan exitosamente las secuencias introducidas. Los clones resistentes de células transformadas establemente pueden proliferar usando técnicas de cultivo de tejido apropiadas para el tipo celular.
Puede usarse cualquier número de sistemas de selección para recuperar estirpes celulares transformadas. Estos incluyen, pero sin limitación, genes de timidina cinasa de herpesvirus simple (Wigler et al., Cell 11: 223-32 (1977)) y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., Cell 22: 817-23 (1990)) que pueden emplearse en células tk.sup. o aprt.sup., respectivamente. También pueden usarse la resistencia a antimetabolito, antibiótico o herbicida como base para la selección, por ejemplo, dhfr que confiere resistencia a metotrexato (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77: 3567-70 (1980)); npt, que confiere resistencia a aminoglucósidos, neomicina y G-418 (Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150: 1-14 (1981)); y als o pat, que confieren resistencia a clorsulfurón y fosfinotricina acetiltransferasa, respectivamente (Murry, supra). Se han descrito genes seleccionables adicionales, por ejemplo, trpB, que permite a las células utilizar indol en lugar de triptófano, o hisD, que permite a las células utilizar histinol en lugar de histidina (Hartman y Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 8047-51 (1988)). Recientemente, el uso de marcadores visibles ha ganado popularidad con marcadores tales como antocianinas, \beta-glucuronidasa y su sustrato GUS y luciferasa y su sustrato luciferina, usados ampliamente no sólo para identificar transformantes, sino también para cuantificar la cantidad de expresión de proteína transitoria o estable atribuible a un sistema de vector específico (Rhodes et al., Methods Mol. Biol. 55: 121-131 (1995)).
Aunque la presencia/ausencia de expresión del gen marcador sugiere que el gen de interés está también presente, su presencia y expresión pueden tener que confirmarse. Por ejemplo, si la secuencia que codifica un polipéptido se inserta en una secuencia de gen marcador, las células recombinantes que contienen secuencias pueden identificarse por la ausencia de función de gen marcador. Como alternativa, puede disponerse un gen marcador en serie con una secuencia de codificación de polipéptido bajo el control de un solo promotor. La expresión del gen marcador en respuesta a la inducción o selección indica habitualmente la expresión del gen en serie también.
Como alternativa, las células hospedadoras que contienen y expresan una secuencia polinucleotídica deseada pueden identificarse mediante una variedad de procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Estos procedimientos incluyen, pero sin limitación, hibridaciones ADN-ADN o ADN-ARN y técnicas de bioensayo de proteína o inmunoensayo que incluyen tecnología basada en membrana, disolución o chip para la detección y/o cuantificación de ácido nucleico o proteína.
Son conocidas en la materia una variedad de protocolos para detectar y medir la expresión de productos codificados por polinucleótidos, usando anticuerpos policlonales o monoclonales específicos del producto. Los ejemplos incluyen ensayo de inmunosorción ligado a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Puede preferirse un inmunoensayo basado en anticuerpo monoclonal de dos sitios que utiliza anticuerpos monoclonales reactivos con dos epítopos no interferentes en un polipéptido dado para algunas aplicaciones, pero puede emplearse también un ensayo de unión competitiva. Se describen estos y otros ensayos, entre otros lugares, en Hampton et al., "Serological Methods, a Laboratory Manual" (1990) y Maddox et al., J. Exp. Med. 158: 1211-1216 (1983).
Son conocidas una amplia variedad de marcadores y técnicas de conjugación por los expertos en la materia y pueden usarse en diversos ensayos de ácido nucleico y aminoácido. Los medios para producir sondas de hibridación o PCR marcadas para detectar secuencias relacionadas con polinucleótidos incluyen oligomarcaje, traslado de muesca, marcaje terminal o amplificación por PCR usando un nucleótido marcado. Como alternativa, las secuencias, o cualquier porción de las mismas, pueden clonarse en un vector para la producción de una sonda de ARNm. Dichos vectores son conocidos en la materia, están comercialmente disponibles y pueden usarse para sintetizar muestras de ARN in vitro mediante la adición de una ARN polimerasa apropiada tal como T7, T3 o SP6 y nucleótidos marcados. Estos procedimientos pueden realizarse usando una variedad de kits comercialmente disponibles. Las moléculas marcadoras o indicadores adecuados que pueden usarse incluyen radionucleidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogénicos, así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares.
Las células hospedadoras transformadas con una secuencia polinucleotídica de interés pueden cultivarse en condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína del cultivo celular. La proteína producida por una célula recombinante puede secretarse o estar contenida intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o el vector usados. Como se entenderá por los expertos en la materia, los vectores de expresión que contienen polinucleótidos de la invención pueden diseñarse para contener secuencias señal que dirijan la secreción del polipéptido codificado a través de una membrana celular procariótica o eucariótica. Pueden usarse otras construcciones recombinantes para unir secuencias que codifican un polipéptido de interés con una secuencia nucleotídica que codifica un dominio polipeptídico que facilitará la purificación de proteínas solubles. Dichos dominios facilitadores de la purificación incluyen, pero sin limitación, péptidos quelantes de metal tales como módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación sobre metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de purificación por extensión/afinidad FLAGS (Immunex Corp., Seattle, Wash.). La inclusión de secuencias ligadoras escindibles tales como aquellas específicas de factor XA o enterocinasa (Invitrogen. San Diego, Calif.) entre el dominio de purificación y el polipéptido codificado puede usarse para facilitar la purificación. Uno de dichos vectores de expresión proporciona la expresión de una proteína de fusión que contiene un polipéptido de interés y un ácido nucleico que codifica 6 residuos de histidina que preceden a una tiorredoxina o sitio de escisión de enterocinasa. Los residuos de histidina facilitan la purificación en IMIAC (cromatografía de afinidad por ión metálico inmovilizado) como se describe en Porath et al., Prot. Exp. Purif. 3: 263-281 (1992), mientras que el sitio de escisión de enterocinasa proporciona un medio para purificar el polipéptido deseado a partir de la proteína de fusión. Se proporciona una discusión de vectores que contienen proteínas de fusión en Kroll et al., DNA Cell Biol. 12: 441-453 (1993)).
Además de los métodos de producción recombinante de la invención, los polipéptidos de la invención y fragmentos de los mismos pueden producirse mediante síntesis peptídica directa usando técnicas en fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963)). La síntesis de proteína puede efectuarse usando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada puede conseguirse, por ejemplo, usando el sintetizador peptídico Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer). Como alternativa, pueden sintetizarse químicamente diversos fragmentos por separado y combinarse usando métodos químicos para producir la molécula completa.
Técnicas de suministro de polinucleótido in vivo
En realizaciones adicionales, se introducen constructos genéticos que comprenden uno o más de los polinucleótidos de la invención en células in vivo. Esto puede conseguirse usando cualquiera de una variedad de enfoques bien conocidos, varios de los cuales se exponen a continuación con fines de ilustración.
1. Adenovirus
Uno de los métodos preferidos para el suministro in vivo de una o más secuencias de ácido nucleico implica el uso de un vector de expresión de adenovirus. "Vector de expresión de adenovirus" pretende incluir aquellos constructos que contienen secuencias de adenovirus suficientes para (a) apoyar el empaquetamiento del constructo y (b) expresar un polinucleótido que se ha clonado en el mismo en orientación de codificación o no codificación. Por supuesto, en el contexto de un constructo de no codificación, la expresión no requiere que el producto génico se
sintetice.
El vector de expresión comprende una forma modificada por ingeniería genética de un adenovirus. El conocimiento de la organización genética del adenovirus, un virus de ADN bicatenario lineal de 36 kb, permite la sustitución de grandes trozos de ADN adenovírico por secuencias ajenas de hasta 7 kb (Grunhaus y Horwitz, 1992). En contraposición con los retrovirus, la infección adenovírica de células hospedadoras no da como resultado la integración cromosómica, porque el ADN adenovírico puede replicarse de manera episómica sin genotoxicidad potencial. También, los adenovirus son estructuralmente estables y no se ha detectado redistribución genómica después de una extensa amplificación. Los adenovirus pueden infectar virtualmente todas las células epiteliales independientemente de su etapa de ciclo celular. Hasta ahora, la infección adenovírica parece estar ligada sólo a enfermedad leve tal como enfermedad respiratoria aguda en seres humanos.
El adenovirus es particularmente adecuado para uso como vector de transferencia génica debido a su genoma de tamaño medio, facilidad de manipulación, alta titulación, amplio intervalo de células diana y alta infectividad. Ambos extremos del genoma vírico contienen 100-200 repeticiones invertidas de pares de bases (ITR) que son elementos en cis necesarios para la replicación y empaquetamiento de ADN vírico. Las regiones temprana (E) y tardía (L) del genoma contienen diferentes unidades de transcripción que están divididas por el inicio de replicación del ADN vírico. La región E1 (E1A y E1B) codifica proteínas responsables de la regulación de la transcripción del genoma vírico y unos pocos genes celulares. La expresión de la región E2 ((E2A y E2B) da como resultado la síntesis de proteínas para la replicación del ADN vírico. Estas proteínas están implicadas en la replicación de ADN, la expresión de gen tardío y el bloqueo de células hospedadoras (Renan, 1990). Los productos de los genes tardíos, incluyendo la mayoría de las proteínas de cápsida vírica, se expresan sólo después de un procesamiento significativo de un solo transcrito primario procedente del promotor tardío principal (MLP). El MLP (localizado a 16,8 u.m.) es particularmente eficaz durante la fase tardía de la infección, y todos los ARNm procedentes de este promotor poseen una secuencia líder tripartita 5' (TPL) que los hace ARNm preferidos para traducción.
\newpage
En un sistema actual, se generan adenovirus recombinantes a partir de recombinación homóloga entre un vector lanzadera y un vector provírico. Debido a la posible recombinación entre dos vectores províricos, pueden generarse adenovirus de tipo silvestre en este proceso. Por lo tanto, es crítico aislar un solo clon de virus de una placa individual y examinar su estructura genómica.
La generación y propagación de los vectores adenovíricos actuales, que son deficientes de replicación, depende de una estirpe celular auxiliar única, designada 293, que se transformó a partir de células de riñón embriónicas humanas mediante fragmentos de ADN de Ad5 y que expresa constitutivamente proteínas E1 (Graham et al., 1977). Puesto que la región E3 es prescindible en el genoma de adenovirus (Jones y Shenk, 1978), los vectores adenovíricos actuales, con la ayuda de células 293, portan ADN ajeno en las regiones E1, D3 o ambas (Graham y Prevec, 1991). En la naturaleza, los adenovirus pueden empaquetar aproximadamente un 105% del genoma de tipo silvestre (Ghosh-Choudhury et al., 1987), proporcionando capacidad para aproximadamente 2 kb extra de ADN. Combinado con las aproximadamente 5,5 kb de ADN que son reemplazables en las regiones E1 y E3, la capacidad máxima del vector adenovírico actual es menor de 7,5 kb, o aproximadamente un 15% de la longitud total del vector. Más de un 80% del genoma vírico del adenovirus permanece en la cadena principal del vector y es la fuente de citotoxicidad portada por vector. También la deficiencia de replicación del virus con E1 eliminado es incompleta. Por ejemplo, se ha observado pérdida de expresión génica vírica con los vectores actualmente disponibles a altas multiplicidades de infección (MOI) (Mulligan, 1993).
Las estirpes celulares auxiliares pueden derivar de células humanas tales como células de riñón embriónicas humanas, células musculares, células hematopoyéticas u otras células mesenquimáticas o epiteliales embriónicas humanas. Como alternativa, las células auxiliares pueden derivar de células de otras especies de mamífero que toleran adenovirus humanos. Dichas células incluyen, por ejemplo, células Vero u otras células mesenquimáticas o epiteliales embriónicas de mono. Como se indica anteriormente, la estirpe celular auxiliar actualmente preferida es 293.
Recientemente, Racher et al. (1995) dieron a conocer métodos mejorados para cultivar células 293 y propagar adenovirus. En un formato, se cultivan agregados de células naturales inoculando células individuales en matraces de centrifugación siliconizados de 1 litro (Techne, Cambridge, RU) que contienen 100-200 ml de medio. Después de agitar a 40 rpm, se estima la viabilidad celular con azul de tripano. En otro formato, se emplean microportadores Fibra-Cel (Bibby Sterlin, Stone, RU) (5 g/l) del modo siguiente. Se añade un inóculo celular, resuspendido en 5 ml de medio, al portador (50 ml) en un matraz Erlenmeyer de 250 ml y se deja estacionario, con agitación ocasional, durante 1 a 4 h. Se reemplaza entonces el medio por 50 ml de medio reciente y se inicia la agitación. Para la producción de virus, se dejan crecer las células hasta aproximadamente un 80% de confluencia, después de dicho tiempo se reemplaza el medio (hasta 25% del volumen final) y se añade adenovirus a una MOI de 0,05. Se dejan los cultivos estacionarios durante una noche, después de lo cual se aumenta el volumen al 100% y se comienza la agitación durante otras 72 h.
Aparte del requisito de que el vector adenovírico sea defectivo de replicación, o al menos condicionalmente defectivo, no se cree la naturaleza del vector adenovírico sea crucial para la práctica exitosa de la invención. El adenovirus puede ser cualquiera de los 42 serotipos o subgrupos A-F diferentes conocidos. El adenovirus de tipo 5 del subgrupo C es el material de partida preferido para obtener un vector adenovírico defectivo de replicación condicional para uso en la presente invención, puesto que el adenovirus de tipo 5 es un adenovirus humano sobre el que se conoce una gran cantidad de información bioquímica y genética, y se ha usado históricamente para la mayoría de construcciones que emplean adenovirus como vector.
Como se afirma anteriormente, el vector típico según la presente invención es defectivo de replicación y no tendrá una región E1 adenovírica. Por tanto, lo más conveniente será introducir el polinucleótido que codifica el gen de interés en la posición de la que se han eliminado las secuencias de codificación de E1. Sin embargo, la posición de la inserción del constructo en las secuencias adenovíricas no es crítica para la invención. El polinucleótido que codifica el gen de interés puede insertarse también en lugar de la región E3 eliminada en vectores de reemplazo de E3 como se describe por Karlsson et al. (1986) o en la región E4 donde una estirpe celular auxiliar o virus auxiliar complementa el defecto de E4.
El adenovirus es fácil de cultivar y manipular y exhibe un amplio intervalo hospedador in vitro e in vivo. Este grupo de virus puede obtenerse con altas titulaciones, por ejemplo, 10^{9}-10^{11} unidades de formación de placa por ml, y son altamente infecciosos. El ciclo vital del adenovirus no requiere la integración en el genoma de la célula hospedadora. Los genes ajenos suministrados por los vectores adenovíricos son episómicos, y por lo tanto, tienen una baja genotoxicidad para células hospedadoras. No se han reseñado efectos secundarios en estudios de vacunación con adenovirus de tipo silvestre (Couch et al., 1963; Top et al., 1971), demostrando su seguridad y potencial terapéutico como vector de transferencia génica in vivo.
Los vectores adenovíricos se han usado en la expresión génica eucariótica (Levrero et al., 1991; Gómez-Foix et al., 1992) y el desarrollo de vacunas (Grunhaus y Horwitz, 1992; Graham y Prevec, 1992). Recientemente, estudios animales han sugerido que podrían usarse adenovirus recombinantes para terapia génica (Stratford-Perricaudet y Perricaudet, 1991; Stratford-Perricaudet et al., 1990; Rich et al., 1993). Los estudios para administrar adenovirus recombinantes a diferentes tejidos incluyen instilación traqueal (Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1992), inyección muscular (Ragot et al., 1993), inyecciones intravenosas periféricas (Herz y Gerard, 1993) e inoculación estereotáctica en el cerebro (Le Gal La Salle et al., 1993).
2. Retrovirus
Los retrovirus son un grupo de virus de ARN monocatenarios caracterizados por la capacidad de convertir su ARN en ADN bicatenario en células infectadas mediante un proceso de transcripción inversa (Coffin, 1990). El ADN resultante se integra establemente entonces en cromosomas celulares en forma de provirus y dirige la síntesis de proteínas víricas. La integración da como resultado la retención de las secuencias génicas víricas en la célula receptora y sus descendientes. El genoma retrovírico contiene tres genes: gag, pol y env, que codifican proteínas de cápsida, enzima polimerasa y componentes de cubierta, respectivamente. Una secuencia encontrada cadena arriba del gen gag contiene una señal de empaquetamiento del genoma en viriones. Están presentes dos secuencias repetidas terminales largas (LTR) en los extremos 5' y 3' del genoma vírico. Estas contienen secuencias promotoras fuertes y potenciadoras y son también necesarias para la integración en el genoma de la célula hospedadora (Coffin, 1990).
Para construir un vector retrovírico, se inserta un ácido nucleico que codifica una o más secuencias oligonucleotídicas o polinucleotídicas de interés en el genoma vírico en lugar de ciertas secuencias víricas para producir un virus que es defectivo de replicación. Para producir viriones, se construye una estirpe celular de empaquetamiento que contiene los genes gag, pol y env pero sin LTR ni componentes de empaquetamiento (Mann et al., 1983). Cuando se introduce un plásmido recombinante que contiene un ADNc, junto con las LTR retrovíricas y las secuencias de empaquetamiento, en esta estirpe celular (mediante precipitación con fosfato de calcio, por ejemplo), las secuencias de empaquetamiento permiten al transcrito de ARN del plásmido recombinante empaquetarse en partículas víricas, que se secretan entonces al medio de cultivo (Nicolas y Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). Se recoge entonces el medio que contiene los retrovirus recombinantes, opcionalmente concentrado, y se usa para transferencia génica. Los vectores retrovíricos son capaces de infectar una amplia variedad de tipos celulares. Sin embargo, la integración y expresión estables requieren la división de células hospedadoras (Paskind et al., 1975).
Se ha desarrollado recientemente un enfoque novedoso diseñado para permitir una orientación específica de vectores retrovíricos basado en la modificación química de un retrovirus mediante la adición química de residuos de lactosa a la cubierta vírica. Esta modificación podría permitir la infección específica de hepatocitos mediante receptores de sialoglucoproteína.
Se ha diseñado un enfoque diferente para la orientación de retrovirus recombinantes en el que se usaron anticuerpos biotinilados contra una proteína de cubierta retrovírica y contra un receptor celular específico. Se acoplaron los anticuerpos mediante los componentes de biotina usando estreptavidina (Roux et al., 1989). Usando anticuerpos contra antígenos del complejo principal de histocompatibilidad de clase I y clase II, se demostró la infección de una variedad de células humanas que portan esos antígenos de superficie con un virus ecotrópico in vitro (Roux et al., 1989).
3. Virus adenoasociados
El AAV (Ridgeway, 1988; Hermonat y Muzycska, 1984) es un parovirus descubierto como contaminación de disoluciones madre adenovíricas. Es un virus ubicuo (los anticuerpos están presentes en el 85% de la población humana de los EE.UU.) que no se ha ligado a ninguna enfermedad. Se clasifica también como dependovirus, porque sus replicaciones dependen de la presencia de un virus auxiliar tal como adenovirus. Se han aislado cinco serotipos, de los cuales el AAV-2 es el mejor caracterizado. El AAV tiene un ADN lineal monocatenario que está encapsidado en las proteínas de cápsida VP1, VP2 y VP3 formando un virión icosaédrico de 20 a 24 nm de diámetro (Muzyczka y McLaughlin, 1988).
El ADN de AAV es de aproximadamente 4,7 kb de longitud. Contiene dos marcos abiertos de lectura y está flanqueado por dos ITR. Hay dos genes principales en el genoma de AAV: rep y cap. El gen rep codifica proteínas responsables de replicaciones víricas, mientras que cap codifica la proteína de cápsida VP1-3. Cada ITR forma una estructura de horquilla en forma de T. Estas repeticiones terminales son los únicos componentes en cis esenciales de AAV para la integración cromosómica. Por lo tanto, el AAV puede usarse como vector con todas las secuencias de codificación víricas eliminadas y reemplazadas por el módulo de genes para suministro. Se han identificado tres promotores víricos y nombrado p5, p19 y p40, según su posición en el mapa. La transcripción a partir de p5 y p19 da como resultado la producción de proteínas rep, y la transcripción de p40 produce las proteínas de cápsida (Hermonat y Muzyczka, 1984).
Hay varios factores que alentaron a los investigadores a estudiar la posibilidad de usar rAAV como vector de expresión. Uno es que los requisitos para suministrar un gen para integrar en el cromosoma hospedador son sorprendentemente pocos. Es necesario tener las ITR de 145 pb, que son sólo un 6% del genoma de AAV. Esto deja espacio en el vector para ensamblar una inserción de ADN de 4,5 kb. Aunque esta capacidad de carga puede evitar que AAV suministre genes grandes, es ampliamente adecuada para suministrar los constructos de no codificación de la presente invención.
El AAV es también una buena elección de vehículo de suministro debido a su seguridad. Hay un mecanismo de rescate relativamente complicado: no sólo los adenovirus de tipo silvestre, sino también los genes de AAV son necesarios para movilizar el rAAV. Igualmente, el AAV no es patogénico y no está asociado a ninguna enfermedad. La eliminación de secuencias de codificación víricas minimiza las reacciones inmunitarias ante la expresión génica vírica y, por lo tanto, el rAAV no provoca una respuesta inflamatoria.
4. Otros vectores víricos como constructos de expresión
Pueden emplearse otros vectores víricos como constructos de expresión en la presente invención para el suministro de secuencias oligonucleotídicas o polinucleotídicas a una célula hospedadora. Pueden emplearse vectores derivados de virus tales como virus Vaccinia (Ridgeway, 1988; Coupar et al., 1988), lentivirus, poliovirus y herpesvirus. Ofrecen varios rasgos atractivos para diversas células de mamífero (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990).
Con el reciente reconocimiento de los virus de hepatitis B defectivos, se ha conseguido un nuevo conocimiento de la relación entre estructura y función de diferentes secuencias víricas. Los estudios in vitro mostraron que los virus podían retener la capacidad de empaquetamiento dependiente del auxiliar y la transcripción inversa a pesar de la eliminación de hasta el 80% de su genoma (Horwich et al., 1990). Esto sugería que podían reemplazarse grandes porciones del genoma por material genético ajeno. El hepatotropismo y la persistencia (integración) eran propiedades particularmente atractivas para la transferencia génica dirigida al hígado. Chang et al. (1991) introdujeron el gen de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) en genoma del virus de hepatitis B de pato en lugar de las secuencias de codificación de polimerasa, superficie y presuperficie. Se cotransfectó con virus de tipo silvestre en una estirpe celular de hepatoma aviar. Se usaron medios de cultivo que contenían altas titulaciones del virus recombinante para infectar hepatocitos de pato joven primarios. Se detectó la expresión génica de CAT estable durante al menos 24 días después de la transfección (Chang et al., 1991).
5. Vectores no víricos
Para efectuar la expresión de las secuencias oligonucleotídica o polinucleotídica de la presente invención, el constructo de expresión debe suministrarse a una célula. Este suministro puede conseguirse in vitro, como en procedimientos de laboratorio para transformar estirpes celulares, o in vivo o ex vivo, como en el tratamiento de ciertos estados patológicos. Como se describe anteriormente, es un mecanismo preferido para el suministro mediante infección vírica en el que el constructo de expresión se encapsula en una partícula vírica infecciosa.
Una vez se ha suministrado el constructo de expresión a la célula, puede colocarse y expresarse en diferentes sitios el ácido nucleico que codifica las secuencias oligonucleotídicas o polinucleotídicas. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el constructo puede integrarse establemente en el genoma de la célula. Esta integración puede estar en la localización y orientación específica mediante recombinación homóloga (reemplazo génico) o puede integrarse en una localización aleatoria no específica (aumento génico). En aún otras realizaciones adicionales, el ácido nucleico puede mantenerse establemente en la célula en forma de un fragmento episómico separado de ADN. Dichos segmentos de ácido nucleico o "episomas" codifican secuencias suficientes para permitir el mantenimiento y replicación independientemente o sincronizados con el ciclo de la célula hospedadora. Cómo se suministra el constructo de expresión a una célula y dónde permanece en la célula el ácido nucleico depende del tipo de constructo de expresión empleado.
En ciertas realizaciones de la invención, el constructo de expresión que comprende una o más secuencias oligonucleotídicas o polinucleotídicas puede consistir simplemente en ADN recombinante desnudo o plásmidos. La transferencia del constructo puede efectuarse mediante cualquiera de los métodos mencionados anteriormente que permeabilizan física o químicamente la membrana celular. Esto es particularmente aplicable para la transferencia in vitro, pero puede aplicarse también al uso in vivo. Dubensky et al. (1984) inyectaron exitosamente ADN de poliomavirus en forma de precipitados de fosfato de calcio en el hígado y bazo de ratones adultos y recién nacidos, demostrando una replicación vírica activa e infección aguda. Benvenisty y Reshef (1986) demostraron también que la inyección intraperitoneal directa de plásmidos precipitados con fosfato de calcio da como resultado la expresión de los genes transfectados. Se prevé que el ADN que codifica un gen de interés pueda transferirse también de manera similar in vivo y expresar el producto génico.
Otra realización de la invención para transferir un constructo de expresión de ADN desnudo a células puede implicar el bombardeo de partículas. Este método depende de la capacidad de acelerar microproyectiles recubiertos con ADN a alta velocidad, permitiéndoles perforar las membranas celulares y entrar en las células sin matarlas (Klein et al., 1987). Se han desarrollado varios dispositivos para acelerar partículas pequeñas. Uno de dichos dispositivos se basa en una descarga de alto voltaje para generar una corriente eléctrica, que a su vez proporciona la fuerza motriz (Yang et al., 1990). Los microproyectiles usados han consistido en sustancias biológicamente inertes tales como perlas de wolframio u oro.
Se han bombardeado in vivo los órganos seleccionados, incluyendo hígado, piel y tejido muscular de ratas y ratones (Yang et al., 1990; Zelenin et al., 1991). Esto puede requerir la exposición quirúrgica del tejido o células para eliminar cualquier tejido intermedio entre la pistola y el órgano diana, concretamente, tratamiento ex vivo. De nuevo, el ADN que codifica un gen particular puede suministrarse mediante este método y seguir incorporado a la presente
invención.
Composiciones polipeptídicas
La presente invención proporciona, en otros aspectos, composiciones polipeptídicas.
Pueden identificarse generalmente las porciones inmunogénicas usando técnicas bien conocidas, tales como las resumidas en Paul, "Fundamental Immunology", 3ª ed., 243-247 (1993) y referencias citadas en el mismo. Dichas técnicas incluyen examen en polipéptidos de la capacidad de reaccionar con anticuerpos específicos de antígeno, antisueros y/o estirpes de linfocitos T o clones. Como se usa en la presente memoria, los antisueros y anticuerpos son "específicos de antígeno" si se unen específicamente a un antígeno (concretamente, reaccionan con la proteína en un ELISA u otro inmunoensayo, y no reaccionan detectablemente con proteínas no relacionadas). Dichos antisueros y anticuerpos pueden prepararse como se describe en la presente memoria y usando técnicas bien conocidas. Una porción inmunogénica de una proteína de Mycobacterium sp. es una porción que reacciona con dichos antisueros y/o linfocitos T a un nivel que no es sustancialmente menor que la reactividad del polipéptido completo (por ejemplo, en un ensayo ELISA y/o de reactividad de linfocitos T). Dichas porciones inmunogénicas pueden reaccionar en dichos ensayos a un nivel que es similar a o mayor que la reactividad del polipéptido completo. Dichos exámenes pueden efectuarse generalmente usando métodos conocidos por los expertos en la materia, tales como los descritos en Harlow y Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual" (1988). Por ejemplo, puede inmovilizarse un polipéptido sobre un soporte sólido y ponerse en contacto con sueros del paciente para permitir la unión de los anticuerpos en los sueros al polipéptido inmovilizado. Los sueros no unidos pueden retirarse entonces y detectarse los anticuerpos unidos usando, por ejemplo, proteína A marcada con ^{125}I.
Los polipéptidos pueden prepararse usando cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas. Los polipéptidos recombinantes codificados por secuencias de ADN como se describen anteriormente pueden prepararse fácilmente a partir de secuencias de ADN usando cualquiera de una variedad de vectores de expresión conocidos por los expertos en la materia. Puede conseguirse la expresión en cualquier célula hospedadora apropiada que se ha transformado o transfectado con un vector de expresión que contiene una molécula de ADN que codifica un polipéptido recombinante. Las células hospedadoras adecuadas incluyen procariotas, levaduras y células eucarióticas superiores tales como células de mamífero y células de planta. Preferiblemente, las células hospedadoras empleadas son E. coli, levadura o una estirpe celular de mamífero tal como COS o CHO. Pueden concentrarse en primer lugar los sobrenadantes de sistemas de hospedador/vector adecuados que secretan proteína o polipéptido recombinante en el medio de cultivo usando un filtro comercialmente disponible. Después de la concentración, puede aplicarse el concentrado a una matriz de purificación adecuada tal como una matriz de afinidad o una resina de intercambio iónico. Finalmente, pueden emplearse una o más etapas de HPLC inversa para purificar adicionalmente un polipéptido recombinante.
Los polipéptidos de la invención, fragmentos inmunogénicos de los mismos y otras variantes que tienen menos de aproximadamente 100 aminoácidos, y generalmente menos de aproximadamente 50 aminoácidos, pueden generarse también mediante medios sintéticos, usando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, dichos polipéptidos pueden sintetizarse usando cualquiera de las técnicas en fase sólida disponibles comercialmente, tales como el método de síntesis en fase sólida de Merrifield, en el que se añaden secuencialmente aminoácidos a una cadena aminoacídica creciente. Véase Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2146 (1963). El equipo para la síntesis automatizada de polipéptidos está comercialmente disponible de suministradores tales como Perkin Elmer/Applied BioSystems Division (Foster City, CA), y puede hacerse funcionar según las instrucciones del fabricante.
En ciertas realizaciones específicas, un polipéptido puede ser una proteína de fusión como se describe en la presente memoria, o comprende al menos una proteína de fusión como se describe en la presente memoria y una secuencia no relacionada.
Un asociado de fusión puede, por ejemplo, ayudar a proporcionar epítopos auxiliares de T (un asociado de fusión inmunitario), preferiblemente epítopos auxiliares de T reconocidos por seres humanos, o puede ayudar a expresar la proteína (un potenciador de la expresión) a rendimientos mayores que la proteína recombinante nativa. Ciertos asociados de fusión preferidos son asociados de fusión tanto inmunitarios como potenciadores de la expresión. Pueden seleccionarse otros asociados de fusión para aumentar la solubilidad de la proteína o para posibilitar orientar la proteína a los compartimentos intracelulares deseados. Aún otros asociados de fusión incluyen marcadores de afinidad, que facilitan la purificación de la proteína.
Las proteínas de fusión pueden prepararse generalmente usando técnicas estándar, incluyendo la conjugación química. Preferiblemente, se expresa una proteína de fusión como proteína recombinante, que permite la producción de niveles aumentados respecto a una proteína no fusionada en un sistema de expresión. Brevemente, las secuencias de ADN que codifican los componentes polipeptídicos pueden ensamblarse separadamente, y ligarse en un vector de expresión apropiado. El extremo 3' de la secuencia de ADN que codifica un componente polipeptídico está ligado, con o sin un ligador peptídico, al extremo 5' de una secuencia de ADN que codifica un segundo componente polipeptídico de modo que los marcos de lectura de las secuencias estén en fase. Esto permite la traducción en una sola proteína de fusión que retiene la actividad biológica de ambos componentes polipeptídicos.
Puede emplearse una secuencia ligadora peptídica para separar el primer y segundo componentes polipeptídicos por una distancia suficiente para asegurar que cada polipéptido se pliega en sus estructuras secundaria y terciaria. Dicha secuencia ligadora peptídica se incorpora a la proteína de fusión usando técnicas estándar bien conocidas en la materia. Las secuencias ligadoras peptídicas adecuadas pueden elegirse basándose en los siguientes factores: (1) su capacidad de adoptar una conformación extendida flexible; (2) su incapacidad de adoptar una estructura secundaria que pudiera interaccionar con epítopos funcionales en el primer y segundo polipéptidos; y (3) la falta de residuos hidrófobos o cargados que podrían reaccionar con los epítopos funcionales polipeptídicos. Las secuencias ligadoras peptídicas preferidas contienen residuos de Gly, Asn y Ser. Pueden usarse también otros residuos aminoacídicos neutros tales como Thr y Ala en la secuencia ligadora. Las secuencias aminoacídicas que pueden emplearse con provecho como ligadores incluyen las dadas a conocer en Maratea et al., Gene 40: 39-46 (1985); Murphy et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 83: 8258-8262 (1986); patentes de EE.UU. nº 4.935.233 y patente de EE.UU. nº 4.751.180. La secuencia ligadora puede ser generalmente de 1 a aproximadamente 50 aminoácidos de longitud. Las secuencias ligadoras no son necesarias cuando el primer y segundo polipéptidos tienen regiones aminoacídicas N-terminales no esenciales que pueden usarse para separar los dominios funcionales y prevenir la interferencia estérica.
Las secuencias de ADN ligadas están ligadas operativamente a elementos reguladores transcripcionales o traduccionales adecuados. Los elementos reguladores responsables de la expresión de ADN están localizados sólo 5' de la secuencia de ADN que codifica los primeros polipéptidos. De forma similar, los codones de terminación necesarios para terminar la traducción y las señales de terminación de la transcripción están presentes sólo en 3' de la secuencia de ADN que codifica el segundo polipéptido.
Se proporcionan también proteínas de fusión. Dichas proteínas comprenden un polipéptido como se describe en la presente memoria junto con una proteína inmunogénica no relacionada. Preferiblemente, la proteína inmunogénica es capaz de provocar una respuesta de evocación. Los ejemplos de dichas proteínas incluyen proteínas de tétanos, tuberculosis y hepatitis (véase, por ejemplo, Stoute et al., New Engl. J. Med. 336: 86-91 (1997)).
En las realizaciones preferidas, un asociado de fusión inmunitario deriva de proteína D, una proteína de superficie de la bacteria gramnegativa Haemophilus influenzae B (documento WO 91/18926). Preferiblemente, un derivado de proteína D comprende aproximadamente el primer tercio de la proteína (por ejemplo, los primeros 100-110 aminoácidos N-terminales) y un derivado de proteína D puede estar lipidado. En ciertas realizaciones preferidas, los primeros 109 residuos de un asociado de fusión de lipoproteína D están incluidos en el extremo N para proporcionar al polipéptido epítopos de linfocitos T exógenos adicionales y para aumentar el nivel de expresión en E. coli (funcionando por tanto con un potenciador de la expresión). La cola lipídica asegura una presentación óptima del antígeno a células presentadoras de antígeno. Otros asociados de fusión incluyen la proteína no estructural del virus de la gripe NS1 (hemaglutinina). Típicamente, se usan los 81 aminoácidos N-terminales, aunque pueden usarse diferentes fragmentos que incluyan epítopos auxiliares de T.
En otra realización, el asociado de fusión inmunitario es la proteína conocida como LYTA, o una porción de la misma (preferiblemente una porción C-terminal). La LYTA deriva de Streptococcus pneumoniae, que sintetiza una N-acetil-L-alanina amidasa conocida como amidasa LYTA (codificada por el gen LytA; Gene 43: 265-292 (1986)). La LYTA es una autolisina que degrada específicamente ciertos enlaces en la cadena principal de peptidoglicano. El dominio C-terminal de la proteína LYTA es responsable de la afinidad por la colina o algunos análogos de colina tales como DEAE. Esta propiedad se ha explotado para el desarrollo de plásmidos que expresan C-LYTA de E. coli útiles para la expresión de proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento C-LYTA en el extremo amino (véase Biotechnology 10: 795-798 (1992)). En una realización preferida, puede incorporarse una porción repetida de LYTA a una proteína de fusión. Se encuentra una porción repetida en la región C-terminal a partir del residuo 178. Una porción repetida particularmente preferida incorpora los residuos 188-305.
En general, se aíslan los polipéptidos (incluyendo proteínas de fusión) y polinucleótidos como se describen en la presente memoria. Un polipéptido o polinucleótido "aislado" es aquel que se retira de su entorno original. Por ejemplo, una proteína de origen natural se aísla si se separa de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural. Preferiblemente, dichos polipéptidos son al menos aproximadamente un 90% puros, más preferiblemente al menos aproximadamente un 95% puros y lo más preferiblemente al menos aproximadamente un 99% puros. Un polinucleótido se considera aislado, por ejemplo, si se clona en un vector que no es parte del entorno natural.
Linfocitos T
Los linfocitos T pueden aislarse de médula ósea, sangre periférica o una fracción de médula ósea o sangre periférica de un paciente usando un sistema de separación celular comercialmente disponible tal como Isolex^{TM} System, disponible en Nexell Therapeutics, Inc. (Irvine, CA; véanse también la patente de EE.UU. nº 5.240.856; patente de EE.UU. nº 5.215.926; documentos WO 89/06280; WO 91/16116 y WO 92/07243). Como alternativa, los linfocitos T pueden derivar de estirpes o cultivos celulares de seres humanos relacionados o no relacionados o mamíferos no humanos.
Los linfocitos T pueden estimularse con un polipéptido de la invención, un polinucleótido que codifica dicho polipéptido y/o una célula presentadora de antígeno (CPA) que expresa dicho polipéptido. Dicha estimulación se efectúa en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la generación de linfocitos T que sean específicos del polipéptido. Preferiblemente, el polipéptido o polinucleótido está presente en un vehículo de suministro, tal como una microesfera, para facilitar la generación de linfocitos T específicos.
Los linfocitos T se considera que son específicos de un polipéptido de la invención si los linfocitos T específicamente proliferan, secretan citocinas o matan células diana recubiertas con el polipéptido o expresan un gen que codifica el polipéptido. La especificidad de linfocitos T puede evaluarse usando cualquiera de una variedad de técnicas estándar. Por ejemplo, en un ensayo de liberación de cromo o ensayo de proliferación, un índice de estimulación aumentado más de dos veces de la lisis y/o proliferación en comparación con controles negativos, indica especificidad de linfocitos T. Dichos ensayos pueden efectuarse, por ejemplo, como se describe en Chen et al., Cancer Res. 54: 1065-1070 (1994)). Como alternativa, la detección de la proliferación de linfocitos T puede conseguirse mediante una variedad de técnicas conocidas. Por ejemplo, la proliferación de linfocitos T puede detectarse midiendo una velocidad de síntesis de ADN aumentada (por ejemplo, mediante cultivos de linfocitos T marcados por pulsos con timidina tritiada y midiendo la cantidad de timidina tritiada incorporada al ADN). El contacto con un polipéptido de la invención (100 ng/ml - 100 \mug/ml, preferiblemente 200 ng/ml - 25 \mu/ml) durante 3-7 días debería dar como resultado un aumento de al menos dos veces de la proliferación de linfocitos T. El contacto como se describe anteriormente durante 2-3 horas debería dar como resultado la activación de los linfocitos T, medida usando ensayos de citocina estándar en los que un aumento de dos veces del nivel de liberación de citocina (por ejemplo, TNF o IFN-\gamma) es indicativo de la activación de linfocitos T (véase Coligan et al., Current Protocols in Immunology, vol. 1 (1998)). Los linfocitos T que se han activado en respuesta a un polipéptido, polinucleótido o CPA que expresa polipéptido pueden ser CD4^{+} y/o CD8^{+}. Los linfocitos T específicos de proteína pueden ampliarse usando técnicas estándar.
Los linfocitos T CD4^{+} o CD8^{+} que proliferan en respuesta a un polipéptido, polinucleótido o CPA pueden ampliarse en número in vitro o in vivo. La proliferación de dichos linfocitos T puede conseguirse de una variedad de modos. Por ejemplo, los linfocitos T pueden volver a exponerse a un polipéptido o péptido corto correspondiente a una porción inmunogénica de dicho polipéptido, con o sin la adición de factores de crecimiento de linfocitos T tales como interleucina-2 y/o células estimulantes que sintetizan el polipéptido. Como alternativa, uno o más linfocitos T que proliferan en presencia de la proteína pueden ampliarse en número mediante clonación. Los métodos para clonar células son bien conocidos en la materia e incluyen dilución limitante.
Composiciones farmacéuticas
En realizaciones adicionales, la presente invención se refiere a la formulación de uno o más de los polinucleótidos o polipéptidos dados a conocer en la presente memoria en disoluciones farmacéuticamente aceptables o fisiológicamente aceptables para administración a una célula o un animal, solos o en combinación con una o más de otras modalidades de terapia. Dichas composiciones son también útiles para usos de diagnóstico.
Se entenderá también que, si se desea, el segmento de ácido nucleico o composiciones de ARN, ADN o ANP que expresan un polipéptido como se da a conocer en la presente memoria pueden administrarse en combinación con otros agentes también tales como, por ejemplo, otras proteínas o polipéptidos o diversos agentes farmacéuticamente activos. De hecho, no hay virtualmente límite para los otros componentes que pueden incluirse también, dado que los agentes adicionales no causan un efecto adverso significativo tras el contacto con las células diana o tejidos hospedadores. Por tanto, las composiciones pueden suministrarse junto con diversos otros agentes según sea necesario en un caso particular. Dichas composiciones pueden purificarse a partir de células hospedadoras u otras fuentes biológicas, o como alternativa, pueden sintetizarse químicamente como se describe en la presente memoria. Igualmente, dichas composiciones pueden comprender adicionalmente composiciones de ARN o ADN sustituido o derivatizado.
La formulación de excipientes y disoluciones portadoras farmacéuticamente aceptables es bien conocida por los expertos en la materia, como el desarrollo de regímenes de dosificación y tratamiento adecuados para usar las composiciones particulares descritas en la presente memoria en una variedad de regímenes de tratamiento incluyendo, por ejemplo, administración y formulación oral, parenteral, intravenosa, intranasal e intramuscular.
1. Suministro oral
En ciertas aplicaciones, las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en la presente memoria pueden suministrarse mediante administración oral a un animal. Como tales, estas composiciones pueden formularse con un diluyente inerte o con un portador comestible asimilable, o pueden incluirse en cápsulas de gelatina de cubierta dura o blanda, o pueden comprimirse en comprimidos, o pueden incorporarse directamente al alimento de la dieta.
Los compuestos activos pueden incluso incorporarse a excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares (Mathiowitz et al., 1997; Hwang et al., 1998; patente de EE.UU. 5.641.515; patente de EE.UU. 5.580.579 y patente de EE.UU. 5.792.451.
Los comprimidos, trociscos, píldoras, cápsulas y similares pueden contener también lo siguiente: un aglutinante como goma de tragacanto, goma arábiga, almidón de maíz o gelatina; excipientes tales como fosfato dicálcico; un agente disgregante tal como almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico y similares; un lubricante tal como estearato de magnesio y puede añadirse un agente edulcorante tal como sacarosa, lactosa o sacarina o un agente aromatizante tal como menta piperita, aceite de gaulteria o aroma de cereza. Cuando la forma unitaria de dosificación es una cápsula, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un portador líquido. Pueden estar presentes diversos otros materiales como recubrimientos o para modificar de otro modo la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, los comprimidos, píldoras o cápsulas pueden estar recubiertos con goma laca, azúcar o ambos. Un jarabe o elixir pueden contener el compuesto activo sacarosa como agente edulcorante, metil- y propilparabenos como conservantes, un tinte y aromatizantes tales como aroma de cereza o naranja. Por supuesto, cualquier material usado en la preparación de cualquier forma unitaria de dosificación debe ser farmacéuticamente puro y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, los compuestos activos pueden incorporarse a preparaciones y formulaciones de liberación sostenida.
Típicamente, estas formulaciones pueden contener al menos aproximadamente un 0,1% del compuesto activo o más, aunque el porcentaje de ingrediente(s) activo(s) puede variar, por supuesto, y puede estar convenientemente entre aproximadamente 1 ó 2% y aproximadamente 60 ó 70% o más del peso o volumen de la formulación total. Naturalmente, la cantidad de principio(s) activo(s) en cada composición terapéuticamente útil puede prepararse de tal modo que se obtenga una dosificación adecuada a cualquier dosis unitaria dada del compuesto. Se contemplarán por un experto en la materia de preparar dichas formulaciones farmacéuticas factores tales como solubilidad, biodisponibilidad, semivida biológica, vía de administración, vida útil del producto, así como otras consideraciones farmacológicas y, como tales, pueden ser deseables una variedad de dosificaciones y regímenes de tratamiento.
Para administración oral, las composiciones de la presente invención pueden incorporar como alternativa uno o más excipientes en forma de un colutorio, dentífrico, comprimido bucal, pulverizador oral o formulación administrada por vía oral sublingual. Por ejemplo, puede prepararse un colutorio incorporando el ingrediente activo en la cantidad necesaria a un disolvente apropiado, tal como una disolución de borato de sodio (disolución de Dobell). Como alternativa, el ingrediente activo puede incorporarse a una disolución oral tal como aquella que contiene borato de sodio, glicerina y bicarbonato de potasio, o dispersarse en un dentífrico, o añadirse en una cantidad terapéuticamente eficaz a una composición que puede incluir agua, aglutinantes, abrasivos, agentes aromatizantes, agentes espumantes y humectantes. Como alternativa, las composiciones pueden conformarse en forma de comprimido o disolución que puede disponerse bajo la lengua o disolverse de otro modo en la boca.
2. Suministro inyectable
En ciertas circunstancias, será deseable suministrar las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en la presente memoria por vía parenteral, intravenosa, intramuscular o incluso intraperitoneal como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.543.158; la patente de EE.UU. nº 5.641.515 y la patente de EE.UU. nº 5.399.363. Pueden prepararse disoluciones de los compuestos activos en forma de base libre o sales farmacológicamente aceptables en agua adecuadamente mezcladas con un tensioactivo tal como hidroxipropilcelulosa. Pueden prepararse también dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.
Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones inyectables estériles (patente de EE.UU. 5.466.468).
En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una fácil inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y/o aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede facilitarse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ocasionarse mediante el uso en las composiciones de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Para administración parenteral en una disolución acuosa, por ejemplo, la disolución debe estar adecuadamente tamponada en caso necesario y volverse en primer lugar el diluyente líquido isotónico con suficiente disolución salina o glucosa. Estas disoluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, será conocido por los expertos en la materia un medio acuoso estéril que pueda emplearse a la vista de la presente divulgación. Por ejemplo, puede disolverse una dosificación en 1 ml de disolución isotónica de NaCl y añadirse a 1.000 ml de fluido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio de infusión propuesto (véase, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15ª edición, pág. 1035-1038 y 1570-1580). Aparecerá necesariamente cierta variación en la dosificación dependiendo de la afección del sujeto que se esté tratando. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual. Además, para administración humana, las preparaciones deberían satisfacer los estándares de esterilidad, pirogenicidad y seguridad y pureza generales requeridos por la Oficina de estándares biológicos de la FDA
Las disoluciones inyectables estériles se preparan mediante la incorporación de los compuestos activos en la cantidad necesaria al disolvente apropiado con algunos de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando diversos ingredientes activos esterilizados a un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son técnicas de secado a vacío y liofilización que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una disolución del mismo anteriormente esterilizada por filtración.
Las composiciones dadas a conocer en la presente memoria pueden formularse en forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y las que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres pueden derivar también de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Tras la formulación, se administrarán las disoluciones de manera compatible con la formulación de dosificación y en tal cantidad que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación tales como disoluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármaco y similares.
Como se usa en la presente memoria "portador" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, tampones, disoluciones portadoras, suspensiones, coloides y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la materia. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. Pueden incorporarse también ingredientes activos suplementarios a las composiciones.
La frase "farmacéuticamente estable" designa entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción alérgica o similar adversa cuando se administran a un ser humano. La preparación de una composición acuosa que contiene una proteína como ingrediente activo es bien conocida en la materia. Típicamente, se preparan dichas composiciones en forma de inyectables, en disoluciones o suspensiones líquidas; pueden prepararse también formas sólidas adecuadas para disolución o suspensión en líquido antes de la inyección. La preparación puede también
emulsionarse.
3. Suministro nasal
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden suministrarse mediante pulverizadores intranasales, de inhalación y/u otros vehículos de suministro por aerosol. Se han descrito métodos para suministrar genes, ácidos nucleicos y composiciones peptídicas directamente a los pulmones mediante pulverizadores por aerosol, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 5.756.353 y la patente de EE.UU. nº 5.804.212. Igualmente, son también bien conocidos en las técnicas farmacéuticas el suministro de fármacos usando resinas microparticuladas intranasales (Takenaga et al., 1998) y compuestos de lisofosfatidilglicerol (patente de EE.UU. nº 5.725.871). Igualmente, se describe el suministro transmucoso de fármaco en forma de una matriz de soporte de politetrafluoroetileno en la patente de EE.UU. nº 5.780.045
4. Suministro mediado por liposomas, nanocápsulas y micropartículas
En ciertas realizaciones, los inventores contemplan el uso de liposomas, nanocápsulas, micropartículas, microesferas, partículas lipídicas, vesículas y similares para la introducción de las composiciones de la presente invención en células hospedadoras adecuadas. En particular, las composiciones de la presente invención pueden formularse para suministro encapsuladas en una partícula lipídica, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera o una nanopartícula o similar.
Dichas formulaciones pueden preferirse para la introducción de formulaciones farmacéuticamente aceptables de los ácidos nucleicos o constructos dados a conocer en la presente memoria. La formación y uso de liposomas son generalmente conocidos por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Couvreur et al., 1977; Couvreur, 1988; Lasic, 1998; que describen el uso de liposomas y nanocápsulas en la terapia de antibióticos orientada para infecciones y enfermedades bacterianas intracelulares). Recientemente, se han desarrollado liposomas con estabilidad sérica y semividas de circulación mejoradas (Gabizon y Papahadjopoulos, 1988; Allen y Choun, 1987; patente de EE.UU. nº 5.741.516).
Adicionalmente, se han revisado diversos métodos de liposomas y preparaciones similares a liposomas como portadores de fármaco potenciales (Takakura, 1998; Chandran et al., 1997; Margalit, 1995; patente de EE.UU. nº 5.567.434; patente de EE.UU. nº 5.552.157; patente de EE.UU. nº 5.565.213; patente de EE.UU. nº 5.738.868 y patente de EE.UU. nº 5.795.587.
Los liposomas se han usado exitosamente con una serie de tipos celulares que son normalmente resistentes a la transfección mediante otros procedimientos, incluyendo suspensiones de linfocitos T, cultivos de hepatocitos primarios y células PC 12 (Renneisen et al., 1990; Muller et al., 1990). Además, los liposomas están exentos de las limitaciones de longitud de ADN que son típicas en sistemas de suministro basados en virus. Los liposomas se han usado eficazmente para introducir genes, fármacos (Heath y Martin, 1986; Heath et al., 1986; Balazsovits et al., 1989; Fresta y Puglisi, 1996), agentes radioterapéuticos (Pikul et al., 1987), enzimas (Imaizumi et al., 1990a; Imaizumi et al., 1990b), virus (Faller y Baltimore, 1984), factores de transcripción y efectores alostéricos (Nicolau y Gersonde, 1979) en una variedad de estirpes celulares cultivadas y animales. Además, se han completado varios ensayos clínicos exitosos que examinaban la eficacia del suministro de fármacos mediado por liposomas (López-Berestein et al., 1985a; 1985b; Coune, 1988; Sculier et al., 1988). Además, varios estudios sugieren que el uso de liposomas no está asociado a respuestas autoinmunitarias, toxicidad ni localización gonádica después del suministro sistémico (Mori y Fukatsu, 1992).
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Los liposomas se forman a partir de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas bicapa concéntricas multilamelares (también denominadas vesículas multilamelares (VML). Las VML tienen generalmente diámetros de 25 nm a 4 \mum. La sonicación de VML da como resultado la formación de vesículas unilamelares pequeñas (VUP) con diámetros en el intervalo de 200 a 500 \ring{A}, que contienen una disolución acuosa en el núcleo.
Los liposomas tienen semejanza con membranas celulares y se contemplan para uso relacionado con la presente invención como portadores de las composiciones peptídicas. Son ampliamente adecuados ya que pueden atrapar tanto sustancias solubles en agua como en lípidos, concretamente, en los espacios acuosos y en la bicapa misma, respectivamente. Es posible que los liposomas portadores de fármaco puedan emplearse incluso para el suministro específico de sitio de agentes activos modificando selectivamente la formulación liposómica.
Además de las enseñanzas de Couvreur et al. (1977; 1988), puede utilizarse la siguiente información en la generación de formulaciones liposómicas. Los fosfolípidos pueden formar una variedad de estructuras distintas de liposomas cuando se dispersan en agua, dependiendo de la relación molar de lípido a agua. A relaciones bajas, el liposoma es la estructura preferida. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, fuerza iónica y la presencia de cationes divalentes. Los liposomas pueden mostrar baja permeabilidad a sustancias iónicas y polares, pero a temperaturas elevadas experimentan una transición de fase que altera notablemente su permeabilidad. La transición de fase implica un cambio desde una estructura ordenada estrechamente empaquetada conocida como estado de gel a una estructura menos ordenada empaquetada suelta conocida como estado de fluido. Esto ocurre a una temperatura de transición de fase característica y da como resultado un aumento de la permeabilidad a los iones, azúcares y fármacos.
Además de la temperatura, la exposición a proteínas puede alterar la permeabilidad de los liposomas. Ciertas proteínas solubles tales como citocromo c se unen a, deforman y penetran la bicapa, causando así cambios en la permeabilidad. El colesterol inhibe esta penetración de proteínas, aparentemente al empaquetar los fosfolípidos más estrechamente. Se contempla que las formaciones de liposoma más útiles para suministro de antibióticos e inhibidores contendrán colesterol.
La capacidad de atrapar solutos varía entre los diferentes tipos de liposomas, por ejemplo, las VML son moderadamente eficaces para atrapar solutos, pero las VUP son extremadamente ineficaces. Las VUP ofrecen la ventaja de homogeneidad y reproducibilidad en la distribución por tamaño, sin embargo, y se ofrece un compromiso entre tamaño y eficacia de atrapamiento por las vesículas unilamelares grandes (VUG). Estas se preparan mediante evaporación de éter y son 3 a 4 veces más eficaces en el atrapamiento de soluto que las VML.
Además de las características del liposoma, es un determinante importante en el atrapamiento de compuestos las propiedades fisicoquímicas del compuesto mismo. Los compuestos polares se atrapan en los espacios acuosos y los compuestos no polares se unen a la bicapa lipídica de la vesícula. Los compuestos polares se liberan mediante permeación o cuando se rompe la bicapa, pero los compuestos no polares permanecen unidos a la bicapa a menos que se desestabilice por temperatura o exposición a lipoproteínas. Ambos tipos muestran velocidades de salida máximas a la temperatura de transición de fase.
Los liposomas interaccionan con células mediante cuatro mecanismos diferentes: endocitosis por células fagocíticas del sistema reticuloendotelial tales como macrófagos y neutrófilos; adsorción a la superficie celular, por fuerzas hidrófobas débiles no específicas o electrostáticas o por interacciones específicas con componentes de la superficie celular; fusión con la membrana celular plasmática mediante inserción de la bicapa lipídica del liposoma en la membrana plasmática, con liberación simultánea de los contenidos liposómicos en el citoplasma, y por transferencia de lípidos liposómicos a membranas celulares o subcelulares o viceversa, sin asociación con los contenidos liposómicos. A menudo es difícil determinar cuál mecanismo es operativo y pueden funcionar más de uno a la vez.
El destino y disposición de los liposomas inyectados por vía intravenosa depende de sus propiedades físicas, tales como tamaño, fluidez y carga superficial. Pueden persistir en tejidos durante horas o días, dependiendo de su composición, y las semividas en la sangre están en el intervalo de minutos a varias horas. Los liposomas grandes, tales como VML y VUG, se incorporan rápidamente por las células fagocíticas del sistema reticuloendotelial, pero la fisiología del sistema circulatorio limita la salida de dichas especies grandes en la mayoría de los sitios. Sólo pueden salir en lugares en que existan grandes aberturas o poros en el endotelio capilar, tales como en los sinusoides del hígado o bazo. Por tanto, estos órganos son el sitio de captación predominante. Por otro lado, las VUP muestran una distribución de tejido más amplia, pero siguen secuestrándose en gran medida en el hígado y el bazo. En general, este comportamiento in vivo limita la orientación potencial de los liposomas a sólo aquellos órganos y tejidos accesibles a su gran tamaño. Estos incluyen sangre, hígado, bazo, médula ósea y órganos linfoides.
La orientación no es generalmente una limitación en términos de la presente invención. Sin embargo, en el caso de que se desee una orientación específica, están disponibles métodos para conseguir esto. Pueden usarse anticuerpos para unirse a la superficie liposómica y dirigir el anticuerpo y sus contenidos de fármaco a receptores antigénicos específicos localizados en una superficie de tipo celular particular. Los determinantes de carbohidrato (componentes de superficie celular glucoproteicos o glucolipídicos que desempeñan un papel en el reconocimiento, interacción y adhesión célula-célula) pueden usarse también como sitios de reconocimiento, ya que tienen potencial para dirigir los liposomas a tipos celulares particulares. La mayoría de veces, se contempla que se usaría la inyección intravenosa de preparaciones liposómicas, pero también son concebibles otras vías de administración.
Como alternativa, la invención proporciona formulaciones en nanocápsula farmacéuticamente aceptables de las composiciones de la presente invención. Las nanocápsulas pueden atrapar generalmente compuestos de modo estable y reproducible (Henry-Michelland et al., 1987; Quintanar-Guerrero et al., 1998; Douglas et al., 1987). Para evitar los efectos secundarios debidos a una sobrecarga polimérica intracelular, deben diseñarse dichas partículas ultrafinas (tamaño de aproximadamente 0,1 \mum) usando polímeros capaces de degradarse in vivo. Se contemplan para uso en la presente invención nanopartículas de poli(cianoacrilato de alquilo) biodegradables que satisfacen estos requisitos. Dichas partículas pueden prepararse fácilmente como se describe en (Couvreur et al., 1980; 1988; zur Muhlen et al., 1998; Zambaux et al. 1998; Pinto-Alphandry et al., 1995 y la patente de EE.UU. nº 5.145.684).
Vacunas
En ciertas realizaciones preferidas de la presente invención, se proporcionan vacunas. Las vacunas comprenderán generalmente una o más composiciones farmacéuticas, tales como las discutidas anteriormente, en combinación con un inmunoestimulante. Un inmunoestimulante puede ser cualquier sustancia que potencie una respuesta inmunitaria (de anticuerpo y/o mediada por célula) ante un antígeno exógeno. Los ejemplos de inmunoestimulantes incluyen coadyuvantes, microesferas biodegradables (por ejemplo, poli(galactida láctica)) y liposomas (en los que se incorpora el compuesto, véase, por ejemplo, Fullerton, patente de EE.UU. nº 4.235.877). La preparación de vacuna se describe generalmente, por ejemplo, en Powell y Newman, eds., "Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach)" (1995). Las composiciones farmacéuticas y vacunas dentro del alcance de la presente invención pueden contener también otros compuestos, que pueden ser biológicamente activos o inactivos. Por ejemplo, pueden estar presentes una o más porciones inmunogénicas de otros antígenos tumorales, incorporadas a un polipéptido de fusión o en forma de un compuesto separado, en la composición o vacuna.
Las vacunas ilustrativas pueden contener ADN que codifica uno o más de los polipéptidos descritos anteriormente, de tal modo que el polipéptido se genere in situ. Como se observa anteriormente, el ADN puede estar presente en cualquiera de una variedad de sistemas conocidos por los expertos en la materia, incluyendo sistemas de expresión de ácido nucleico, bacterias y sistemas de expresión vírica. Son bien conocidas en la materia numerosas técnicas de suministro génico, tales como las descritas por Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15: 143-198 (1998) y las referencias citadas en el mismo. Los sistemas de expresión de ácido nucleico apropiados contienen las secuencias de ADN necesarias para expresión en el paciente (tales como una señal promotora y terminadora adecuadas). Los sistemas de suministro bacterianos implican la administración de una bacteria (tal como bacilo de Calmette-Guerin) que expresa una porción inmunogénica del polipéptido sobre su superficie celular o secreta dicho epítopo. En una realización preferida, el ADN puede introducirse usando un sistema de expresión vírico (por ejemplo, virus Vaccinia u otro poxvirus, retrovirus o adenovirus), que puede implicar el uso de un virus no patogénico (defectivo) competente de replicación. Se dan a conocer sistemas adecuados, por ejemplo, en Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 317-321 (1989); Flexner et al., Ann. N.Y. Acad Sci. 569: 86-103 (1989); Flexner et al., Vaccine 8: 17-21 (1990); patentes de EE.UU. nº 4.603.112, 4.769.330 y 5.017.487; WO 89/01973; patente de EE.UU. nº 4.777.127; GB 2.200.651; EP 0.345.242; WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 6: 616-627 (1988); Rosenfeld et al., Science 252: 431-434 (1991); Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 215-219 (1994); Kass-Eisler et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 90: 11498-11502 (1993); Guzmán et al., Circulation 88: 2838-2848 (1993) y Guzmán et al., Cir. Res. 73: 1202-1207 (1993). Las técnicas para incorporar ADN a dichos sistemas de expresión son bien conocidas por los expertos en la materia. El ADN puede ser también "desnudo" como se describe, por ejemplo, en Ulmer et al., Science 259: 1745-1749 (1993) y se revisa por Cohen, Science 259: 1691-1692 (1993). La captación de ADN desnudo puede aumentarse recubriendo el ADN sobre perlas biodegradables, que se transportan eficazmente en las células. Resultará evidente que una vacuna puede comprender tanto un componente polinucleotídico como polipeptídico. Dichas vacunas pueden proporcionar una respuesta inmunitaria potenciada.
Resultará evidente que una vacuna puede contener sales farmacéuticamente aceptables de los polinucleótidos y polipéptidos proporcionados en la presente memoria. Dichas sales pueden prepararse a partir de bases no tóxicas farmacéuticamente aceptables incluyendo bases orgánicas (por ejemplo, sales de aminas primarias, secundarias y terciarias y aminoácidos básicos) y bases inorgánicas (por ejemplo, sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio y magnesio).
Aunque puede emplearse cualquier portador adecuado conocido por los expertos en la materia en las composiciones de vacuna de esta invención, el tipo de portador variará dependiendo del modo de administración. Las composiciones de la presente invención pueden formularse para cualquier manera apropiada de administración incluyendo, por ejemplo, administración tópica, oral, nasal, intravenosa, intracraneal, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. Para administración parenteral, tal como inyección subcutánea, el portador comprende preferiblemente agua, disolución salina, alcohol, una grasa, una cera o un tampón. Para administración oral, puede emplearse cualquiera de los portadores anteriores o un portador sólido tal como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa y carbonato de magnesio. Pueden emplearse también microesferas biodegradables (por ejemplo, polilactato-poliglicolato) como portadores para las composiciones farmacéuticas de esta invención. Se dan a conocer microesferas biodegradables adecuadas, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. nº 4.897.268; 5.075.109; 5.928.647; 5.811.128; 5.820.883; 5.853.763; 5.814.344 y 5.942.252. Puede emplearse también un portador que comprende los complejos de partícula-proteína descritos en la patente de EE.UU. nº 5.928.647, que son capaces de inducir una respuesta de linfocitos T citotóxicos limitada de clase I en un hospedador.
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Dichas composiciones pueden comprender también tampones (por ejemplo, disolución salina tamponada neutra o disolución salina tamponada con fosfato), carbohidratos (por ejemplo, glucosa, manosa, sacarosa o dextranos), manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos tales como glicina, antioxidantes, bacteriostáticos, agentes quelantes tales como EDTA o glutation, coadyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio), solutos que vuelven la formulación isotónica, hipotónica o débilmente hipertónica con la sangre de un receptor, agentes de suspensión, agentes espesantes y/o conservantes. Como alternativa, las composiciones de la presente invención pueden formularse en forma de un liofilizado. Los compuestos pueden encapsularse también en liposomas usando tecnología bien conocida.
Puede emplearse cualquiera de una variedad de inmunoestimulantes en las vacunas de esta invención. Por ejemplo, puede incluirse un coadyuvante. La mayoría de coadyuvantes contienen una sustancia diseñada para proteger al antígeno de un catabolismo rápido, tal como hidróxido de aluminio o aceite mineral, y un estimulante de respuestas inmunitarias tal como lípido A, especies de Bortadella pertussis o Mycobacterium o proteínas derivadas de Mycobacterium. Por ejemplo, puede usarse M. vaccae deslipidada desglucolipidada ("pVac"). En otra realización, se usa BCG como coadyuvante. Además, la vacuna puede administrarse a un sujeto expuesto anteriormente a BCG. Los coadyuvantes adecuados están comercialmente disponibles, por ejemplo, como coadyuvante incompleto y coadyuvante completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, MI); coadyuvante Merck 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2 y derivados de los mismos (SmithKline Beecham, Filadelfia, PA); CWS, TDM, Leif, sales de aluminio tales como gel de hidróxido de aluminio (alúmina) o fosfato de aluminio; sales de calcio, hierro o cinc; una suspensión insoluble de tirosina acilada; azúcares acilados; polisacáridos derivatizados catiónica o aniónicamente; polifosfazenos; microesferas biodegradables; monofosforil-lípido A y quil A. Pueden usarse también como coadyuvantes citocinas tales como GM-CSF o interleucina 2, 7 ó 12.
En las vacunas proporcionadas en la presente memoria, la composición de coadyuvante se diseña preferiblemente para inducir una respuesta inmunitaria predominantemente de tipo Th1. Los altos niveles de citocinas de tipo Th1 (por ejemplo, IFN-\gamma, TNF-\alpha, IL-2 e IL-12) tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunitarias mediadas por células ante un antígeno administrado. En contraposición, los altos niveles de citocinas de tipo Th2 (por ejemplo, IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10) tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunitarias humorales. Después de la aplicación de una vacuna como se proporciona en la presente memoria, un paciente soportará una respuesta inmunitaria que incluye respuestas de tipo Th1 y Th2. En una realización preferida, en la que una respuesta es predominantemente de tipo Th1, el nivel de citocinas de tipo Th1 aumentará en una mayor medida que el nivel de citocinas de tipo Th2. Los niveles de estas citocinas pueden evaluarse fácilmente usando ensayos estándar. Para una revisión de las familias de citocinas, véase Mosmann y Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7: 145-173 (1989).
Los coadyuvantes preferidos para uso para provocar una respuesta de tipo predominantemente Th1 incluyen, por ejemplo, una combinación de monofosforil-lípido A, preferiblemente monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL), junto con una sal de aluminio. Los coadyuvantes de MPL están disponibles en Corixa Corporation (Seattle, WA; véanse las patentes de EE.UU. nº 4.436.727; 4.877.611; 4.866.034 y 4.912.094). Los oligonucleótidos que contienen CpG (en los que el dinucleótido CpG no está metilado) inducen también predominantemente una respuesta Th1. Dichos oligonucleótidos son bien conocidos y se describen, por ejemplo, en los documentos WO 96/02555, WO 99/33488 y patentes de EE.UU. nº 6.008.200 y 5.856.462. Se describen también secuencias de ADN inmunoestimulantes, por ejemplo, por Sato et al., Science 273: 352 (1996). Otro coadyuvante preferido comprende una saponina tal como Quil A, o derivados de la misma, incluyendo QS21 y QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA); escina; digitonina; o saponinas de Gypsophila o Chenopodium quinoa. Otras formulaciones preferidas incluyen más de una saponina en las combinaciones de coadyuvante de la presente invención, por ejemplo, combinaciones de al menos dos del siguiente grupo que comprende QS21, QS7, quil A, \beta-escina o digitonina.
Como alternativa, las formulaciones de saponina pueden combinarse con vehículos de vacuna compuestos por quitosano u otros polímeros policatiónicos, partículas de polilactida y polilactida-co-glicolida, matriz polimérica basada en poli-N-acetilglucosamina, partículas compuestas por polisacáridos o polisacáridos modificados químicamente, liposomas y partículas basadas en lípidos, partículas compuestas por monoésteres de glicerol, etc. Las saponinas pueden formularse también en presencia de colesterol para formar estructuras particuladas tales como liposomas o ISCOM. Además, las saponinas pueden formularse junto con un éter o éster de polioxietileno en una disolución o suspensión no particulada o en una estructura particulada tal como un liposoma paucilamelar o ISCOM. Las saponinas pueden formularse también con excipientes tales como Carbopol® para aumentar la viscosidad, o pueden formularse en un polvo seco con un excipiente en polvo tal como lactosa.
En una realización preferida, el sistema coadyuvante incluye la combinación de un monofosforil-lípido A y un derivado de saponina, tal como la combinación de QS21 y coadyuvante 3D-MPL®, como se describe en el documento WO 94/00153, o una composición menos reactogénica en que el QS21 se inactiva con colesterol, como se describe en el documento WO 96/33739. Otras formulaciones preferidas comprenden una emulsión de aceite en agua y tocoferol. Se describe en el documento WO 95/17210 otra formulación coadyuvante particularmente preferida que emplea QS21, coadyuvante 3D-MPL® y tocoferol en una emulsión de aceite en agua.
Otro sistema coadyuvante potenciado implica la combinación de un oligonucleótido que contiene CpG y un derivado de saponina, particularmente la combinación de CpG y QS21 como se da a conocer en el documento WO 00/09159. Preferiblemente, la formulación comprende adicionalmente una emulsión de aceite en agua y tocoferol.
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Otros coadyuvantes preferidos incluyen Montanide ISA 720 (Seppic, Francia), SAF (Chiron, California, Estados Unidos), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), la serie de coadyuvantes SBAS (por ejemplo, SBAS-2, AS2', AS2'', SBAS-4 o SBAS6, disponibles en SmithKline Beecham, Rixensart, Bélgica), Detox (Corixa, Hamilton, MT), RC-529 (Corixa, Hamilton, MT) y otros 4-fosfatos de aminoalquilglucosaminida (AGP), tales como aquellos descritos en las solicitudes de patente de EE.UU. en tramitación de nº de serie 08/853.826 y 09/074.720 y coadyuvantes de polioxietilenéter tales como los descritos en el documento WO 99/52549A1.
Otros coadyuvantes preferidos incluyen moléculas coadyuvantes de fórmula general (I): HO(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-A-R, en la que n es 1-50, A es un enlace o -C(O)-, R es alquilo C_{1-50} o fenilalquilo C_{1-50}.
Una realización de la presente invención consiste en una formulación de vacuna que comprende un polioxietilenéter de fórmula general (I), en la que n es entre 1 y 50, preferiblemente 4-24, lo más preferiblemente 9; el componente R es alquilo C_{1-50}, preferiblemente alquilo C_{4-20} y lo más preferiblemente alquilo C_{12} y A es un enlace. La concentración de polioxietilenéteres debería estar en el intervalo de 0,1-20%, preferiblemente de 0,1-10%, y lo más preferiblemente en el intervalo de 0,1-1%. Los polioxietilenéteres preferidos se seleccionan del siguiente grupo: polioxietilen-9-lauriléter, polioxietilen-9-esteariléter, polioxietilen-8-esteariléter, polioxietilen-4-lauriléter, polioxietilen-35-lauriléter y polioxietilen-23-lauriléter. Los polioxietilenéteres tales como polioxietilenlauriléter se describen en el Índice Merck (12ª edición, entrada 7717). Estas moléculas coadyuvantes se describen en el documento WO 99/52549.
El polioxietilenéter según la fórmula general (I) anterior puede combinarse, si se desea, con otro coadyuvante. Por ejemplo, es una combinación coadyuvante preferida con CpG como se describe en la solicitud de patente de RU en tramitación GB 9820956.2.
Puede prepararse cualquier vacuna proporcionada en la presente memoria usando métodos bien conocidos que dan como resultado una combinación de un antígeno, un potenciador de la respuesta inmunitaria y un portador o excipiente adecuado. Las composiciones descritas en la presente memoria pueden administrarse como parte de una formulación de liberación sostenida (concretamente, una formulación tal como una cápsula, esponja o gel (compuesta por polisacáridos, por ejemplo) que efectúa una liberación lenta de compuesto después de la administración. Dichas formulaciones pueden prepararse generalmente usando tecnología bien conocida (véase, por ejemplo, Coombes et al., Vaccine 14: 1429-1438 (1996)) y administrarse, por ejemplo, por vía oral, rectal o implante subcutáneo, o mediante implante en el sitio diana deseado. Las formulaciones de liberación sostenida pueden contener un polipéptido, polinucleótido o anticuerpo dispersado en una matriz portadora y/o contenido en un depósito rodeado por una membrana controladora de la velocidad.
Los portadores para uso en dichas formulaciones son biocompatibles y pueden ser también biodegradables; preferiblemente, la formulación proporciona un nivel relativamente constante de liberación de compuesto activo. Dichos portadores incluyen micropartículas de poli(lactida-co-glicolida), poliacrilato, látex, almidón, celulosa, dextrano y similares. Otros portadores de liberación retardada incluyen biovectores supramoleculares que comprenden un núcleo hidrófilo no líquido (por ejemplo, un polisacárido u oligosacárido reticulado) y, opcionalmente, una capa externa que comprende un compuesto anfífilo, tal como un fosfolípido (véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.151.254 y las solicitudes PCT WO 94/20078, WO/94/23701 y WO 96/06638). La cantidad de compuesto activo contenida en una formulación de liberación sostenida depende del sitio de implantación, la velocidad y duración esperada de la liberación y la naturaleza de la afección a tratar o prevenir.
Puede emplearse cualquiera de una variedad de vehículos de suministro en composiciones farmacéuticas y vacunas para facilitar la producción de una respuesta inmunitaria específica de antígeno que se orienta a células tumorales. Los vehículos de suministro incluyen células presentadoras de antígeno (CPA) tales como células dendríticas, macrófagos, linfocitos B, monocitos y otras células que pueden modificarse por ingeniería genética para ser CPA eficaces. Dichas células pueden, pero no necesariamente, modificarse genéticamente para aumentar la capacidad de presentar el antígeno, mejorar la activación y/o el mantenimiento de la respuesta de linfocitos T, tener efectos antitumorales per se y/o ser inmunológicamente compatibles con el receptor (concretamente, haplotipo HLA coincidente). Las CPA pueden aislarse generalmente de cualquiera de una variedad de fluidos biológicos y órganos, incluyendo tejidos tumorales y peritumorales, y pueden ser células autólogas, alogénicas, singénicas o xenogénicas.
Ciertas realizaciones preferidas de la presente invención usan células dendríticas o progenitoras de las mismas como células presentadoras de antígeno. Las células dendríticas son CPA muy potentes (Banchereau y Steinman, Nature 392: 245-251 (1998)) y se ha mostrado que son eficaces como coadyuvante fisiológico para provocar inmunidad antitumoral profiláctica o terapéutica (véase Timmerman y Levy, Ann. Rev. Med. 50: 507-529 (1999)). En general, las células dendríticas pueden identificarse basándose en su forma típica (estrellada in situ, con procesos citoplasmáticos marcados (dendritas) visibles in vitro), su capacidad de incorporar, procesar y presentar antígenos con alta eficacia y su capacidad de activar respuestas de linfocitos T no expuestos. Las células dendríticas pueden, por supuesto, modificarse por ingeniería genética para expresar receptores de superficie celular específicos o ligandos que no se encuentran comúnmente en células dendríticas in vivo o ex vivo, y dichas células dendríticas modificadas se contemplan en la presente invención. Como alternativa a las células dendríticas, pueden usarse células dendríticas cargadas con antígeno secretado de vesícula (denominados exosomas) en una vacuna (véase Zitvogel et al., Nature Med. 4:
594-600 (1998)).
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Las células dendríticas y progenitoras pueden obtenerse a partir de sangre periférica, médula ósea, células infiltradas con tumores, células infiltradas con tejidos peritumorales, nódulos linfáticos, bazo, piel, sangre de cordón umbilical o cualquier otro tejido o fluido adecuado. Por ejemplo, las células dendríticas pueden diferenciarse ex vivo mediante la adición de una combinación de citocinas tales como GM-CSF, IL-4, IL-13 y/o TNF-\alpha\beta a cultivos de monocitos recogidos de sangre periférica. Como alternativa, las células CD34^{+} recogidas de sangre periférica, sangre de cordón umbilical o médula ósea pueden diferenciarse en células dendríticas mediante la adición al medio de cultivo de combinaciones de GM-CSF, IL-3, TNF-\alpha, ligando CD40, LPS, ligando flt3 y/u otro(s) compuesto(s) que induce(n) la diferenciación, maduración y proliferación de células dendríticas.
Las células dendríticas se clasifican convenientemente como células "inmaduras" y "maduras", lo que permite un modo sencillo de discriminar entre dos fenotipos bien caracterizados. Sin embargo, esta nomenclatura no debe considerarse que excluya todas las posibles etapas intermedias de diferenciación. Las células dendríticas inmaduras se caracterizan como CPA con una alta capacidad de captación y procesamiento de antígeno, lo que se correlaciona con la alta expresión del receptor Fc\gamma y el receptor de manosa. El fenotipo maduro se caracteriza típicamente por una menor expresión de estos marcadores, pero una alta expresión de moléculas de superficie celular responsables de la activación de linfocitos T, tales como MHC de clase I y clase II, moléculas de adhesión (por ejemplo, CD54 y CD11) y moléculas coestimulantes (por ejemplo, CD40, CD80, CD86 y 4-1BB).
Las CPA pueden transfectarse generalmente con un polinucleótido que codifica una proteína (o porción u otra variante de la misma) de tal modo que el polipéptido, o una porción inmunogénica del mismo, se exprese en la superficie celular. Dicha transfección puede tener lugar ex vivo, y puede usarse entonces una composición o vacuna que comprende dichas células transfectadas con fines terapéuticos, como se describe en la presente memoria. Como alternativa, puede administrarse a un paciente un vehículo de suministro génico que orienta a una célula dendrítica u otra presentadora de antígeno, dando como resultado una transfección que ocurre in vivo. La transfección in vivo y ex vivo de células dendríticas, por ejemplo, puede efectuarse generalmente usando cualquier método conocido en la materia, tal como los descritos en el documento WO 97/24447, o el enfoque de pistola génica descrito por Mahvi et al., Immunology and Cell Biology 75: 456-460 (1997). La carga de antígeno de las células dendríticas puede conseguirse mediante la incubación de células dendríticas o células progenitoras con el polipéptido, ADN (desnudo o en un vector plasmídico) o ARN; o con bacterias o virus recombinantes que expresan antígeno (por ejemplo, vectores de Vaccinia, de viruela aviar, adenovirus o lentivirus). Antes de la carga, el polipéptido puede conjugarse covalentemente con un asociado inmunitario que proporciona la ayuda de linfocitos T (por ejemplo, una molécula portadora). Como alternativa, puede someterse a pulsos una célula dendrítica con un asociado inmunitario no conjugado, separadamente o en presencia del polipéptido.
Las vacunas y composiciones farmacéuticas pueden presentarse en envases de dosis unitaria o dosis múltiples, tales como ampollas o viales sellados. Dichos envases están preferiblemente sellados herméticamente para conservar la esterilidad de la formulación hasta su uso. En general, las formulaciones pueden almacenarse en forma de suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos. Como alternativa, puede almacenarse una vacuna o composición farmacéutica en estado liofilizado que requiere sólo la adición de un portador líquido estéril inmediatamente antes del uso.
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Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan sólo a modo de ilustración y no a modo de limitación. Los expertos en la materia reconocerán fácilmente una variedad de parámetros no críticos que podrían cambiarse o modificarse para proporcionar resultados esencialmente similares.
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Ejemplo de antecedentes 1
Vacunación de conejillos de Indias con la proteína de fusión MTB72F y composiciones con antígenos individuales
Se inmunizaron conejillos de Indias con coadyuvante solo (SBAS1, SBAS2, o ASAS7 más Al(OH)_{3}), proteína de fusión MTB72 en coadyuvante o TbH9 más composición antigénica Ra35.
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Métodos
Grupos:
1) SBAS1
\quad
2) SBAS2
\quad
3) SBAS7 + Al(OH)_{3}
\quad
4) TbH9+Ra35 + SBAS 1
\quad
5) TbH9 + Ra35 + SBAS2
\quad
6) TbH9 + Ra35 + SBAS7(Al(OH)_{3})
\quad
7) MTB72F en SBAS 1
\quad
8) MTB72F en SBAS2
\quad
9) MTB72F en SBAS7+AI(OH)_{3}
\quad
10) PBS
\quad
11) BCG
Dosificación:
4 \mug de cada uno de TbH9 y Ra35
\quad
8 \mug de MTB72F.
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Protocolo: 1ª inmunización, 2ª inmunización aproximadamente 3 semanas después, 3ª inmunización aproximadamente dos semanas y media después.
Antes de la exposición: DTH (hipersensibilidad de tipo retardado, usada para determinar la antigenicidad; 10 \mug de antígeno)
Exposición: Aerosol con \sim30 ufc de cepa Erdman
Monitorización después de la exposición: pérdida de peso y muerte (\sim6 meses después de la exposición).
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Resultados 1. DTH
Reacción positiva a los antígenos inmunizantes. Las reacciones a antígenos individuales o la proteína de fusión fueron comparables. La reactividad del ensayo cutáneo ante PPD se observó sólo con los grupos inmunizados con BCG.
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2. Protección
Los conejillos de Indias vacunados con la proteína de fusión MTB72F proporcionaban protección en comparación con los inmunizados con una mezcla de antígenos (véase la Figura 1).
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Ejemplo de antecedentes 2
Vacunación de ratón con la proteína de fusión MTB72F y composiciones con antígenos individuales
Como se describe anteriormente, se inmunizaron ratones con coadyuvante solo (SBAS2, SBAS2', SBAS2'' o SBAS6), proteína de fusión MTB72F en coadyuvante, ADN de MTB72F, proteína de fusión MTB59F en coadyuvante o composición antigénica TbH9, Ra35 y Ra12.
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Métodos
Grupos:
1) MTB72F+ SBAS2
\quad
2) MTB72F + SBAS2'
\quad
3) MTB72F + SBAS2''
\quad
4) MTB72F + SBAS6
\quad
5) Ra12+ TbH9 + Ra35 en SEAS2
\quad
6) MTB59F en SBAS2
\quad
7) SBAS2
\quad
8) MTB72F + M. vaccae deslipidada desglucolipidada
\quad
9) ADN de MTB72F
\quad
10) MTB72F + IFA
\quad
11) MTB72F + BCG
\quad
12) M. vaccae deslipidada desglucolipidada
\quad
13) BCG
\quad
14) disolución salina
\quad
15) MTB72F +SBAS2 (formulación propia).
8 animales por grupo
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\global\parskip0.950000\baselineskip
Esquema de inmunización: primera inmunización, segunda inmunización aproximadamente 3 semanas después, tercera inmunización aproximadamente 3 semanas después.
Exposición a aerosol aproximadamente 3 meses después de la primera dosis.
Se aislaron células de bazo o pulmón y se cultivaron; recuento de UFC de los cultivos aproximadamente 3 semanas después de la siembra.
Dosis: 8 \mug de MTB72F, 6,56 \mug de MTB59F, o 1,52, 4,3 y 2,24 \mug, respectivamente, de Ra12, TbH9 y Ra35 mezclados.
\vskip1.000000\baselineskip
Resultados
De los coadyuvantes AS, AS2'' + MTB72F dieron la mejor protección tanto en bazo como en pulmón en esta serie de experimentos (véanse las Figuras 2A y 2B). MTB72F dio \sim1 log mejor protección que MTB59F tanto en bazo como en pulmón en este conjunto de experimentos, indicando que Ra12 proporciona un beneficio adicional. La mezcla de 12/H9/35 + AS2 dio una mejor protección que MTB72F en este experimento. El ADN de MTB72F dio la mejor protección en este experimento, particularmente en el bazo (>2 log). La protección era comparable en el pulmón con la de proteína MTB72F + AS2'' en este experimento.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de antecedentes 3
Vacunación de conejillos de Indias con proteína de fusión MTB72F y composiciones con antígenos individuales
Como se describe anteriormente, se inmunizaron conejillos de Indias con coadyuvante solo (SBAS2, SBAS2', SBAS2'' o SBAS6), proteína de fusión MTB72F en coadyuvante, ADN de MTB72F, proteína de fusión MTB59F en coadyuvante o composición antigénica TbH9, Ra35 y Ra12.
\vskip1.000000\baselineskip
Métodos
Grupos:
1) MTB72F + SBAS2
\quad
2) MTB72F + SBAS2'
\quad
3) MTB72F + SBAS2''
\quad
4) MTB72F + SBAS6
\quad
5) Ra12+ TbH9 + Ra35 en SBAS2
\quad
6) MTB59F en SBAS2
\quad
7) SBAS2
\quad
8) MTB72F + pvac
\quad
9) ADN de MTB72F
\quad
10) MTB72F +IFA
\global\parskip1.000000\baselineskip
\quad
11) MTB72F + BCG
\quad
12) BCG
\quad
13) disolución salina
\quad
14) M. vaccae deslipidada desglucolipidada
\vskip1.000000\baselineskip
Antígenos
Se formularon los antígenos en equivalentes molares
5 animales por grupo
El volumen de inyección por dosis es de 250 \mul (IM) que contiene
MTB72F
20 \mug
Ra12, TbH9, Ra35
3,8, 10,8 y 5,6 \mug
MTB59F
16,4 \mug
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
1ª inmunización, 2ª inmunización aproximadamente tres semanas después, 3ª inmunización aproximadamente tres semanas después.
Exposición: \sim Un mes y medio después de la primera inmunización.
\vskip1.000000\baselineskip
Resultados
\sim 38 semanas después de la exposición.
1
A las 50 semanas después de la exposición, aunque un 80% (4/5) de los conejillos de Indias inmunizados con BCG + Mtb72F seguían vivos, sólo un 20% (1/5) de los inmunizados con BCG solo estaban vivos. A las 85 semanas, 4/5 de los conejillos de Indias inmunizados con BCG + Mtb72F seguían vivos y sanos (véase la Figura 7).
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.900000\baselineskip
Ejemplo de antecedentes 4
Protección a largo plazo
Como se describe anteriormente, se inmunizaron conejillos de Indias con coadyuvante solo (AS2 o AS2''), proteína de fusión MTB72F en coadyuvante, composición antigénica TbH9, Ra35 y Ra12, o una variedad de antígenos individuales en coadyuvante.
\vskip1.000000\baselineskip
Métodos
2 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de antecedentes 5
Vacunación de mono con proteína de fusión MTB72F y composiciones con antígenos individuales
Como se describe anteriormente, se inmunizaron monos con la proteína de fusión MTB72F en coadyuvante SBAS2, o composición antigénica MTB8.4 en coadyuvante, o una mezcla de MTB72F y MTB8.4.
\vskip1.000000\baselineskip
Métodos Grupos
1.
Disolución salina
2.
BCG
3.
MTB8.4/AS2
4.
MTB72F/AS2
5.
MTB72F/AS2 (un brazo) + MTB8.4/AS2 (el otro brazo)
40 \mug de cada antígeno
\global\parskip1.000000\baselineskip
Resultados
A las 8 semanas después de la exposición, los monos inmunizados con BCG muestran signos de infección.
Los datos actuales durante 16 semanas después de la exposición revelan la siguiente tendencia:
Los grupos inmunizados con MTB72F (4 y 5) mantienen sus pesos y tienen bajos valores de ESR comparados con el grupo 3 (inmunización con MTB8.4) (Tablas 1 y 2).
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 1 Estudio de vacuna profiláctica en monos cinomolgos con MTB8.4 y MTB72F formuladas en AS2 20 semanas después de la exposición
3
TABLA 2 Estudio de vacuna profiláctica en monos cinomolgos con MTB8.4 y MTB72F formuladas en AS2
5 
\newpage
Ejemplo de antecedentes 6
Experimento de cebado con BCG en monos
Se inmunizaron con BCG 4 grupos de 5 animales por grupo y después reposo, se inmunizaron entonces como se describe anteriormente y se expusieron. Se usará el siguiente protocolo:
7
Todos los antígenos se formulan en AS2.
Los grupos 4 y 5 tienen 4 animales cada uno. Dos de los monos inmunizados con BCG murieron.
9 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 7 Construcción de Ra35MutSA y MTB72FMutSA
La expresión de Mtb72f da típicamente como resultado ciertos productos de degradación. Además, la expresión de las secuencias completas de la forma madura o completa de Ra35 (Mtb32A) en E. coli ha sido difícil. El producto expresado era sólo visible después de inmunotransferencia con un Ab policlonal de conejo anti-Ra35, indicativo de bajos niveles de expresión de proteína. Incluso entonces, se detectaron múltiples especies específicas (bandas) indicativas de degradación autocatalítica del antígeno recombinante. Esto se supuso debido a la expresión de Ra35FL en E. coli en forma biológicamente activa.
Se ha mostrado anteriormente que era posible expresar Ra35FL en forma de dos mitades superpuestas que comprenden la mitad N-terminal (extremo N de Ra35, denominado Ra35) y la mitad C-terminal (extremo C de Ra35, denominado Ra12). Para potenciar y estabilizar la expresión de toda la molécula de Ra35, se introdujo una sola mutación puntual en uno de los residuos en la triada de sitio activo (sustitución de Ser por Ala; véanse la Figuras 6). Esta forma mutagenizada de Mtb32A puede expresarse ahora fácilmente a altos niveles en forma estable. Además, para estabilizar la expresión de Mtb72F, se incorporó una sola sustitución nucleotídica (T a G, dando como resultado un cambio de Ser a Ala en la posición 710 del polipéptido de fusión) en la secuencia de Mtb72F en la posición nucleotídica 2128 (véase la Figura 5).
Esta estabilización se consigue también fácilmente mutagenizando uno cualquiera, dos o los tres residuos que comprenden la triada de sitio activo en Ra35FL, Ra35 o Mtb72F u otras proteínas de fusión que comprenden Ra35 (His, Asp o Ser). La mutagénesis puede efectuarse usando cualquier técnica conocida por el experto en la materia.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 8 Inmunización de ratones con Ra35FLMutSA-TbH9 y MTB72FMutSA
Se inmunizaron 8 ratones por grupo con las composiciones enumeradas a continuación, que incluyen el coadyuvante AS2A. Se expusieron entonces los ratones a Mycobacterium tuberculosis y se midió la supervivencia de los ratones.
10 
\global\parskip0.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:1: MTB32A (Ra35 FL)
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1872 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:1:
11 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 355 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:2: MTB32A (Ra35FL)
12 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ra35 maduro
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:3
\vskip1.000000\baselineskip
13 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ra35 maduro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:4
\vskip1.000000\baselineskip
14
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ra35FLMutSA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:5
\vskip1.000000\baselineskip
16 
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ra35FLMutSA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEC ID NO:6
\vskip1.000000\baselineskip
18
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:7: Ra35 (MTB32A término-N)
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 615 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:7:
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:8: Ra35 (MTB32A término-N)
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 205 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:8:
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:9: Ra12
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 447 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:9:
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:10: Ra12
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 132 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:10:
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:11: TbH9
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 851 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:11:
\vskip1.000000\baselineskip
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 263 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:12: TbH9
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:13: TBH9FL
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 3058 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:13:
27
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:14: TbH9FL
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 391 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:14:
29
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2287
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: proteína Mtb72F de tri-fusión (Ral2-TbH9-Ra35 o fusión Mtb32-Mtb39)
31
33
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 729
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: proteína Mtb72F de tri-fusión (Ra12-TbH9-Ra35 o fusión Mtb32-Mtb39)
35
36
37 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2190
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mtb72FMutSA
\vskip1.000000\baselineskip
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 729
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mtb72FMutSA
39
40
41 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1797
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: proteína TbH9-Ra35 de bi-fusión (designada Mtb59f)
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1791)
\vskip1.000000\baselineskip
42
43
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 596
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: proteína TbH9-Ra35 de bi-fusión (designada Mtb59f)
\vskip1.000000\baselineskip
45
46 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:21: DPV (MTB8.4)
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 500 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:21:
47 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:22: DPV (MTB8.4)
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 96 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:22:
48 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:23: MSL (MTB9.8)
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 585 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:23:
49 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:24: MSL (MTB9.8)
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 97 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:24:
\vskip1.000000\baselineskip
50 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:25: MTI (MTB9.9A)
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1742 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:25:
51 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:26. MTI (MTB9.9A)
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2836 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:26:
52 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:27: MTI (MTB9.9A)
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 94 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:27:
53 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:28: HTCC#1
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1200 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:28:
54 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:29: HTCC#1
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 392 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:29:
55 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:30: MTCC#2
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1441 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:30:
56 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:31: MTCC#2
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 423 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:31:
57 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:32: ESAT-6
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 154 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:32:
58 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:33: ESAT-6
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 51 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:33:
59 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:34: Tb38-1
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 327 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:34:
60 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:35: Tb38-1
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 95 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:35:
61 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:36: TbRa3
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 542 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:36:
62 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:37: TbRa3
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:37:
63 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:38: 38 kD
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1993 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:38:
64
65 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:39: 38 kD
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 374 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:39:
\vskip1.000000\baselineskip
66
67 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:40: DPEP
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 999 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:40:
68 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:41: DPEP
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 332 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:41:
69 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:42: TbH4
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 702 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:42:
70 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:43: TbH4
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 286 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:43:
\vskip1.000000\baselineskip
71 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:44: DPPD
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 339 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Genómico DNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:44:
\vskip1.000000\baselineskip
72 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:45: DPPD
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 112 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:45:
\vskip1.000000\baselineskip
73 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 921
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: proteína DPV-MTI-MSL de tri-fusión (designada Mtb31f)
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(900)
74
75 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 299
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: proteína DPV-MTI-MSL de tri-fusión (designada Mtb31f)
76
77 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2168
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: proteína DPV-MTI-MSL-MTCC2 de tetra-fusión (designada Mtb71f)
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2133)
\vskip1.000000\baselineskip
78
79
80
81 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEC ID NO:49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 710
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: proteína DPV-MTI-MSL-MTCC2 tetra-fusión (designada Mtb71f)
\vskip1.000000\baselineskip
82
83
84

Claims (22)

1. Un polipéptido de fusión que comprende (i) un antígeno MTB39 (SEC ID Nº 12 o 14), una variante de dicho antígeno MTB39 que tiene al menos un 90% de identidad con el mismo o un fragmento inmunogénico de dicho antígeno MTB39, y (ii) un antígeno MTB32A (SEC ID Nº 2 ó 4), una variante de dicho antígeno MTB32A que tiene al menos un 90% de identidad con el mismo o un fragmento inmunogénico de dicho antígeno MTB32A, caracterizado porque dicho antígeno MTB32A, variante o fragmento tiene una sustitución aminoacídica correspondiente a la posición 183 de la SEC ID Nº 4 o a la posición aminoacídica 208 de la SEC ID Nº 2, en la que el residuo de serina encontrado habitualmente en esta posición se ha reemplazado por otro aminoácido.
2. Un polipéptido de fusión de la reivindicación 1, que comprende al menos 195 aminoácidos del extremo N de un antígeno MTB32A (SEC ID Nº 2 ó 4) o una variante de dicho antígeno MTB32A que tiene al menos un 90% de identidad con el mismo.
3. Un polipéptido de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el residuo de serina correspondiente a la posición aminoacídica 183 de la SEC ID Nº 4 o a la posición aminoacídica 208 de la SEC ID Nº 2 se ha sustituido por alanina.
4. Un polipéptido de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende adicionalmente un polipéptido que comprende al menos aproximadamente 132 aminoácidos del extremo C del antígeno MTB32A (SEC ID Nº 2 ó 4) o una variante de dicho antígeno MTB32A que tiene al menos un 90% de identidad con el mismo.
5. El polipéptido de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que los antígenos están ligados covalentemente mediante un ligador químico.
6. El polipéptido de fusión de la reivindicación 5, en el que el ligador químico es un ligador aminoacídico.
7. Un polipéptido de fusión de la reivindicación 6, en el que el polipéptido de fusión comprende la secuencia aminoacídica de MTB72FMutSA (SEC ID Nº 18).
8. Un polipéptido de fusión de la reivindicación 7, que comprende adicionalmente al menos un polipéptido heterólogo adicional de Mycobacterium sp.
9. Un polipéptido de fusión de la reivindicación 8, en el que el antígeno adicional se selecciona del grupo constituido por el antígeno MTB8.4 (SEC ID Nº 22), el antígeno MTB9.8 (SEC ID Nº 24), el antígeno MTB9.9 (SEC ID Nº 27), el antígeno MTB40 (SEC ID Nº 29), el antígeno MTB41 (SEC ID Nº 31), 38-1 (SEC ID Nº 35), TbRa3 (SEC ID Nº 37), 38 kDa (SEC ID Nº 39), DPEP (SEC ID Nº 41), TbH4 (SEC ID Nº 43), DPPD (SEC ID Nº 45), Erd14, el antígeno ESAT-6 (SEC ID Nº 33), el antígeno complejo MTB85 o un antígeno \alpha cristalino o un fragmento inmunogénico de los mismos.
10. Un polipéptido de fusión de la reivindicación 7, en el que el polipéptido de fusión tiene la secuencia aminoacídica de MTB72FMutSA (SEC ID Nº 18).
11. Una composición de vacuna que comprende un polipéptido de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende adicionalmente un coadyuvante.
12. La composición de vacuna de la reivindicación 11, en la que el coadyuvante comprende QS21 y MPL.
13. La composición de vacuna de la reivindicación 11, en la que el coadyuvante se selecciona del grupo consistente en AS2, ENHANZYN, MPL, 3D-PL, IFA, QS21, CWS, TDM, AGP, CPG, Leif, saponina y miméticos de saponina.
14. Un polinucleótido que codifica un polipéptido de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
15. Un polinucleótido según la reivindicación 14, que codifica MTB72FMutSA (SEC ID Nº 18).
16. Un polinucleótido según la reivindicación 15, que tiene la secuencia exhibida en la SEC ID Nº 17.
17. Una composición de vacuna que comprende un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, que comprende adicionalmente un coadyuvante.
18. Un polipéptido de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para uso como un medicamento.
19. Un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 para uso como un medicamento.
20. Uso de un polipéptido de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en la fabricación de un medicamento para provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero.
21. Uso de un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 en la fabricación de un medicamento para provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero.
22. Un método para la producción de una proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, comprendiendo dicho método el uso de una secuencia polinucleotídica que codifica dicha proteína de fusión para dirigir la expresión en una célula hospedadora.
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