ES2321346T3 - Polinucleotidos que codifican un polipeptido antigenico de chlamydia pneumoniae. - Google Patents

Polinucleotidos que codifican un polipeptido antigenico de chlamydia pneumoniae. Download PDF

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Abstract

SE DESCRIBE UN POLIPEPTIDO ANTIGENICO DE CHLAMIDIA PNEUMONIAE, QUE COMPRENDE EL POLIPEPTIDO A, EL CUAL CONTIENE LA SECUNCIA DE AL MENOS CINCO AMINOACIDOS CONSECUTIVOS EN EL POLIPEPTIDO DE SEQ ID NO:1; UN ADN QUE CODIFICA PARA DICHO POLIPEPTIDO; UN VECTOR RECOMBINANTE QUE CONTIENE DICHO ADN; UN TRANSFORMANTE QUE CONTIENE DICHO VECTOR; UN PROCEDIMIENTO DE PRODUCCION DE UN ANTICUERPO ANTI-C. PNEUMONIAE, MEDIANTE LA UTILIZACION DEL POLIPEPTIDO ANTIGENICO COMO ANTIGENO; METODOS DE DETECCION Y ENSAYO DE DICHO ANTICUERPO ANTI-C. PNEUMONIAE; UTILIZACION DE DICHO POLIPEPTIDO ANTIGENICO; UNA PROTEINA DE FUSION CONSISTENTE EN UNA REDUCTASA DE DIHIDROFOLIATO Y UN POLIPEPTIDO ANTIGENICO DE C. PNEUMONIAE, DONDE EL POLIPEPTIDO DE SEQ ID NO:14, ESTA UNIDO AL POLIPEPTIDO A, QUE CONTIENE LA SECUENCIA DE AL MENOS CINCO AMINOACIDOS CONSECUTIVOS EN EL POLIPEPTIDO DE SEQ ID NO:1. SE DESCRIBE ASIMISMO, UN ADN QUE CODIFICA PARA LA PROTEINA DE FUSION; UN VECTOR RECOMBINANTE QUE CONTIENE DICHO ADN; UN TRANSFORMANTEQUE CONTIENE DICHO VECTOR; UN PROCEDIMIENTO DE PRODUCCION DE UN ANTICUERPO ANTI-C. PNEUMONIAE, MEDIANTE LA UTILIZACION DE DE LA PROTEINA DE FUSION COMO ANTIGENO; METODOS DE DETECCION Y ENSAYO DEL ANTICUERPO ANTI-C. PNEUMONIAE, MEDIANTE LA UTILIZACION DE LA PROTEINA DE FUSION COMO ANTIGENO; UTILIZACION DE DICHA PROTEINA DE FUSION; UNA SONDA Y UN CEBADOR PARA DETECTAR Y ENSAYAR LOS GENES DE C. PNEUMONIAE; METODOS DE DETECCION Y ENSAYO DE LOS GENES DE C. PNEUMONIAE, MEDIANTE LA UTILIZACION DE DICHA SONDA O CEBADOR; Y LA UTILIZACION DE DICHA SONDA O CEBADOR.

Description

Polinucleótidos que codifican un polipéptido antigénico de Chlamydia pneumoniae.
Campo de la invención
La invención se refiere a polipéptidos antigénicos de Chlamydia pneumoniae, proteínas fusionadas que contienen los polipéptidos, ADN que los codifican, vectores recombinantes que llevan los ADN, transformantes que contienen los vectores recombinantes, sondas y cebadores para la detección y/o medición de un gen de Chlamydia pneumoniae y un método y reactivos para la detección y/o medición de un gen de Chlamydia pneumoniae. La invención puede usarse eficazmente en la industria farmacéutica, particularmente en la preparación de agentes para el diagnóstico de infecciones por Chlamydia pneumoniae.
Técnica antecedente
Se conocen varias clases de especies de Chlamydia, es decir, Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci, Chlamydia pecorum, Chlamydia pneumoniae y similares. La Chlamydia trachomatis causa tracoma, linfogranuloma venéreo, infecciones urogenitales, conjuntivitis de inclusión, neumonía neonatal y similares. La Chlamydia psittaci causa psitacosis y similares. La Chlamydia pneumoniae causa infecciones respiratorias, neumonía atípica y similares.
Puesto que los síntomas de infecciones en el aparato respiratorio que están causadas por Chlamydia pneumoniae son similares a las infecciones causadas por Micoplasma pneumoniae o virus Influenza, los médicos realizan con frecuencia un diagnóstico erróneo. Por lo tanto, existe la necesidad del desarrollo de un método sencillo para diagnosticar las infecciones causadas por Chlamydia pneumoniae.
En general, una infección puede diagnosticarse de forma fiable por detección de la bacteria causante en el sitio infectado o por detección de un anticuerpo contra la bacteria causante en fluidos corporales tales como suero y similares. El primer método se denomina ensayo de antígeno y el último se denomina ensayo de anticuerpo. Ambos métodos son clínicamente importantes. En cuanto a Chlamydia pneumoniae, se conoce un ensayo de anticuerpo que se lleva a cabo por un método en el que se detecta un anticuerpo mediante el uso de un cuerpo elemental de Chlamydia pneumoniae.
Sin embargo, este método tiene la desventaja de que el cuerpo elemental de Chlamydia pneumoniae reacciona no solamente con un anticuerpo contra Chlamydia pneumoniae, sino también con anticuerpos contra otras especies de Chlamydia, siendo por lo tanto bastante inespecífico. Esto es porque el cuerpo elemental de Chlamydia pneumoniae contiene un antígeno que también está presente en otras especies del género Chlamydia distintas de Chlamydia pneumoniae, es decir, Chlamydia trachomatis y Chlamydia psittaci.
Como un plásmido que puede usarse para la expresión de una gran cantidad de una proteína en E. coli, se conoce pBBK10MM (Publicación de Patente Japonesa no examinada Nº Hei 4-117284). Este plásmido puede usarse para la expresión de una proteína fusionada de un péptido antialérgico con DHFR. La proteína fusionada expresada también mantiene la actividad enzimática de DHFR y, por lo tanto, puede purificarse fácilmente mediante la utilización de las propiedades y actividades características de DHFR.
Se ha llevado a cabo una exploración genética para diagnosticar infecciones. En esta exploración, se examina la presencia del gen de un microorganismo que se va a detectar en una muestra usando sondas de ácidos nucleicos y similares.
En cuanto a Chlamydia pneumoniae, se conoce un método de exploración genética que se lleva a cabo como se describe en la Publicación de Patente Japonesa no examinada Nº Sho 64-500083 y en los documentos U. S. P. Nº 5.281.518 y WO94/04549.
Sin embargo, la Publicación de Patente Japonesa no examinada Nº Sho 64-500083 y el documento U. S. P. Nº 5.281.518 describen solamente que un ADN cromosómico de Chlamydia pneumoniae o un fragmento de ADN que se obtiene por escisión del ADN cromosómico con una enzima de restricción o similar se usa como sonda. No se determinan las secuencias de bases de estas moléculas de ADN y, por lo tanto, la especificidad de estas sondas no está clara. Además, es difícil determinar las condiciones de reacción.
Iijiama et al (1994) describen la caracterización de una proteína de 53 kDa de Chlamydia como un antígeno altamente conservado entre diferentes cepas de Chlamydia pneumoniae. Roberts et al (2001) describen que la expresión de la proteína de 53 kDa completa de Chlamydia pneumoniae es letal cuando se expresa como una proteína recombinante, o insoluble cuando se expresa en un vector alternativo. Se obtuvo una genoteca de expresión en \lambdagt11 a partir de ADN genómico de Chlamydia pneumoniae y se exploró con un suero inmune de conejo anti-Chlamydia pneumoniae que reconocía un polipéptido de 76 kDa (Melgosa et al., 1994). Los mismos autores fueron capaces de expresar y purificar proteínas de fusión que comprendían la glutatión S-transferasa y el polipéptido de 76 kDa. Thije et al. (1993) presentan un método de PCR para la detección de Chlamydia pneumoniae que comprende cebadores y un método de hibridación que comprende sondas, estas últimas derivadas del polinucleótido que codifica la proteína principal de la membrana externa de Chlamydia pneumoniae.
Aunque el documento WO94/04549 describe un método que usa una sonda que hibrida con ARN ribosómico o el ADN correspondiente al mismo, la especificidad de estas sondas no es fiable porque la homología del ARN ribosómico es relativamente elevada en todos los organismos.
Descripción de la invención
Un objeto de la invención es proporcionar ADN que codifiquen polipéptidos antigénicos que no reaccionen con anticuerpos contra especies del género Chlamydia distintas de Chlamydia pneumoniae, tales como Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci y similares, y que reaccionen solamente con un anticuerpo específico de Chlamydia pneumoniae y, por lo tanto, puedan detectar el anticuerpo específico de Chlamydia pneumoniae.
Otro objeto de la invención es proporcionar un método para sintetizar grandes cantidades de los polipéptidos antigénicos mediante el uso de técnicas de recombinación de genes.
También se describe en este documento un método para la producción de un anticuerpo específico anti-Chlamydia pneumoniae, un método y reactivos para la detección y/o medición del anticuerpo específico anti-Chlamydia pneumoniae y agentes para el diagnóstico de infecciones por Chlamydia pneumoniae, todo mediante el uso de dichos polipéptidos antigénicos.
Un objeto adicional más de la invención es proporcionar sondas y cebadores para detectar y/o medir específicamente un gen de Chlamydia pneumoniae, un método y reactivos para la detección y/o medición de un gen de Chlamydia pneumoniae y agentes para el diagnóstico de infecciones por Chlamydia pneumoniae, todo mediante el uso de las sondas o cebadores.
También se describen en este documento polipéptidos antigénicos para la detección de un anticuerpo que reaccione con el género Chlamydia, incluyendo Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci y similares.
Sumario de la invención
Las cuestiones objeto de la invención son las siguientes:
(1) Un ADN que codifica un polipéptido antigénico de Chlamydia pneumoniae que comprende:
(a) Un ADN que codifica un polipéptido que contiene una secuencia de no menos de 20 aminoácidos consecutivos en el polipéptido de la SEQ ID Nº: 1 (en lo sucesivo denominado "polipéptido A").
(b) El ADN que codifica el polipéptido antigénico de (a), en el que dicho polipéptido A es un polipéptido en el que una secuencia de aminoácidos o peptídica está unido a una secuencia de no menos de 20 aminoácidos consecutivos en el polipéptido de la SEQ ID Nº: 1.
(c) El ADN que codifica el polipéptido antigénico de (a), en el que dicho polipéptido A es un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 1.
El ADN que codifica el polipéptido antigénico de (a), en el que dicho polipéptido A es un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 2.
El ADN que codifica el polipéptido antigénico de (a), en el que dicho polipéptido A es un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 5.
Un ADN que codifica el polipéptido antigénico de uno cualquiera de (a)-(c) o un ADN complementario al mismo.
(d) El ADN de (c), que contiene la secuencia de bases de la SEQ ID Nº: 3.
El ADN de (c), que contiene la secuencia de bases de la SEQ ID Nº: 4.
El ADN de (c), que contiene la secuencia de bases de la SEQ ID Nº: 7.
(2) Un ADN que codifica una proteína fusionada de un polipéptido antigénico de Chlamydia pneumoniae con dihidrofolato reductasa, en el que el polipéptido codificado por el ADN de (1) está unido a dihidrofolato reductasa directamente o a través de un aminoácido o secuencia de aminoácidos intermedia, o un ADN complementario al mismo.
(3) El ADN de (2), en el que la proteína fusionada es un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 15 o SEQ ID Nº: 16.
(4) El ADN de (2) o (3), que contiene la secuencia de bases de la SEQ ID Nº: 17 o SEQ ID Nº: 18.
(5) Un vector recombinante que lleva el ADN de uno cualquiera de (1)-(4).
(6) El vector recombinante de (5), que es el plásmido PCPN533\alpha que contiene la secuencia de bases de la SEQ ID Nº: 10 o el plásmido PCPN533T, depositado bajo el número de acceso FERH BP 5222.
(7) Un transformante que contiene el vector recombinante de (5) o (6).
(8) Una sonda o cebador para la detección y/o medición de un gen de Chlamydia pneumoniae, que comprende uno cualquiera de:
(a) un ADN que contiene una secuencia de al menos 20 bases consecutivas en el ADN de la SEQ ID Nº: 3; y
(b) un ADN complementario al ADN (a).
(9) La sonda de (8), que contiene la secuencia de bases de la SEQ ID Nº: 19 o SEQ ID Nº: 20.
(10) Un método para la detección y/o medición de un gen de Chlamydia pneumoniae, caracterizado por que se usa la sonda o cebador de uno cualquiera de (8) o (9).
(11) Un reactivo para la detección y/o medición de un gen de Chlamydia pneumoniae, que comprende la sonda o cebador de uno cualquiera de (8) o (9).
(12) Un conjunto de cebadores de PCR para la detección y/o medición de un gen de Chlamydia pneumoniae, en el que cada cebador comprende uno cualquiera de:
(a) un ADN que contiene una secuencia de al menos 15 bases consecutivas en el ADN de la SEQ ID Nº:3; y
(b) un ADN complementario al ADN (a).
Descripción detallada de la invención
En la memoria descriptiva, los desoxinucleótidos que tienen sólo una base se denominan "monodesoxinucleótidos" y los desoxinucleótidos que tienen al menos dos bases se denominan "ADN" a menos que se indique otra cosa.
La invención se explicará a continuación en detalle.
Polipéptido antigénico
El polipéptido antigénico codificado por el ADN de la presente invención está formado por polipéptidos que contienen no menos de 20 aminoácidos seguidos en un polipéptido de la SEQ ID Nº: 1 (en lo sucesivo denominado "Polipéptido A") desde el punto de vista del tamaño mínimo, permitiendo que un péptido posea antigenicidad.
Ya que puede esperarse que la reacción antígeno-anticuerpo aumente en sensibilidad a medida que aumenta la longitud de la secuencia de aminoácidos, el polipéptido A está apropiadamente formado por no menos de 20, preferiblemente no menos de 100 y, más preferiblemente, no menos de 250 aminoácidos.
Siempre que el polipéptido A posea la antigenicidad inherente a Chlamydia pneumoniae, tolera la pérdida de aminoácidos (1-250 aminoácidos, por ejemplo) del polipéptido de la SEQ ID Nº: 1. Si el número de aminoácidos ausentes es excesivamente grande, tenderá a verse afectada la antigenicidad inherente a Chlamydia pneumoniae del polipéptido A.
Cuando el número de aminoácidos ausentes es grande (cinco o más, por ejemplo), se prefiere que la ausencia de dichos aminoácidos en el polipéptido A (cinco o más, por ejemplo) tenga lugar en una serie continua para conservar la antigenicidad de Chlamydia pneumoniae.
Siempre que el polipéptido A posea la antigenicidad inherente a Chlamydia pneumoniae, tolera la sustitución de parte de los aminoácidos (1-100 aminoácidos, por ejemplo) por otros aminoácidos o la inserción de aminoácidos (1-100 aminoácidos, por ejemplo) en el polipéptido de la SEQ ID Nº: 1. Si el número de aminoácidos implicados en la sustitución o inserción es excesivamente grande, tenderá a verse afectada la antigenicidad inherente a Chlamydia pneumoniae del polipéptido A. Cuando el número de aminoácidos implicados en la sustitución o inserción es grande (cinco o más, por ejemplo), se prefiere que los aminoácidos del polipéptido A (cinco o más, por ejemplo) aparezcan en una serie continua para conservar la antigenicidad de Chlamydia pneumoniae. Se prefiere que los aminoácidos que van a estar implicados en la sustitución posean cualidades similares tales como las observadas en la sustitución entre glicina y alanina, por ejemplo.
Siempre que el polipéptido A posea la antigenicidad inherente a Chlamydia pneumoniae, puede ser un polipéptido que tenga aminoácidos o péptidos ligados directamente, o por medio de una secuencia de aminoácidos intermedia, a secuencias de al menos cinco aminoácidos seguidos en el polipéptido de la SEQ ID Nº: 1.
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Los péptidos para la ligación están apropiadamente formados por secuencias de no más de 1000 aminoácidos, preferiblemente secuencias de no más de 500 aminoácidos y, más preferiblemente, secuencias de no más de 200 aminoácidos para conservar la antigenicidad inherente a Chlamydia pneumoniae.
Como ejemplos concretos de dichos aminoácidos o péptidos, pueden citarse leucina, leucina-metionina, ácido dihidrofólico reductasa (DHFR) y \beta-galactosidasa.
Como ejemplos concretos del polipéptido A usando DHFR o \beta-galactosidasa como péptido, pueden citarse proteína fusionada de DHFR-polipéptido antigénico de Chlamydia pneumoniae y proteína fusionada de \beta-galactosidasa-polipéptido antigénico de Chlamydia pneumoniae. Puede ligarse DHFR o \beta-galactosidasa directamente o por medio de una secuencia de aminoácidos intermedia con polipéptido antigénico de Chlamydia pneumoniae.
Como ejemplos concretos del polipéptido A, pueden citarse los polipéptidos de la SEQ ID Nº: 1, SEQ ID Nº: 2 y SEQ Nº: 5.
Aunque la secuencia de aminoácidos intermedia no está definida particularmente, son ejemplos las secuencias de aminoácidos de leucina y leucina-metionina.
Como ejemplos concretos de la proteína fusionada de la presente invención, puede citarse el polipéptido formado por secuencias de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 15 y el polipéptido formado por secuencias de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 16.
Entre las proteínas fusionadas citadas anteriormente, el polipéptido formado por las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 15, incluyendo el polipéptido antigénico completo de 53 kDa de Chlamydia pneumoniae demuestra ser particularmente ventajoso.
El método de síntesis química y el método de recombinación genética están disponibles para la producción del polipéptido antigénico de esta invención.
El polipéptido de la SEQ ID Nº: 1 de esta invención es un polipéptido antigénico formado por 488 restos aminoacídicos, como se muestra en la tabla de secuencias.
El polipéptido de la SEQ. ID Nº: 2 de esta invención es un polipéptido antigénico formado por 271 restos aminoacídicos, como se muestra en la tabla de secuencias.
El polipéptido de la SEQ ID Nº: 5 de esta invención es un polipéptido antigénico formado por 259 restos aminoacídicos, como se muestra en la tabla de secuencias.
Entre otros polipéptidos antigénicos mencionados anteriormente, demuestra ser particularmente ventajoso el polipéptido de la SEQ ID Nº: 1 que contiene el polipéptido antigénico completo de 53 kDa de Chlamydia pneumoniae.
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Método para la producción de polipéptido antigénico
El método de síntesis química y el método de recombinación genética están disponibles para la producción del polipéptido antigénico de esta invención.
Entre los métodos de síntesis química se cuenta el método MAP (péptido antigénico múltiple). El método MAP se corresponde con la síntesis de un péptido formado por secuencias de no más de 30 aminoácidos. Esta síntesis puede ponerse en práctica mediante el uso de un dispositivo de síntesis de péptidos disponible en el mercado.
Entre los métodos de recombinación genética se cuenta un método que comprende insertar un ADN que codifica el polipéptido antigénico de esta invención en un vector, construyendo de este modo un vector recombinante, insertar el vector recombinante en un hospedador, produciendo de este modo un transformante, y aislar el péptido objetivo a partir del transformante.
El ADN que codifica el polipéptido antigénico de esta invención se describirá más adelante.
El vector puede ser un plásmido, fago, etc.
Como ejemplos concretos del hospedador, pueden citarse Escherichia coli, Bacillus subtilis, levaduras, etc.
Ahora, el método para formar el transformante y el método para refinar el péptido objetivo mediante el uso del transformante se describirán en detalle a continuación.
Preparación de vector recombinante que lleva el ADN que codifica el polipéptido antigénico y transformantes que lo contienen
El fago \lambda obtenido por exploración (véase a continuación) ya es una clase de vector recombinante que lleva el ADN de la invención. Pueden prepararse vectores recombinantes adicionales por inserción en un vector plasmídico o vector fago conocido del ADN que codifica el polipéptido antigénico de Chlamydia pneumoniae (véase a continuación) en un procedimiento convencional. En este caso, puede usarse un enlazador si es necesario. Como el vector plasmídico conocido, puede usarse pBR322, pUC18, pUC19, pBBK10MM o similares. Los plásmidos pBR322, pUC18 y pUC19 están disponibles en el mercado y el pBBK10MM se describe en detalle en la Publicación de Patente Japonesa no examinada Nº Hei 4-117284. Como el vector fago, puede usarse el fago \lambda gt11, el fago \lambda gt10 o similar. En cualquier caso, pueden obtenerse vectores recombinantes que se corresponden con los vectores parentales usados.
Los vectores recombinantes que llevan el ADN de la invención incluyen el plásmido pCPN533 \alpha, el fago \lambda 53-3S y similares (véase a continuación).
El vector recombinante obtenido se introduce en un hospedador para preparar un transformante. Si se usa un plásmido derivado de E. coli o fago \lambda, puede usarse una cepa de E. coli tal como HB 101 como hospedador. El hospedador se trata para convertirlo en una célula competente. Una célula competente obtenida por tratamiento de la cepa de E. coli HB101 está disponible en el mercado en Takara Shuzo Co., Ltd. Se describe un método de introducción del vector recombinante en un hospedador para preparar un transformante en "Molecular Cloning".
El transformante obtenido se cultiva para formar colonias. Se obtienen ADN plasmídicos a partir de cada una de las colonias y se escinden con una enzima de restricción apropiada. Se selecciona un transformante que tenga un plásmido recombinante deseado de acuerdo con los resultados de un análisis electroforético en gel de agarosa del ADN plasmídico escindido. Los vectores plasmídicos preparados de este modo incluyen el plásmido pCPN533 \alpha.
Los ejemplos del transformante preparado de este modo incluyen la cepa de E. coli HB101 que contiene el vector recombinante pCPN533 \alpha.
Preparación de vectores recombinantes que llevan el ADN que codifica una proteína fusionada del polipéptido antigénico de Chlamydia pneumoniae con DHFR y transformantes que lo contienen
La molécula de ADN que codifica el polipéptido antigénico de Chlamydia pneumoniae (véase a continuación) se liga con la molécula de ADN que codifica DHFR (véase a continuación) por medio de un kit disponible en el mercado. En la ligación, puede usarse un enlazador si es necesario. Puede usarse un kit de ligación de ADN (Takara Shuzo Co., Ltd) como un kit disponible en el mercado. Si el ADN obtenido mediante la ligación no tiene un origen de replicación y, por lo tanto, no funciona como un plásmido, el ADN se inserta en un vector plasmídico separado que puede ser pBR322, pUC18 o similar.
El ADN ligado se introduce en un hospedador para preparar un transformante. Si se usa un plásmido derivado de E. coli, puede usarse una cepa de E. coli tal como HB 101 como hospedador. El hospedador se trata para convertirlo en una célula competente. Una célula competente obtenida por tratamiento de la cepa de E. coli HB 101 está disponible en el mercado en Takara Shuzo Co., Ltd. Se describe el método de introducción del ADN ligado en un hospedador para preparar un transformante en "Molecular Cloning".
El transformante obtenido se cultiva para formar colonias. Se obtienen ADN plasmídicos a partir de cada una de las colonias y se escinden con una enzima de restricción apropiada. Se selecciona un transformante que tiene un plásmido recombinante deseado de acuerdo con los resultados de un análisis electroforético en gel de agarosa. Un ejemplo del vector plasmídico preparado de este modo es el plásmido pCPN533T.
Un ejemplo del transformante preparado de este modo es la cepa de E. coli HB101 que contiene el vector recombinante pCPN533T.
El transformante se cultiva en agitación en un incubador que contiene el transformante a una temperatura apropiada en un medio que permite al transformante crecer hasta que se acumule en el transformante una cantidad suficiente del polipéptido antigénico deseado. Si la cepa de E. coli HB101 que contiene los vectores recombinantes pCPN533 \alpha o pCPN533T se usa como transformante, la célula se cultiva mientras se agita en medio LB que contiene ampicilina a 37ºC durante una noche. Posteriormente, el cultivo se inocula en medio TB que contiene ampicilina y se cultiva adicionalmente mientras se agita a 37ºC durante una noche. Se describe un método para preparar el medio TB en "Molecular Cloning".
El transformante cultivado se recoge por centrifugación y se suspende en un tampón. El transformante se rompe por sonicación de la suspensión. Si el transformante es E. coli, la célula puede lisarse añadiendo sucesivamente lisozima y un tampón que contiene SDS a la suspensión.
Cuando el polipéptido objetivo es de calidad secretora, el caldo de cultivo se centrifuga para obtener el sobrenadante.
Después de la rotura del transformante, el residuo celular se retira por centrifugación, obteniendo de este modo el sobrenadante. Se añade sulfato de estreptomicina al sobrenadante. La mezcla se agita durante un cierto periodo de tiempo y se centrifuga para precipitar ácidos nucleicos, obteniendo de este modo el sobrenadante.
Este sobrenadante se precipita con sulfato de amonio y se centrifuga. Generalmente, el precipitado se recupera como el producto. Puesto que el sobrenadante contiene posiblemente el péptido objetivo, la práctica de tomar muestras y analizar el sobrenadante, confirmando de este modo la presencia o ausencia del péptido, demuestra ser ventajosa.
La solución del precipitado en una pequeña cantidad de solución de tampón o el sobrenadante se fraccionan mediante cromatografía líquida. Las proteínas contenidas en las fracciones se transfieren mediante el método de transferencia de Western usando un anticuerpo monoclonal específico de Chlamydia pneumoniae para obtener las fracciones que contienen polipéptido antigénico. Cuando el polipéptido A es una proteína fusionada con DHFR, puede usarse una columna de metotrexato como la columna para la cromatografía líquida. Se describen procedimientos específicos de eliminación de residuos tales como una membrana celular y similares, retirada de ADN por adición de sulfato de estreptomicina, recuperación de proteínas por adición de sulfato de amonio y un método de transferencia de Western en "Molecular Cloning".
ADN que codifican los polipéptidos antigénicos
En la invención, el ADN que codifica el polipéptido de la SEQ ID Nº: 1 se refiere a ADN seleccionados del grupo de ADN que se obtienen por traducción de los aminoácidos del polipéptido de la SEQ ID Nº: 1 en tripletes de acuerdo con el código genético (a cada aminoácido se le asignan 1-6 conjuntos de secuencias de nucleótidos). Este grupo de ADN incluye el ADN de la SEQ ID Nº: 3.
El ADN que codifica el polipéptido antigénico A se refiere a ADN que codifican el polipéptido A. Estos ADN se seleccionan del grupo de ADN que se obtienen por traducción de la secuencia de aminoácidos del polipéptido A en tripletes de acuerdo con el código genético.
En cuanto al polipéptido A, pueden proporcionarse los polipéptidos que se han descrito bajo el punto "Polipéptidos antigénicos" anterior. En cuanto al ADN que codifica el polipéptido A, pueden proporcionarse secuencias de nucleótidos que se corresponden con las secuencias de aminoácidos de esos polipéptidos.
De forma similar, el ADN que codifica el polipéptido de la SEQ ID Nº: 2 se refiere a ADN seleccionados del grupo de ADN que se obtienen por traducción de los aminoácidos del polipéptido de la SEQ ID Nº: 2 en tripletes de acuerdo con el código genético. Este grupo de ADN incluye el ADN de la SEQ ID Nº: 4.
Además, el ADN que codifica el polipéptido de la SEQ ID Nº: 5 se refiere a ADN seleccionados del grupo de ADN que se obtienen por traducción de los aminoácidos del polipéptido de la SEQ ID Nº: 5 en tripletes de acuerdo con el código genético. Este grupo de ADN incluye el ADN de la SEQ ID Nº: 7.
Además, el ADN que codifica el polipéptido de la SEQ ID Nº: 6 se refiere a ADN seleccionados del grupo de ADN que se obtienen por traducción de los aminoácidos del polipéptido de la SEQ ID Nº: 6 en tripletes de acuerdo con el código genético. Este grupo de ADN incluye el ADN de la SEQ ID Nº: 8.
Los ADN que codifican las proteínas fusionadas comprenden codones que se corresponden con la secuencia de aminoácidos de la proteína fusionada. Los ADN incluyen, pero sin limitación, los ADN de las SEQ ID Nº: 17 y 18.
La secuencia de bases de la SEQ ID Nº: 17 es la secuencia de bases del ADN que codifica la proteína fusionada de DHFR y el polipéptido antigénico completo de 53 kDa de Chlamydia pneumoniae y la secuencia de bases de la SEQ ID Nº: 18 es la secuencia de bases del ADN que codifica la proteína fusionada de DHFR y (parte de) el polipéptido antigénico de 53 kDa de Chlamydia pneumoniae.
Estos ADN pueden fabricarse por el método de síntesis química o el método de recombinación genética.
Entre los métodos de síntesis química se cuenta el método de fosforamidita, que se corresponde con la síntesis de un ADN formado en una longitud de secuencias de no más de 100 bases. Esta síntesis química puede lograrse mediante un dispositivo de síntesis de ADN disponible en el mercado.
Entre los métodos de recombinación genética se cuenta un método para clonar el ADN del cuerpo elemental de Chlamydia pneumoniae de la forma ya descrita y el método de PCR que utiliza el ADN ya obtenido como molde y que usa un cebador fabricado adoptando la secuencia de bases en una posición seleccionada arbitrariamente en ese ADN. El método de recombinación genética es capaz de fabricar un ADN largo de más de 100 bases.
Ahora, el método para clonar el ADN que codifica el polipéptido antigénico del cuerpo elemental de Chlamydia pneumoniae se describirá en detalle a continuación.
Cultivo de Chlamydia pneumoniae
Se prepara una suspensión de células a partir de células HL cultivadas. El sobrenadante del cultivo se elimina y después se añade la suspensión de Chlamydia pneumoniae a la lámina de células resultante. Después de la incubación, se obtienen células HL infectadas con Chlamydia pneumoniae por centrifugación. Como Chlamydia pneumoniae, puede usarse la cepa YK41 (Y. Kanamoto et al., Micro Biol. Immunol., Vol. 37, págs. 495-498, 1993).
Purificación de cuerpo elemental de Chlamydia pneumoniae
Las células HL infectadas con Chlamydia pneumoniae se rompen y se centrifugan, recuperando de este modo el sobrenadante. El sobrenadante obtenido se estratifica por centrifugación en una solución de gradiente de densidad continuo que contiene urografina (Schering).
Se recuperó la banda blanca amarillenta porque en el experimento preliminar se confirmó que contenía el cuerpo elemental de Chlamydia pneumoniae con ayuda de un microscopio electrónico.
Preparación de ADN genómico de Chlamydia pneumoniae
El cuerpo elemental de Chlamydia pneumoniae se suspende en tampón Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) que contiene diaminotetraacetato de etileno (EDTA) 1 mM (en lo sucesivo denominado "tampón TE"). A la suspensión resultante se añade una solución acuosa al 1% de dodecilsulfato sódico (SDS) y una solución acuosa de proteinasa K (1 mg/ml) y el cuerpo elemental se lisa mientras se incuba. A la solución resultante se añade fenol saturado con tampón Tris-HCl 0,1 M (pH 8,0). La mezcla se agita y se centrifuga para recuperar una fase acuosa. La fase acuosa obtenida se trata sucesivamente con ARNasa y fenol/cloroformo/alcohol isoamílico, seguido de precipitación con etanol. Como resultado, se obtiene ADN genómico de Chlamydia pneumoniae.
Preparación de una genoteca de expresión de ADN genómico
El ADN genómico se digiere con las enzimas de restricción AccI, HaeIII y AluI. El producto digerido se trata con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y se somete a precipitación con etanol para dar ADN parcialmente digeridos. A los ADN parcialmente digeridos se les añade un enlazador, adenosina 5'-trifosfato (en lo sucesivo abreviado como "ATP") y ligasa T4, ligando de este modo el enlazador a los ADN parcialmente digeridos.
Los ADN parcialmente digeridos ligados a enlazador se aplican a una columna Chroma spin 6000, en la que la fase móvil es tampón Tris-HCl 10 mM, que contiene NaCl 0,1 M y EDTA 1 mM. Se recoge el eluido y se recuperan fracciones que contienen fragmentos de ADN de 1-7 kpb. A las fracciones resultantes se añade ATP y polinucleótido quinasa T4 y se realiza una reacción para fosforilar el extremo 5' de los fragmentos de ADN. La solución de reacción se trata con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y se somete a precipitación con etanol para dar fragmentos de ADN con extremo 5' fosforilado.
A los fragmentos de ADN resultantes se añade ADN de \lambda gt11 previamente digerido con la enzima de restricción EcoRI, ATP y ligasa T4 y se realiza una reacción. El ADN de \lambda gt11 recombinante resultante se empaqueta con un kit de empaquetamiento disponible en el mercado para preparar una genoteca de expresión de ADN genómico.
Clonación de ADN que codifica polipéptido antigénico
Se infectan células cultivadas de E. coli cepa Y1090r- con la genoteca de expresión de ADN genómico y se incuban en un medio de agar. Se transfiere una proteína producida en las células por expresión del ADN insertado a un filtro de nitrocelulosa sumergido en una solución acuosa de isopropiltio-\beta-D-galactósido (IPTG). El filtro se bloquea con una albúmina de suero bovino y se lava. Después, el filtro se hace reaccionar con un anticuerpo monoclonal específico de Chlamydia pneumoniae. Como el anticuerpo monoclonal específico de Chlamydia pneumoniae puede usarse AY6E2E8 y SCP53. Se ha depositado una línea celular de hibridoma que produce AY6E2E8 en el Instituto Nacional de Biociencias y Tecnología Humana, la Agencia de Ciencia Industrial y Tecnología (1-3, Higashi 1 chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305, Japón) como FERM BP-5154 bajo los términos del Tratado de Budapest. Se describe una línea celular de hibridoma que produce SCP53 en J. Clin. Microbiol., Vol. 132, págs. 583-588, 1994. Después de la reacción, el filtro se lava y se hace reaccionar con un anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con una enzima tal como peroxidasa o similar. Después de la reacción, el filtro se lava y se hace reaccionar con una solución de substrato que desarrolla color. Como la solución de substrato que desarrolla color, puede usarse una mezcla de una solución acuosa de peróxido de hidrógeno y una solución de 4-cloro-1-naftol en metanol. Después de la reacción, el filtro se lava y se seca al aire.
Se identifican las placas que se corresponden con las manchas que desarrollan color sobre el filtro y se obtiene el fago \lambda contenido en las placas. El procedimiento anterior se repite hasta que todas las placas reaccionan con el anticuerpo monoclonal mencionado anteriormente. Como resultado, se clona el ADN que codifica un polipéptido antigénico y se obtiene fago \lambda que expresa el polipéptido antigénico específico de Chlamydia pneumoniae, que tiene reactividad con el anticuerpo monoclonal específico de Chlamydia pneumoniae.
Producción de ADN que codifica el polipéptido antigénico específico de Chlamydia pneumoniae
Se infecta la cepa Y1090r- de E. coli con el fago \lambda obtenido y se cultiva para dar una gran cantidad de fago \lambda. Se obtienen moléculas de ADN y se purifican a partir del fago \lambda usando un kit disponible en el mercado. A las moléculas de ADN obtenidas se les añade un cebador, polimerasa Taq y desoxinucleótidos. Se repiten las etapas de calentamiento, enfriamiento e incubación, amplificando de este modo la molécula de ADN insertada en \lambda gt11. Pueden usarse cebador directo de \lambda gt11 y un cebador inverso de \lambda gt11 (Takara Shuzo Co., Ltd.) como cebadores y puede usarse ADN polimerasa AmpliTaq como una polimerasa Taq. Se conoce un procedimiento general de amplificación de ADN como el método de PCR, que se describe en detalle en J. Sambrook et al., Molecular Cloning, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (en lo sucesivo denominado "Molecular Cloning").
Se obtiene el ADN amplificado y se determina y se analiza su secuencia de bases. El ADN amplificado puede obtenerse con un kit disponible en el mercado tal como Wizard PCR Prep kit (Promega). La secuencia de bases puede determinarse mediante secuenciación cíclica con terminadores marcados con fluorescencia usando una polimerasa Taq. Esta secuenciación puede realizarse con un kit disponible en el mercado en Perkin-Elmer Japón. Para el análisis de la secuencia de bases, puede usarse un aparato disponible en el mercado tal como el secuenciador de ADN Modelo 373A (Applied Biosystems).
Después de la determinación de la secuencia de bases, la secuencia de bases del ADN se analiza usando un paquete informático de secuenciación de ADN tal como DNASIS (Hitachi Software Engineering) para estimar y editar regiones de unión y de traducción de aminoácidos.
Si se descubre que no se ha obtenido un gen de longitud completa, se obtienen moléculas de ADN cadena arriba y cadena debajo del ADN disponible por paseo genómico. El paseo genómico puede realizarse con un kit disponible en el mercado en Takara Shuzo Co., Ltd.
Preparación de ADN que codifica DHFR
Se obtiene ADN que codifica DHFR por digestión del ADN con una enzima de restricción a partir de un vector plasmídico que contiene el ADN o por amplificación del ADN por PCR usando un ADN plasmídico o ADN genómico de molde que contiene el ADN con un cebador apropiado.
En el primer método, pueden usarse el vector plasmídico pBBK10MM y el vector recombinante pCPN533T de la invención como el vector plasmídico que contiene ADN que codifica DHFR. Se ha depositado una E. coli que contiene pCPN533T en el Instituto Nacional de Biociencias y Tecnología Humana, la Agencia de Ciencia Industrial y Tecnología, como FERM BP-5222. Puede obtenerse el plásmido pCPN533T a partir de la E. coli depositada mediante un método convencional para obtener ADN plasmídico que se describe en "Molecular Cloning". Cuando se usa el plásmido pBBK10MM, puede escindirse un fragmento de ADN que tiene una longitud de aproximadamente 4,8 kpb con las enzimas de restricción BamHI y XhoI.
En el último método, pueden usarse pBBK10MM y pCPN533T (véase anteriormente) como ADN plasmídico y puede usarse ADN genómico de Bacillus subtilis como ADN genómico. Puede obtenerse ADN genómico mediante un método convencional para obtener ADN genómico que se describe en "Molecular Cloning".
El cebador que se va a usar en el último método puede diseñarse y sintetizarse teniendo en cuenta las secuencias de bases en los extremos 5' y 3' del ADN que codifica DHFR. Por ejemplo, puede usarse un oligonucleótido que tenga la secuencia 1-20 en la secuencia de bases de la SEQ ID Nº: 17 y uno que tenga una secuencia complementaria a la secuencia 461-480 en la secuencia de base de la SEQ ID Nº: 5. Estos oligonucleótidos pueden sintetizarse químicamente con un sintetizador de ADN disponible en el mercado.
En los polipéptidos antigénicos mencionados anteriormente, se prefiere particularmente el polipéptido de la SEQ ID Nº: 1 que contiene el polipéptido antigénico completo de 53 kDa de Chlamydia pneumoniae
También se describe en este documento un método de producción de anticuerpo anti-Chlamydia pneumoniae mediante el uso del polipéptido antigénico como antígeno.
Puede producirse un anticuerpo anti-Chlamydia pneumoniae por inmunización de un ratón con el polipéptido antigénico de la invención como antígeno, separación de un esplenocito del ratón inmunizado, fusión del esplenocito con una línea celular de mieloma para producir hibridomas, selección de un hibridoma que reconozca el polipéptido antigénico de 53 kDa de Chlamydia pneumoniae a partir de los hibridomas producidos y cultivo del hibridoma seleccionado.
Las líneas celulares de mieloma ejemplares incluyen P3X63Ag8.653 (ATCC CRL-1580) y P3/NSI/1-Ag4-1 (ATTC TIB-18).
El anticuerpo anti-Chlamydia pneumoniae se produce mediante un procedimiento general conocido para obtener anticuerpos por inmunización de un ratón, excepto por que el polipéptido antigénico de la invención se usa como antígeno.
Métodos y reactivos para la detección y/o medición de anticuerpo anti-Chlamydia pneumoniae usando el polipéptido antigénico como antígeno y agentes para el diagnóstico de infecciones por Chlamydia pneumoniae que comprenden el polipéptido antigénico como ingrediente activo
Un método para la detección y/o medición de un anticuerpo anti-Chlamydia pneumoniae comprende, por ejemplo, las etapas de inmovilizar el polipéptido antigénico en un soporte, aplicar una muestra, lavar, añadir un anticuerpo secundario marcado, lavar y detectar y/o medir el marcador directamente o indirectamente.
Los ejemplos del soporte incluyen partículas de látex, hilos de celulosa, placas de ensayo y partículas de plástico y similares.
El polipéptido antigénico puede inmovilizarse sobre el soporte mediante formación de enlaces covalentes o adsorción física.
Los ejemplos de la muestra incluyen sueros humanos y similares. La superficie del soporte puede bloquearse con albúmina de suero bovino o similar antes de la adición de una muestra para asegurar que no se unirán inespecíficamente al soporte otros anticuerpos en la muestra.
El soporte se lava con un tampón fosfato que contiene un tensioactivo o similar.
Un ejemplo del anticuerpo secundario marcado es un anticuerpo monoclonal anti-humano marcado. Los marcadores útiles incluyen diversas clases de enzimas tales como fosfatasa alcalina, luciferasa, peroxidasa, \beta-galactosidasa y similares, diversos compuestos fluorescentes tales como fluoresceína y similares. Un compuesto químico tal como biotina, avidina, estreptavidina, digoxigenina o similar puede insertarse entre el anticuerpo y el marcador.
Cuando el marcador es una enzima, puede detectarse y/o medirse por adición de un substrato y detección y/o medición de la emisión de luz o del desarrollo de color que se produce debido a la acción catalítica de la enzima, o por medición del cambio en la absorbancia de luz. Cuando el marcador es un compuesto fluorescente, puede detectarse y/o medirse por irradiación del sistema de reacción con luz UV y detección y/o medición de la fluorescencia emitida. Puede usarse un sensibilizante si es necesario.
Los reactivos para la detección y/o medición del anticuerpo anti-Chlamydia pneumoniae usando el polipéptido antigénico de interés como antígeno incluyen los polipéptidos antigénicos que están inmovilizados en un soporte y los que incluyen las cantidades necesarias del anticuerpo secundario y del substrato.
Los reactivos mencionados anteriormente pueden usarse como agentes para el diagnóstico de infecciones por Chlamydia pneumoniae.
Sondas y cebadores para la detección y/o medición de un gen de Chlamydia pneumoniae
El ADN que codifica el polipéptido antigénico de 53 kDa de Chlamydia pneumoniae tiene la secuencia de bases de la SEQ ID Nº: 3.
Las sondas y cebadores de la invención comprenden ADN que contiene uno cualquiera de:
(a) un ADN que contiene una secuencia de al menos 10 bases consecutivas en el ADN de la SEQ ID Nº: 3,
(b) un ADN complementario al ADN (a).
La longitud de la secuencia de bases de las sondas y cebadores es preferiblemente de 10-50 pb, más preferiblemente de 15-20 pb.
Los ejemplos específicos de las sondas y cebadores de la invención incluyen un ADN que comprende la secuencia de bases de la SEQ ID Nº: 19 y un ADN que comprende la secuencia de bases de la SEQ ID Nº: 20.
Las sondas y cebadores de la invención pueden sintetizarse fácilmente con un sintetizador de ADN disponible en el mercado. Están disponibles en el mercado sintetizadores de ADN en Applied Biosystems y similares. Como alternativa, las sondas y cebadores de la invención pueden prepararse sintetizando químicamente un fragmento de ADN corto y sintetizando un fragmento de ADN largo por PCR usando el ADN corto como cebador.
Las sondas y cebadores de la invención incluyen los preparados por marcaje de dichos ADN.
Los marcadores ejemplares incluyen compuestos químicos tales como biotina, avidina, estreptavidina, digoxigenina y similares; enzimas tales como fosfatasa alcalina, luciferasa, peroxidasa, \beta-galactosidasa y similares; y compuestos fluorescentes tales como fluoresceína y similares. La biotina puede unirse a las sondas mediante, por ejemplo, adición de desoxiuridina 5'-trifosfato biotinilada a las sondas en presencia de una transferasa terminal. Puede adquirirse un kit que contiene una transferasa terminal y desoxiuridina 5'-trifosfato biotinilada en Boehringer Mannheim. En el caso en el que se va a unir un marcador distinto de biotina, también puede usarse un kit disponible en el mercado. Dicho kit puede adquirirse en Takara Shuzo Co., Ltd y TOYOBO CO., LTD. Como alternativa, el marcador puede unirse mediante un método descrito en "Molecular Cloning".
Si se desea, pueden usarse isótopos radiactivos como marcadores. En este caso, se añade (\gamma^{-32}P)dATP a las sondas y cebadores en presencia de polinucleótido quinasa T4. Se describe un procedimiento general de marcaje con un isótopo radiactivo en "Molecular Cloning". Puede adquirirse polinucleótido quinasa T4 en TOYOBO CO., LTD y (\gamma^{-32}P)dATP en Amersham.
Los ARN correspondientes a las secuencias de bases de las sondas y cebadores de la invención, es decir, ácidos nucleicos en los que la timina se sustituye con uracilo en el resto de base y en el que las desoxirribosas se sustituyen con ribosas en la cadena de azúcar, pueden usarse como las sondas y cebadores de la invención en lugar de las sondas y cebadores mencionados anteriormente que comprenden ADN como unidades estructurales. Estas sondas y cebadores que comprenden ARN como unidades estructurales pueden usarse en el método y en los reactivos para la detección y/o medición de la invención.
Método para la detección y/o medición de un gen de Chlamydia pneumoniae
Un gen de Chlamydia pneumoniae se detecta y/o mide, por ejemplo, por separación de ADN en una muestra basándose en la diferencia en peso molecular mediante electroforesis, transferencia del ADN obtenido a un filtro de nitrocelulosa, filtro de membrana de nylon o similar para su identificación, adición de la sonda marcada de la invención y detección y/o medición del marcador. Este método se denomina la técnica de transferencia de Southern y su procedimiento general se describe en "Molecular Cloning".
Un gen de Chlamydia pneumoniae se detecta y/o mide con el cebador de la invención, por ejemplo, mediante el método de PCR que se ha descrito anteriormente. El método para detectar y/o medir un gen de Chlamydia pneumoniae por PCR usando el cebador de la invención comprende las siguientes etapas.
(i) Se añade un tampón que contiene el cebador de la invención, ADN polimerasa, dATP, dCTP, dGTP y dTTP a una muestra que contiene ADN y se calienta la mezcla.
(ii) La solución de reacción se enfría, se mantiene a una temperatura constante y se calienta.
(iii) Se repite la etapa (ii).
(iv) Se detecta y/o mide el ADN contenido en la solución de reacción.
La muestra que contiene ADN que se va a usar en la etapa (i) pueden ser ácidos nucleicos según se extraen de la mucosa de la faringe de un paciente.
La ADN polimerasa que se va a usar en la etapa (i) puede ser una polimerasa Taq que puede adquirirse en TOYOBO CO., LTD.
En la etapa (i), la mezcla se calienta, por ejemplo, dejándola reposar a 90-100ºC durante 0,5-10 minutos.
En la etapa (ii), la solución de reacción se enfría, por ejemplo, dejándola reposar a 45-65ºC durante 0,5-5 minutos, se mantiene a temperatura constante, por ejemplo, a 70-80ºC durante 1-10 minutos y se calienta, por ejemplo, dejándola reposar a 90-100ºC durante 0,5-5 minutos.
El calentamiento en la etapa (i) y el enfriamiento, mantenimiento a una temperatura constante y calentamiento en la etapa (ii) pueden llevarse a cabo usando un DNA thermal cycler® (Perkin-Elmer Cetus).
La etapa (iii) puede repartirse cualquier número de veces, preferiblemente aproximadamente 30 veces.
El ADN contenido en la solución de reacción se detecta y/o mide en la etapa (iv), por ejemplo, sometiendo a electroforesis la solución de reacción con un gel de agarosa que contiene bromuro de etidio y, por lo tanto, separando el ADN en la solución de reacción basándose en la diferencia en peso molecular e irradiando el gel de agarosa con luz UV. Si el cebador de la invención es uno marcado, el ADN se detecta y/o mide con ayuda del marcador.
En otra realización de la invención, después de las etapas (i)-(iii), el cebador de la invención puede sustituirse con uno que tenga otra secuencia de bases y se repiten las etapas (i)-(iii), seguidas de la etapa (iv).
Reactivos para la detección y/o medición de un gen de Chlamydia pneumoniae
Un reactivo ejemplar para la detección y/o medición de un gen de Chlamydia pneumoniae de acuerdo con la invención es una solución acuosa de la sonda o cebador de la invención que se envasa congelada en un recipiente de plástico.
Mejor modo de llevar a cabo la invención
Ahora, esta invención se describirá en detalle a continuación con referencia a ejemplos.
Ahora, las etapas componentes del proceso desde el cultivo de células hospedadoras de Chlamydia pneumoniae hasta la determinación de la secuencia de ADN de un gen/secuencia de aminoácidos del polipéptido antigénico de Chlamydia pneumoniae se describirán a continuación en el orden en que tienen lugar.
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Ejemplo 1 Preparación de ADN que codifica un polipéptido antigénico de 53 K específico para Chlamydia pneumoniae (A) Cultivo de células hospedadoras (células HL)
Las células HL cultivadas de antemano hasta la confluencia en la superficie del fondo de una matraz de cultivo de plástico (75 cm^{2}) se lavaron con 5 ml de una solución sin magnesio (-) de una solución salina fisiológica tamponada con fosfato (en lo sucesivo denominado "PBS"), se recubrieron por toda la superficie completa del mismo con 5 ml de un PBS que contenía tripsina al 0,1% (p/v), se les privó del exceso de solución, se mantuvieron calientes a 37ºC durante 10 minutos y se hizo añadir 5 ml de un medio de cultivo MEM de Dulbecco que contenía suero fetal bovino al 10% (v/v). Las células HL que se adherían al interior del matraz se retiraron por pipeteo para obtener una suspensión celular.
El cultivo en un matraz de cultivo de plástico (75 cm^{2}) se llevó a cabo por carga del matraz de cultivo con 1 ml de la suspensión celular mencionada anteriormente y de 5 a 20 ml del medio de cultivo MEM de Dulbecco que contenía suero fetal bovino al 10% (v/v), y el cultivo en un recipiente de cultivo de plástico de 6 pocillos se efectuó por colocación en cada uno de los 6 pocillos de 4 ml de una solución mixta que consistía en 8 ml de la suspensión celular mencionada anteriormente y 292 ml del medio de cultivo MEM de Dulbecco que contenía suero fetal bovino al 10% y realización del cultivo en un ambiente que contenía gas dióxido de carbono al 5% (v/v).
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(B) Cultivo de Chlamydia pneumoniae YK41
A partir de la solución de cultivo de las células HL propagadas en un recipiente de cultivo de plástico de 6 pocillos (sobre la superficie del fondo del mismo), se retiró el sobrenadante con una pipeta. La lámina de células residual en el recipiente de cultivo, después de añadir 2 ml por pocillo de la suspensión de la cepa YK41 de Chlamydia pneumoniae (Kamoto et al., Microbiol. Immunol., Vol. 37, págs. 495-498, 1993) [el sobrenadante se obtiene por dilución de una solución conservada de Chlamydia pneumoniae YK41 de 12 a 24 veces el volumen original con una solución acuosa que contiene 75 g de sacarosa, 0,52 g de fosfato monopotásico, 1,22 g de fosfato dipotásico y 0,72 g de ácido glutámico por litro (en lo sucesivo denominado "SPG"), tratamiento de la solución diluida con una onda supersónica durante un minuto y sometimiento de la solución diluida resultante a separación por centrifugación a 2.000 rpm durante tres minutos], se sometió a adsorción por centrifugación a 2.000 rpm durante una hora. Después de la adsorción por centrifugación, se retiró la suspensión de Chlamydia pneumoniae de la lámina de células resultante. La lámina de células residual, después de añadir 4 ml por pocillo de un medio de cultivo MEM de Dulbecco que contenía 1 \mug de cicloheximida por ml y el 10% (v/v) de suero fetal bovino, se cultivó a 36ºC durante tres días en un ambiente que contenía gas dióxido de carbono al 5% (v/v). Después de este cultivo, las células que se adherían al recipiente de cultivo se separaron con un rascador de silicona esterilizado y se recuperaron. Las células se centrifugaron a 8.000 rpm durante 30 minutos. Posteriormente, el sedimento obtenido se resuspendió en SPG y la suspensión resultante se almacenó a -70ºC.
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(C) Purificación de cuerpo elemental de Chlamydia pneumoniae YK41
La suspensión congelada de células HL infectadas con la Chlamydia pneumoniae YK41 conservada a -70ºC se fundió y se homogeneizó mediante el uso de un homogeneizador. El homogeneizado se separó por centrifugación a 2.500 rpm durante 10 minutos y por consiguiente se recuperó el sobrenadante formado. El sedimento se suspendió de nuevo en SPG y se trató de la misma forma que se ha descrito anteriormente para recuperar un nuevo sobrenadante. Este procedimiento se repitió dos veces más. Los sobrenadantes sucesivos se juntaron en un volumen.
Por separado, en un tubo de centrifugación, se echó un tampón tris-clorhidrato 0,03 M (pH 7,4) que contenía sacarosa al 50% (p/v), después se superpuso una solución mixta de 3 partes por volumen de urografina al 76% (producida por Schering Corporation) con 7 partes por volumen de tampón tris-clorhidrato 0,03 M (pH 7,4) y posteriormente el sobrenadante recuperado como se ha descrito anteriormente se superpuso cuidadosamente sobre la capa de la solución mixta. Las capas superpuestas en el tubo de centrifugación se centrifugaron a 8.000 rpm durante una hora. La capa del tampón tris-clorhidrato 0,03 M (pH 7,4) que contenía sacarosa al 50% (p/v) y el sedimento se recuperaron del tubo. La solución recuperada y el SPG añadido a la misma en un volumen equivalente se sometieron a centrifugación a 10.000 rpm durante 30 minutos. A partir de las fases separadas resultantes, se desechó el sobrenadante y el sedimento se suspendió en SPG. En los tubos de centrifugación, se dispusieron soluciones de gradiente de densidad continuo que consistían en del 35% al 50% de urografina al 76% (producida por Schering Corporation) en tampón tris-clorhidrato 0,03 M (pH 7,4) (proporciones en volumen del primer componente con respecto al volumen total de solución) y la suspensión mencionada anteriormente se superpuso sobre las mismas. Las capas superpuestas en los tubos se centrifugaron a 8.000 rpm durante una hora. Cuando se obtuvo una muestra de una pequeña cantidad de la banda blanco amarillenta y se observó bajo un microscopio electrónico, se descubrió que contenía el cuerpo elemental de Chlamydia pneumoniae. De este modo, esta banda se recuperó y se diluyó con SPG hasta dos veces el volumen original y se centrifugó a 10.000 rpm durante 30 minutos. El sedimento obtenido como consecuencia de la centrifugación se suspendió en SPG, se ensayó para determinar la concentración de proteína (con ayuda de un kit de análisis de proteína producido por Biorad Corp, con albúmina de suero bovino como patrón) y se almacenó a -70ºC.
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(D) Preparación de ADN genómico de la cepa YK41 de Chlamydia pneumoniae
Se centrifugaron trescientos (300) \mul de una suspensión del cuerpo elemental de la cepa YK-41 de Chlamydia pneumoniae purificada mencionada anteriormente (concentración de proteína: 1,37 mg/ml) a 4ºC a 12.000 rpm durante cinco minutos. El sedimento resultante se suspendió en 500 \mul de tampón tris 10 mM (pH 8,0) que contenía EDTA 1 mM (en lo sucesivo denominado "tampón TE"). Se repitió la misma centrifugación y el sedimento resultante se suspendió en 300 \mul de tampón TE. La suspensión producida y 30 \mul de una solución acuosa de SDS al 2% y 30 \mul de una solución acuosa de proteinasa K 1 mg/ml añadidos a la misma se incubaron a 56ºC durante 30 minutos para efectuar la disolución del cuerpo elemental. La solución incubada y 350 \mul de tampón tris-clorhidrato 0,1 M saturado con fenol (pH 8,0) añadido a la misma se agitaron minuciosamente con un mezclador vorticial. La mezcla resultante se centrifugó a 4ºC a 12.000 rpm durante cinco minutos. A partir de las fases separadas, se recuperó la fase acuosa (para extracción de ADN). Este procedimiento de extracción se repitió una vez más. La fase acuosa y 2 \mul de una solución de ARNasa 10 mg/ml añadida a la misma se incubaron a 37ºC durante dos horas para efectuar la descomposición del ARN. La solución incubada y 300 \mul de una solución mixta que consistía en un tampón tris-clorhidrato 0,1 M saturado con fenol (pH 8,0), cloroformo y alcohol isoamílico a una relación volumétrica de 25:24:1 (en lo sucesivo denominado "PCI") se agitaron minuciosamente con un mezclador vorticial. La mezcla resultante se centrifugó a 4ºC a 12.000 rpm durante cinco minutos. A partir de las fases separadas, se recuperó la fase acuosa. Este procedimiento se repitió hasta una quinta vez.
Una parte por volumen de la solución resultante y 1/10 parte por volumen de una solución acuosa de acetato de amonio 10 M y dos partes por volumen de etanol añadidas a la misma se dejaron reposar durante cinco minutos para efectuar la precipitación del ADN. La solución mixta resultante se centrifugó a 4ºC a 12.000 rpm durante cinco minutos. El sedimento más 600 \mul de una solución acuosa de etanol al 70% se agitaron minuciosamente y se centrifugaron a 4ºC a 12.000 rpm durante cinco minutos para efectuar la purificación. Este procedimiento se repitió dos veces más. El contenido de los tubos de centrifugación se dejó reposar durante 15 minutos con las tapas de los tubos mantenidas abiertas para secar el sedimento. El sedimento seco se disolvió con 200 \mul de TE y la solución resultante se almacenó a -20ºC.
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(E) Preparación de una genoteca de expresión de ADN genómico
Cien (100) \mul de una solución de ADN genómico y 10 \mul de un tampón M de uso con endonucleasa de restricción y 10 \mul de una solución mixta de endonucleasa de restricción (obtenida por mezcla de 0,4 \mul de cada una de AccI, Hae III y una dilución 1/50 de AluI con 20 \mul de TE) añadida a la misma se dejaron reaccionar a 37ºC durante 20 minutos. El tiempo de reacción de 20 minutos mencionado anteriormente era una duración necesaria para que el ADN se decompusiera en fracciones de ADN parcialmente digerido de tamaños que variaban de 1 kpb a 7 kpb. Se descubrió empíricamente de antemano mediante el uso de una pequeña cantidad de ADN genómico. La solución de reacción resultante y 100 \mul de PCI añadidos a la misma se agitaron minuciosamente con un mezclador vorticial y la mezcla producida se centrifugó a 4ºC a 12.000 rpm durante cinco minutos. La fase acuosa se recuperó a partir de las fases separadas obtenidas por consiguiente. La fase acuosa recuperada y 10 \mul de una solución acuosa de acetato de sodio 3 M y 220 \mul de etanol añadidos a la misma se dejaron reposar a -80ºC durante 15 minutos para efectuar la precipitación del ADN parcialmente digerido. La solución mixta producida se centrifugó a 4ºC a 12.000 rpm durante cinco minutos. A partir de las fases separadas se desechó el sobrenadante. El sedimento se mezcló con 600 \mul de una solución acuosa de etanol al 70% y la mezcla producida se centrifugó de nuevo a 12.000 rpm durante cinco minutos. Se desechó el sobrenadante y el sedimento se secó a una presión reducida.
El ADN parcialmente digerido obtenido por consiguiente se disolvió en 20 \mul de agua purificada. La cantidad de 19 \mul de la solución de ADN y 14 \mul de un enlazador (20 pmol/\mul) representado mediante la siguiente secuencia de bases, 4,5 \mul de ATP 10 mM, 4,5 \mul de un tampón tris-clorhidrato 0,2 M (pH 7,6; en lo sucesivo denominado "tampón de uso en ligación de concentración de diez veces") que contenía MgCl_{2} 50 mM, ditiotreitol 50 mM y albúmina de suero bovino 500 \mug/ml, 2 \mul de agua purificada y 1 \mul de ligasa T4 añadidos a la misma se dejaron reaccionar a 16ºC durante cuatro horas para efectuar la adición del enlazador.
5'-AATTCGAACCCCTTCG-3'
3'-GCTTGGGGAAGCp-5'
El ADN parcialmente digerido que añade el enlazador, como se ha escrito anteriormente, se trató con una columna (Chroma Spin 6000) usando un tampón tris-clorhidrato 10 mM que contenía NaCl 0,1 M y EDTA 1 mM como fase de migración. A partir del eluido, se separaron fracciones cada una de dos gotas. Cada fracción se analizó en parte mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8% para recuperar una fracción que contenía segmentos de ADN de tamaños desde una 1 kpb hasta 7 kpb. La cantidad de 144 \mul de la fracción producida y 13 \mul de agua purificada, 20 \mul de ATP 10 mM, 20 \mul de un tampón tris-clorhidrato 0,5 M (pH 7,6 máximo; denominado en lo sucesivo "tampón de uso en fosforilación de concentración de diez veces") que contenía MgCl_{2} 0,1 M, ditiotreitol 50 mM, clorhidrato de espermidina 1 mM y EDTA 1 mM y 3 \mul de polinucleótido quinasa T4 añadidos a la misma se dejaron reaccionar a 37ºC durante 30 minutos para efectuar la fosforilación del extremo terminal 5' del fragmento de ADN. La solución de reacción resultante y 200 \mul de PCI añadidos a la misma se mezclaron minuciosamente por agitación. La mezcla producida se centrifugó a 4ºC a 12.000 rpm durante cinco minutos. A partir de las fases separadas, se recuperó la fase acuosa. Se hizo precipitar los nucleótidos de la fase acuosa por adición de 1 \mul de una solución acuosa de glucógeno 20 mg/ml, 20 \mul de una solución acuosa de acetato de sodio 3 M y 400 \mul de etanol. La solución producida se centrifugó a 4ºC a 12.000 rpm durante 10 minutos. Se desechó el sobrenadante. El sedimento se mezcló con 200 \mul de etanol al 70% y se centrifugó de nuevo. A partir de las fases separadas, se desechó el sobrenadante. El sedimento se secó al aire y después se disolvió en 1 \mul de agua purificada.
La cantidad de 0,6 \mul de la solución acuosa resultante y 1 \mul de ADN de \lambda gt11 (1 \mug/\mul producido por Stratagene Corp.) escindido de antemano con una endonucleasa de restricción EcoRI, 0,5 \mul de un tampón de uso en ligación de concentración de diez veces, 0,5 \mul de ATP 10 mM, 0,4 \mul de ligasa T4 y 2\mul de agua purificada añadidos a la misma se dejaron reaccionar durante una noche a 4ºC. Después, el ADN de \lambda gt11 recombinante obtenido por consiguiente se empaquetó mediante el uso de un kit de empaquetamiento (producido por Stratagene Corp. y comercializado bajo la denominación comercial de Gigapack II Gold'').
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(F) Producción de anticuerpo monoclonal específico de Chlamydia pneumoniae Cultivo y transferencia de la cepa de células de mieloma
La cepa de células de mieloma usada para la producción del anticuerpo monoclonal era P3/NSI/1-Ag 4-1 (ATCC TIB-18). Se incubó y se sometió a cultivo de transferencia sucesivo en el medio de cultivo RPMI 1640 que contenía suero fetal bovino al 10% (v/v). Dos semanas antes de la fusión celular, la cepa se incubó durante una semana en el medio de cultivo RPMI 1640 que contenía 0,13 mM de 8-azaguanina, 0,5 \mug/ml de un agente de expulsión de mycoplasma (producido por Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. y comercializado bajo el código de producto "MC-210") y suero fetal bovino al 10% (v/v) y, después, se incubó en un medio de cultivo convencional durante una semana.
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Inmunización de ratones
Doscientos (200) \mul de la suspensión del cuerpo elemental mencionado anteriormente que tenía una concentración de proteína de 270 \mug/ml se centrifugaron a 12.000 rpm durante 10 minutos. El precipitado y 200 \mul de PBS añadidos al mismo se suspendieron juntos. La suspensión se emulsionó por adición de 100 \mul de adyuvante de Freund. Una porción, 150 \mul de volumen, de la emulsión se inyectaron por vía hipodérmica en el lomo de un ratón (día 0 del experimento). En los días 14º, 34º y 49º, la suspensión del cuerpo elemental purificado que tenía una concentración de proteína de 270 \mug/ml se inyectó por vía intraabdominal a una dosis fija de 100 \mul en el ratón. Además, 50 \mul de la suspensión del cuerpo elemental purificado que tenía una concentración de proteína de 800 \mug/ml se inyectaron por vía intraabdominal en el ratón en el día 69º y 100 \mul de la misma suspensión se inyectaron de forma similar en el ratón el día 92º. En el día 95º, el ratón se sacrificó para extirpar el bazo, al que se dio uso en la fusión celular.
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Fusión celular
En un tubo de vidrio de fondo redondo, se mezclaron minuciosamente 10^{8} esplenocitos obtenidos del bazo del ratón inmunizado y 10^{7} células de mieloma y se centrifugaron a 1400 rpm durante cinco minutos. Se retiró el sobrenadante y las células restantes se mezclaron adicionalmente minuciosamente. Las células y 0,4 ml del medio de cultivo RPMI 1640 que contenía polietilenglicol al 30% (p/v) y mantenido de antemano a 37ºC se dejaron reposar en conjunto durante 30 segundos. La mezcla resultante se centrifugó a 700 rpm durante seis minutos. El tubo de vidrio que contenía esta mezcla y 10 ml del medio de cultivo RPMI 1640 añadido de nuevo al mismo se hicieron girar lentamente para asegurar una dispersión minuciosa del polietilenglicol y se centrifugó a 1400 rpm durante cinco minutos. El sobrenadante se retiró completamente. El precipitado y 5 ml del medio de cultivo HAT añadidos al mismo se dejaron reposar en conjunto durante cinco minutos. La mezcla resultante y 10-20 ml del medio de cultivo HAT añadidos a la misma se dejaron reposar juntos durante 30 minutos y después se diluyeron mediante la adición del medio de cultivo HAT hasta que la concentración de células de mieloma alcanzó 3,3 x 10^{5}/ml para suspender las células. Se dispensaron dos gotas de la suspensión en cada uno de los pocillos de un recipiente de incubación de plástico de 96 pocillos mediante el uso de una pipeta Pasteur. La suspensión se incubó en la atmósfera de gas dióxido de carbono al 5% (v/v) a 36ºC. Después de un día, 7 días y 14 días siguientes al inicio de la incubación, se añadieron de una a dos gotas de medio de cultivo HAT a cada uno de los pocillos.
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Exploración de células productoras de anticuerpo
El cuerpo elemental purificado de la cepa YK41 de Chlamydia pneumoniae se solubilizó con SDS al 1% (p/v), se dializó contra una solución de tampón bicarbonato sódico 0,05 M (pH 9,6) que contenía el 0,02% de azida sódica, se diluyó hasta que la concentración de proteína alcanzó un nivel en el intervalo de 1-10 \mug/ml, se dispensaron 50 \mul en cada uno de los pocillos de una placa de uso en EIA de 96 pocillos hecha de cloruro de vinilo y se dejaron reposar durante una noche a 4ºC para inducir la adsorción del antígeno. Se retiró el sobrenadante. Se añadieron 150 \mul del PBS que contenía Tween 20 al 0,02% (p/v) a los pocillos y la placa se dejó reposar durante tres minutos. A los pocillos se les privó de PBS y se limpiaron. Después de administrarse un tratamiento de limpieza a los pocillos una vez más, se añadieron 100 \mul del PBS que contenía albúmina de suero bovino al 1% (v/v) a los pocillos y se dejaron reposar durante una noche a 4ºC para efectuar el bloqueo. A los pocillos se les privó del PBS que contenía albúmina de suero bovino, se limpiaron dos veces de la misma forma que anteriormente con el PBS que contenía Tween 20 al 0,02% (p/v), después de añadir 50 \mul del sobrenadante de cultivo de las células fusionadas, se dejaron reposar a temperatura ambiente durante dos horas. Los pocillos se limpiaron tres veces de la misma forma que anteriormente con el PBS que contenía Tween 20 al 0,02% (p/v) y, después de añadir 50 \mul del anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón (25 ng/ml) marcado con peroxidasa, se dejaron reposar a temperatura ambiente durante dos horas. Los pocillos se limpiaron tres veces de la misma forma que anteriormente con el PBS que contenía Tween 20 al 0,02% (p/v), después de añadir 50 \mul de la solución de ABTS (producida por KPL. Corp.), se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos-una hora para inducir una reacción de coloración. El contenido de los pocillos se ensayó para determinar la absorbancia a 405 nm mediante el uso de un fotómetro de uso en placas de EIA de 96 pocillos.
Como resultado, se detectaron los pocillos positivos y se descubrió que los sobrenadantes de caldo de cultivo en estos pocillos contenían un anticuerpo capaz de reaccionar con el cuerpo elemental. Las células en estos pocillos se recuperaron por separado con la pipeta Pasteur, se transfirieron a un recipiente de incubación de plástico de 24 pocillos y, después de añadir 1-2 ml del medio de cultivo HAT, se incubaron de la misma forma que anteriormente.
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Clonación por método de dilución limitante
Las células fusionadas propagadas en el recipiente de incubación de plástico de 24 pocillos se ensayaron para determinar la concentración celular y se diluyeron con el medio de cultivo HT para ajustar el número de células a 20/ml. Por separado, los timocitos de ratones de 4 a 6 semanas de edad suspendidos en el medio de cultivo HT se dispensaron en un recipiente de cultivo de plástico de 96 pocillos a una proporción de 2 x 10^{5}/pocillo y, después de añadir las células fusionadas mencionadas anteriormente (concentración celular de 20/ml) a una proporción de 50 \mul/pocillo, se incubaron en una atmósfera de gas dióxido de carbono al 5% (v/v) a 36ºC. Después de 1 día, 7 días y 14 días siguientes al inicio de la incubación, el medio de cultivo HT se añadió al recipiente de cultivo a una proporción de 1 a dos gotas/pocillo. A partir de los pocillos en los que se observó que se habían propagado las células, se recuperó el sobrenadante del caldo de cultivo a un volumen fijo de 50 \mul por pocillo y después se analizó de la misma forma que anteriormente para confirmar la producción de un anticuerpo.
A partir de los pocillos en los que sólo estaba presente una colonia de células, se recuperaron células que producían un anticuerpo capaz de reaccionar con el cuerpo elemental y que demostraban una propagación rápida, y se dejó que continuara la propagación en un recipiente de cultivo de plástico de 24 pocillos. Se repitió el mismo procedimiento de clonación hasta que se obtuvo en última instancia un hibridoma AY6E2E8.
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Producción de anticuerpo monoclonal
El hibridoma AY6E2E8 se cultivó en un matraz de cultivo de células de plástico de 75 cm^{2} que contenía en su interior 20 ml del medio de cultivo RPMI 1640 que contenía suero fetal bovino al 10% (v/v). A partir del caldo de cultivo formado en el matraz, se extrajo una muestra de 16-18 ml de volumen a intervalos de tres a cuatro días. El caldo de cultivo residual se repuso mientras tanto hasta un volumen total de 20 ml con un suministro recién preparado del medio de cultivo RPMI 1640 que contenía suero fetal bovino al 10% (v/v). Por lo tanto, se continuó con el subcultivo del hibridoma. Las muestras extraídas a partir del caldo de cultivo se centrifugaron a 1.200 rpm durante cinco minutos para recuperar el sobrenadante (el sobrenadante de cultivo que contenía el anticuerpo monoclonal).
A un ratón Balb/c que había recibido una inyección intraabdominal de 0,5 ml de pristano dos semanas antes del experimento, se le inyectó por vía intraabdominal la cepa de hibridoma suspendida en el PBS a una concentración de 1-5 x 10^{6}/ml en un volumen de 1 ml. Después de tres semanas desde entonces, se recuperó el líquido ascítico del ratón Balb/c y se centrifugó a 1200 rpm durante cinco minutos para recuperar el sobrenadante (conteniendo el líquido ascítico el anticuerpo monoclonal).
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Identificación de subclase de anticuerpo monoclonal
La subclase del anticuerpo monoclonal se identificó con el ISOTYPE Ab-STAT (producido por Sang Stat Medical Corp.). Como resultado, se identificó que la subclase del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma AY6E2E8 era IgG2b.
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Purificación de anticuerpo monoclonal
El anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma AY6E2E8 se purificó de la forma siguiente. Una mezcla de 1 parte por volumen del líquido ascítico que contenía anticuerpo monoclonal obtenido por inyección del hibridoma AY6E2E8 por vía intraabdominal en el ratón con 3 partes por volumen de PBS se centrifugó a 3000 rpm durante diez minutos. El sobrenadante resultante se pasó a través de un filtro, de 0,22 \mum de tamaño de poro. El filtrado se purificó mediante la HPLC usando Chromatop Superprotein A Colum (4,6 mm de diámetro x 100 mm, producida por NGK Insulators Ltd.). Esta columna se equilibró con el PBS antes del tratamiento.
Una muestra de 1 ml de volumen del filtrado que emanaba del filtro de 0,22 \mum se inyectó en la columna. La columna se lavó por paso del PBS primero a un caudal de 1ml/min durante tres minutos y después a un caudal de 5 ml/min durante cuatro minutos. El anticuerpo monoclonal adsorbido sobre la columna se eluyó por paso de una solución de 8,77 g de NaCl, 16,7 g de ácido cítrico (monohidrato) y 14,72 g de Na2HPO4\cdot12H2O en 1 litro de agua purificada a través del interior de la columna a un caudal de 2 ml/min durante cinco minutos. Las fracciones del anticuerpo monoclonal desorbido se juntaron y se diluyeron con una solución de TTBS.
El cuerpo elemental de Chlamydia pneumoniae se disolvió para obtener el péptido contenido en el cuerpo elemental. El péptido y el anticuerpo monoclonal mencionado anteriormente se sometieron a la transferencia de Western para determinar la especificidad del anticuerpo monoclonal obtenido.
Como resultado, se descubrió que el anticuerpo monoclonal obtenido era capaz de reconocer el polipéptido antigénico de 53 KDa de Chlamydia pneumoniae.
Se obtuvo un hibridoma 70 de la misma forma que el hibridoma AY6E2E8. Cuando se ensayó el anticuerpo monoclonal que producía el hibridoma 70 para determinar la especificidad siguiendo el procedimiento descrito anteriormente, se descubrió que este anticuerpo monoclonal era capaz de reconocer el polipéptido antigénico de 73 KDa de Chlamydia pneumoniae.
Cuando el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma 70 se examinó de la misma forma que anteriormente a modo de identificación de subclase, se descubrió que la subclase de este anticuerpo era IgG.
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(G) Clonación de ADN que codifica polipéptido antigénico
Se inoculó un asa de platino llena de la cepa Y1090r- de Escherichia coli en un medio de cultivo LB (que contenía 5 g de NaCl, 10 g de polipeptona y 5 g de extracto de levadura por litro de agua) que contenía maltosa al 0,2% y 50 \mug/ml de ampicilina y se cultivó en agitación a 37ºC durante una noche. La solución de cultivo resultante se centrifugó a 2.000 rpm durante 10 minutos. El sedimento (Escherichia coli) se mezcló con 9 ml de una solución acuosa de MgSO_{4} 10 mM. La cantidad de 0,35 ml de la suspensión de Escherichia coli y de 0,1 a 10 \mul de la suspensión de \lambda gt11 (genoteca de ADN) añadidos a la misma se incubaron a 37ºC durante 20 minutos para infectar la Escherichia coli con \lambda gt11. La Escherichia coli infectada con \lambda gt11 mencionada anteriormente se añadió a 2,5 ml de un medio de cultivo de agar LB líquido mantenido caliente de antemano a 47ºC y la mezcla resultante se esparció sobre un medio de cultivo de agar LB. Después de que se solidificara la capa superior del medio de cultivo, el medio de cultivo completo se cultivó a 42ºC durante de tres a cuatro horas. En el momento en que se observó una placa, se montó un filtro de nitrocelulosa (que contenía perforaciones de 82 mm de diámetro) sumergido de antemano en una solución acuosa de IPTG 10 mM en la capa superior del medio de cultivo de agar. Después, el medio de cultivo completo se cultivó a 37ºC durante 12 horas. Con una jeringa que tenía la punta de la boquilla de la misma manchada con tinta china, se perforó el filtro en tres puntos asimétricos seleccionados como marcas sobre el filtro. Después, el filtro que ahora llevaba las marcas de la tinta china se extrajo del medio de cultivo de agar y se lavó tres veces con un tampón tris-clorhidrato 20 mM (pH 7,5) que contenía NaCl 150 mM y Tween 20 al 0,1% (en lo sucesivo denominado "tampón TTBS"). El medio de cultivo de agar residual se almacenó en un frigorífico.
El filtro se sumergió en una solución que contenía albúmina de suero bovino al 0,1% de un tampón tris-clorhidrato 20 mM (pH 7,5) que contenía NaCl 150 mM (en lo sucesivo denominado "tampón TBS") y se agitó a 37ºC durante una hora para efectuar una reacción de bloqueo sobre el mismo. Después, el filtro se lavó dos veces con el tampón TTBS, se sumergió en la solución de TTBS 10 \mug/ml de un anticuerpo monoclonal específico para Chlamydia pneumoniae y se agitó a 37ºC durante una hora. El filtro se lavó tres veces con el tampón TTBS y después se agitó en una solución de anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con peroxidasa (tampón TTBS, 50 ng/ml) a 37ºC durante una hora. El filtro se lavó tres veces con el tampón TTBS y tres veces con el tampón TBS, después se sumergió en una solución de sustancia de color de fondo (preparada por adición de 60 \mul de una solución acuosa de peróxido de hidrógeno al 30% y 20 ml de una solución metanólica de 4-cloro-1-naftol al 0,3% en 100 ml del tampón TBS) y se dejó reposar en la misma a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. En el momento en el que el filtro se coloreaba totalmente, este filtro se extraía de la solución, se lavaba con agua purificada y se secaba al aire.
Las placas formadas sobre el medio de cultivo de agar en las posiciones correspondientes a las manchas coloreadas sobre el filtro se buscaban y se identificaban. Las porciones pertinentes del agar se perforaban con una pipeta Pasteur para recuperar las placas. Cada placa recuperada se colocaba en un tampón tris-clorhidrato 50 mM (pH 7,5) que contenía NaCl 0,1 M, sulfato de magnesio 8 mM y gelatina al 0,01% (en lo sucesivo denominado "tampón SM") y una gota de cloroformo y se dejó reposar en el mismo a 4ºC durante una noche para efectuar la extracción del fago \lambda a partir de la placa. El procedimiento que se acaba de describir se repitió hasta que la placa reaccionaba completamente con el anticuerpo monoclonal mencionado anteriormente para obtener un clon del ADN que codifica el polipéptido antigénico.
Como resultado, se obtuvo el fago \lambda que expresaba un polipéptido antigénico específico de Chlamydia pneumoniae reactivo con un anticuerpo monoclonal específico de Chlamydia pneumoniae y se designó como fago \lambda 53-3S.
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(H) Cultivo de fago \lambda 53-3S y purificación de ADN
Se formaron placas siguiendo el procedimiento descrito en (F) anteriormente. Se recuperó una de las placas, se colocó en 100 \mul del tampón SM y se dejó reposar en el mismo a 4ºC durante una noche para efectuar la extracción del fago \lambda. En el medio de cultivo LB en el que se cultivaron durante una noche 250 \mul de la cepa Y1090r- de Escherichia coli, se echaron de 5 a 10 \mul de la solución de fago \lambda y se dejaron reposar en el mismo a 37ºC durante 20 minutos para efectuar la infección de la Escherichia coli con el fago \lambda. La Escherichia coli infectada se inoculó en 50 ml del medio de cultivo LB que contenía sulfato de magnesio 10 mM y mantenido caliente de antemano a 37ºC y se cultivó en agitación en el mismo a 37ºC de cinco a siete horas hasta que se produjo la bacteriolisis de la Escherichia coli por el fago \lambda. La solución de cultivo resultante, después de añadir 250 \mul de cloroformo, se centrifugó a 3.000 rpm durante 10 minutos para efectuar la eliminación de las células residuales de Escherichia coli y obtener una suspensión del fago \lambda. El ADN del fago \lambda se purificó mediante el uso de un dispositivo especial (producido por Promega Corp. y comercializado bajo la denominación comercial de "Wizard \lambda Preps Kit").
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(I) Amplificación de ADN que codifica polipéptido antigénico de Chlamydia pneumoniae
Se cargó un microtubo graduado de 600 \mul con 61,5 \mul de agua purificada, 10 \mul de una concentración de diez veces de tampón de reacción (un tampón tris-clorhidrato, pH 8,3, que contenía KCl 500 mM, MgCl_{2} 15 mM y gelatina al 0,01%), 1 \mul de dNTP 20 mM, 0,1 \mul de solución de ADN de fago \lambda 53-3S, 1 \mul de cebador directo de \lambda gt11 20 nM (producido por Takara Shuzo Co., Ltd.), 1 \mul de cebador inverso de \lambda gt11 20 nM (producido por Takara Shuzo Co., Ltd.) y 0,5 \mul de ADN polimerasa AmpliTaq, con dos o tres gotas de aceite mineral dispuestas para formar una capa superior. El contenido del microtubo se sometió a 30 ciclos de incubación, consistiendo cada uno en 30 segundos de mantenimiento a 94ºC, 30 segundos de mantenimiento a 55ºC y dos minutos de mantenimiento a 73ºC para efectuar la amplificación del ADN. Después de la reacción, la solución de reacción se sometió a una electroforesis en gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1,2% para escindir el ADN amplificado. Este ADN amplificado se purificó mediante el uso del "Wizard PCR prep Kit" (producido por Promega Corp.).
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(J) Análisis para determinar la secuencia de bases del ADN
El análisis del ADN para determinar la secuencia de bases se efectuó sometiendo a una muestra a una reacción de secuenciación de acuerdo con el método de secuenciación cíclica con terminadores marcados con fluorescencia usando una ADN polimerasa Taq con un ADN amplificado por PCR como molde y analizando el producto de reacción mediante un secuenciador de ADN (producido por Applied Biosystems Corp. y comercializado bajo el código de producto de "Modelo 373A"). La secuencia de base de ADN obtenida por consiguiente se examinó mediante el programa informático de análisis de secuencia de genes (producido por Hitachi Software Engineering Co., Ltd. y comercializado bajo la denominación comercial de "DNASIS") para estimar la región de aglutinación, ligación y traducción de aminoácidos. Posteriormente, la secuencia se identificó como SEQ ID Nº: 9.
Los resultados del análisis de la secuencia de la SEQ ID Nº: 9 muestran que se aclaraba aproximadamente el 60% de la secuencia de aminoácidos del polipéptido antigénico de 53 KDa desde el N-terminal del mismo hacia el C-terminal.
El ADN que codifica el polipéptido antigénico de Chlamydia pneumoniae es específico para Chlamydia pneumoniae y se ha clonado utilizando un anticuerpo monoclonal que reconoce el polipéptido antigénico de 53 KDa. Por lo tanto, este ADN codifica aparentemente el polipéptido antigénico de 53 KDa.
La búsqueda de homología tanto de la secuencia de bases como de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº:9 que se llevó a cabo de acuerdo con la base de datos GenBank confirmaba la ausencia de una serie conocida que presentase una homología elevada.
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Ejemplo 2 Preparación de vector recombinante que contiene ADN que codifica un polipéptido que contiene parte del polipéptido antigénico de Chlamydia pneumoniae y preparación de un transformante que lleve el vector
Aunque el ADN obtenido codificaba evidentemente el polipéptido antigénico de 53 KDa que se ha mencionado anteriormente, se expresó como se muestra a continuación para determinar si reaccionaría o no con el anticuerpo mencionado anteriormente como precaución.
Un plásmido pBBK10MM se cortó con las enzimas de restricción BamHI y XhoI y se sometió a una electroforesis en gel de agarosa en solución de bajo punto de fusión al 1,2% para escindir un fragmento de ADN de aproximadamente 4,6 Kpb. Este fragmento se purificó. Cada uno de los ADN sintéticos de la SEQ ID Nº:11 y la SEQ ID Nº: 12 se añadió en una cantidad de 1 ng a 100 ng del fragmento de ADN y se ligaron mediante el uso de un kit de ligación de ADN (producido por Takara Shuzo Co., Ltd.). El producto de reacción resultante se introdujo en una célula competente de cepa HB101 de Escherichia coli (producida por Takara Shuzo Co., Ltd.) para preparar un transformante y obtener un plásmido que se designó pADA431. Este plásmido se cortó con una enzima de restricción MunI y después se sometió a una reacción con fosfatasa alcalina para efectuar la eliminación de la base de ácido fosfórico 5'.
Por separado, el ADN del fago \lambda 53-3S se cortó con una enzima de restricción EcoRI. Se añadieron cien (100) ng del ADN plasmídico de pADA431 cortados con la enzima de restricción MunI mencionada anteriormente a 50 ng del fragmento de ADN y se ligaron de la misma forma que se ha descrito anteriormente para preparar un transformante y obtener un plásmido que incorporaba en el mismo el fragmento de la enzima de restricción EcoRI del ADN del fago \lambda 53-3S, que se designó pCPN533 \alpha. Este plásmido era un ADN de una longitud de aproximadamente 5,7 kpb que poseía una secuencia de bases de la SEQ ID Nº: 10 y era capaz de expresar el polipéptido que contenía parte del polipéptido antigénico de 53K con un hospedador de Escherichia coli. La secuencia de bases del ADN que codifica el polipéptido que contiene parte del polipéptido antigénico de 53K se muestra mediante la SEQ ID Nº: 4. La secuencia de aminoácidos deducida a partir de esta secuencia de bases se muestra mediante la SEQ ID Nº: 2. Se sometió una Escherichia coli que llevaba el plásmido pCPN533a a cultivo, electroforesis, transferencia a una membrana de nitrocelulosa y detección con un anticuerpo monoclonal de la misma forma que se ha descrito anteriormente. Como resultado, se confirmó visualmente la aparición de una banda coloreada que se corresponde con el polipéptido mencionado anteriormente. Este hecho indica que la Escherichia coli que lleva el plásmido pCN533a expresaba el polipéptido antigénico de 53K capaz de reaccionar con un anticuerpo monoclonal específicamente reactivo con Chlamydia pneumoniae.
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Ejemplo 3 Obtención de ADN que codifica el polipéptido antigénico de 53 KDa completo de Chlamydia pneumoniae
Se sintetizó un ADN que poseía las secuencias de bases de las SEQ ID Nº: 26 y 27 basándose en la secuencia de bases de la SEQ ID Nº: 9 mediante el uso de un dispositivo de síntesis de ADN.
Diez (10) \mul de la solución acuosa de ADN genómico de la cepa YK 41 de Chlamydia pneumoniae (contenido de ADN: aproximadamente 1 \mug) obtenida en el Ejemplo 1 y 5 \mul de un tampón K concentrado hasta 1/10 vez el volumen original, 35 \mul de agua purificada y 5 \mul de una enzima limitante Hind III (19 U/\mul) añadidos a la misma se mantuvieron en conjunto a 37ºC durante tres horas.
La solución de reacción resultante se extrajo a partir de fenol. El extracto y etanol añadido al mismo se centrifugaron juntos para obtener un precipitado. Este precipitado y 5 \mul del ADN de casete de Hind III (20 ng/\mul) en el kit de clonación in vitro por PCR (denominación comercial de Takara Shuzo Co., Ltd.) y 15 \mul de una solución de ligación añadidos a los mismos se mantuvieron en conjunto a 16ºC durante 30 minutos.
La solución de reacción resultante se extrajo a partir de fenol. El extracto y etanol añadido al mismo se centrifugaron juntos para obtener un precipitado. Este precipitado se disolvió en 10 \mul de agua purificada.
La solución resultante y 78,5 \mul de agua purificada, 10 \mul de un tampón de uso en PCR concentrado hasta 1/10 vez el volumen original, 8 \mul de dNTP 2,5 mM y 0,5 \mul (5 U/\mul) de polimerasa Taq añadida a la misma y 1 \mul de un ADN que posee la secuencia de bases de la SEQ ID Nº: 26 (20 pmol/\mul) y 1 \mul de un ADN que posee la secuencia de bases de la SEQ ID Nº: 28 (20 pmol/\mul) (incluido como Cebador C1 en el kit mencionado anteriormente) añadidos adicionalmente a la misma como ADN de cebadores se dispusieron juntos en un microtubo de 0,6 ml de volumen, con dos gotas de aceite mineral superpuestas sobre la mezcla resultante en el microtubo. La mezcla se sometió a 30 ciclos de temperatura consistiendo cada uno en 30 segundos a 94ºC, 2 minutos a 55ºC y 3 minutos a 72ºC. Este procedimiento se denominará en lo sucesivo "proceso de PCR".
Un (1) \mul de la solución de reacción resultante del proceso de PCR y 1 \mul de un ADN que posee la secuencia de bases de la SEQ ID Nº: 27 (20 pmol/\mul) y 1 \mul de un ADN que posee la secuencia de bases de la SEQ ID Nº: 29 (pmol/\mul) (incluido como Cebador C2 en el kit mencionado anteriormente) añadidos al mismo como ADN de cebadores se sometieron al proceso de PCR.
La solución de reacción resultante del segundo proceso de PCR se sometió a electroforesis con un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1,2% para separar un gel de agarosa que contiene un ADN de aproximadamente 1,4 kpb de tamaño. El Wizard PCR Prep kit (Promega Corp) se usó para la purificación del ADN. El gel de agarosa separado y la solución tampón incluida en el kit se calentaron juntos parar disolver el gel de agarosa. La resina de purificación incluida en el kit se añadió a la solución resultante para adsorber el ADN. La mezcla resultante se centrifugó para obtener la resina de purificación como un precipitado. El precipitado se lavó con propanol y se centrifugó de nuevo para obtener un precipitado. Se añadió agua purificada al precipitado para disolver el ADN fuera de la resina de purificación. La mezcla resultante se centrifugó para obtener un sobrenadante (solución acuosa de ADN). El proceso descrito anteriormente se denominará en este documento a continuación como "proceso de purificación de ADN".
Se hizo que la solución de ADN acuosa obtenida se sometiera a una reacción de secuenciación mediante el método de secuenciación cíclica con terminadores marcados con fluorescencia usando la ADN polimerasa Taq usando como molde el ADN contenido, y se analizó para determinar la secuencia de bases del ADN con un secuenciador de ADN, Modelo 373A, (Applied Biosystems Corp.). La secuencia de bases de ADN obtenida por consiguiente se recopiló y se ligó mediante el programa informático para análisis de secuencia de genes y (producido por Hitachi Software Engineering Co., Ltd y comercializado bajo la denominación comercial de "DNASIS") para estimar la región de traducción de aminoácidos. El proceso que se acaba de describir se denominará en este documento a continuación como "proceso de análisis de la secuencia de bases".
Cuando el ADN obtenido se analizó para determinar la secuencia de bases, se descubrió que este ADN poseía aproximadamente 50 pb de secuencias de bases en el lado terminal 3' del ADN que codifica el polipéptido antigénico de Chlamydia pneumoniae obtenido en el Ejemplo 1. Se descubrió adicionalmente que existían aproximadamente 0,7 kb de región codificante que contenía un codón de terminación en el lado cadena debajo de la secuencia de bases.
Se sintetizó un ADN que poseía la secuencia de bases de la SEQ ID Nº: 30 como un cebador que se corresponde con la parte cadena arriba del ADN que codifica el polipéptido antigénico de Chlamydia pneumoniae basado en la secuencia de bases de la SEQ ID Nº: 9 y se sintetizó un ADN que poseía la secuencia de bases de la SEQ ID Nº: 31 como un cebador que se corresponde con la parte cadena abajo del ADN que codifica el polipéptido antigénico de Chlamydia pneumoniae basado en la secuencia de bases que contiene las aproximadamente 0,7 kb mencionadas anteriormente de zona de código por separado mediante el uso del sintetizador de ADN.
El proceso de PCR se realizó sobre 1 \mul del ADN que posee la secuencia de bases de la SEQ ID. Nº 30 y 1 \mul del ADN que posee la secuencia de bases de la SEQ ID Nº: 31 como un ADN cebador mediante el uso de 1 \mul de la solución acuosa del ADN genómico de la cepa YK 41 de Chlamydia pneumoniae obtenida en el Ejemplo 1.
El proceso de purificación de ADN mencionado anteriormente se llevó a cabo sobre la solución de reacción que es el resultado de la tercera ronda del proceso de PCR para obtener aproximadamente 1,5 kpb de ADN.
El proceso de análisis de secuencia de bases mencionado anteriormente se llevó a cabo sobre la solución acuosa obtenida de ADN.
Cuando se analizó la secuencia de bases del ADN obtenido, se descubrió que este ADN poseía la secuencia de bases de la SEQ ID Nº: 3 y codificaba la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 1.
El ADN que codifica el polipéptido antigénico de 53 KDa completo de Chlamydia pneumoniae se obtuvo efectuando un paseo genómico mediante el uso del plásmido pCPN533a y la genoteca de ADN de \lambda gt11.
Ejemplo 4 Preparación de vector recombinante que contiene ADN que codifica el polipéptido antigénico de 53 KDa completo de Chlamydia pneumoniae y preparación de un transformante que lleve el vector
El vector de recombinación que contiene el ADN que codifica el polipéptido antigénico de 53 KDa de Chlamydia pneumoniae completo y el transformante que contiene el vector pueden fabricarse de la forma siguiente.
Un vector recombinante que contiene un ADN que codifica el polipéptido antigénico de 53 KDa completo de Chlamydia pneumoniae y un transformante que lleva el vector se preparan siguiendo el procedimiento del Ejemplo 2 usando el ADN que codifica el polipéptido antigénico de 53 KDa completo de Chlamydia pneumoniae.
Ejemplo 5 Preparación de un ADN que codifica un polipéptido antigénico de 73K de Chlamydia pneumoniae
Se obtuvo un hibridoma 70 mediante el mismo método que se usó para la obtención de un hibridoma AY6E2E8. Se obtuvo el líquido ascítico murino mediante el uso del hibridoma 70. El sobrenadante del líquido ascítico se analizó para determinar la calidad del anticuerpo monoclonal contenido en el mismo. Los resultados de este análisis indican que este anticuerpo monoclonal era específico para el polipéptido antigénico de 73 KDa de Chlamydia pneumoniae.
Se obtuvo un clon de fago \lambda 70-2S siguiendo el procedimiento del Ejemplo 1 al tiempo que se usaba un anticuerpo monoclonal 70 en lugar del anticuerpo monoclonal SCP53 o AY6E2E8. A partir del fago, se obtuvo una secuencia de la SEQ ID Nº: 13.
Los resultados del análisis de la secuencia de la SEQ ID Nº: 13 indican claramente que se aclaraba aproximadamente el 90% de la secuencia de aminoácidos de la proteína antigénica de 73 K de Chlamydia pneumoniae desde el N-terminal hacia el C-terminal de la misma.
La búsqueda de homología tanto de la secuencia de bases como de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 13 se efectuó de acuerdo con la base de datos GenBank. Los resultados de la búsqueda muestran claramente que estas secuencias presentaban una alta homología con la secuencia de bases del gen aislado de Chlamydia trachomatis [L. M. Sardinia et al: J. Bacteriol., Vol. 17., 335-341 (1989)].
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Ejemplo 6 Producción de anticuerpo anti-Chlamydia pneumoniae usando polipéptido antigénico de Chlamydia pneumoniae como antígeno
El anticuerpo anti-Chlamydia pneumoniae puede producirse mediante el uso del polipéptido antigénico de Chlamydia pneumoniae de la forma siguiente.
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(A) Cultivo y paso de una cepa de células de mieloma
Como una cepa de células de mieloma, se cultivó P3X63Ag8.653 (ATCC CRL-1580) y se pasó en un medio de cultivo RPMI1640 que contenía suero fetal bovino al 10% (v/v). Dos semanas antes de que la cepa se someta a fusión celular, esta cepa se cultiva durante una semana en el medio de cultivo RPMI1640 que contiene 0,13 mM de 8-azaguanina, 0,5 \mug/ml de un agente de eliminación de mycoplasma (producido por Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. y comercializado bajo el código de producto "MC-210") y suero fetal bovino al 10% (v/v). La semana posterior se dedica al cultivo en un medio de cultivo normal.
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(B) Inmunización de ratones
La cantidad de 200 \mul de una solución del polipéptido antigénico mencionado anteriormente y que tiene una concentración de proteína de 270 \mug/ml se emulsiona por adición de 200 \mul de un adyuvante completo de Freund. La emulsión producida se inyecta por vía hipodérmica en una cantidad de 150 \mul en el lomo de un ratón (la fecha de esta inyección se considera el día 0). El día 14º, el día 34º y día 49º, se inyectan por vía intraabdominal 100 \mul de una suspensión del polipéptido antigénico que tiene una concentración de proteína de 270 \mug/ml en el ratón. Además, se inyectan por vía intraabdominal 50 \mul de unas suspensión del mismo polipéptido antigénico que tiene una concentración de proteína de 800 \mug/ml en el ratón el día 69º y se inyectan por vía intraabdominal 100 \mul de la misma suspensión en el ratón el día 92º. El día 95º el ratón se sacrifica para extirpar el bazo. Este bazo se utiliza para la fusión celular.
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(C) Fusión celular
En un tubo de vidrio de fondo redondo se mezclan minuciosamente 10^{8} esplenocitos obtenidos del bazo mencionado anteriormente y 10^{7} células de mieloma. La mezcla resultante se centrifuga a 1.400 rpm durante cinco minutos y, con el sobrenadante formado por consiguiente retirado de la misma, se mezcla minuciosamente adicionalmente. La mezcla producida se añade a 0,4 ml de un medio de cultivo RPMI1640 que contiene polietilenglicol al 30% (p/v) y mantenido caliente de antemano a 37ºC y se deja reposar en el mismo durante 30 segundos. El medio de cultivo que contiene ahora la mezcla se centrifuga a 700 rpm durante seis minutos. El tubo de vidrio, después de añadir 10 ml del medio de cultivo RPMI1640 se hace girar suavemente para permitir una mezcla minuciosa del polietilenglicol. Después, la mezcla se centrifuga a 1.400 rpm durante cinco minutos. El sobrenadante formado por consiguiente se retira minuciosamente. El sedimento y 6 ml del medio de cultivo HAT añadidos al mismo se dejan reposar durante cinco minutos. La mezcla resultante y de 10 a 20 ml del medio de cultivo HAT añadidos a la misma se dejan reposar durante 30 minutos. El medio de cultivo HAT se añade adicionalmente a la misma en una cantidad tal para ajustar una concentración de células de mieloma a 3,3 x 10^{5}/ml para obtener una suspensión de células. La suspensión se dispensa en una proporción de dos gotas en cada uno de los pocillos de un recipiente de cultivo de plástico de 96 pocillos mediante el uso de una pipeta Pasteur. La suspensión se cultiva en un ambiente de gas dióxido de carbono al 5% (v/v) a 36ºC. Después, se añaden de una a dos gotas del medio de cultivo HAT a cada uno de los pocillos después del transcurso de un día, siete días y 14 días.
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(D) Exploración de células productoras de anticuerpo
El polipéptido antigénico mencionado anteriormente se suspende en una suspensión de bicarbonato de sodio 0,05 M (pH 9,6) que contiene azida sódica al 0,02% (p/v) para ajustar la concentración de proteína en el intervalo de 1 a 10 \mug/ml. La suspensión resultante se dializa contra un tampón bicarbonato de sodio 0,05 M (pH 9,6) que contiene el 0,02% de azida sódica. El dializado se diluye para ajustar la concentración de proteína en el intervalo de 1 a 10 \mug/ml. El dializado diluido se dispensa en una proporción de 50 \mul en cada uno de los pocillos de una placa de 96 pocillos para EIA hecha de cloruro de vinilo y se deja reposar en el mismo a 4ºC durante una noche para efectuar la adsorción del antígeno. Los sobrenadantes formados por consiguiente se retiran de los pocillos. A cada uno de los pocillos se añaden 150 \mul de PBS que contiene Tween 20 al 0,02% (p/v), se deja reposar en el mismo durante tres minutos, después se retira y se lavan. El lavado se repite una vez más. Al pocillo se añaden 100 \mul de PBS que contiene albúmina de suero bovino al 1% (v/v) y se deja reposar a 4ºC durante una noche para efectuar el bloqueo. El PBS que contiene la albúmina de suero bovino se retira y después se lava dos veces más con el PBS que contiene Tween 20 al 0,02% (p/v) de la misma forma que se ha descrito anteriormente. Después, se añaden 50 \mul del sobrenadante de cultivo de células fusionadas al pocillo y se deja reposar en el mimo a temperatura ambiente durante dos horas. El pocillo se lava tres veces con el PBS que contiene Tween 20 al 0,02% (p/v) de la misma forma que se ha descrito anteriormente. En el pocillo, se echan 50 \mul de un anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón marcado con peroxidasa (25 ng/ml) y se deja reposar a temperatura ambiente. El pocillo se lava tres veces con el PBS que contiene Tween 20 al 0,02% (p/v) de la misma forma que se ha descrito anteriormente. En el pocillo se echan 50 \mul de una solución de ABTS (producida por KPL Corp.) y se deja reposar a temperatura ambiente durante de 15 minutos a una hora para efectuar una reacción de coloración. La solución de cultivo en el pocillo se ensaya para determinar la absorbancia a 405 nm con el fotómetro para placas de EIA de 96 pocillos. Las células en los pocillos positivos se recuperan por separado con la pipeta Pasteur, se transfieren a un recipiente de cultivo de plástico de 24 pocillos, después de añadir de 1 a 2 ml del medio de cultivo HAT, se cultivan de la misma forma que se ha descrito anteriormente.
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(E) Clonación por método de dilución limitante
Las células fusionadas de dos cepas propagadas en un recipiente de cultivo de plástico de 24 pocillos se ensayan para determinar la concentración celular y se diluyen por separado con un medio de cultivo HT hasta que el número de células disminuyó a 20/ml. Por separado, los timocitos de ratones de cuatro a seis semanas de edad suspendidos en el medio de cultivo HT se dispensan en una proporción de 1 a 2 por 10^{5}/pocillos en un recipiente de cultivo de plástico de 96 pocillos y las células fusionadas mencionadas anteriormente (concentración celular 20/ml) se dispensan en una proporción de 50 \mul/pocillo en el mismo recipiente de cultivo y se cultivan en un ambiente de gas dióxido de carbono al 5% (v/v) a 36ºC. Un día, siete días y 14 días después, se añade el medio de cultivo HT a los mismos a una proporción de una a dos gotas por pocillo. A partir de cada uno de los pocillos en los que se observa el crecimiento de células, se recupera el sobrenadante de cultivo a una cantidad fija de 50 \mul. Este sobrenadante se analiza de la misma forma que en (D) titulado "Exploración de células productoras de anticuerpo" para confirmar la producción de un anticuerpo en el mismo.
Las células que permitían la aparición de una sola colonia celular en un pocillo, producían un anticuerpo capaz de reaccionar con un cuerpo elemental y conseguían una proliferación rápida se recuperaban de los pocillos pertinentes y se dejan proliferar posteriormente en un recipiente de cultivo de plástico de 24 pocillos. Además, se obtiene un hibridoma que produce un anticuerpo anti-Chlamydia pneumoniae por repetición del mismo proceso de clonación que se ha descrito anteriormente. Este hibridoma se cultiva y se produce el anticuerpo anti-Chlamydia pneumoniae a partir del sobrenadante de cultivo resultante.
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Ejemplo 7 Detección y determinación de anticuerpo anti-Chlamydia pneumoniae usando un polipéptido antigénico como antígeno
El anticuerpo anti-Chlamydia pneumoniae puede detectarse y medirse mediante el uso del polipéptido antigénico de esta invención como antígeno de la forma siguiente.
El polipéptido formado por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 1 se usa como polipéptido antigénico. Se fija en una placa de microtitulación, se hace añadir un PBS que contiene albúmina de suero bovino y se deja reposar durante una noche a 4ºC para efectuar el bloqueo. El PBS que contiene la albúmina de suero bovino se retira y el pocillo se lava dos veces con el PBS que contiene Tween 20 al 0,02% (p/v). El suero sanguíneo de un paciente se añade en el pocillo al mismo y se deja reposar a temperatura ambiente durante dos horas. La solución resultante se retira y el pocillo se lava tres veces con el PBS que contiene Tween 20 al 0,02% (p/v) de la misma forma que se ha descrito anteriormente. En cada uno de los pocillos, se coloca un anticuerpo de ratón anti-IgG humana marcado con peroxidasa y se deja reposar a temperatura ambiente durante dos horas. Se retira la solución en el pocillo y el pocillo se lava tres veces con el PBS que contiene Tween 20 al 0,02% (p/v) de la misma forma que se ha descrito anteriormente. En el pocillo, se coloca una solución de ABTS (producida por KPL Corp.) y se deja reposar a temperatura ambiente durante de 15 minutos a una hora para efectuar una reacción de coloración. Después, la solución se ensaya para determinar la absorbancia a 405 nm mediante el uso de un fotómetro para placas de EIA de 96 pocillos.
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Ejemplo 8 Producción de vector recombinante que lleva ADN que codifica proteína fusionada de péptido que contiene DHFR y parte de un polipéptido antigénico de Chlamydia pneumoniae y producción de un transformante que contenga el vector recombinante
Un plásmido pBBK10MM se cortó con las enzimas de restricción BamHI y XhoI y se sometió a electroforesis en gel de agarosa en solución de bajo punto de fusión al 1,2% para escindir un fragmento de ADN de aproximadamente 4,6 Kpb. Este fragmento se purificó.
Por separado se cortó ADN de fago \lambda 53-3S con una enzima de restricción EcoRI para obtener aproximadamente 1,0 Kpb de un fragmento de ADN de forma similar en una forma purificada. Este segmento de ADN se cortó adicionalmente con una enzima de restricción AvaII para obtener un segmento de ADN de aproximadamente 0,8 Kpb de forma similar en una forma purificada. La cantidad de 100 ng de un segmento de ADN de aproximadamente 4,6 Kpb, 100 ng de un segmento de ADN de aproximadamente 0,8 Kpb mencionado anteriormente y 1 ng de cada uno de los ADN sintéticos de las SEQ ID Nº: 21 a 24 añadidos a los mismos se sometieron a una ligación de ADN mediante el uso del kit de ligación de ADN (producido por Takara Shuzo Co., Ltd.). El producto de reacción se introdujo en una célula compe-
tente de la cepa HB101 de Escherichia coli (producida por Takara Shuzo Co., Ltd.) para producir un transformante.
Este transformante se extendió sobre un medio de cultivo de agar LB que contenía 50 mg/l de ampicilina y se cultivó sobre el mismo a 37ºC durante 24 horas. La colonia Escherichia coli obtenida por consiguiente se inoculó en 3 ml del medio de cultivo LB que contenía 50 mg/litro de ampicilina y después se cultivó en agitación durante una noche a 37ºC. El vector plasmídico se separó a partir del medio de cultivo por el método de lisis alcalina, se cortó con una enzima de restricción NruI y se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8% para seleccionar una Escherichia coli que poseía un vector plasmídico recombinante que hubiera producido segmentos de ADN de 616 pb y 4822 pb. El vector plasmídico recombinante obtenido de este modo se denominó pCPN533T. Este vector plasmídico era un ADN de una longitud de aproximadamente 5,4 kpb que poseía una secuencia de bases de la SEQ ID Nº: 25. Era capaz de expresar una proteína fusionada que tenía un polipéptido que contenía parte del polipéptido antigénico de 53 KDa de Chlamydia pneumoniae ligado con el C-terminal de DHFR. La secuencia de bases del ADN que codifica esta proteína fusionada se mostraba mediante la SEQ ID Nº: 18. La secuencia de aminoácidos deducida a partir de esta secuencia de bases se mostraba en la SEQ ID Nº: 16.
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Ejemplo 9 Reconocimiento de una proteína fusionada de polipéptido que contiene DHFR y parte del polipéptido antigénico de 53 KDa de Chlamydia pneumoniae
Se inoculó un asa de platino llena de la cepa HB101 de Escherichia coli que conservaba el plásmido pCPN533T en 3 ml del medio de cultivo LB que contenía 50 mg/l de ampicilina y se cultivó en agitación durante una noche a 37ºC. La cantidad de 10 \mul del medio de cultivo que contenía la Escherichia coli y 10 \mul de tampón de carga (un tampón tris-clorhidrato 0,156 M que contenía el 0,01% de azul de bromofenol, el 10% de mercaptoetanol, el 20% de glicerol y el 5% de SDS y que tenía pH 6,8) añadidos al mismo se calentaron a 80ºC durante cinco minutos. La solución de reacción resultante se sometió a electroforesis en gel en gradiente de poliacrilamida del 5 al 20%. Sobre la placa del ánodo de un dispositivo de transferencia semiseca, se superpusieron de forma secuencial en el orden mencionado un papel de filtro humedecido con solución acuosa de tris 0,3 M que contenía el 10% de metanol y dodecilsulfato sódico al 0,05%, un papel de filtro humedecido con una solución acuosa de tris 25 mM que contenía el 10% de metanol y el 0,05% de dodecilsulfato sódico, un papel de filtro humedecido con solución acuosa de tris 25 mM que contenía el 10% de metanol y el 0,05% de dodecilsulfato sódico, una membrana de nitrocelulosa humedecida con una solución acuosa de tris 25 mM que contenía el 10% de metanol, el 0,05% de dodecilsulfato sódico y ácido aminocaproico 40 mM, el gel de poliacrilamida completamente sometido a la electroforesis mencionada anteriormente y dos papeles de filtro humedecidos con una solución acuosa de tris 25 mM que contenía ácido aminocaproico 40 mM. Se preparó una placa de cátodo en oposición a la placa de ánodo al otro lado de los filtros superpuestos y se hizo pasar una corriente eléctrica a través de los filtros a una densidad de corriente de 2,5 mA/cm^{2} durante una hora para efectuar la transferencia de la proteína en el gel de poliacrilamida a la membrana de nitrocelulosa. La membrana de nitrocelulosa se colocó en un tampón TBS que contenía el 0,1% de albúmina de suero bovino y se dejó reposar en el mismo a temperatura ambiente durante no menos de una hora para efectuar el bloqueo. La membrana de nitrocelulosa se lavó dos veces con el tampón TTBS y después se agitó en una solución de anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma SCP53 (en el tampón TTBS de 5 a 10 \mug/ml) a 37ºC durante una hora. La membrana de nitrocelulosa se lavó tres veces con el tampón TTBS y después se agitó en una solución acuosa de un anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con peroxidasa (en el tampón TTBS 50 ng/ml) a 37ºC durante una hora. La membrana de nitrocelulosa se lavó tres veces con el tampón TTBS y después se colocó en una solución de sustancia de color de fondo (obtenida por mezcla de 100 ml del tampón TBS con 60 \mul de una solución acuosa de peróxido de hidrógeno al 30% y 20 ml de una solución metanólica de 4-cloro-1-naftol) y se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos. La membrana de nitrocelulosa se extrajo, se lavó con agua purificada y después se secó al aire. Como resultado, se observaron bandas coloreadas en posiciones que se correspondían con tamaños de proteína fusionada. Este hecho indica que la Escherichia coli que posee el plásmido pCPN533T expresaba la proteína de fusión que contenía el antígeno de 53 KDa capaz de reaccionar con el anticuerpo monoclonal que reacciona específicamente con Chlamydia pneumoniae.
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Ejemplo 10 Obtención de ADN que codifica el polipéptido antigénico de 53 KDa completo de Chlamydia pneumoniae
El ADN que codifica el polipéptido antigénico de 53 KDa completo de Chlamydia pneumoniae ya se obtuvo en el Ejemplo 3. Sin embargo, se obtuvo por separado el ADN de la forma siguiente.
Un ADN que codifica el polipéptido antigénico de 53 KDa completo de Chlamydia pneumoniae se obtuvo también efectuando un paseo genómico mediante el uso del plásmido pCPN533T y la genoteca de ADN de \lambda gt11. Cuando estos ADN se analizaron para determinar la secuencia de bases, se descubrió que poseían las secuencias de las bases 484ª a 1947ª de la SEQ ID Nº: 17 y codifican las secuencias de los aminoácidos 162º a 649º de la SEQ ID Nº: 15.
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Ejemplo 11 Producción de vector recombinante que lleva ADN que codifica una proteína fusionada de DHFR y polipéptido antigénico de 53 KDa completo de Chlamydia pneumoniae y producción de un transformante que contenga el vector recombinante
El vector recombinante que contiene el ADN que codifica la proteína fusionada de DHFR y el polipéptido antigénico de 53 KDa completo de Chlamydia pneumoniae y el transformante que contiene el vector recombinante pueden producirse de la forma siguiente.
Un vector recombinante que contiene un ADN que codifica la proteína fusionada de la DFHR y el polipéptido antigénico de 53 KDa completo de Chlamydia pneumoniae se produce siguiendo el procedimiento del Ejemplo 8 al tiempo que se usa un ADN que codifica el plásmido pBBK10MM y el polipéptido antigénico de 53 KDa completo de Chlamydia pneumoniae mencionado anteriormente y se produce el transformante que contiene el vector recombinante. La secuencia de bases del ADN que codifica la proteína fusionada se muestra en la SEQ ID Nº: 17 y la secuencia de aminoácidos deducida a partir de esta secuencia de bases se muestra en la SEQ ID Nº: 15.
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Ejemplo 12 Producción de anticuerpo anti-Chlamydia pneumoniae mediante el uso de proteína fusionada como antígeno
El anticuerpo anti-Chlamydia pneumoniae puede producirse mediante el uso de la proteína fusionada de esta invención como antígeno de la forma siguiente.
Se obtiene un hibridoma que produce un anticuerpo anti-Chlamydia pneumoniae siguiendo el procedimiento del Ejemplo 6 al tiempo que se usa la proteína fusionada mencionada anteriormente como antígeno para la inmunización. Este hibridoma se cultiva y se produce el anticuerpo anti-Chlamydia pneumoniae a partir del sobrenadante de cultivo formado por consiguiente.
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Ejemplo 13 Detección y determinación de anticuerpo anti-Chlamydia pneumoniae mediante el uso de proteína fusionada como antígeno
Puede detectarse y medirse el anti-Chlamydia pneumoniae mediante el uso de la proteína fusionada de esta invención como antígeno de la forma siguiente.
El polipéptido formado por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 15 se usa como proteína fusionada. Se fija en una placa de microtitulación, se hace añadir un PBS que contiene albúmina de suero bovino y se deja reposar durante una noche a 4ºC para efectuar el bloqueo. El PBS que contiene la albúmina de suero bovino se retira y la placa se lava dos veces con el PBS que contiene Tween 20 al 0,02% (p/v). El suero sanguíneo de un paciente se añade a los pocillos y se deja reposar a temperatura ambiente durante dos horas. El pocillo se lava tres veces con el PBS que contiene Tween 20 al 0,02% (p/v) de la misma forma que se ha descrito anteriormente. En cada uno de los pocillos, se coloca un anticuerpo de ratón anti-IgG humana marcado con peroxidasa y se deja reposar a temperatura ambiente durante dos horas. La solución de cultivo en el pocillo se lava tres veces con el PBS que contiene Tween 20 al 0,02% (p/v) de la misma forma que se ha descrito anteriormente. En el pocillo, se coloca una solución de ABTS (producida por KPL Corp.) y se deja reposar a temperatura ambiente durante de 15 minutos a una hora para efectuar una reacción de coloración. Después, se ensaya la solución de cultivo para determinar la absorbancia a 405 nm mediante el uso de un fotómetro para una placa de EIA de 96 pocillos.
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Ejemplo 14 Detección de un gen de Chlamydia pneumoniae mediante un método de PCR
Un ADN formado por una secuencia de bases de la SEQ ID Nº: 19 y un ADN formado por una secuencia de bases de la SEQ ID Nº: 20 se sintetizaron químicamente con un dispositivo de síntesis de ADN producido por Applied Biosystems Corp y se designaron respectivamente como Cebador 53F2 y Cebador 53R2.
Las células infectadas con la cepa YK41 de Chlamydia pneumoniae o la cepa L2 de Chlamydia trachomatis o la cepa Bugd. 17-SL de Chlamydia psittaci se recuperaron por centrifugación. Las células más 0,1 ml de un tampón tris-clorhidrato 50 mM (pH 8,3) que contenía 50 mM de KCl, 2,5 mM de MgCl_{2}, 0,1 mg/ml de gelatina, el 0,45% de Nonidet P40, el 0,45% de Tween 20 y 0,1 mg/ml de proteinasa K se mantuvieron calientes a 56ºC durante una hora y después se calentaron a 95ºC durante 10 minutos para inactivar la proteinasa K y obtener una muestra que contenía el gen de Chlamydia pertinente.
Un (1) \mul de la muestra se combinó con 78,5 \mul de agua purificada, 8 \mul de una solución acuosa de dNTP 2,5 mM, 10 \mul de un tampón tris-clorhidrato 100 mM (pH 8,3) que contenía 500 mM de KCl y 15 mM de MgCl_{2}, 1 \mul de cada una de las soluciones acuosas de Cebador 53F2 y Cebador 53R2 30 \muM mencionados anteriormente y 0,5 \mul de 5 U/\mul de polimerasa Taq. Sobre la mezcla resultante se superpusieron 50 \mul de aceite mineral y se sometió a 30 ciclos de un procedimiento que consistía en un calentamiento a 94ºC durante 30 segundos, a 60ºC durante 30 segundos y a 72ºC durante 60 segundos, enfriamiento y calentamiento.
Después de completarse la reacción, se sometieron 2 \mul de la solución de reacción a una electroforesis en gel de agarosa, con el gel sumergido en 0,5 \mul/ml de bromuro de etidio para hacer visible una banda de ADN por irradiación de una luz ultravioleta.
Como resultado, se descubrió que la muestra obtenida a partir de la cepa YK41 de Chlamydia pneumoniae formaba una banda visible de ADN de un tamaño de 360 pb que se corresponde con una región interpuesta entre la secuencia de bases del Cebador 53F2 y una secuencia de bases complementaria a la secuencia de bases del cebador 53R2 en todas las secuencias de bases de la SEQ ID Nº: 3. Las muestras obtenidas a partir de las otras cepas no se descubrió que formaran ninguna banda visible de ADN.
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Aplicabilidad industrial
El polipéptido antigénico de esta invención formado por un polipéptido A que contiene secuencias de no menos de 20 aminoácidos seguidos en los polipéptidos de la SEQ ID Nº: 1 puede utilizarse para el examen de un anticuerpo de Chlamydia pneumoniae.
El polipéptido antigénico de esta invención, cuyo polipéptido A es un polipéptido que surge de la pérdida de los aminoácidos 1 a 250 de los polipéptidos de la SEQ ID Nº: 1, tiene una secuencia de aminoácidos de una longitud pequeña y, por lo tanto, permite aumentar el número de péptidos antigénicos que pueden fijarse sobre un vehículo. Por lo tanto, puede utilizarse para la producción de un agente de diagnóstico de alta sensibilidad.
El polipéptido antigénico de esta invención, cuyo polipéptido A es un polipéptido que es el resultado de la sustitución 1 a 100 aminoácidos en los polipéptidos de la SEQ ID Nº: 1 por otros aminoácidos, es capaz de formar una estructura muy poco susceptible a la descomposición por una proteasa y, por lo tanto, es de una estabilidad excelente como antígeno.
El polipéptido antigénico de esta invención, cuyo polipéptido A es un polipéptido que tiene un aminoácido o secuencias de 2 a 1000 aminoácidos ligados con secuencias de al menos cinco aminoácidos seguidos en los polipéptidos de la SEQ ID Nº: 1, puede fijarse a un vehículo haciendo uso del aminoácido o de las secuencias de 2 a 1000 aminoácidos y, por lo tanto, no produce fácilmente disminución o pérdida de la antigenicidad por fijación.
El polipéptido antigénico de esta invención, cuyo polipéptido A es un polipéptido formado por secuencias de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 1, posee la totalidad de los polipéptidos antigénicos específicos para Chlamydia pneumoniae y, por lo tanto, es muy adecuado para el examen de antígenos y para un diagnóstico preciso de infecciones que implican Chlamydia pneumoniae.
El polipéptido antigénico de esta invención, cuyo polipéptido A es un polipéptido formado por secuencias de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 2 o ID Nº: 5, posee una parte antigénica específica para Chlamydia pneumoniae y, por lo tanto, es muy adecuado para el examen de antígenos y para un diagnóstico preciso de infecciones que implican Chlamydia pneumoniae.
El ADN de esta invención, que es un ADN que codifica cualquiera de los polipéptidos antigénicos mencionados anteriormente o un ADN complementario al mismo, puede utilizarse para la producción de un polipéptido antigénico adecuado para el examen de antígenos de Chlamydia pneumoniae, el diagnóstico de infecciones que implican Chlamydia pneumoniae y similares.
El ADN de esta invención, cuya secuencia de bases es una secuencia de bases de la SEQ ID Nº: 3 codifica la totalidad del polipéptido antigénico específico para Chlamydia pneumoniae, puede utilizarse para la producción de un polipéptido antigénico adecuado para el examen de anticuerpos específicos contra Chlamydia pneumoniae.
El ADN de esta invención, cuya secuencia de bases es una secuencia de bases de la SEQ ID Nº: 4 o ID Nº: 7, codifica la parte antigénica específica para Chlamydia pneumoniae, puede utilizarse para la producción de un polipéptido antigénico adecuado para el examen de antígenos específicos para Chlamydia pneumoniae.
El vector recombinante de esta invención, que contiene cualquiera de los ADN mencionados anteriormente, puede utilizarse para la producción de un polipéptido antigénico adecuado para el examen de un anticuerpo de Chlamydia pneumoniae y el diagnóstico de infecciones que implican a Chlamydia pneumoniae.
El vector recombinante de esta invención, que es un plásmido pCPN533a que posee una secuencia de bases de la SEQ ID Nº: 10, es capaz de expresar un polipéptido que posee una parte antigénica específica para Chlamydia pneumoniae y, por lo tanto, puede utilizarse para la producción de un polipéptido antigénico altamente adecuado para el examen de anticuerpos específicos contra Chlamydia pneumoniae.
El transformante de esta invención, que contiene cualquiera de los vectores recombinantes mencionados anteriormente, puede utilizarse para la producción de un polipéptido antigénico adecuado para el examen de un anticuerpo específico contra Chlamydia pneumoniae.
Un método para la producción de un anticuerpo anti-Chlamydia pneumoniae, que se caracteriza por el uso de cualquiera de los polipéptidos antigénicos mencionados anteriormente como antígeno, puede utilizarse para la producción de un agente de diagnóstico para infecciones que implican a Chlamydia pneumoniae.
Un método para la detección y determinación de un anticuerpo anti-Chlamydia pneumoniae, que se caracteriza por el uso de cualquiera de los polipéptidos antigénicos mencionados anteriormente como antígeno, puede utilizarse para el examen de anticuerpos de Chlamydia pneumoniae y el diagnóstico de infecciones que implican a Chlamydia pneumoniae.
Particularmente, cuando se utiliza un polipéptido antigénico que tiene una secuencia de aminoácidos de una longitud pequeña, manifiesta una alta sensibilidad porque permite un aumento en el número de polipéptidos antigénicos que se van a fijar sobre un vehículo.
Cuando se utiliza un polipéptido antigénico que tiene aminoácidos inherentes al mismo sustituidos por otros aminoácidos para la detección y determinación mencionadas anteriormente, los resultados de la detección y determinación son muy fiables porque el polipéptido antigénico es capaz de formar una estructura muy poco susceptible a la descomposición por una proteasa y, por consiguiente, de una estabilidad excelente.
Cuando se utiliza un polipéptido antigénico que añade otras secuencias de aminoácidos para el diagnóstico de infecciones que implican a Chlamydia pneumoniae, desempeña el papel de forma ideal porque permite que un polipéptido que se esté usando como antígeno se fije sobre un vehículo haciendo uso de aminoácidos o secuencias de 2 a 1000 aminoácidos, y provoca muy poca disminución o pérdida de la antigenicidad debido a la fijación.
Cuando se utiliza un polipéptido antigénico formado por secuencias de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 1 para el examen de anticuerpos o el diagnóstico de infecciones que implican a Chlamydia pneumoniae, desempeña el examen o el diagnóstico con una precisión perfecta porque un polipéptido que se está usando como antígeno posee el polipéptido antigénico completo específico para Chlamydia pneumoniae.
Cuando se utiliza un polipéptido antigénico formado por secuencias de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 2 o ID Nº: 5 para el examen de anticuerpos o el diagnóstico de infecciones que implican a Chlamydia pneumoniae, desempeña el examen o el diagnóstico con una precisión perfecta porque un polipéptido que se está usando como antígeno posee una parte antigénica específica para Chlamydia pneumoniae.
El reactivo de esta invención para la detección y determinación de un anticuerpo anti-Chlamydia pneumoniae que contiene cualquiera de los polipéptidos antigénicos mencionados anteriormente como antígeno se ajusta de forma ideal al examen de anticuerpos de Chlamydia pneumoniae y al diagnóstico de infecciones que implican a Chlamydia pneumoniae.
Particularmente, cuando se utiliza un polipéptido antigénico que tiene una secuencia de aminoácidos de una longitud pequeña como el reactivo, el reactivo goza de una alta sensibilidad porque permite un aumento en el número de polipéptidos antigénicos que se fijan sobre un vehículo.
Cuando se utiliza un polipéptido antigénico que tiene aminoácidos inherentes al mismo sustituidos por otros aminoácidos para la detección y determinación mencionadas anteriormente, los resultados del examen y la determinación son altamente fiables porque el polipéptido antigénico es capaz de formar una estructura muy poco susceptible a la descomposición por una proteasa y, como resultado, de una estabilidad excelente.
Además, cuando se utiliza un polipéptido antigénico que añade otras secuencias de aminoácidos para el diagnóstico de infecciones que implican a Chlamydia pneumoniae, desempeña el papel de forma ideal porque permite que un polipéptido que se esté usando como antígeno se fije sobre un vehículo haciendo uso de aminoácidos o secuencias de 2 a 1000 aminoácidos y provoca muy poca disminución o pérdida de la antigenicidad debido a la fijación.
Entonces, cuando se utiliza un polipéptido antigénico formado por secuencias de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 1 para el examen de anticuerpos o el diagnóstico de infecciones que implican a Chlamydia pneumoniae, desempeña el examen o el diagnóstico con una precisión perfecta porque un polipéptido que se esté usando como antígeno posee el polipéptido antigénico completo específico para Chlamydia pneumoniae.
Cuando se utiliza un polipéptido antigénico formado por secuencias de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 2 o ID Nº: 5 para el examen de anticuerpos o el diagnóstico de infecciones que implican a Chlamydia pneumoniae, desempeña el examen o el diagnóstico con una precisión perfecta porque un polipéptido que se está usando como antígeno posee una parte antigénica específica para Chlamydia pneumoniae.
Un agente de diagnóstico que tiene cualquiera de los polipéptidos antigénicos mencionados anteriormente como componente activo se ajusta de forma ideal al diagnóstico de infecciones que implican a Chlamydia pneumoniae.
Particularmente, cuando se adopta como agente un polipéptido antigénico que tiene una secuencia de aminoácidos de una longitud corta, el agente goza de una alta sensibilidad porque permite un aumento en el número de polipéptidos antigénicos que se van a fijar sobre un vehículo.
Cuando se utiliza un polipéptido antigénico que tiene aminoácidos inherentes al mismo sustituidos por otros aminoácidos para la detección y determinación mencionadas anteriormente, los resultados del examen y la determinación son altamente fiables porque el polipéptido antigénico es capaz de formar una estructura muy poco susceptible a la descomposición por una proteasa y, como resultado, de una estabilidad excelente.
Además, cuando se utiliza un polipéptido antigénico que añade otras secuencias de aminoácidos para el diagnóstico de infecciones que implican a Chlamydia pneumoniae, desempeña el papel de forma ideal porque permite que un polipéptido que se esté usando como antígeno se fije sobre un vehículo haciendo uso de aminoácidos o secuencias de 2 a 1000 aminoácidos y provoca muy poca disminución o pérdida de la antigenicidad debido a la fijación.
Entonces, cuando se utiliza un polipéptido antigénico formado por secuencias de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 1 para el examen de anticuerpos o el diagnóstico de infecciones que implican a Chlamydia pneumoniae, desempeña el examen o el diagnóstico con una precisión perfecta porque un polipéptido que se está usando como antígeno posee el polipéptido antigénico completo específico para Chlamydia pneumoniae.
Cuando se utiliza un polipéptido antigénico formado por secuencias de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 2 o ID Nº: 5 para el examen de anticuerpos o el diagnóstico de infecciones que implican a Chlamydia pneumoniae, desempeña el examen o el diagnóstico con una precisión perfecta porque un polipéptido que se esté usando como antígeno posee una parte antigénica específica para Chlamydia pneumoniae.
La proteína fusionada de esta invención que se ha ligado con un polipéptido de la SEQ ID Nº: 14 directamente o por medio de una secuencia de aminoácidos, conteniendo un polipéptido A secuencias de al menos cinco aminoácidos seguidos en los polipéptidos de la SEQ ID Nº: 1, puede utilizarse para el examen de anticuerpos de Chlamydia pneumoniae.
La proteína fusionada de esta invención, cuyo polipéptido A es un polipéptido que surge de la pérdida de 1 a 250 aminoácidos de los polipéptidos de la SEQ ID Nº: 1, tiene una secuencia de aminoácidos de una longitud pequeña y, por lo tanto, permite aumentar el número de péptidos antigénicos que pueden fijarse sobre un vehículo. Por lo tanto, puede utilizarse para la producción de un agente de diagnóstico de alta sensibilidad.
Una proteína fusionada cuyo polipéptido A es un polipéptido que es el resultado de la sustitución de 1 a 100 aminoácidos en el polipéptido de la SEQ ID Nº: 1 por otros aminoácidos es capaz de formar una estructura muy poco susceptible a la descomposición por una proteasa y, por lo tanto, de una estabilidad excelente como antígeno.
La proteína fusionada de esta invención, que es un polipéptido formado por secuencias de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 15, es altamente adecuado para el examen de anticuerpos y el diagnóstico de infecciones que implican a Chlamydia pneumoniae porque posee la totalidad de los polipéptidos antigénicos específicos para Chlamydia pneumoniae.
La proteína fusionada de esta invención, que es un polipéptido formado por secuencias de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 16, es altamente adecuada para el examen de anticuerpos y el diagnóstico de infecciones que implican a Chlamydia pneumoniae porque posee una parte antigénica específica para Chlamydia pneumoniae.
El ADN de esta invención, que es un ADN que codifica cualquiera de las proteínas fusionadas mencionadas anteriormente un ADN complementario al mismo, puede utilizarse para la producción de una proteína fusionada adecuada para el examen de anticuerpos de Chlamydia pneumoniae, el diagnóstico de infecciones que implican a Chlamydia pneumoniae y similares.
El ADN de esta invención, cuyas secuencias de bases son secuencias de bases de la SEQ ID Nº: 17, puede utilizarse para la producción de una proteína fusionada adecuada para el examen de anticuerpos específicos contra Chlamydia pneumoniae porque la proteína fusionada codificada por este ADN posee la totalidad de polipéptidos antigénicos específicos para Chlamydia pneumoniae.
El ADN de esta invención, cuya secuencia de bases son secuencias de bases de la SEQ ID Nº: 18, puede utilizarse para la producción de una proteína fusionada adecuada para el examen de anticuerpos específicos contra Chlamydia pneumoniae porque la proteína fusionada codificada por este ADN posee una parte antigénica específica para Chlamydia pneumoniae.
El vector recombinante de esta invención que lleva cualquiera de los ADN mencionados anteriormente puede utilizarse para la producción de una proteína fusionada adecuada para el examen de anticuerpos de Chlamydia pneumoniae y el diagnóstico de infecciones que implican a Chlamydia pneumoniae.
El vector recombinante de esta invención, que es un plásmido pCPN533T, puede utilizarse para la producción de una proteína fusionada altamente adecuada para el examen de anticuerpos específicos contra Chlamydia pneumoniae porque es capaz de expresar una proteína fusionada que posee una parte antigénica específica para Chlamydia pneumoniae.
El transformante de esta invención, que contiene cualquiera de los vectores recombinantes mencionados anteriormente, puede utilizarse para la producción de una proteína fusionada adecuada para el examen de anticuerpos específicos para Chlamydia pneumoniae.
Un método descrito en este documento para la producción de un anticuerpo anti-Chlamydia pneumoniae, que se caracteriza por el uso de cualquiera de las proteínas fusionadas mencionadas anteriormente como antígeno, puede utilizarse para la producción de un agente de diagnóstico para infecciones que implican a Chlamydia pneumoniae.
Un método descrito en este documento para la detección y determinación de un anticuerpo anti-Chlamydia pneumoniae, que se caracteriza por el uso de cualquiera de las proteínas fusionadas mencionadas anteriormente como antígeno, es adecuado para el examen de anticuerpos de Chlamydia pneumoniae y el diagnóstico de infecciones que implican a Chlamydia pneumoniae.
Particularmente, cuando se adopta para el método una proteína fusionada que tiene una secuencia de aminoácidos de una longitud corta, el método goza de una alta sensibilidad porque esta proteína fusionada permite un aumento en el número de polipéptidos antigénicos que se van a fijar sobre un vehículo.
Cuando se utiliza una proteína fusionada que tiene aminoácidos inherentes a la misma sustituidos por otros aminoácidos para la detección y determinación mencionadas anteriormente, los resultados del examen y la determinación son muy fiables porque la proteína fusionada es capaz de formar una estructura muy poco susceptible a la descomposición por una proteasa y, como resultado, de una estabilidad excelente.
Una proteína fusionada que está formada por secuencias de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 15 es altamente adecuada para el examen de anticuerpos y el diagnóstico de infecciones que implican a Chlamydia pneumoniae porque una proteína fusionada que se está usando como antígeno posee la totalidad de polipéptidos antigénicos específicos para Chlamydia pneumoniae.
Una proteína fusionada que está formada por secuencias de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 16 es altamente adecuada para el examen de anticuerpos y al diagnóstico de infecciones que implican a Chlamydia pneumoniae porque una proteína fusionada que se está usando como antígeno posee una parte antigénica específica para Chlamydia pneumoniae.
El reactivo de esta invención, que contiene cualquiera de las proteínas fusionadas mencionadas anteriormente como antígeno, es adecuado para el examen de anticuerpos de Chlamydia pneumoniae y el diagnóstico de infecciones que implican a Chlamydia pneumoniae.
Particularmente, cuando se utiliza una proteína fusionada que tiene una secuencia de aminoácidos de una longitud pequeña como reactivo, el reactivo goza de una alta sensibilidad porque permite un aumento en el número de polipéptidos antigénicos que se van a fijar sobre un vehículo.
Cuando se utiliza una proteína fusionada que tiene aminoácidos inherentes a la misma sustituidos por otros aminoácidos para la detección y la determinación mencionadas anteriormente, los resultados del examen y la determinación son altamente fiables porque la proteína fusionada es capaz de formar una estructura muy poco susceptible a la descomposición por una proteasa y, como resultado, de una estabilidad excelente.
\newpage
Una proteína fusionada que está formada por secuencias de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 15 es altamente adecuada para el examen de anticuerpos y el diagnóstico de infecciones que implican a Chlamydia pneumoniae porque una proteína fusionada que se está usando como antígeno posee la totalidad de polipéptidos antigénicos específicos para Chlamydia pneumoniae.
Una proteína fusionada que está formada por secuencias de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 16 es altamente adecuada para el examen de anticuerpos y el diagnóstico de infecciones que implican a Chlamydia pneumoniae porque una proteína fusionada que se está usando como antígeno posee una parte antigénica específica para Chlamydia pneumoniae.
La medicina de diagnóstico descrita en este documento que tiene cualquiera de las proteínas fusionadas mencionadas anteriormente como componente activo de la misma es adecuada para el examen de anticuerpos de Chlamydia pneumoniae y el diagnóstico de infecciones que implican a Chlamydia pneumoniae.
Particularmente, cuando se utiliza una proteína fusionada que tiene una secuencia de aminoácidos de una longitud pequeña como agente, el agente goza de una alta sensibilidad porque permite un aumento en el número de polipéptidos antigénicos que se van a fijar sobre un vehículo.
Cuando se utiliza una proteína fusionada que tiene aminoácidos inherentes a la misma sustituidos por otros aminoácidos para la detección y la determinación mencionadas anteriormente, los resultados del examen y la determinación son altamente fiables porque la proteína fusionada es capaz de formar una estructura muy poco susceptible a la descomposición por una proteasa y, como resultado, de una estabilidad excelente.
Una proteína fusionada que está formada por secuencias de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 15 es altamente adecuada para el examen de anticuerpos y el diagnóstico de infecciones que implican a Chlamydia pneumoniae porque una proteína fusionada que se está usando como antígeno posee la totalidad de polipéptidos antigénicos específicos para Chlamydia pneumoniae.
Una proteína fusionada que está formada por secuencias de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 16 es altamente adecuada para el examen de anticuerpos y el diagnóstico de infecciones que implican a Chlamydia pneumoniae porque una proteína fusionada que se está usando como antígeno posee una parte antigénica específica para Chlamydia pneumoniae.
La sonda y el cebador de esta invención son adecuados para la detección y determinación de un gen de Chlamydia pneumoniae y el diagnóstico de infecciones que implican a Chlamydia pneumoniae.
Particularmente, una sonda y un cebador que poseen secuencias de bases de la SEQ ID Nº: 19 o ID Nº: 20 pueden utilizarse para un diagnóstico preciso de infecciones que implican a Chlamydia pneumoniae porque poseen secuencias de bases específicas para Chlamydia pneumoniae.
El método de esta invención para la detección y determinación de un gen de Chlamydia pneumoniae mediante el uso de cualquiera de las sondas o cebadores mencionados anteriormente es adecuado para el diagnóstico de infecciones que implican a Chlamydia pneumoniae.
El reactivo descrito en este documento para la detección y determinación de una Chlamydia pneumoniae que contiene cualquiera de las sondas o los cebadores mencionados anteriormente es de forma ideal adecuado para el diagnóstico de infecciones que implican a Chlamydia pneumoniae.
El agente de diagnóstico descrito en este documento que tiene cualquiera de las sondas o los cebadores mencionados anteriormente como componente activo es de forma ideal adecuado para el diagnóstico de infecciones que implican a Chlamydia pneumoniae.
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Referencias citadas en la descripción
La lista de referencias citadas por el solicitante es, únicamente, para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Si bien se ha tenido gran cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP declina toda responsabilidad a este respecto.
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Documentos de patente citados en la descripción
\bullet JP HEI4117284 B [0006]
\bullet US 6281518 A [0008][0009]
\bullet JP SHO64500083 B [0008][0009]
\bullet WO 9404549 A [0008][0010]
\newpage
Literatura no patente citada en la descripción
\bullet Y. KANAMOTO et al. Microbiol. Immunol., 1993, vol. 37, 498-498 [0071]
\bulletJ. Clin. Microbiol., 1994, vol. 132, 583-588 [0078]
\bullet J. SAMBROOK et al. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 [0080]
\bulletKANAMOTO et al. Microbiol. Immunol., 1993, vol. 37, 495-498 [0126]
\bullet L. M. SARDINIA et al. J. Bacteriol., 1989, vol. 17, 335-341 [0185]
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 488 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
1
2
3 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 2
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 271 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
4
5 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 3
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1464 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico; ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 3:
6
7
8
9
10 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 4
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 813
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico; ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
11
12
13 
\newpage
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 5
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 259 aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
14
15 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 6
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 571 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
16
17
18
19 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 7
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 777 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
20
21 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1712 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 8:
22
24 
\newpage
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1048 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: doble
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Chlamydia pneumoniae 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: YK-41
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: 53-3S
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 263 a 1012
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: P
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
25
26
27
28 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5702 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico; plásmido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
29
30
31
32
33
34
35 
\newpage
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico; ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
360 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico; ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
361 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1954 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Chlamydia pneumoniae 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: YK-41
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: 70-2s
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: señal -35
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 146 a 151
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: por similitud con una secuencia conocida o con una secuencia consenso establecida
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: señal -10
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 169 a 174
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: por similitud con una secuencia conocida o con una secuencia consenso establecida
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: RBS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 199 a 205
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: por similitud con una secuencia conocida o con una secuencia consenso establecida
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 215 a 1927
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: por similitud con una secuencia conocida o con una secuencia consenso establecida
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
37
38
39
40
41
42 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 160 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
43
44 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 649 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
45
46
47
48 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 432 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
49
50
51 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1947 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico; ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 17:
53
54
55
56
57
58 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1296 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico; ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 18:
60
61
62
63 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico; ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
64 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico; ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
65 
\newpage
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico; ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
66 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico; ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
67 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico; ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
68 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico; ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
69 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5438 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico; Plásmido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
70
71
72
73
74
75
76
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico; ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
77 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico; ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
78 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico; ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
79 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico; ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
80 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico; ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
81 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico; ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
82

Claims (12)

1. Un ADN que codifica un polipéptido antigénico de Chlamydia pneumoniae, en el que dicho ADN se selecciona del grupo que consiste en:
a)
un ADN que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de no menos de 20 aminoácidos consecutivos en el polipéptido de la SEQ ID Nº: 1;
b)
el ADN de (a), en el que en dicho polipéptido, un aminoácido o una secuencia peptídica está unida a una secuencia de no menos de 20 aminoácidos consecutivos en el polipéptido de la SEQ ID Nº: 1;
c)
un ADN que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de al menos 5 aminoácidos consecutivos en el polipéptido de la SEQ ID Nº: 1, en el que dicho polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 1, SEQ ID Nº: 2 o SEQ ID Nº: 5;
d)
un ADN que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de al menos 5 aminoácidos consecutivos en el polipéptido de la SEQ ID Nº: 1, en el que el ADN consiste en la secuencia de bases de la SEQ ID Nº: 3, SEQ ID Nº: 4 o SEQ ID Nº: 7; y
e)
un ADN complementario a uno cualquiera de (a) a (d).
2. Un ADN que codifica una proteína fusionada de polipéptido antigénico de Chlamydia pneumoniae con dihidrofolato reductasa, en el que el polipéptido antigénico codificado por el ADN de la reivindicación 1 se une a la dihidrofolato reductasa directamente o mediante un aminoácido o secuencia de aminoácidos intermedia, o un ADN complementario al mismo.
3. El ADN de la reivindicación 2, en el que la proteína fusionada es un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 15 o SEQ ID Nº: 16.
4. El ADN de la reivindicación 2 ó 3, que contiene la secuencia de bases de la SEQ ID Nº: 17 o SEQ ID Nº: 18.
5. Un vector recombinante que lleva el ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. El vector recombinante de la reivindicación 5, que es un plásmido pCPN533\alpha que contiene la secuencia de bases de la SEQ ID Nº: 10 o un plásmido pCPN533T depositado bajo el número de acceso FERM BP5222.
7. Un transformante que contiene el vector recombinante de la reivindicación 5 ó 6.
8. Una sonda o cebador para la detección y/o medición de un gen de Chlamydia pneumoniae seleccionado del grupo que consiste en:
(a)
un ADN que comprende una secuencia de al menos 20 bases consecutivas en el ADN de la SEQ ID Nº: 3; y
(b)
un ADN complementario al ADN (a).
9. La sonda o cebador de la reivindicación 8, que contiene la secuencia de bases de la SEQ ID Nº: 19 o SEQ ID Nº: 20
10. Un método para la detección y/o medición de un gen de Chlamydia pneumoniae, en el que se usa la sonda o cebador de una cualquiera de las reivindicaciones 8 y 9.
11. Un reactivo para la detección y/o medición de un gen de Chlamydia pneumoniae, que comprende la sonda o cebador de una cualquiera de las reivindicaciones 8 y 9.
12. Un conjunto de cebadores de PCR para la detección de un gen de Chlamydia pneumoniae que consiste en dos cebadores, en el que cada cebador comprende un ADN seleccionado del grupo que consiste en:
a)
un ADN que contiene una secuencia de al menos 15 bases consecutivas en el ADN de la SEQ ID Nº: 3; y
(b)
un ADN complementario al ADN (a).
ES95932194T 1994-09-20 1995-09-20 Polinucleotidos que codifican un polipeptido antigenico de chlamydia pneumoniae. Expired - Lifetime ES2321346T3 (es)

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