CN113684241A - 一种可定量数字化龋风险体外诊断试剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种可定量数字化龋风险体外诊断试剂及其制备方法和应用，所述可定量数字化龋风险体外诊断试剂以重量百分比计包括1.5‑2.0％氮源、0.5‑1.5％碳源、0.001‑1.5％微生物生长抑制剂、0.5‑1.5％无机盐、0.01‑0.05％酸碱指示剂和水。本发明提供的可定量数字化龋风险体外诊断试剂检测准确度高，能够定量评估龋风险，灵敏度高，精度高，人为误差小。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种可定量数字化龋风险体外诊断试剂及其制备方法和应用，尤其涉及一种准确的可定量数字化龋风险体外诊断试剂及其制备方法和应用。
背景技术
龋风险体外诊断试剂具有无创、安全、不直接接触人体口腔等优势，它通过对口腔内微生物特别是产酸致龋菌产酸能力的鉴定，进一步评估被检测对象的未来患龋风险，可作为口腔健康状况的重要评估手段之一。目前，市场上主流的龋风险检测试剂(增菌培养基)基本原理为口腔内的微生物特别是致龋菌利用糖分产生甲酸、乙酸、乳酸等代谢产物，从而是体系中的pH值下降，酸碱指示剂呈现不同的颜色；通过肉眼识别颜色或设备识别颜色，根据相近颜色区间对照患龋风险等级从而进行龋病风险评估。但是，市场上的评估试剂均采用定性方法，只能通过相近的颜色表征，没有量化的数值，缺乏科学严谨性。
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由于目前市场上的评估试剂均采用定性方法，只能通过相近的颜色表征，没有量化的数值，缺乏科学严谨性。因此，如何提供一种可定量的龋风险体外诊断方法，成为了亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可定量数字化龋风险体外诊断试剂及其制备方法和应用，尤其提供一种准确的可定量数字化龋风险体外诊断试剂及其制备方法和应用。本发明提供的可定量数字化龋风险体外诊断试剂检测准确度高，能够定量评估龋风险，灵敏度高，精度高，人为误差小。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种可定量数字化龋风险体外诊断试剂，所述可定量数字化龋风险体外诊断试剂以重量百分比计包括1.5-2.0％氮源、0.5-1.5％碳源、0.001-1.5％微生物生长抑制剂、0.5-1.5％无机盐、0.01-0.05％酸碱指示剂和水。
其中，氮源的重量百分比可以是1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％或2.0％等，碳源的重量百分比可以是0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％或1.5％等，微生物生长抑制剂的重量百分比可以是0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％或1.5％等，无机盐的份数可以是0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％或1.5％等，酸碱指示剂的份数可以是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％或0.05％等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
上述特定组分配比的可定量数字化龋风险体外诊断试剂能够有效反映牙菌斑中菌种的含量，进而可定量地表征未来患龋风险，从而评估口腔环境的健康状态。
上述氮源和碳源提供的资源仅能满足牙菌斑中产酸菌种的生长需求，因此需选择微生物生长抑制剂对非产酸菌种进行抑制，避免其对产酸菌种形成竞争，影响检测结果。
优选地，所述氮源包括胰蛋白胨、胰蛋白
大豆蛋白胨、细菌蛋白胨、酵母蛋白胨或牛肉膏中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述碳源包括葡萄糖、蔗糖或淀粉中任意一种或至少两种的组合。
其中，氮源可以是胰蛋白胨和胰蛋白
的组合、牛肉膏和细菌蛋白胨的组合或大豆蛋白胨和细菌蛋白胨的组合等，碳源可以是葡萄糖和淀粉的组合、淀粉和蔗糖的组合或蔗糖和葡萄糖的组合等，但不限于以上所列举的组合，上述组合范围内其他未列举的组合同样适用。
优选地，所述微生物生长抑制剂包括硫酸链霉素、氯化锂或山梨酸钾中任意一种或至少两种的组合，例如硫酸链霉素和氯化锂的组合、氯化锂和山梨酸钾的组合或硫酸链霉素和山梨酸钾等，但不限于以上所列举的组合，上述组合范围内其他未列举的组合同样适用。
上述微生物生长抑制剂能够有效抑制非产酸菌种的生长，并对产酸菌种的生长抑制效果小，提高了检测结果的准确度。
优选地，所述微生物生长抑制剂为硫酸链霉素和氯化锂的组合。
上述特定微生物生长抑制剂进一步有效抑制了非产酸微生物的生长，提高了检测结果的准确度。
优选地，所述氯化锂和硫酸链霉素的质量比为(1300-1700):1，例如1300:1、1400:1、1500:1、1600:1或1700:1等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，所述无机盐包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氢氧化钠或氯化钠中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述酸碱指示剂包括溴甲酚蓝、溴甲酚紫、溴酚蓝、溴麝香草酚蓝、石蕊或酚酞中任意一种或至少两种的组合。
其中，无机盐可以是磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的组合、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的组合或磷酸二氢钠和氢氧化钠的组合等，酸碱指示剂可以是溴甲酚蓝和溴甲酚紫的组合、溴酚蓝和溴甲酚紫的组合或石蕊和溴酚蓝的组合等，但不限于以上所列举的组合，上述组合范围内其他未列举的组合同样适用。
第二方面，本发明提供了如上所述的可定量数字化龋风险体外诊断试剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
将氮源、碳源、无机盐、酸碱指示剂与水混合搅拌，之后灭菌，与微生物生长抑制剂混合，得到所述可定量数字化龋风险体外诊断试剂。
第三方面，本发明提供了如上所述的可定量数字化龋风险体外诊断试剂在制备可定量数字化龋风险体外诊断装置中的应用。
第四方面，本发明提供了一种可定量数字化龋风险体外诊断装置，所述可定量数字化龋风险体外诊断装置包括培养模块和检测模块，所述培养模块含有如上所述的可定量数字化龋风险体外诊断试剂，所述检测模块包括分光光度计。
上述诊断装置通过采用培养装置对牙菌斑进行培养，之后利用分光光度计对其进行检测，能够定量检测试剂吸光度，相比常规方法中只能通过相近的颜色表征，极大减少了人为误差，提高了检测准确度、灵敏度。
优选地，所述培养模块用于将牙菌斑置于如上所述的可定量数字化龋风险体外诊断试剂中培养，之后测定试剂吸光度，对比参考区间确定CAT值，判断龋风险。
优选地，所述培养的温度为36-38℃，时间为44-52h。
优选地，所述测定试剂吸光度的检测波长为630-640nm。
其中，温度可以是36℃、36.5℃、37℃、37.5℃或38℃等，时间可以是44h、45h、46h、47h、48h、49h、50h、51h或52h等，检测波长可以是630nm、631nm、632nm、633nm、634nm、635nm、636nm、637nm、638nm、639nm或640nm等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，所述参考区间由包括以下步骤的方法制备得到：
向如上所述的可定量数字化龋风险体外诊断试剂中加入酸，得到一系列pH值的待测试剂，之后采用分光光度计法对待测试剂进行检测，得到一系列pH-吸光度对应关系，并通过pH-CAT值对应关系建立吸光度-CAT值对应关系，即得到参考区间。
第五方面，本发明还提供了一种龋风险体外诊断方法，所述龋风险体外诊断方法包括以下步骤：
取牙菌斑用如上所述的可定量数字化龋风险体外诊断试剂培养，之后测定试剂吸光度，对比参考区间确定CAT(龋活跃性)值，判断龋风险。
上述方法通过采用上述可定量数字化龋风险体外诊断试剂进行培养，之后通过测定吸光度以确定CAT值，相比常规方法中只能通过相近的颜色表征，极大减少了人为误差，提高了检测准确度、灵敏度。
通过吸光度值能够判断培养体系中产酸致龋菌的产酸量，从而鉴别出致龋菌的代谢能力，能够通过更精确地预测判断出患龋风险。
优选地，所述培养的温度为36-38℃，时间为44-52h。
优选地，所述测定试剂吸光度的检测波长为630-640nm。
其中，温度可以是36℃、36.5℃、37℃、37.5℃或38℃等，时间可以是44h、45h、46h、47h、48h、49h、50h、51h或52h等，检测波长可以是630nm、631nm、632nm、633nm、634nm、635nm、636nm、637nm、638nm、639nm或640nm等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供了一种可定量数字化龋风险体外诊断试剂，通过选择特定组分配比能够有效反映牙菌斑中菌种的含量，进而可定量地表征未来患龋风险，从而评估口腔环境的健康状态；选择特定微生物生长抑制剂能够有效抑制非产酸菌种的生长，并对产酸菌种的生长抑制效果小，提高了检测结果的准确度；
(2)本发明提供了一种可定量数字化龋风险体外诊断装置，通过采用培养装置对牙菌斑进行培养，之后利用分光光度计对其进行检测，能够定量检测试剂吸光度，相比常规方法中只能通过相近的颜色表征，极大减少了人为误差，提高了检测准确度、灵敏度；
(3)本发明还提供了一种龋风险体外诊断方法，通过采用上述可定量数字化龋风险体外诊断试剂进行培养，之后通过测定吸光度以确定CAT值，相比常规方法中只能通过相近的颜色表征，极大减少了人为误差，提高了检测准确度、灵敏度。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
制备例1
本制备例提供了一种可定量数字化龋风险体外诊断试剂，原料及配比(质量百分比)如下：
牛肉膏0.45％、胰蛋白胨1.5％、蔗糖0.5％、葡萄糖0.75％、溴甲酚蓝0.02％、溴甲酚紫0.01％、磷酸二氢钾0.5％、氯化钠0.75％、1.4％氯化锂、0.001％硫酸链霉素、水余量。
制备方法如下：
将牛肉膏和胰蛋白胨加入适量的纯化水中，60rpm搅拌混合均匀；再加入葡萄糖和蔗糖，60rpm搅拌混合均匀；加入溴甲酚蓝和溴甲酚紫，60rpm搅拌混合均匀；随后加入磷酸二氢钾和氯化钠，60rpm搅拌混合均匀；随后加入氯化锂，60rpm搅拌混合均匀；补充纯化水使体系总量为100％。将配置完成的体系分装置1000mL螺口瓶中，121℃高温高压灭菌15min，待冷却后加入0.001％的无菌硫酸链霉素，随后分装至无菌的5mL高硼硅玻璃瓶中，盖紧瓶盖，得到所述可定量数字化龋风险体外诊断试剂。
所用的硫酸链霉素为100万单位，将每克试剂用水稀释至100mL溶解，使用0.22微米的无菌滤膜过滤除菌，配制得到标准液，每100mL中加入100微升即为所需硫酸链霉素含量。
制备例2
本制备例提供了一种可定量数字化龋风险体外诊断试剂，原料及配比(质量百分比)如下：
牛肉膏0.5％、胰蛋白胨1％、葡萄糖1.5％、溴甲酚蓝0.02％、溴甲酚紫0.01％、磷酸二氢钠1.5％、0.5％氯化锂、水余量。
制备方法参考制备例1。
制备例3
本制备例提供了一种可定量数字化龋风险体外诊断试剂，原料及配比(质量百分比)如下：
胰蛋白胨2％、蔗糖0.5％、溴甲酚蓝0.02％、溴甲酚紫0.01％、磷酸二氢钠0.5％、0.001％硫酸链霉素、水余量。
制备方法参考制备例1。
制备例4
本制备例提供了一种可定量数字化龋风险体外诊断试剂，原料中除将氯化锂替换成等量的山梨酸钾外，其余与制备例1一致。
制备方法参考制备例1。
制备例5
本制备例提供了一种可定量数字化龋风险体外诊断试剂，原料中除将硫酸链霉素替换成等量的山梨酸钾外，其余与制备例1一致。
制备方法参考制备例1。
制备例6
本制备例提供了一种可定量数字化龋风险体外诊断试剂，原料中除将硫酸链霉素替换成等量的氯化锂外，其余与制备例1一致。
制备方法参考制备例1。
实施例1-6
实施例1-6分别提供了一种可定量数字化龋风险体外诊断装置，包括培养装置和检测装置，其中培养装置为培养箱和制备例1-6分别提供的可定量数字化龋风险体外诊断试剂，检测装置为分光光度计(上海佑科仪器仪表有限公司，TN5000)
参考区间制备：
用以下试剂为样品，向其中逐滴加入盐酸，得到一系列不同pH的样品溶液，并将其进行吸光度检测(检测波长635nm)，得到吸光度-pH对应关系，之后参考《维护牙周健康的中国口腔医学多学科专家共识(第一版)》(中华口腔医学杂志.2021.56(2):127-135)中的pH-CAT值对应关系建立吸光度-CAT值对应关系，结果如下：
样品成分：牛肉膏0.45％、胰蛋白胨1.5％、蔗糖0.5％、葡萄糖0.75％、溴甲酚蓝0.02％、溴甲酚紫0.01％、磷酸二氢钾0.5％、氯化钠0.75％、1.4％氯化锂、0.001％硫酸链霉素、水余量。
吸光度-CAT值对应关系：
之后利用实施例1-6提供的装置进行可定量数字化龋风险体外诊断，受试者(28岁、女性、无龋齿、口腔卫生习惯较差)，利用一次性无菌棉签在受试者第6-7恒牙的唇侧牙缝处刮取5次，将牙菌斑分别接种至制备例1-6提供的可定量数字化龋风险体外诊断试剂上(对照组不添加任何微生物生长抑制剂，其他成分与实施例1相同)，扣紧瓶盖，37℃恒温培养48h，之后取出用分光光度计检测吸光度(检测波长635nm)，并判断CAT值，此外采用《维护牙周健康的中国口腔医学多学科专家共识(第一版)》(中华口腔医学杂志.2021.56(2):127-135)中的常规方法对同一牙菌斑进行检测，汇总结果如下：
通过数据分析，可以发现实施例1和6的CAT值判定结果与常规方法相同，且实施例1吸光度更低，CAT值更高，说明其更能够有效抑制非产酸致龋菌的生长繁殖，使得体系中的营养物质被产酸菌利用产酸，更能有效的鉴别出产酸致龋菌的代谢能力。
以上内容可以发现，与常规方法相比，本发明提供的可定量数字化龋风险体外诊断试剂能够有效、精确检测龋风险，同时采用检测吸光度的方式能够有效减少常规方法中由于只能通过相近的颜色表而造成的人为误差，提高了检测便携性、准确度及灵敏度；同时比较实施例1、4-6可以发现，本发明通过采用特定微生物生长抑制剂的组合，可以有效抑制革兰氏阴性菌等非产酸致龋菌的生长繁殖，防止非产酸致龋菌竞争营养物质而使产酸菌产酸能力不足，从而造成龋风险判定结果偏低，提高了产酸致龋菌代谢活性的鉴定能力，进一步提高了检测结果的准确度。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的可定量数字化龋风险体外诊断试剂及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (10)
1.一种可定量数字化龋风险体外诊断试剂，其特征在于，所述可定量数字化龋风险体外诊断试剂以重量百分比计包括1.5-2.0％氮源、0.5-1.5％碳源、0.001-1.5％微生物生长抑制剂、0.5-1.5％无机盐、0.01-0.05％酸碱指示剂和水。
2.根据权利要求1所述的可定量数字化龋风险体外诊断试剂，其特征在于，所述氮源包括胰蛋白胨、胰蛋白
大豆蛋白胨、细菌蛋白胨、酵母蛋白胨或牛肉膏中任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述碳源包括葡萄糖、蔗糖或淀粉中任意一种或至少两种的组合。
3.根据权利要求1或2所述的可定量数字化龋风险体外诊断试剂，其特征在于，所述微生物生长抑制剂包括硫酸链霉素、氯化锂或山梨酸钾中任意一种或至少两种的组合。
4.根据权利要求3所述的定量数字化龋风险体外诊断试剂，其特征在于，所述微生物生长抑制剂为硫酸链霉素和氯化锂的组合。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的可定量数字化龋风险体外诊断试剂，其特征在于，所述无机盐包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氢氧化钠或氯化钠中任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述酸碱指示剂包括溴甲酚蓝、溴甲酚紫、溴酚蓝、溴麝香草酚蓝、石蕊或酚酞中任意一种或至少两种的组合。
6.一种根据权利要求1-5中任一项所述的可定量数字化龋风险体外诊断试剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
将氮源、碳源、无机盐、酸碱指示剂与水混合搅拌，之后灭菌，与微生物生长抑制剂混合，得到所述可定量数字化龋风险体外诊断试剂。
7.一种根据权利要求1-6中任一项所述的可定量数字化龋风险体外诊断试剂在制备可定量数字化龋风险体外诊断装置中的应用。
8.一种可定量数字化龋风险体外诊断装置，其特征在于，所述可定量数字化龋风险体外诊断装置包括培养模块和检测模块，所述培养模块含有权利要求1-5中任一项所述的可定量数字化龋风险体外诊断试剂，所述检测模块包括分光光度计。
9.根据权利要求8所述的可定量数字化龋风险体外诊断装置，其特征在于，所述培养模块用于将牙菌斑置于权利要求1-5中任一项所述的可定量数字化龋风险体外诊断试剂中培养，之后测定试剂吸光度，对比参考区间确定CAT值，判断龋风险。
10.根据权利要求9所述的可定量数字化龋风险体外诊断装置，其特征在于，所述培养的温度为36-38℃，时间为44-52h；
优选地，所述测定试剂吸光度的检测波长为630-640nm；
优选地，所述参考区间由包括以下步骤的方法制备得到：
向权利要求1-5中任一项所述的可定量数字化龋风险体外诊断试剂中加入酸，得到一系列pH值的待测试剂，之后采用分光光度计法对待测试剂进行检测，得到一系列pH-吸光度对应关系，并通过pH-CAT值对应关系建立吸光度-CAT值对应关系，即得到参考区间。
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