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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur in-vitro -Diagnose
einer Chlamydophila pneumoniae (Chlamydia pneumoniae) spezifischen
Infektion mittels den Biomarkern DnaJ und/oder Hydrolase/phosphatase
homolog und/oder davon abgeleiteten Derivaten gemäß Anspruch
1, die Verwendung dieser Biomarker für für diagnostische und therapeutische
Zwecke gemäß den Ansprüchen 11,
12 und 13, einen Kit zur in vitro Diagnose einer Chlamydophila pneumoniae
spezifischen Infektion gemäß Anspruch
14 sowie eine pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß Anspruch
18.
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Die
Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur in vitro Diagnose
einer Chlamydophila pneumoniae spezifischen Infektion unter Verwendung
der Proteine mit den Aminosäuresequenzen
gemäß SEQ-ID
1 bzw. SEQ-ID 2 als Biomarker.
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Aus
Gründen
der Lesbarkeit wird im folgenden für die Begriffe Chlamydophila
pneumoniae und Chlamydia pneumoniae nur der Begriff Chlamydia pneumoniae
verwendet.
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Stand
der Technik
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Chlamydien
sind sehr kleine gramnegative, obligat intrazelluläre Bakterien.
Man unterscheidet heute neun unterschiedliche Spezies. Bisher wurden
drei humanpathogene Chlamydien-Spezies beschrieben: Chlamydia trachomatis,
Chlamydophila pneumoniae und Chlamydophila psittaci.
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Chlamydien
sind Bakterien, die sich ausschließlich im Inneren von eukaryoten
Zellen vermehren. Sie durchlaufen einen Entwicklungszyklus, der
mit der Aufnahme sogenannter infektiöser Elementarkörper (extrazelluläre Form
der Chlamydien) in ein Phagosom einer Wirtszelle beginnt. Die Chlamydien
werden jedoch nicht abgetötet,
sondern gestalten die Organelle derart um, dass sie ihnen als Nische
zur Vermehrung dient.
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Die
teilungsfähigen
Stadien bezeichnet man als Retikularkörper, sie wandeln sich wieder
in Elementarkörper
um, wenn die Zelle unter dem Druck der Bakterienlast zu platzen
droht. Die Elementarkörper
werden in die Umgebung freigesetzt und infizieren neue Zellen. In
einem Entwicklungsstadium, das als Persistenz bezeichnet wird, verweilen
die Chlamydien als Retikularkörper
im Zellinneren, ohne das Wachstum fortzusetzen und die Zelle zu
lysieren.
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Die
medizinisch bedeutendsten Spezies sind Chlamydia pneumoniae und
Chlamydia trachomatis sowie Chlamydophila psittaci. Fast jeder Mensch
wird im Laufe seines Lebens durch Chlamydia pneumoniae infiziert.
Der Erreger verursacht Erkrankungen der oberen Atemwege und ca.
10% der ambulant erworbenen Pneumonien. Chlamydia trachomatis ist
Erreger von Geschlechtskrankheiten und verursacht das Trachom des Auges,
eine der häufigsten
Ursachen für
Erblindung weltweit. Trotz einer möglichen Antibiotikatherapie
gibt es eine Reihe von Fällen,
bei denen die Erkrankungen therapieresistent sind und die Erreger
persistieren.
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Chlamydien
sind als Krankheitserreger seit nunmehr fast 100 Jahren bekannt.
Chlamydieninfektionen sind zudem weltweit verbreitet. Nach Schätzungen
der WHO lag die Inzidenz von Chlamydia trachomatis-Infektionen im Jahr
1999 bei 92 Millionen (vgl. z.B. www.medac.de/fachkreis/diagnostik/chlamydienserologie.php).
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Chlamydien
besiedeln die Schleimhäute
des Auges und des Urogenitaltrakts (C. trachomatis) sowie des Respirationstrakts
(Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci). Chlamydien können auch
von Zellen des mononuklären
Systems aufgenommen werden und so im gesamten Organismus verbreitet
werden. Auch in der Synovia von Gelenken sind lebensfähige Erreger
von C. trachomatis und von C. pneumoniae bereits nachgewiesen worden.
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In
Abhängigkeit
vom Serotyp kann Chlamydia trachomatis das Trachom (Serotyp A–C), das
Lymphogranuloma venereum (Serotyp L1–L3) und unspezifische Infektionen
des Urogenitaltraktes (Serotyp D–K) verursachen. Die Inzidenz
ist in hohem Maße
vom Alter abhängig
und ist in den ersten Jahren der sexuellen Aktivität am höchsten (In
Deutschland wird für
15–19
jährige
Frauen eine Prävalenz
von 7,3% und für
20–24
jährige
Männer
eine Prävalenz
von 7,7% angegeben). Bei 70% der infizierten Frauen und bei 50%
der infizierten Männer
verläuft
die Infektion asymptomatisch und bleibt daher oft unbehandelt. Asymptomatisch
verlaufende Chlamydien-Infektionen sind heute die häufigste
Ursache der infektionsbedingten Sterilität.
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Chlamydophila
pneumoniae verursacht meist leicht verlaufende, dafür jedoch
oft langwierige Infekte der Respirationsorgane. Nach einer nicht
behandelten Erkrankung der Atemwege, schließen sich häufig langwierige und schwerwiegende
extrapulmonale Erkrankungen an. Zum Krankheitsbild einer Infektion
mit Chlamydophila pneumoniae gehören:
atypische Pneumonie, Sinusitis, Pharyngitis, Bronchitis, chronisch
obstruktive Atemwegserkrankungen, infektionsbedingtes Asthma und
reaktive Arthritis. Seroepidemiologische Studien belegen eine hohe
Durchseuchung in der Normalbevölkerung.
Die Seroprävalenz
von IgG-Antikörpern
gegen Chlamydophila pneumoniae ist altersabhängig. Von weit unter 10% bei
Vorschulkindern steigt sie bis zum 14. Lebensjahr auf 20–30% an
und erreicht bei älteren
Menschen mehr als 75%.
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Der
Nachweis einer Infektion mit Chlamydien kann prinzipiell über eine
Erregeranzucht (Kultur), den Antigennachweis, oder serologisch über den
Nachweis von Immunglobulinen geführt
werden.
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Erregeranzucht:
Die Kultur von Chlamydien ist aufgrund ihres rudimentären Energiestoffwechsels
nur in eukaryotischen Wirtszellen, beispielsweise in speziellen
Zellkulturen, im Dottersack des Hühnerembryos oder in Versuchstieren
möglich.
Die Kultur von Chlamydien setzt das Vorhandensein entsprechenden
Abstrichmaterials mit lebensfähigen
Bakterien voraus. Die Methode ist sehr komplex und erzielt oft nur
geringe Ausbeuten. Die Anzucht von Chlamydophila pneumomiae ist
zudem ausgesprochen schwierig und erfordert ein entsprechend spezialisiertes
Laboratorium.
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Antigennachweise:
Der direkte Nachweis des Erregers setzt eine frische Infektion voraus.
Antigennachweise werden mit Hilfe direkter oder indirekter Immunfluoreszenztests
(IFTs) und einer mikroskopischen Auswertung durchgeführt. Es
kommen speziesspezifische monoklonale Antikörper zum Einsatz, die fluoreszenzmarkiert
sind und überwiegend
gegen äußere Membranproteine
des Erregers gerichtet sind. Die Methode ermöglicht die Untersuchung von
Abstrichmaterial, aber auch von nichtinvasiv gewonnenem Probenmaterial. Die
Technik ist arbeitsaufwändig
und die Auswertung des Tests ist subjektiv. Die Methode erfordert
daher geschultes Laborpersonal.
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Weiterhin
stehen Enzymimmunoassays (EIAs) zur Verfügung. Hier ist beispielsweise
der Nachweis von genusspezifischem Lipopolysaccharid (LPS) mit Hilfe
von Antikörpern
zu nennen. Diese Tests lassen sich automatisieren. Jedoch liegt
die Sensitivität
dieser Verfahren nur zwischen 60 und 80%, sodass sich die Bestätigung eines
positiven Befundes durch einen IFT empfiehlt.
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Die
Nukleinsäurebasierten
Amplifikationstechniken Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und die Ligase-Kettenreaktion
(LCR) ermöglichen
einen hochspezifischen und hochsensitiven Nachweis der DNA bakterieller
Erreger. Die Methode ermöglicht
einen Erregernachweis in einer Vielzahl unterschiedlicher klinischer
Proben. Theoretisch lässt
sich ein einzelnes Elementarkörperchen
nachweisen (Sensitivität ≤ 1 inclusion
forming unit (IFU)). Die hohe Sensitivität birgt die Gefahr von Kreuzkontaminationen.
Die Vermeidung bzw. die Identifizierung falsch-positiver und falsch-negativer
Testergebnisse stellt hohe Anforderungen an die Einhaltung interner
und externer Qualitätsstandards.
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Serologische
Tests: Für
den Nachweis chronischer Infektionen, wie sie für diese Erreger charakteristisch
sind, wird serologischen Tests der Vorzug gegeben. Chlamydien sind
oft schon sehr kurze Zeit nach der Primärinfektion an der Eintrittspforte
nicht mehr nachweisbar und haben sich in tiefere Bereiche des Respirations-
oder Urogenitaltraktes zurückgezogen,
wo sie persistieren können.
Die auf diese Weise dem Direktnachweis entzogenen Bakterien lassen
sich dann nur noch indirekt über
serologische Verfahren nachweisen. Serologische Tests werden zudem
zur Absicherung der Ergebnisse direkter Nachweisverfahren hinzugezogen. Auch
bei der Therapiekontrolle antibiotischer Behandlungen spielt die
Serologie eine wichtige Rolle.
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Grundsätzlich stehen
zwei Verfahren für
den serologischen Nachweis einer Chlamydien-Infektion zur Verfügung: Der
genusspezifische Nachweis von Antikörpern gegen ein definiertes
chlamydientypisches Fragment des Lipopolysaccharids und der speziespezifische
Nachweis von Antikörpern
gegen immundominante Chlamydienproteine.
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Für den speziesspezifischen
serologischen Chlamydienachweis ist der Mikroimmunfluoreszenztest (MIF)
die Methode der Wahl. Der MIF ist der einzige serologische Test,
der neben einem speziesspezifischen Chlamydien-Nachweis auch eine
gleichzeitige Differenzierung der nachgewiesenen Immunglobuline
in einzelne Isotypen (IgG, IgA und IgM) ermöglicht. Die Spezifität des Tests
wird durch die Verwendung gereinigter Elementarkörperchen der humanpathogenen
Chlamydienspezies gewährleistet.
Das Testformat beinhaltet eine Fixierung der gereinigten Elementarkörperchen
auf einem Objektträger.
Der Objekträger
wird mit dem stufenweise verdünnten
Patientenserum inkubiert und die gebundenen Immunglobuline mit einem
Fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper nachgewiesen.
Der Test ist nicht automatisierbar, die Auswertung des Tests ist subjektiv
und erfordert entsprechend geschultes Laborpersonal. Zudem sind
Kreuzreaktivitäten
nicht auszuschließen.
Eine Standardisierung des Verfahrens ist bisher nicht erreicht worden.
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Für Routinelabors
sind speziesspezifische Chlamydien-Antikörper-ELISAs die Methode der
Wahl. Diese Verfahren nutzen synthethische oder hochaufgereinigte
Peptide oder Proteine als Antigene. Hierfür kommen Epitope aus immundominanten
Proteinen der jeweiligen Spezies, typischerweise Proteine der äußeren Zellwand,
in Frage. Bisher werden Epitope der Proteine MOMP (Major Outer Membrane
Protein), Omp2 (einem cysteinereichen Protein der äußeren Zellmembran)
und HSP60 (Heat Shock Proteins 60) verwendet. Antikörper-ELISA-Tests
ermöglichen
zudem auch eine Differenzierung der nachgewiesenen Immunglobuline
in die einzelnen Isotypen. Antikörper-ELISAs
sind automatisierbar, reproduzierbar und können objektiv ausgewertet werden.
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Die
Sensitivität
und Spezifität
von Antikörper-ELISA-Tests
für den
Nachweis von Chlamydieninfektionen sind von der Speziesspezifität und der
Immundominanz der Epitope in den immunogenen Chlamydien proteinen
abhängig.
Bisher stehen Antikörper-ELISA-Tests
jedoch nur für
den Nachweis von Chlamydia trachomatis-Infektionen zur Verfügung.
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Zusammenfassend
läßt sich
zum Stand der Technik sagen, dass die Diagnostik der Chlamydien-Infektionen
heute generell schwierig, aufwändig
und teuer ist. Standardisierte und gut evaluierte kommerziell verfügbare Nachweisverfahren
stehen nur für
den Antigen- und Nukleinsäurenachweis
von akuten urogenitalen Chlamydia trachomatis-Infektionen zur Verfügung. Zum
Nachweis chronischer Chlamydia trachomatis-Infektionen und zum Nachweis
von Chlamydophila pneumoniae und Chlamydophila psittaci-Infektionen mangelt es
an sensitiven und spezifischen Verfahren. Insbesondere für die Serodiagnostik
von Chlamydieninfektionen fehlt es an der Charakterisierung immundominanter
und Spezies-spezifischer Chlamydien-Proteine, die als Antigene für die Diagnostik
eingesetzt werden könnten.
Die bisher auf dem Markt befindlichen gattungsspezifischen Antikörpernachweise
erfassen Antikörper
gegen alle Chlamydienarten und sind angesichts der hohen Prävalenz von
Chlamydophila pneumoniae-Antikörper positiven
Patienten oft sehr schwer zu interpretieren (Kutlin et al.; 1997).
Speziesspezifische Tests sind technisch sehr aufwändig und
nur von entsprechend geschultem Personal zu beurteilen (Mikroimmunfluoreszenztest)
oder stehen bisher nur für
Chlamydia trachomatis zur Verfügung
(Antikörper-ELISA).
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Versuche,
Antikörper
mit rekombinanten Antigenen von Chlamydien im Westernblot zu erfassen
haben sich hoffnungsvoll entwickelt. Während rekombinante Antigene
von Chlamydia trachomatis entsprechende Antikörper in Patientenseren im Immunoblot
sicher erkennen lassen, sind bisherige Versuche mit rekombinanten
Antigenen von Chlamydophila pneumoniae und Chlamydophila psittaci
weit weniger erfolgreich verlaufen (Hermann et al.; 2002 und 2004).
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Infektionen
durch Chlamydien haben eine hohe klinische Relevanz. Es besteht
daher ein dringender Bedarf zur Entwicklung von sensitiven und Spezies-spezifischen
Verfahren für
den zuverlässigen
Labornachweis von Chlamydien-bedingten Infektionen, um damit eine
rechtzeitig einsetzende Therapie oder sogar eine Prophylaxe zu ermöglichen.
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Der
vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein zuverlässiges Verfahren
für die
in vitro Diagnose einer Chlamydia pneumoniae spezifischen Infektion
zur Verfügung
zu stellen und somit die unzureichenden Diagnosemöglichkeiten
des Standes der Technik zu verbessern sowie neue Therapie- und Prophylaxemöglichkeiten
zu erschließen.
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Diese
Aufgabe wird verfahrenstechnisch durch die kennzeichnenden Merkmale
des Anspruchs 1 gelöst.
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Verwendungstechnisch
wird die Aufgabe durch die kennzeichnenden Merkmale der Ansprüche 11,
12 und 13 gelöst.
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Ein
Kit gemäß Anspruch
14 löst
die Aufgabe ebenfalls.
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Eine
weitere Lösung
der obigen Aufgabe stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch
18 dar.
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Insbesondere
betrifft die Erfindung ein Verfahren zur in vitro Diagnose einer
Chlamydia pneumoniae spezifischen Infektion auf Basis einer in vitro
Bestimmung der Anwesenheit von mindestens einem der Biomarker DnaJ
und Hydrolase/phosphatase homolog und/oder mindestens einem gegen
diese Proteine und/oder davon abgeleitete Derivate gerichteten Antikörper in
einer Patientenprobe.
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Die
Erfindung ermöglicht
ferner neue Detektionsmöglichkeiten
basierend auf der Verwendung von mindestens einem der Biomarker
DnaJ und Hydrolase/phosphatase homolog und/oder mindestens einem
gegen diese Proteine und/oder davon abgeleiteten Derivaten gerichteten
Antikörper.
Außerdem
bildet die Erfindung die Grundlage für die Entwicklung neuer therapeutischer
Wirkstoffe gegen Infektionen mit Chlamydia pneumoniae.
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Insbesondere
beschreibt die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose einer Chlamydia
pneumoniae spezifischen Infektion, wobei man in einer Probe aus
einem Menschen die Anwesenheit von mindestens einem der Biomarker
DnaJ und Hydrolase/phosphatase homolog und/oder mindestens einem
gegen diese Proteine und/oder davon abgeleitete Derivate gerichteten
Antikörper
und davon abgeleitete Derivate bestimmt und aufgrund des Ergebnisses
auf das Vorliegen und/oder den Therapieerfolg bei einer Chlamydia
pneumoniae spezifischen Infektion schließt.
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In
einem bevorzugten Verfahren kann auf eine Chlamydia pneumoniae spezifische
Infektion geschlossen werden, falls die Anwesenheit von mindestens
einem der Biomarker oder davon abgeleiteten Derivaten und/oder mindestens
einen gegen diese Proteine und/oder davon abgeleiteten Derivaten
gerichteten Antikörpers
bei infizierten Patienten vorliegt.
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Die
Anwesenheit von mindestens einem der Biomarker DnaJ und Hydrolase/phosphatase
homolog und/oder davon abgeleiteten Derivaten sprechen für eine Anwesenheit
des Erregers Chlamydia pneumoniae.
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Anwesenheit
von mindestens einem gegen diese Proteine und/oder davon abgeleiteten
Derivaten gerichteten Antikörper
sprechen für
einen Kontakt zwischen Chlamydia pneumoniae Erregern und des Immunsystems
eines Wirtes.
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In
einem weiteren bevorzugten Verfahren weisen die Biomarker DnaJ und
Hydrolase/phosphatase homolog die Aminosäuresequenzen gemäß Seq-ID.
1 bzw. Seq-ID. 2 auf.
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Es
ist dem Fachmann klar, dass unter dem Begriff „Derivate" jegliche Modifikationen der Biomarker, sowie
Peptide oder Nukleinsäuren,
welche von den Biomarkern abgeleitet werden können, verstanden werden. Solche
Modikfikationen können
beispielweise pre- oder posttranslationalen Charakters sein, wie
z.B. Glykosylierung, proteolytische Spaltung von Proteinen, Methylierung,
Phosphorylierung, Sulfatierung, und Prenylierung.
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Der
Anwesenheit von mindestens einem der Biomarker DnaJ und Hydrolase/phosphatase
homolog oder davon abgeleiteter Derivate und/oder einem gegen diese
Proteine und/oder davon abgeleiteten Derivaten gerichteten Antikörpers wird
aus einer Probe, welche Vollblut, Blutbestandteile, Urin, Abstriche
oder Gewebe sein kann, bestimmt.
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Ein
bevorzugtes Verfahren ist die Bestimmung der Anwesenheit von mindestens
einem der Biomarker DnaJ und Hydrolase/phosphatase homolog aus dem
Plasma oder Serum der Patienten.
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Für die messtechnische
Bestimmung von mindestens einem der Biomarker DnaJ und Hydrolase/phosphatase
homolog oder davon abgeleiteter Derivate und/oder einem gegen diese
Proteine und/oder davon abgeleiteten Derivaten gerichteten Antikörpers kommen
verschiedene, dem Fachmann bekannte Verfahren zum Einsatz. Bevorzugt
werden dabei immundiagnostische Verfahren eingesetzt. Hierbei kommen üblicherweise Antiköper-Assays
zum Einsatz, welche gegen das von mindestens einem der Biomarker
DnaJ und Hydrolase/phosphatase homolog oder davon abgeleiteten Derivaten
und/oder einem gegen diese Proteine und/oder davon abgeleiteten
Derivaten gerichteten Antikörper
gerichtete Antikörper
beinhalten. Beispiele solcher Messverfahren sind ELISA, Western
Blot, Immunopräzipitation
oder FACS-Analysen.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
werden Verfahren eingesetzt, die neben der Bestimmung von mindestens
einem der Biomarker DnaJ und Hydrolase/phosphatase homolog oder
davon abgeleiteten Derivaten und/oder einem gegen diese Proteine
und/oder davon abgeleiteten Derivaten gerichteten Antikörper auch
parallel die Bestimmung weiteren Biomarker zur Diagnose einer Chlamydia
pneumoniae spezifischen Infektion ermöglichen. Solche weiteren Biomarker
können
weitere Proteinmarker darstellen, welche mit Proteinchips oder immunchromatographischen
Messvorrichtungen bestimmt werden.
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Die
erfindungsgemäßen Verfahren
können
mit dem Fachmann bekannten computer-gestützten Auswerteeinheiten ausgewertet
werden. Hierbei können
die Messwerte die An- oder Abwesenheit von mindestens einem der
Biomarker DnaJ und Hydrolase/phosphatase homolog oder davon abgeleiteter
Derivate und/oder einem gegen diese Proteine und/oder davon abgeleiteten
Derivaten gerichteten Antikörper
direkt oder über
ein umgewandeltes Signal als Input für die Auswerteeinheit dienen,
darin verarbeitete Daten können über eine graphische
oder sonstiges Darstellung zur Auswertung dargestellt werden.
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Die
Erfindung umfasst auch die Verwendung der Biomarker oder davon abgeleiteter
Derivate für
die Gewinnung von gegen diese Biomarker DnaJ und Hydrolase/phosphatase
homolog gerichteten Antikörpern und/oder
davon abgeleitete Derivate. Solche abgeleiteten Derivate sind beispielsweise (mono,
bi, tri) Fab-Fragmente, Fv-Fragmente, SFv-(Single Chain Antikörper), Di-,
Tri-, oder Tetrabodies sein. Die Antikörper können mono- oder polyklonale
Antiköper
sein. Solche Antikörper
und/oder davon abgeleitete Derivate können über verschiedene, dem Fachmann
bekannte Verfahren, wie z.B. die Hybridom-Technologie oder rekombinante
Verfahren wie die Phagen-Display-Technolgie, gewonnen werden.
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Die
auf dieser Basis gewonnenen Antikörper können in diagnostischen Testsystemen
oder zur therapeutischen Nutzung eingesetzt werden. Eine solche
therapeutische Nutzung kann beispielsweise durch Einsatz solcher
Antikörper
und/oder davon abgeleiteter Derivate in prophylaktischen und/oder
therapeutischen Impfungen, Injektion oder Gentherapie erfolgen.
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Ein
bevorzugter therapeutischer Einsatz derart gewonnener Antikörpern und/oder
davon abgeleiteter Derivate sind Infektionskrankheiten, Entzündungserkrankungen
oder der Einsatz in der kontrollierten Gentherapie, als z.B. TET-ON/TET-OFF
System.
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In
einer weiteren Ausführungsform
umfasst die Erfindung Kits zur Diagnose, einer Chlamydia pneumoniae
spezifischen Infektion. Solche Kits können mindestens einen der Biomarker
DnaJ und Hydrolase/phosphatase homolog und/oder Komponenten enthalten,
welche mindestens einen der Biomarker DnaJ und Hydrolase/phosphatase
homolog und/oder dessen Derivate spezifisch erkennen. Solche Komponenten
können beispielsweise
Antikörper,
Antikörperfragmente,
Nukleinsäuren,
Peptidonukleotide oder Aptamere sein. Weiterhin können solche
Kits Reagenzien enthalten, welche zur Probenvorbereitung oder Detektion
benötigt
werden. Solche Reagenzien können
z.B. Farbstoffe, Enzyme, Primer, radioaktive Substanzen, Puffer
oder Trägermaterialien
sein.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist der Kit Bestandteil einer Vorrichtung, welche verschiedene Schritte
der Bestimmung mindestens eines der Biomarker DnaJ und Hydrolase/phosphatase
homolog semi- oder vollautomatisch ausführt. Solche Vorrichtungen können derart
gestaltet sein, dass die Verarbeitung der Patientenproben in vitro
semi- oder vollautomatisch durchgeführt wird, beispielsweise die
Antrennung des Serums von restlichen Blutbestandteilen, die Verdünnung der
Blutprobe etc., und der meßtechnisch
bestimmt Gehalt der Biomarker in diesen Patientenproben über eine
geeignete Anzeige numerisch oder graphisch dargestellt wird.
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Die
Erfindung umfasst weiterhin die Verwendung der für Chlamydia pneumoniae Infektionen
spezifischen Biomarker und/oder deren Derivate oder gegen diese
Biomarker gereichteten Antikörper
in einer pharmazeutisch Zusammensetzung. Solche pharmazeutischen
Zusammensetzung können
beispielsweise als Impfstoffe Verwendung finden.
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Auführungsbeispiel
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Das
Ausführungsbeispiel
beschreibt die Identifizierung von neuen, für Chlamydia pneumoniae spezifischen
immunogenen Proteinen in isolierten Elementarkörpern, mit Hilfe einer serologischen
Proteomanalyse (SERPA), die für
die erfindungsgemäßen Verfahren
und Verwendungen anwendbar sind.
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Hierfür wurde
das Proteom der gereinigten Elementarkörper solubilisiert und die
Proteine mit Hilfe der zweidimensionalen Gelelektrophorese (2D-Elektrophorese) aufgetrennt.
Die voneinander getrennten Proteine wurden auf eine Membran übertragen
und immobilisiert. Die immobilisierten Proteine wurden dann mit
den Seren von zwei ausgewählten,
an einer nachgewiesenen Chlamydia pneumoniae spezifischen Infektion
erkrankten Patienten in Kontakt gebracht, und die spezifischen Immunreaktionen
visualisiert. Die immunogenen Proteine wurden mit Hilfe der Massenspektrometrie
und einer Datenbanksuche identifiziert.
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Für die SERPA
wurden spezifische Seren verwendet, d.h. Seren, die ausschließlich einen
Antikörpertiter
entweder gegen die Chlamydienspezies Chlamydia trachomatis oder
gegen die Chlamydienspezies Chlamydia pneumoniae aufwiesen. Die
Spezifität
der serologischen Analyse wurde somit gewährleistet durch die Verwendung
von Seren, die ausschließlich
eine Immunantwort gegen eine Chlamydienspezies, jedoch keinerlei
serologische Aktivität
gegenüber
der jeweils anderen Chlamydienspezies zeigten. Die entsprechenden
Eigenschaften der Seren wurden mit dem Mikroimmunfluoreszenz-Test
(MIF) charakterisiert.
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Für das Ausführungsbeispiel
werden folgende Figuren verwendet:
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1:
Nachweis immunreaktiver Proteine aus Elementarkörpern von Chlamydia pneumoniae
(Stamm TWAR 183).
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Detaillierte Beschreibunbg
des Ausführungsbeispiels:
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Ausgewählte Patientenseren
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- 1. Serum (SE 170026): Das Serum stammt von
einem männlichen
Patienten (Jahrgang 1952) mit einer nachgewiesenen akuten Infektion
mit Chlamydia trachomatis (MIF 1: 2048 (IgG); 1: 160 (IgA); IgM
negativ). In der MIF war in diesem Serum keinerlei Reaktion gegenüber Chlamydophila
pneumoniae nachweisbar.
- 2. Serum (SE 118715): Das Serum stammt von einem männlichen
Patienten (Jahrgang 1996) mit einer nachgewiesenen akuten Infektion
mit Chlamydia pneumoniae (MIF 1: 512 (IgG); 1:80 (IgA); IgM negativ). In
der MIF war in diesem Serum keinerlei Reaktion gegenüber Chlamydia
trachomatis und Chlamydophila psittaci nachweisbar.
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Anzucht und
Isolierung von Elementarkörpern
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A. Wirtszellen
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Stammhaltung:
BGM-Zellen wurden in Gewebekulturflaschen 250 ml bzw. 550 ml mit
OptiMEM und 10% FKS angezüchtet;
Einsaatdichte 1,5 × 106.
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Für die Gebrauchshaltung
wurden 48 Gewebekulturflaschen (50 ml) angelegt. Als Parallelkultur
wurden 4–10
Röhrchen
mit eingelegtem Deckglas verwendet; pro Röhrchen wurden 0,6 ml Zellsuspension
eingesät.
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Von
2 Gewebekulturflaschen (550 ml) wurde der Zellrasen trypsiniert
und das Zellsediment wurde in 500 ml OptiMEM + 10% FKS aufgenommen.
Davon wurden je 8 ml in die 50 ml Gewebekulturflasche geben. Die
Inkubation erfolgte im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 für ca. 3
Tage. Nachdem der Zellrasen geschlossen war, wurde die Chlamydieninfektion
durchgeführt.
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B. Infektion
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Die
Kulturflüssigkeit
wurde abgesaugt und in jede Gewebekulturflasche wurden 6 ml PBS
mit Chlamydophila pneumoniae (Stamm TWAR 183, kommerziell erhältlich bei
LGC Protochem unter der Nr. ATCC VR-2282, [cf. http://www.Igcpromochem-atcc.com/common/catalog/numSearch/numResults.cfm,
see also: GRAYSTON (J.T.), KUO (C.C.), CAMPBELL (L.A.) and WANG
(S.P.): Chlamydia pneumoniae sp. nov. for Chlamydia sp. strain TWAR.
Int. J. Syst. Bacteriol., 1989, 39, 88–90, the used strain originates
from Washington Research Foundation (Seattle, Washington)] gegeben
(3 × 107 IFUs/Flasche). Die Ansätze wurden bei 2000 × g zentrifugiert
(37°C; 30
min).
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Die
Parallelröhrchen
wurden mit 400 μl
des Chlamydienansatzes zur Kontrolle der Infektionsrate gegeben.
Ausserdem wurden 2 Röhrchen
mit je 10 μl
des Chlamydienansatzes zur Titerkontrolle beimpft und ebenso zentrifugiert.
Chlamydophila pneumoniae wurde nach 2 Tagen fixiert und gefärbt. Nach
der Zentrifugation wurde der Überstand
in den Flaschen abgesaugt und durch Panserin ersetzt (6 ml/Flasche).
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C. Ernte
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Der
Kulturüberstand
wurde abgesaugt (ein Teil des Überstandes
wurde als Spüllösung aufbewahrt). Der
Zellrasen wurde vorsichtig abgeschabt und die chlamydienhaltige
Flüssigkeit
in einer Kulturflasche gesammelt. Die abgeschabten Kulturflaschen
wurden mit aufgehobener Spüllösung gewaschen
und die Waschlösung
dann zu der chlamydienhaltigen Suspension zugegeben. Die Kulturflasche
wurde fest verschlossen, mit Parafilm abgedichtet und die Ernte
dann im Ultraschallbad ca. 30 sec aufgeschlossen. Danach wurde die
Chlamydienernte in 2 Zentrifugenröhrchen (50 ml Röhrchen)
gefüllt
und 3 min bei 4000 × g
zentrifugiert. Der Überstand
wurde dann mit einer Schlauchpumpe in Röhrchen für die Ultrazentrifuge gefüllt. Das
Zellsediment wurde noch einmal im gebrauchten Medium gewaschen und
danach erneut zentrifugiert.
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D. Präparation der Elementarkörper
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Die
Ultrazentrifugation erfolgte in Anlehnung an Caldwell et al. (1981).
Zur Reinigung und Trennung der Elementarkörperchen (EK) und Retikularkörperchen
(RK) mittels Dichtegradientenzentrifugation wurde Visipaque 320
[Amersham Health (GE Healthcare)] verwendet. Die gewünschte Verdünnung für die Gradienten erfolgte
mit PBS.
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In
jedes Zentrifugenröhrchen
wurden 24 ml Chlamydiensuspension gefüllt. Dann wurde mit 2 ml 8%, 3
ml 15% und 15 ml 30% Visipaque unterschichtet. Nach dem Verschweissen
der Zentrifugenröhrchen
wurde in der Ultrazentrifuge bei 40 000 × g für 50 min bei 8°C zentrifugiert.
Nach der Zentrifugation wurden die Röhrchen aufgeschnitten, die Überstände abgesaugt
und verworfen. Das Sediment wurde in PBS aufgenommen, homogenisiert
und in ein neues Röhrchen
für die
Ultrazentrifugation gegeben. Es erfolgte eine erneute Unterschichtung
der Präparation
mit Visipaque: 6 ml Chlamydiensuspension wurden mit 8%, 15%, 30%,
40% und 47% Visipaque unterschichtet, die Röhrchen verschweißt und bei
50 000 × g
50 min bei 10°C
zentrifugiert. Nach dem Öffnen
der Röhrchen
wurde der Inhalt vom Boden her abgepumpt. An der Grenze zwischen
47% und 40% Visipaque befanden sich die EK, während sich die RK im Bereich
von 36% Visipaque sammelten. Die EK wurden in einem neuen Ultrazentrifugenröhrchen gesammelt.
Dieses wurde mit PBS aufgefüllt,
verschweißt
und die Präparation
wurde erneut bei 30 000 × g
für 50
min bei 4°C
zentrifugiert. Die pelletierten Eks wurden in PBS aufgenommen, homogenisiert,
aliquotiert und bei –80°C eingefroren.
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2-D Gelelektrophorese
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Isoelektrische
Fokussierung: Der Proteingehalt (1 mg Gesamtprotein) aus Elementarkörperchen
von Chlamydophila pneumoniae (Stamm TWAR 183) wurde in eine Portionen
mit 700 μg
und 3 Portionen mit jeweils 100 μg
aufgeteilt und die Portionen wurden dann mit Methanol und Chloroform
nach dem Protokoll von Wessel und Flügge (1984) präzipitiert.
Die präzipitierten
Proteine wurden mit jeweils 50 μl
IEF-Lysispuffer (8 M Urea (Sigma U 6504), 4% (w/v) CHAPS (Sigma
C-9426; Bio-Rad 161-0460), 0,25% (w/v) Bio- Lytes 3/10 (Bio-Rad 163-1112), 65 mM
DTT (frisch zugeben) (Sigma D-9779),
10 mM Tris Base (frisch zugeben)) und 250 μl IEF-Puffer (8 M Urea (Sigma
U 6504), 2,4 M Thiourea (2,0 M finale Konzentration) (Sigma T-8656), 4% CHAPS (Sigma
C-9426; Bio-Rad 161-0460), 65 mM DTT (Sigma D-9779), 0,4% (w/v)
Bio-Lytes 3/10 (Bio-Rad 163-1112)), sowie 10 μl Bromphenolblau 1% (100 mg
Bromophenol blue, 60 mg Tris base, add 10 ml ddH2O) in
Lysis Puffer versetzt und in Lösung
gebracht (Schüttler,
20°C, 800
rpm, 30 min).
-
Nach
dem Abzentrifugieren ungelöster
Bestandteile (13,2 rpm, 20°C,
30 min) wurden die Ansätze
(300 μl)
in die Gelkammer für
die isoelektrische Fokussierung pipettiert, die Proteinlösung mit
IPG-Gelstreifen (17 cm IPG ready strip, Bio-Rad) blasenfrei in Kontakt
gebracht und die Gelstreifen mit 1,5 ml Mineralöl abgedeckt. Die Fokussierungskammer
wurde mit dem Deckel abgedeckt und das Programm zur isoelektrischen
Fokussierung gestartet.
-
Programm für die isoelektrische
Fokussierung:
-
A. Präfokussierung
-
- Temperatur 20°C
- Aktive Rehydrierung (50 V; 16 h; Pause nach Rehydrierung; nach
Beendigung der Rehydrierung wurden feuchte Elektrodenpapiere zwischen
Elektrodendraht und Gelstreifen positioniert)
-
B. Fokussierung
-
- S 01: 200 V; rapid slope; 2 h
- S 02: 400 V; rapid slope; 2 h
- S 03: 600 V; rapid slope; 2 h
- S 04: 1000 V; rapid slope; 2 h
- S 05: 2000 V; rapid slope; 2 h
- S 06: 3500 V; 60.000 V/h
- S 07: 250 V; 24 h
-
Die
fertigen IPG-Strips wurden aus der Fokussierungskammer entnommen,
kurz in H2O eingetaucht und bei –20°C eingefroren.
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SDS-PAGE:
Vor Beginn der SDS-PAGE wurden die aufgetauten IPG-Strips 2 × 15 min
in SDS-PAGE Äquilibrierungspuffer
I (6 M Urea (Sigma U 6504), 0,375 M Tris-HCl pH 8,8, 2% (w/v) SDS,
20% (v/v) Glycerol, 2% (w/v) DTT (Sigma D-9779)) und anschließend sofort
2 × 15
min in SDS-PAGE Äquilibrierungspuffer
II (6 M Urea (Sigma U 6504), 0,375 M Tris-HCl pH 8,8, 2% (w/v) SDS,
20% (v/v) Glycerol, 2,5% (w/v) Iodoacetamide (I-1149)) gewaschen.
-
Anschließend wurden
die IPG-Strips kurz in 1 × SDS-PAGE
Laufpuffer gespült
und sofort auf die in die Elektrophoresekammer montierten SDS-PAGE Gele aufgetragen.
Die auf dem Sammelgel aufgebrachten IPG-Strips wurden mit heißer Agarose
in 1 × SDS
Laufpuffer eingebettet.
-
Die
SDS-PAGE wurde mit Gradientengelen mit 7–20% Acrylamidgehalt durchgeführt. Die
Elektrophorese erfolgte bei einer konstanten Temperatur von 16°C (Lauda
WK 1400). Es wurde eine programmierbare Spannungquelle benutzt (Power
Pac 1000; Bio-Rad): Die Proben liefen bei 50 V in das Gel ein. Danach
wurde die Spannung auf 100 V eingestellt. Nach Erreichen der Trenngelgrenze
wurden 300 V eingestellt und die Proteine bei dieser Spannung aufgetrennt.
Die Elektrophorese wurde beendet, nachdem der zugesetzte Farbstoff Bromphenolblau
aus dem Gel herausgewandert war.
-
Die
fertigen Gele wurden wie folgt gefärbt bzw. prozessiert:
Gel
1 (700 μg
Protein): Färbung
mit Coomassie Brilliant Blau G250 (60 min auf Schüttler).
Entfärbung
mit 20% Methanol/10% Eisessig.
Gel 2 (100 μg Protein): Färbung mit
Silber
Gel 2 und 4 (jeweils 100 μg Protein): Die Proteine in
diesen Gelen wurden für
den serologischen Nachweis mit Hilfe des Western-blot Verfahrens
auf eine PVDF Membran übertragen.
-
Färbung mit
Coomassie Brilliant Blau
-
Die
fertigen SDS-PAGE Gele wurden für
60 Minuten in einer Coomassie-Färbelösung (6,25
g Coomassie-Brilliant Blau R 250, 900 ml Methanol, 180 ml Eisessig,
H2O ad 2 l) inkubiert (Schüttler, RT)
und anschließend
mit Entfärbelösung entfärbt.
-
Färbung mit Silber nach dem Protokoll
von Shevchenko (Shevchenko et al.; 1996)
-
Nach
der Elektrophorese wurden die Gele in 50% Methanol, 5% Eisessig
für 20
min bei RT auf einem Schüttler
inkubiert. Dann folgte eine Inkubation der Gele in 50% Methanol
für 10
Minuten.
-
Anschließend wurden
sie für
10 Minuten in ddH2O gewaschen (RT, Schüttler).
Es folgte eine Inkubation des Gels in 0.02% Natriumthiosulfat für 1 Minute.
Anschließend
wurden die Gele 2× für eine Minute
mit ddH2O gewaschen. Danach wurden die Gele
in einer gekühlten
(4°C) 0.1%
Silbernitrat-Lösung
für 20
Minuten bei 4°C
inkubiert. Die Gele wurden dann erneut 2× für eine Minute mit ddH2O gewaschen.
-
Die
Entwicklung der Gele erfolgte in 0.04% Formalin (35% Formaldehyd
in Wasser) in 2% Natriumkarbonat. Die Entwicklungslösung wurde
in ständiger
Bewegung gehalten (Schüttler).
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Die
Färbereaktion
wurde durch Abgießen
der Färbelösung und
sofortiger Zugabe von 5% Eisessig gestoppt. Die Gele wurden in 1%
Eisessig bei 4°C
aufbewahrt.
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Blotting
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Die
separierten Proteine aus den Gelen 2 und 4 wurden im Elektroblot-Verfahren auf PVDF-Membranen übertragen.
Hierfür
wurde das Gel zunächst
für 15
Minuten im Transferpuffer (48 mM Tris, 39 mM Glyzin, 1,3 mM SDS,
20% (v/v) Methanol) equilibriert. Das equilibrierte SDS-Gel wurde
dann mit der zuvor mit Methanol aktivierten PVDF-Membran luftblasenfrei
in Kontakt gebracht. Der Transfer erfolgte mit Hilfe der Trans-Blot Apparatur
(Bio-Rad) für
1 h bei 20 V. Nach dem Transfer wurde die Membran aus der Blotapparatur
entnommen und an der Luft getrocknet. Unmittelbar vor dem immunchemischen
Nachweis wurde die getrocknete Membran erneut mit Methanol aktiviert.
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Für den spezifischen
immunchemischen Nachweis der auf der Membran immobilisierten Proteine
wurden die unspezifischen Bindungsstellen zunächst in TBST [Tris-Buffered
Saline Tween-20] mit 4% Magermilchpulver abgesättigt (1 h, Schüttler, RT).
Anschließend
wurden die abgesättigten
Membranen nacheinander mit den Patientenseren in Kontakt gebracht.
-
Zunächst wurde
das Serum 2 (SE 118715) in einer Verdünnung von 1:5.000 mit TBST
mit 2% Magermilchpulver versetzt und die Membranen für 1 h auf
dem Schüttler
bei RT inkubiert. Nach einem Waschschritt mit TBST (5 min, 15 min
und 40 min, Schüttler,
RT) wurde der Blot mit dem sekundären Antikörper (Rabbit anti-human IgG
(DAKO, Dänemark)
inkubiert (Verdünnung
1:10.000 mit TBST mit 2% Magermilchpulver, 1 h, Schüttler, RT).
Nach dem abschließenden
Waschschritt (5 min, 15 min und 40 min, Schüttler, RT) wurden die an die
immobilisierten Chlamydienproteine gebundenen Serum-IgGs mit Hilfe
von Chemoluminiszenz (ECL-Kit; Amersham) detektierbar gemacht. Die
emittierte Chemoluminiszenz wurde mit Hilfe eines Röntgenfilms
nachgewiesen (Expositionszeit: 10 min, 60 min).
-
Vor
dem Immunnachweis mit dem Serum 1 (SE 170026) wurden die Membranen
zunächst
von den gebundenen Antikörpern,
die aus dem Serum 2 (SE 118715) stammen, befreit (Stripping Puffer
(0,2 M Glycin-HCl, pH 2,5; 0,05% TWEEN 20); 1 h, 65°C) und die
Membranen dann erneut mit TBST mit 4% Magermilchpulver abgesättigt.
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Der
Immunnachweis mit dem Serum 1 (SE 170026) wurde aufgrund des 4 fachen
Titers mit einer Verdünnung
von 1:10.000 (TBST mit 2% Magermilchpulver) durchgeführt. Die
Membranen wurden zunächst
mit dem verdünnten
Serum für
1 h auf dem Schüttler
bei RT inkubiert. Nach einem Waschschritt (5 min, 15 min und 40
min, Schüttler,
RT) mit TBST wurde die Membran mit dem sekundären Antikörper (Rabbit anti-human IgG
(DAKO, Dänemark)
inkubiert (Verdünnung
1:10.000 mit TBST mit 2% Magermilchpulver, 1 h, Schüttler, RT).
Nach dem abschließenden
Waschschritt (5 min, 15 min und 40 min, Schüttler, RT) wurden die an die
immunogenen Proteine bindenden Serum-IgGs mit Hilfe von Chemoluminiszenz
(ECL-Kit; Amersham) und eines Röntgenfilms
nachgewiesen (Expositionszeit: 10 min, 60 min).
-
Die
serologische Studie zeigt, dass Hydrolase/phosphatase homolog (Nr
1) und das Heat Shock Protein J (DnaJ) (Nr 2 und 3) von Immunglobulinen
(IgG) aus dem Serum des Patienten mit einer C. pneumoniae-Infektion erkannt
werden (1). Im Serum des Patienten mit
einer Infektion mit der nahe verwandten Spezies C. trachomatis ist
keine nennenswerte Immunreaktion gegen Hydrolase/phosphatase homolog
und DnaJ nachweisbar.
-
Das
mit Silber gefärbte
SDS-Gel zeigt die Positionen der immunogenen Proteine. Diese wurden
aus dem Gel ausgeschnitten und massenspektrometrisch analysiert
(1).
-
MALDI-Peptide Mass Fingerprint
(MALDI-PMF)
-
Für die Identifizierung
der Proteine, die für
die Immunologische Reaktion verantwortlich waren, wurden die Signale
auf den Röntgenfilmen
mit dem Spotmuster der gefärbten
Gele verglichen. Spots, deren Koordinaten mit den Signalen auf dem
Röntgenfilm übereinstimmten,
wurden aus dem Coomassie bzw. dem mit Silber gefärbten Gel ausgeschnitten und
zur Identifizierung einer massenspektrometrischen Analyse zugeführt.
-
Hierfür wurden
die aus dem Gel ausgeschnittenen Proteinspots zunächst entfärbt (1,5
l Methanol, 1,0 l Eisessig, H2O ad 10 l)
und die darin enthaltenen Proteine im Gel mit Trypsin verdaut. Anschließend wurden die
entstandenen tryptischen Fragmente aus der Gelmatrix eluiert und
mit Hilfe von C18-Ziptips
(Millipore) entsalzt. Aliquots wurden mit MALDI-MS (Voyager-DE STR;
Applied Biosystems) vermessen und Peptidmassen-Fingerprints erstellt.
Die Peptidmassen Fingerprints wurden mit den Datenbankeinträgen der
NCBI-Datenbank verglichen. Die Datenbanksuche ergab folgende Ergebnisse
(Tabelle 1):
-
Tabelle
1: Ergebnisse der MALDI-PMF Analyse
-
-
Die
gefundenen Peptidmassen wurden mit der NCBI-Datenbank verglichen.
Bei der Identifizierung wurden die höchsten Signifikanzen jeweils
für Proteine
aus Chlamydophila pneumoniae (Stamm CWL029) gefunden. Die berechneten
Molekulargewichte und isoelektrischen Punkte (17,5 kDa/5.13 für Hydrolase/phosphatase
homolog und 42,6 kDa/7.04 für
DnaJ) entsprechen den für
die jeweiligen Proteinspots aus den 2D-Gelen abgeschätzten Werten.
-
Die
gezeigten Analysen zeigen somit deutlich, dass die identifizierten
Proteine DnaJ und Hydrolase/phosphatase homolog als spezifische
Marker für
Chlamydia pneumoniae-Infektionen und damit für die erfindungsgemäßen Verfahren
anwendbar sind.
-
Literatur
-
- Kutlin A, Tsumura N, Emre U, Roblin PM, Hammerschlag
MR. Evaluation of Chlamydia immunoglobulin M (IgM), IgG, and IgA
rELISAs Medac for diagnosis of Chlamydia pneumoniae infection. Clin
Diagn Lab Immunol. 1997 Mar; 4(2): 213–6.
- Hermann C, Graf K, Groh A, Straube E, Hartung T. Comparison
of eleven commercial tests for Chlamydia pneumoniae-specific immunoglobulin
G in asymptomatic healthy individuals. J Clin Microbiol. 2002 May;
40(5): 1603–9.
- Hermann C, Gueinzius K, Oehme A, Von Aulock S, Straube E, Hartung
T. Comparison of quantitative and semiquantitative enzyme-linked
immunosorbent assays for immunoglobulin G against Chlamydophila
pneumoniae to a microimmunofluorescence test for use with patients
with respiratory tract infections. J Clin Microbiol. 2004 Jun; 42(6):
2476–9.
- Caldwell HD, Kromhout J, Schachter J. Purification and partial
characterization of the major outer membrane protein of Chlamydia
trachomatis. Infect Immun. 1981 Mar; 31(3): 1161–76.
- Wessel D, Flügge
Ul. A method for the quantitative recovery of protein in dilute
solution in the presence of detergents and lipids. Anal Biochem.
1984 Apr; 138(1): 141–3
- Shevchenko A, Wilm M, Vorm O, Mann M., Mass spectrometric sequencing
of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 1996
Mar; 168(5): 850–8.
PMID: 8779443
-
Es
folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
Dieses kann
von der amtlichen Veröffentlichungsplattform
des DPMA heruntergeladen werden.
