CN1354794A - 弱氧化葡糖杆菌山梨糖醇脱氢酶、基因及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学、细菌学和工业发酵领域。更明确地说,本发明提供了分离的核酸分子以及含有该分离的核酸分子的载体和宿主细胞,其中分离的核酸分子编码本发明之新的、膜结合的、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)山梨糖醇脱氢酶(SDH)的三个亚基。本发明进一步提供了本发明之SDH酶的三个亚基的分离多肽,并且提供了产生L－山梨糖和2－酮－L－古洛糖酸的方法。

Description

弱氧化葡糖杆菌山梨糖醇脱氢酶、基因及其使用方法
                    发明背景
发明领域
本发明涉及分子生物学、细菌学和工业发酵领域。更明确地说，本发明涉及对弱氧化葡糖杆菌(Gluconobacter suboxydans)中一个新的膜结合山梨糖醇脱氢酶之亚基的核酸序列和蛋白质的鉴定和分离。本发明进一步涉及从D-山梨糖醇发酵产生L-山梨糖以及随后2-酮-L-古洛糖酸的产生。
相关领域
山梨糖醇脱氢酶(SDH)是一种酶，在生产2-酮-L-古洛糖酸(2-KLG)(合成维生素C的一个重要前体)的过程中，其负责在山梨糖发酵期间将D-山梨糖醇有效转化为L-山梨糖。葡糖杆菌属(Gluconobacter)具有数种SDH，根据它们对辅因子的需要可分类为：(1)NAD-依赖的，(2)NADP-依赖的，以及(3)NAD(P)-不依赖的类型。其中，在工业的山梨糖发酵期间，认为NAD(P)-不依赖的酶直接参与山梨糖的有效产生(Cummins，J.T.等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem)，224，323；226，301(1957))。
从D-山梨糖醇生产L-山梨糖的方法一般通过发酵醋酸细菌(如弱氧化葡糖杆菌和木醋杆菌(Acetobacter xylinum))进行。室温条件下，24小时内可进行96-99％的转化(Liebster，J.等人，化学杂志(Chem.List.)，50：395(1956))。
通过SDH作用产生的L-山梨糖是产生2-酮-L-古洛糖酸(2-KLG)的一个底物。产生2-KLG的许多方法是公知的。例如，对广泛品种的细菌通过氧化L-山梨糖经过山梨酮(sorbosone)中间产物至2-KLG而发酵产生2-KLG的方法进行了描述，其中细菌为氧化葡糖杆菌(美国专利Nos.4,935,359；4,960,695；5,312,741；和5,541,108)；Pseudogluconobactersaccharoketogenes(美国专利No.4,877,735；欧洲专利No.221 707)；Pseudomonas sorbosoxidans(美国专利Nos.4,933,289和4,892,823)；上述菌与其它属(如醋杆菌属(Acetobacter)、芽胞杆菌属(Bacillus)、沙雷氏菌属(Serratia)、分支杆菌属(Mycobacterium)和链霉菌属(Streptomyces)(美国专利Nos.3,912,592；3,907,639；和3,234,105))的微生物混合物；以及新的菌株(美国专利No.5,834,231)。
文献中已鉴定了一些参与山梨糖醇、山梨糖和山梨酮发酵氧化的酶。美国专利Nos.5,88,786；5,861,292；5,834,263和5,753,481公开了编码L-山梨糖脱氢酶和L-山梨酮脱氢酶的核酸分子和/或者分离的蛋白质；并且美国专利No.5,747,301公开了一种具山梨糖醇脱氢酶特性的酶。
除了基于对辅因子的需要而区分葡糖杆菌属SDH外，在文献中也可找到其它的物理特性来区分这些不同的酶。例如在美国专利No.5,747,301中所鉴定的山梨糖醇脱氢酶是基于其亚细胞定位(膜结合的)和800±50KDa的haloenzyme分子量(79±5KDa的10个同源亚基)而区分的。由Shinagawa等人分离的膜结合D-山梨糖醇脱氢酶(E.Shinagawa，K.Matsushita，O.Adachi和M.Ameyama(农业与生物化学(Agric.Biol.Chem.)，46，135-141，1982))由三种亚基组成，其分子量为63,000、51,000和17,000。
在致力于提高产生2-KLG商业发酵的产量时，发明者在一株弱氧化葡糖杆菌中，鉴定了一种新的膜结合山梨糖醇脱氢酶，其不同于文献中描述的其它山梨糖醇脱氢酶(Choi，E.C.等人，欧洲微生物学会联合会微生物学快报(FEMS Microbiol.Lett.)，125；45(1995))。
                         发明概述
本发明涉及弱氧化葡糖杆菌的一种新的膜结合山梨糖醇脱氢酶。所分离的山梨糖脱氢酶包含三个亚基：75kDa的第一个亚基，其包含作为辅因子的吡咯并喹啉醌(PQQ)；50kDa的第二个亚基，其为细胞色素c；以及29kDa的第三个亚基，其在酶的稳定性和催化活性方面起着重要作用。
本发明提供了此处描述的葡糖杆菌属山梨糖醇脱氢酶的三个蛋白质亚基的核酸分子。在第一个具体的实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸分子，其涉及如SEQ ID NO：1所示的第一个SDH亚基(75kDa)。在第二个具体的实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸分子，其涉及如SEQ ID NO：2所示的第二个SDH亚基(50kDa)。在第三个具体的实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸分子，其涉及如SEQ ID NO：3所示的第三个SDH亚基(29kDa)。其它相关的实施方案涉及载体、其产生方法及携带该载体的宿主细胞。
本发明也提供了分离的核酸分子，其编码本发明之SDH的三个亚基。在一个具体的实施方案中，本发明提供了一个克隆的核酸分子，其编码75kDa和50kDa亚基。山梨糖醇脱氢酶第一个及第二个亚基的结构基因分别为2,265bp和1,437bp长，它们聚集在该克隆的核酸分子中，其中该克隆的核酸分子为显示操纵子特性的5.7kb PstI DNA片段。在另一个具体的实施方案中，本发明提供了一个克隆的核酸分子，其编码第三个(29kDa)SDH亚基之蛋白质。编码第三个亚基的结构基因为921bp长，且存在于4.5kb ClaI DNA片段中。其它相关的实施方案涉及载体、其产生方法及携带该载体的宿主细胞。
本发明也涉及此处描述的SDH之三个亚基的分离多肽。
本发明也提供了产生D-山梨糖的方法，其包括(a)用至少一种分离的核酸序列转化宿主细胞，其中分离的核酸序列选自：包含SEQ ID NO：1多核苷酸序列的多核苷酸；包含SEQ ID NO：2多核苷酸序列的多核苷酸；以及包含SEQ ID NO：3多核苷酸序列的多核苷酸；以及(b)选择并增殖该转化的宿主细胞。
本发明的另一个方面涉及产生2-KLG的方法，其包括(a)用至少一种分离的核酸序列转化宿主细胞，其中分离的核酸序列选自：包含SEQ IDNO：1多核苷酸序列的多核苷酸；包含SEQ ID NO：2多核苷酸序列的多核苷酸；以及包含SEQ ID NO：3多核苷酸序列的多核苷酸；以及(b)选择并增殖该转化的宿主细胞。
                       附图简述
图1表示使用pH5.0(A)和PH6.0(B)醋酸钠缓冲液的DEAE-TSK柱层析。
图2表示对DEAE-TSK柱层析法分离的峰I级分(A)和峰II级分(B)的SDS-PAGE分析。
图3表示使用pH6.5磷酸钠缓冲液的DEAE-TSK柱层析。
图4表示在pH6.5时用DEAE-TSK柱分离的峰I(列1)，峰II(列3)以及峰III(列2)柱级分的SDS-PAGE分析。列M表示分子量标准标记。
图5表示用胰蛋白酶消化峰II蛋白质后的HPLC层析谱，其中峰II蛋白质来自pH6.5时的DEAE-TSK柱层析。虚线代表流动相中乙腈的浓度梯度。
图6表示λGEM5-1的限制性酶切图谱。用作探针的1.53kb DNA片段(#SDH2-1)用实心条显示。
图7表示λGEM5-1中5.7kb PstI片段用不同组的限制性酶切后产生的S1、S2和S3 DNA片段的定位。
图8表示5.7kb PstI片段中的4,830个碱基的核苷酸序列(SEQ IDNO：7)。第一个和第二个亚基推断的氨基酸序列显示在核苷酸序列下。通过对纯化的山梨糖醇脱氢酶N-末端氨基酸测序而获得的氨基酸序列用下划线表示。信号序列切割位点用三角形标记。血红素结合序列用虚的下划线表示。潜在的核糖体结合序列(SD)封闭在框中。转录终止茎-环结构用箭头表示。第一个亚基基因完整的编码序列位于665-2,929处(SEQ IDNO：1)，其中信号序列位于665-766，且编码SDH第一个亚基成熟蛋白质的序列位于767-2,929(SEQ ID NO：22)。第二个亚基基因完整的编码序列位于2,964-4,400处(SEQ ID NO：2)，其中信号序列位于2,964-3,071，且编码SDH第二个亚基成熟蛋白质的序列位于3,072-4,400(SEQ IDNO：23)。
图9表示ClaI-#69的限制性酶切图谱。封闭框表示山梨糖醇脱氢酶第三个亚基基因的编码区。
图10表示包括山梨糖醇脱氢酶第三个亚基基因的DNA片段之核苷酸序列(SEQ ID NO：8)。推断的氨基酸序列显示在核苷酸序列下，信号序列切割位点用三角形标记。潜在的核糖体结合序列(SD)封闭在框中。第三个亚基基因完整的编码序列位于1,384-2,304处(SEQ ID NO：3)，其中信号序列位于1,384-1,461，且编码SDH第三个亚基成熟蛋白质的序列位于1,462-2,304(SEQ ID NO：24)。
                优选的实施方案详述
1、定义
克隆载体：质粒或噬菌体DNA或其它DNA序列，其可在宿主细胞中自主复制，并且其通过一个或少量几个限制性内切酶识别位点表征，在上述识别位点处，DNA序列以可决定的方式被切割但不丢失载体所必需的生物功能，并且可将DNA片段插入其中，引起该DNA片段的复制和克隆。该克隆载体可进一步包含标记，其适用于对克隆载体所转化之细胞的鉴定。标记例如，可提供四环素抗性或氨苄青霉素抗性。
表达：表达是从结构基因产生多肽的过程。该过程包括将基因转录为mRNA和将此mRNA翻译为多肽。
表达载体：类似于克隆载体的载体，但其在转化进宿主后可增强克隆于其中的基因的表达。克隆的基因通常置于(即有效连接于)某些控制序列(如启动子序列)的控制之下。启动子序列可为组成型的或可诱导型的。
基因：一段DNA序列，其包含表达蛋白质或多肽所需的信息。
宿主：任一原核或真核细胞，其为可复制的表达载体或克隆载体的接纳体。此处所用术语“宿主”也包括用公知的基因工程技术设计的原核或真核细胞，在其染色体或基因组上含有目标基因。此类宿主实例见Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第二版(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1989)。
同源的/非同源的：如果两个核酸分子的核苷酸序列相似性高于50％，则认为它们是“同源的”，这一点可通过HASH-编码算法确定(Wilber，W.J.和Lipman，D.J.，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)，80：726-730(1983))。如果两个核酸分子的核苷酸序列相似性低于50％，则认为它们是“非同源的”。
突变：如此处所用，该术语指目标核苷酸序列中单一碱基对的改变、插入、或删除。
诱变：如此处所用，该术语指在DNA中产生突变的过程。对于“随机”诱变，突变的确切位点是不可预测的，其可发生在微生物染色体的任一处，并且突变的发生是由试剂(如放射性)引起的物理损伤或化学处理的结果。
操纵子：如此处所用，该术语指细菌基因表达和调节的单位，包括DNA中的结构基因和调节元件。
亲代菌株：如此处所用，该术语指一株微生物菌株，其易于受到一些形式的诱变而产生本发明的微生物。
表型：如此处所用，该术语指依赖于微生物的遗传组成的、可观察到的物理特征。
启动子：一段DNA序列，其通常描述为基因的5’区，位于起始密码子邻近处。毗连基因的转录起始于启动子区。如果启动子是可诱导型启动子，那么诱导剂可提高转录速率；相反，如果启动子是组成型启动子，转录速率不受诱导剂调节。
重组宿主：根据本发明，重组宿主可为任一原核或真核细胞，其包含在表达载体或克隆载体上的目标克隆基因。该术语也包括那些经基因工程设计过的原核或真核细胞，在该有机体的染色体或基因组上包含目标基因。
重组载体：任一包含目标克隆基因的克隆载体或表达载体。
2、山梨糖醇脱氢酶的分离和纯化
使用一系列的柱层析步骤，本发明从弱氧化葡糖杆菌KCTC2111(韩国典型培养物保藏中心)2111(等同于ATCC 621)的胞浆膜分离和纯化SDH。提供了该纯化酶的生化特性，并且分离了每一个亚基，用氨基酸序列分析仪(Applied Biosystems，Model 477A)测定了每一个亚基的N-末端氨基酸序列。
不同于已报道的、来自弱氧化葡糖杆菌IFO 3254菌株的、FAD-依赖的SDH(Shinagawa，E等人，农业与生物化学，46：135(1982))，新表征的酶含有作为辅因子的吡咯并喹啉醌(PQQ)，且包含三个亚基(Choi，E.C.等人，欧洲微生物学会联合会微生物学快报，125；45(1995))。
本发明的SDH可用标准的蛋白质技术分离。简言之，在SYP培养基中(5％D-山梨糖醇、1％Bacto-Peptone、0.5％酵母提取物)培养弱氧化葡糖杆菌KCTC 2111，在10mM醋酸钠缓冲液(pH5.0)中裂解细胞。12,000g离心去除细胞碎片后，所得上清超离心以回收胞浆膜级分。用1.5％正辛基葡糖苷(Boehringer Mannheim)溶解胞浆膜级分，通过一系列的层析柱(包括CM-TSK 650(S)(Merck)、DEAE-TSK 650(S)(Merck)、Mono-S(Pharmacia)和Superose 12(Pharmacia))完成纯化。
所纯化的酶对多元醇具有活性，如D-山梨糖醇(100％)、D-甘露醇(68％)和D-核糖醇(70％)。当加入吡咯并喹啉醌(PQQ)时，酶活性增高达9倍，暗示PQQ是酶的辅因子；荧光谱分析确证纯化的酶包含吡咯并喹啉醌(PQQ)。纯化酶的吸收谱分析阐示该酶包含细胞色素c。当纯化的酶在pH4.3下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(Reisfeld，R.A.等人，自然(Nature)，195：281(1962))时，它在活性染色后的胶上形成一条单一的活性带。
纯化酶的最初SDS-PAGE分析显示该酶包含三个亚基，为75kDa、50kDa和14kDa，分别将它们命名为第一个亚基、第二个亚基和第三个亚基(Choi，E.C.等人，欧洲微生物学会联合会微生物学快报，125；45(1995))。然而在对该酶的进一步研究中，发现29kDa的另一个亚基对SDH的稳定性和催化活性起着很重要的作用。就是说：在研究一系列pH条件以增加DATE-TSK柱纯化过程中蛋白质的分离性能时发现，在pH5.0洗脱时部分分离的活性峰在pH6.0洗脱时完全分离为两个分别的活性峰。先洗脱的活性峰很快失去了酶活性，而后洗脱的活性峰仍然稳定。通过SDS-PAGE分析这两个峰，发现具稳定酶活性的峰除了包含75kDa和50kDa亚基外，还包含一个额外的29kDa亚基，而迅速失去酶活性的峰只包含75kDa和50kDa亚基。这个额外的29kDa亚基重命名为第三个亚基：在丙烯酰胺胶上将以前指定的第三个亚基(14kDa亚基)与其它亚基比较相对含量时，不能确定14kDa亚基是否是酶的一个真正亚基。也发现了将洗脱缓冲液的pH进一步增加至pH6.5会导致三个亚基完全分离为单个的亚基。
通过Ferric-Dupanol测定法(Wood，W.A.等人，酶学方法(Meth.Enzymol.)，5：287(1962))测试两个或三个亚基的不同组合对酶活性的恢复，发现只有存在29kDa的第三个亚基，酶活性才完全恢复。因此可得出结论：29kDa的第三个亚基在SDH的稳定性和催化活性方面起着重要的作用。
用D-山梨糖醇作为底物时，测定的米-曼氏常数为Km＝120mM，Vmax＝3.9×10-5M/分钟。二氯酚靛酚(DCIP)或高铁氰化物作为酶的电子受体可有效发挥作用。当加入吩嗪硫酸甲酯(PMS)作为电子传递体时，酶活性增加。加入钙或镁离子可显著增加纯化酶的活性，而加入铜离子可严重抑制酶的活性。
本发明之SDH酶的纯化和表征的进一步详述在实施例1中提供。
3、本发明的核酸分子
本发明提供分离的核酸分子，其编码此处描述的SDH酶三个亚基中的一个或多个亚基。设计用于操纵分离的核酸分子的方法和技术为本领域公知。例如，核酸分子的分离、纯化和克隆方法，以及描述真核和原核宿主细胞的使用和其中的核酸及蛋白质表达的方法和技术在Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第二版。冷泉港，纽约，1989，和分子生物学最新方法(Current Protocols in Molecular Biology)，FrederickM.Ausubel等人Eds.，John Wiley & Sons，Inc.，1987中描述，在此处公开引用作为参考。
更明确地，本发明提供了一些分离的核酸分子，其编码本发明之SDH酶单独的75kDa、50kDa和29kDa亚基蛋白质。另外，本发明提供了一些分离的核酸分子，其编码本发明之SDH酶的一个或多个亚基蛋白质。为了清楚起见，描述了本发明特定的分离核酸分子。然后，更加详细地描述了这些分离的核酸分子的特性和表征。
除非另外指出，此处通过测定DNA分子序列而得到的所有核苷酸序列是使用自动DNA测序仪(如Applied Biosystems，Inc.的Model 373A)测定的，并且由此处测定之DNA分子所编码多肽的所有氨基酸序列是通过翻译上述测定的DNA序列而预测的。因此，任何用这种自动方法测定的DNA序列、任何此处测定的核苷酸序列可能含有一些错误，这一点为本领域公知，自动化测定的核苷酸序列一般至少约90％，更一般至少约95％到至少约99.9％等同于被测序DNA分子的实际核苷酸序列。实际序列可通过其它方法更精确地测定，其中包括本领域公知的手工DNA测序法。与实际的序列相比，在测定的核苷酸序列中单碱基插入或删除会引起核苷酸序列的翻译移码，致使预测的、由测定的核苷酸序列编码的氨基酸序列自该插入或删除处开始完全不同于由被测序DNA分子编码的实际氨基酸序列，这一点也是本领域公知的。
在一个实施方案中，本发明提供了本发明之SDH酶第一个亚基(75kDa)的分离的核酸分子，其包含的多核苷酸序列选自(a)SEQ IDNO：1的多核苷酸；(b)一种多核苷酸片段，其为SEQ ID NO：1多核苷酸的至少约20个核苷酸长；(c)一种多核苷酸，其编码SEQ ID NO：4的氨基酸序列；以及(d)一种多核苷酸，其编码的片段为SEQ ID NO：4氨基酸序列的至少约10个氨基酸长。
在另一个实施方案中，本发明提供了本发明之SDH酶第一个亚基(75kDa)的分离的核酸分子，其包含的多核苷酸序列至少约95％等同于上述本发明之SDH酶第一个亚基(75kDa)的分离的核酸序列。
在本发明的另一个实施方案中，本发明提供了本发明之SDH酶第二个亚基(50kDa)的分离的核酸分子，其包含的多核苷酸序列选自(a)SEQID NO：2的多核苷酸；(b)一种多核苷酸片段，其为SEQ ID NO：2多核苷酸的至少约20个核苷酸长；(c)一种多核苷酸，其编码SEQ ID NO：5的氨基酸序列；以及(d)一种多核苷酸，其编码的片段为SEQ ID NO：5氨基酸序列的至少约10个氨基酸长。
在另一个实施方案中，本发明提供了本发明之SDH酶第二个亚基(50kDa)的分离的核酸分子，其包含的多核苷酸序列至少约95％等同于上述本发明之SDH酶第二个亚基(50kDa)的分离的核酸序列。
在本发明的另一个实施方案中，本发明提供了本发明之SDH酶第三个亚基(29kDa)的分离的核酸分子，其包含的多核苷酸序列选自(a)SEQID NO：3的多核苷酸；(b)一种多核苷酸片段，其为SEQ ID NO：3多核苷酸的至少约20个核苷酸长；(c)一种多核苷酸，其编码SEQ ID NO：6的氨基酸序列；以及(d)一种多核苷酸，其编码的片段为SEQ ID NO：6氨基酸序列的至少约10个氨基酸长。
在另一个实施方案中，本发明提供了本发明之SDH酶第三个亚基(29kDa)的分离的核酸分子，其包含的多核苷酸序列至少约95％等同于上述本发明之SDH酶第三个亚基(29kDa)的分离的核酸序列。
在本发明的另一个实施方案中，本发明提供了编码本发明之SDH酶第一个(75kDa)和第二个(50kDa)亚基蛋白质的分离的核酸分子，其包含的多核苷酸序列选自(a)SEQ ID NO：7的多核苷酸；以及(b)一种多核苷酸片段，其为SEQ ID NO：7多核苷酸的至少约20个核苷酸长。
在另一个实施方案中，本发明提供了本发明之SDH酶第一个(75kDa)和第二个(50kDa)亚基蛋白质的分离的核酸分子，其包含的多核苷酸序列至少约95％等同于本发明之SDH酶第一个(75kDa)和第二个(50kDa)亚基蛋白质的分离的核酸序列。
在本发明的另一个实施方案中，本发明提供了本发明之SDH酶第三个亚基(29kDa)的分离的核酸分子，其包含的多核苷酸序列选自(a)SEQID NO：8的多核苷酸；以及(b)一种多核苷酸片段，其为SEQ ID NO：8多核苷酸的至少约20个核苷酸长。
在另一个实施方案中，本发明提供了本发明之SDH酶第三个亚基(29kDa)的分离的核酸分子，其包含的多核苷酸序列至少约95％等同于上述本发明之SDH酶第三个亚基(29kDa)的分离的核酸序列。
“分离的”核酸分子是指DNA或RNA核酸分子，其已被从其天然环境移出。例如，包含在载体中的重组DNA分子被认为是为了本发明目的而分离的。分离的DNA分子之进一步的实例包括异源宿主细胞内存在的重组DNA分子或在溶液中的纯化(部分地或基本地)DNA分子。分离的RNA分子包括本发明之DNA分子的体内或体外RNA转录本。根据本发明之分离的核酸分子进一步包括合成产生的此类分子。
RNA载体也可应用于本发明所公开的SDH核酸分子。这些载体是基于正链或负链RNA病毒的，其在许多真核细胞中自然复制(Bredenbeek，P.J.和Rice，C.M.，病毒学(Virology)，3：297-310(1992))。这些病毒不像逆转录病毒，它们缺乏中间体DNA的生活周期相，完全以RNA形式存在。例如，用甲病毒作为外源蛋白质的表达载体，因为它们可应用于大范围的宿主细胞并且可提供高水平的表达；这类病毒的实例包括辛德比斯病毒(Sindbis virus)和无名森林病毒(Semliki Forest virus)(Schlesinger，S.，生物技术趋势(TIBTECH)11：18-22(1993)；Frolov，I.等人，美国国家科学院院报93：11371-11377(1996))。通过使用Invitrogen的辛德比斯表达系统，研究者在实验室可方便地以DNA形式维持重组分子(pSinrep 5质粒)，而以RNA形式增殖也是可行的。在用于表达的宿主细胞内，包含目标基因的载体完全以RNA形式存在，并且如果希望的话可以那种状态不断增殖。
在另一个实施方案中，本发明进一步提供了变体的核酸分子，其编码此处描述之分离的核酸分子的一部分、类似物或衍生物。变体包括那些通过核苷酸替换、删除或添加而产生的变体，其可涉及到一个或多个核苷酸。变体可为编码区、非编码区或两者中的改变。编码区的改变可产生保守的或不保守的氨基酸替换、删除或添加。
本发明之分离的核酸分子的变体可自然发生，如自然的等位基因变体，“等位基因变体”是指基因的一些交替形式之一，其中所述基因位于有机物染色体上的某个位点。基因II(Genes II)，Lewin，B.，ed.，John Wiley& Sons，纽约(1985)。非自然发生的变体可使用本领域公知的诱变技术产生。
本发明之分离的核酸分子也包括多核苷酸序列，其与此处描述的分离的核苷酸分子相比较95％、96％、97％、98％和99％是相同的。计算机程序如BestFit程序(威斯康星序列分析软件包(Wisconsin SequenceAnalysis Package)，Unix版本10，Genetics Computer Group，UniversityResearch Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711)可用于确定任一特定的核酸分子与此处公开的核苷酸序列或此处描述的保藏克隆之核苷酸序列是否至少有95％、96％、97％、98％和99％是相同的。BestFit使用Smith和Waterman的局部同源性算法，应用数学进展(Advances inApplied Mathematics)2：482-489(1981))，以发现两序列间的最佳同源片段。
例如，当计算机对比程序(如BestFit)用于确定与参照核苷酸序列具95％的同一性时，它是对参照核苷酸序列之全长来计算同一性百分率，并且允许参照序列之核苷酸总数中有高达5％的同源性差异。这样，所分析的每100个碱基对中，95％的同一性表示被测序列中每100个核苷酸中，有多达5个核苷酸与参照核苷酸序列不同。
本发明也包括此处描述的核苷酸序列片段和分离的核酸分子。在一个优选的实施方案中，本发明提供了至少20个碱基长的片段。此类片段的长度用数学易于定义。例如，SEQ ID NO：1提供了一种长为2,265个碱基的分离的核酸分子。至少20个碱基长的SEQ ID NO：1的片段(F1)可定义为F1＝20+X，其中X定义为0或从1至2,245之间的任一全整数。同样，此处描述的其它分离的核酸分子片段可如下定义：对于长为1,437个碱基的SEQ ID NO：2，至少20个碱基长的SEQ ID NO：2的片段(F2)可定义为F2＝20+X，其中X定义为0或从1至1,417之间的任一全整数。对于长为921个碱基的SEQ ID NO：3，至少20个碱基长的SEQ ID NO：3的片段(F3)可定义为F3＝20+X，其中X定义为0或从1至901之间的任一全整数。对于长为4,830个碱基的SEQ ID NO：7，至少20个碱基长的SEQ ID NO：7的片段(F7)可定义为F7＝20+X，其中X定义为0或从1至4,810之间的任一全整数。对于长为2,700个碱基的SEQ ID NO：8，至少20个碱基长的SEQ ID NO：8的片段(F8)可定义为F8＝20+X，其中X定义为0或从1至2,680之间的任一全整数。本领域技术人员将了解本发明之分离的核酸序列片段可为单链或双链分子。
本发明公开了分离的核酸分子，其编码本发明之SDH酶的三个亚基蛋白质。计算机分析提供了关于每一个亚基的开放读码框、推定的信号序列及成熟蛋白质形式的信息。编码第一个(75kDa)和第二个(50kDa)的基因完全包含在λGEM5-1克隆的一个5.7kb PstI片段中，在韩国典型培养物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures，KCTC)，韩国生物科学与生物技术研究所(Korea Research Institute of Bioscience andBiotechnology，KRIBB)，52，Oun-Dong，Yusong-Ku，Taejon 305-33，韩国，该克隆保藏在细菌中保藏号为KCTC 0593BP，以及作为DNA保藏的保藏号为KCTC 0597BP。第三个(29kDa)亚基基因包含在称为ClaI-#69中的一个4.5kb长的序列中，在韩国典型培养物保藏中心(KoreanCollection for Type Cultures，KCTC)，韩国生物科学与生物技术研究所(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology，KRIBB)，52，Oun-Dong，Yusong-Ku，Taejon 305-33，韩国，ClaI-#69保藏在细菌中的保藏号为KCTC 0594BP，以及作为DNA保藏的保藏号为KCTC0598BP。
这样，本发明提供了携带于新菌株KCTC 0593BP中的分离的核酸分子(KCTC 0597BP)，并且本发明也提供了携带于新菌株KCTC 0594BP中的分离的核酸分子(KCTC 0598BP)。
从λGEM5-1的5.7kb PstI片段获得的序列见图8，并命名为SEQ IDNO：7。第一个亚基基因完整的编码序列位于665-2,929处(SEQ IDNO：1)，其中信号序列位于665-766，且编码SDH第一个亚基成熟蛋白质的序列位于767-2,929(SEQ ID NO：22)。第二个亚基基因完整的编码序列位于2,964-4,400处(SEQ ID NO：2)，其中信号序列位于2,964-3,071，且编码SDH第二个亚基成熟蛋白质的序列位于3,072-4,400(SEQ IDNO：23)。
这样，本发明的另一个实施方案提供了分离的核酸分子，其衍生于图8中从λGEM5-1的5.7kb PstI片段获得的如SEQ ID NO：7所示的序列。此类分离的核酸分子包括以下核苷酸：(1)如SEQ ID NO：28所示的SEQ ID NO：7中1-644的核苷酸；(2)如SEQ ID NO：29所示的SEQ IDNO：7中50-644的核苷酸；(3)如SEQ ID NO：30所示的SEQ ID NO：7中100-644的核苷酸；(4)如SEQ ID NO：31所示的SEQ ID NO：7中150-644的核苷酸；(5)如SEQ ID NO：32所示的SEQ ID NO：7中200-644的核苷酸；(6)如SEQ ID NO：33所示的SEQ ID NO：7中250-644的核苷酸；(7)如SEQ ID NO：34所示的SEQ ID NO：7中300-644的核苷酸；(8)如SEQ ID NO：35所示的SEQ ID NO：7中350-644的核苷酸；(9)如SEQ ID NO：36所示的SEQ ID NO：7中400-644的核苷酸；(10)如SEQ ID NO：37所示的SEQ ID NO：7中450-644的核苷酸；(11)如SEQ ID NO：38所示的SEQ ID NO：7中500-644的核苷酸；(12)如SEQ ID NO：39所示的SEQ ID NO：7中550-644的核苷酸；(13)如SEQ ID NO：40所示的SEQ ID NO：7中600-644的核苷酸；(14)如SEQ ID NO：1所示的SEQ ID NO：7中665-2,929的核苷酸序列，其编码本发明的SDH之亚基1蛋白质的全长；(15)如SEQ IDNO：22所示的SEQ ID NO：7中767-2,929的核苷酸序列，其编码本发明的SDH之亚基1蛋白质的成熟形式；(16)如SEQ ID NO：2所示的SEQID NO：7中2,964-4,400的核苷酸序列，其编码本发明的SDH之亚基2蛋白质的全长；(17)如SEQ ID NO：23所示的SEQ ID NO：7中3,072-4,400的核苷酸序列，其编码本发明的SDH之亚基2蛋白质的成熟形式；(18)如SEQ ID NO：41所示的SEQ ID NO：7中2,930-2,963的核苷酸；(19)如SEQ ID NO：42所示的SEQ ID NO：7中4,401-4,451的核苷酸；(20)如SEQ ID NO：43所示的SEQ ID NO：7中4,401-4,501的核苷酸；(21)如SEQ ID NO：44所示的SEQ ID NO：7中4,401-4,551的核苷酸；(22)如SEQ ID NO：45所示的SEQ ID NO：7中4,401-4,601的核苷酸；(23)如SEQ ID NO：46所示的SEQ ID NO：7中4,401-4,651的核苷酸；(24)如SEQ ID NO：47所示的SEQ ID NO：7中4,401-4,701的核苷酸；(25)如SEQ ID NO：48所示的SEQ ID NO：7中4,401-4,751的核苷酸；(26)如SEQ ID NO：49所示的SEQ ID NO：7中4,401-4,801的核苷酸；以及(27)如SEQ ID NO：50所示的SEQ ID NO：7中4,401-4,830的核苷酸。
从ClaI-#69克隆中获得的序列见图10，并命名为SEQ ID NO：8。第三个亚基基因全部的编码序列位于1,384-2,304处(SEQ ID NO：3)，其中信号序列位于1,384-1,461，且编码SDH第三个亚基成熟蛋白质的序列位于1,462-2,304(SEQ ID NO：24)。
这样，本发明的另一个实施方案提供了分离的核酸分子，其衍生于图10中从ClaI-#69克隆中获得的如SEQ ID NO：7所示的序列。此类分离的核酸分子包括以下核苷酸：(1)如SEQ ID NO：51所示的SEQ IDNO：8中1-1,383的核苷酸；(2)如SEQ ID NO：52所示的SEQ ID NO：8中50-1,383的核苷酸；(3)如SEQ ID NO：53所示的SEQ ID NO：8中100-1,383的核苷酸；(4)如SEQ ID NO：54所示的SEQ ID NO：8中150-1,383的核苷酸；(5)如SEQ ID NO：55所示的SEQ ID NO：8中200-1,383的核苷酸；(6)如SEQ ID NO：56所示的SEQ ID NO：8中250-1,383的核苷酸；(7)如SEQ ID NO：57所示的SEQ ID NO：8中300-1,383的核苷酸；(8)如SEQ ID NO：58所示的SEQ ID NO：8中350-1,383的核苷酸；(9)如SEQ ID NO：59所示的SEQ ID NO：8中400-1,383的核苷酸；(10)如SEQ ID NO：60所示的SEQ ID NO：8中450-1,383的核苷酸；(11)如SEQ ID NO：61所示的SEQ ID NO：8中500-1,383的核苷酸；(12)如SEQ ID NO：62所示的SEQ ID NO：8中550-1,383的核苷酸；(13)如SEQ ID NO：63所示的SEQ ID NO：8中600-1,383的核苷酸；(14)如SEQ ID NO：64所示的SEQ ID NO：8中600-1,383的核苷酸；(15)如SEQ ID NO：65所示的SEQ ID NO：8中650-1,383的核苷酸；(16)如SEQ ID NO：66所示的SEQ ID NO：8中700-1,383的核苷酸；(17)如SEQ ID NO：67所示的SEQ ID NO：8中750-1,383的核苷酸；(18)如SEQ ID NO：68所示的SEQ ID NO：8中800-1,383的核苷酸；(19)如SEQ ID NO：69所示的SEQ ID NO：8中850-1,383的核苷酸；(20)如SEQ ID NO：70所示的SEQ ID NO：8中900-1,383的核苷酸；(21)如SEQ ID NO：71所示的SEQ ID NO：8中950-1,383的核苷酸；(22)如SEQ ID NO：72所示的SEQ ID NO：8中1,000-1,383的核苷酸；(23)如SEQ ID NO：73所示的SEQ ID NO：8中1,050-1,383的核苷酸；(24)如SEQ ID NO：74所示的SEQ ID NO：8中1,100-1,383的核苷酸；(25)如SEQ ID NO：75所示的SEQ ID NO：8中1,150-1,383的核苷酸；(26)如SEQ ID NO：76所示的SEQ ID NO：8中1,200-1,383的核苷酸；(27)如SEQ ID NO：77所示的SEQ ID NO：8中1,250-1,383的核苷酸；(28)如SEQ ID NO：78所示的SEQ ID NO：8中1,300-1,383的核苷酸；(29)如SEQ ID NO：79所示的SEQ ID NO：8中1,350-1,383的核苷酸；(30)如SEQ ID NO：3所示的SEQ ID NO：8中从1,384-1,461的核苷酸序列，其编码本发明之SDH亚基3蛋白质的全长；(31)如SEQ ID NO：24所示的SEQ ID NO：8中从1,462-2,304的核苷酸序列，其编码本发明之SDH亚基3蛋白质的成熟形式；(32)如SEQ ID NO：80所示的SEQ ID NO：8中2,305-2,355的核苷酸；(33)如SEQ ID NO：81所示的SEQ ID NO：8中2,305-2,405的核苷酸；(34)如SEQ ID NO：82所示的SEQ ID NO：8中2,305-2,455的核苷酸；(35)如SEQ ID NO：83所示的SEQ ID NO：8中2,305-2,505的核苷酸；(32)如SEQ ID NO：84所示的SEQ ID NO：8中2,305-2,555的核苷酸；(32)如SEQ ID NO：85所示的SEQ ID NO：8中2,305-2,605的核苷酸；(32)如SEQ ID NO：86所示的SEQ ID NO：8中2,305-2,655的核苷酸；以及(33)如SEQ ID NO：87所示的SEQ ID NO：8中2,305-2,700的核苷酸。
本发明也包括重组构建体，其包含上面概述的一个或多个序列。构建体包含载体(如质粒或病毒载体)，其中已正向或反向插入了本发明的序列。在该实施方案的一个优选的方面，构建体进一步包含调节序列，包括例如，与序列有效连接的启动子。大量合适的载体和启动子为本领域技术人员公知并可通过商业购买获得。以实例的方式提供下列载体：细菌的-pET(Novagen)、pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBs、phagescript、psiX174、pBlueScript SK、pBsKS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)；以及真核的pWLneo、pSV2cat、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。这样，可使用这些和任一其它质粒或载体，只要它们在宿主中可复制且能生存。
启动子区可选自使用具有选择性标记的CAT(氯霉素转移酶)载体或其它载体的任一目标基因。两个合适的载体为pKK232-8和pCM7。特定命名的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp。真核的启动子包括CMV立即早期、HSV胸腺嘧啶激酶、早期和晚期SV40、逆病毒的LTRs和小鼠金属硫蛋白-I。本领域一般的技术水平足以选择合适的载体和启动子。
在另一个实施方案中，本发明提供了产生此处描述之载体的方法，其包含：(a)将本发明之分离的核酸分子插入载体；以及(b)在宿主细胞中选择和增殖该载体。
合适宿主的代表性实例包括，但不限于，细菌细胞，如葡糖杆菌属、短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、大肠杆菌(E.coli)、链霉菌属、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、醋杆菌属、假单胞菌属(Pseudomonas)、假葡糖杆菌属(Pseudogluconobacter)、芽胞杆菌属、土壤杆菌属(Agrobacterium)细胞；真菌和酵母生物，包括酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、曲霉属(Aspergillus)和根霉属(Rhizopus)；昆虫细胞，例如果蝇属S2(Drosophila S2)和灰翅夜蛾属Sf9(Spodoptera Sf9)细胞；动物细胞例如CHO、COS和鲍斯黑色素瘤细胞(Bowes melanomacells)；以及植物细胞。上述宿主细胞的合适培养基和条件为本领域公知。
4.本发明的多肽
本发明提供了本发明之SDH酶的分离的多肽分子。设计用于操纵分离的多肽分子的方法和技术为本领域熟知。例如分离和纯化多肽分子的方法在蛋白质科学最新方法(Current Protocols in Protein Science)，JohnE.Coligan等人Eds.，John Wiley & Sons，Inc.，1997进行了描述，此处对其公开引用以作参考。
更明确地，本发明提供了一些分离的多肽分子，其编码本发明之SDH酶单独的75kDa、50kDa和29kDa亚基蛋白质。为了清楚起见，描述了本发明特定的分离的多肽分子。然后，更加详细地描述了这些分离的多肽分子的特性和表征。
在一个实施方案中，本发明提供了分离的多肽，其包含的多肽序列选自：(a)由SEQ ID NO：1的多核苷酸序列编码的多肽序列；(b)SEQ IDNO：4的多肽序列；以及(c)一种多肽，其为SEQ ID NO：4多肽序列的至少约10个氨基酸长。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的多肽，其包含的多肽序列选自：(a)由SEQ ID NO：2的多核苷酸序列编码的多肽序列；(b)SEQ IDNO：5的多肽序列；以及(c)一种多肽，其为SEQ ID NO：5多肽序列的至少约10个氨基酸长。
仍然在另一个实施方案中，本发明提供了分离的多肽，其包含的多肽序列选自：(a)由SEQ ID NO：3的多核苷酸序列编码的多肽序列；(b)SEQID NO：6的多肽序列；以及(c)一种多肽，其为SEQ ID NO：6多肽序列的至少约10个氨基酸长。
本发明的其它实施方案包括一种分离的多肽序列，其包含由分离的核酸序列SEQ ID NO：7编码的多肽；一种分离的多肽序列，其包含由分离的核酸序列SEQ ID NO：8编码的多肽；一种分离的多肽序列，其包含由KCTC保藏号No.0593BP中的DNA克隆编码的多肽；以及一种分离的多肽序列，其包含由KCTC保藏号No.0594BP中的DNA克隆编码的多肽。
此处所用术语“分离的多肽”是指从其天然环境移出的多肽。这样，产生和/或包含在重组的宿主细胞中的多肽被认为是为了本发明目的而分离的。从重组的宿主细胞部分地或基本地纯化的多肽也称为“分离的多肽”。
本发明的多肽包括天然纯化的产物、化学合成过程的产物、以及原核或真核宿主中通过重组技术产生的产物，其中原核或真核宿主包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。本发明的多肽可为糖基化的或非糖基化的，这取决于重组体生产过程中所使用的宿主。此外本发明的多肽也可含有起始的被修饰过的甲硫氨酸残基，在有些情况下这是宿主介导的加工的结果。
本发明的多肽也包括上述多肽的变体。术语“变体”包括自然的等位基因变异的多肽序列，其存在保守的或不保守的氨基酸替换、删除或添加。术语“变体”也包括那些经人工(通过公知的诱变技术或通过化学合成方法)而产生的分离的多肽序列。此类人为的变体包括存在保守的或不保守的氨基酸替换、删除或添加的多肽序列。
本领域技术人员熟知是否某个特定的氨基酸是保守的还是不保守的。保守氨基酸的替换不会显著影响蛋白质的折叠或活性。作为例子，表1列出了保守氨基酸替换的列表。
表1.保守氨基酸的替换
芳香族的 苯丙氨酸色氨酸酪氨酸
疏水的 亮氨酸异亮氨酸缬氨酸
极性的 谷氨酰胺天冬酰胺
碱性的 精氨酸赖氨酸组氨酸
酸性的 天冬氨酸谷氨酸
小分子的 丙氨酸丝氨酸苏氨酸甲硫氨酸甘氨酸
可通过本领域公知的方法鉴定本发明之蛋白质中对功能所必需的氨基酸，如定点诱变或丙氨酸-扫描诱变(Cunningham和Wells，科学(Science)244：1081-1085(1989))。
本发明之分离的多肽分子也包括这样的多肽序列，其与此处描述之分离的多肽分子相比较95％、96％、97％、98％和99％是相同的。计算机程序如BestFit程序(威斯康星序列分析软件包(Wisconsin SequenceAnalysis Package)，Unix版本10，Genetics Computer Group，UniversityResearch Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711)可用于确定任一特定的多肽分子与此处公开的多肽序列或此处描述的保藏克隆之分离的DNA分子所编码的多肽序列是否至少有95％、96％、97％、98％和99％是相同的。BestFit使用Smith和Waterman的局部同源性算法，应用数学进展2：482-489(1981))，以发现两序列间的最佳同源片段。
例如，当计算机对比程序(如BestFit)用于确定与参照多肽序列具95％的同一性时，它是对参照多肽序列之全长来计算同一性百分率，并且允许参照序列之氨基酸总数中有高达5％的同源性差异。这样，所分析的每100个氨基酸中，95％的同一性表示被试序列的每100个氨基酸中，有多达5个氨基酸与参照多肽序列不同。
本发明也包括此处描述的多肽序列片段和分离的多肽分子。在一个优选的实施方案中，本发明提供了至少10个氨基酸长的片段。此类片段的长度用数学易于定义。例如，SEQ ID NO：4提供了一种长为754个氨基酸的分离的多肽分子。至少10个氨基酸长的SEQ ID NO：4的片段(F4)可定义为F4＝10+X，其中X定义为0或从1至744之间的任一全整数。同样，此处描述的其它分离的多肽分子片段可如下定义：对于长为478个氨基酸的SEQ ID NO：5，至少10个氨基酸长的SEQ ID NO：5的片段(F5)可定义为F5＝10+X，其中X定义为0或从1至468之间的任一全整数。对于长为306个氨基酸的SEQ ID NO：6，至少10个氨基酸长的SEQID NO：6的片段(F6)可定义为F6＝10+X，其中X定义为0或从1至296之间的任一全整数。
本发明特别优选的实施方案提供了如下的分离的多肽：(1)本发明之SDH亚基1的全长多肽，其由分离的核酸分子SEQ ID NO：1编码并鉴定为SEQ ID NO：4；(2)本发明之SDH亚基2的全长多肽，其由分离的核酸分子SEQ ID NO：2编码并鉴定为SEQ ID NO：5；(3)本发明之SDH亚基3的全长多肽，其由分离的核酸分子SEQ ID NO：3编码并鉴定为SEQ ID NO：6；(4)本发明之SDH亚基1多肽的成熟形式，其由分离的核酸分子SEQ ID NO：22编码并鉴定为SEQ ID NO：25；(5)本发明之SDH亚基2多肽的成熟形式，其由分离的核酸分子SEQ ID NO：24编码并鉴定为SEQ ID NO：26；以及本发明之SDH亚基3多肽的成熟形式，其由分离的核酸分子SEQ ID NO：23编码并鉴定为SEQ ID NO：27。
本发明也提供了产生多肽的方法，其包括：(a)含有SEQ ID NO：2的分离的核酸分子或其变体的宿主细胞的生长；(b)表达由该分离的核酸分子编码的多肽；以及(c)分离该多肽。
在另一个实施方案中，本发明也提供了产生多肽的方法，其包括：(a)含有SEQ ID NO：1的分离的核酸分子或其变体的宿主细胞的生长；(b)表达由该分离的核酸分子编码的多肽；以及(c)分离该多肽。
本发明提供的另一个过程是为了产生多肽，其包括：(a)含有SEQ IDNO：3的分离的核酸分子或其变体的宿主细胞的生长；(b)表达由该分离的核酸分子编码的多肽；以及(c)分离该多肽。
合适宿主的代表性实例包括，但不限于，细菌细胞如葡糖杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属、大肠杆菌、链霉菌属、鼠伤寒沙门氏菌、醋杆菌属、假单胞菌属、假葡糖杆菌属、芽胞杆菌属、土壤杆菌属细胞；真菌和酵母生物包括酵母属、克鲁维酵母属、曲霉属和根霉属；昆虫细胞例如果蝇属S2和灰翅夜蛾属Sf9细胞；动物细胞例如CHO、COS和鲍斯黑色素瘤细胞；以及植物细胞。上述宿主细胞的合适培养基和条件为本领域公知。
多肽可以修饰形式表达(如融合蛋白质)并且不仅可包含分泌信号，还可包含额外的异源功能区。例如，额外的氨基酸区(特别是带电荷氨基酸)可加至多肽的N-末端，以提高在纯化过程中，或接下来的处理和贮存过程中多肽在宿主细胞中的稳定性和持久性。肽部分也可加至多肽上以利于纯化。这些区可在多肽的最后制备前去除。向多肽添加肽部分以引起分泌或排泄、提高稳定性以及促进纯化等是本领域熟悉的和常规的技术。
从重组的细胞培养物中，用熟知的方法可回收并纯化本发明的多肽，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。最优选地，使用高效液相色谱法(“HPLC”)纯化。
5.L-山梨糖和2-酮-L-古洛糖酸的产生
本发明提供了产生L-山梨糖和2-酮-L-古洛糖酸的方法，它们对维生素C的产生是有用的。
在一个实施方案中，本发明提供了从D-山梨糖醇产生L-山梨糖的方法，其包含：(a)用至少一种分离的核苷酸序列转化宿主细胞，其中分离的核苷酸序列选自：(i)一种包含SEQ ID NO：1多核苷酸序列的多核苷酸；(ii)一种包含SEQ ID NO：2多核苷酸序列的多核苷酸；以及(iii)一种包含SEQ ID NO：3多核苷酸序列的多核苷酸；以及(b)选择并增殖该转化的宿主细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了2-酮-L-古洛糖酸的产生方法，其包含：(a)用至少一种分离的核苷酸序列转化宿主细胞，其中分离的核苷酸序列选自：(i)一种包含SEQ ID NO：1多核苷酸序列的多核苷酸；(ii)一种包含SEQ ID NO：2多核苷酸序列的多核苷酸；以及(iii)一种包含SEQ ID NO：3多核苷酸序列的多核苷酸；以及(b)选择并增殖该转化的宿主细胞。
在此处提供的方法中，为产生L-山梨糖和2-酮-L-古洛糖酸所使用的作为宿主细胞的合适的细菌为本领域技术人员共知，这些细菌包括，但不限于，大肠杆菌、短杆菌属、棒杆菌属、葡糖杆菌属、醋杆菌属、假单胞菌属和假葡糖杆菌属。
表达本发明之SDH酶的其它宿主细胞包括：在美国专利No.5,834,231中鉴定的菌株；氧化葡糖杆菌DSM 4025(美国专利No.4,960,695)；氧化葡糖杆菌TIOO(应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63：454-460(1997))；Pseudogluconobacter saccharoketogenes IFO 14464(欧洲专利No.221 707)；Pseudomonas sorbosoxidans(美国专利No.4,933,289)；和液化醋杆菌(Acetobacter liquefaciens)IFO 12258(应用与环境微生物学61：413-420(1995))。
在本发明的其它实施方案中，本领域公知的许多发酵技术可应用于本发明之涉及L-山梨糖和2-酮-L-古洛糖酸的产生的过程中。一般地，L-山梨糖和2-酮-L-古洛糖酸可通过发酵方法产生，如分批型发酵或属于补料分批型的发酵。分批型发酵时，在发酵一开始即加入所有的营养物。补料分批或持续补料分批型发酵时，不断向培养物中补充一种或多种营养物，其中营养物从发酵刚好开始时、或在培养物达到了某个时期后、或当培养液中补加的营养物消耗完了时补充。属于补料分批型发酵中的一系列持续分批发酵为反复的补料分批或填充-取出发酵，其在继续供给营养物的同时，于某些时候例如，当发酵罐满了时，取走发酵罐内容物的一部分。发酵以这种方式可持续较长时间。
另一种发酵类型(连续发酵或恒化培养)连续供给完全培养基，同时连续或半连续地取出培养液，以这种方式使发酵罐中液体培养基之体积维持大体上恒定。连续发酵原则上可维持无限长的时间。
分批发酵时，在培养物中必需营养物之一消耗尽之前，或者在发酵条件变得不利(例如pH降至某个抑制微生物生长的值)之前，有机体可生长。补料分批发酵时，通常使用方法来维持有利的生长条件(例如通过使用pH控制)，并且通过向培养物中供给一种或多种营养物以防止这些营养物耗尽。微生物将继续生长，其生长速率用营养补料的速率表示。通常单一的营养物(经常为碳源)会成为对生长的限制。同样的原理适用于连续发酵，通常在培养基补料中一种营养物是限制的，所有其它营养物是过量的。限制的营养物将以很低浓度(往往低得检测不到)存在于培养液中。可使用不同类型的营养物限制。碳源限制是最常用的。其它实例为通过氮源限制、通过氧限制、通过一种特定的营养物如维生素或氨基酸限制(在微生物对这样一个化合物是营养缺陷的情况下)、通过硫磺限制和通过含磷物限制。
合适的追加碳源的阐明性实例包括但不限于：其它糖类如葡萄糖、果糖、D-甘露醇、淀粉或淀粉水解物、纤维素水解物以及糖蜜；有机酸如乙酸、丙酸、乳酸、蚁酸、苹果酸、柠檬酸和延胡索酸；以及醇类如丙三醇。
合适的氮源的阐明性实例包括但不限于：氨，包括氨气和氨水；无机酸或有机酸的胺盐，如氯化铵、硝酸铵、磷酸铵、硫酸铵和醋酸铵；尿素；硝酸盐或亚硝酸盐，以及其它含氮物质，包括纯的或粗制备之氨基酸、肉膏、蛋白胨、鱼粉、鱼水解物、玉米浆、酪蛋白水解物、大豆饼水解物、酵母提取物、干酵母、乙醇-酵母馏出物、大豆粉、棉籽粉等。
合适的无机盐的阐明性实例包括但不限于：钾盐、钙盐、钠盐、镁盐、锰盐、钴盐、锌盐、铜盐以及其它超微量元素的盐和磷酸盐。
合适的痕量营养物、生长因子等的阐明性实例包括，但不限于：辅酶A、泛酸、生物素、硫胺素、核黄素、盐酸吖啶黄单核苷酸、盐酸吖啶黄腺嘌呤二核苷酸、其它的维生素、氨基酸(如半胱氨酸)、硫代硫酸钠、对氨基苯甲酸、烟酰胺等，它们以纯的或部分纯化的化学化合物，或者于天然物质中存在。本发明之微生物菌株的培养可使用任一本领域技术人员公知的浸没发酵技术(如气升式发酵)、传统的喷射搅拌设计或者振摇培养来进行。
所使用的培养条件(包括温度、pH、通气速率、搅拌速率、培养持续时间等)可通过一个本领域技术人员靠经验决定，以使L-山梨糖和2-酮-L-古洛糖酸的产量最高。特定培养条件的选择取决于以下因素，如使用特定发明的微生物菌株、培养基组成和类型、培养技术以及类似考虑。
合适的回收2-KLG的方法之阐明性实例在美国专利Nos.5,474,924；5,312,741；4,960,695；4,935,359；4,877,735；4,933,289；4,892,823；3,043,749；3,912,592；3,907,639和3,234,105中描述。
根据上述方法之一，首先通过公知的方法(如离心或过滤)从培养液中去除微生物，并且将所得的溶液真空浓缩。然后通过过滤获得结晶的2-KGL，并且如果希望的话，通过重结晶纯化。同样地，2-KGL可通过公知的方法获得，如离子交换树脂、溶剂提取、沉淀、盐析等方法。
当2-KGL以游离酸形式获得时，可使用传统方法如所希望地将其转换为盐，与钠、钾、钙、氨或类似阳离子形成的盐。另外，当2-KGL以盐的形式回收时，可使用传统方法将它转换为其游离形式或转换为其它盐。
此处引用的所有专利和出版物作为参考。现在已总体上描述了本发明，通过参考下列以例证方式提供的实施例，本发明将更易理解，并且除非特别说明，它们不用于限制本发明。
实施例
                   实施例1
从弱氧化葡糖杆菌KCTC 2111分离并表征SDH
给出了从弱氧化葡糖杆菌KCTC 2111纯化本发明之吡咯并喹啉醌(PQQ)-依赖的SDH的改良方法。相对于最初的纯化方案(Choi，E.S.等人，欧洲微生物学会联合会微生物学快报，125：45(1995))，改进涉及到对亚基的分辨率变大以及酶活性的稳定性提高。
步骤1：弱氧化葡糖杆菌KCTC 2111的培养
将弱氧化葡糖杆菌KCTC 2111接种于5ml SYP培养基(5％D-山梨糖醇、1％Bacto蛋白胨和0.5％酵母提取物)并且于30℃培养20小时。取1毫升(ml)此培养物，转移至500ml烧瓶中的50ml同样的培养基中，于旋转式摇瓶机上30℃培养20小时(180转/分钟)。这样制备的培养物用作5L罐式发酵器的接种物，其中含有3L同样的培养基，将这3L培养物生长至早期稳定期。
步骤2：膜级分的制备
于12,000g离心10分钟收获细胞，用10mM醋酸钠缓冲液(pH5.0)洗一次，并且在珠搅拌器(Edmund Buhler，Vi4)中用玻璃珠(直径为0.1mm)于4℃破碎90秒。如此制备的匀浆物于12,000g离心5分钟，以去除细胞碎片和玻璃珠。所得到的上清于100,000g离心60分钟，可获得沉淀形式的粗膜级分。
步骤3：从膜级分中溶解SDH
以40mg蛋白质/ml 1.5％正辛基葡糖苷重悬并溶解粗膜级分，于4℃搅拌2小时。所得的悬液于12,000g离心10分钟，给出上清，称之为溶解的SDH级分。在纯化过程中使用的所有溶液包含0.75％正辛基葡糖苷。
步骤4：酶活性测定
以二氯酚靛酚(DCIP)作为人工电子受体，并以吩嗪硫酸甲酯(PMS)作为电子传递体，用分光光度法测定酶活性。反应混合物含有50mM醋酸钠缓冲液(pH5.0)、10mM MgCl2、5mM CaCl2、5mM KCN、0.1mMPMS、0.12mM DCIP、250mM D-山梨糖醇、0.75％n-辛基葡糖苷和酶溶液，总体积为1.0ml。使用pH5.0时DCIP的摩尔消光系数ε＝5,600cm-1M-1。酶活性的一个单位定义为：每分钟酶催化减少1μmol DCIP的量。
也可用Ferric-Dupanol法(Wood，W.A.等人，酶学方法，5：287(1962))测定实施例1步骤6描述的重建亚基的酶活性。单一的或者不同组合的亚基蛋白质于25℃预温育5分钟。加入10mM(终浓度)高铁氰化钾和250mM(终浓度)D-山梨糖醇开始反应。一段合适的时间后，加入硫酸铁-月桂硫酸钠溶液(Fe2(SO4)3·nH2O 5g/L、月桂硫酸钠3g/L和85％的磷酸95ml/L)终止反应，并且用分光光度计于660nm处测定普鲁士色的吸收。
步骤5：离子-交换层析法
溶解的级分上样于经10mM醋酸钠(pH5.0)平衡过的CM-TSK 650(S)(Merck)柱(2.5×20cm)。用醋酸钠线性梯度(从10mM至500mM)洗脱CM-TSK柱。合并活性级分并用膜滤器(Amicon，YM10)超滤浓缩，然后上样于DEAE-TSK650(S)(Merck)柱(2.5×20cm)。DEAE-TSK柱用pH5.0或pH6.0的10mM醋酸钠(pH5.0)无梯度洗脱。
如图1所示，于pH6.0洗脱时(图1-B)，活性峰的分辨率远高于pH5.0的洗脱(图1-A)，且酶活性峰I和II完全分开。洗脱后立即测量级分的酶活性，以及洗脱后1小时测量级分的酶活性，发现pH5.0时一同洗脱下来的峰I和II级分的酶活性随着时间的变化没有明显的不同。然而对于pH6.0时分别洗脱下来的峰I和II级分，峰I的酶活性在洗脱后1小时内降至小于最初值的十分之一，而峰II的酶活性仍然不变。
SDS-PAGE(Laemmli，U.K.，自然(nature)，227，680(1970))分析DEAE-TSK柱于pH6.0时洗脱下来的包含峰I和II的级分(图2)。图2-A显示峰I的级分。列M显示标准的分子量标记。如列1至4所示，可观察到75kDa的第一个亚基条带和50kDa的第二个亚基条带，但没有观察到29kDa的第三个亚基条带。在这种条件下，洗脱后1小时，酶活性减少十倍多。图2-B显示峰II的级分。列M显示标准的分子量标记。如列5至8所示，可观察到峰II级分除了包含75kDa和50kDa的亚基外，还包含29kDa的第三个亚基条带。该观察表明29kDa的第三个亚基可能在SDH的稳定性方面起着重要作用。
步骤6：用不同亚基重建SDH
因为在DEAE柱层析中，将洗脱缓冲液的pH从5.0增加至6.0可提高层析峰的分辨率，故将洗脱缓冲液的pH进一步增至6.5。如实施例1步骤5所述的、经CM-TSK 650(S)柱层析得到的、部分纯化SDH上样于用20mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)预平衡的DEAE-TSK 650(S)柱(2.5×16.5cm)，并且用180ml同一缓冲液无梯度洗脱，然后用20mM和500mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)各160ml进行梯度洗脱。SDS-PAGE分析柱级分。
如图3所示，在无梯度洗脱过程中，75kDa的第一个亚基最先洗脱(峰I)，然后是29kDa的第三个亚基(峰II)，并且在梯度洗脱过程中，50kDa的第二个亚基稍后洗脱(峰III)。如图4所示，这三个峰的SDS-PAGE分析表明这三个亚基基本上是纯的，并且相互间完全分开。
由于在非变性条件下，三个亚基可被纯化并分离为单一的种类，故进行了重建实验以确定每个亚基在SDH酶催化活性中的作用。将pH6.5时从DEAE柱洗脱的每个亚基约100pmol，或单独或以不同组合预孵育，用实施例1步骤4描述的Ferric-Dupanol法测定酶活性(表2)。单独的每个亚基显示极低水平的酶活性。当第一个亚基和第二个亚基重建时，与单独的第一个亚基相比较，酶活性提高了2倍。向第一个亚基中以及第一个和第二个亚基的混合物中加入第三个亚基时，酶活性分别提高了30倍和20倍，这些结果表明第三个亚基对SDH的催化活性及该酶的稳定性起着重要作用。
表2
  亚基(kDa)   SDH酶活性(OD660)
  75   0.029
  50   0.002
  29   0.004
  75+50   0.051
  75+29   0.944
  75+50+29   0.692
                       实施例2
             SDH亚基N-末端氨基酸序列的测定
对实施例1制备的纯化SDH进行SDS-PAGE(12.5％凝胶)，并将分离的蛋白质电印迹至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Bollag，D.M.和Edelstein，S.J.，蛋白质方法(Protein Methods)，Wiley-Liss，Inc.，8(1991))。丽春红S染色观察后，将含有每个SDH亚基的膜部分切成片，并且每个亚基的膜片直接用氨基酸序列分析仪(Applied Biosystems，Model 477A)分析N-末端氨基酸序列。
表3显示了所得到的第一个和第三个亚基的数据(SEQ ID Nos：9和11)。没有得到第二个亚基的N-末端氨基酸序列，很可能因为存在封闭的N-末端。封闭的N-末端的类似发现已有报道，其为另一个醋酸菌Acetobacter pasteurianus(Takemura，H.等人细菌学杂志(J.Bacteriol.)，175，21，6857(1993))的乙醇脱氢酶复合体之细胞色素c亚基，其中将N-末端的封闭归因于N-末端谷氨酸残基被修饰为焦谷氨酸残基，在对N-末端氨基酸测序时后者抗Edman降解。
因此，为了得到纯化的SDH之第二个亚基的N-末端序列，对分离的SDH蛋白质首先用焦谷氨酸氨肽酶处理，以释放出潜在的被封闭N-末端。简而言之，将实施例1纯化的SDH约50pg溶解于消化缓冲液(100mM磷酸钠缓冲液、10mM EDTA、5mM二硫苏糖醇和5％(v/v)甘油，pH8.0)，并与3.75g焦谷氨酸氨肽酶(Boehringer Mannheim)4℃温育18小时，然后于25℃额外温育4小时。温育后，将反应混合物进行SDS-PAGE，电印迹至PDVF膜，并切下膜上的第二个亚基条带，然后如上所述分析N-末端氨基酸序列。在表3中SEQ ID NO：10显示了N-末端氨基酸序列的10个残基。
             表3
 序列ID号  N-末端氨基酸序列
 SEQ ID NO：9  EDTGTAITNADQHPG
 SEQ ID NO：10  DADDALIQRG
 SEQ ID NO：11  AGTPLKIGVSFQEMNNPYFVTMKDA
                          实施例3
               第三个亚基内部氨基酸序列的测定
对于第三个亚基，除测定了其N-末端氨基酸序列外，还测定其内部氨基酸序列，以促进相应基因的克隆。按以前所述方法(Matsudaira，P.T.，实用微测序蛋白质和肽纯化指导(A Practical Guide to Protein and PeptPurification for Microsequencing)，学术出版社(Academic Press)p.37(1989))，将如实施例1步骤6所述分离的约7μg第三个亚基用胰蛋白酶(Boehringer Mannheim)消化，。用Brownlee SPHERI-5 RP 18柱(0.2×22cm)通过HPLC分离胰蛋白酶消化物，并将该柱用15-70％乙腈以210微升/分钟进行60分钟的线性梯度洗脱。214nm处监测洗脱物，并收集分离得好的三个肽峰(图5中表示为1、5和7)并且如(实施例2)所述分析它们的氨基酸序列。表4中，峰1、5和7的内部氨基酸序列显示如下(分别为SEQ ID NO：12、13和14)。
             表4
序列ID号   内部氨基酸序列
SEQ ID NO：12   HSDIK
SEQ ID NO：13   NYDAGFK
SEQ ID NO：14   KWGAGVPK
                      实施例4
含有SDH基因之一部分的1.53kb DNA片段的引物设计和分离
根据第一个亚基的N-末端氨基酸序列(SEQ ID NO：9)，合成两条简并引物，引物1(5’-CCGGAATTCGAA(G)GAT(C)ACIGGIACIGC-3’)(SEQ ID NO：15)和引物2(5’-ATT(C，A)ACIAAT(C)GCIGAT(C)CAA(G)CAT(C)CC-3’)(SEQ ID NO：16)。
用Takeda和Shimizu法(Takeda和Shimizu，发酵生物工程杂志，72；1(1991))分离的弱氧化葡糖杆菌KCTC 2111基因组DNA用BamHI部分消化。质粒pBluescript SK(Stratagene)用NaeI和BamHI限制性酶切，并将基因组DNA的BamHI部分消化产物连接至质粒的BamHI位点。
按照单特异引物PCR(SSP-PCR)法(White，B.，SSP-PCR和基因组步移(SSP-PCR and genome walking)，《分子生物学方法，PCR法》(Method in Mol.Biol.，PCR protocols)，Humana Press，15：339(1993))进行30个循环的聚合酶链反应(PCR)，以分离大小为1.53kb的克隆(#SDH2-1)。
如上制备的连接反应混合物用基因特异性引物(引物1)和T7引物扩增。虽然属的T7引物可与所有被连接片段的末端退火，而所得的产物只呈线性增长。但是，将基因特异性引物1和T7引物与特异性产物同时退火会导致特异性一级产物呈指数扩增。用巢式引物(基因特异性引物2)和T7引物进行二级PCR可产生特异性二级产物，其进一步证实了一级PCR的特异性。
将PCR产物连接至质粒pT7 Blue(Novagen)，并且用SEM法(Inoue，H.等人，基因，96：23(1990))转化大肠杆菌DH5α。于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中(1％Bacto-Tryptone、0.5％酵母提取物和1％NaCl)培养转化子。然后，用碱裂解法提取质粒(Sambrook，J.等人，分子克隆，CSH Press，p.125(1988))。
以这个质粒作为模板，用引物1或者引物2与T7引物进行PCR，产生阳性反应。#SDH2-1片段的部分核苷酸测序进一步证实了引物1结合位点下游推导出的氨基酸序列与实验测定的N-末端氨基酸序列相匹配。但#SDH2-1只包含第一个亚基基因的一部分。
                          实施例5以1.53kb DNA片段作为探针，分离包含SDH亚基基因的λGEM5-1克隆
用DIG标记和检测试剂盒Kit(使用DIG系统进行滤膜杂交的用户指南(The DIG System User’s Guide for Filter Hybridization)，p.6-9，Boehringer Mannheim(1993))标记实施例4分离的#SDH2-1。
为了构建弱氧化葡糖杆菌KCTC 2111的基因组DNA文库，将按照实施例4所述方法从弱氧化葡糖杆菌KCTC 2111分离的基因组DNA用Sau3A I部分消化。部分消化的DNA于0.8％的琼脂糖凝胶电泳，用QLAEXII Gel提取试剂盒(QIAGEN)洗脱大小在15至23kb的DNA。然后，将洗脱的DNA连接至λGEM-11载体(Promega)的BamHI位点。根据指导手册，用Packagene体外包装体系(Promega)将连接混合物包装入噬菌体λ颗粒。大肠杆菌LE392细胞30℃生长于含0.2％麦芽糖和10mM MgSO4的TB培养基(1％Bacto-Tryptone和0.5％NaCl)中，当OD600达到0.6后存贮在4℃。将包装混合物加入细胞悬液，并将该混合物于37℃温育30分钟，以引起感染。向这个混合物中加入3ml融化的(45℃)TB顶层琼脂(在含10mM MgSO4的TI3培养基中有0.8％Bacto-Agar)，轻轻涡旋并立即倒于LB平板上。平板于37℃倒置温育过夜。
将λ噬菌斑固定于尼龙膜(Amersham)，并用预杂交液(5×SSC，1％(w/v)封闭试剂、0.1％N-十二烷基肌氨酸、0.02％SDS和50％(v/v)甲酰胺)在杂交炉中(Hybaid)对膜进行预杂交，42℃，3小时。然后用杂交液(用预杂交液稀释的、DIG-标记的#SDH2-1探针)进行膜杂交，42℃，16小时。通过DIG-标记的#SDH2-1探针的噬菌斑杂交(使用DIG系统进行滤膜杂交的用户指南。Boehringer Mannheim(1993))，在约20,000个λ噬菌体的噬菌斑中有11个噬菌斑给出阳性信号。
从阳性λ克隆分离λDNAs，并用λDNA纯化试剂盒(Stratagene)纯化。分离的λDNAs用BamHI消化，并进行0.7％琼脂糖凝胶电泳。将凝胶上分离的DNA片段转移至尼龙膜，并如上述同样的条件下，用#SDH2-1作为探针，再次进行Southern杂交分析。选择了一个给出阳性信号的克隆，并用XhoI从克隆中切下15kb的插入DNA，然后将其克隆入pBluescript SK的XhoI位点，得到λGEM5-1。用一些不同的限制性酶消化，绘制λGEM5-1克隆的图谱。
                  实施例6
λGEM5-1克隆中5.7kb PstI片段核苷酸序列的测定
实施例5获得的阳性克隆，λGEM5-1，用一些不同的限制性酶消化，绘制图谱，并且如实施例5所述进行Southern杂交分析。一个与#SDH2-1杂交的5.7kb PstI片段被亚克隆，并且测定了其核苷酸序列。为了使DNA测序简单化，用限制性酶组：KpnI-PstI、NotI-SacII和PstII-SacI分别构建了三个重叠的亚克隆：S1、S2和S3，如图7所示。用ExoIII-Mungbean缺失试验盒(Stratagene)对每一个亚克隆制备了一系列的删除克隆。用染料末端终止循环测序方便反应试剂盒(AppliedBiosystems)进行核苷酸测序反应，并于自动的DNA测序仪(AppliedBiosystems，Model 373A)测定序列。
图8显示了5.7kb PstI片段中4,830bp的核苷酸序列(SEQ IDNO：7)。测序的DNA包含两个开放读码框(ORFs)，分别具有2,265个核苷酸和1,437个核苷酸。第一个ORF编码第一个亚基。第一个亚基基因前为SD序列，“AGGA”位于651-654bp。第一个亚基的34个氨基酸信号序列位于SEQ ID NO：7的665-766bp。第一个亚基蛋白质成熟部分的编码序列位于SEQ ID NO：7的767-2,929bp，其编码720个氨基酸的多肽，推导出的N-末端氨基酸序列与通过N-末端氨基酸序列分析而得到的15个氨基酸残基正好一致。
第二个ORF接在第一个ORF后，这两个ORF被一个短的基因间隔区隔开。第二个ORF编码第二个亚基。第二个亚基基因的SD序列(AGGA)位于SEQ ID NO：7的2,950-2,953bp，并且结构基因位于SEQID NO：7的2,964-4,400bp。第二个亚基基因编码478个氨基酸的多肽，其中包括36个氨基酸的信号序列。推导出的成熟多肽的氨基酸序列与将样品用焦谷氨酸氨肽酶处理后通过实验所获得的序列完全匹配。第二个亚基基因终止密码子的下游发现了反转重复序列。
第一个和第二个亚基成熟蛋白质的计算分子量分别为79kDa和48kDa，其分别与SDS-PAGE测定的实验值75kDa和50kDa相一致。
此外，也发现了出现在第一个亚基中的特征PQQ-结合序列，共有序列表征性地出现在PQQ-依赖的脱氢酶的氨基和羧基末端。表5中，存在于氨基末端部分的特征PQQ-结合序列显示为SEQ ID NO：17，存在于羧基末端部分的特征序列显示为SEQ ID NO：18(此处，X表示任意氨基酸)。氨基末端特征序列位于812-898bp，羧基末端序列位于1,490-1,555bp。这些数据提供了额外证据证明第一个亚基包含作为辅因子的吡咯并喹啉醌(PQQ)。
          表5
    [SEQ ID NO：17][D/E/N]-W-X-X-X-G-[R/K]-X-X-X-X-X-X-[F/Y/W]-S-X-X-X-X-[L/I/V/M]-X-X-X-N-X-X-X-L-[R/K]
    [SEQ ID NO：18]W-X-X-X-X-Y-D-X-X-X-[D/N]-[L/I/V/M/F/Y]-[L/I/V/M/F/Y]-[L/I/V/M/F/Y]-[L/I/V/M/F/Y]-X-X-G-X-X-[S/T/A]-P
此外，也发现了位于第一个亚基基因的2,612-2,626bp处一个单一的血红素结合序列(下表6的SEQ ID NO：19)，以及位于第二个亚基基因中的三个血红素结合序列，位于以下位置：3,129-3,143；3,573-3,587和3,981-3,995bp(此处，XA表示任意氨基酸，XB表示任意不同于XA的氨基酸)。
        表6
[SEQ ID NO：19]C-XA-XB-C-H
同源序列的数据库检索确定了第一个亚基基因的DNA序列与许多包含辅因子吡咯并喹啉醌(PQQ)的脱氢酶具很大程度的相似性：特别是，Acetobacter polyoxogenes的乙醇脱氢酶(Tamaki，T.等人，生物化学与生物物理学报(Biochem.Biophys.Acta)，1088，292(1991))和Acetobacteraceti的乙醇脱氢酶(Inoue，T.等人，细菌学杂志，171，3115(1989))与第一个亚基分别有77％和70％相同。第二个亚基基因的数据库检索提供了它与弱氧化葡糖杆菌IFO12528(Takeda和Shimizu，发酵生物工程杂志，72；1(1991))的细胞色素c具最大程度的相似性，匹配的核苷酸序列的同一性为83％，氨基酸序列的同一性为88％。
                       实施例7
           320bp DNA片段的引物设计和PCR克隆，
            该片段包含第三个亚基基因的一部分
实施例6所述的第一个和第二个亚基基因的核苷酸序列分析表明分离的操纵子克隆不包含第三个亚基基因。进一步对5’和3’侧翼区测序也未能显示第三个亚基的存在。因此，为了分离编码第三个亚基的基因，基于氨基酸序列信息合成简并引物，以通过PCR产生一段用作探针的短DNA片段，其包含第三个亚基基因的一部分。
基于实施例2获得的第三个亚基成熟蛋白质之N-末端氨基酸序列(SEQ ID NO：11)以及实施例3获得的胰蛋白酶消化肽的内部氨基酸序列之一(SEQ ID NO：13)，分别合成两条简并引物，引物3(5’-GGGAATTCTTT(C)CAA(G)GAA(G)ATGAAT(C)AA-3’)(SEQ IDNO：20)和引物4(5’-GGGAATTCTTGAAA(G)CC NGC A(G)TCA(G)TA-3’)(SEQ ID NO：21)。
用Takeda和Shimizu法(Takeda和Shimizu，发酵生物工程杂志，72；1(1991))制备的弱氧化葡糖杆菌KCTC 2111基因组DNA作为模板，用引物3和4进行PCR反应。反应产生了一条320bp的DNA片段。将该320bp PCR产物连接至pBluescript SK(Stratagene)，并且用SEM法(Inoue，H.等人，基因(Gene)，96：23(1990))转化大肠杆菌DH5α。于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养转化子。然后，用碱裂解法提取质粒(Sambrook，J.等人，分子克隆，CSH Press，p.125(1988))。以这个质粒DNA作为模板，用引物3和引物4进行PCR反应确证亚克隆。320bp片段的部分核苷酸测序进一步证实了引物3结合位点下游推导出的氨基酸序列与实验测定的N-末端氨基酸序列相匹配。但320bp片段只包含第三个亚基基因的N-末端部分。
                      实施例8
     以320bp DNA片段作为探针，分离第三个亚基基因
用DIG标记和检测试剂盒(使用DIG系统进行滤膜杂交的用户指南，p.6-9，Boehringer Mannheim(1993))标记(实施例7)分离的320bp DNA片段。对Takeda和Shimizu法(Takeda和Shimizu，发酵生物工程杂志，72；1(1991))分离的弱氧化葡糖杆菌KCTC 2111基因组DNA用BamHI、ClaI、EcoRI、HindIII、PstI或XhoI消化，0.8％的琼脂糖凝胶电泳，并如所述(Southern，E.M.，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)98,503(1975))转移至尼龙膜(NYTRAN，Schleicher & Schuell)。用预杂交液(5×SSC，1％(w/v)封闭试剂、0.1％N-十二烷基肌氨酸、0.2％SDS和50％(v/v)甲酰胺)在杂交炉中(Hybaid)对膜进行预杂交，42℃，2小时。然后用杂交液(用预杂交液稀释的、DIG-标记的探针)进行膜杂交，42℃，12小时。对所用的每一个酶Southern杂交均给出强的分散信号。洗脱对应于阳性信号的、位于4.5kb ClaI处的DNA，并克隆于pBlueseript SK，以构建一个小文库。如上所述通过重复Southern杂交筛选该小文库，以得到阳性克隆。选择一个给出了阳性信号的克隆并指定为ClaI-#69。图9表示ClaI-#69的限制性酶图谱。
                           实施例9
       包含第三个亚基的4.5kb ClaI片段之核苷酸序列分析
测定并分析了在4.5kb ClaI-#69克隆的中第三个亚基基因的核苷酸序列。为了使DNA测序简单化，对一些重叠的限制性片段亚克隆，并测定了每一个克隆的核苷酸序列。用染料末端终止循环测序方便反应试剂盒(Applied Biosystems)进行核苷酸测序反应，并于自动的DNA测序仪(Applied Biosystems，Model 373A)测定序列。
图10显示了4.5kb ClaI片段中2700bp的核苷酸序列(SEQ IDNO：8)。所测序的DNA中包含一个具有921个核苷酸的开放读码框(ORF)，其编码第三个亚基多肽。第三个亚基基因前为潜在的SD序列(AGG)，其位于1,375-1,377bp。第三个亚基多肽的氨基酸信号序列位于1,384-1,461bp。第三个亚基蛋白质成熟部分的编码序列位于1,462-2,304bp，其编码一个具有280个氨基酸的多肽，所推导出的N-末端氨基酸序列与通过N-末端氨基酸序列分析而得到的25个氨基酸残基正好一致。第三个亚基成熟蛋白质的计算分子量为29,552Da，其与SDS-PAGE测定的实验值29kDa相一致。
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                                                                          PCT/IB 99/00736
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                序列表<110>Choi，Eui-SungRhee，Sang-KiLee，Eun-Hae<120>弱氧化葡糖杆菌山梨糖醇脱氢酶基因及其使用方法<130>1533.087CN00<140><141><150>PCT/IB99/00736<151>1999-04-23<160>87<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>2265<212>DNA<213>弱氧化葡糖杆菌<400>1atggtttctg gtctactgac gccgatcaac gttacgaaga agcgccttct gggttgcgct 60gctgctctgg cattctgcgc cacctctcct gtcgccctgg ctgaggacac aggaacagcc 120attacaaacg ccgaccagca tccgggtgac tggatgagct atggccggac ctattccgag 180cagcgctaca gcccgctgga tcagatcacc aaggacaatg cgagcaatct gaagctggca 240tggcactacg atctggatac caaccgtggt caggaaggta cgccgctgat cgttgatggc 300gtcatgtacg ccaccacaaa ctggagcaag atgaaggctc tggatgcagc tacgggcaag 360ctgctgtggt cttacgatcc aaaggttcca ggcaacatcg ccgaccgcgg ctgctgcgat 420acggtcaacc gtggtgcagc ctactggaac ggcaaagtct atttcggcac cttcgacggt 480cgcctgattg ccctggatgc caagaccggc aagctggtct ggagcgtcta tacggttccc 540aaggaagcgc agctgggtca ccagcgctcc tacacggttg acggtgctcc ccgtatcgcc 600aagggcaagg tcatcatcgg caacggcggt gcagagttcg gcgcccgtgg cttcgtgacg 660gcgtatgacg ctgaaacggg aaagatggac tggcgcttct tcaccgttcc gaaccctgac 720aacaagccgg acggcgcagc gtctgacgac gtgctgatgt ccaaggctta tccgacatgg 780ggcaagggcg gcgcgtggaa gcagcagggc ggtggcggta ccgtctggga ttcgctgatc 840tatgaccctg taacggatct cgtctatctg ggcgtcggta acggctcgcc atggaactac 900aagttccgtt ctgaaggaaa aggcaacaac ctcttcctcg gcagcatcgt ggccatcaat 960cctgacaccg gcaaatacgt ctggcatttc caggaaacgc caatggacca gtgggattat 1020acctcggttc agcagatcat ggccctcgac atgccggtca atggcgaaat gcgccatgtg 1080ctcgtgcatg cgccgaagaa cggcttcttc tatatcattg atgccaagac cggtaagttc 1140atctccggca agccgtacac ctacgagaac tgggccaatg gcctcgatcc ggtaacgggt 1200cgtccgaact acaatccaga tgctctctgg acgctgaacg gcaagccctg gtacggcatc 1260cccggcgatc tgggtggtca taacttcgct gccatggctt acagcccaca gacgaagctg 1320gtttacattc ccgcccagca ggttcccttc gtttacgatc cgcagaaggg tggcttcaag 1380gctcaccacg acagctggaa ccttggcctc gacatgaaca agatcggcct gcttgatgac 1440aacgatccac agcacaaggc tgacaaggcc cagttcctga aggatctgaa gggctggatc 1500gttgcatggg atccgcagaa gcagcaggca gccttcacgg ttgaccacaa gggtccgtgg 1560aatggcggtc ttctggcaac ggctggtggc gttctgttcc agggtctcgc caacggtgag 1620ttccacgcct acgacgcgac gacgggtaag gatctcttca ccttcccagc acagagcgcc 1680atcattgccc cgccagtcac ctacacagcc aacggcaagc agtatgttgc ggttgaagtg 1740ggctggggcg gtatctatcc gttcttcctg ggcggcgtag cccgtacgtc cggctggacc 1800gtcaaccact cccggatcat cgcgttcgct ctggacggca acgacaagct gccagccaag 1860aacgagctcg gcttcgttcc agtgaagccg cctgagaaat gggatgaagc caagatcaag 1920gacggctact tccagttcca gacctattgc gcagcctgcc atggtgacaa cggtatctcc 1980ggcggtgttc tgccagacct gcgctggtcc ggtgcgatcc gtggagagga gaagttctac 2040aagctcgtcg gcaagggtgc tctaacggcc tacggtatgg accgtttcga cacgtccatg 2100tcgccagctg aaatcgaaga catccgcaac ttccttgtga agcgcgccaa cgagtcctac 2160gcagacgaag tcaaggcccg aaagaatgag gcaggcgtcc ctaacggcga attcctcaac 2220gtccctcagg gttcggttgc gcctgcaacg ccggaccatc cgtaa                 2265<210>2<211>1437<212>DNA<213>弱氧化葡糖杆菌<400>2atgctcaagg cattaactcg ggacagactg gtatctgaga tgaaacaggg atggaaatac 60gcggccgcag tcggcctcat ggcagtgtct ttcggtgctg cccaagccca ggacgctgat 120gacgccctga ttcagcgcgg tgcctacgtg gcccgcctgt ctgactgcgt tgcctgccat 180accgcactac acggccagcc ttttgctggt ggtctggaga tcaagagccc gatcggcacg 240atctactcca ccaacatcac gcctgacccg aaatacggta tcggcaacta tacactcgaa 300gatttcacga aggcgatccg taagggtatc cgcaaggacg gcgcgacggt ttatccggcc 360atgccgtatc ctgagttcgc tcgcctgtct gatgacgaca tcaaggccat gtatgccttc 420ttcatgcatg gcgtgaagcc ggtcgccctt cagaacaagc agccggacat ctcctggccg 480atgaacatgc gctggccgtt ggccatctgg cgcgcgatgt ttgttccgac tgtcacacca 540ggcctcgaca agagcatctc cgatccggaa gtggcgcgtg gcgaatacct cgtgaatggc 600ccaggccatt gtggcgagtg tcatacgccc cgtggcatgg ccatgcaggt caagggctat 660acggccaagg acggcaacgc ttacctctcc ggtggcgcac cgatcgacaa ctggattgct 720cccagcctgc gtagcaatag cgacacgggt ctgggtcgct ggtctgaaga cgacattgcc 780gagttcctga agagcggccg tatcgaccat tctgccgtct tcggtggcat ggctgacgtg 840gtggcctaca gcacccagca ctggaccgac gacgatctgc acgcaacggc caagtacctg 900aagagcatgc cggccgttcc ggaaggcaaa aacctgggtc aggatgacgg caaggccacg 960gccctgctcg aagccggtgg caagggtgat gcaggcgcag aggtttacct ccacaactgt 1020gccatctgcc atatgaacga tggcactggt gtcaaccgca tgttcccgcc gctggctggc 1080aacccggtcg tcatcacgga caatgcaacc tcaatggcca acatcgtgac attcggcggt 1140attctgcctc cgacgaatac ggcgccatct gctgttgcca tgccgggctt ccgcgatcat 1200ctgtctgacc agcagatcgc cgatgttgtg aacttcatgc gcaagagctg gggcaaccag 1260gctccgggaa ccctgtctgc ctcggatatc cgcaagctcc gcacatcggg tactgcggtt 1320tccacggccg gctggaacgt ctcttccaag ggctggatgg cctacatgcc gcagccttat 1380ggcgaaggct ggaccttctc cccgcagaca cacacgggcg tggatcaggc tcagtaa    1437<210>3<211>921<212>DNA<213>弱氧化葡糖杆菌<400>3atgaagacca agacgcttcc gctggccctt ctgtctctcg ctcttggcgg gacggccctg 60tcagacccgg ctgccgcagc tggaaccccg ctgaaaattg gcgtttcctt tcaggaaatg 120aacaatccgt acttcgtcac catgaaggac gcattgcagg aagccgctgg cacgatcggt 180gcgaatgtca tcatcagtga tgcgcatcat gatgtttcca agcaggtgag tgacattgag 240gacatgatcc agcagggcgc gcagatcatc atcatcaacc cgaccgatac agtaggcgtc 300acgtccgtcg taaagagcgt tcatgacaag aacatcccga tcgtctcggt ggatgctcag 360gctggcggtc cgctcgatgc gtttgtgggg tccaagaact atgatgccgg cttcaaggcc 420tgcgagtatc tcgccacgac gatcaagagc ggcaatatcg gaatcatcga cggtatcccg 480gtcgttccca ttcttgagcg tgtcaaaggc tgcaaaaacg ctatcgccaa gcattcagat 540atcaagattg tcagcgttca gaacggcaag caggagcgcg atgaggctct gacggtggct 600gaaaacatgc tccaggccaa cccggatctg aaaggtatct tcagcgtcaa tgacaacgga 660tcgctcggtg tgctgtccgc tatcgaatcc agtggttcag acgtgaagct ggtcagcgtt 720gatggcaacc cggaagccgt gaaggccatc tacaagccag gctctcattt catcgctacg 780gctgcgcagt tcccccggca ggatatccgt ctggcactgg cgctcgccct tgccaggaaa 840tggggcgcag gcgtgccgaa ggtcctgcct gttgatgtcg agctgatcga cgcgacgaaa 900gccaagacgt tcagctggta a                                           921<210>4<211>754<212>PRT<213>弱氧化葡糖杆菌<400>4Met Val Ser Gly Leu Leu Thr Pro Ile Asn Val Thr Lys Lys Arg Leu1               5                  10                  15Leu Gly Cys Ala Ala Ala Leu Ala Phe Cys Ala Thr Ser Pro Val Ala
         20                  25                  30Leu Ala Glu Asp Thr Gly Thr Ala Ile Thr Asn Ala Asp Gln His Pro
     35                  40                  45Gly Asp Trp Met Ser Tyr Gly Arg Thr Tyr Ser Glu Gln Arg Tyr Ser
 50                  55                  60Pro Leu Asp Gln Ile Thr Lys Asp Asn Ala Ser Asn Leu Lys Leu Ala65                  70                  75                  80Trp His Tyr Asp Leu Asp Thr Asn Arg Gly Gln Glu Gly Thr Pro Leu
             85                  90                  95Ile Val Asp Gly Val Met Tyr Ala Thr Thr Asn Trp Ser Lys Met Lys
        100                 105                 110Ala Leu Asp Ala Ala Thr Gly Lys Leu Leu Trp Ser Tyr Asp Pro Lys
    115                 120                 125Val Pro Gly Asn Ile Ala Asp Arg Gly Cys Cys Asp Thr Val Asn Arg
130                 135                 140Gly Ala Ala Tyr Trp Asn Gly Lys Val Tyr Phe Gly Thr Phe Asp Gly145                 150                 155                 160Arg Leu Ile Ala Leu Asp Ala Lys Thr Gly Lys Leu Val Trp Ser Val
            165                 170                 175Tyr Thr Val Pro Lys Glu Ala Gln Leu Gly His Gln Arg Ser Tyr Thr
        180                 185                 190Val Asp Gly Ala Pro Arg Ile Ala Lys Gly Lys Val Ile Ile Gly Asn
    195                 200                 205Gly Gly Ala Glu Phe Gly Ala Arg Gly Phe Val Thr Ala Tyr Asp Ala
210                 215                 220Glu Thr Gly Lys Met Asp Trp Arg Phe Phe Thr Val Pro Asn Pro Asp225                 230                 235                 240Asn Lys Pro Asp Gly Ala Ala Ser Asp Asp Val Leu Met Ser Lys Ala
            245                 250                 255Tyr Pro Thr Trp Gly Lys Gly Gly Ala Trp Lys Gln Gln Gly Gly Gly
        260                 265                 270Gly Thr Val Trp Asp Ser Leu Ile Tyr Asp Pro Val Thr Asp Leu Val
    275                 280                 285Tyr Leu Gly Val Gly Asn Gly Ser Pro Trp Asn Tyr Lys Phe Arg Ser
290                 295                 300Glu Gly Lys Gly Asn Asn Leu Phe Leu Gly Ser Ile Val Ala Ile Asn305                 310                 315                 320Pro Asp Thr Gly Lys Tyr Val Trp His Phe Gln Glu Thr Pro Met Asp
            325                 330                 335Gln Trp Asp Tyr Thr Ser Val Gln Gln Ile Met Ala Leu Asp Met Pro
        340                 345                 350Val Asn Gly Glu Met Arg His Val Leu Val His Ala Pro Lys Asn Gly
    355                 360                 365Phe Phe Tyr Ile Ile Asp Ala Lys Thr Gly Lys Phe Ile Ser Gly Lys
370                 375                 380Pro Tyr Thr Tyr Glu Asn Trp Ala Asn Gly Leu Asp Pro Val Thr Gly385                 390                 395                 400Arg Pro Asn Tyr Asn Pro Asp Ala Leu Trp Thr Leu Asn Gly Lys Pro
            405                 410                 415Trp Tyr Gly Ile Pro Gly Asp Leu Gly Gly His Asn Phe Ala Ala Met
        420                 425                 430Ala Tyr Ser Pro Gln Thr Lys Leu Val Tyr Ile Pro Ala Gln Gln Val
    435                 440                 445Pro Phe Val Tyr Asp Pro Gln Lys Gly Gly Phe Lys Ala His His Asp
450                 455                 460Ser Trp Asn Leu Gly Leu Asp Met Asn Lys Ile Gly Leu Leu Asp Asp465                 470                 475                 480Asn Asp Pro Gln His Lys Ala Asp Lys Ala Gln Phe Leu Lys Asp Leu
            485                 490                 495Lys Gly Trp Ile Val Ala Trp Asp Pro Gln Lys Gln Gln Ala Ala Phe
        500                 505                 510Thr Val Asp His Lys Gly Pro Trp Asn Gly Gly Leu Leu Ala Thr Ala
    515                 520                 525Gly Gly Val Leu Phe Gln Gly Leu Ala Asn Gly Glu Phe His Ala Tyr
530                 535                 540Asp Ala Thr Thr Gly Lys Asp Leu Phe Thr Phe Pro Ala Gln Ser Ala545                 550                 555                 560Ile Ile Ala Pro Pro Val Thr Tyr Thr Ala Asn Gly Lys Gln Tyr Val
            565                 570                 575Ala Val Glu Val Gly Trp Gly Gly Ile Tyr Pro Phe Phe Leu Gly Gly
        580                 585                 590Val Ala Arg Thr Ser Gly Trp Thr Val Asn His Ser Arg Ile Ile Ala
    595                 600                 605Phe Ala Leu Asp Gly Asn Asp Lys Leu Pro Ala Lys Asn Glu Leu Gly
610                 615                 620Phe Val Pro Val Lys Pro Pro Glu Lys Trp Asp Glu Ala Lys Ile Lys625                 630                 635                 640Asp Gly Tyr Phe Gln Phe Gln Thr Tyr Cys Ala Ala Cys His Gly Asp
            645                 650                 655Asn Gly Ile Ser Gly Gly Val Leu Pro Asp Leu Arg Trp Ser Gly Ala
        660                 665                 670Ile Arg Gly Glu Glu Lys Phe Tyr Lys Leu Val Gly Lys Gly Ala Leu
    675                 680                 685Thr Ala Tyr Gly Met Asp Arg Phe Asp Thr Ser Met Ser Pro Ala Glu
690                 695                 700Ile Glu Asp Ile Arg Asn Phe Leu Val Lys Arg Ala Asn Glu Ser Tyr705                 710                 715                 720Ala Asp Glu Val Lys Ala Arg Lys Asn Glu Ala Gly Val Pro Asn Gly
            725                 730                 735Glu Phe Leu Asn Val Pro Gln Gly Ser Val Ala Pro Ala Thr Pro Asp
        740                 745                 750His Pro<210>5<211>478<212>PRT<213>弱氧化葡糖杆菌<400>5Met Leu Lys Ala Leu Thr Arg Asp Arg Leu Val Ser Glu Met Lys Gln1               5                  10                  15Gly Trp Lys Tyr Ala Ala Ala Val Gly Leu Met Ala Val Ser Phe Gly
         20                  25                  30Ala Ala Gln Ala Gln Asp Ala Asp Asp Ala Leu Ile Gln Arg Gly Ala
     35                  40                  45Tyr Val Ala Arg Leu Ser Asp Cys Val Ala Cys His Thr Ala Leu His
 50                  55                  60Gly Gln Pro Phe Ala Gly Gly Leu Glu Ile Lys Ser Pro Ile Gly Thr65                  70                  75                  80Ile Tyr Ser Thr Asn Ile Thr Pro Asp Pro Lys Tyr Gly Ile Gly Asn
             85                  90                  95Tyr Thr Leu Glu Asp Phe Thr Lys Ala Ile Arg Lys Gly Ile Arg Lys
        100                 105                 110Asp Gly Ala Thr Val Tyr Pro Ala Met Pro Tyr Pro Glu Phe Ala Arg
    115                 120                 125Leu Ser Asp Asp Asp Ile Lys Ala Met Tyr Ala Phe Phe Met His Gly
130                 135                 140Val Lys Pro Val Ala Leu Gln Asn Lys Gln Pro Asp Ile Ser Trp Pro145                 150                 155                 160Met Asn Met Arg Trp Pro Leu Ala Ile Trp Arg Ala Met Phe Val Pro
            165                 170                 175Thr Val Thr Pro Gly Leu Asp Lys Ser Ile Ser Asp Pro Glu Val Ala
        180                 185                 190Arg Gly Glu Tyr Leu Val Asn Gly Pro Gly His Cys Gly Glu Cys His
    195                 200                 205Thr Pro Arg Gly Met Ala Met Gln Val Lys Gly Tyr Thr Ala Lys Asp
210                 215                 220Gly Asn Ala Tyr Leu Ser Gly Gly Ala Pro Ile Asp Asn Trp Ile Ala225                 230                 235                 240Pro Ser Leu Arg Ser Asn Ser Asp Thr Gly Leu Gly Arg Trp Ser Glu
            245                 250                 255Asp Asp Ile Ala Glu Phe Leu Lys Ser Gly Arg Ile Asp His Ser Ala
        260                 265                 270Val Phe Gly Gly Met Ala Asp Val Val Ala Tyr Ser Thr Gln His Trp
    275                 280                 285Thr Asp Asp Asp Leu His Ala Thr Ala Lys Tyr Leu Lys Ser Met Pro
290                 295                 300Ala Val Pro Glu Gly Lys Asn Leu Gly Gln Asp Asp Gly Lys Ala Thr305                 310                 315                 320Ala Leu Leu Glu Ala Gly Gly Lys Gly Asp Ala Gly Ala Glu Val Tyr
            325                 330                 335Leu His Asn Cys Ala Ile Cys His Met Asn Asp Gly Thr Gly Val Asn
        340                 345                 350Arg Met Phe Pro Pro Leu Ala Gly Asn Pro Val Val Ile Thr Asp Asn
    355                 360                 365Ala Thr Ser Met Ala Asn Ile Val Thr Phe Gly Gly Ile Leu Pro Pro
370                 375                 380Thr Asn Thr Ala Pro Ser Ala Val Ala Met Pro Gly Phe Arg Asp His385                 390                 395                 400Leu Ser Asp Gln Gln Ile Ala Asp Val Val Asn Phe Met Arg Lys Ser
            405                 410                 415Trp Gly Asn Gln Ala Pro Gly Thr Leu Ser Ala Ser Asp Ile Arg Lys
        420                 425                 430Leu Arg Thr Ser Gly Thr Ala Val Ser Thr Ala Gly Trp Asn Val Ser
    435                 440                 445Ser Lys Gly Trp Met Ala Tyr Met Pro Gln Pro Tyr Gly Glu Gly Trp
450                 455                 460Thr Phe Ser Pro Gln Thr His Thr Gly Val Asp Gln Ala Gln465                 470                 475<210> 6<211> 306<212>PRT<213>弱氧化葡糖杆菌<400> 6Met Lys Thr Lys Thr Leu Pro Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ala Leu Gly1               5                  10                  15Gly Thr Ala Leu Ser Asp Pro Ala Ala Ala Ala Gly Thr Pro Leu Lys
         20                  25                  30Ile Gly Val Ser Phe Gln Glu Met Asn Asn Pro Tyr Phe Val Thr Met
     35                  40                  45Lys Asp Ala Leu Gln Glu Ala Ala Gly Thr Ile Gly Ala Asn Val Ile
 50                  55                  60Ile Ser Asp Ala His His Asp Val Ser Lys Gln Val Ser Asp Ile Glu65                  70                  75                  80Asp Met Ile Gln Gln Gly Ala Gln Ile Ile Ile Ile Asn Pro Thr Asp
             85                  90                  95Thr Val Gly Val Thr Ser Val Val Lys Ser Val His Asp Lys Asn Ile
        100                 105                 110Pro Ile Val Ser Val Asp Ala Gln Ala Gly Gly Pro Leu Asp Ala Phe
    115                 120                 125Val Gly Ser Lys Asn Tyr Asp Ala Gly Phe Lys Ala Cys Glu Tyr Leu
130                 135                 140Ala Thr Thr Ile Lys Ser Gly Asn Ile Gly Ile Ile Asp Gly Ile Pro145                 150                 155                 160Val Val Pro Ile Leu Glu Arg Val Lys Gly Cys Lys Asn Ala Ile Ala
            165                 170                 175Lys His Ser Asp Ile Lys Ile Val Ser Val Gln Asn Gly Lys Gln Glu
        180                 185                 190Arg Asp Glu Ala Leu Thr Val Ala Glu Asn Met Leu Gln Ala Asn Pro
    195                 200                 205Asp Leu Lys Gly Ile Phe Ser Val Asn Asp Asn Gly Ser Leu Gly Val
210                 215                 220Leu Ser Ala Ile Glu Ser Ser Gly Ser Asp Val Lys Leu Val Ser Val225                 230                 235                 240Asp Gly Asn Pro Glu Ala Val Lys Ala Ile Tyr Lys Pro Gly Ser His
            245                 250                 255Phe Ile Ala Thr Ala Ala Gln Phe Pro Arg Gln Asp Ile Arg Leu Ala
        260                 265                 270Leu Ala Leu Ala Leu Ala Arg Lys Trp Gly Ala Gly Val Pro Lys Val
    275                 280                 285Leu Pro Val Asp Val Glu Leu Ile Asp Ala Thr Lys Ala Lys Thr Phe
290                 295                 300Ser Trp305<210>7<211>4830<212>DNA<213>弱氧化葡糖杆菌<400> 7cgagaacgga agcccgctga aatcgacccg ttccccatca aaatactttt cgagaagatc 60acgaaccttc accaggagcg gcgtctcttc ctgatcgcgc ccccaccccc aatcgagagc 120aacaatacgc ccgtcatctt cactgatggt cagggctccg agatgggaat ggcaggaaag 180ctgtggcata cagatacgct gccccatccc ccggaaagcg tcaatcatgc ttccctaaaa 240gagtccctga gaaaaaaata catgcgtgtc acgcatatgc agggaggccg gtattctcaa 300ataacatatg ggatcatttt tgtatgattt catgaaatat tacgcacttt gttgagaaac 360tgccattttt tgtgtcaaac ctgcgacaga cactaaagct gttttggttg tttggttatt 420aagaataatt ctcatgtaat taagcgagcg attttacgcg gatagtgctc acggagacgt 480cagaagccca cgtttccgac aaacaataaa ataagcgagt agtaagttca cgcgatgcta 540cgttttccag acgacttgga gaaactgagg agcacctagg cacccacaga ggcgcctatc 600aggacttgga ttacgtctga ataccattaa caggaacagt ctttgcaaaa aggacagtcg 660gatcatggtt tctggtctac tgacgccgat caacgttacg aagaagcgcc ttctgggttg 720cgctgctgct ctggcattct gcgccacctc tcctgtcgcc ctggctgagg acacaggaac 780agccattaca aacgccgacc agcatccggg tgactggatg agctatggcc ggacctattc 840cgagcagcgc tacagcccgc tggatcagat caccaaggac aatgcgagca atctgaagct 900ggcatggcac tacgatctgg ataccaaccg tggtcaggaa ggtacgccgc tgatcgttga 960tggcgtcatg tacgccacca caaactggag caagatgaag gctctggatg cagctacggg 1020caagctgctg tggtcttacg atccaaaggt tccaggcaac atcgccgacc gcggctgctg 1080cgatacggtc aaccgtggtg cagcctactg gaacggcaaa gtctatttcg gcaccttcga 1140cggtcgcctg attgccctgg atgccaagac cggcaagctg gtctggagcg tctatacggt 1200tcccaaggaa gcgcagctgg gtcaccagcg ctcctacacg gttgacggtg ctccccgtat 1260cgccaagggc aaggtcatca tcggcaacgg cggtgcagag ttcggcgccc gtggcttcgt 1320gacggcgtat gacgctgaaa cgggaaagat ggactggcgc ttcttcaccg ttccgaaccc 1380tgacaacaag ccggacggcg cagcgtctga cgacgtgctg atgtccaagg cttatccgac 1440atggggcaag ggcggcgcgt ggaagcagca gggcggtggc ggtaccgtct gggattcgct 1500gatctatgac cctgtaacgg atctcgtcta tctgggcgtc ggtaacggct cgccatggaa 1560ctacaagttc cgttctgaag gaaaaggcaa caacctcttc ctcggcagca tcgtggccat 1620caatcctgac accggcaaat acgtctggca tttccaggaa acgccaatgg accagtggga 1680ttatacctcg gttcagcaga tcatggccct cgacatgccg gtcaatggcg aaatgcgcca 1740tgtgctcgtg catgcgccga agaacggctt cttctatatc attgatgcca agaccggtaa 1800gttcatctcc ggcaagccgt acacctacga gaactgggcc aatggcctcg atccggtaac 1860gggtcgtccg aactacaatc cagatgctct ctggacgctg aacggcaagc cctggtacgg 1920catccccggc gatctgggtg gtcataactt cgctgccatg gcttacagcc cacagacgaa 1980gctggtttac attcccgccc agcaggttcc cttcgtttac gatccgcaga agggtggctt 2040caaggctcac cacgacagct ggaaccttgg cctcgacatg aacaagatcg gcctgcttga 2100tgacaacgat ccacagcaca aggctgacaa ggcccagttc ctgaaggatc tgaagggctg 2160gatcgttgca tgggatccgc agaagcagca ggcagccttc acggttgacc acaagggtcc 2220gtggaatggc ggtcttctgg caacggctgg tggcgttctg ttccagggtc tcgccaacgg 2280tgagttccac gcctacgacg cgacgacggg taaggatctc ttcaccttcc cagcacagag 2340cgccatcatt gccccgccag tcacctacac agccaacggc aagcagtatg ttgcggttga 2400agtgggctgg ggcggtatct atccgttctt cctgggcggc gtagcccgta cgtccggctg 2460gaccgtcaac cactcccgga tcatcgcgtt cgctctggac ggcaacgaca agctgccagc 2520caagaacgag ctcggcttcg ttccagtgaa gccgcctgag aaatgggatg aagccaagat 2580caaggacggc tacttccagt tccagaccta ttgcgcagcc tgccatggtg acaacggtat 2640ctccggcggt gttctgccag acctgcgctg gtccggtgcg atccgtggag aggagaagtt 2700ctacaagctc gtcggcaagg gtgctctaac ggcctacggt atggaccgtt tcgacacgtc 2760catgtcgcca gctgaaatcg aagacatccg caacttcctt gtgaagcgcg ccaacgagtc 2820ctacgcagac gaagtcaagg cccgaaagaa tgaggcaggc gtccctaacg gcgaattcct 2880caacgtccct cagggttcgg ttgcgcctgc aacgccggac catccgtaac gggaaaccgt 2940cacgctgaaa ggaatgacgt gacatgctca aggcattaac tcgggacaga ctggtatctg 3000agatgaaaca gggatggaaa tacgcggccg cagtcggcct catggcagtg tctttcggtg 3060ctgcccaagc ccaggacgct gatgacgccc tgattcagcg cggtgcctac gtggcccgcc 3120tgtctgactg cgttgcctgc cataccgcac tacacggcca gccttttgct ggtggtctgg 3180agatcaagag cccgatcggc acgatctact ccaccaacat cacgcctgac ccgaaatacg 3240gtatcggcaa ctatacactc gaagatttca cgaaggcgat ccgtaagggt atccgcaagg 3300acggcgcgac ggtttatccg gccatgccgt atcctgagtt cgctcgcctg tctgatgacg 3360acatcaaggc catgtatgcc ttcttcatgc atggcgtgaa gccggtcgcc cttcagaaca 3420agcagccgga catctcctgg ccgatgaaca tgcgctggcc gttggccatc tggcgcgcga 3480tgtttgttcc gactgtcaca ccaggcctcg acaagagcat ctccgatccg gaagtggcgc 3540gtggcgaata cctcgtgaat ggcccaggcc attgtggcga gtgtcatacg ccccgtggca 3600tggccatgca ggtcaagggc tatacggcca aggacggcaa cgcttacctc tccggtggcg 3660caccgatcga caactggatt gctcccagcc tgcgtagcaa tagcgacacg ggtctgggtc 3720gctggtctga agacgacatt gccgagttcc tgaagagcgg ccgtatcgac cattctgccg 3780tcttcggtgg catggctgac gtggtggcct acagcaccca gcactggacc gacgacgatc 3840tgcacgcaac ggccaagtac ctgaagagca tgccggccgt tccggaaggc aaaaacctgg 3900gtcaggatga cggcaaggcc acggccctgc tcgaagccgg tggcaagggt gatgcaggcg 3960cagaggttta cctccacaac tgtgccatct gccatatgaa cgatggcact ggtgtcaacc 4020gcatgttccc gccgctggct ggcaacccgg tcgtcatcac ggacaatgca acctcaatgg 4080ccaacatcgt gacattcggc ggtattctgc ctccgacgaa tacggcgcca tctgctgttg 4140ccatgccggg cttccgcgat catctgtctg accagcagat cgccgatgtt gtgaacttca 4200tgcgcaagag ctggggcaac 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         20                  25<210>12<211>5<212>PRT<213>弱氧化葡糖杆菌<400>12His Ser Asp Ile Lys1               5<210>13<211>7<212>PRT<213>弱氧化葡糖杆菌<400>13Asn Tyr Asp Ala Gly Phe Lys1               5<210>14<211>8<212>PRT<213>弱氧化葡糖杆菌<400>14Lys Trp Gly Ala Gly Val Pro Lys1               5<210>15<211>26<212>DNA<213>弱氧化葡糖杆菌<220><221>修饰的碱基<222>(18)<223>i<220><221>修饰的碱基<222>(21)<223>i<220><221>修饰的碱基<222>(24)<223>i<400>15ccggaattcg argayacngg nacngc                                       26<210>16<211>23<212>DNA<213>弱氧化葡糖杆菌<220><221>修饰的碱基<222>(6)<223>i<220><221>修饰的碱基<222>(12)<223>i<400>16athacnaayg cngaycarca rcc                                          23<210>17<211>29<212>PRT<213>弱氧化葡糖杆菌<220><221>不定<222>(1)<223>可以是D，E，或N<220><221>不定<222>(3)..(5)<223>可以是任意氨基酸<220><221>不定<222>(7)<223>可以是R或K<220><221>不定<222>(8)..(13)<223>可以是任意氨基酸<220><221>不定<222>(14)<223>可以是F，Y，或W<220><221>不定<222>(16)..(19)<223>可以是任意氨基酸<220><221>不定<222>(20)<223>可以是L，I，V，或M<220><221>不定<222>(21)..(23)<223>可以是任意氨基酸<220><221>不定<222>(25)..(27)<223>可以是任意氨基酸<220><221>不定<222>(29)<223>可以是R或K<400>17Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa1               5                  10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Leu Xaa
         20                  25<210>18<211>22<212>PRT<213>弱氧化葡糖杆菌<220><221>不定<222>(2)..(5)<223>可以是任意氨基酸<220><221>不定<222>(8)..(10)<223>可以是任意氨基酸<220><221>不定<222>(11)<223>可以是D或N<220><221>不定<222>(12)..(15)<223>可以是L，I，V，M，F，或Y<220><221>不定<222>(16)..(17)<223>可以是任意氨基酸<220><221>不定<222>(19)..(20)<223>可以是任意氨基酸<220><221>不定<222>(21)<223>可以是S，T，或A<400>18Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1               5                  10                  15Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Pro
         20<210>19<211>5<212>PRT<213>弱氧化葡糖杆菌<220><221>不定<222>(2)<223>可以是任意氨基酸<220><221>不定<222>(3)<223>可以是不同于位置2氨基酸的任意氨基酸<400>19Cys Xaa Xaa Cys His1               5<210>20<211>25<212>DNA<213>弱氧化葡糖杆菌<400>20gggaattctt ycargaratg aayaa                                        25<210>21<211>25<212>DNA<213>弱氧化葡糖杆菌<400>21gggaattctt gaarccngcr tcrta                                        25<210>22<211>2163<212>DNA<213>弱氧化葡糖杆菌<400>22gaggacacag gaacagccat tacaaacgcc gaccagcatc cgggtgactg gatgagctat 60ggccggacct attccgagca gcgctacagc ccgctggatc agatcaccaa ggacaatgcg 120agcaatctga agctggcatg gcactacgat ctggatacca accgtggtca ggaaggtacg 180ccgctgatcg ttgatggcgt catgtacgcc accacaaact ggagcaagat gaaggctctg 240gatgcagcta cgggcaagct gctgtggtct tacgatccaa aggttccagg caacatcgcc 300gaccgcggct gctgcgatac ggtcaaccgt ggtgcagcct actggaacgg caaagtctat 360ttcggcacct tcgacggtcg cctgattgcc ctggatgcca agaccggcaa gctggtctgg 420agcgtctata cggttcccaa ggaagcgcag ctgggtcacc agcgctccta cacggttgac 480ggtgctcccc gtatcgccaa gggcaaggtc atcatcggca acggcggtgc agagttcggc 540gcccgtggct tcgtgacggc gtatgacgct gaaacgggaa agatggactg gcgcttcttc 600accgttccga accctgacaa caagccggac ggcgcagcgt ctgacgacgt gctgatgtcc 660aaggcttatc cgacatgggg caagggcggc gcgtggaagc agcagggcgg tggcggtacc 720gtctgggatt cgctgatcta tgaccctgta acggatctcg tctatctggg cgtcggtaac 780ggctcgccat ggaactacaa gttccgttct gaaggaaaag gcaacaacct cttcctcggc 840agcatcgtgg ccatcaatcc tgacaccggc aaatacgtct ggcatttcca ggaaacgcca 900atggaccagt gggattatac ctcggttcag cagatcatgg ccctcgacat gccggtcaat 960ggcgaaatgc gccatgtgct cgtgcatgcg ccgaagaacg gcttcttcta tatcattgat 1020gccaagaccg gtaagttcat ctccggcaag ccgtacacct acgagaactg ggccaatggc 1080ctcgatccgg taacgggtcg tccgaactac aatccagatg ctctctggac gctgaacggc 1140aagccctggt acggcatccc cggcgatctg ggtggtcata acttcgctgc catggcttac 1200agcccacaga cgaagctggt ttacattccc gcccagcagg ttcccttcgt ttacgatccg 1260cagaagggtg gcttcaaggc tcaccacgac agctggaacc ttggcctcga catgaacaag 1320atcggcctgc ttgatgacaa cgatccacag cacaaggctg acaaggccca gttcctgaag 1380gatctgaagg gctggatcgt tgcatgggat ccgcagaagc agcaggcagc cttcacggtt 1440gaccacaagg gtccgtggaa tggcggtctt ctggcaacgg ctggtggcgt tctgttccag 1500ggtctcgcca acggtgagtt ccacgcctac gacgcgacga cgggtaagga tctcttcacc 1560ttcccagcac agagcgccat cattgccccg ccagtcacct acacagccaa cggcaagcag 1620tatgttgcgg ttgaagtggg ctggggcggt atctatccgt tcttcctggg cggcgtagcc 1680cgtacgtccg gctggaccgt caaccactcc cggatcatcg cgttcgctct ggacggcaac 1740gacaagctgc cagccaagaa cgagctcggc ttcgttccag tgaagccgcc tgagaaatgg 1800gatgaagcca agatcaagga cggctacttc cagttccaga cctattgcgc agcctgccat 1860ggtgacaacg gtatctccgg cggtgttctg ccagacctgc gctggtccgg tgcgatccgt 1920ggagaggaga agttctacaa gctcgtcggc aagggtgctc taacggccta cggtatggac 1980cgtttcgaca cgtccatgtc gccagctgaa atcgaagaca tccgcaactt ccttgtgaag 2040cgcgccaacg agtcctacgc agacgaagtc aaggcccgaa agaatgaggc aggcgtccct 2100aacggcgaat tcctcaacgt ccctcagggt tcggttgcgc ctgcaacgcc ggaccatccg 2160taa                                                               2163<210>23<211>1329<212>DNA<213>弱氧化葡糖杆菌<400> 23caggacgctg atgacgccct gattcagcgc ggtgcctacg tggcccgcct gtctgactgc 60gttgcctgcc ataccgcact acacggccag ccttttgctg gtggtctgga gatcaagagc 120ccgatcggca cgatctactc caccaacatc acgcctgacc cgaaatacgg tatcggcaac 180tatacactcg aagatttcac gaaggcgatc cgtaagggta tccgcaagga cggcgcgacg 240gtttatccgg ccatgccgta tcctgagttc gctcgcctgt ctgatgacga catcaaggcc 300atgtatgcct tcttcatgca tggcgtgaag ccggtcgccc ttcagaacaa gcagccggac 360atctcctggc cgatgaacat gcgctggccg ttggccatct ggcgcgcgat gtttgttccg 420actgtcacac caggcctcga caagagcatc tccgatccgg aagtggcgcg tggcgaatac 480ctcgtgaatg gcccaggcca ttgtggcgag tgtcatacgc cccgtggcat ggccatgcag 540gtcaagggct atacggccaa ggacggcaac gcttacctct ccggtggcgc accgatcgac 600aactggattg ctcccagcct gcgtagcaat agcgacacgg gtctgggtcg ctggtctgaa 660gacgacattg ccgagttcct gaagagcggc cgtatcgacc attctgccgt cttcggtggc 720atggctgacg tggtggccta cagcacccag cactggaccg acgacgatct gcacgcaacg 780gccaagtacc tgaagagcat gccggccgtt ccggaaggca aaaacctggg tcaggatgac 840ggcaaggcca cggccctgct cgaagccggt ggcaagggtg atgcaggcgc agaggtttac 900ctccacaact gtgccatctg ccatatgaac gatggcactg gtgtcaaccg catgttcccg 960ccgctggctg gcaacccggt cgtcatcacg gacaatgcaa cctcaatggc caacatcgtg 1020acattcggcg gtattctgcc tccgacgaat acggcgccat ctgctgttgc catgccgggc 1080ttccgcgatc atctgtctga ccagcagatc gccgatgttg tgaacttcat gcgcaagagc 1140tggggcaacc aggctccggg aaccctgtct gcctcggata tccgcaagct ccgcacatcg 1200ggtactgcgg tttccacggc cggctggaac gtctcttcca agggctggat ggcctacatg 1260ccgcagcctt atggcgaagg ctggaccttc tccccgcaga cacacacggg cgtggatcag 1320gctcagtaal                                                        329<210>24<211>843<212>DNA<213>弱氧化葡糖杆菌<400>24gctggaaccc cgctgaaaat tggcgtttcc tttcaggaaa tgaacaatcc gtacttcgtc 60accatgaagg acgcattgca ggaagccgct ggcacgatcg gtgcgaatgt catcatcagt 120gatgcgcatc atgatgtttc caagcaggtg agtgacattg aggacatgat ccagcagggc 180gcgcagatca tcatcatcaa cccgaccgat acagtaggcg tcacgtccgt cgtaaagagc 240gttcatgaca agaacatccc gatcgtctcg gtggatgctc aggc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 50                  55                  60Asp Gly Val Met Tyr Ala Thr Thr Asn Trp Ser Lys Met Lys Ala Leu65                  70                  75                  80Asp Ala Ala Thr Gly Lys Leu Leu Trp Ser Tyr Asp Pro Lys Val Pro
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        100                 105                 110Ala Tyr Trp Asn Gly Lys Val Tyr Phe Gly Thr Phe Asp Gly Arg Leu
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 50                  55                  60Asp Phe Thr Lys Ala Ile Arg Lys Gly Ile Arg Lys Asp Gly Ala Thr65                  70                  75                  80Val Tyr Pro Ala Met Pro Tyr Pro Glu Phe Ala Arg Leu Ser Asp Asp
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        100                 105                 110Ala Leu Gln Asn Lys Gln Pro Asp Ile Ser Trp Pro Met Asn Met Arg
    115                 120                 125Trp Pro Leu Ala Ile Trp Arg Ala Met Phe Val Pro Thr Val Thr Pro
130                 135                 140Gly Leu Asp Lys Ser Ile Ser Asp Pro Glu Val Ala Arg Gly Glu Tyr145                 150                 155                 160Leu Val Asn Gly Pro Gly His Cys Gly Glu Cys His Thr Pro Arg Gly
            165                 170                 175Met Ala Met Gln Val Lys Gly Tyr Thr Ala Lys Asp Gly Asn Ala Tyr
        180                 185                 190Leu Ser Gly Gly Ala Pro Ile Asp Asn Trp Ile Ala Pro Ser Leu Arg
    195                 200                 205Ser Asn Ser Asp Thr Gly Leu Gly Arg Trp Ser Glu Asp Asp Ile Ala
210                 215                 220Glu Phe Leu Lys Ser Gly Arg Ile Asp His Ser Ala Val Phe Gly Gly225                 230                 235                 240Met Ala Asp Val Val Ala Tyr Ser Thr Gln His Trp Thr Asp Asp Asp
            245                 250                 255Leu His Ala Thr Ala Lys Tyr Leu Lys Ser Met Pro Ala Val Pro Glu
        260                 265                 270Gly Lys Asn Leu Gly Gln Asp Asp Gly Lys Ala Thr Ala Leu Leu Glu
    275                 280                 285Ala Gly Gly Lys Gly Asp Ala Gly Ala Glu Val Tyr Leu His Asn Cys
290                 295                 300Ala Ile Cys His Met Asn Asp Gly Thr Gly Val Asn Arg Met Phe Pro305                 310                 315                 320Pro Leu Ala Gly Asn Pro Val Val Ile Thr Asp Asn Ala Thr Ser Met
            325                 330                 335Ala Asn Ile Val Thr Phe Gly Gly Ile Leu Pro Pro Thr Asn Thr Ala
        340                 345                 350Pro Ser Ala Val Ala Met Pro Gly Phe Arg Asp His Leu Ser Asp Gln
    355                 360                 365Gln Ile Ala Asp Val Val Asn Phe Met Arg Lys Ser Trp Gly Asn Gln
370                 375                 380Ala Pro Gly Thr Leu Ser Ala Ser Asp Ile Arg Lys Leu Arg Thr Ser385                 390                 395                 400Gly Thr Ala Val Ser Thr Ala Gly Trp Asn Val Ser Ser Lys Gly Trp
            405                 410                 415Met Ala Tyr Met Pro Gln Pro Tyr Gly Glu Gly Trp Thr Phe Ser Pro
        420                 425                 430Gln Thr His Thr Gly Val Asp Gln Ala Gln
    435                 440<210>27<211>280<212>PRT<213>弱氧化葡糖杆菌<400>27Ala Gly Thr Pro Leu Lys Ile Gly Val Ser Phe Gln Glu Met Asn Asn1               5                  10                  15Pro Tyr Phe Val Thr Met Lys Asp Ala Leu Gln Glu Ala Ala Gly Thr
         20                  25                  30Ile Gly Ala Asn Val Ile Ile Ser Asp Ala His His Asp Val Ser Lys
     35                  40                  45Gln Val Ser Asp Ile Glu Asp Met Ile Gln Gln Gly Ala Gln Ile Ile
 50                  55                  60Ile Ile Asn Pro Thr Asp Thr Val Gly Val Thr Ser Val Val Lys Ser65                  70                  75                  80Val His Asp Lys Asn Ile Pro Ile Val Ser Val Asp Ala Gln Ala Gly
             85                  90                  95Gly Pro Leu Asp Ala Phe Val Gly Ser Lys Asn Tyr Asp Ala Gly Phe
        100                 105                 110Lys Ala Cys Glu Tyr Leu Ala Thr Thr Ile Lys Ser Gly Asn Ile Gly
    115                 120                 125Ile Ile Asp Gly Ile Pro Val Val Pro Ile Leu Glu Arg Val Lys Gly
130                 135                 140Cys Lys Asn Ala Ile Ala Lys His Ser Asp Ile Lys Ile Val Ser Val145                 150                 155                 160Gln Asn Gly Lys Gln Glu Arg Asp Glu Ala Leu Thr Val Ala Glu Asn
            165                 170                 175Met Leu Gln Ala Asn Pro Asp Leu Lys Gly Ile Phe Ser Val Asn Asp
        180                 185                 190Asn Gly Ser Leu Gly Val Leu Ser Ala Ile Glu Ser Ser Gly Ser Asp
    195                 200                 205Val Lys Leu Val Ser Val Asp Gly Asn Pro Glu Ala Val Lys Ala Ile
210                 215                 220Tyr Lys Pro Gly Ser His Phe Ile Ala Thr Ala Ala Gln Phe Pro Arg225                 230                 235                 240Gln Asp Ile Arg Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Arg Lys Trp Gly
            245                 250                 255Ala Gly Val Pro Lys Val Leu Pro Val Asp Val Glu Leu Ile Asp Ala
        260                 265                 270Thr Lys Ala Lys Thr Phe Ser Trp
    275                 280<210>28<211>664<212>DNA<213>弱氧化葡糖杆菌<400>28cgagaacgga agcccgctga aatcgacccg ttccccatca aaatactttt cgagaagatc 60acgaaccttc accaggagcg gcgtctcttc ctgatcgcgc ccccaccccc aatcgagagc 120aacaatacgc ccgtcatctt cactgatggt cagggctccg agatgggaat ggcaggaaag 180ctgtggcata cagatacgct gccccatccc ccggaaagcg tcaatcatgc ttccctaaaa 240gagtccctga gaaaaaaata catgcgtgtc acgcatatgc agggaggccg gtattctcaa 300ataacatatg ggatcatttt tgtatgattt catgaaatat tacgcacttt gttgagaaac 360tgccattttt tgtgtcaaac ctgcgacaga cactaaagct gttttggttg tttggttatt 420aagaataatt ctcatgtaat taagcgagcg attttacgcg gatagtgctc acggagacgt 480cagaagccca cgtttccgac aaacaataaa ataagcgagt agtaagttca cgcgatgcta 540cgttttccag acgacttgga gaaactgagg agcacctagg cacccacaga ggcgcctatc 600aggacttgga ttacgtctga ataccattaa caggaacagt ctttgcaaaa aggacagtcg 660gatc                                                              664<210>29<211>615<212>DNA<213>弱氧化葡糖杆菌<400>29tcgagaagat cacgaacctt caccaggagc ggcgtctctt cctgatcgcg cccccacccc 60caatcgagag caacaatacg cccgtcatct tcactgatgg tcagggctcc gagatgggaa 120tggcaggaaa gctgtggcat acagatacgc tgccccatcc cccggaaagc gtcaatcatg 180cttccctaaa agagtccctg agaaaaaaat acatgcgtgt cacgcatatg cagggaggcc 240ggtattctca aataacatat gggatcattt ttgtatgatt tcatgaaata ttacgcactt 300tgttgagaaa ctgccatttt ttgtgtcaaa cctgcgacag acactaaagc tgttttggtt 360gtttggttat taagaataat tctcatgtaa ttaagcgagc gattttacgc ggatagtgct 420cacggagacg tcagaagccc acgtttccga caaacaataa aataagcgag tagtaagttc 480acgcgatgct acgttttcca gacgacttgg agaaactgag gagcacctag gcacccacag 540aggcgcctat caggacttgg attacgtctg aataccatta acaggaacag tctttgcaaa 600aaggacagtc ggatc                                                  615<210>30<211>565<212>DNA<213>弱氧化葡糖杆菌<400>30cccccacccc caatcgagag caacaatacg cccgtcatct tcactgatgg tcagggctcc 60gagatgggaa tggcaggaaa gctgtggcat acagatacgc tgccccatcc cccggaaagc 120gtcaatcatg cttccctaaa agagtccctg agaaaaaaat acatgcgtgt cacgcatatg 180cagggaggcc ggtattctca aataacatat gggatcattt ttgtatgatt tcatgaaata 240ttacgcactt tgttgagaaa ctgccatttt ttgtgtcaaa cctgcgacag acactaaagc 300tgttttggtt gtttggttat taagaataat tctcatgtaa ttaagcgagc gattttacgc 360ggatagtgct cacggagacg tcagaagccc acgtttccga caaacaataa aataagcgag 420tagtaagttc acgcgatgct acgttttcca gacgacttgg agaaactgag gagcacctag 480gcacccacag aggcgcctat caggacttgg attacgtctg aataccatta acaggaacag 540tctttgcaaa aaggacagtc ggatc                                       565<210>31<211>515<212>DNA<213>弱氧化葡糖杆菌<400>31tcagggctcc gagatgggaa tggcaggaaa gctgtggcat acagatacgc tgccccatcc 60cccggaaagc gtcaatcatg cttccctaaa agagtccctg agaaaaaaat acatgcgtgt 120cacgcatatg cagggaggcc ggtattctca aataacatat gggatcattt ttgtatgatt 180tcatgaaata ttacgcactt tgttgagaaa ctgccatttt ttgtgtcaaa cctgcgacag 240acactaaagc tgttttggtt gtttggttat taagaataat tctcatgtaa ttaagcgagc 300gattttacgc ggatagtgct cacggagacg tcagaagccc acgtttccga caaacaataa 360aataagcgag tagtaagttc acgcgatgct acgttttcca gacgacttgg agaaactgag 420gagcacctag gcacccacag aggcgcctat caggacttgg attacgtctg aataccatta 480acaggaacag tctttgcaaa aaggacagtc ggatc                            515<210>32<211>465<212>DNA<213>弱氧化葡糖杆菌<400>32tgccccatcc cccggaaagc gtcaatcatg cttccctaaa agagtccctg agaaaaaaat 60acatgcgtgt cacgcatatg cagggaggcc ggtattctca aataacatat gggatcattt 120ttgtatgatt tcatgaaata ttacgcactt tgttgagaaa ctgccatttt ttgtgtcaaa 180cctgcgacag acactaaagc tgttttggtt gtttggttat taagaataat tctcatgtaa 240ttaagcgagc gattttacgc ggatagtgct cacggagacg tcagaagccc acgtttccga 300caaacaataa aataagcgag tagtaagttc acgcgatgct acgttttcca gacgacttgg 360agaaactgag gagcacctag gcacccacag aggcgcctat caggacttgg attacgtctg 420aataccatta acaggaacag tctttgcaaa aaggacagtc ggatc                 465<210>33<211>415<212>DNA<213>弱氧化葡糖杆菌<400>33agaaaaaaat acatgcgtgt cacgcatatg cagggaggcc ggtattctca aataacatat 60gggatcattt ttgtatgatt tcatgaaata ttacgcactt tgttgagaaa ctgccatttt 120ttgtgtcaaa cctgcgacag acactaaagc tgttttggtt gtttggttat taagaataat 180tctcatgtaa ttaagcgagc gattttacgc ggatagtgct cacggagacg tcagaagccc 240acgtttccga caaacaataa aataagcgag tagtaagttc acgcgatgct acgttttcca 300gacgacttgg agaaactgag gagcacctag gcacccacag aggcgcctat caggacttgg 360attacgtctg aataccatta acaggaacag tctttgcaaa aaggacagtc ggatc      415<210>34<211>365<212>DNA<213>弱氧化葡糖杆菌<400>34aataacatat gggatcattt ttgtatgatt tcatgaaata ttacgcactt tgttgagaaa 60ctgccatttt ttgtgtcaaa cctgcgacag acactaaagc tgttttggtt gtttggttat 120taagaataat tctcatgtaa ttaagcgagc gattttacgc ggatagtgct cacggagacg 180tcagaagccc acgtttccga caaacaataa aataagcgag tagtaagttc acgcgatgct 240acgttttcca gacgacttgg agaaactgag gagcacctag gcacccacag aggcgcctat 300caggacttgg attacgtctg aataccatta acaggaacag tctttgcaaa aaggacagtc 360ggatc                                                             365<210>35<211>315<212>DNA<213>弱氧化葡糖杆菌<400>35tgttgagaaa ctgccatttt ttgtgtcaaa cctgcgacag acactaaagc tgttttggtt 60gtttggttat taagaataat tctcatgtaa ttaagcgagc gattttacgc ggatagtgct 120cacggagacg tcagaagccc acgtttccga caaacaataa aataagcgag tagtaagttc 180acgcgatgct acgttttcca 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Claims (34)

1.一种分离的核酸分子，其包含选自如下的多核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO：1的多核苷酸；
(b)一种多核苷酸片段，其为SEQ ID NO：1多核苷酸的至少约20个核苷酸长；
(c)一种多核苷酸，其编码SEQ ID NO：4的氨基酸序列；以及
(d)一种多核苷酸，其编码为SEQ ID NO：4氨基酸序列的至少约10个氨基酸长的片段。
2.一种分离的核酸分子，其所包含的多核苷酸至少约95％与 1中分离的核酸分子相同。
3.一种含有权利要求1的核酸之载体。
4.一种产生权利要求3的载体的方法，其包含：
(a)将权利要求1的多核苷酸插入载体；以及
(b)在宿主细胞中选择和扩增该载体。
5.一种包含权利要求3的载体之宿主细胞。
6.一种分离的核酸分子，其包含选自如下的多核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO：2的多核苷酸，或其片段；
(b)一种多核苷酸片段，其为SEQ ID NO：2多核苷酸的至少约20个核苷酸长；
(c)一种多核苷酸，其编码SEQ ID NO：5的氨基酸序列；以及
(d)一种多核苷酸，其编码为SEQ ID NO：5氨基酸序列的至少约10个氨基酸长的片段。
7.一种分离的核酸分子，其所包含的多核苷酸至少约95％与 6中分离的核酸分子相同。
8.一种含有权利要求6的核酸之载体。
9.一种产生权利要求8的载体的方法，其包含：
(a)将权利要求6的多核苷酸插入载体；以及
(b)在宿主细胞中选择和扩增该载体。
10.一种包含权利要求8的载体之宿主细胞。
11.一种分离的核酸分子，其包含选自如下的多核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO：3的多核苷酸；
(b)一种多核苷酸片段，其为SEQ ID NO：3多核苷酸的至少约20个核苷酸长；
(c)一种多核苷酸，其编码SEQ ID NO：6的氨基酸序列；以及
(d)一种多核苷酸，其编码为SEQ ID NO：6氨基酸序列的至少约10个氨基酸长的片段。
12.一种分离的核酸分子，其所包含的多核苷酸至少约95％与权利要求11中分离的核酸分子相同。
13.一种含有权利要求11的核酸之载体。
14.一种产生权利要求13的载体的方法，其包含：
(a)将权利要求11的多核苷酸插入载体；以及
(b)在宿主细胞中选择和增殖该载体。
15.一种包含权利要求13的载体之宿主细胞。
16.一种分离的核酸分子，其包含选自如下的多核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO：7的多核苷酸，以及；
(b)一种多核苷酸片段，其为SEQ ID NO：7多核苷酸的至少约20个核苷酸长；
17.一种分离的核酸分子，其所包含的多核苷酸至少约95％与 16中分离的核酸分子相同。
18.一种含有权利要求16的核酸之载体。
19.一种产生权利要求18的载体的方法，其包含：
(a)将权利要求16的多核苷酸插入载体；以及
(b)在宿主细胞中选择和扩增该载体。
20.一种宿主细胞，其包含权利要求18的载体。
21.权利要求16的核酸分子，其中该多核苷酸具有KCTC保藏号No.0593BP中包含的DNA克隆之完整核苷酸序列。
22.一种分离的核酸分子，其包含选自如下的多核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO：8的多核苷酸，以及；
(b)一种多核苷酸片段，其为SEQ ID NO：8多核苷酸的至少约20个核苷酸长；
23.一种分离的核酸分子，其所包含的多核苷酸至少约95％与 22中分离的核酸分子相同。
24.一种含有权利要求22的核酸之载体。
25.一种产生权利要求24的载体的方法，其包含：
(a)将权利要求22的多核苷酸插入载体；以及
(b)在宿主细胞中选择和扩增该载体。
26.一种包含权利要求24的载体之宿主细胞。
27.权利要求22的核酸分子，其中该多核苷酸具有KCTC保藏号No.0594BP中包含的DNA克隆之完整核苷酸序列。
28.一种从D-山梨糖醇生产L-山梨糖的方法，其包括：
(a)用至少一种分离的核酸序列转化宿主细胞，其中分离的核酸序列选自：
(b)一种多核苷酸，其包含SEQ ID NO：1的多核苷酸序列；
(c)一种多核苷酸，其包含SEQ ID NO：2的多核苷酸序列；以及
(d)一种多核苷酸，其包含SEQ ID NO：3的多核苷酸序列；以及
(e)筛选和增殖该转化的宿主细胞。
29.权利要求28的方法，其中该宿主细胞为葡糖杆菌属。
30.一种分离的多肽，其包含选自如下的多肽序列：
(a)由SEQ ID NO：3的多核苷酸序列编码的多肽序列；
(b)SEQ ID NO：6的多肽序列；以及
(c)一种多肽，其为SEQ ID NO：6多肽序列的至少约10个氨基酸长。
31.一种产生多肽的方法，其包括：
(a)生长权利要求15的宿主细胞。
(b)表达权利要求29的多肽；以及
(c)分离该多肽。
32.一种增加2-酮-L-古洛糖酸产量的方法，其包括：
(a)用至少一种分离的核酸序列转化宿主细胞，其中分离的核酸序列选自：
(b)一种多核苷酸，其包含SEQ ID NO：1的多核苷酸序列；
(c)一种多核苷酸，其包含SEQ ID NO：2的多核苷酸序列；以及
(d)一种多核苷酸，其包含SEQ ID NO：3的多核苷酸序列；以及
(e)筛选和增殖该转化的宿主细胞。
33.一种分离的核酸分子，其包含选自如下的多核苷酸序列：
(a)如SEQ ID NO：28所示的SEQ ID NO：7中1-644的核苷酸；
(b)如SEQ ID NO：29所示的SEQ ID NO：7中50-644的核苷酸；
(c)如SEQ ID NO：30所示的SEQ ID NO：7中100-644的核苷酸；
(d)如SEQ ID NO：31所示的SEQ ID NO：7中150-644的核苷酸；
(e)如SEQ ID NO：32所示的SEQ ID NO：7中200-644的核苷酸；
(f)如SEQ ID NO：33所示的SEQ ID NO：7中250-644的核苷酸；
(g)如SEQ ID NO：34所示的SEQ ID NO：7中300-644的核苷酸；
(h)如SEQ ID NO：35所示的SEQ ID NO：7中350-644的核苷酸；
(i)如SEQ ID NO：36所示的SEQ ID NO：7中400-644的核苷酸；
(j)如SEQ ID NO：37所示的SEQ ID NO：7中450-644的核苷酸；
(k)如SEQ ID NO：38所示的SEQ ID NO：7中500-644的核苷酸；
(l)如SEQ ID NO：39所示的SEQ ID NO：7中550-644的核苷酸；
(m)如SEQ ID NO：40所示的SEQ ID NO：7中600-644的核苷酸；
(n)如SEQ ID NO：1所示的SEQ ID NO：7中665-2,929的核苷酸序列，其编码本发明的SDH之亚基1蛋白质的全长；
(o)如SEQ ID NO：22所示的SEQ ID NO：7中767-2,929的核苷酸序列，其编码本发明的SDH之亚基1蛋白质的成熟形式；
(p)如SEQ ID NO：41所示的SEQ ID NO：7中2,930-2,963的核苷酸；
(q)如SEQ ID NO：2所示的SEQ ID NO：7中2,964-4,400的核苷酸序列，其编码本发明的SDH之亚基2蛋白质的全长；
(r)如SEQ ID NO：23所示的SEQ ID NO：7中3,072-4,400的核苷酸序列，其编码本发明的SDH之亚基2蛋白质的成熟形式；
(s)如SEQ ID NO：42所示的SEQ ID NO：7中4,401-4,451的核苷酸；
(t)如SEQ ID NO：43所示的SEQ ID NO：7中4,401-4,501的核苷酸；
(u)如SEQ ID NO：44所示的SEQ ID NO：7中4,401-4,551的核苷酸；
(v)如SEQ ID NO：45所示的SEQ ID NO：7中4,401-4,601的核苷酸；
(w)如SEQ ID NO：46所示的SEQ ID NO：7中4,401-4,651的核苷酸；
(x)如SEQ ID NO：47所示的SEQ ID NO：7中4,401-4,701的核苷酸；
(y)如SEQ ID NO：48所示的SEQ ID NO：7中4,401-4,751的核苷酸；
(z)如SEQ ID NO：49所示的SEQ ID NO：7中4,401-4,801的核苷酸；以及
(aa)如SEQ ID NO：50所示的SEQ ID NO：7中4,401-4,830的核苷酸。
34.一种分离的核酸分子，其包含选自如下的多核苷酸序列：
(a)如SEQ ID NO：51所示的SEQ ID NO：8中1-1,383的核苷酸；
(b)如SEQ ID NO：52所示的SEQ ID NO：8中50-1,383的核苷酸；
(c)如SEQ ID NO：53所示的SEQ ID NO：8中100-1,383的核苷酸；
(d)如SEQ ID NO：54所示的SEQ ID NO：8中150-1,383的核苷酸；
(e)如SEQ ID NO：55所示的SEQ ID NO：8中200-1,383的核苷酸；
(f)如SEQ ID NO：56所示的SEQ ID NO：8中250-1,383的核苷酸；
(g)如SEQ ID NO：57所示的SEQ ID NO：8中300-1,383的核苷酸；
(h)如SEQ ID NO：58所示的SEQ ID NO：8中350-1,383的核苷酸；
(i)如SEQ ID NO：59所示的SEQ ID NO：8中400-1,383的核苷酸；
(j)如SEQ ID NO：60所示的SEQ ID NO：8中450-1,383的核苷酸；
(k)如SEQ ID NO：61所示的SEQ ID NO：8中500-1,383的核苷酸；
(l)如SEQ ID NO：62所示的SEQ ID NO：8中550-1,383的核苷酸；
(m)如SEQ ID NO：63所示的SEQ ID NO：8中600-1,383的核苷酸；
(n)如SEQ ID NO：64所示的SEQ ID NO：8中600-1,383的核苷酸；
(o)如SEQ ID NO：65所示的SEQ ID NO：8中650-1,383的核苷酸；
(p)如SEQ ID NO：66所示的SEQ ID NO：8中700-1,383的核苷酸；
(q)如SEQ ID NO：67所示的SEQ ID NO：8中750-1,383的核苷酸；
(r)如SEQ ID NO：68所示的SEQ ID NO：8中800-1,383的核苷酸；
(s)如SEQ ID NO：69所示的SEQ ID NO：8中850-1,383的核苷酸；
(t)如SEQ ID NO：70所示的SEQ ID NO：8中900-1,383的核苷酸；
(u)如SEQ ID NO：71所示的SEQ ID NO：8中950-1,383的核苷酸；
(v)如SEQ ID NO：72所示的SEQ ID NO：8中1,000-1,383的核苷酸；
(w)如SEQ ID NO：73所示的SEQ ID NO：8中1,050-1,383的核苷酸；
(x)如SEQ ID NO：74所示的SEQ ID NO：8中1,100-1,383的核苷酸；
(y)如SEQ ID NO：75所示的SEQ ID NO：8中1,150-1,383的核苷酸；
(z)如SEQ ID NO：76所示的SEQ ID NO：8中1,200-1,383的核苷酸；
(aa)如SEQ ID NO：77所示的SEQ ID NO：8中1,250-1,383的核苷酸；
(bb)如SEQ ID NO：78所示的SEQ ID NO：8中1,300-1,383的核苷酸；
(cc)如SEQ ID NO：79所示的SEQ ID NO：8中1,350-1,383的核苷酸；
(dd)如SEQ ID NO：3所示的SEQ ID NO：8中从核苷酸1,384-1,461的核苷酸序列，其编码本发明之SDH亚基3蛋白质的全长；
(ee)如SEQ ID NO：24所示的SEQ ID NO：8中从核苷酸1,462-2,304的核苷酸序列，其编码本发明之SDH亚基3蛋白质的成熟形式；
(ff)如SEQ ID NO：80所示的SEQ ID NO：8中2,305-2,355的核苷酸；
(gg)如SEQ ID NO：81所示的SEQ ID NO：8中2,305-2,405的核苷酸；
(hh)如SEQ ID NO：82所示的SEQ ID NO：8中2,305-2,455的核苷酸；
(ii)如SEQ ID NO：82所示的SEQ ID NO：8中2,305-2,505的核苷酸；
(jj)如SEQ ID NO：83所示的SEQ ID NO：8中2,305-2,555的核苷酸；
(kk)如SEQ ID NO：85所示的SEQ ID NO：8中2,305-2,605的核苷酸；
(ll)如SEQ ID NO：86所示的SEQ ID NO：8中2,305-2,655的核苷酸；以及
(mm)如SEQ ID NO：87所示的SEQ ID NO：8中2,305-2,700的核苷酸。
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