CN103842816A - 测定氧化还原指示剂的色调变化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供能够利用于致龋菌数的测定等的、测定氧化还原指示剂的色调变化的方法。一种测定氧化还原指示剂的色调变化的方法，其包括使检查试剂与受检试样反应来测定色调变化的步骤，上述检查试剂包含氧化还原指示剂、氧化还原反应促进剂及卤素的盐，利用该方法测定氧化还原指示剂的色调变化。

Description

测定氧化还原指示剂的色调变化的方法

技术领域

本发明涉及能够利用于致龋菌数的测定等的、测定氧化还原指示剂的色调变化的方法、以及用于该方法的试验片。

背景技术

在口腔内存在多种细菌，其中，将引起龋齿的细菌称作致龋菌。例如，唾液中的致龋菌数越高，认为龋齿风险越高，即显示出口腔以哪种程度处于易患龋齿的状态的风险越高。作为致龋菌的检测法，已知使用作为氧化还原指示剂的刃天青的检测法(专利文献1、2)、利用基于NADH等的还原力的化学发光的检测法(专利文献3)等。

刃天青通常以作为氧化型的蓝色色素的刃天青(极大吸收波长605nm)形式存在，其被通过细菌的代谢生成的NADH、NADPH(以下，有时将它们统称为“NAD(P)H”)还原，转化为作为红紫色色素(极大吸收波长573nm)的试卤灵。此外，试卤灵进一步被NAD(P)H还原，转化为无色的氢化刃天青。因此，基于刃天青的色调变化，可以对受检试样中的细菌、主要是包含致龋菌的革兰氏阳性菌的菌数进行测定。作为利用了刃天青的致龋菌数的测定系统，已知RDテスト“昭和”(商品名、昭和药品化工株式会社制)、CAT21ファスト(商品名、ウィルデント公司制)。

1-甲氧基-5-甲基吩嗪

硫酸甲酯盐(1-甲氧基PMS)、吩嗪

硫酸甲酯盐(PMS)、吩嗪硫酸乙酯(PES)等电子载体例如在使用四唑

盐作为显色试剂的反应体系中作为四唑

盐的氧化还原反应的介质(mediator)来利用。此外，PMS在使用刃天青作为氧化还原指示剂的反应体系中作为介质(mediator)来利用(专利文献4)，但是，作为介质(mediator)，与PMS相比，更优选黄递酶(专利文献4)。

但是，还不清楚在利用这样的氧化还原指示剂、介质的反应体系中进一步利用氯化钠、氯化钾等盐。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开昭58-225029号公报

专利文献2：日本特开2004-093335号公报

专利文献3：日本特开平10-210998号公报

专利文献4：日本特开昭62-239999号公报

发明内容

发明所要解决的问题

在上述的以往的致龋菌数的测定系统中，需要32℃～37℃的温度调节和15～20分钟的反应时间，无法在牙科医院等以短时间进行致龋菌数的测定。此外，在不进行温度调节的情况下，存在反应所需时间进一步增大的问题。即，在以往的致龋菌数的测定法中，在反应温度、所需时间的方面尚有改善的余地。本发明的课题在于提供能够利用于致龋菌数的测定等的、测定氧化还原指示剂的色调变化的新方法。

用于解决问题的方法

本发明人进行了深入研究，结果发现，在使用含有刃天青作为显色指示剂的检查试剂的致龋菌数的测定方法中，通过添加1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯盐(1-甲氧基PMS)作为检查试剂的成分，显色反应性提高。本发明人还发现，通过进一步添加氯化钠、氯化钾、溴化钠或溴化钾作为检查试剂的成分，显色反应性进一步提高，从而完成了本发明。

即，本发明可以列举如下示例。

[1]一种测定氧化还原指示剂的色调变化的方法，其包括使检查试剂与受检试样反应来测定色调变化的步骤，

上述检查试剂包含氧化还原指示剂、氧化还原反应促进剂及卤素的盐。

[2]如[1]所述的方法，其为对受检试样中的致龋菌数进行测定的方法。

[3]如[1]或[2]所述的方法，其中，上述氧化还原指示剂为刃天青。

[4]如[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，上述氧化还原反应促进剂为1-甲氧基-5-甲基吩嗪

硫酸甲酯盐、吩嗪

硫酸甲酯盐或吩嗪硫酸乙酯。

[5]如[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，上述卤素的盐为氯化钠、氯化钾、溴化钠或溴化钾。

[6]如[1]～[5]中任一项所述的方法，其使用具有支撑载体和负载于该支撑载体的吸收性载体的试验片进行测定，所述试验片中，上述吸收性载体用于保持上述检查试剂。

[7]一种NADH和NADPH的测定试剂，其包含氧化还原指示剂、氧化还原反应促进剂及卤素的盐。

[8]如[7]所述的试剂，其中，上述氧化还原指示剂为刃天青。

[9]如[7]或[8]所述的试剂，其中，上述氧化还原反应促进剂为1-甲氧基-5-甲基吩嗪

硫酸甲酯盐、吩嗪

硫酸甲酯盐或吩嗪硫酸乙酯。

[10]如[7]～[9]中任一项所述的试剂，其中，上述卤素的盐为氯化钠、氯化钾、溴化钠或溴化钾。

[11]一种用于测定NADH和NADPH的试验片，其具有支撑载体和负载于该支撑载体的吸收性载体，所述试验片中，

上述吸收性载体用于保持[7]～[10]中任一项所述的试剂。

[12]如[11]所述的试验片，其为用于测定致龋菌数的试验片。

发明效果

根据本发明，能够明确地测定氧化还原指示剂的色调变化。因此，根据本发明，能够在室温下以短时间测定致龋菌数。因此，根据本发明，在牙科医院等临床现场，能够在无恒温装置等设备的条件下以短时间对多数样本进行处理，能够进行简便且迅速的致龋菌数的检查。

附图说明

图1(A)为表示本发明的试验片的一个实施方式的俯视图，图1(B)为表示本发明的试验片的一个实施方式的前视图。

图2为表示各研究成分对从反应开始1分钟起到5分钟后的反射率变化(Δ4分钟反射率)产生的效果的图。

图3为表示各研究成分对基本反射率产生的效果的图。

图4为表示各研究成分对Δ4分钟反射率产生的效果的图。

图5为表示在1-甲氧基PMS浓度为0.4mM的情况下添加盐时和不添加盐时吐出液中致龋菌数与Δ4分钟反射率的相关关系的图。

图6为表示在1-甲氧基PMS浓度为0.5mM的情况下添加盐时和不添加盐时吐出液中致龋菌数与Δ4分钟反射率的相关关系的图。

图7为表示在1-甲氧基PMS浓度为0.6mM的情况下添加盐时和不添加盐时吐出液中致龋菌数与Δ4分钟反射率的相关关系的图。

图8为表示各种盐类对Δ4分钟反射率产生的效果的图。

具体实施方式

以下，对本发明详细地进行说明。

本发明的方法为测定氧化还原指示剂的显色的方法，其特征在于，利用氧化还原指示剂、氧化还原反应促进剂及卤素的盐。

即，本发明的方法为测定氧化还原指示剂的色调变化的方法，其包括使检查试剂与受检试样反应来测定色调变化的步骤，上述检查试剂包含氧化还原指示剂、氧化还原反应促进剂及卤素的盐。

本发明的方法中，氧化还原指示剂为通过以NAD(P)H作为供电子体的氧化还原反应而显色的指示剂。因此，上述检查试剂可以作为NAD(P)H的测定试剂来利用。

同样，本发明的方法可以利用于受检试样所含的NAD(P)H和/或反应体系中所生成的NAD(P)H的检测。因此，利用本发明的方法，可以检测例如通过受检试样中所含的细菌的代谢生成的NAD(P)H，由此可以检测出受检试样中所含的细菌。作为此类细菌，具体而言，可列举例如致龋菌。

即，本发明的方法的一个方式为测定受检试样中的致龋菌数的方法，其包括使检查试剂与受检试样反应来测定色调变化的步骤，上述检查试剂包含氧化还原指示剂、氧化还原反应促进剂及卤素的盐。以下，举例示出测定致龋菌数的方法，对本发明的方法进行说明。另外，以下，有时将氧化还原指示剂、氧化还原反应促进剂及卤素的盐统称为“有效成分”。

本发明中，致龋菌是指能够成为引起龋齿的原因的菌。作为致龋菌，具体而言，可列举变形链球菌(Streptococcus mutans)及远缘链球菌(Streptococcus sobrinus)等。致龋菌数越多，认为龋齿风险越高，即患有龋齿的风险越高。

本发明中，进行致龋菌数的测定的受检试样并无特别限定。例如，作为进行致龋菌数的测定的受检试样，可列举从口腔得到的受检试样。作为从口腔得到的受检试样，例如可列举安静时唾液(非刺激唾液)、刺激唾液、漱口吐出液。作为刺激唾液，可列举用口香糖进行刺激而采集得到的唾液。其中，优选漱口吐出液。漱口吐出液例如可以通过在口中含漱纯化水并将其吐出而得到。具体而言，例如只要将3mL的纯化水在口中含漱10秒再将其吐出至容器即可。纯化水的容量、在口中含漱的时间可以根据需要适当改变。所得的受检试样可以直接利用于以后的操作而不进行特别的前处理，也可以根据需要进行适当稀释等追加操作。此外，作为进行致龋菌数的测定的受检试样，可列举致龋菌的培养液等包含致龋菌的试样。致龋菌的培养液可以是例如能够从ATCC等生物资源库获得的经分离得到的致龋菌株的培养液。

本发明中，检查试剂包含氧化还原指示剂。本发明中，氧化还原指示剂只要是能够通过以NAD(P)H作为供电子体的氧化还原反应进行显色的指示剂，则并无特别限定。NAD(P)H通过细菌的代谢产生。即，根据受检试样中的细菌、主要是包含致龋菌的革兰氏阳性菌的活菌数，进行氧化还原指示剂的还原。因此，通过氧化还原指示剂的还原而产生的色调变化会反映致龋菌数。需要说明的是，“以NAD(P)H作为供电子体”是指：可以直接被NAD(P)H还原，也可以经由被NAD(P)H还原的其他物质(mediator)而间接地被还原。作为氧化还原指示剂，具体而言，可列举例如刃天青、四唑

盐、亚甲基蓝及二甲苯蓝。其中，优选刃天青。这些氧化还原指示剂可以单独含有，也可以以任意的组合含有。

刃天青通常以作为氧化型蓝色色素的刃天青(极大吸收波长605nm)形式存在，其被NAD(P)H还原，转化为作为红紫色色素(极大吸收波长573nm)的试卤灵。此外，试卤灵进一步被NAD(P)H还原，转化为无色的氢化刃天青。

四唑

盐被NAD(P)H还原，转化为甲色素。作为四唑

盐，具体而言，可列举例如MTT(3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑

溴化物)、XTT(2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑

-5-甲酰苯胺盐)、MTS(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑

)、WST-1(2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)-2H-四唑

)及WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)-2H-四唑

)。其中，优选WST-1或WST-8。

需要说明的是，氧化还原指示剂的吸收光谱因各指示剂而异，因此，显色反应的检测条件只要根据所使用的氧化还原指示剂进行适当设定即可。

本发明的方法中，氧化还原指示剂的浓度只要根据受检试样中的致龋菌数而使显色反应进行则并无特别限定，可以根据所使用的氧化还原指示剂的种类、其他成分等诸条件进行适当设定。例如，在使用试验片进行致龋菌数的测定时，用于制作试验片的试剂浸渍液中的氧化还原指示剂的浓度优选为0.01～1mM，更优选为0.05～0.3mM，进一步优选为0.1～0.16mM。

本发明中，检查试剂包含氧化还原反应促进剂。本发明中，氧化还原反应促进剂只要是促进基于氧化还原反应的氧化还原指示剂的显色反应的化合物，则并无特别限定。作为氧化还原反应促进剂，可列举例如被NAD(P)H还原而成为还原型、且具有将其他物质还原的功能的化合物。作为被还原型的氧化还原反应促进剂还原的其他物质，可列举氧化还原指示剂。作为氧化还原反应促进剂，具体而言，可列举例如1-甲氧基-5-甲基吩嗪

硫酸甲酯盐(1-甲氧基PMS)、吩嗪

硫酸甲酯盐(PMS)、吩嗪硫酸乙酯(PES)。其中，优选1-甲氧基PMS。这些氧化还原反应促进剂可以单独含有，也可以以任意的组合含有。

本发明的方法中，氧化还原反应促进剂的浓度只要能够根据受检试样中的致龋菌数使显色反应进行则并无特别限定，可以根据所使用的氧化还原反应促进剂的种类、其他成分等诸条件进行适当设定。例如，试剂浸渍液中的氧化还原反应促进剂的浓度优选为0.01～5mM，更优选为0.05～1mM，进一步优选为0.1～0.6mM。

本发明中，检查试剂包含卤素的盐。本发明中，卤素的盐是指卤素离子与任意的阳离子进行离子键合而得到的盐。作为卤素的盐，可列举例如氟化物盐、氯化物盐、溴化物盐、碘化物盐。作为卤素的盐，优选氯化物盐或溴化物盐，更优选氯化物盐。此外，作为卤素的盐，优选卤素与碱金属的盐。作为碱金属，优选钠或钾。作为卤素的盐，具体而言，可优选使用氯化钠、氯化钾、溴化钠或溴化钾。这些卤素的盐可以单独含有，也可以以任意的组合含有。

本发明的方法中，卤素的盐的浓度只要能够根据受检试样中的致龋菌数使显色反应进行则并无特别限定，可以根据所使用的卤素的盐的种类、其他成分等诸条件进行适当设定。例如，试剂浸渍液中的卤素的盐的浓度优选为1～1000mM，更优选为5～500mM，特别优选为50～200mM。

通过包含卤素的盐，可以期待例如显色反应的背景的降低。具体而言，例如，在氧化还原指示剂为刃天青、氧化还原反应促进剂为1-甲氧基PMS时，与单独使用刃天青时相比，在将刃天青和1-甲氧基PMS混合使用的情况下，刃天青的蓝色位移至红色侧，通过进一步添加卤素的盐，可以使刃天青的色调回到蓝色侧。如上所述，刃天青(蓝色)被NAD(P)H还原为试卤灵(红紫色)，因此，刃天青的蓝色位移至红色侧意味着显色反应的背景增大，并且意味着色调可变化的范围仅限于该位移的量。因此，利用卤素的盐使刃天青的色调回到蓝色侧意味着显色反应的背景降低，并且意味着能够扩大色调可变化的范围。因此，本发明的方法中，通过包含卤素的盐，与不含卤素的盐的情况相比，更能明确地测定色调变化。因此，卤素的盐对于基于色调变化的致龋菌数的测定是有效的。

此外，只要能够根据受检试样中的致龋菌数使显色反应进行，则检查试剂也可以含有其他成分。

检查试剂优选含有例如碳源。碳源优选能够使致龋菌同化的碳源以便能够使致龋菌的代谢活化。作为碳源，可列举糖类、有机酸，优选糖类。作为糖类，具体而言，可列举蔗糖、葡萄糖，特别优选蔗糖。在含有碳源时，试剂浸渍液中的碳源的浓度优选为1～1000mM，更优选为5～500mM，特别优选为20～250mM。

此外，检查试剂可以含有例如pH缓冲剂。作为pH缓冲剂，具体而言，可列举例如磷酸缓冲剂、HEPES缓冲剂、PIPES缓冲剂、MES缓冲剂、Tris缓冲剂、GTA广域缓冲剂。在含有pH缓冲剂时，试剂浸渍液中的pH缓冲剂的浓度优选为10～1000mM，更优选为20～500mM，特别优选为50～150mM。反应液的pH例如通常为pH4.0～9.0，优选为5.5～8.0。

此外，检查试剂可以含有例如粘合剂。作为粘合剂，具体而言，可列举例如聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羧甲基纤维素。在含有粘合剂时，试剂浸渍液中的粘合剂的浓度优选为0.01～5%，更优选为0.05～3%，进一步优选为0.1～1%。需要说明的是，本发明中，粘合剂的浓度的“%”只要无特别说明则是指w/v%。

此外，检查试剂也可以含有例如抑制除致龋菌以外的代谢的药剂。作为此类药剂，具体而言，可列举例如用于抑制杆菌肽等致龋菌以外的细菌的增殖的药剂、抑制亚碲酸钾等革兰氏阴性菌的增殖的药剂。

这些成分均可以分别单独含有，也可以以任意的组合含有。

本发明的方法可以使用试验片来实施。本发明的方法中使用的试验片(以下，也称作本发明的试验片)为用于保持包含氧化还原指示剂、氧化还原反应促进剂及卤素的盐的检查试剂的试验片。本发明的试验片可以为用于测定NAD(P)H的试验片，其一个方式为用于测定致龋菌数的试验片。以下，举例示出用于测定致龋菌数的试验片，对本发明的试验片进行说明。

本发明的试验片优选具有支撑载体和负载于该支撑载体的吸收性载体，且该吸收性载体用于保持检查试剂。通过将受检试样点样于用于保持检查试剂的吸收性载体部分，能够根据受检试样中的致龋菌数使显色反应进行。图1中举例示出具有支撑载体10和负载于支撑载体10的吸收性载体11的、本发明的试验片的一个实施方式的试验片1。图1(A)为试验片1的俯视图，图1(B)为试验片1的前视图。

作为吸收性载体，只要能够保持检查试剂且能够测定基于氧化还原指示剂的还原的色调变化，则任意载体均可使用。即，作为吸收性载体，可列举例如纸、纤维素、多孔陶瓷、化学纤维、合成树脂制织布及无纺布，优选为滤纸或玻璃纤维滤纸。作为滤纸或玻璃纤维滤纸，可以优选使用例如市售的产品。

作为支撑载体，可以优选使用膜、片或板等平面状载体。支撑载体可以为塑料制或纸制。作为塑料，可以使用例如聚乙烯、聚丙烯、聚酯及聚氯乙烯等各种塑料。作为支撑载体，优选例如聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)制载体。此外，支撑载体可以为复合材料，可以利用聚酯与聚乙烯的复合材料、将聚乙烯和铝层叠而成的复合材料、其他各种复合材料。支撑载体的厚度优选为10～500μm，更优选为50～300μm。

本发明的试验片中，可以具备至少1个用于保持致龋菌数测定用检查试剂的吸收性载体，也可以具备2个或2个以上用于保持致龋菌数测定用检查试剂的吸收性载体。

此外，本发明的试验片除了具有用于保持致龋菌数测定用检查试剂的吸收性载体以外，还可以具有除致龋菌数以外的参数测定用的吸收性载体。进而，本发明的试验片除了具有致龋菌数等的参数测定用的吸收性载体以外，还可以具有任意的试验纸、例如不用于参数的测定的空白样本的吸收性载体。在本发明的试验片具有多个吸收性载体时，各吸收性载体只要根据所使用的检测仪器的种类等进行适当排列即可。作为检测仪器，可以优选使用各种反射率测定仪器，例如，在使用Pocket Chem UA PU-4010(爱科来株式会社制)作为检测仪器时，优选各吸收性载体在支撑载体上呈直线状排列。

制造本发明的试验片的方法并无特别限定，本发明的试验片可以通过例如使预先保持有检查试剂的吸收性载体负载于支撑载体来制造。使试剂保持于吸收性载体的方法并无特别限定，例如可以将吸收性载体浸渍于试剂溶液，也可以将试剂溶液点样或涂布于吸收性载体。其中，优选将吸收性载体浸渍于试剂溶液。需要说明的是，试剂溶液为含有检查试剂的溶液。使试剂保持于吸收性载体的步骤可以包含多次的浸渍、多次的点样或多次的涂布等步骤。保持有试剂的吸收性载体可以在干燥后用于以后的步骤。可以根据需要将保持有试剂的吸收性载体切断，再负载于支撑载体，由此来制造本发明的试验片。此外，本发明的试验片可以通过例如使检查试剂保持于在支撑载体上预先负载的吸收性载体来制造。此时，优选的是：通过将试剂溶液点样或涂布于吸收性载体，使试剂保持于吸收性载体，之后使其干燥。本发明的试验片中，使吸收性载体负载于支撑载体的方法并无特别限制，例如可以优选使用通常所使用的胶粘方法。例如，可以利用粘合带进行粘贴，也可以利用胶粘剂进行粘贴。

根据本发明的方法，不进行温度调节即可测定致龋菌数。即，反应温度可以为室温。具体而言，例如，反应温度通常为15℃～37℃，也可以为15℃～30℃。需要说明的是，本发明的方法中可以适当进行温度调节。

本发明的方法中，反应时间可以根据反应温度、试剂成分等诸条件进行适当设定。反应时间例如通常为1～10分钟。例如，反应时间可以为5分钟。

本发明的方法中，可以基于所测定的色调变化而测定致龋菌数。需要说明的是，“测定致龋菌数”不限于算出受检试样中的致龋菌数的值本身，可以将受检试样中的致龋菌数的程度划分成至少2个等级、优选3个等级或3个以上的等级来判定。具体而言，例如只要判定出受检试样中的致龋菌数属于“少”、“中等程度”或“多”3个等级中的哪一个即可。划分为多个等级时的具体的菌数只要根据临床数据、所使用的受检试样的形态进行适当设定即可。若列举一个例子，则以通过用3mL的纯化水漱口10秒而得的漱口吐出液中的致龋菌数计，在低于10⁶CFU/mL时判定为“少”，在10⁶CFU/mL以上且低于10⁷CFU/mL时判定为“中等程度”，在10⁷CFU/mL以上时判定为“多”。

利用本发明的方法测得的色调变化、致龋菌数的值或致龋菌数的程度可以用于判定采集受检试样的受检者的龋齿风险。例如，基于色调变化、致龋菌数的值或致龋菌数的程度，可以将采集受检试样的受检者的龋齿风险划分为至少2个等级、优选3个或3个以上的等级来判定。具体而言，例如只要判定出采集受检试样的受检者的龋齿风险属于“低”、“中等程度”或“高”3个等级中的哪一个即可。本发明的方法中，如此地判定龋齿风险也是“测定致龋菌数”的一个方式。需要说明的是，利用本发明的方法测得的色调变化、致龋菌数的值或致龋菌数的程度可以单独用于龋齿风险的判定，也可以与其他参数组合来用于龋齿风险的判定。

基于色调变化的致龋菌数的测定只要使用菌数已知的致龋菌标准试样获得致龋菌数与色调变化的相关数据并利用该相关数据进行即可。相关数据是指例如标准曲线。此外，在进行龋齿风险的判定时，只要进一步设定包含龋齿风险的相关数据并加以利用即可。

本发明的方法中，色调变化是指基于氧化还原指示剂的还原的在特定波长下的吸光度的增减和/或极大吸收波长的位移。即，本发明的方法中，氧化还原指示剂的一部分或全部被还原，由此根据被还原的氧化还原指示剂的量和/或比率而产生在特定波长下的吸光度的增减和/或极大吸收波长的位移。

本发明的方法中，色调变化可以利用光学检测仪器测定。色调变化优选以在特定波长下的吸光度的增减进行测定。

在特定波长下的吸光度的增减通常可以通过如下方法测定：对显色部位、即点样有受检试样的吸收性载体部分照射该特定波长的光，获得在该特定波长下的经过一定时间的反射率的变化值。在特定波长下的吸光度的增加可以测定为在该特定波长下的反射率的减少。在特定波长下的吸光度的减少可以以在该特定波长下的反射率的增加进行测定。一定时间可以是从受检试样的刚点样后起至经过任意时间为止，也可以是从受检试样的点样后的某个时刻起至进一步经过任意时间为止。一定时间的长度可以根据反应时间等诸条件进行适当设定，例如通常为1～10分钟，也可以为2～8分钟。受检试样的点样后的某个时刻可以根据反应时间等诸条件进行适当设定，例如优选为受检试样的点样的5秒后～3分钟后，更优选为10秒后～2分钟后。具体而言，例如可以将反应时间设为5分钟并对直至反应开始后1分钟～5分钟的4分钟内的反射率变化进行测定。可以测定至少2次反射率并以测定值之差算出反射率的变化值。反射率也可以测定3次或3次以上。经过一定时间的反射率的变化值可以基于多次测得的反射率而以反射率的变化速度的形式算出。

此外，在不需要测定在受检试样的刚点样后或受检试样的点样后的某个时刻的反射率时，可以减少反射率的测定次数。例如，在无论受检试样中的致龋菌数为何值均将受检试样的刚点样后或受检试样的点样后的某个时刻的反射率假定为一定的值时，也可以在自此后经过任意时间的时刻仅进行1次反射率的测定，以测定值与该一定的值之差计算出反射率的变化值。该一定的值只要在计算反射率的变化值时确定即可。需要说明的是，在无论受检试样中的致龋菌数为何值均将受检试样的刚点样后或受检试样的点样后的某个时刻的反射率假定为一定的值时，利用在自此后经过任意时间的时刻的反射率与致龋菌数的相关数据，由此无需计算反射率的变化值本身亦可测定致龋菌数。在这种无需计算反射率的变化值本身即可测定致龋菌数时，可以将测定反射率这件事本身看作“测定吸光度的增减”，并且也可以看作本发明的方法中的“测定色调变化”。即，这种无需计算反射率的变化值本身即可测定致龋菌数的情况也包括在基于色调变化测定致龋菌数的情况内。

吸光度的增减只要基于至少1个测定用波长进行测定即可，也可以基于包含至少1个测定用波长的2个或2个以上的波长进行测定。例如可以利用2个或2个以上的测定用波长，也可以分别设定测定用波长和用于消除背景影响的参照用波长并加以利用。为了测定吸光度的增减而使用的光源的波长可以根据所使用的氧化还原指示剂、检测仪器进行适当设定。测定用波长可以为所使用的氧化还原指示剂的氧化型的极大吸收波长，也可以为还原型的极大吸收波长，还可以是除此以外的波长。例如，在使用刃天青作为氧化还原指示剂时，可以将测定波长设为630～635nm、参照波长设为750～760nm。

极大吸收波长的位移可以通过对经过一定时间之前和之后的极大吸收波长进行比较来测定。极大吸收波长可以通过对显色部位、即点样有受检试样的吸收性载体部分照射多个波长的光并测定各波长下的反射率来确定。关于用于测定极大吸收波长的位移的条件，除了使用多个波长的光确定极大吸收波长以外，与测定特定波长下的吸光度的增减的情况相同。

需要说明的是，以下，将为了测定色调变化而获得的如上所述的数据、即特定波长下的反射率、据此算出的反射率的变化值、极大吸收波长等有时统称为“反射率数据”。

作为光学检测仪器，并无特别限定，例如可以使用尿试验纸用或血液试验纸用的反射率测定仪器。作为尿试验纸用的反射率测定仪器，例如可以使用Pocket Chem UA PU-4010(爱科来株式会社制)。在使用Pocket Chem UA PU-4010时，可以利用双波长反射测光法进行测定。对于Pocket Chem UA PU-4010而言，可以在测光部利用多台LED对显色部位照射波长不同的2种光、即测定波长的光及参照波长的光，基于其反射率测定色调变化。

具体而言，例如，在使用采用刃天青作为氧化还原指示剂的试验片并使用Pocket Chem UA PU-4010(爱科来株式会社制)作为检测仪器的情况下，在室温、5分钟的反应时间的条件下，将测定波长设为635nm、参照波长设为760nm进行测定。在该条件下，刃天青的还原反应的进行以635nm的吸光度的减少、即照射635nm的光时反射率的增加进行检测。在将反应时间设为5分钟时，例如只要对反应开始后1分钟～5分钟的4分钟内的反射率变化进行测定即可。

本发明的方法可以进一步包括例如输出所测定的色调变化、算出的致龋菌数的值、判定出的致龋菌数的程度和/或判定出的龋齿风险的程度的步骤，此外，还可以包括基于上述测定/判定结果输出建议的步骤。建议是指例如对测定/判定结果的说明。作为建议的例子，可列举“唾液中的龋齿菌少，呈良好的状态”。输出例如可以通过显示在设置于反射率测定仪器的显示部来进行。显示部只要能够显示文字、图像等信息，则并无特别限定，例如可以优选使用具有LED背光灯的液晶显示器。显示通过文字、图形、符号、色彩或它们的结合等任意形式来进行。需要说明的是，输出的方式只要能够使医师、牙科保健师或受检者等能够识别所输出的信息就没有特别的限制，例如可以以印刷的方式输出，也可以利用声音输出。此外，也可以将显示部的视觉显示、基于印刷的输出及基于声音的输出等任意组合而进行信息的输出。

本发明的方法中，反射率数据的获得、致龋菌数的计算等演算、以及测定/判定结果、建议的输出等各步骤可以利用单个计算机来执行，也可以利用物理上独立的多个计算机来执行。例如可以将所获得的反射率数据利用电信线路等输送到其他装置，并利用该其他装置进行致龋菌数的计算等演算。此外，也可以将测定/判定结果利用电信线路等输送到其他装置，并利用该其他装置显示该测定/判定结果、基于该测定/判定结果的建议等信息。作为这样的方式，可以例示如下方式：在WEB上输入反射率数据，将反射率数据输送到演算用服务器，利用该演算用服务器进行致龋菌数的计算等演算，再将测定/判定结果显示于WEB上。此外，可以采用基于利用电信线路等的数据的接收和输送的收费系统。作为此类收费系统，例如可列举：在使用者将测定/判定结果显示于WEB浏览器上的时刻或完成包含测定/判定结果的文件夹的下载的时刻进行收费的系统。收费可以通过显示/下载从量制、及根据日、周或月等期间进行收费的定额制等任意的方式来实施。

以上，举例示出测定致龋菌数的方法对本发明的方法进行了说明，但本发明的方法不限于致龋菌数的测定，其可以利用于使用受检试样所含的NAD(P)H和/或反应体系中生成的NAD(P)H的检测的任意的方法。例如，本发明的方法可以利用于直接或间接地生成NAD(P)H的酶反应的检测。需要说明的是，本发明的方法可以以NAD(P)H的测定本身为目的，也可以不以其为目的。与测定致龋菌数的方法及同其相关的检查试剂、试验片等有关的上述说明也可以适用于本发明的方法的其他方式。例如，本发明的方法可以根据其方式包括基于所测定的色调变化算出NAD(P)H的量或程度的步骤，也可以包括基于所测定的色调变化算出与NAD(P)H量相关的检测对象的量或程度的步骤。

此外，本发明的方法中，根据测定的目的等诸条件而不限于使用如上所述的试验片的方式，也可以以其他任意方式进行显色反应。例如，本发明的方法中，可以在包含上述检查试剂的容器内进行显色反应。具体而言，例如，可以将受检试样和上述检查试剂装入到任意的容器内，由此根据受检试样所含的NAD(P)H和/或容器内生成的NAD(P)H的量进行显色反应。作为容器，并无特别限制，例如可列举软管、试管。

此外，本发明的方法中，根据测定的目的等诸条件而不限于使用如上所述的检测仪器的方式，也可以以其他任意方式测定显色反应。例如，在本发明的方法中，可以用肉眼测定色调变化。但是，通常，为了有效地利用基于卤素的盐的显色反应的背景的降低效果，优选使用光学检测仪器定量地测定色调变化，此外，优选基于色调变化的定量测定结果定量地进行致龋菌数的测定等。

此外，本发明的方法中，根据测定的目的等诸条件，只要最终利用氧化还原指示剂、氧化还原反应促进剂及卤素的盐作为有效成分，则可以从反应开始时起在反应体系中包含受检试样和这些所有的有效成分，也可以不从反应开始时起在反应体系中包含受检试样和这些所有的有效成分。例如，可以在受检试样中充分进行NAD(P)H的生成后，将检查试剂添加到反应体系中。此外，例如也可以在不同的时机将各有效成分添加到反应体系中。需要说明的是，为了得到基于卤素的盐的显色反应的背景的降低效果，通常，优选将卤素的盐在将受检试样、氧化还原指示剂和氧化还原反应促进剂全都添加到反应体系中之前添加到反应体系中，更优选将卤素的盐预先添加到氧化还原指示剂或者氧化还原指示剂与氧化还原反应促进剂的混合物中。

此外，本发明中，检查试剂只要含有各有效成分，则可以以任意的方式提供。例如，检查试剂可以如上述那样以保持于试验片的方式提供，也可以以装入任意容器的方式提供。此外，检查试剂可以以固体状、液体状、凝胶状等任意形态进行制剂化后提供。在制剂化时，可以使用通常作为制剂载体使用的赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、稳定剂、矫味矫臭剂、稀释剂、表面活性剂或溶剂等添加剂。检查试剂可以直接利用于本发明的方法，或者使用水、生理盐水、缓冲液等稀释、分散或溶解后利用于本发明的方法。这样进行稀释、分散或溶解等的情况当然也包括在本发明的检查试剂的范围内。需要说明的是，各有效成分可以经过混合后包含在检查试剂中，也可以不经过混合而分别包含在检查试剂中。本发明的检查试剂中的各有效成分的浓度只要根据测定的目的等诸条件进行适当设定即可，例如，可以为在反应体系中与受检试样混合的液体状态下达到上述的试剂浸渍液的优选浓度的浓度。

此外，本发明的检查试剂可以以NAD(P)H测定用或致龋菌数测定用等的试剂盒的形式提供。试剂盒只要含有本发明的检查试剂，则并无特别限制。

实施例

以下，通过实施例对本发明更具体地进行说明。但是，本发明不受这些实施例的限定。

[实验例1]敏化剂的确定

本实验例中，在使用刃天青作为氧化还原指示剂时，进行能够作为敏化剂利用的化合物的筛选。

＜试剂浸渍液处方＞

对于将刃天青钠(东京化成制)42mg、1M磷酸缓冲液(pH6.0)120mL、蔗糖(ナカライテスク制)12g溶解于蒸馏水1100mL而得到的基本组成，按照表1所示浓度添加各研究成分，制备试剂浸渍液。

表1

＜试验片制作＞

将滤纸浸渍于上述试剂浸渍液中后，使其在50℃下干燥15分钟，得到试验纸。将制作的各试验纸切割成5mm×300mm宽，将其粘贴于粘贴有100mm×280mm的粘合剂的PET膜上。将该粘贴有试验纸的PET膜切割成5mm宽，得到100mm×5mm的试验片。需要说明的是，以下，有时将保持试剂的试验纸部分称作“试剂部分”。

＜测定方法＞

向上述试验片的试剂部分滴加以使浓度达到10⁹CFU/mL的方式悬浮于蒸馏水的变形链球菌(Streptococcus mutans、ATCC25175)的菌液10μL，在室温下放置。使用反射率测定仪器测定各试验纸在测定波长635nm/参照波长760nm下的1分钟后至5分钟后的反射率变化(也称作Δ4分钟反射率)。

＜结果＞

结果如图2所示。研究的结果表明：通过在基本组成中添加1-甲氧基PMS，可显著提高Δ4分钟反射率。

[实验例2]基本反射率降低剂的确定

本实验例中，在使用刃天青作为氧化还原指示剂且使用1-甲氧基PMS作为敏化剂时，进行能够降低基本反射率(即反射率的背景值)的化合物的筛选。

＜处方＞

对于将刃天青钠(东京化成制)42mg、1M磷酸缓冲液(pH6.0)120mL、蔗糖(ナカライテスク制)12g、1-甲氧基PMS(同仁化学制)242mg溶解于蒸馏水1100mL而得到的基本组成，按照表2所示的浓度添加各研究成分，制备试剂浸渍液。

＜试验片制作＞

将滤纸浸渍于上述试剂浸渍液中后，使其在50℃下干燥15分钟，得到试验纸。将制作的各试验纸切割成5mm×300mm宽，将其粘贴于粘贴有100mm×280mm的粘合剂的PET膜上。将该粘贴有试验纸的PET膜切割成5mm宽，得到100mm×5mm的试验片。

＜测定方法＞

首先，进行各试验片的基本反射率的测定。向上述试验片的试剂部分滴加蒸馏水10μL，在室温下放置。使用反射率测定仪器对各试验纸在测定波长635nm/参照波长760nm下的1分钟后的反射率进行测定，作为基本反射率。

进而，另外进行了各试验片对致龋菌的反应性的评价。向上述试验片的试剂部分滴加以使浓度达到10⁹CFU/mL的方式悬浮于蒸馏水的变形链球菌(Streptococcus mutans、ATCC25175)的菌液10μL，在室温下放置。使用反射率测定仪器测定各试验纸在测定波长635nm/参照波长760nm下的1分钟后至5分钟后的反射率变化(Δ4分钟反射率)。

＜结果＞

基本反射率的测定结果如图3所示。研究的结果表明：通过在基本组成中添加KCl或NaCl，可显著降低基本反射率。

此外，进行反应性的评价的结果如图4所示。表明：与仅添加有作为敏化剂的1-甲氧基PMS的情况相比，通过并用KCl或NaCl，Δ4分钟反射率进一步提高，并且反应性显著提高。

[实验例3]使用吐出液的研究

本实验例中，使用漱口吐出液作为受检试样，研究了KCl或NaCl的添加效果。

＜处方＞

对于将刃天青钠(东京化成制)42mg、1M磷酸缓冲液(pH6.0)120mL、蔗糖(ナカライテスク制)12g溶解于蒸馏水1100mL而得到的基本组成，按照表3所示浓度添加1-甲氧基PMS、和KCl或NaCl，制备试剂浸渍液。

表3

＜试验片制作＞

将滤纸浸渍于上述试剂浸渍液中后，使其在50℃下干燥15分钟，得到试验纸。将制作的各试验纸切割成5mm×300mm宽，将其粘贴于粘贴有100mm×280mm的粘合剂的PET膜上。将该粘贴有试验纸的PET膜切割成5mm宽，得到100mm×5mm的试验片。

＜测定方法＞

得到12名志愿者的配合，将通过用3mL的纯化水漱口10秒后吐到容器中而得的吐出液作为受检试样。向上述试验片的试剂部分滴加各受检试样10μL，使用反射率测定仪器测定各试验纸在测定波长635nm/参照波长760nm下的1分钟后至5分钟后的反射率变化(Δ4分钟反射率)。此外，用平板培养法(MSB培养基)进行了受检试样中的致龋菌数的测定。

结果如图5、图6、图7所示。与在基本组成中仅添加有1-甲氧基PMS的对照组相比，通过进一步添加KCl或NaCl，观察到Δ4分钟反射率的提高。因此，与使用变形链球菌的菌液的研究同样，在使用吐出液的研究中，也显示出KCl或NaCl的有效性。此外，表明：对于KCl或NaCl的添加组而言，在1-甲氧基PMS的浓度为0.4mM～0.6mM中的任意一种的情况下，显示出同等程度的高的Δ4分钟反射率。利用此种高的Δ4分钟反射率，例如能够将吐出液中的致龋菌数的大小划分成3个等级来判定。

[实验例4]各种盐类的添加效果的研究

本实验例中，使用漱口吐出液作为受检试样，对各种盐类的添加效果进行了研究。

＜处方＞

对于将刃天青钠(东京化成制)42mg、1M磷酸缓冲液(pH6.0)120mL、蔗糖(ナカライテスク制)12g溶解于蒸馏水1100mL而得到的基本组成，按照表4所示浓度添加1-甲氧基PMS和各种盐类，制备试剂浸渍液。

＜试验片制作＞

将滤纸浸渍于上述试剂浸渍液中后，使其在50℃下干燥15分钟，得到试验纸。将制作的各试验纸切割成5mm×300mm宽，将其粘贴于粘贴有100mm×280mm的粘合剂的PET膜上。将该粘贴有试验纸的PET膜切割成5mm宽，得到100mm×5mm的试验片。

＜测定方法＞

得到12名的志愿者的配合，将通过用3mL的纯化水漱口10秒后吐到容器中而得的吐出液作为受检试样。向上述试验片的试剂部分滴加各受检试样10μL，使用反射率测定仪器测定各试验纸在测定波长635nm/参照波长760nm下的1分钟后至5分钟后的反射率变化(Δ4分钟反射率)。

结果如表5和图8所示。与在基本组成中仅添加有1-甲氧基PMS的对照组相比，通过进一步添加KBr或NaBr，观察到Δ4分钟反射率的提高。

表5

产业上的可利用性

根据本发明，能够明确测定氧化还原指示剂的色调变化。因此，根据本发明，能够在室温下以短时间测定致龋菌数。因此，根据本发明，在牙科医院等临床现场，能够在无恒温装置等设备的条件下以短时间对多数样本进行处理，能够进行简便且迅速的致龋菌数的检查。测定结果例如可以适合用于受检者的龋齿风险的判定。因此，本发明对于龋齿的预防等是有用的。

标号说明

1…试验片

10…支撑载体

11…吸收性载体

Claims (12)

1.一种测定氧化还原指示剂的色调变化的方法，

其包括使检查试剂与受检试样反应来测定色调变化的步骤，

所述检查试剂包含氧化还原指示剂、氧化还原反应促进剂及卤素的盐。

2.如权利要求1所述的方法，其为对受检试样中的致龋菌数进行测定的方法。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述氧化还原指示剂为刃天青。

4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述氧化还原反应促进剂为1-甲氧基-5-甲基吩嗪

硫酸甲酯盐、吩嗪

硫酸甲酯盐或吩嗪硫酸乙酯。

5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述卤素的盐为氯化钠、氯化钾、溴化钠或溴化钾。

6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其使用具有支撑载体和负载于该支撑载体的吸收性载体的试验片进行测定，所述试验片中，所述吸收性载体用于保持所述检查试剂。

7.一种NADH和NADPH的测定试剂，其包含氧化还原指示剂、氧化还原反应促进剂及卤素的盐。

8.如权利要求7所述的试剂，其中，所述氧化还原指示剂为刃天青。

9.如权利要求7或8所述的试剂，其中，所述氧化还原反应促进剂为1-甲氧基-5-甲基吩嗪

硫酸甲酯盐、吩嗪

硫酸甲酯盐或吩嗪硫酸乙酯。

10.如权利要求7～9中任一项所述的试剂，其中，所述卤素的盐为氯化钠、氯化钾、溴化钠或溴化钾。

11.一种用于测定NADH和NADPH的试验片，其具有支撑载体和负载于该支撑载体的吸收性载体，所述试验片中，

所述吸收性载体用于保持权利要求7～10中任一项所述的试剂。

12.如权利要求11所述的试验片，其为用于测定致龋菌数的试验片。

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