JP4074163B2 - 口腔内感染診断用培地組成物 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、簡易簡便に口腔内感染の有無を診断することができる口腔内感染診断用培地組成物、およびこれを使用する口腔内感染の診断方法に関するものである。更に詳しくは、本発明に係る診断用培地組成物は、その製造や流通および口腔内の感染診断において非常に利便性が高く、且つ感染の有無を定量値として客観的に把握でき、正確な診断が可能なものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ウ蝕（ムシ歯）の発生メカニズムはよく研究されており、ストレプトコッカス ミュータンス（Streptococcus mutans）や乳酸桿菌（Lactobacilli）等がその主要な原因菌といわれている。これらの細菌は、飲食後、口腔内に残留する糖類を分解し酸を生成する。こうして口腔内ｐＨが低下すると、歯のエナメル質からカルシウムイオンやリン酸イオンが溶出することによって、ウ蝕が進行する。
【０００３】
また、近年ではウ蝕以外にも歯周病（歯槽膿漏）が問題となっている。その原因菌は主にアクチノバチラス アクチノマイセテムコミタンス（Actinobacillus actinomycetemcomitans）とポルフィロモナス ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）等であり、ストレプトコッカス ミュータンスと同様に口腔内残留物を栄養源として繁殖する。そして、真菌であるカンジダ アルビカンス（Candida albicans）は、口腔カンジダ症，鵞口瘡，義歯性口内炎などの起因菌としてよく知られており、口腔内における日和見感染症の原因菌として重要な役割を占める。これらの細菌や真菌も、口腔内に残留した糖類を分解して増殖し酸を産生する。
【０００４】
従って、ｐＨを測定することによって口腔内に存在する細菌や真菌の感染の有無を診断することが可能であることから、これまでにも斯かる技術が開発されてきた。
【０００５】
例えば、特開昭５４−４７７００号公報には、糖類および所定のｐＨ指示薬を含有するウ蝕活性試験用液体組成物が記載されており、特開昭５７−１６６９９５号公報には、糖類やｐＨ指示薬等を含有するカンジダ感染症診断用液体培地が記載されている。これらは、歯垢や患部から採取した検体を添加することにより生じる指示薬の変色を観察することによって、専門的な検査技術や器具・装置等を必要とすることなく、ウ蝕やカンジダ感染の有無を容易に診断することができる。
【０００６】
しかしながら口腔内は常に唾液の影響を受けているので、従来技術では口腔内細菌および真菌の存在を把握できるのみであり、その診断結果が必ずしも感染の進行程度に直結するわけではなく、正確な口腔内感染の診断ができない場合がある。つまり、本来唾液はｐＨの低下を軽減する緩衝作用を有し、細菌や真菌の感染を予防および軽減するリゾチーム，ラクトフェリンや，免疫グロブリンであるＩｇＡ等を含むため、人によっては甘党であったり歯磨き回数が少なくても感染症に罹患し難いなど個人差が大きい。ところが、これら技術による診断結果には、唾液が享有する防衛機能の個人差が全く反映されない。更に、これらは液体であるために、運搬時等に容器から漏出するおそれがあり製品としての利便性が低いだけでなく、組成物の一部が壁面に付着している場合は同一検体であっても変色の度合いが一定とならず、正確な測定ができない可能性がある。
【０００７】
また、特開昭５８−２２５０２９号公報には、ウ蝕判別のための試薬組成物を小紙片等に浸潤させ、これに唾液を付すことによって生じる色調変化によりウ蝕を判別する方法が記載されている。
【０００８】
当該技術によれば、確かに唾液が享有する緩衝作用も含めた診断結果としてウ蝕の有無を判断し得る。しかし、菌類による感染に対しての唾液が有するその他の防衛機能は全く試験できず、その上、紙片等の色変化の判別では客観的な判断が困難であり、ウ蝕の進行程度を正確に把握することができない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
上記に示す状況の下、唾液が有する緩衝作用等の防衛機能を判断要素に取り入れれば、極めて正確な口腔内感染の診断が可能であると考えられる。また、呈色剤により口腔内感染の有無を診断することは非常に簡便で有用性が高く、診断用培地を固体とすれば、製品の製造時や運搬時における利便性が高いと考えられる。その一方で、培地が固体であれば唾液を添加しても速やかに均一混合することができず、診断の容易性を達成することができない。
【００１０】
そこで、本発明が解決すべき課題は、所定量の唾液を検体とすることにより正確な口腔内感染の診断が可能であり、唾液検体の添加によって容易に均一混合できることから口腔内感染の診断を簡易迅速に行なうことができ、且つ客観的な定量的診断が可能である一方で、低流動性であるために、その製造時や流通時における利便性が高い口腔内感染診断用培地組成物、およびこれを利用した口腔内感染の診断方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、ウ蝕や口腔内真菌感染等の診断検体として唾液を利用する培地組成物について鋭意研究を進めたところ、培地組成物として菌類の栄養源と含有水分量を適切に規定すれば、製品の利便性を確保しつつ診断用培地の流動性を抑制することができ、且つ所定量の唾液の添加によって容易に均一混合できることを見出して、本発明を完成した。
【００１２】
即ち、本発明に係る口腔内感染診断用培地は、細菌または真菌の栄養源および呈色剤を含有し、含有水分量が該栄養源に対して０.２０〜０.４５質量倍であることを特徴とし、低流動性である。
【００１３】
また、当該培地としては、崩壊剤を含むもの、および口腔内に存在する細菌または真菌の一部に有効な殺菌剤を含んでいてもよい。
【００１４】
更に、本発明に係る口腔内感染診断用培地は、細菌または真菌の栄養源、呈色剤および水分からなり、含有水分量が該栄養源に対して約０.２４〜約０.３４質量倍であり、且つ緩衝剤および口腔内に存在する細菌または真菌の一部に有効な殺菌剤からなる群より選択される１種以上を添加されていてもよいものが好ましい。
【００１５】
また、本発明に係る口腔内感染の診断方法は、口腔内感染を診断する方法であって、上記の口腔内感染診断用培地組成物に唾液を加えて均一混合する工程、およびその変色を観察する工程を含むことを特徴とする。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明に係る口腔内感染診断用培地組成物が有する最大の特徴は、唾液自体を培地の主要な構成成分とすることにより極めて正確な診断が可能なことにある。従来、唾液を口腔内感染の診断用検体として使用する技術はあったが、唾液を試験液や試験紙等に少量付するものであり、正確な診断結果が得られるものではなかった。これに対して本発明者らは、唾液自体を培地の主要な構成成分として採用することによって、唾液が有する緩衝作用等の感染症に対する防衛機能を判断要素に含めた総合的な判断を可能とし、口腔内における細菌や真菌の増殖過程を再現できる口腔内感染診断用培地組成物とこれを利用する診断方法を完成した。
【００１７】
また、本発明の培地組成物は、低流動性である故に製造時や輸送時の利便性が高い一方で、検体である唾液を添加することによって速やかに均一混合できるため、診断が容易で且つ客観的で正確な定量的データを得ることができる。その上、呈色剤によるｐＨ変化等の測定を利用した菌類による感染の診断という非常に簡便な方法を利用しているので、専門的知識や装置等を必要とせず、簡易簡便に診断を行なうことができる。
【００１８】
以下に、斯かる特徴を発揮する本発明の実施形態、及びその効果について説明する。
【００１９】
本発明の口腔内感染診断用培地組成物は、細菌または真菌の栄養源および呈色剤を含有し、含有水分量が該栄養源に対して０.２０〜０.４５質量倍であることを必須要件とし、その結果、当該培地組成物は低流動性となる。
【００２０】
「細菌または真菌の栄養源」は、診断対象となる菌類の栄養源となるものであり、炭素源や窒素源を使用する。「炭素源」としては「糖類」を好適に使用することができ、斯かる「糖類」は、口腔内感染症の原因となるこれら病原菌の栄養源となるものであれば特に制限なく使用できるが、その例としてはグルコース，スクロース（ショ糖），フルクトース，マルトース等を挙げることができる。「窒素源」としては、培地の組成成分として一般的に用いられるものであれば特に制限なく使用できるが、例えばトリプトース，ポリペプトン，酵母エキス等を挙げることができる。当該「栄養源」としては、主として「炭素源」（特に「糖類」）を好適に使用するが、診断の対象となる菌類の増殖を促進するため、対象菌種に応じて「窒素源」を含有せしめる。
【００２１】
本発明の培地組成物は、細菌または真菌の栄養源を含有し、その含有水分量は該栄養源に対して０.２０〜０.４５質量倍である。細菌または真菌の栄養源は一般的に水溶性が非常に高く、他の必須構成成分である「呈色剤」は極微量（培地組成物全量に対して０.１質量％以下）でその作用効果を発揮するため、栄養源を培地組成物の主な構成成分とし水分の含有割合を適切に規定することによって「低流動性」となり、極めて利便性の高い製品を調製することができるからである。即ち、本発明の培地組成物は、あくまで液体であるので唾液の添加によって容易に均一混合できる一方で、その濃度が適切に規定されていることから流動性は低く抑えられ、容器が傾けられても組成物が流出することはなく且つ激しい振動を受けても分離飛散することがない。
【００２２】
因みに、本発明の培地組成物が、上記栄養源、呈色剤および水分のみで構成されている場合には、その含有水分量は、後述する実施例によりその値が決定されている通り該栄養源に対して約０.２４〜約０.３４質量倍であることが好ましい。また、当該規定内であれば、緩衝剤および口腔内に存在する細菌または真菌の一部に有効な殺菌剤をその作用効果を発揮する量（培地組成物全量に対して１質量％以下）添加しても、その「低流動性」は維持される。しかし、後述する「崩壊剤」を添加すれば、含有水分量がこれより低い場合であっても唾液添加により速やかに均一混合することができるので、その量は栄養源に対して０.２０以上質量倍であればよい。また、後述する他成分を添加する場合には、栄養源の含有量は相対的に減少することがあるため、含有水分量は栄養源に対して０.４５質量倍以下であればよい。
【００２３】
「呈色剤」としては、口腔内感染菌の代謝に伴う酸の生成量、即ち培地のｐＨにより色が変化する「酸塩基指示薬」、或いは菌の増殖に伴う酸化還元電位の変化により色が変化する「酸化還元指示薬」を使用する。ここで、「酸塩基指示薬」としては、例えばメチルレッド，ブロムクレゾールグリーン，クロロフェノールレッド，リトマス，ブロモチモールブルー等を挙げることができ、「酸化還元指示薬」としては、例えばレサズリン，メチレンブルー，キシレンブルー等を挙げることができる。因みに、口腔内のｐＨは、菌が産生する酸によって低下するので、本発明で使用する「酸塩基指示薬」は、口腔内感染菌の増殖により低下するｐＨの最下限から中性領域に変色域を有するものである。
【００２４】
本願において「低流動性」とは２つの意味を有する。即ち、本発明の培地組成物は本質的に「液状」（上記栄養源の水溶液）でありながら、その粘度が高く静止状態では実質的な流動を起こし得ないことを示す。即ち、「低流動性」であることの目安は、例えば、マイクロチューブに入れた培地組成物が、チューブを逆さに傾けても容易に垂れることなく、また、チューブを上下に振盪した場合においても培地組成物が分離飛散しないことである。
【００２５】
本発明の口腔内感染診断用培地組成物は、一定量を量り取り、ここへ一定量の唾液を加えて均一混合し、一定温度で一定時間インキュベートして当該培地中で口腔内感染症の原因菌を培養した後、その変色を観察することによって口腔内に含まれる菌の存在とその増殖傾向を判断する。当該判断においては、事前に種々の濃度を有する菌液を同様の条件でインキュベートし、比較すべき色調データを取っておけば、ウ蝕や真菌感染等の進行程度を正確に判断することができる。また、比色測定を行なうことによって、測定を定量的に行なうことも可能である。
【００２６】
ここで「均一混合」とは、本発明の培地と唾液の液体成分とが均一に溶解混合した状態をいう。つまり、唾液中には菌の代謝等に由来する不溶性物質が含まれるが、これらは呈色剤の変色に殆ど影響を与えないので、本発明では考慮しない。尚、本発明の培地組成物は利便性が高いことから、唾液を加えた後に容器を手で数回振盪すれば容易に「均一混合」できるが、機械的に振盪しても構わない。多数の検体を診断する場合には、機械的な振盪が便利である。
【００２７】
「唾液」には、特別な刺激がなくても絶えず分泌される安静時唾液と、咀嚼等の刺激によって分泌される刺激唾液があるが、本発明では何れも使用できる。但し、複数の被験者を同時に診断する場合には、安静時唾液であるか又は刺激唾液であるかは統一する。唾液の防衛機能がその種類により異なる場合があるからである。また、一般的には、採取量の面から刺激唾液が使用し易い。
【００２８】
本発明の培地組成物に添加される唾液の質量は、培地組成物の質量に対して５〜５０倍であることが好ましい。適切な菌の生育条件は主に栄養源としての糖類濃度により定まり、唾液を当該範囲で加えることによって、大部分の感染菌に適する生育条件が整うからである。従って、添加する唾液の量は、診断対象とする菌により定めればよい。例えば、ストレプトコッカス ミュータンス等のウ蝕原因菌であれば、唾液を培地の５〜１０倍量程度加え、真菌については２０倍量程度加える。また、５〜５０倍の唾液を加えれば、個人個人が有する唾液の緩衝作用等の防衛機能がそのまま診断結果に反映されるという利点もある。この点を考慮すれば、本発明の培地組成物には、唾液以外の溶媒を実質的に加えないことが好ましい。
【００２９】
本発明の培地組成分中には、「崩壊剤」を含有せしめてもよい。「崩壊剤」は、含有水分量が少なく培地と唾液が速やかに混合しない場合であっても、これを添加することによって、均一化を補助する作用を有するものをいう。従って、「崩壊剤」を添加する場合には、培地組成物の含有水分はより少なくてもよい。その様な「崩壊剤」としては、例えば結晶セルロース，でんぷん等を挙げることができる。
【００３０】
また、診断開始当初のｐＨをできるだけ一定にするため、培地組成物に「緩衝剤」を添加してもよい。即ち、被験者により唾液のｐＨは異なり、そのままでは正確な診断結果が得られない可能性があるため、被験者間における診断開始当初の条件の相違を少なくし、その後における菌類の増殖を促進すべく、「緩衝剤」を含有せしめることが好ましい。その様な「緩衝剤」としては、例えば塩化ナトリウム等を挙げることができる。尚、菌類の増殖が活発になれば、当該「緩衝剤」の緩衝能を超えてｐＨは低下する。
【００３１】
「口腔内に存在する細菌または真菌の一部に有効な殺菌剤」は、診断の対象となる菌類が事前に決まっている場合に、対象外の菌類の増殖を抑制して対象菌感染の有無をより明確に診断するためのものである。例えば、ウ蝕の主要な原因菌であるストレプトコッカス ミュータンスを診断対象とする場合には、他の一般細菌の増殖を抑制すべくバシトラシンや亜テルル酸カリウムを添加し、グラム陰性菌の増殖抑制剤としてフェネチルアルコールを添加したり、診断対象菌がカンジダ アルビカンス等の真菌である場合には、細菌増殖を抑制する一方で真菌の増殖には影響しないクロラムフェニコールを含有したり、対象菌が細菌である場合には、カビや真菌の増殖抑制のためにアジ化ナトリウムを含有することも有効である。尚、これら薬剤は、同時に製品の防腐剤としての役割をも果たす。
【００３２】
その他、組成物中水分の揮発を防止すべく、グリセリンやポリエチレングリコール等の如く菌の増殖を抑制しない水溶性有機溶媒を添加してもよい。また、酢酸や乳酸等のｐＨ調整剤を添加してもよい。
【００３３】
本発明は以上の様に構成されており、本発明の口腔内感染診断用培地は、マイクロチューブ等に一定量充填すれば、流動性が低いために製品製造時や輸送時に漏れ出す等のおそれがないことから、製品としての利便性が極めて高い。その一方で、唾液の添加により速やかに均一混合できることから、簡易簡便な口腔内感染診断ツールとして非常に有用である。また、本発明の診断方法は、所定量の唾液を検体とすることから口腔内の感染状況をインビトロ（in vitro）で再現することが可能であり、より正確な診断結果を得ることができる。
【００３４】
【実施例】
以下に実施例および製造例を示し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００３５】
（実施例１）含有水分量の決定
スクロース７５ｇに精製水を加えて１００ｍｌとなるように溶解し、呈色剤としてブロムチモールブルー０.０３ｇを加えて均一溶液とした。これを１.５ｍｌのマイクロチューブに０.１３３ｍｌ（０.１６９ｇ）ずつ分注して３７℃で乾燥し、含有水分量と流動性との関係、および唾液１ｍｌを加えたときの溶解容易性を調査した。その結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】

【００３７】
上記表１中の「流動性」については、容器を倒すと流れる場合を「高」，多少流動性は低いものの容器を倒すと若干垂れる場合を「やや高」，容器を倒しても垂れない場合を「適」とした。また、溶解性については、唾液１ｍｌを加えた後容器を手に持って振盪したときに、振盪１０回までに均一混合できた場合を「良好」，３０回までを「やや良好」，均一混合するのにそれ以上振盪しなければならない場合を「不適」としたが、含有水分量が１５％以下の場合には、８０回振盪して漸く均一混合する程度の溶解性であった。
【００３８】
当該結果より、製品調製時と保存時の利便性および唾液を加えた際の溶解性を考慮して、崩壊剤を含有しない場合の含有水分量を１９〜２５％とした。これを栄養源に対する質量部に換算すると０.２３５〜０.３３３倍となる。従って、本発明の培地組成物が栄養源、呈色剤および水分のみで構成されている場合の含有水分量を、該栄養源に対して約０.２４〜約０.３４質量倍と決定した。しかし、崩壊剤を加えた場合には、ある程度流動性が低い場合であっても速やかな溶解性を示すため、含有水分量は０.２０質量倍以上であればよい。
【００３９】
（実施例２）
スクロース６６.５ｇ、ポリエチレングリコール（平均分子量４００）６.７ｇに精製水を加えて１００ｍｌとし、更に塩化ナトリウム０.３３ｇ、アジ化ナトリウム０.３３ｇ、レサズリン０.０２ｇを加えて均一溶液とした。これを１.５ｍｌのマイクロチューブに０.１５ｍｌづつ分注し、３７℃で乾燥して含有水分量を１８〜２３％として口腔内感染診断用培地とした。この場合、含有水分量を栄養源に対する質量倍に換算すると０.２４〜０.３３となる。
【００４０】
６歳から１５歳の小中学生９０名を被験者とし、口腔内から刺激唾液１ｍｌを前記マイクロチューブに採取して、均一混合した。
【００４１】
これを３７℃で３０分間インキュベートし、呈色状態によって青色〜青紫色を（陰性，−）、赤紫色〜紅色（疑陽性，±）、淡紅色〜微淡紅色（陽性，＋）の３段階で判定した。また、実際の口腔内検診により、ＤＭＦＴ歯数を調べた。
【００４２】
その結果、培地の呈色判定陰性群のＤＭＦＴ歯数は５.３３歯、疑陽性群のＤＭＦＴ歯数は６.３３歯、陽性群のＤＭＦＴ歯数は１０.８９歯となり、正の相関関係が認められた。また、陰性群および疑陽性群と陽性群の間には、それぞれ有意差が認められた（ＡＮＯＶＡ（分散分析）ｐ＜０.０５）。
【００４３】
（製造例１）
（１）スクロース ６６.５０質量部
（２）メチルレッド ０.０４質量部
（３）アジ化ナトリウム ０.３３質量部
上記（１）〜（３）を１００ｍｌとなるように精製水に混合溶解し、１.５ｍｌのマイクロチューブに０.１５ｍｌづつ分注し、３７℃で乾燥して含有水分量を２０〜２４％として口腔内感染診断用培地とする。この場合、含有水分量を栄養源に対する質量倍に換算すると０.２５〜０.３２となる。
【００４４】
ここへ、種々の濃度で生理食塩水に懸濁したストレプトコッカス ミュータンス（Streptococcus mutans）の菌液を１ｍｌずつ添加して３７℃で３０分間インキュベートすると、菌液濃度により黄色〜橙色〜淡赤色に変化する。
【００４５】
（製造例２）
（１）グルコース ３３.３３質量部
（２）ブロムクレゾールグリーン ０.０４質量部
（３）グリセリン ６.６７質量部
（４）トリプトース １３.３３質量部
（５）アジ化ナトリウム ０.３３質量部
（６）乳酸 適量
含有水分量を１８〜２２％とした以外は前記製造例１と同様の処理により口腔内感染診断用培地を調製する。但し、菌の増殖を促進するために、乳酸の添加によりｐＨを５.２０に調製する。この場合、含有水分量を栄養源に対する質量倍に換算すると０.２５〜０.３２となる。
【００４６】
ここへ、種々の濃度で生理食塩水に懸濁したラクトバチルス カゼイ（Lactobacillus casei）の菌液を１ｍｌずつ添加して３７℃で４８時間インキュベートすると、菌液濃度により青色〜緑色〜黄色に変化する。
【００４７】
（製造例３）
（１）グルコース ２６.６７質量部
（２）クロロフェノールレッド ０.０３３質量部
（３）結晶性セルロース １３.３３質量部
（４）クロラムフェニコール ０.００３質量部
（５）ポリペプトン ６. ６７質量部
（６）酢酸 適量
含有水分量を１５〜２０％とした以外は前記製造例１と同様の処理により口腔内感染診断用培地を調製する。但し、酢酸によりｐＨを５.８０に調製する。この場合、含有水分量を栄養源に対する質量倍に換算すると０.２４〜０.３５となる。
【００４８】
ここへ、種々の濃度で生理食塩水に懸濁したカンジダ アルビカンス（Candida albicans）の菌液を１ｍｌずつ添加して３７℃で２４時間インキュベートすると、菌液濃度により赤色〜橙色〜黄色に変化する。
【００４９】
【発明の効果】
本発明の口腔内感染診断用培地組成物は、これに唾液を添加し均一混合した培地の中で感染症の原因菌を増殖させることから、口腔内の状況を再現することができ、正確な感染診断が可能となる。その上、流動性が低いため製造時や運搬時等の利便性が高い。その一方で、検体である唾液を加えると速やかに均一混合できるため簡易迅速な診断が可能であり、診断結果を定量的データとして得ることができるという利点を有する。
【００５０】
従って、本発明に係る培地は、ウ蝕や口腔内の真菌感染の簡便な診断ツールとなるばかりでなく、製品としての利便性が高いため、産業上において極めて有用である。
【００５１】
また、本発明に係る口腔内感染の診断方法は、専門的な技術、知識や装置等の必要がなく、簡易簡便に口腔内の感染の有無を診断することができる。

Claims (5)

1. 細菌または真菌の栄養源、呈色剤および水分を含有し、含有水分量が該栄養源に対して０．２０〜０．４５質量倍であることを特徴とする口腔内感染診断用培地組成物。
2. 低流動性である請求項１に記載の口腔内感染診断用培地組成物。
3. 崩壊剤を含む請求項１または２に記載の口腔内感染診断用培地組成物。
4. 口腔内に存在する細菌または真菌の一部に有効な殺菌剤を含む請求項１〜３のいずれかに記載の口腔内感染診断用培地組成物。
5. 細菌または真菌の栄養源、呈色剤および水分を含有し、
   含有水分量が該栄養源に対して約０．２４〜約０．３４質量倍であり、且つ、
   口腔内に存在する細菌もしくは真菌の一部に有効な殺菌剤、または緩衝剤の少なくとも一方を添加されてもよい請求項１〜３のいずれかに記載の口腔内感染診断用培地組成物。