CN1163619A - 肺炎衣原体抗原多肽 - Google Patents

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Abstract

肺炎衣原体的抗原多肽，它包括含有SEQ ID NO：1多肽中至少5个连续的氨基酸残基的序列的多肽A；编码该多肽的DNA；含该DNA的重组载体；含该载体的转化子；用抗原多肽为抗原产生抗肺炎衣原体的抗体的方法；检测和分析此抗肺炎衣原体的抗体的方法；抗原多肽的应用；由二氢叶酸还原酶和肺炎衣原体抗原多肽组成的融合蛋白，其中SEQ ID NO：14的多肽与含SEQ ID NO：1多肽中至少5个连续的氨基酸残基的序列的多肽A进行了结合；编码该融合蛋白的DNA；含该DNA的重组载体；含该载体的转化子；用融合蛋白为抗原产生抗肺炎衣原体的抗体的方法；用融合蛋白为抗原检测和分析抗肺炎衣原体抗体的方法；融合蛋白的应用；检测和分析肺炎衣原体基因的探针和引物；应用该探针或引物检测和分析肺炎衣原体基因的方法，以及该探针或引物的应用。

Description

肺炎衣原体抗原多肽
发明标题
肺炎衣原体抗原多肽，含该多肽的融合蛋白，及其编码DNA，携带该DNA的重组载体，含该重组载体的转化子，产生抗体的方法，检测和/或测定抗体的方法和试剂，诊断肺炎衣原体感染的方法和试剂，检测和/或测定肺炎衣原体基因的探针和引物以及检测和/或测定肺炎衣原体基因的方法和试剂。发明领域
本发明涉及肺炎衣原体抗原多肽，含该多肽的融合蛋白，其编码DNA，携带该DNA的重组载体，含该重组载体的转化子，产生抗体的方法，检测或测定抗体的方法和试剂，诊断肺炎衣原体感染的方法和试剂，检测和/或测定肺炎衣原体基因的探针和引物，和检测和/或测定肺炎衣原体基因的方示和试剂。本发明可有效地用于制药工业，特别是制备诊断肺炎衣原体感染的药物。背景技术
已知有几种衣原体，即，砂眼衣原体，鹦鹉热衣原体，眼结膜衣原体，
肺炎衣原体等。砂眼衣原体引起砂眼，腹股沟淋巴肉芽肿，泌尿生殖道感染，包涵体结膜炎，新生儿肺炎等。鹦鹉热衣原体引起鹦鹉热等。肺炎衣原体引起呼吸道感染，非典型肺炎等。
由于肺炎衣原体引起的呼吸器官感染的综合症与由肺炎支原体或流感病毒引起的感染类似，医生常作出错误的诊断。因此，需要开发一种诊断由肺炎衣原体引起的感染的简单方法。
一般说来，可通过对感染部位的致病菌的检测或对体液如血清等中的抗致病菌的抗体检测而可靠的诊断感染。前述的方法称为抗原试验而后者称为抗体试验。它们在临床上都是重要的。如对肺炎衣原体，已知可用一种方法进行抗体试验，其中可用肺炎衣原体的原体抗体进行检测。
但是，该方法的缺点是肺炎衣原体的原体不仅与抗肺炎衣原体抗体反应，还可与抗其它种类的衣原体的抗体反应，因此非常不特异。这是因为肺炎衣原体的原体含有还存在于衣原体属中肺炎衣原体之外的其它种类，即，砂眼衣原体和鹦鹉热衣原体中的抗原。
做为可用于在大肠杆菌中表达大量蛋白的质粒，pBBK10MM是已知的(未审查的日本专利公开No.Hei 4-117284)。该质粒可用于表达一种抗过敏肽与DHFR的融合蛋白。表达的融合蛋白还保留了DHFR的酶促活性且因此可利用DHFR的特征和活性很方便地被纯化。
还进行了基因筛选以诊断感染。在该筛选中，应用核酸探针等对待测样品微生物基因的存在进行了实验测定。
对肺炎衣原体来说，已知一种如在日本未审查的专利公开号Sho 64-500083，U.S.P.No.5,281,518和WO 94/04549中所公开的那样进行的基因筛选方法。
但是，日本未审查的专利公开号Sho 64-500083和U.S.P.No.5,281,518仅公开了肺炎衣原体的染色体DNA或通过限制性酶切割染色体DNA而获得的DNA片段或其类似物被用做探针。这些DNA分子的碱基序列未被确定，从而这些探针的特异性是不清楚的。另外，很难确定反应条件。
尽管WO 94/04549公开了应用与核糖体RNA或其对应的DNA杂交的探针的方法，这些探针的特异性是不可靠的，因为在所有的生物体中核糖体RNA的同源性是相当高的。发明公开
本发明的一个目的是提供抗原多肽，它不与肺炎衣原体之外的衣原体属中的其它种类的抗体反应，如砂眼衣原体，鹦鹉热衣原体等并且只与肺炎衣原体特异的抗体反应从而可检测肺炎衣原体特异的抗体。
本发明的另一个目的是为了提供一种利用基因重组技术合成大量的抗原多肽的方法。
本发明的进一步的目的是提供产生抗肺炎衣原体的特异抗体的方法，检测和/或测定抗肺炎衣原体的特异抗体的方法和试剂，和诊断肺炎衣原体感染的药物，所有的方法都应用了所说的抗原多肽。
本发明还有另外一个目的是为了提供特异性地检测和/或测定肺炎衣原体基因的探针和引物，检测和/或测定肺炎衣原体基因的方法和试剂以及诊断肺炎衣原体感染的药物，所有的都使用了该探针或引物。
本发明还有另外一个目的是为了提供检测与衣原体属包括肺炎衣原体，砂眼衣原体，鹦鹉热衣原体等反应的抗体的抗原多肽。发明概述
发明的有关内容如下：
(1)一种肺炎衣原体抗原多肽，它包括含SEQ ID NO：1多肽的至少5个连续的氨基酸的序列的多肽(以后称为“多肽A”)。
(2)(1)的抗原多肽，其中所说的多肽A是一种从SEQ ID NO：1多肽中缺失了至少一个氨基酸的多肽。
(3)(1)的抗原多肽，其中所说的多肽A是一种在SEQ ID NO：1多肽中至少一个氨基酸被其它的氨基酸取代的多肽或一种在SEQ IDNO：1多肽中加入了至少一个氨基酸的多肽。
(4)(1)的抗原多肽，其中所说的多肽A是一种SEQ ID NO：1多肽中至少5个连续的氨基酸的序列结合了一个氨基酸或一个多肽序列的多肽。
(5)(1)的抗原多肽，其中的多肽A是含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽。
(6)(1)的抗原多肽，其中的多肽A是含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽。
(7)(1)的抗原多肽，其中所说的多肽A是含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽。
(8)编码(1)-(7)之任一的抗原多肽的DNA，或其互补DNA。
(9)(8)的DNA，它含有SEQ ID NO：3的碱基序列。
(10)(8)的DNA，它含有SEQ ID NO：4的碱基序列。
(11)(8)的DNA，它含有SEQ ID NO：7的碱基序列。
(12)携带(8)-(11)之任一的DNA的重组载体。
(13)(12)的重组载体，它是含SEQ ID NO：10的碱基序列的质粒pCPN533α。
(14)含(12)或(13)的重组载体的转化子。
(15)抗肺炎衣原体抗体的方法，其中(1)-(7)之任一的抗原多肽被用作抗原。
(16)检测和/或测定抗肺炎衣原体抗体的方法，其中(1)-(7)之任一的抗原多肽被用作抗原。
(17)检测和/或测定抗肺炎衣原体抗体的试剂，它包括作为抗原的(1)-(7)之任一的抗原多肽。
(18)诊断肺炎衣原体感染的试剂，它包括作为活性组份的(1)-(7)之任一的抗原多肽。
(19)肺炎衣原体抗原多肽与二氢叶酸还原酶的融合蛋白，其中含SEQ ID NO：2中至少5个连续氨基酸的序列的多肽直接或通过中介氨基酸或氨基酸序列与SEQ ID NO：14的多肽(以后称作“多肽B”)结合。
(20)(19)的融合蛋白，其中所说的多肽B是从SEQ ID NO：1的多肽中缺失了至少一个氨基酸的多肽。
(21)(19)的融合蛋白，其中所说的多肽B是一种SEQ ID NO：1的多肽中的至少一个氨基酸被其它的氨基酸取代的多肽或一种在SEQID NO：1多肽中添加了至少一个氨基酸的多肽。
(22)(19)的融合蛋白，它是含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的多肽。
(23)(19)的融合蛋白，它是含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的多肽。
(24)编码(19)～(23)之任一的融合蛋白的DNA，或其互补DNA。
(25)(24)的DNA，它含有SEQ ID NO：17的碱基序列。
(26)(24)的DNA，它含有SEQ ID NO：18的碱基序列。
(27)携带(24)～(26)之任一的DNA的重组载体。
(28)(27)的重组载体，它是质粒pCPN533T。
(29)含(27)或(28)的重组载体的转化子。
(30)产生抗肺炎衣原体抗体的方法，其中(19)～(23)之任一的融合蛋白被用作抗原。
(31)检测和/或测定抗肺炎衣原体抗体的方法，其中(19)～(23)之任一的融合蛋白被用作抗原。
(32)检测和/或测定抗肺炎衣原体抗体的试剂，它包括作为抗原的(19)～(23)之任一的融合蛋白。
 (33)诊断肺炎衣原体感染的试剂，它包括作为活性成份的(19)～(23)之任一的融合蛋白。
(34)检测和/或测定肺炎衣原体基因的探针，它包括如下之任一
(a)含SEQ ID NO：3 DNA中至少10个连续的碱基序列的DNA，
(b)(a)DNA的互补DNA，或
(c)与(a)或(b)的DNA有至少90％同源性的DNA。
(35)(34)的探针，它含有SEQ ID NO：19的碱基序列。
(36)(34)的探针，它含有SEQ ID NO：20的碱基序列。
(37)检测和/或测定肺炎衣原体基因的方法，其特征在于应用了(34)～(36)之任一的探针。
(38)检测和/或测定肺炎衣原体基因的试剂，它包括(34)～(36)之任一的探针。
(39)诊断肺炎衣原体感染的药物，它包括作为活性成份的(34)～(36)之任一的探针。
(40)检测和/或测定肺炎衣原体基因的引物，它包括如下之任一
(a)含SEQ ID NO：3 DNA中至少10个连续碱基序列的DNA，
(b)与DNA(a)的互补DNA，或
(c)与DNA(a)或(b)有至少90％同源性的DNA。
(41)(40)的引物，它含有SEQ ID NO：19的碱基序列。
(42)(40)的引物，它含有SEQ ID NO：20的碱基序列。
(43)检测和/或测定肺炎衣原体基因的方法，其中使用了(40)～
(42)之任一的引物。
(44)检测和/或测定肺炎衣原体基因的试剂，它包括(40)～(42)之任一的引物。
(45)诊断肺炎衣原体感染的试剂，它包括作为活性成份的(40)～(42)之任一的引物。
(46)一种肺炎衣原体抗原多肽，它选自
(a)SEQ ID NO：5的多肽，
(b)在SEQ ID NO：5多肽中缺失至少一个氨基酸的多肽，
(c)在SEQ ID NO：5多肽中至少一个氨基酸被另一个氨基酸取代的多肽，和
(d)(a)～(c)之任一与另一个氨基酸或肽的融合蛋白。
(47)一种肺炎衣原体抗原多肽，它选自
(a)SEQ ID NO：6的多肽，
(b)在SEQ ID NO：6的多肽中缺失了至少一个氨基酸的多肽，
(c)SEQ ID NO：6的多肽中至少一个氨基酸被另一个氨基酸取代的多肽，和
(d)(a)～(c)之任一与另一个氨基酸或肽的融合多肽。
(48)编码(46)的多肽的DNA，或其互补DNA。
(49)编码(47)的多肽的DNA，或其互补DNA。
(50)(48)的DNA，其中所说的编码(46)的多肽的DNA是SEQ ID NO：7的DNA。
(51)(49)的DNA，其中所说的编码(47)的多肽的DNA是SEQ ID  NO：8的DNA。
(52)携带(48)～(51)之任一的DNA的重组载体。发明详述
除非特别指出，在说明书中，只有一个碱基的脱氧核苷酸称为“单脱氧核苷酸”并且具有至少两个碱基的脱氧核苷酸称为“DNA”。
下面将详细解释本发明。抗原多肽
从可让肽具有抗原性的最小的角度出发，本发明的抗原多肽由含有SEQ ID NO：1多肽中至少5个连续的氨基酸序列的多肽组成的(以后称为“多肽A”)。
由于可以期望抗原-抗体反应的敏感性可随着氨基酸序列长度的增加而成比例的增加，多肽A最好由不少于20，优选不少于100，更优选不少于250氨基酸组成。
只要多肽A还具有肺炎衣原体固有的抗原性，它可耐受SEQ IDNo.1多肽中氨基酸的缺失(例如，1-250个氨基酸)。如果丢失的氨基酸的数目太大了，多肽A中固有的肺炎衣原体的抗原性将受到损害。
当丢失的氨基酸数目很大时(例如，5个或更多)时，为了保留肺炎衣原体的抗原性，多肽A优选丢失的氨基酸(例如，5个或更多)是连续的。
只要多肽A还具有肺炎衣原体固有的抗原性，它可忍受SEQ IDNo.1多肽中部分氨基酸被其它的氨基酸取代(例如，1-100氨基酸)或插入氨基酸(例如，1-100氨基酸)。如果取代或插入的氨基酸数目太大，多肽A中肺炎衣原体固有的抗原性将会受到损害。当取代或插入的氨基酸数目很大时(例如，5个或更多)，为了保留肺炎衣原体的抗原性，多肽A优选取代或插入的氨基酸(例如，5个或更多)是连续的。
取代中包括的氨基酸优选具有类似的特性，例如，如在甘氨酸和丙氨酸之间的取代中所观察到的。
只要多肽A还具有肺炎衣原体固有的抗原性，它可以是带有直接或通过中介氨基酸序列与SEQ ID No.1多肽至少5个连续的氨基酸序列连接的氨基酸或肽的多肽。
为了保留肺炎衣原体固有的抗原性，连接用的肽最好由不超过1000个氨基酸的序列组成，优选不超过500个氨基酸的序列，并最优选不超过200个氨基酸的序列。
做为这类氨基酸或肽的具体例子，可引用亮氨酸，亮氨酸-甲硫氨酸，二氢叶酸还原酶(DHFR)，和β-半乳糖苷酶。
作为应用DHFR或β-半乳糖苷酶作为肽的多肽A的具体例子，可引用DHFR肺炎衣原体抗原多肽融合蛋白和β-半乳糖苷酶肺炎衣原体抗原多肽融合蛋白。DHFR或β-半乳糖苷酶可直接或通过中介氨基酸序列与肺炎衣原体抗原多肽连接。
作为多肽A的具体例子，可引用SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，和Sequence No.5。
尽管中介氨基酸序列没有特别的定义，实例有亮氨酸和亮氨酸-甲硫氨酸的氨基酸序列。
作为本发明的融合蛋白的具体实例，可引用由SEQ ID No.15的氨基酸序列组成的多肽和由SEQ ID No.16的氨基酸序列组成的多肽。
在上面引用融合蛋白中，包含肺炎衣原体53kDa的整个抗原多肽的由SEQ ID No.15的氨基酸序列组成的多肽证明特别有用。
存在产生本发明的抗原多肽的化学合成的方法和基因重组的方法。
本发明的SEQ ID No.1的多肽是如序列表中所示由488氨基酸残基组成的抗原多肽。
本发明的SEQ ID No.2的多肽是如序列表中所示由271氨基酸残基组成的抗原多肽。
本发明的SEQ ID No.5的多肽是如序列表中所示由259氨基酸残基组成的抗原多肽。
在上述的其它抗原多肽，含有整个53kDa的肺炎衣原体的抗原多肽的SEQ ID No.1多肽证明特别有用。产生抗原多肽的方法
本发明提供了产生抗原多肽的化学合成的方法和基因重组的方法。
例如，在化学合成的方法中要数MAP(多抗原肽)法。MAP方法适于合成不超过30个氨基酸序列的肽。该合成可应用商业供应的肽合成装置完成。
在基因重组的方法中采用了这样的方法，它包括在载体中插入编码本发明的抗原多肽的DNA，从而构建重组载体，在宿主中插入重组载体从而产生转化子，并从转化子中分离靶肽。
后面将描述编码本发明的抗原多肽的DNA。
载体可以是质粒，噬菌体等。
作为宿主的具体实例，可以引用大肠杆菌，枯草杆菌，酵母，等。
现在，下面将详细描述形成转化子的方法和应用转化子纯化靶肽的方法。制备携带编码抗原多肽的DNA的重组载体和含同样的DNA的转化子
通过筛选(见下文)获得的λ噬菌体已是一种携带本发明的DNA的重组载体。用常规方法通过在已知的质粒载体或噬菌体载体中插入编码肺炎衣原体抗原多肽的DNA(见下文)而制备另外的重组载体。在这种情况下，如果需要可使用接头。可使用pBR322，pUC18，pUC19，pBBK10MM等已知的质粒载体。质粒pBR322，pUC18和pUC19可商业供应而pBBK10MM在日本未审查的专利公开号Hei 4-117284中有详细描述。对噬菌体载体来说，可应用λgtll噬菌体，λgt10噬菌体等。在任何情况下，都可获得对应于所用的亲本载体的重组载体。
携带本发明的DNA的重组载体包括质粒pCPN533α，53-3Sλ噬菌体等(见下文)。
所得到的重组载体被导入宿主中以制备转化子。如果应用源自大肠杆菌的质粒或λ噬菌体，大肠杆菌菌体如HB101作为宿主。宿主被处理成感受态细胞。通过处理大肠杆菌菌株HB101得到的感受态细胞可从Takara Shuzo有限公司购得。将重组载体导入宿主中制备转化子的方法在“分子克隆”中有描述。
培养获得的转化子以形成菌落。从每个菌落中获取质粒DNA并用合适的限制酶切割。根据切割的质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分析的结果选择具有所期望的重组质粒的转化子。这样制备质粒载体包括质粒pCPN533α。
这样制备的转化子实例包括含重组载体pCPN 533α的大肠杆菌HB101菌株。
带有编码肺炎衣原体抗原多肽和DHFR的融合蛋白的DNA的重组载体及含同样的DNA的转化子的制备
通过商业提供的试剂盒的方法将编码肺炎衣原体DNA分子的抗原多肽(见下文)与编码DHFR的DNA分子(见下文)连接。如果需要，在连接中可使用接头。DNA连接的试剂盒(Takara  Shuzo有限公司)可使用商业供应的试剂盒。如果由连接获得的DNA没有复制起点并且从而不能做为质粒起作用，该DNA可被插入到独立的质粒载体，如pBR322，pUC18等中。
连接的DNA被导入宿主中以制备转化子。如果使用源自大肠杆菌的质粒，大肠杆菌菌株如HB101可被用做宿主。宿主被处理成感受态细胞。由处理大肠杆菌HB101获得的感受态细胞可从Takara  Shuzo有限公司购得。在“分子克隆”中描述了将连接的DNA导入宿主中以制备转化子的方法。
培养获得的转化子以形成菌落。从每个菌落中获取质粒DNA并用合适的限制酶消化切割。根据琼脂糖凝胶电泳分析的结果选择了具有所需的重组质粒的转化子。这样制备的一个质粒载体一个实例是质粒pCPN533T。
这样制备的转化子实例包括含重组载体pCPN 533T的大肠杆菌HB101菌株。
转化子的培养如下：在合适的温度下，在含有该转化子的培养箱中摇荡培养，培养基允许转化子生长到足够量的所需的抗原多肽已积累在转化子中。如果用含重组载体pCPN 533α或pCPN 533T的大肠杆菌HB101株作为转化子，该细胞可在含氨苄青霉素的LB培养基中37℃过夜振荡培养。接着，将培养物接种到含氨苄青霉素的TB培养基中并在37℃进一步摇荡培养过夜。制备TB培养基的方法在“分子克隆”中描述。
离心收获培养的转化子并悬于缓冲液中。通过在悬液中超声破碎转化子。如果转化子是大肠杆菌，可接着向悬液中加入溶菌酶和含SDS的缓冲液裂解细胞。
当目标多肽是可分泌形式时，离心培养肉汤以获得上清。
在破碎转化子之后，离心去除细胞碎片，从而得到上清。向上清中加入硫酸链霉素。将混合物搅拌一段时间然后离心沉淀核酸，从而得到上清。
用硫酸铵沉淀上清并离心。通常，回收沉淀作为产物。由于上清可能含目标肽，实践证明取样并分析上清从而确证肽的存在与否是有好处的。
沉淀的少量缓冲液的溶液或者上清通过液体层析分级分离。用肺炎衣原体特异的单克隆抗体通过Western印迹对含蛋白的级分进行印迹以得到含抗原多肽的级分。当多肽A是与DHFR融合的蛋白时，在液体层析中可使用氨甲蝶呤(Metaotrexate)柱。在“分子克隆”中描述了特定去除细胞膜等残渣的方法，加入硫酸链霉素去除DNA的方法，加入硫酸铵回收蛋白质的方法和Western印迹方法。编码抗原多肽的DNA
在本发明中，编码SEQ ID NO：1的多肽的DNA指通过利用遗传密码将SEQ ID NO：1的多肽的氨基酸翻译成三联体而得到的DNA(每个氨基酸指定了1-6套核苷酸序列)。该组DNA包括SEQ IDNO：3的DNA。
编码抗原多肽A的DNA指编码多肽A的多种DNA。这些DNA选自根据遗传密码将多肽A的氨基酸序列翻译成三联体而得到的DNA。
对多肽A，可提供这些已在上面“抗原多肽”一书中描述的多肽。对编码多肽A的DNA，可提供对应于这些多肽的氨基酸序列的核苷酸序列。
类似地，编码SEQ ID NO：2的多肽的DNA指选自根据遗传密码将SEQ ID NO：2的多肽的氨基酸翻译成三联体而得到的多种DNA。这组DNA包括SEQ ID NO：4的DNA。
另外，编码SEQ ID NO：5的多肽的DNA指选自根据遗传密码将SEQ ID NO：5的多肽的氨基酸翻译成三联体而得到的多种DNA。这组DNA包括SEQ ID NO：7的DNA。
另外，编码SEQ ID NO：6的多肽的DNA指选自根据遗传密码将SEQ ID NO：6多肽的氨基酸翻译成三联体而得到的多种DNA。这组DNA包括SEQ ID NO：8的DNA。
编码融合蛋白的DNA包括对应于融合蛋白的氨基酸序列的密码子。该DNA包括但并不限于SEQ ID NOs：17 & 18的DNA。
SEQ ID No.17的碱基序列是编码DHFR和53kDa的肺炎衣原体整个抗原多肽的融合蛋白的DNA碱基序列，以及SEQ ID No.18的碱基序列是编码DHFR和(部分)肺炎衣原体的53kDa的抗原多肽之融合蛋白的DNA碱基序列。
这些DNA可由化学合成方法或基因重组方法产生。
在化学合成方法中主要是适于不超100个碱基序列长度的DNA的合成的磷酰亚胺(phosphoamidite)方法。这种化学合成可由商业供应的DNA合成仪进行。
在基因重组的方法主要是用一种已描述的方法从肺炎衣原体的原体中克隆DNA的方法和利用已得到的DNA为模板并应用在该DNA中任意选择的位点碱基序列生产的引物的PCR方法。基因重组的方法可产生超过1000碱基的长DNA。
现在，如下将详细描述编码来自肺炎衣原体原体的抗原多肽的DNA的克隆方法。肺炎衣原体的培养
细胞悬液制备自HL细胞。去除培养上清然后向得到的细胞沉淀(sheet)中加入肺炎衣原体的悬液。在培养之后，离心得到肺炎衣原体感染的HL细胞。对肺炎衣原体使用了YK41株(Y.Kanamoto等，Microbiol.Immunol.，Vol.37，p495-498，1993)。肺炎衣原体原体的纯化
将肺炎衣原体感染的HL细胞破碎并离心，从而回收上清。将得到的上清在含Urografin(Schering)连续的密度梯度溶液离心分层。
回收淡黄色白带，因为在预实验中已借助电子显微镜确证了它含有肺炎衣原体的原体。肺炎衣原体基因组DNA的制备
肺炎衣原体的原体被悬于含1mM乙二胺四乙酸盐(EDTA)的10mM Tris-HCl缓中液(pH8.0)中(以后称为“TE”缓冲液)。向得到悬液中加入1％十二烷基磺酰钠(SDS)的水溶液和蛋白酶K的水溶液(1mg/ml)并温育裂解原体。向得到的溶液中加入用0.1MTris-HCl缓冲液(pH8.0)饱和的苯酚。搅拌混合物并离心回收水层。得到的水层接着用RNase和苯酚/氯仿/异戊醇处理，接着用乙醇沉淀。结果得到了肺炎衣原体的基因组DNA。基因组DNA表达文库的制备
基因组DNA被限制酶AccI，HaeIII和AluI消化。消化液用苯酚/氯仿/异戊醇处理并进行乙醇沉淀以产生部分消化的DNA。向部分消化的DNA中加入接头，腺苷5-三磷酸(以后称为“ATP”)和T4连接酶，从而将接头与部分消化的DNA连接。
将被接头连接的部分消化的DNA上Chroma spin 6000柱，其中流动相是含0.1M NaCl和1mM EDTA的10mM Tris-HCl缓冲液。收集洗脱液并回收含1-7kb DNA片段的级分。向得到的级分中加入ATP和T4多核苷酸激酶并进行反应使DNA片段的5’末端磷酸化。反应液被苯酚/氯仿/异戊醇处理并进行乙醇沉淀以产生5’末端磷酸化的DNA片段。
向得到的DNA片段中加入预先用限制酶EcoRI消化的λgt11DNA，ATP和T4连接酶并进行反应。将得到的重组λgt11 DNA用商业提供的包装试剂盒进行包装以制备基因组DNA表达文库。编码抗原多肽的DNA的克隆
大肠杆菌Y1090r-株的培养细胞被基因组DNA表达文库感染并在琼脂培养基中培养。插入DNA在细胞中产生的蛋白质被转移到浸在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)水溶液中的硝酸纤维素滤膜上。滤膜用牛血清白蛋白封闭并漂洗。滤膜然后与肺炎衣原体特异的单克隆抗体反应。肺炎衣原体特异的单克隆抗体，可使用AY6E2E8和SCP53。根据布达佩斯条约，一个产生AY6E2E8的杂交瘤细胞株已被保藏在工业科学和技术省，国立生命科学和人体技术研究所(日本，Higashi 1 ChomeTsukubashi Ibaraki-ken305，1-3)，保藏号FERM BP-5154。产生SCP53的杂交瘤细胞系已在J.Clin.Microbiol.，Vol.132，p.583-588，1994中公开。反应之后，将膜漂洗，并与用如过氧化物酶等酶标记的抗-小鼠IgG抗体反应，反应之后，将膜漂洗，并与显色底物溶液反应。显色底物溶液，可使用过氧化氢水溶液和4-氯-1-萘酚甲醇溶液的混合物。反应之后，将膜漂洗，并将其在空气中干燥。
对应于膜上显色斑点的噬菌斑被鉴定并得到了包含在噬菌斑中的λ噬菌体。重复上述的方法直到所有噬菌斑都与前述的单克隆抗体反应。结果，编码抗原多肽的DNA被克隆并得到了表达具有与肺炎衣原体特异性的单克隆抗体的反应性的肺炎衣原体抗原多肽的λ噬菌体。编码肺炎衣原体特异的抗原多肽的DNA的产生
大肠杆菌Y1090r-株被得到的λ噬菌体感染并被培养以产生大量的λ噬菌体。用商业供应的试剂盒从λ噬菌体中得到DNA分子并纯化。向得到的DNA分子中加入引物，Taq聚合酶和脱氧核苷酸。重复加热，冷却和温育的步骤，从而扩增插入到λgt11中的DNA分子。可用λgt11正向引物和反向引物(Takara Shuzo有限公司)作为引物和用AmpliTaqDNA聚合酶作为Taq聚合酶。DNA扩增的一般方法称为PCR方法，它在J.Sambrook等，分子克隆，第二版，冷泉港实验室出版(1989)(以后称“分子克隆”)中有详细描述。
得到扩增的DNA并测定和分析其碱基序列。可用商业供应的试剂盒如Wizard PCR Prep试剂盒(Promega)得到扩增的DNA。该碱基序列可通过Taq聚合酶荧光标记的终止子(terminator)循环测序确定。该测序可用从日本Perkin-Elmer商业购得的试剂盒进行。为了分析碱基序列，可使用商业供应的装置如373A型DNA测序仪(AppliedBiosystems)。
在确定了碱基序列之后，用DNA测序软件包如DNASIS(HitachiSoftware Engineering)分析DNA的碱基序列以评估一个可剪辑的，有功能的可翻译成氨基酸的区域。
但是发现没有得到全长的基因，用基因组步行得到现在该DNA的上游和下游DNA分子。基因组步行可用购自Takara Shuzo有限公司的试剂盒进行。编码DHFR的DNA的制备
通过从含该DNA的质粒载体上用限制酶消化该DNA或者通过用模板质粒DNA或含该DNA的基因组DNA和一个合适的引物用PCR扩增该DNA而得到编码DHFR的DNA。
在前者的方法中，本发明的质粒载体pBBK10MM和重组载体pCPN533T可被用做含DHFR编码DNA的质粒载体。含pCPN 533T的大肠杆菌和含pBBK10MM的大肠杆菌已被保藏于工业科学和技术省，国立生命科学和人体技术研究所，保藏号分别是FERM BP-5222和FERM BP-2374。质粒pCPN 533T可用常规的得到质粒DNA的方法从保藏的大肠杆菌中得到，该方法在“分子克隆”中描述。当用质粒pBBK10MM时，可用限制酶BamHI和XhoI切割下约48kb长度的DNA片段。
在后者的方法中，pBBK10MM和pCPN 533T(见上文)可被用做质粒DNA并且枯草杆菌的基因组DNA可以做为基因组DNA。可用常规的得到基因组DNA的方法得到基因组DNA，该方法在“分子克隆”中有描述。
后者方法中所用的引物可在考虑了DHFR编码DNA的5’和3’末端之后设计和合成。例如，可使用含SEQ ID NO：17碱基序列中1-20序列的寡核苷酸和具有与SEQ ID NO：5碱基序列中461-480序列互补序列的寡核苷酸。这些寡核苷酸可用商业供应的DNA合成仪化学合成。
在上面提到的抗原多肽中，特别优选含有肺炎衣原体整个53kDa抗原多肽的SEQ ID NO.1的多肽。应用抗原多肽为抗原产生抗肺炎衣原体抗体的方法
一种抗肺炎衣原体的抗体可如下产生：用本发明抗原多肽做为抗原免疫小鼠，从免疫小鼠中分离脾细胞，将脾细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，从所产生的杂交瘤中筛选能识别肺炎衣原体53kDa抗原多肽的杂交瘤并培养所选择的杂交瘤。
代表性的骨髓瘤细胞系包括p3X63Ag8·653(ATCC CRL-1580)和p3/NSI/l-Ag4-1(ATCC TIB-18)。
除了用本发明的抗原多肽作为抗原之外，用常规的通过免疫小鼠获得抗体的已知的常规方法得到了抗肺炎衣原体的抗体。用抗原多肽作为抗原检测和/或测定抗肺炎衣原体的方法和试剂，以及包括作为活性成分的抗原多肽的用于诊断肺炎衣原体感染的药物
检测和/或测定抗肺炎衣原体抗体的方法包括，例如，将抗原多肽固定在承载体上，上样品，漂洗，加入标记的二抗，漂洗并直接或间接检测和/或测定标记等步骤。
承载体的实例包括乳汁颗粒，纤维素珠，塑料分析板和颗粒等。
抗原多肽可通过共价键合或物理吸附固定到承载体上。
样品实例包括人血清等。优选用牛血清白蛋白等在加入样品之前封闭承载体的表面以便确认样品中其它的抗体不会与承载体非特异性的结合。
承载体用含表面活性剂的缓冲液等洗涤。
一个标记的二抗是标记的抗人单克隆抗体。可用的标记包括各种酶如碱性磷酸酶，虫荧光素酶，过氧化物酶，β-半乳糖苷酶等，各种荧光化合物如荧光素等。化学化合物如生物素，亲和素，链霉亲和素，地高辛等可被插入到抗体和标记物之间。
当标记物是一种酶时，可通过加入底物和/或测定由酶的催化作用引起的光发射或显色反应或测定光吸收的变化而被检测和/或测定。当标记物是荧光化合物时，它可通过用紫外线照射反应系统和检测和/或测定发射荧光而被检测和/或测定。如果需要增感屏(sensitizer)。
用本发明的抗原多肽为抗原检测和/或测定抗肺炎衣原体抗体的试剂包括固定在承载体上的抗原多肽和必要量的二抗和底物的试剂。
上述的试剂可被用做诊断肺炎衣原体感染的药物。检测和/或测定肺炎衣原体基因的探针和引物
编码肺炎衣原体53kDa的抗原多肽的DNA具有SEQ ID NO：3的碱基序列。
本发明的探针和引物包括选自如下之任一的DNA
(a)含SEQ ID NO：3 DNA中至少10个连续碱基序列的DNA，
(b)与(a)的DNA互补的DNA，或
(c)与(a)或(b)的DNA具有至少90％同源性的DNA。
探针和引物碱基序列的长度优选为10-50bp，更优选15-20bp。
本发明的探针和引物的特定的实例包括一个包含SEQ ID NO：19的碱基序列的DNA和一个包含SEQ ID NO：20的碱基序列的DNA。
本发明的探针和引物可用商业供应的合成仪方便地合成。DNA合成仪可用商业供应的Applied Biosystems等的产品。另外，本发明的探针和引物可通过化学合成一个短的DNA片段并以短的DNA为引物用PCR合成长的DNA片段来进行。
本发明的探针和引物包括这些被标记的DNA。
代表性的标记包括化学化合物例如生物素，亲和素，链霉亲和素，地高辛等；酶如碱性磷酸酶，虫荧光素酶，过氧化物酶，β-半乳糖苷酶等；和荧光化合物如荧光素等。生物素可与探针结合，例如，通过在末端转移酶的存在下向探针中加入生物素化的脱氧尿苷5’-三磷酸。可从Boehringer Mannheim购得含末端转移酶和生物素化的脱氧尿苷5’-三磷酸。在结合生物素之外的其它标记时，也可使用商业供应的试剂盒。这样的试剂盒可从Takara Shuzo有限公司和TOYOBO有限公司购到。另外，可用“分子克隆”所描述的方法结合标记。
如果需要，放射性同位素可被用做标记。在这种情况下，在T4多核苷酸激酶的存在时，(γ-32P)dATP被加入到探针和引物中。在“分子克隆”中描述了用放射性同位素进行标记的一般方法。T4多核苷酸激酶可购自TOYOBO有限公司和(γ-32P)dATP可购自Amersham。
与本发明的探针和引物对应的RNA，即，其中在碱基部分胸苷被尿苷取代以及在糖链中脱氧核糖被核糖取代的核酸，可代替前述的包括作为结构单位的DNA作为探针和引物。这些以RNA为结构单元的探针和引物可被用于检测和/或测定本发明的方法和试剂中。检测和/或测定肺炎衣原体基因的方法
肺炎衣原体基因可如下检测和/或测定，例如，通过电泳基于分子量的差别从样品中分离DNA，将得到的DNA转移到硝酸纤维素膜上，尼龙膜等上以便鉴定，加入本发明的标记探针，并检测和/或测定该标记。该方法被称为Sourthern印迹技术并且其一般的方法在“分子克隆”中有描述。
例如，肺炎衣原体基因可用本发明的引物，用上述的PCR方法进行检测和/或测定。应用本发明的引物通过PCR检测和/或测定肺炎衣原体基因的方法包括下面的步骤。
(i)含本发明的引物的缓冲液，DNA聚合酶，dATP，dCTP，dGTP和dTTP被加入到含DNA的样品中并加热该混合物。
(ii)反应液被冷却，保持恒温并加热。
(iii)重复步骤(ii)。
(iv)反应液中所含的DNA被检测和/或测定。
步骤(i)中所用的含DNA的样品可以是从病人的咽粘膜中提取的核酸。
步骤(i)中所用的DNA聚合酶可以是Taq聚合酶，它可购自TOYOBO有限公司。
在步骤(i)中，混合物被加热，例如，让其在90-100℃保持0.5-10分钟。
在步骤(ii)中，反应液被冷却，例如，让其在45-65℃保持0.5～5分钟，再让其在恒温，例如70-80℃中保持1-10分钟，再加热，例如，在90-100℃保持0.5-5分钟。
步骤(i)中的加热，和步骤(ii)中的冷却，保持恒温以及加热可用DNA热循环仪_(Perkin-Elmer Cetus)进行。
步骤(iii)可重复任意次数，优选大约30次。
反应液中所含的DNA在步骤(iv)中被检测和/或测定，例如，用含溴化乙锭的琼脂糖凝胶将反应液进行电泳并且从而基于分子量的差别和用紫外线照射琼脂糖凝胶分离反应液中的DNA。如果本发明的引物被标记了，可借助于该标记检测和/或测定该DNA。
在本发明的另一个实施方案中，在步骤(i)-(iii)之后，本发明的引物可被另外的具有另外的碱基序列的引物替代并且重复步骤(i)-(iii)，接着是步骤(iv)。检测和/或测定肺炎衣原体基因的试剂
一个根据本发明的检测和/或测定肺炎衣原体基因的代表性试剂是本发明的探针或引物的水溶液，它被冷冻包装在塑料容器中。实施本发明的最佳方式
下面将参照实施例详细描述本发明。应该明确理解到本发明不受这些实施例任何的限制。
下面将按其发生序列描述该方法的组成步骤，即从肺炎衣原体宿主细胞的培养到肺炎衣原体抗原多肽基因DNA序列/氨基酸序列的确定。实施例1：编码对肺炎衣原体特异的53K抗原多肽的DNA的制备(A)宿主细胞的培养(HL细胞)
在塑料培养瓶(75cm2)的底面上接近汇合培养的HL细胞用5ml无镁(-)的磷酸缓冲生理盐溶液(以后称为“PBS”)漂洗，用5ml含0.1％胰蛋白酶(w/v)的PBS封闭整个平面，去除过多的溶液，在37℃保温10分钟，并加入5ml含10％(v/v)胎牛血清的DulbeccoMEM培养基。通过吸取(pipetting)回收粘附到瓶内部的HL细胞以得到细胞悬液。
塑料瓶中的培养如下完成：用1ml上述的细胞悬液和5到20ml含10％(v/v)胎牛血清的Dulbecco MEM培养基接种培养瓶并且6孔塑料培养板(vessel)中的培养如下进行：向6个孔中的每一个中加入4ml由8ml上述的细胞悬液和292ml含10％胎牛血清的Dulbecco MEM培养基组成的混合液，并在含5％(v/v)二氧化碳气的空气中进行培养。(B)肺炎衣原体YK41的培养
从繁殖在6-孔塑料培养板(在其底部表面上)的HL细胞的培养溶液中，用移液器(pipet)去除上清。在培养板上残留的细胞片(sheet)上，接着每孔加入2ml肺炎衣原体YK41株的悬液(Kanamoto等，Microbiol.Immunol.，Vol，37，p.495-498，1993)[通过用含75g蔗糖，0.52g磷酸二氢钾，1.22g磷酸氢二钾，和0.72g谷氨酸每升的水溶液将保存的肺炎衣原体YK41溶液稀释到原体积的12到24倍，用超声波处理被稀释的溶液1分钟，将得到的稀释液在2,000rpm离心分离3分钟而得到的上清]，被在2,000rpm离心吸附1小时。在离心吸附之后，从得到的细胞片中去除肺炎衣原体悬液。剩余的细胞片在每孔加入4ml含1μg/ml环己亚胺和10％(v/v)胎牛血清的Dubecco MEM培养基后，在含5％(v/v)二氧化碳气的空气中在36℃培养3天。在培养之后，粘附到培养板上的细胞用无菌的硅氧烷刮刀分离下来并回收。该细胞在8,000rpm离心30分钟。得到沉淀接着重悬浮于SPG中并将得到的悬液保存在-70℃。(C)肺炎衣原体YK41株原体的纯化
保存在-70℃的被肺炎衣原体YK41感染的HL细胞冷冻悬液被融化并用匀浆器匀浆。将匀浆液在2,500rpm离心分离10分钟并回收得到的上清。将沉淀再次悬浮于SPG中并用上面所描述的同样的方法去回收新的上清。再重复该程序二次。后面的上清被加入到一个体积中。
独立地，在离心管中放0.03M含50％蔗糖(w/v)的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，然后3份体积的76％Urografin(由Schering公司生产)与7份体积的0.03M Tris-HCl缓冲液(pH7.4)的混合液被放在上面，并且接着将如上所述回收的上清小心地迭加在混合液层的上面。将离心管中迭加的多层在8,000rpm离心1小时。从管中回收含50％(v/v)蔗糖的0.03M Tris-HCl缓冲液(pH7.4)的层和沉淀。将回收的溶液和加入其中的等体积的SPG在10,000rpm离心30分钟。从得到的分离相中去除上清并将沉淀悬浮于SPG中。在离心管中放入连续的由0.03M Tris-HCl缓冲液(pH7.4)中35％到50％的Urogratin76％(前者成份的体积占总溶液体积的比例)组成的溶液并在其上放上前述的悬液。将离心管中迭加的各层在8,000rpm离心1小时。取样少量的淡黄色白带并在电子显微镜下观察，发现它含有肺炎衣原体的原体。因此，回收该带并且用SPG稀释到原体积的2倍，再在10,000rpm离心30分钟将接着离心得到的沉淀悬浮在SPG中，分析蛋白浓度(借助于Biorad公司生产的蛋白分析试剂盒，用牛血清白蛋白作为标准)，并在-70℃保存。(D)肺炎衣原体YK-41株基因组DNA的制备
将三百(300)μl上述的纯化的肺炎衣原体YK-41株原体(蛋白浓度：1.37mg/ml)的悬液在4℃12,000rpm离心5分钟。得到的沉淀被悬浮在500μl 10mM的含1mM EDTA的Tris缓冲液(pH8.0)中(以后称为“TE缓冲液”)。重复同样的离心并将得到的沉淀悬浮在300μl TE缓冲液中。产生的悬液和加入到其中的30μl 2％SDS水溶液和30μl 1mg/ml蛋白酶K水溶液在56℃温育30分钟以对原体的溶液起作用。温育过的溶液和加入到其中的350μl苯酚饱和的0.1MTris-HCl缓冲液(pH8.0)用旋涡混和器充分搅拌。得到的混合物在4℃12,000rpm离心5分钟。从分离的各层中，回收水层(为了提取DNA)。将提取方法再重复一次。将水层和加入至其中的2μl 10mg/ml RNase溶液在37℃温育2小时以降解RNA。将温育过的溶液与300μl混合液用旋涡混合器充分振荡，混合液由苯酚饱和的0.1M tris-HCl缓冲液(pH8.0)，氯仿，和异戊醇按25∶24∶1的体积比组成(以后称为“PCI”)。得到的混合物在4℃12,000rpm离心5分钟。从分离的各层中，回收水层。重复该程序直到第五次。
将1体积的得到的溶液和加入到其中的1/10体积的乙酸铵水溶液和2体积的乙醇放置5分钟以沉淀DNA。将得到的混合溶液在4℃，12,000rpm离心5分钟。将沉淀加600μl 70％乙醇水溶液充分振荡并在4℃12,000rpm离心5分钟进行纯化。将该程序再重复2次。将离心管中的内容物开着盖放置15分钟以干燥沉淀。将干燥的沉淀溶于200μl TE中并将得到的溶液保存在-20℃。(E)基因组DNA表达文库的制备
将一百(100)μl基因组DNA溶液和加入到其中的10μl限制性内切酶级的M-缓冲液和10μl限制性内切酶混合液(通过混合AccI，HaeIII，和用20μl TE 1/50稀释的AluI各0.4μl而获得)在37℃反应20分钟。上面的20分钟反应时间是将DNA部分降解到1到7kbp的DNA级分所必须的。这是先用少量的基因组DNA的经验中得到的。得到的反应液和加入到其中的100μl PCI用旋涡混合器充分振荡并将产生的混合物在4℃12,000rpm离心5分钟。从由此得到的各层中回收水相。将回收的水层和加入到其中的10μl 3M乙酸铵水溶液和220μl乙醇在-80℃放置15分钟以沉淀部分消化的DNA。将产生的混合液在4℃12,000rpm离心5分钟。从分离的各层中，去除上清。将沉淀与600μl 70％乙醇水溶液混合并将产生的混合物在12,000rpm离心5分钟。弃去上清并减压干燥沉淀。
由此得到的部分消化的DNA被溶于20μl纯水中。19μl DNA溶液和14μl由下面的碱基序列所示的接头(20pmol/μl)，4.5μl 10mMATP，4.5μl含50mM MgCl2，50mM二硫苏糖醇，和500μg/ml牛血清白蛋白的0.2M的Tris-HCl缓冲液(pH7.6，以后称为“10倍浓度的连接级的缓冲液”)，2μl纯水，和1μl T4连接酶被置于16℃反应4小时以加入该接头。
5’-AATTCGAACCCCTTCG-3’
3’-GCTTGGGGAAGCp-5’
如上所述加入了接头的部分消化的DNA用10mM含0.1M NaCl和1mM EDTA的Tris-HCl缓冲液作为迁移相过柱(Chroma Spin6000)。从洗脱液中，每2滴作一个级分分离。对每个级分用0.8％琼脂糖凝胶电泳作部分分析以回收含1kbp到7kbp大小的DNA片段的级分。144μl量的产生的级分和13μl纯水，20μl 10mM ATP，20μl0.5M含0.1M MgCl2，50mM二硫苏糖醇，1mM盐酸精铵，和1mMEDTA的Tris-HCl缓冲液(最大值pH7.6；以后称为“10倍浓度的磷酸化级的缓冲液”)，和3μl T4多核苷酸激酶被置于37℃反应30分钟以对DNA片段的5’末端进行磷酸化。得到的反应液和加入到其中的200μl PCI通过振荡充分混合。产生的混合物在4℃12,000rpm离心5分钟。从分离的各层中，回收水层。向水相中加入1μl 20mg/ml的糖原溶液，20μl 3M乙酸钠水溶液，和400μl乙醇以沉淀核苷酸。得到的溶液在4℃12,000rpm离心10分钟。弃去上清。沉淀与200μl 70％乙醇混合并再次离心。从分离的各层中，弃去上清。沉淀被空气干燥并溶于1μl纯水中。
将0.6μl得到的水溶液和1μl预先用限制内切酶EcoRI切割的λgt11DNA(1μg/μl，由Stratagene公司生产)，0.5μl 10倍浓度的连接级缓冲液，0.5μl 10mM ATP，0.4μl T4连接酶，2μl纯水在4℃反应过夜。接着，由此得到的重组的λgt11 DNA应用包装试剂盒进行包装(由Stratagene公司生产，上市后商标标记为Gigapack II Gold”)。(F)肺炎衣原体特异的单克隆抗体的产生
骨髓瘤细胞株的培养和转化
用于产生单克隆抗体的骨髓瘤细胞株是p3/NSI/1-Ag 4-1(ATCCTIB-18)。它被培养在含10％(v/v)胎牛血清的RPMI 1640培养基中并进行后续的转移培养。在细胞融合之前2周，该细胞株在含0.13mM8-氮鸟嘌呤，0.5μg/ml支原体排毒剂(由Dainippon化学有限公司生产，上市产品编号“MC-210”)和10％(v/v)胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养一周，并接着在标准的培养基中培养一周。免疫小鼠
将二百(200)μl前述的蛋白浓度为270μg/ml的原体悬液在12000rpm离心10分钟。沉淀和加入其中的200μl PBS一起悬浮。加入100μl弗氏完全佐剂乳化悬液。150μl体积的一部分被皮下注射到小鼠的背部(实验的第0天)。在第14，34，和49天，蛋白浓度270μg/ml的纯化原体的悬液被以固定的100μl的剂量腹内注射到小鼠内。而且，在第69天，50μl蛋白浓度800μg/ml的纯化原体的悬液被腹内注射到小鼠中并在第92天类似地注射入100μl同样的悬液。在第95天，杀伤小鼠取脾脏，将其用于细胞融合。细胞融合
在一个圆底的玻璃试管中，108得自免疫小鼠的108脾细胞和107骨髓瘤细胞被彻底混合并于1400rpm离心5分钟。去掉上清并将得到的细胞进一步彻底混合。该细胞和0.4ml含30％(w/v)聚乙二醇并预先保存于37℃的RPMI培养基一起静置30秒钟。得到的混合物在700rpm-离心6分钟。含该混合物和新加入其中的10ml RPMI 1640培养基的玻璃管被缓慢转动以确保聚乙二醇的完全分散并于1400rpm离心5分钟。完全去掉上清。沉淀和5ml加入其中的HAT培养基一起静置5分钟。得到的混合物和加入其中的10-20ml HAT培养基一起静置30分钟并加入HAT培养基进行稀释直到骨髓瘤细胞的浓度达到3.3×105/ml以悬浮该细胞。用巴斯德吸管将悬液分散到96孔塑料培养板中，每孔2滴。将悬液于36℃在含5％(v/v)二氧化碳的空气中培养。在开始培养之后1天，7天和14天，向每个孔中加入1到2滴HAT培养基。产抗体细胞的筛选
将纯化的肺炎衣原体YK41株的原体用1％(w/v)SDS溶解，用含0.02％叠氮钠的0.05M的碳酸氢钠缓冲液(pH9.6)透析，稀释直至1-10μg/ml的蛋白浓度，并向氯乙烯的96孔EIA级板的每个孔中加入50μl，于4℃静置过夜以诱导抗原的吸附。去除上清。向每个孔中加入150μl含0.02(w/v)Tween 20的PBS并将板静置3分钟。去掉每个孔中的PBS并清洗干净。在将每个孔再做一次清洗处理之后，向每个孔中加入含1％(v/v)牛血清白蛋白的PBS并于4℃静置过夜以进行封闭。去掉每个孔中的含牛血清白蛋白的PBS，用含0.02％(w/v)Tween 20的PBS以上述同样的方式清洗2次，在加入50μl的融合细胞的培养上清之后，在室温放置2小时。用含0.02％(w/v)Tween 20的PBS以上面同样的方式清洗3次，在加入50μl过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体(25ng/ml)之后，在室温放置2小时。用含0.02％(w/v)Tween20的PBS以上面同样的方式将孔洗3次，并且在加入50μl ABTS溶液(由KPL公司生产)之后，在室温放置15分钟到1小时以诱导显色反应。通过96孔EIA板光度计测定各孔内容物在405nm的光吸收。
结果，检测到了阳性孔并发现这些孔中培养物(broth)的上清含有能与原体反应的抗体。用巴斯德吸管数次回收这些孔中的细胞，转移到24孔塑料培养板中，并于加入1-2ml HAT培养基之后，用上面同样的方式进行培养。通过有限稀释方法进行克隆
测试于24孔塑料培养板中繁殖的融合细胞的浓度并用HT培养基稀释以调整细胞数为20/ml。独立地，悬浮在HT培养基中的4-6周龄小鼠的胸腺细胞以2×105/孔分配到96孔塑料培养板的各孔中，并在50μl/孔加入前述的融合细胞(细胞浓度20/ml)之后，于含5％(v/v)二氧化碳气的空气中36℃培养。在开始培养之后的第1天，7天，和14天，1-2滴/孔向培养板中加入HT培养基。从观察到有繁殖的细胞的孔中，以每孔50μl的固定体积从培养物中回收上清并接着以上面同样的方式进行分析以确证抗体的产生。
在只存在一个细胞克隆的孔中，回收产生能与原体反应的抗体并可快速繁殖的细胞并于24孔塑料培养板中继续繁殖。重复同样的克隆方法直到最终得到杂交瘤AY6E2E8。单克隆抗体的产生
杂交瘤AY6E2E8被培养在75cm2的塑料细胞培养瓶中，其中带有20ml含10％(v/v)胎牛血清的RPMI 1640培养基。从培养瓶中形成的培养肉汤中，间隔3到4天回收16-18ml的样品。用含10％(v/v)胎牛血清的新鲜RPMI 1640培养基将残留的培养肉汤恢复到20ml的总体积。从而，对杂交瘤继续亚培养。从培养肉汤中回收的样品在1200rpm离心5分钟以回收上清(培养上清含单克隆抗体)。
对已于实验前2周接受了0.5ml姥鲛烷的腹内注射的Balb/c小鼠，以腹内注射1ml以1-5×106/ml浓度悬浮在PBS中的杂交瘤株。3周之后，从Balb/c小鼠回收腹水并于1200rpm离心5分钟以回收上清(腹水中含单克隆抗体)。单克隆抗体亚类的鉴定
用ISOTYPE Ab-STAT(由Sang Stat Medical公司生产)对单克隆抗体的亚类进行鉴定。结果，由杂交瘤AY6E2E8产生的单克隆抗体被鉴定为IgG2b。单克隆抗体的纯化
由杂交瘤AY6E2E8产生的单克隆抗体的纯化如下。1体积由小鼠腹内注射杂交瘤AY6E2E8得到的含单克隆抗体的腹水和3体积PBS的混合物于3000rpm离心10分钟。将得到的上清滤过0.22μm大小孔径的滤器。应用Chromatop Superprotein A Column(4.6mm直径×100mm，由NGK Insucators有限公司生产)通过HPLC纯化滤液。在处理之前用PBS平衡柱子。
1ml体积的从0.22μm滤器中流出的滤液的样品被注射到柱子中。首先以1ml/min的流速3分钟和接着以5ml/min的流速4分钟流过PBS以洗柱。通过从柱子的内部以2ml/min的流速流过8.77g NaCl，16.7g柠檬酸(单水合)，和14.72g Na2HPO4·12H2O于1升纯水中的溶液5分钟，吸附在柱子上的单克隆抗体被洗脱下来。收集脱吸附的单克隆抗体的级分并用TTBS溶液稀释。
溶解肺炎衣原体的原体以得到含在原体中的肽。将该肽和上述的单克隆抗体进行Western印迹以确定所得到的单克隆抗体的特异性。
结果，发现得到的单克隆抗体能够识别肺炎衣原体53kDa的抗原多肽。
以与杂交瘤AY6E2E8同样的方式得到了杂交瘤70。当用上述的同样方法测试由杂交瘤70所产生的单克隆抗体的特异性时，发现该单克隆抗体能识别肺炎衣原体73kDa的抗原多肽。
用上述鉴定亚类的同样方法对杂交瘤70产生的单克隆抗体进行检测时，发现该抗体的亚类是IgG。(G)克隆编码抗原多肽的DNA
一白金环大肠杆菌Y1090r-株被接种到含0.2％麦芽糖和50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(每升水中含5g NaCl，10g蛋白胨，和5g酵母提取物)并于37℃摇荡培养过夜。得到培养液于2,000rpm离心10分钟。沉淀(大肠杆菌)与9ml 10mM MgSO4水溶液混合。将0.35ml量的大肠杆菌悬液和加入其中的0.1到10μl λgt11(DNA文库)悬液于37℃培养20分钟以使λgt11感染大肠杆菌。上述的λgt11感染的大肠杆菌被加入2.5ml预先保温于47℃的液体LB琼脂培养基中，将得到的混合物分散到LB琼脂培养基中。在上层的培养基凝固之后，将整个培养基在42℃培养3到4小时。当看到噬菌斑之后，将预先浸在10mM IPTG水溶液中的硝酸纤维素滤膜(含直径82mm的滤孔)安放于上层琼脂培养基上。然后，将整个培养基于37℃培养12小时。用带有涂有黑墨水的喷头的吸头的注射器在滤膜上制3个不对称的点做为选择标记。然后，从琼脂培养基中取出带有黑墨水记号的滤膜并用20mM的含150mMNaCl和0.1％Tween 20的Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)洗3次(以后称为“TTBS缓冲液”)。剩下的琼脂培养基被保存于冰箱中。
将滤膜浸于带有0.1％牛血清白蛋白的20mM的含150mM NaCl的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)(以后称“TBS”缓冲液)的溶液中并于37℃摇动1小时以进行封闭作用。然后，将滤膜用TTBS缓冲液洗2次，浸于对肺炎衣原体特异的单克隆抗体的10μg/ml的TTBS溶液中，并在37℃摇荡1小时。将滤膜用TTBS缓冲液洗3次并接着于过氧化物酶标记的抗小鼠IgG抗体溶液(TTBS缓冲液，50ng/ml)中于37℃摇动1小时。滤膜用TTBS缓冲液和TBS缓冲液各洗3次，然后置于显色基底物质溶液中(由向100ml TBS缓冲液中加入60μl 30％的过氧化氢水溶液和0.3％的4-氯-1-萘酚的甲醇溶液而制得)，并在室温放置30分钟。当滤膜充分显色之后，从溶液中取出滤膜，用纯水洗涤，并空气干燥。
找出对应于滤膜上显色斑点的位置的琼脂培养基上形成的噬菌斑并进行鉴定。用巴斯德吸管刺琼脂的相应部分以回收噬菌斑。将回收的各个噬菌斑放入50mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中并于4℃放置过夜以从噬菌斑中回收λ噬菌体，其中Tris-HCl缓冲液含0.1M NaCl，8mM硫酸镁，和0.1％明胶(以后称为“SM缓冲液”)。重复上面刚刚描述的方法直至所有的噬菌斑与上面所述的单克隆抗体反应以得到其DNA编码该抗原多肽的克隆。
结果，得到了表达与肺炎衣原体特异的单克隆抗体反应的肺炎衣原体特异的抗原多肽的λ噬菌体并命名为53-3Sλ噬菌体。(H)53-3Sλ噬菌体的培养和DNA的纯化
根据上面(F)中所述的方法形成噬菌斑。回收其中一个噬菌斑，放于100μl SM缓冲液中，并于4℃置过夜以提取λ噬菌体。在将250μl大肠杆菌Y1090r-菌株培养过夜的LB培养基中，放入5～10μlλ噬菌体溶液并于37℃置20分钟以使λ噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种到50ml含10mM MgSO4并于37℃预保温的LB培养基中并于37℃摇荡培养5～7小时直至发生λ噬菌体对大肠杆菌的细菌裂解作用。得到的培养液在加入250μl氯仿后于3,000rpm离心10分钟以去除残留的大肠杆菌细胞并得到λ噬菌体的悬液。用特殊的装置纯化λ噬菌体DNA(由Promega公司生产并且市场上的商标是“WizardλPrepsKit”)。(I)扩增编码肺炎衣原体抗原多肽的DNA
向一600μl的微量离心管(microtube)中加入61.5μl纯水，10μl 10倍浓度的反应缓冲液(含500mM KCl，15mM MgCl2，和0.01％明胶的tris-HCl缓冲液，pH 8.3)，1μl 20mM dNTP，0.1μl 53-3Sλ噬菌体DNA溶液，1μl 20nMλgt11正向引物(由Takara Shuzo有限公司产)，1μl 20nMλgt11反向引物(由Takara Shuzo有限公司产)，和0.5μl AmpliTaq DNA聚合酶，和2或3滴矿物油以形成上层。微量离心管的内容物进行30个循环的温育，每一循环的组成如下：94℃30秒钟，55℃30秒钟，73℃2分钟以扩增DNA。反应之后，将反应液上1.2％的低熔点琼脂糖凝胶电泳以分离扩增的DNA。应用“Wizard PCR Prep Kit”(由Promega公司产)纯化扩增的DNA。(J)DNA碱基序列的分析
DNA碱基序列的分析如下：以PCR扩增的DNA作为模板应用TaqDNA聚合酶，根据荧光标记的终止子循环测序法将样品进行测序反应并用DNA测序仪分析反应产物(由Appliod Biosystem公司产的并在市场上的产品编号为“373A型”)。用基因序列分析软件(由Hitachi SoftwareEngineering有限公司生产并且市场上的商标是“DNASIS”)对得到的DNA碱基序列检测以评价凝集反应，连接反应，和氨基酸翻译区。结果，该序列被鉴定为SEQ ID No：9。
SEQ ID No：9序列分析的结果表明53kDa抗原多肽从N末端到C末端大约60％的氨基酸序列得到了阐释。
编码肺炎衣原体抗原多肽的DNA是对肺炎衣原体特异的并且通过利用识别53kDa抗原多肽的单克隆抗体而被克隆。因此，显而易见该DNA编码53kDa抗原多肽。
根据Genbank数据库对SEQ ID No：9的碱基序列和氨基酸序列同源性的检索证明不存在已知的有高度同源性的序列。实施例2：带有编码含部分肺炎衣原体的抗原多肽的肽的DNA的重组载体的制备，及携带该载体的转化子的制备
尽管如上所述所得到的DNA明显地编码53kDa抗原多肽，为了小心起见，将其如下所示进行表达以确定其是否可与上述的抗体反应。
质粒pBBK10MM被限制性酶BamHI和XhoI切割并进行1.2％低熔点琼脂糖凝胶电泳以分离约4.6kbp的DNA片段。纯化该片段。向SEQID No：11和SEQ ID No：12的合成的DNA各自加入1～100ng量的DNA片段并用DNA连接试剂盒进行连接(由Takara Shuzo有限公司产)。得到的反应产物被放入大肠杆菌HB101菌株感受态细胞(由Takara Shuzo有限公司产)以制备转化子并得到一个命名为pADA 431的质粒。该质粒被限制酶MunI切割并进行了碱性磷酸酶的反应以去除5’磷酸碱基。
独立地，53-3Sλ噬菌体被限制酶EcoRI切割。一百(100)ng上述的被限制酶MunI切割的DNA片段被加入50ng DNA片段并且如上述同样的方式被连接以制备转化子并得到了一个掺入了53-3Sλ噬菌体DNA的限制酶EcoRI片段的质粒，该质粒被命名为pCPN 533α。该质粒是一个约5.3kbp长的DNA，它具有SEQ ID No：10的碱基序列并能用大肠杆菌宿主表达含部分53K抗原多肽的肽。编码含部分53K抗原多肽的肽的DNA之碱基序列如SEQ ID No：4所示。从该碱基序列推导的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。一种携带质粒pCPN 533α的大肠杆菌被培养，电泳，转移到硝酸纤维素膜上，并以如上所述同样的方式用单克隆抗体检测。结果，形成了可见的对应于上述多肽的显色带。该事实表明携带质粒pCPN 533α的大肠杆菌表达可与与肺炎衣原体特异性反应的单克隆抗体反应的53K抗原多肽。实施例3：编码完整的肺炎衣原体的53kDa抗原多肽的DNA的获得
以SEQ ID No.9的碱基序列为基础应用DNA合成装置合成了具有SEQ ID Nos.26和27的碱基序列的DNA。
十(10)μl实施例1中得到的肺炎衣原体YK41菌体的基因组DNA的水溶液(DNA含量：约1μg)和5μl浓缩到原体积1/10的K缓冲液，35μl纯水和5μl加入到其中的限制性酶HindIII(19U/μl)被一起于37℃保持3小时。
得到的反应溶液用苯酚提取。提取物和加入至其中的乙醇一起离心以得到沉淀。该沉淀和5μl PCR体外克隆试剂盒中的HindIII盒式DNA(20ng/μl)(Takara Shuzo有限公司的专卖标记)和加入的15μl连接溶液被一起于10℃放置30分钟。
得到的反应液用苯酚提取。提取物和加入的乙醇一起被离心以得到沉淀。该沉淀被溶于10μl纯水中。
得到的溶液和78.5μl纯水，10μl浓缩到原体积之1/10的PCR缓冲液，8μl 2.5mM dNTP，和加入的0.5μl(5U/μl)Taq聚合酶和1μl具有SEQ ID No.26的碱基序列的DNA(20pmol/μl)和1μl进一步作为引物DNA加入的具有SEQ ID No.28的碱基序列的DNA(20pmol/μl)在前述的试剂盒中作为引物C1被一起放于0.6ml体积的微量离心管中，在微量离心管中得到的混合物上面加2滴矿物油。混合物进行30个温度循环，每个循环由94℃30秒，55℃2分钟和72℃3分钟组成。该方法以后称为“PCR操作”。
将一(1)μl从PCR操作中得到的反应溶液和加入其中做为引物DNA的1μl具SEQ ID No.27碱基序列的DNA(20pmol/μl)和1μl具SEQ ID No.29的碱基序列的DNA(20pmol/μl)(在前述的试剂盒中作为引物C2)进行PCR操作。
从第二次PCR操作中得到的反应液上1.2％低熔点琼脂糖凝胶电泳以分离含约1.4kbp大小DNA的琼脂糖凝胶。Wizard PCR prep kit(Promega公司)被用于纯化该DNA。将分离的琼脂糖凝胶和试剂盒中所带的缓冲液一起加热以溶解琼脂糖凝胶。将试剂盒中所带的纯化树脂加入到所得到的溶液中以吸附DNA。将得到的混合物离心以得到作为沉淀的纯化树脂。将沉淀用丙醇漂洗，再离心得到沉淀。向沉淀中加入纯水以将DNA从纯化树脂中溶解出来。将得到的混合物离心以得到上清(DNA水溶液)。上面描述的操作以后将称为“DNA纯化操作”。
将得到的DNA水溶液进行测序反应，以所含的DNA为模板应用TaqDNA聚合酶通过荧光标记的终止子测序方法进行并用373A型DNA测序仪(Applied Biosystems公司)分析DNA的碱基序列。由基因序列分析的软件(由Hitachi Software Engineering有限公司产并且上市商标为“DNASIS”)对由此得到的DNA碱基序列进行排序和连接以估计氨基酸翻译区。刚刚描述的操作以后将称为“碱基序列分析操作”。
当分析所得到的DNA的碱基序列时，发现该DNA含有编码实施例1中得到的编码肺炎衣原体的抗原多肽的DNA 3’末端约50bp的碱基序列。而且发现在该碱基序列的下游存在一个带终止密码子的约0.7kb的编码区。
通过数次使用DNA合成仪以SEQ ID No.31的碱基序列为基础合成了作为对应于编码肺炎衣原体的抗原多肽的DNA的上游部分的引物的DNA，它具有SEQ ID No.30的碱基序列；并以含前述的约0.7kb的编码区的碱基序列为基础合成了作为对应于编码肺炎衣原体的抗原多肽的DNA的下游部分的引物。
以1μl具有SEQ ID No.30的碱基序列的DNA和1μl具有SEQID No.31的碱基序列的DNA为引物，应用1μl实施例1中得到的肺炎衣原体YK41菌株的基因组DNA的水溶液进行PCR操作。
对从第三次PCR操作中得到的反应液进行上述的DNA纯化操作以获取约1.5kbp的DNA。
对所得到的DNA水溶液进行如上所述的碱基序列分析操作。
当分析得到的DNA之碱基序列时，发现该DNA具有SEQ ID No.3的碱基序列并编码SEQ ID No.2的氨基酸序列。
由对质粒pCPN 533α和λgt11 DNA文库进行基因组步行得到了编码完整的53kDa肺炎衣原体抗原多肽的DNA。实施例4：带有编码完整的53kDa肺炎衣原体抗原多肽的DNA的重组载体的制备和携带该载体的转化子的制备
带有编码整个53kDa肺炎衣原体抗原多肽的DNA的重组载体和携带该载体的转化子的制备如下。
可应用编码整个53kDa肺炎衣原体抗原多肽的DNA根据实施例2的方法制备带有编码完整的53kDa肺炎衣原体抗原多肽的DNA之重组载体和携带该载体的转化子。实施例5：制备编码肺炎衣原体73K抗原多肽的DNA
用获得杂交瘤AY6E2E8同样的方法得到了杂交瘤70。用杂交瘤70得到了小鼠腹水。分析腹水的上清以定量其所含的单克隆抗体。分析结果表明该单克隆抗体对肺炎衣原体73kDa的抗原多肽是特异的。
用单克隆抗体70代替单克隆抗体SCP53或AY6E2E8根据实施例1的方法得到了70-2Sλ噬菌体克隆。从该噬菌体中得到了SEQ IDNo：13的序列。
SEQ ID No：13序列分析的结果清楚地表明肺炎衣原体73K抗原蛋白从N末端到C末端大约90％的氨基酸序列得到了证实。
根据Genbank数据库对碱基序列和SEQ ID No：13的氨基酸序列的同源性进行了检索。检索结果清楚地表明这些序列与分离自砂眼衣原体的序列有高度的同源性[L.M.Sardinia等，细菌学杂志，Vol.17.，335-341(1989)]。实施例6：用肺炎衣原体的抗原多肽作为抗原产生抗肺炎衣原体的抗体
如下可用肺炎衣原体的抗原多肽产生抗肺炎衣原体的抗体。(A)骨髓瘤细胞株的培养和传代
于含10％(v/v)胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养和传代骨髓瘤细胞株，p3X63Ag 8.653(ATCC CRL-1580)。在将该细胞株用于细胞融合之前，将该细胞株于含0.13mM 8-氮鸟嘌呤，0.5μg/ml支原体清除剂(由Dainippon制药有限公司产且市场上产品编号“MC-210”)和10％(v/v)胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养一周。接下来一周在普通培养基中进行培养。(B)免疫小鼠
将200μl上述的蛋白浓度为270μg/ml的抗原多肽的溶液加入200μl完全弗氏佐剂进行乳化。将产生的乳液以l50μl的量皮下注射到小鼠的背上(注射的日期作为第0天)。在第14天，34天，和49天，100μl蛋白浓度为270μg/ml的抗原多肽的悬液被腹内注射到小鼠中。而且，在第69天，50μl蛋白浓度为800μg/ml的同样的抗原多肽的悬液被腹内注射到小鼠中并且在第92天，100μl同样的悬液被腹内注射给小鼠。在第95天杀死小鼠以取出脾脏。该脾脏被用于细胞融合。(C)细胞融合
在一圆底玻璃管中，108得自上述的脾脏的脾细胞和107骨髓瘤细胞被彻底混合。将得到的混合物于1,400rpm离心5分钟，并去除形成的上清，进一步彻底混合。向得到的混合物中加入0.4ml含30％(w/v)聚乙二醇的于37℃预保温的RPMI 1640培养基并静置30秒钟。将含混合物的培养基在700rpm离心6分钟。在加入10ml RPMI 1640培养基之后，该玻璃管被轻轻摇动以将聚乙二醇彻底混合。然后将混合物在1,400rpm离心5分钟。完全去掉由此形成的上清。沉淀和6ml加入的HAT培养基被静置5分钟。将得到的混合物和加入的10到20ml HAT培养基静置30分钟。进一步加入HAT培养基，其量可使骨髓瘤细胞的浓度达到3.3×105/ml以得到细胞悬液。用巴斯德吸管每孔2滴将此悬液分配到96孔塑料培养板的孔中。该悬液于36℃在5％(v/v)二氧化碳气的空气中培养。然后，在1天，7天，和14天之后向每个孔中加入1或2滴HAT培养基。(D)产抗体细胞的筛选
上述的抗原多肽被悬浮在含0.02％(w/v)叠氮钠的0.05M碳酸氢钠悬液(pH9.6)中，以使蛋白浓度为1到10μg/ml。将得到的悬液对含0.02％叠氮化钠的0.05M碳酸氢钠缓冲液(pH9.6)进行透析。将透析产物(dialyzate)进行稀释以使蛋白浓度为1到10μg/ml。将稀释后的透析产物以50μl/每孔分装到EIA用的氯乙烯96孔板中并于4℃置过夜以吸附抗原。从各孔中去掉得到的上清。向每个孔中加入150μl含0.02％(w/v)Tween 20的PBS并放置3分钟，然后去掉该PBS，并洗各孔。再重复洗一次。向孔中加入100μl含1％(v/v)牛血清白蛋白的PBS并于4℃置过夜以进行封闭。去除含牛血清白蛋白的PBS并用上面描述的相同方式用含0.02％(w/v)Tween 20的PBS洗2次。然后，向每个孔中加入50μl融合细胞的培养上清并于室温置2小时。用上述的同样的方式用含0.02％(w/v)Tween 20的PBS将孔洗3次。在孔中，放入了50μl过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体(25ng/ml)并将其置于室温下。以上述同样的方式用含0.02％(w/v)Tween 20的PBS将孔洗3次。在孔中，放入50μl ABTS溶液(由KPL公司生产)并在室温放置15分钟～1小时以进行显色反应。用96孔EIA板适用的光度计测定孔中的培养液在405nm的吸光值。用巴斯德吸管分部从阳性孔中回收细胞，将其转入到24孔塑料培养板中，并且在加入1到2ml HAT培养基之后，以上述同样的方式进行培养。(E)通过限制性稀释方法进行克隆
对繁殖在24孔塑料培养板中的两株融合细胞的细胞浓度进行了测试并用HT培养基进行多数稀释直到细胞数减少至20/ml。独立地悬浮在HT培养基中的4到6周龄的小鼠的胸腺细胞被以1到2×105/孔分配到96孔塑料培养板中并且上述的融合细胞(细胞浓度20/ml)被以50μl/孔分配到同一培养板中并于36℃下在含5％(v/v)二氧化碳气的空气中培养。培养1天，7天，和14天之后，每孔1到2滴加入HT培养基。从每个观察到细胞生长的孔中，定量回收50μl培养上清。以标题为“产抗体细胞的筛选”的(D)中同样的方式分析上清以确证抗体的产生。
从相关的孔中回收可在孔中形成单细胞集落，产生能与原体反应的，并可快速增殖的细胞并接着在24孔塑料培养板中进行增殖。而且，通过重复上述的同样的克隆操作可得到产抗肺炎衣原体抗体的杂交瘤。培养该杂交瘤并在得到的培养上清中得到了抗肺炎衣原体抗体。实施例7：用抗原多肽作为抗原对抗肺炎衣原体抗体的检测和测定
可如下所述用本发明的抗原多肽作为抗原对抗肺炎衣原体的抗体进行检测和测定。
由SEQ ID No：1的氨基酸序列形成的多肽被用作抗原多肽。它被固定在微量滴定板上，加入含牛血清白蛋白的PBS，并于4℃置过夜以进行封闭。去除含牛血清白蛋白的PBS并且用含0.02％(w/v)Tween20的PBS将孔洗2次。将来自病人的血清加入到孔中并于室温放置2小时。去除得到的溶液并以上述同样的方式用含0.02％(w/v)Tween20的PBS将孔洗3次。在每个孔中，放入过氧化物酶标记的鼠抗人IgG抗体并于室温放置2小时。弃去孔中的溶液并以上述相同的方式用含0.02％(w/v)Tween 20的PBS将孔洗3次。在每个孔中放入ABTS溶液(由KPL公司产)并于室温放置15分钟到1小时以进行显色反应。然后以96孔EIA板用的光度计测定溶液在405nm的光吸收值。实施例8：产生携带编码包含DHFR和部分肺炎衣原体的抗原多肽的融合蛋白的DNA的重组载体以及产生带有该重组载体的转化子
质粒pBBK10MM被限制酶BamHI和XhoI切割并进行1.2％低熔点琼脂糖凝胶电泳以分离约4.6kbp的DNA片段。该片段是被纯化的。
独立地，将53-3Sλ噬菌体DNA用限制性酶EcoRI切割以得到同样的纯化形式的约1.0kbp的DNA片段。该DNA片段被进一步用限制酶AvaII切割以得到同样纯化形式的约0.8kbp的DNA片段。上述的100ng量的约4.6kbp的DNA片段，100ng约0.8kbp的DNA片段，和各1ngSEQ ID Nos：21～24的合成的DNA被加入到其中以通过DNA连接试剂盒(由Takara Shuzo有限公司产)以进行连接。反应产物被放于大肠杆菌HB101菌株感受态细胞中(由Takara Shuzo有限公司产)以产生转化子。
该转化子被涂布于含50mg/L氨苄青霉素的琼脂培养基上并于37℃培养24小时。由此得到的大肠杆菌菌落被接种到3ml含50mg/L氨苄青霉素的LB培养基中并于37℃摇动培养过夜。从培养基中通过碱性裂解法分离得到的质粒载体，被限制性酶NruI切割，并通过0.8％琼脂糖凝胶电泳进行分析以选择带有已产生了616bp和4822bp DNA片段的重组质粒载体的大肠杆菌。由此得到的该重组质粒载体被命名为pCPN533T。该质粒载体是一个长约5.4kbp具有SEQ ID No：25的碱基序列的DNA。它能够表达融合蛋白，该融合蛋白包含与部分肺炎衣原体53kDa抗原多肽连接的DHFR的C末端。编码该融合蛋白的DNA的碱基序列被示于SEQ ID No：18中。由该碱基序列推导而来的氨基酸序列如SEQ ID No：16所示。实施例9：含DHFR和部分53kDa肺炎衣原体抗原多肽的多肽的融合蛋白的识别
一满白金环带质粒pCPN 533T的大肠杆菌HB101菌株被菌株接种到3ml含50mg/L的氨苄青霉素的LB培养基中并于37℃摇荡过夜。将10μl量的含大肠杆菌的培养基和加入的10μl上样缓冲液(含0.01％的溴酚兰，10％巯基乙醇，20％甘油，和5％SDS的0.156M的tris-HCl缓冲液，pH6.8)于80℃加热5分钟。该得到的反应溶液上5-20％的聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳。将下面物质依次迭放在半干式印迹装置的阳极板上：一张用0.3M含10％甲醇和0.05％十二烷基磺酸钠的tris水溶液浸湿的滤纸；一张用含10％甲醇和0.05％十二烷基磺酸钠的25mMtris水溶液浸湿的滤纸；一张用含10％甲醇和0.05％十二烷基磺酸钠的25mM tris水溶液浸湿的滤纸，一张用25mM含10％甲醇和0.05％十二烷基磺酸钠和40mM氨基乙酸tris水溶液浸湿的硝酸纤维素膜，如前述完全电泳的聚丙烯酰胺凝胶和两张用25mM含40mM氨酸己酸的tris水溶液浸湿的滤纸。在迭放的滤纸上面阳极板的相对位置放置阴极板并以2.5mA/cm2的电流密度接通电流一小时以将聚丙烯酰胺上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上。将硝酸纤维素膜放在含0.1％牛血清白蛋白的TBS缓冲液中并于室温放置不少于1小时以进行封闭。用TTBS缓冲液将硝酸纤维素膜洗2次并接着在杂交瘤SCP53产生的单克隆抗体溶液(在5到10μg/ml TTBS缓冲液)于37℃摇动1小时。将硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液洗3次，并且然后在用过氧化物酶标记的抗小鼠IgG抗体水溶液中(于50ng/ml TTBS缓冲液中)于37℃摇动1小时。将硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液洗3次，并且然后在用过氧化物酶标记的抗小鼠IgG抗体水溶液中(于50ng/ml TTBS缓冲液中)于37℃摇动1小时。将硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液洗3次并接着将其放入显色基底物质溶液中(通过将100ml带有60μl的30％过氧化氢水溶液的TBS缓冲液，和20ml 4-氯-1-萘酚的甲醇溶液混合而得到)并于室温放置反应30分钟。取出硝酸纤维素膜，用纯水洗，并接着空气干燥。结果，在对应于融合蛋白的大小的位置观察到了显色带。该事实表明带有质粒pCPN 533T的大肠杆菌表达了含有能与与肺炎衣原体特异性反应的单克隆抗体反应的53kDa抗原的融合蛋白。实施例10：编码整个53kDa肺炎衣原体抗原多肽的DNA的获取
编码肺炎衣原体整个53kDa抗原多肽的DNA已在实施例3中得到了。但是，可如下另外得到该DNA。
编码肺炎衣原体整个53kDa抗原多肽的DNA也可由应用质粒pCPN533T和λgtll DNA文库的基因步行而得到。当分析这些DNA的碱基序列时，可发现它具有SEQ ID No：17 484位到1947位的碱基序列并且可编码SEQ ID No：15 162位到649位的氨基序列。实施例11：产生携带编码DHFR和肺炎衣原体整个53kDa抗原多肽的融合蛋白的重组载体和产生含该重组载体的转化子
可按如下制备携带编码DHFR和肺炎衣原体整个53kDa抗原多肽的融合蛋白的重组载体和含该重组载体的转化子。
应用上述编码质粒pBBK10MM的和肺炎衣原体整个53kDa抗原多肽的DNA根据实施例8的方法制备包含编码DHFR和肺炎衣原体整个53kDa抗原多肽的融合蛋白的DNA的重组载体和带有该重组载体的转化子。编码融合蛋白的DNA之碱基序列如SEQ ID No：17所示并且由该碱基序列推导的氨基酸序列如SEQ ID No：15所示。实施例12：用融合蛋白为抗原产生抗肺炎衣原体之抗体
可按如下用本发明的融合蛋白为抗原产生抗肺炎衣原体的抗体。
根据实施例6的方法应用上述的融合蛋白为抗原进行免疫而获得了产抗肺炎衣原体抗体的杂交瘤。培养该杂交瘤并且由此在形成的培养上清中产生了抗肺炎衣原体的抗体。实施例13：用融合蛋白为抗原检测和确定抗肺炎衣原体的抗体
按如下用本发明的融合蛋白为抗原检测和测定抗肺炎衣原体。
由SEQ ID No：15的氨基酸序列形成的多肽被用做融合蛋白。将其固定在微量滴定板上，加入含牛血清白蛋白的PBS，并于4℃置过夜以进行封闭。弃去含牛血清白蛋白的PBS并用含0.02％(w/v)Tween20的PBS将板洗2次。将来自患者的血清加入到各孔中并于室温置2小时。以上述同样的方式以含0.02％(w/v)Tween 20的PBS将孔洗3次。在每个孔中，放入过氧化物酶标记的小鼠抗人IgG抗体并在室温置2小时。以上述同样的方式用含0.02％(w/v)Tween 20的PBS将孔中的培养液洗3次。在孔中放入ABTS溶液(由KPL公司产)并在室温放置15～1小时以进行显色反应。然后应用96孔EIA板适用的光度计测定培养液在405nm的光吸收。实施例14：用PCR方法检测肺炎衣原体基因
由SEQ ID No：19的碱基序列组成的DNA和SEQ ID No：20的碱基序列组成的DNA可由Applied Biosystems公司生产的DNA合成装置化学合成并分别被命名为引物53F2和引物53R2。
离心回收被肺炎衣原体YK41株或肺炎衣原体L2株或鹦鹉热衣原体Bugd.17-SL株感染的细胞。向细胞加入0.1ml 50mM tris-HCl缓冲液(pH8.3)并于56℃保温1小时并接着在95℃加热10分钟以灭活蛋白酶K和得到含相关衣原体基因的样品，其中tris-HCl缓冲液含有50mM KCl，2.5mM MgCl2，0.1mg/ml明胶，0.45％Nonidet p40，0.45％ Tween 20，和0.1mg/ml蛋白酶K。
将一(1)μl样品与如下物质组合：78.5μl纯水，8μl 2.5mMdNTP水溶液，10μl含500mM KCl和15mM MgCl2的100mMtris-HCl缓冲液(pH8.3)，1μl上述30μM引物53F2和引物53R2的水溶液，和0.5μl 5U/μl的Taq聚合酶。将得到的混合物上放置50μl矿物油并进行30个循环，每个循环包括：94℃30秒加热，和60℃30秒，72℃60秒以冷却和保温。
在反应结束之后，将2μl反应液上琼脂糖凝胶电泳，将凝胶浸于0.5μ/ml溴化乙锭中并用紫外线照射以显示DNA带。
结果，从肺炎衣原体YK41株得到的样品中看到了约360bp大小的可见的DNA带，该带对应于在SEQ ID No：3所有碱基序列中插在引物53F2碱基序列和与引物53R2碱基序列互补的碱基序列之间。从其它株得到的株没有发现可见的DNA带。工业实用性
由含SEQ ID No：1多肽中至少5个连续的氨基酸序列多肽A形成的本发明的抗原多肽可被用于检验抗肺炎衣原体的抗体。
本发明的抗原多肽即多肽A是从SEQ ID No：1的多肽中丢失了1到250氨基酸而得到的，它具有较小长度的氨基酸序列，从而可增加固定在承载体(carrier)上的抗原多肽的数目。因此，它可被用于产生有更高敏感性的诊断剂。
本发明的抗原多肽由通过用其它的氨基酸取代SEQ ID No：1多肽的1到100个氨基酸而得到的多肽A，它可形成对蛋白酶的降解较少敏感结构，从而是在作抗原时有很好的稳定性。
本发明的抗原多肽即多肽A，它是具有与SEQ ID No：1的至少5个连续的氨基酸序列连接的一个氨基酸或2～1000个氨基酸的多肽，它可通过利用该氨基酸或2到1000氨基酸序列而被固定到承载体上，从而固定不容易降低或丧失抗原性。
本发明的抗原多肽即多肽A是由具有对肺炎衣原体特异的整个抗原多肽的SEQ ID No：1的氨基酸序列形成的，从而，它特别适合检验包含肺炎衣原体的抗原和对其感染的准确诊断。
本发明的抗原多肽即多肽A是由具有对肺炎衣原体特异的部分抗原多肽的SEQ ID No：2或ID No：5的氨基酸序列形成的，从而，它特别适合检验包含肺炎衣原体的抗原和对其感染的准确诊断。
本发明的编码上述任意的抗原多肽的DNA或与其互补的DNA可被用于产生抗原多肽，该抗原多肽适于检测肺炎衣原体抗原，诊断肺炎衣原体感染等。
本发明的其碱基序列为SEQ ID No：3的编码对肺炎衣原体整个抗原多肽的碱基序列的DNA可被用于产生适于检验肺炎衣原体特异抗体的抗原多肽。
本发明的其碱基序列为SEQ ID No：4或ID No：7的编码肺炎衣原体特异抗原部分的碱基序列的DNA可被用于产生适于检验肺炎衣原体特异抗原的抗原多肽。
本发明的包含任何上述的DNA的重组载体可被用于产生适于检验肺炎衣原体的抗体及诊断包括肺炎衣原体的感染的抗原多肽。
本发明的其为具有SEQ ID No：10的碱基序列的pCPN 533α质粒的重组载体能表达具肺炎衣原体特异的抗原部分的多肽，因此，它可被用于产生特别适于检验肺炎衣原体特异的抗体的抗原多肽。
本发明的包含上述之任一重组载体的转化子可用于生产适合检测肺炎衣原体特异的抗体的抗原多肽。
本发明的产生抗肺炎衣原体抗体的方法，其特征在于作为抗原的上述的任意的抗原多肽可被用于产生肺炎衣原体感染的诊断剂。
本发明的检测和确定抗肺炎衣原体的抗体的方法，其特征在于作为抗原的任意上述的抗原多肽可被用于检验肺炎衣原体的抗体以及诊断肺炎衣原体的感染。
特别是当利用具有长度较小的氨基酸序列的抗原多肽时，由于它可增加固定于承载物上的抗原多肽的数目，它大大提高了敏感性。
当具有固有的被其它的氨基酸取代的氨基酸的抗原多肽被用于如上所述的检测和确定时，检测和确定的结果是高度可靠的，因为抗原多肽可形成对蛋白酶的降解很少敏感性的结构，由此，它是很稳定的。
当加入了其它氨基酸序列的抗原多肽被用于诊断肺炎衣原体感染时，它可很理想地起到其作用，因为它使作为抗原的多肽通过数个或2～1000个氨基酸序列固定在载体上并且很少发生由于固定而引起的抗原性的降低或丧失。
当由SEQ ID No：1的氨基酸序列形成的抗原多肽被用于肺炎衣原体抗体的检测或其感染的诊断时，它满足检验或诊断的高度准确性，因为用作抗原的多肽具有肺炎衣原体特异的整个抗原多肽。
当由SEQ ID No：2或ID No：5的氨基酸序列被用于检验肺炎衣原体抗体或诊断其感染时，它满足了检验或诊断的高度准确性，因为用作抗原的多肽具有肺炎衣原体特异的抗原部分。
含有作为抗原的任意上述的抗原多肽的本发明的检测和确定抗肺炎衣原体抗体的试剂，很适于对肺炎衣原体抗体的检验和肺炎衣原体感染的诊断。
特别是，当具有较小长度氨基酸序列的抗原多肽被用作试剂时，由于它可增加固定于承载体上的抗原多肽的数目，该试剂有高度的敏感性。
当具有固定的由其它的氨基酸取代的抗原多肽被用于上述的检测和确定时，检测和确定结果是高度可靠的，因为抗原多肽能够形成对蛋白酶降解较少敏感的结构，结果，有很好的稳定性。
而且，当增加了其它氨基酸序列的抗原多肽被用于诊断肺炎衣原体感染时，它可很理想地发挥其作用，这是因为它可使作为抗原的多肽通过利用数个氨基酸或2到1000氨基酸序列被固定到承载体上并且很少发生由固定而引起的抗原性的降低或丧失。
然后，当由SEQ ID No：1的氨基酸序列形成的抗原多肽被用于检验肺炎衣原体抗体或诊断其感染时，它可满足检验或诊断的很高的准确性，因为作为抗原的多肽具有肺炎衣原体特异的整个抗原多肽。
当由SEQ ID No：2或ID No：5的氨基酸序列形成的抗原多肽被用作检验抗体或用于诊断肺炎衣原体感染时，它可使检验或诊断有很高的准确性，这是因为用作抗原的多肽具有对肺炎衣原体特异的抗原部分。
本发明的含有任意上述的抗原多肽作为活性成分的诊断剂可很理想地适于对肺炎衣原体感染的诊断。
具体地说，当具有较短氨基酸序列的抗原多肽被用作药物时，该药剂具有很高的敏感性，这是因为它可使被固定于载体上的抗原多肽的数目得到增加。
当固有的氨基酸序列被其它的氨基酸取代的抗原多肽被用于如上所述的检测和确定时，检验和确定的结果是高度可靠的，这是由于该抗原多肽可形成对蛋白酶的降解较不敏感的结构，结果，有很好的稳定性。
而且，当增加了其它的氨基酸序列的抗原多肽被用于诊断肺炎衣原体感染时，它可很理想地起到其作用，因为它可以使作为抗原的多肽通过数个氨基酸或2到1000氨基酸序列固定于载体上并且很少发生由于固定作用而引起的抗原性的降低或丧失。
然后，当由SEQ ID No：1的氨基酸序列形成的抗原多肽被用于检验抗体或肺炎衣原体感染的诊断时，它满足了检验或诊断很高的准确性，这是由于用作抗原的多肽具有对肺炎衣原体特异的完整的抗原多肽。
当由SEQ ID No：2或ID No：5的氨基酸序列形成的抗原多肽被用于检验抗体或肺炎衣原体感染的诊断时，它满足了使检验或诊断有很高的准确性，这是因为用作抗原的多肽具有时肺炎衣原体特异的抗原部分。
本发明的直接或通过含SEQ ID No：1多肽中至少5个连续的氨基酸序列的多肽A的氨基酸序列的介导与SEQ ID No：14的多肽连接的融合蛋白可被用作肺炎衣原体的检验抗体。
本发明的融合蛋白，即由SEQ ID No：1多肽丢失1到250氨基酸形成的多肽A具有较短长度的氨基酸序列，从而可以增加固定于承载体上的抗原肽的数目。因此，它可被用于生产有高度敏感性的诊断剂。
本发明的融合蛋白多肽A，即由其它的氨基酸的取代SEQ IDNo：1多肽中的1到100氨基酸而得到的多肽能形成对蛋白酶的降解较少敏感的结构，从而，作为抗原有很好的稳定性。
本发明的其为由SEQ ID No：15的氨基酸序列形成的多肽的融合蛋白极适于作检验抗体和作肺炎衣原体感染的诊断，这是由于它具有对肺炎衣原体特异的完整的抗原多肽。
本发明的其为由SEQ ID No：16的氨基酸序列形成的多肽的融合蛋白很适于作检验抗体和用于肺炎衣原体感染的诊断，这是因为它具有对肺炎衣原体特异的抗原部分。
作为编码上述任意的融合蛋白的DNA或与其互补的DNA的本发明的DNA可被用于产生适于检验肺炎衣原体抗体的融合蛋白，诊断肺炎衣原体感染等的融合蛋白。
其碱基序列为SEQ ID No：17的碱基序列的本发明的DNA可被用于产生适于用作肺炎衣原体特异抗体的检验的融合蛋白，这是由于该DNA编码的融合蛋白具有对肺炎衣原体特异的整个抗原多肽。
其碱基序列为SEQ ID No：18的碱基序列的本发明的DNA可被用于产生适于用作肺炎衣原体特异的检验抗体的融合蛋白，这是因为由该DNA编码的融合蛋白具有肺炎衣原体特异的抗原部分。
携带任意上述的DNA的本发明的重组载体可被用于产生融合蛋白，该融合蛋白适于作肺炎衣原体抗体的检验和用于诊断肺炎衣原体的感染。
本发明的pCPN 533T质粒重组载体可用于生产高度适合对肺炎衣原体特异的抗体检测的融合蛋白，因为它能表达具肺炎衣原体特异的抗原部分的融合蛋白。
含有上述的任意的重组载体的本发明的转化子可被用产生适于作肺炎衣原体特异抗体的检验的融合蛋白。
本发明的产生抗肺炎衣原体抗体的方法可被用于产生肺炎衣原体感染的诊断剂，其中抗体的特征在于用上述的任意的融合蛋白作为抗原。
本发明的检测和确定抗肺炎衣原体抗体的方法适于对肺炎衣原体抗体的检验和肺炎衣原体感染的诊断，其抗体特征在于用上述任意的融合蛋白作抗原。
具体地说，当具有短的氨基酸序列的融合蛋白被用于该方法时，该方法有高度的敏感性，这是由于该融合蛋白可使固定于承载体上的抗原多肽的数目得到增加。
当其固有的氨基酸序列被其它的氨基酸取代的融合蛋白被用于上述的检测和确定时检验和确定的结果是高度可靠的，这是由于该融合蛋白能形成对蛋白酶降低较少敏感的结构，结果是，有很好的稳定性。
由SEQ ID No：15的氨基酸序列组成的融合蛋白很适于作检验抗体和肺炎衣原体感染的诊断，这是因为作为抗原的融合蛋白具有肺炎衣原体特异的整个抗原多肽。
由SEQ ID No：16的氨基酸序列组成的融合蛋白很适于作检验抗体和肺炎衣原体感染的诊断，这是因为作为抗原的融合蛋白具有肺炎衣原体特异的抗原部分。
含任意上述的融合蛋白作为抗原的本发明的试剂适于作肺炎衣原体抗体的检验和肺炎衣原体感染的诊断。
具体地说，当具有短的氨基酸序列的融合蛋白被用作试剂时，该试剂有高度的敏感性，这是因为它可使固定于承载体上的抗原多肽的数目得以增加。
当其固有的氨基酸被其它的氨基酸取代的融合蛋白被用于上述的检测和确定时，检测和确定的结果是高度可靠的，这是因为该融合蛋白能形成对蛋白酶降解较少敏感的结构，结果是，有很好的稳定性。
由SEQ ID No：15的氨基酸序列形成的融合蛋白很适于作抗体的检验和肺炎衣原体的诊断，这是由于作为抗原的融合蛋白具有对肺炎衣原体特异的整个抗原多肽。
由SEQ ID No：16的氨基酸序列形成的融合蛋白很适于作抗体的检验和肺炎衣原体感染的诊断，这是由于作为抗原的融合蛋白具有对肺炎衣原体特异的抗原部分。
含有上述任意的融合蛋白作为其活性组分的本发明的诊断药物适于作肺炎衣原体的抗体的检验和肺炎衣原体感染的诊断。
具体地说，当具有短的氨基酸序列的融合蛋白被用作药剂时，该药剂有高度的敏感性，因为它可以使固定于承载体上的抗原多肽的数目得到增加。
当其固有的氨基酸序列被其它的氨基酸序列取代的融合蛋白被用于上述的检测和确定时，检验和确定的结果是十分可靠的，这是因为该融合蛋白能形成对蛋白酶降解较少敏感的结构，结果是，有很好的稳定性。
由SEQ ID No：15的氨基酸序列形成的融合蛋白很适于抗体作的检验和肺炎衣原体感染诊断，这是因为作为抗原的融合蛋白具有对肺炎衣原体特异的整个抗原多肽。
由SEQ ID No：16的氨基酸序列形成的融合蛋白很适于作抗体的检验和肺炎衣原体感染的诊断，这是因为用作抗原的融合蛋白具有对肺炎衣原体特异的抗原部分。
本发明的探针和引物适于检测和确定肺炎衣原体基因和诊断肺炎衣原体感染。
具体说，具有SEQ ID No：19或ID No：20的碱基序列的探针和引物可被用于肺炎衣原体感染的准确诊断，因为它们具有肺炎衣原体特异的碱基序列。
本发明的利用上述任意的探针或引物检测和确定肺炎衣原体基因的方法可适于对肺炎衣原体感染作诊断。
含上述任意的探针或引物的用于肺炎衣原体检测和确定的本发明的试剂特别适于诊断肺炎衣原体感染。
含上述作为活性成分任意的探针或引物的本发明的诊断剂特别适于诊断肺炎衣原体感染。序列表SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征：
(A)长度：488氨基酸
(B)类型：氨基酸(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Met Ser Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gln Lys Asn Ile Met1           5                      10                 15Ser Gln Val Leu Thr Ser Thr Pro Gln Gly Val Pro Gln Gln Asp Lys
         20                  25                  30Leu Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gln Ile Gln Gln Thr Arg Gln Gly Lys
     35                  40                  45Asn Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr Ile Ala Gly Ala Ser Gly Lys
 50                  55                  60Asp Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gln Gln Gly65                  70                  75                  80Val Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gln Lys Ala Gly Ala Asp
             85                  90                  95Thr Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala Thr
        100                 105                 110Lys Ile Ala Met Gln Thr Ser Ile Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met Glu
    115                 120                 125Ser Thr Leu Glu Ser Leu Gln Ser Leu Ser Ala Ala Gln Met Lys Glu
130                 135                 140Val Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly Ser145                 150                 155                 160Ala Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro Arg
            165                 170                 175Ser Glu Val Ile Glu Ile Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala Ile Gln Thr
        180                 185                 190Leu Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr Gln
    195                 200                 205Ala Gln Ala Asp Gln Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gln Ala Ile
210                 215                 220Lys Ile Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gln Glu Met Lys Ala Ala Glu225                 230                 235                 240Gln Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr Val
            245                 250                 255Met Ile Ala Val Ser Val Ala Ile Thr Val Ile Ser Ile Val Ala Ala
                260         265                 270Ile Phe Thr Cys Gly Ala Gly Leu Ala Gly Leu Ala Ala Gly Ala Ala
    275                 280                 285Val Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Thr
290                 295                 300Thr Val Ala Thr Gln Ile Thr Val Gln Ala Val Val Gln Ala Val Lys305                 310                315                 320Gln Ala Val Ile Thr Ala Val Arg Gln Ala Ile Thr Ala Ala Ile Lys
            325                 330                 335Ala Ala Val Lys Ser Gly Ile Lys Ala Phe Ile Lys Thr Leu Val Lys
        340                 345                 350Ala Ile Ala Lys Ala Ile Ser Lys Gly Ile Ser Lys Val Phe Ala Lys
    355                 360                 365Gly Thr Gln Met Ile Ala Lys Asn Phe Pro Lys Leu Ser Lys Val Ile
370                 375                 380Ser Ser Leu Thr Ser Lys Trp Val Thr Val Gly Val Gly Val Val Val385                 390                 395                 400Ala Ala Pro Ala Leu Gly Lys Gly Ile Met Gln Met Gln Leu Ser Glu
            405                 410                 415Met Gln Gln Asn Val Ala Gln Phe Gln Lys Glu Val Gly Lys Leu Gln
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450                 455                 460Lys Ala Thr Lys Leu Gly Ala Gln Ile Leu Lys Ala Tyr Ala Ala Ile465                 470                 475                 480Ser Gly Ala Ile Ala Gly Ala Ala
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(A)长度：271氨基酸
(B)类型：氨基酸(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Ser Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gln Lys Asn Ile Met1           5                      10                  15Ser Gln Val Leu Thr Ser Thr Pro Gln Gly Val Pro Gln Gln Asp Lys
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(A)长度：1464碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双(ii)分子类型：其它核酸；合成的DNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：ATG TCT ATT TCA TCT TCT TCA GGA CCT GAC AAT CAA AAA AAT ATC ATG 48Met Ser Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gln Lys Asn Ile Met1               5                  10                  15TCT CAA GTT CTG ACA TCG ACA CCC CAG GGC GTG CCC CAA CAA GAT AAG 96Ser Gln Val Leu Thr Ser Thr Pro Gln Gly Val Pro Gln Gln Asp Lys
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370                 375                 380TCG TCT CTT ACC AGT AAA TGG GTC ACG GTT GGG GTT GGG GTT GTA GTT 1200Ser Ser Leu Thr Ser Lys Trp Val Thr Val Gly Val Gly Val Val Val385                 390                 395                 400GCG GCG CCT GCT CTC GGT AAA GGG ATT ATG CAA ATG CAG CTC TCG GAG 1248Ala Ala Pro Ala Leu Gly Lys Gly Ile Met Gln Met Gln Leu Ser Glu
            405                 410                 415ATG CAA CAA AAC GTC GCT CAA TTT CAG AAA GAA GTC GGA AAA CTG CAG 1296Met Gln Gln Asn Val Ala Gln Phe Gln Lys Glu Val Gly Lys Leu Gln
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    435                 440                 445AGT AAA ATT GCC TCA AAA CAA ACA GGC GAG TCT AAT GAA ATG ACT CAA 1392Ser Lys Ile Ala Ser Lys Gln Thr Gly Glu Ser Asn Glu Met Thr Gln
450                 455                 460AAA GCT ACC AAG CTG GGC GCT CAA ATC CTT AAA GCG TAT GCC GCA ATC 1440Lys Ala Thr Lys Leu Gly Ala Gln Ile Leu Lys Ala Tyr Ala Ala Ile465                 470                 475                 480AGC GGA GCC ATC GCT GGC GCA GCA                                 1464Ser Gly Ala Ile Ala Gly Ala Ala
            485         488SEQ ID NO：4的信息：(i)序列特征：
(A)长度：813
(B)类型：核酸
(C)链型：双(ii)分子类型：其它核酸；合成的DNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：ATG TCT ATT TCA TCT TCT TCA GGA CCT GAC AAT CAA AAA AAT ATC ATG        48Met Ser Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gln Lys Asn Ile Met1               5                  10                  15TCT CAA GTT CTG ACA TCG ACA CCC CAG GGC GTG CCC CAA CAA GAT AAG        96Ser Gln Val Leu Thr Ser Thr Pro Gln Gly Val Pro Gln Gln Asp Lys
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 50                  55                  60GAC AAA ACT TCC TCG ACT ACA AAA ACA GAA ACA GCT CCA CAA CAG GGA 240Asp Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gln Gln Gly65                  70                  75                  80GTT GCT GCT GGG AAA GAA TCC TCA GAA AGT CAA AAG GCA GGT GCT GAT 288Val Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gln Lys Ala Gly Ala Asp
             85                  90                  95ACT GGA GTA TCA GGA GCG GCT GCT ACT ACA GCA TCA AAT ACT GCA ACA 336Thr Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala Thr
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        180                 185                 190TTG GGA GAA GCC ACA AAA TCT GCC TTA TCT AAC TAT GCA AGT ACA CAA 624Leu Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr Gln
    195                 200                 205GCA CAA GCA GAC CAA ACA AAT AAA CTA GGT CTA GAA AAG CAA GCG ATA 672Ala Gln Ala Asp Gln Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gln Ala Ile
210                 215                 220AAA ATC GAT AAA GAA CGA GAA GAA TAC CAA GAG ATG AAG GCT GCC GAA 720Lys Ile Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gln Glu Met Lys Ala Ala Glu225                 230                  235                240CAG AAG TCT AAA GAT CTC GAA GGA ACA ATG GAT ACT GTC AAT ACT GTG 768Gln Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr Val
            245                 250                 255ATG ATC GCG AAG GGG TTC GAA TTG CCA TGG GGG CCC TTA ATT AAT     813Met Ile Ala Lys Gly Phe Glu Leu Pro Trp Gly Pro Leu Ile Asn
        260                 265                 270 271SEQ ID NO：5的信息：(i)序列特征：
(A)长度：259氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：Met Ser Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gln Lys Asn Ile Met1           5                      10                  15Ser Gln Val Leu Thr Ser Thr Pro Gln Gly Val Pro Gln Gln Asp Lys
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130                     135             140Val Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly Ser145                 150                 155                 160Ala Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro Arg
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    195                 200                 205Ala Gln Ala Asp Gln Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gln Ala Ile
210                 215                 220Lys Ile Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gln Glu Met Lys Ala Ala Glu225                 230                 235                 240Gln Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr Val
            245                 250                 255Met Ile Ala
    259SEQ ID NO：6的信息：(i)序列特征：
(A)长度：571氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：Met Pro Lys Gln Ala Glu Tyr Thr Trp Gly Ser Lys Lys Ile Leu Asp1               5                  10                  15Asn Ile Glu Cys Leu Thr Glu Asp Val Ala Glu Phe Lys Asp Leu Leu
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 50                  55                  60Asp Phe Val Val Val Asp Val Gly Leu Lys Ser Glu Gly Val Ile Pro65                  70                  75                  80Met Ser Glu Phe Ile Asp Ser Ser Glu Gly Leu Val Leu Gly Ala Glu
             85                  90                  95Val Glu Val Tyr Leu Asp Gln Ala Glu Asp Glu Glu Gly Lys Val Val
        100                 105                 110Leu Ser Arg Glu Lys Ala Thr Arg Gln Arg Gln Trp Glu Tyr Ile Leu
    115                 120                 125Ala His Cys Glu Glu Gly Ser Ile Val Lys Gly Gln Ile Thr Arg Lys
130                 135                 140Val Lys Gly Gly Leu Ile Val Asp Ile Gly Met Glu Ala Phe Leu Pro145                 150                 155                 160Gly Ser Gln Ile Asp Asn Lys Lys Ile Lys Asn Leu Asp Asp Tyr Val
            165                 170                 175Gly Lys Val Cys Glu Phe Lys Ile Leu Lys Ile Asn Val Glu Arg Arg
        180                 185                 190Asn Ile Val Val Ser Arg Arg Glu Leu Leu Glu Ala Glu Arg Ile Ser
    195                 200                 205Lys Lys Ala Glu Leu Ile Glu Gln Ile Ser Ile Gly Glu Tyr Arg Lys
210                 215                 220Gly Val Val Lys Asn Ile Thr Asp Phe Gly Val Phe Leu Asp Leu Asp225                 230                 235                240Gly Ile Asp Gly Leu Leu His Ile Thr Asp Met Thr Trp Lys Arg Ile
                245             250                 255Arg His Pro Ser Glu Met Val Glu Leu Asn Gln Glu Leu Glu Val Ile
        260                 265                 270Ile Leu Ser Val Asp Lys Glu Lys Gly Arg Val Ala Leu Gly Leu Lys
    275                 280                 285Gln Lys Glu His Asn Pro Trp Glu Asp Ile Glu Lys Lys Tyr Pro Pro
290                 295                 300Gly Lys Arg Val Leu Gly Lys Ile Val Lys Leu Leu Pro Tyr Gly Ala305                 310                 315                 320Phe Ile Glu Ile Glu Glu Gly Ile Glu Gly Leu Ile His Ile Ser Glu
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        340                 345             350Gly Asp Glu Val Glu Ala Ile Val Leu Ser Ile Gln Lys Asp Glu Gly
    355                 360                 365Lys Ile Ser Leu Gly Leu Lys Gln Thr Glu Arg Asn Pro Trp Asp Asn
370                 375                 380Ile Glu Glu Lys Tyr Pro Ile Gly Leu His Val Asn Ala Glu Ile Lys380                 385                 390                 395Asn Leu Thr Asn Tyr Gly Ala Phe Val Glu Leu Glu Pro Gly Ile Glu
            400                 405                 410Gly Leu Ile His Ile Ser Asp Met Ser Trp Ile Lys Lys Val Ser His
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    430                 435                 440Ser Val Asp Lys Glu Ser Lys Lys Ile Thr Leu Gly Val Lys Gln Leu
445                 450                 455Ser Ser Asn Pro Trp Asn Glu Ile Glu Ala Met Phe Pro Ala Gly Thr460                 465                 470                 475Val Ile Ser Gly Val Val Thr Lys Ile Thr Ala Phe Gly Ala Phe Val
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        495                 500                 505Asp Lys Pro Phe Ala Lys Iie Glu Asp Ile Ile Ser Ile Gly Glu Asn
    510                 515                 520Val Ser Ala Lys Val Ile Lys Leu Asp Pro Asp His Lys Lys Val Ser
525                 530                 535Leu Ser Val Lys Glu Tyr Leu Ala Asp Asn Ala Tyr Asp Gln Asp Ser540                 545                 550                 560Arg Thr Glu Leu Asp Phe Lys Asp Ser Gln Gly
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(B)类型：核酸
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(A)生物体：肺炎衣原体
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(B)克隆：53-3S(ix)特征：
(A)名称/键：CDS
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                                                         Met
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     20                  25                  30TCT GGC AAC GAA ACG AAG CAA ATA CAG CAA ACA CGT CAG GGT AAA AAC 382Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gln Ile Gln Gln Thr Arg Gln Gly Lys Asn
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             70                  75                  80GCT GCT GGG AAA GAA TCC TCA GAA AGT CAA AAG GCA GGT GCT GAT ACT 526Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gln Lys Ala Gly Ala Asp Thr
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    100                 105                 110ATT GCT ATG CAG ACC TCT ATT GAA GAG GCG AGC AAA AGT ATG GAG TCT 622Ile Ala Met Gln Thr Ser Ile Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met Glu Ser
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            150                 155                 160AAA TTG GAA ACA CCT GAG CTC CCC AAG CCC GGG GTG ACA CCA AGA TCA 766Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro Arg Ser
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    180                 185                 190GGA GAA GCC ACA AAA TCT GCC TTA TCT AAC TAT GCA AGT ACA CAA GCA 862Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr Gln Ala
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 259SEQ ID NO：10的信息：(i)序列特征：
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(A)长度：35
(B)类型：核酸
(C)链型：单(ii)分子类型：其它核酸；合成的DNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：GATCCAATTG CCATGGGGGC CCTTAATTAA TTAAC                   35SEQ ID NO：12的信息：(i)序列特征：
(A)长度：35碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单(ii)分子类型：其它核酸；合成的DNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：TCGAGTTAAT TAATTAAGGG CCCCCATGGC AATTG                   35SEQ ID NO：13的信息：(i)序列特征：
(A)长度：1954碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：基因组DNA(vi)来源：
(A)生物体：肺炎衣原体
(B)株：YK-41(vii)直接来源：
(B)克隆：70-2S(ix)特征：
(A)名称/键：-35信号
(B)位点：146到151
(C)鉴定方法：通过与已知序列或已建立的一致序列的相似性(ix)特征：
(A)名称/键：-10信号
(B)位点：169到174
(C)鉴定方法：通过与已知序列或已建立的一致序列的相似性(ix)特征：
(A)名称/键：RBS
(B)位点：199到205
(C)鉴定方法：通过与已知序列或已建立的一致序列的相似性(ix)特征：
(A)名称/键：CDS
(B)位点：215到1927
(C)鉴定方法：通过与已知序列或已建立的一致序列的相似性(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：TTGACACCAG ACCAACTGGT AATGGTAGCG ACCGGCGCTC AGCTGGAATT CGAACCCCTT 60CGCCTTATAC ATCTCTAGAA CGGAAGTATA GGATTTTACG ATTAATTCGA TTATATAGAA 120CTAATCGTCT CCTGCAAGGG AGGTCTTGCC TTTTTTAAGG TTTATATTTA CACTGTCTTT 180TTTGACTTTG TAGTTTTTAG GAGAATAACA ATAA ATG CCA AAA CAA GCT GAA TAT 235
                                  Met Pro Lys Gln Ala Glu Tyr
                                    1               5ACT TGG GGA TCT AAA AAA ATT CTG GAC AAT ATA GAA TGC CTC ACA GAA   283Thr Trp Gly Ser Lys Lys Ile Leu Asp Asn Ile Glu Cys Leu Thr Glu
     10                  15                  20GAC GTT GCC GAA TTT AAA GAT TTG CTT TAT ACG GCA CAC AGA ATT ACT   331Asp Val Ala Glu Phe Lys Asp Leu Leu Tyr Thr Ala His Arg Ile Thr
 25                  30                  35TCG AGC GAA GAA GAA TCT GAT AAC GAA ATA CAG CCT GGC GCC ATC CTA   379Ser Ser Glu Glu Glu Ser Asp Asn Glu Ile Gln Pro Gly Ala Ile Leu40                  45                  50                  55AAA GGT ACC GTA GTT GAT ATT AAT AAA GAC TTT GTC GTA GTT GAT GTT   427Lys Gly Thr Val Val Asp Ile Asn Lys Asp Phe Val Val Val Asp Val
             60                  65                  70GGT CTG AAG TCT GAG GGA GTG ATC CCT ATG TCA GAG TTC ATA GAC TCT 475Gly Leu Lys Ser Glu Gly Val Ile Pro Met Ser Glu Phe Ile Asp Ser
         75                  80                  85TCA GAA GGT TTA GTG CTT GGA GCT GAA GTA GAA GTC TAT CTC GAC CAA 523Ser Glu Gly Leu Val Leu Gly Ala Glu Val Glu Val Tyr Leu Asp Gln
     90                  95                 100GCC GAA GAC GAA GAG GGC AAA GTT GTC CTT TCT AGA GAA AAA GCC ACA 571Ala Glu Asp Glu Glu Gly Lys Val Val Leu Ser Arg Glu Lys Ala Thr
105                 110                 115CGA CAA CGT CAA TGG GAA TAC ATC TTA GCT CAT TGT GAA GAA GGT TCT 619Arg Gln Arg Gln Trp Glu Tyr Ile Leu Ala His Cys Glu Glu Gly Ser120                 125                 130                 135ATT GTT AAA GGT CAA ATT ACA CGT AAA GTC AAA GGC GGC CTT ATT GTA 667Ile Val Lys Gly Gln Ile Thr Arg Lys Val Lys Gly Gly Leu Ile Val
            140                 145                 150GAT Ile Gly Met Glu Ala Phe Leu Pro Gly Ser Gln Ile Asp Asn Lys 715Asp ATT GGA ATG GAA GCC TTC CTA CCT GGA TCA CAA ATT GAC AAC AAG
        155                 160                 165Lys ATC AAA AAT TTA GAT GAT TAT GTC GGA AAA GTT TGT GAA TTC AAA 763AAA Ile Lys Asn Leu Asp Asp Tyr Val Gly Lys Val Cys Glu Phe Lys
    170                 175                 180ATT TTA AAA ATT AAC GTT GAA CGT CGC AAT ATT GTT GTC TCA AGA AGA 811Ile Leu Lys Ile Asn Val Glu Arg Arg Asn Ile Val Val Ser Arg Arg
185                 190                 195GAA CTC TTA GAA GCT GAG AGA ATC TCT AAG AAA GCC GAA CTT ATT GAA 859Glu Leu Leu Glu Ala Glu Arg Ile Ser Lys Lys Ala Glu Leu Ile Glu200                 205                 210                 215CAA ATT TCT ATC GGA GAA TAC CGC AAA GGA GTT GTT AAA AAC ATT ACT 907Gln Ile Ser Ile Gly Glu Tyr Arg Lys Gly Val Val Lys Asn Ile Thr
            220                 225                 230GAC TTT GGT GTA TTC TTA GAT CTC GAT GGT ATT GAC GGT CTT CTC CAC 955Asp Phe Gly Val Phe Leu Asp Leu Asp Gly Ile Asp Gly Leu Leu His
        235                 240                 245ATT ACC GAT ATG ACC TGG AAG CGC ATA CGA CAT CCT TCC GAA ATG GTC 1003Ile Thr Asp Met Thr Trp Lys Arg Ile Arg His Pro Ser Glu Met Val
    250                 255                 260GAA TTG AAT CAA GAG TTG GAA GTA ATT ATT TTA AGC GTA GAT AAA GAA 1051Glu Leu Asn Gln Glu Leu Glu Val Ile Ile Leu Ser Val Asp Lys Glu
265                 270                 275AAA GGA CGA GTT GCT CTA GGT CTC AAA CAA AAA GAG CAT AAT CCT TGG 1099Lys Gly Arg Val Ala Leu Gly Leu Lys Gln Lys Glu His Asn Pro Trp280                 285                 290                 295GAA GAT ATT GAG AAG AAA TAC CCT CCT GGA AAA CGA GTT CTT GGT AAA 1147Glu Asp Ile Glu Lys Lys Tyr Pro Pro Gly Lys Arg Val Leu Gly Lys
            300                 305                 310ATT GTG AAG CTT CTC CCC TAC GGA GCT TTC ATT GAA ATT GAA GAG GGC 1195Ile Val Lys Leu Leu Pro Tyr Gly Ala Phe Ile Glu Ile Glu Glu Gly
        315                 320                  325ATT GAA GGT CTA ATT CAC ATT TCT GAA ATG TCT TGG GTG AAA AAT ATT 1243Ile Glu Gly Leu Ile His Ile Ser Glu Met Ser Trp Val Lys Asn Ile
    330                 335                 340GTA GAT CCT AGT GAA GTC GTA AAT AAA GGC GAT GAA GTT GAA GCC ATT 1291Val Asp Pro Ser Glu Val Val Asn Lys Gly Asp Glu Val Glu Ala Ile
345                 350                 355GTT CTA TCT ATT CAG AAG GAC GAA GGA AAA ATT TCT CTA GGA TTA AAG 1339Val Leu Ser Ile Gln Lys Asp Glu Gly Lys Ile Ser Leu Gly Leu Lys360                 365                 370                 375CAA ACA GAA CGT AAT CCT TGG GAC AAT ATC GAA GAA AAA TAT CCT ATA 1387Gln Thr Glu Arg Asn Pro Trp Asp Asn Ile Glu Glu Lys Tyr Pro Ile
            380                 385                 390GGT CTC CAT GTC AAT GCT GAA ATC AAG AAC TTA ACC AAT TAC GGT GCT 1435Gly Leu His Val Asn Ala Glu Ile Lys Asn Leu Thr Asn Tyr Gly Ala
        395                 400                 405TTC GTT GAA TTA GAA CCA GGA ATT GAG GGT CTG ATT CAT ATT TCT GAC 1483Phe Val Glu Leu Glu Pro Gly Ile Glu Gly Leu Ile His Ile Ser Asp
    410                 415                 420ATG AGT TGG ATT AAA AAA GTC TCT CAC CCT TCA GAA CTA TTC AAA AAA 1531Met Ser Trp Ile Lys Lys Val Ser His Pro Ser Glu Leu Phe Lys Lys
425                 430                 435GGA AAT TCT GTA GAG GCT GTT ATT TTA TCA GTA GAC AAA GAA AGT AAA 1579Gly Asn Ser Val Glu Ala Val Ile Leu Ser Val Asp Lys Glu Ser Lys440                 445                 450                 455AAA ATT ACT TTA GGA GTT AAG CAA TTA AGT TCT AAT CCT TGG AAT GAA 1627Lys Ile Thr Leu Gly Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Pro Trp Asn Glu
            460                 465                 470ATT GAA GCT ATG TTC CCT GCT GGC ACA GTA ATT TCA GGA GTT GTG ACT 1675Ile Glu Ala Met Phe Pro Ala Gly Thr Val Ile Ser Gly Val Val Thr
        475                 480                 485AAA ATC ACT GCA TTT GGA GCC TTT GTT GAG CTA CAA AAC GGG ATT GAA 1723Lys Ile Thr Ala Phe Gly Ala Phe Val Glu Leu Gln Asn Gly Ile Glu
    490                 495                 500GGA TTG ATT CAC GTT TCA GAA CTT TCT GAC AAG CCC TTT GCA AAA ATT 1771Gly Leu Ile His Val Ser Glu Leu Ser Asp Lys Pro Phe Ala Lys Ile
505                 510                 515GAA GAT ATT ATC TCC ATT GGA GAA AAT GTT TCT GCA AAA GTA ATT AAG 1919Glu Asp Ile Ile Ser Ile Gly Glu Asn Val Ser Ala Lys Val Ile Lys520                 525                 530                 535CTA GAT CCA GAT CAT AAA AAA GTT TCT CTT TCT GTA AAA GAA TAC TTA 1867Leu Asp Pro Asp His Lys Lys Val Ser Leu Ser Val Lys Glu Tyr Leu
            540                 545                 550GCT GAC AAT GCT TAT GAT CAA GAC TCT AGG ACT GAA TTA GAT TTC AAG 1915Ala Asp Asn Ala Tyr Asp Gln Asp Ser Arg Thr Glu Leu Asp Phe Lys
        555                 560                 565GAT TCT CAA GGC GAA GGG GTT CGA ATT CCG CCG ATA CTG             1954Asp Ser Gln Gly Glu Gly Val Arg Ile Pro Pro Ile Leu
    570                 575                 580SEQ ID NO：14的信息：(i)序列特征：
(A)长度：160氨基酸
(B)类型：氨基酸(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met1               5                  10                  15Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys
         20                  25                  30Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu
     35                  40                  45Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser
 50                  55                  60Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu65                  70                  75                  80Ala Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly
             85                  90                  95Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu
        100                 105                 110Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr
    115                 120                 125Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp
130                 135                 140Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Glu Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg Ile145                 150                 155                 160SEQ ID NO：15的信息：(i)序列特征：
(A)长度：649氨基酸
(B)类型：氨基酸(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met1               5                  10                  15Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys
          20                 25                  30Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu
     35                  40                  45Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser
 50                  55                  60Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu 65                  70                  75                  80Ala Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly
             85                  90                  95Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu
        100                 105                 110Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr
    115                 120                 125Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp
130                 135                 140Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Glu Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg Ile145                 150                 155                 160Leu Met Ser Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gln Lys Asn Ile
            165                 170                 175Met Ser Gln Val Leu Thr Ser Thr Pro Gln Gly Val Pro Gln Gln Asp
        180                 185                 190Lys Leu Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gln Ile Gln Gln Thr Arg Gln Gly
    195                 200                 205Lys Asn Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr Ile Ala Gly Ala Ser Gly
210                 215                 220Lys Asp Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gln Gln225                 230                 235                 240Gly Val Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gln Lys Ala Gly Ala
            245                 250                 255Asp Thr Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala
        260                 265                 270Thr Lys Ile Ala Met Gln Thr Ser Ile Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met
    275                 280                 285Glu Ser Thr Leu Glu Ser Leu Gln Ser Leu Ser Ala Ala Gln Met Lys
290                 295                 300Glu Val Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly305                 310                 315                 320Ser Ala Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro
            325                 330                 335Arg Ser Glu Val Ile Glu Ile Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala Ile Gln
        340                 345                 350Thr Leu Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr
    355                 360                 365Gln Ala Gln Ala Asp Gln Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gln Ala
370                 375                 380Ile Lys Ile Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gln Glu Met Lys Ala Ala385                 390                 395                 400Glu Gln Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr
            405                 410                 415Val Met Ile Ala Val Ser Val Ala Ile Thr Val Ile Ser Ile Val Ala
        420                 425                 430Ala Ile Phe Thr Cys Gly Ala Gly Leu Ala Gly Leu Ala Ala Gly Ala
    435                 440                 445Ala Val Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala
450                 455                 460Thr Thr Val Ala Thr Gln Ile Thr Val Gln Ala Val Val Gln Ala Val465                 470                 475                 480Lys Gln Ala Val Ile Thr Ala Val Arg Gln Ala Ile Thr Ala Ala Ile
            485                 490                 495Lys Ala Ala Val Lys Ser Gly Ile Lys Ala Phe Ile Lys Thr Leu Val
        500                 505                 510Lys Ala Ile Ala Lys Ala Ile Ser Lys Gly Ile Ser Lys Val Phe Ala
    515                 520                 525Lys Gly Thr Gln Met Ile Ala Lys Asn Phe Pro Lys Leu Ser Lys Val
530                 535                 540Ile Ser Ser Leu Thr Ser Lys Trp Val Thr Val Gly Val Gly Val Val545                 550                 555                 560Val Ala Ala Pro Ala Leu Gly Lys Gly Ile Met Gln Met Gln Leu Ser
            565                 570                 575Glu Met Gln Gln Asn Val Ala Gln Phe Gln Lys Glu Val Gly Lys Leu
        580                 585                 590Gln Ala Ala Ala Asp Met Ile Ser Met Phe Thr Gln Phe Trp Gln Gln
    595                 600                 605Ala Ser Lys Ile Ala Ser Lys Gln Thr Gly Glu Ser Asn Glu Met Thr
610                 615                 620Gln Lys Ala Thr Lys Leu Gly Ala Gln Ile Leu Lys Ala Tyr Ala Ala625                 630                 635                 640Ile Ser Gly Ala Ile Ala Gly Ala Ala
            645             649SEQ ID NO：16的信息：(i)序列特征：
(A)长度：432氨基酸
(B)类型：氨基酸(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met1               5                  10                  15Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys
         20                  25                  30Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu
     35                  40                  45Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser
 50                  55                  60Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu65                  70                  75                  80Ala Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly
             85                  90                  95Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu
        100                 105                 110Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr
    115                 120                 125Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp
130                 135                 140Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Glu Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg Ile145                 150                 155                 160Leu Met Ser Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gln Lys Asn Ile
            165                 170                 175Met Ser Gln Val Leu Thr Ser Thr Pro Gln Gly Val Pro Gln Gln Asp
        180                 185                 190Lys Leu Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gln Ile Gln Gln Thr Arg Gln Gly
    195                 200                 205Lys Asn Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr Ile Ala Gly Ala Ser Gly
210                 215                 220Lys Asp Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gln Gln225                 230                 235                 240Gly Val Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gln Lys Ala Gly Ala
            245                 250                 255Asp Thr Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala
        260                 265                 270Thr Lys Ile Ala Met Gln Thr Ser Ile Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met
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(A)长度：5438碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双(ii)分子类型：其它核酸；质粒(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：ATCGATGTTA ACAGATCTAA GCTTAACTAA CTAACTCCGG AAAAGGAGGA ACTTCCATGA 60TCAGTCTGAT TGCGGCGTTA GCGGTAGATC GCGTTATCGG CATGGAAAAC GCCATGCCGT 120GGAACCTGCC TGCCGATCTC GCCTGGTTTA AACGCAACAC CTTAAATAAA CCCGTGATTA 180TGGGCCGCCA TACCTGGGAA TCAATCGGTC GTCCGTTGCC AGGACGCAAA AATATTATCC 240TCAGCAGTCA ACCGGGTACG GACGATCGCG TAACGTGGGT GAAGTCGGTG GATGAAGCCA 300TCGCGGCGTG TGGTGACGTA CCAGAAATCA TGGTGATTGG CGGCGGTCGC GTTTATGAAC 360AGTTCTTGCC AAAAGCGCAA AAACTGTATC TGACGCATAT CGACGCAGAA GTGGAAGGCG 420ACACCCATTT CCCGGATTAC GAGCCGGATG ACTGGGAATC GGTATTCAGC GAATTCCACG 480ATGCTGATGC GCAGAACTCT CACAGCTATG AGTTCGAAAT TCTGGAGCGG CGGATCCTGA 540TGTCTATTTC ATCTTCTTCA GGACCTGACA ATCAAAAAAA TATCATGTCT CAAGTTCTGA 600CATCGACACC CCAGGGCGTG CCCCAACAAG ATAAGCTGTC TGGCAACGAA ACGAAGCAAA 660TACAGCAAAC ACGTCAGGGT AAAAACACTG AGATGGAAAG CGATGCCACT ATTGCTGGTG 720CTTCTGGAAA AGACAAAACT TCCTCGACTA CAAAAACAGA AACAGCTCCA CAACAGGGAG 780TTGCTGCTGG GAAAGAATCC TCAGAAAGTC AAAAGGCAGG TGCTGATACT GGAGTATCAG 840GAGCGGCTGC TACTACAGCA TCAAATACTG CAACAAAAAT TGCTATGCAG ACCTCTATTG 900AAGAGGCGAG CAAAAGTATG GAGTCTACCT TAGAGTCACT TCAAAGCCTC AGTGCCGCGC 960AAATGAAAGA AGTCGAAGCG GTTGTTGTTG CTGCCCTCTC AGGGAAAAGT TCGGGTTCCG 1020CAAAATTGGA AACACCTGAG CTCCCCAAGC CCGGGGTGAC ACCAAGATCA GAGGTTATCG 1080AAATCGGACT CGCGCTTGCT AAAGCAATTC AGACATTGGG AGAAGCCACA AAATCTGCCT 1140TATCTAACTA TGCAAGTACA CAAGCACAAG CAGACCAAAC AAATAAACTA GGTCTAGAAA 1200AGCAAGCGAT AAAAATCGAT AAAGAACGAG AAGAATACCA AGAGATGAAG GCTGCCGAAC 1260AGAAGTCTAA AGATCTCGAA GGAACAATGG ATACTGTCAA TACTGTGATG ATCGCGAAGG 1320GGTTCGAATT GCCATGGGGG CCCTTAATTA ATTAACTCGA GAGATCCAGA TCTAATCGAT 1380GATCCTCTAC GCCGGACGCA TCGTGGCCGG CATCACCGGC GCCACAGGTG CGGTTGCTGG 1440CGCCTATATC GCCGACATCA CCGATGGGGA AGATCGGGCT CGCCACTTCG GGCTCATGAG 1500CGCTTGTTTC GGCGTGGGTA TGGTGGCAGG CCCGTGGCCG GGGGACTGTT GGGCGCCATC 1560TCCTTGCATG CACCATTCCT TGCGGCGGCG GTGCTCAACG GCCTCAACCT ACTACTGGGC 1620TGCTTCCTAA TGCAGGAGTC GCATAAGGGA GAGCGTCGAC CGATGCCCTT GAGAGCCTTC 1680AACCCAGTCA GCTCCTTCCG GTGGGCGCGG GGCATGACTA TCGTCGCCGC ACTTATGACT 1740GTCTTCTTTA TCATGCAACT CGTAGGACAG GTGCCGGCAG CGCTCTGGGT CATTTTCGGC 1800GAGGACCGCT TTCGCTGGAG CGCGACGATG ATCGGCCTGT CGCTTGCGGT ATTCGGAATC 1860TTGCACGCCC TCGCTCAAGC CTTCGTCACT GGTCCCGCCA CCAAACGTTT CGGCGAGAAG 1920CAGGCCATTA TCGCCGGCAT GGCGGCCGAC GCGCTGGGCT ACGTCTTGCT GGCGTTCGCG 1980ACGCGAGGCT GGATGGCCTT CCCCATTATG ATTCTTCTCG CTTCCGGCGG CATCGGGATG 2040CCCGCGTTGC AGGCCATGCT GTCCAGGCAG GTAGATGACG ACCATCAGGG ACAGCTTCAA 2100GGATCGCTCG CGGCTCTTAC CAGCCTAACT TCGATCACTG GACCGCTGAT CGTCACGGCG 2160ATTTATGCCG CCTCGGCGAG CACATGGAAC GGGTTGGCAT GGATTGTAGG CGCCGCCCTA 2220TACCTTGTCT GCCTCCCCGC GTTGCGTCGC GGTGCATGGA GCCGGGCCAC CTCGACCTGA 2280ATGGAAGCCG GCGGCACCTC GCTAACGGAT TCACCACTCC AAGAATTGGA GCCAATCAAT 2340TCTTGCGGAG AACTGTGAAT GCGCAAACCA ACCCTTGGCA GAACATATCC ATCGCGTCCG 2400CCATCTCCAG CAGCCGCACG CGGCGCATCT CGGGCAGCGT TGGGTCCTGG CCACGGGTGC 2460GCATGATCGT GCTCCTGTCG TTGAGGACCC GGCTAGGCTG GCGGGGTTGC CTTACTGGTT 2520AGCAGAATGA ATCACCGATA CGCGAGCGAA CGTGAAGCGA CTGCTGCTGC AAAACGTCTG 2580CGACCTGAGC AACAACATGA ATGGTCTTCG GTTTCCGTGT TTCGTAAAGT CTGGAAACGC 2640GGAAGTCAGC GCCCTGCACC ATTATGTTCC GGATCTGCAT CGCAGGATGC TGCTGGCTAC 2700CCTGTGGAAC ACCTACATCT GTATTAACGA AGCGCTGGCA TTGACCCTGA GTGATTTTTC 2760TCTGGTCCCG CCGCATCCAT ACCGCCAGTT GTTTACCCTC ACAACGTTCC AGTAACCGGG 2820CATGTTCATC ATCAGTAACC CGTATCGTGA GCATCCTCTC TCGTTTCATC GGTATCATTA 2880CCCCCATGAA CAGAAATTCC CCCTTACACG GAGGCATCAA GTGACCAAAC AGGAAAAAAC 2940CGCCCTTAAC ATGGCCCGCT TTATCAGAAG CCAGACATTA ACGCTTCTGG AGAAACTCAA 3000CGAGCTGGAC GCGGATGAAC AGGCAGACAT CTGTGAATCG CTTCACGACC ACGCTGATGA 3060GCTTTACCGC AGCTGCCTCG CGCGTTTCGG TGATGACGGT GAAAACCTCT GACACATGCA 3120GCTCCCGGAG ACGGTCACAG CTTGTCTGTA AGCGGATGCC GGGAGCAGAC AAGCCCGTCA 3180GGGCGCGTCA GCGGGTGTTG GCGGGTGTCG GGGCGCAGCC ATGACCCAGT CACGTAGCGA 3240TAGCGGAGTG TATACTGGCT TAACTATGCG GCATCAGAGC AGATTGTACT GAGAGTGCAC 3300CATATGCGGT GTGAAATACC GCACAGATGC GTAAGGAGAA AATACCGCAT CAGGCGCTCT 3360TCCGCTTCCT CGCTCACTGA CTCGCTGCGC TCGGTCGTTC GGCTGCGGCG AGCGGTATCA 3420GCTCACTCAA AGGCGGTAAT ACGGTTATCC ACAGAATCAG GGGATAACGC AGGAAAGAAC 3480ATGTGAGCAA AAGGCCAGCA AAAGGCCAGG AACCGTAAAA AGGCCGCGTT GCTGGCGTTT 3540TTCCATAGGC TCCGCCCCCC TGACGAGCAT CACAAAAATC GACGCTCAAG TCAGAGGTGG 3600CGAAACCCGA CAGGACTATA AAGATACCAG GCGTTTCCCC CTGGAAGCTC CCTCGTGCGC 3660TCTCCTGTTC CGACCCTGCC GCTTACCGGA TACCTGTCCG CCTTTCTCCC TTCGGGAAGC 3720GTGGCGCTTT CTCAATGCTC ACGCTGTAGG TATCTCAGTT CGGTGTAGGT CGTTCGCTCC 3780AAGCTGGGCT GTGTGCACGA ACCCCCCGTT CAGCCCGACC GCTGCGCCTT ATCCGGTAAC 3840TATCGTCTTG AGTCCAACCC GGTAAGACAC GACTTATCGC CACTGGCAGC AGCCACTGGT 3900AACAGGATTA GCAGAGCGAG GTATGTAGGC GGTGCTACAG AGTTCTTGAA GTGGTGGCCT 3960AACTACGGCT ACACTAGAAG GACAGTATTT GGTATCTGCG CTCTGCTGAA GCCAGTTACC 4020TTCGGAAAAA GAGTTGGTAG CTCTTGATCC GGCAAACAAA CCACCGCTGG TAGCGGTGGT 4080TTTTTTGTTT GCAAGCAGCA GATTACGCGC AGAAAAAAAG GATCTCAAGA AGATCCTTTG 4140ATCTTTTCTA CGGGGTCTGA CGCTCAGTGG AACGAAAACT CACGTTAAGG GATTTTGGTC 4200ATGAGATTAT CAAAAAGGAT CTTCACCTAG ATCCTTTTAA ATTAAAAATG AAGTTTTAAA 4260TCAATCTAAA GTATATATGA GTAAACTTGG TCTGACAGTT ACCAATGCTT AATCAGTGAG 4320GCACCTATCT CAGCGATCTG TCTATTTCGT TCATCCATAG TTGCCTGACT CCCCGTCGTG 4380TAGATAACTA CGATACGGGA GGGCTTACCA TCTGGCCCCA GTGCTGCAAT GATACCGCGA 4440GACCCACGCT CACCGGCTCC AGATTTATCA GCAATAAACC AGCCAGCCGG AAGGGCCGAG 4500CGCAGAAGTG GTCCTGCAAC TTTATCCGCC TCCATCCAGT CTATTAATTG TTGCCGGGAA 4560GCTAGAGTAA GTAGTTCGCC AGTTAATAGT TTGCGCAACG TTGTTGCCAT TGCTGCAGGC 4620ATCGTGGTGT CACGCTCGTC GTTTGGTATG GCTTCATTCA GCTCCGGTTC CCAACGATCA 4680AGGCGAGTTA CATGATCCCC CATGTTGTGC AAAAAAGCGG TTAGCTCCTT CGGTCCTCCG 4740ATCGTTGTCA GAAGTAAGTT GGCCGCAGTG TTATCACTCA TGGTTATGGC AGCACTGCAT 4800AATTCTCTTA CTGTCATGCC ATCCGTAAGA TGCTTTTCTG TGACTGGTGA GTACTCAACC 4860AAGTCATTCT GAGAATAGTG TATGCGGCGA CCGAGTTGCT CTTGCCCGGC GTCAACACGG 4920GATAATACCG CGCCACATAG CAGAACTTTA AAAGTGCTCA TCATTGGAAA ACGTTCTTCG 4980GGGCGAAAAC TCTCAAGGAT CTTACCGCTG TTGAGATCCA GTTCGATGTA ACCCACTCGT 5040GCACCCAACT GATCTTCAGC ATCTTTTACT TTCACCAGCG TTTCTGGGTG AGCAAAAACA 5100GGAAGGCAAA ATGCCGCAAA AAAGGGAATA AGGGCGACAC GGAAATGTTG AATACTCATA 5160CTCTTCCTTT TTCAATATTA TTGAAGCATT TATCAGGGTT ATTGTCTCAT GAGCGGATAC 5220ATATTTGAAT GTATTTAGAA AAATAAACAA ATAGGGGTTC CGCGCACATT TCCCCGAAAA 5280GTGCCACCTG ACGTCTAAGA AACCATTATT ATCATGACAT TAACCTATAA AAATAGGCGT 5340ATCACGAGGC CCTTTCGTCT TCAAGAATTA ATTGTTATCC GCTCACAATT AATTCTTGAC 5400AATTAGTTAA CTATTTGTTA TAATGTATTC ATAAGCTT                         5438SEQ ID NO：26的信息：(i)序列特征：
(A)长度：20碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单(ii)分子类型：其它核酸；合成的DNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：GCTGCCGAAC AGAAGTCTAA                                             20SEQ ID NO：27的信息：(i)序列特征：
(A)长度：20碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单(ii)分子类型：其它核酸；合成的DNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：CTCGAAGGAA CAATGGATAC                                             20SEQ ID NO：28的信息：(i)序列特征：
(A)长度：23碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单(ii)分子类型：其它核酸；合成的DNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：GTACATATTG TCGTTAGAAC GCG                               23SEQ ID NO：29的信息：(i)序列特征：
(A)长度：23碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单(ii)分子类型：其它核酸；合成的DNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：29：TAATACGACT CACTATAGGG AGA                               23SEQ ID NO：30的信息：(i)序列特征：
(A)长度：28碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单(ii)分子类型：其它核酸；合成的DNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：30：GCGGATCCTG ATGTCTATTT CATCTTCT                          28SEQ ID NO：31的信息：(i)序列特征：
(A)长度：30碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单(ii)分子类型：其它核酸；合成的DNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：31：ATCTCGAGTT TTATGCTGCT GCGCCAGCGA                        30

Claims (45)

1.一种肺炎衣原体抗原多肽，它包含含有SEQ ID NO：1多肽中至少5个连续的氨基酸序列的多肽A。
2.权利要求1的抗原多肽，其中所说的多肽A是一种从SEO IDNO：1多肽中缺失了至少1个氨基酸的多肽。
3.权利要求1的抗原多肽，其中多肽A是在SEO ID NO：1多肽中至少1个氨基酸被其它的氨基酸取代的多肽或者在SEO IDNO：1多肽中添加了至少1个氨基酸的多肽。
4.权利要求1的抗原多肽，其中所说的多肽A是1个氨基酸或肽序列与SEQ ID NO：1多肽中至少5个连续氨基酸的序列结合的多肽。
5.权利要求1的抗原多肽，其中所说的多肽A是含有SEQ IDNO：1的氨基酸序列的多肽。
6.权利要求1的抗原多肽，其中所说的多肽A是含有SEQ IDNO：2氨基酸序列的多肽。
7.权利要求1的抗原多肽，其中所说的多肽A是含有SEQ IDNO：5的氨基酸序列的多肽。
8.编码权利要求1-7之任一的抗原多肽的DNA，或其互补DNA。
9.权利要求8的DNA，它含有SEQ ID NO：3的碱基序列。
10.权利要求8的DNA，它含有SEQ ID NO：4的碱基序列。
11.权利要求8的DNA，它含有SEQ ID NO：7的碱基序列。
12.携带权利要求8-11之任一的DNA的重组载体。
13.权利要求12的重组载体，它是含有SEQ ID NO：10碱基序列的质粒pCPN533α。
14.含有权利要求12或13的重组载体的转化子。
15.一种产生抗肺炎衣原体抗体的方法，其中权利要求1-7之任一的抗原多肽被用作抗原。
16.一种检测和/或测定抗肺炎衣原体抗体的方法，其中权利要求1-7之任一的抗原多肽被用作抗原。
17.一种检测和/或测定抗肺炎衣原体抗体的试剂，它包含作为抗原的权利要求1-7之任一的抗原多肽。
18.一种诊断肺炎衣原体感染的试剂，它包含作为活性成分的权利要求1-7之任一的抗原多肽。
19.肺炎衣原体抗原多肽与二氢叶酸还原酶的融合蛋白，其中含SEQID NO：1多肽中至少5个连续氨基酸的序列的多肽B直接或者通过中介氨基酸或氨基酸序列与SEQ ID NO：14的多肽连接。
20.权利要求19的融合蛋白，其中所说的多肽B是从SEQ IDNO：1多肽中缺失了至少1个氨基酸的多肽。
21.权利要求19的融合蛋白，其中所说的多肽B是在SEQ IDNO：1中至少1个氨基酸被其它的氨基酸取代的多肽或者在SEQ IDNO：1多肽中添加了至少1个氨基酸的多肽。
22.权利要求19的融合蛋白，它是含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的多肽。
23.权利要求19的融合蛋白，它是含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的多肽。
24.编码权利要求19-23之任一融合蛋白的DNA，或其互补DNA。
25.权利要求24的DNA，它含有SEQ ID NO：17的碱基序列。
26.权利要求24的DNA，它含有SEQ ID NO：18的碱基序列。
27.携带权利要求24-26之任一的DNA的重组载体。
28.权利要求27的重组载体，它是质粒pCPN533T。
29.含有权利要求27或28的重组载体的转化子。
30.一种产生抗肺炎衣原体抗体的方法，其中权利要求19-23之任一的融合蛋白被用作抗原。
31.一种检测和/或测定抗肺炎衣原体抗体的方法，其中权利要求19-23之任一的融合蛋白被用作抗原。
32.检测和/或测定抗肺炎衣原体抗体的试剂，它包含作为抗原的权利要求19-23之任一的融合蛋白。
33.诊断肺炎衣原体感染的试剂，它包含作为活性组分的权利要求19-23之任一的融合蛋白。
34.检测和/或测定肺炎衣原体基因的探针，它包含如下之任一
(a)含SEQ ID NO：3 DNA中至少10个连续碱基的序列的DNA，
(b)与DNA(a)互补的DNA，或
(c)与DNA(a)或(b)有至少90％同源性的DNA。
35.权利要求34的探针，它含有SEQ ID NO：19的碱基序列。
36.权利要求34的探针，它含有SEQ ID NO：20的碱基序列。
37.检测和/或测定肺炎衣原体基因的方法，其中应用了权利要求34-36之任一的探针。
38.检测和/或测定肺炎衣原体基因的试剂，其中应用了权利要求34-36之任一的探针。
39.诊断肺炎衣原体感染的试剂，它包含作为活性组分的权利要求34-36之任一的探针。
40.检测和/或测定肺炎衣原体基因的引物，它包括如下之任一
(a)含SEQ ID NO：3 DNA中至少10个连续碱基序列的DNA，
(b)与DNA(a)互补的DNA，或
(c)与DNA(a)或(b)有至少90％同源性的DNA。
41.权利要求40的引物，它含有SEQ ID NO：19的碱基序列。
42.权利要求40的引物，它含有SEQ ID NO：20的碱基序列。
43.检测和/或测定肺炎衣原体基因的方法，其中应用了权利要求40-42之任一的引物。
44.检测和/或测定肺炎衣原体基因的试剂，它包含权利要求40-42之任一的引物。
45.诊断肺炎衣原体感染的试剂，它包含作为活性组分的权利要求40-42之任一的引物。
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