KR20100117186A

KR20100117186A - 치아 우식증 활성 측정용 조성물

Info

Publication number: KR20100117186A
Application number: KR1020090035799A
Authority: KR
Inventors: 김백일; 강시묵; 권호근
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2009-04-24
Filing date: 2009-04-24
Publication date: 2010-11-03
Also published as: KR101091016B1

Abstract

본 발명은 제1성분으로서의 브로모크레졸그린, 제2성분으로서의 브로모크레졸퍼플 및 제3성분으로서의 메틸오렌지, 레자주린 또는 나프틸레드를 포함하는 치아 우식증 활성 측정용 조성물 및 조성물을 이용한 치아 우식증 진단방법에 관한 것이다. 본 발명은 기존의 치아 우식증 활성 진단방법에 비해 간편하고 그 측정 pH 범위가 넓으면서 더 세밀한 측정이 가능한 진단방법을 제공한다. 본 발명은 비교적 넓은 pH 범위, 예컨대 pH 3-7 범위에 걸쳐 뚜렷한 색상 변화를 나타내어 넓은 범위의 치아우식활성을 분석할 수 있다. 또한, 본 발명은 환자로부터 분리된 치태에 존재하는 미생물의 배양액에 적용되어 실시되기 때문에, 환자의 치아에 직접 적용되는 종래기술과 비교하여 환자의 순응도(compliance)가 높다. 본 발명은 육안으로 관찰된 색상 관찰을 통하여 간편한 방식으로 치아우식활성을 분석할 수 있으며, 기존의 검사법이 갖고 있는 시료 채취의 불편함을 극복함으로써 기존 방법으로는 검사가 용이하지 않은 영유아나 장애인 및 노인까지 그 대상을 확대할 수 있다.

치아우식증, 우식활성진단, 브로모크레졸그린, 브로모크레졸퍼플, 메틸오렌지, 메틸레드, 레자주린, 나프틸레드

Description

치아 우식증 활성 측정용 조성물{Compositions for Measurement of Dental Caries Activity}

본 발명은 치아 우식증 활성 측정용 조성물 및 치아우식증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 치태내 존재하는 미생물로부터 충치의 원인이 되는 유기산의 생산 잠재력을 검출하는 방법에 관한 것이다.

치아 우식증(충치)은 구강 내에 상주하는 세균의 대사 작용에 의하여 치아에 부착된 음식찌꺼기의 당분이나 전분 등의 탄수화물이 분해되어 생기는 젖산 등 유기산에 의해 치아 경조직이 탈회되는 질병을 말하며, 이를 방치하게 되면 치수염을 일으켜 심한 통증을 느끼게 되고, 이로 인해서 치아를 상실할 수도 있다. 따라서 치아 우식증의 예방을 위해서는 치아우식증의 위험 요인을 조기에 발견하고 적절한 예방적 처치를 통해 치아우식증의 진행을 방지하는 것이 중요하다. 치아우식증을 유발하는데 관련된 요인으로는 크게 미생물요인, 숙주요인 및 식이요인 등이 있는데, 이 중에서 미생물 요인은 치아우식증의 원인균들과 관련된 중요한 인 자이다. 그러므로 미생물 요인의 변화를 조기에 탐지하여 치아우식증 고위험 집단을 선별할 수 있다면, 이는 치아우식증 예방에 획기적인 도움이 될 수 있다.

지금까지 이러한 치아우식활성 검사로는 치아 우식증의 원인균으로 알려진 스트랩토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)나 락토바실리(Lactobacilli) 등이 선별적으로 자랄 수 있는 선택 배지를 이용하여 배양된 세균의 양을 측정하는 방법이 주로 활용되어왔다. 하지만 이 방법으로는 구강 내에서 각기 한 종류의 우식 유발 세균 종만을 배양할 수 있고, 검사대상자의 샘플을 채취하기 위해서 왁스를 씹게 한 뒤 자극성 타액을 수집하는 번거로운 과정을 거쳐야 하기 때문에 이러한 과정에 자발적으로 협조가 어려운 영유아에게는 적용이 어려웠다. 한편 최근에는 분자생물학적인 방법을 적용하여 스트랩토코커스 뮤탄스 균의 항체를 이용하여 해당 균의 존재 유무를 판별할 수 있는 진단방법이 소개되기도 하였지만, 이 방법 역시 높은 가격과 해당 세균의 양을 상대적으로 표시하지 못한다는 제한점이 있다.

최근 치아우식증의 발생 메커니즘은 스트랩토코커스 뮤탄스나 락토바실리등 특정 미생물만이 관여하는 것이 아니라 구강내 존재하는 수많은 미생물종들이 복합적으로 작용하는 것이라는 가설이 설득력을 얻고 있다. 또한 동일한 스트랩토코커스 뮤탄스 종이라도 형질(serotype)에 따라 유기산 생산 정도 등에 차이가 있다는 보고가 있다. 따라서 치태내 존재하는 미생물 총 균체의 산 생산 능력을 측정하는 것이 실제 구강에서 존재하는 우식 활성을 검사하는 좋은 지표가 될 것이다.

본 발명자들은 치아 우식증의 세균이 분비하는 산의 양을 측정할 수 있다면 치아 우식증의 활성을 예측하는 것이 가능하다는 점에 착안하여, 치아 우식증 유발 세균들이 성장할 수 있는 배양액을 이용하여 이들 세균들이 분비하는 유기산 생산 정도를 색 변화를 통해 구분할 수 있는 우식 활성 진단 시약을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 중성 또는 염기성 화합물인 혼합 시약을 이용하여 1 pH 단위마다 적색, 오렌지색, 황색, 녹색 또는 남색 등으로 변색되는 과정을 관찰함으로써 우식활성 여부 뿐 아니라 그 진행 정도까지 간편하게 예측할 수 있는 치아 우식증 활성 측정용 조성물을 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 치아 우식증 활성 측정용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 치아우식증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 환자의 치태에 존재하는 미생물로부터 산의 생산 능력을 직접 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 제1성분으로서의 브로모크레졸 그린, (b) 제2성분으로서의 브로모크레졸퍼플 및 (c) 제3성분으로서의 메틸오렌지, 레자주린 또는 나프틸레드를 포함하는 치아우식증 활성 측정용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 치아 우식증의 세균이 분비하는 산의 양을 측정할 수 있다면 치아 우식증의 활성을 예측하는 것이 가능하다는 점에 착안하여, 치아 우식증 유발 세균들이 성장할 수 있는 배양액을 이용하여 이들 세균들이 분비하는 유기산 생산 정도를 색 변화를 통해 구분할 수 있는 우식 활성 진단 시약을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 중성 또는 염기성 화합물인 혼합 시약을 이용하여 1 pH 단위마다 적색, 오렌지색, 황색, 녹색 또는 남색 등으로 변색되는 과정을 관찰함으로써 우식활성 여부 뿐 아니라 그 진행 정도까지 간편하게 예측할 수 있는 치아 우식증 활성 측정용 조성물을 개발하였다.

본 발명의 치아우식증 활성 측정용 조성물은 브로모크레졸그린과 브로모크레졸퍼플을 기본성분으로 하여, pH 측정범위가 더 넓어지고 세밀해지도록 메틸오렌지, 레자주린 및 나프틸레드 시약 중 어느 하나를 지시약 혼합물에 추가적으로 혼합하여 조성된다.

본 발명의 치아우식증 활성 측정용 조성물에서, pH 3.8 - 5.4의 범위에 대한 지시약 즉 제1성분으로서 브로모크레졸그린이 이용된다. 브로모크레졸 그린은 pH 3.8 - 5.4의 범위에서 색깔변화를 보이며, 산성 상태에서 황색을 나타내다가 pH가 높아질수록 청색으로 색상이 변한다.

본 발명의 치아우식증 활성 측정용 조성물에서, pH 약 5.2 - 6.8의 범위에 대한 지시약 즉 제2성분으로서 브로모크레졸퍼플이 이용된다. 브로모크레졸퍼플은 변색범위가 pH 약 5.2 - 6.8로서 산성 상태에서 노란색을 보이고 염기성이 될수록 자주색을 나타낸다.

한편, 본 발명의 치아우식증 활성 측정용 조성물에서 상기 제1성분 및 제2성분의 지식약에 의한 pH 변색범위를 보다 넓히면서 보다 명확하고 차별적인 색상을 나타내도록 추가적으로 제3성분이 포함된다. 제3성분은 메틸오렌지, 레자주린 및 나프틸레드 중 어느 하나이다. 메틸오렌지는 pH 약 3.1 - 4.4의 변색범위를 가지고 있으며 pH 3.1 이하의 산성조건 하에서는 붉은색을 띠고 pH 4.4 에 가까워질수록 노란색을 띈다. 레자주린은 pH 약 3.8 - 6.4의 변색범위를 가지고 있으며, 산성에서 오렌지색을 띄다가 염기성이 될수록 보라색으로 변한다. 나프틸레드는 pH 약 3.7 - 5.0 사이의 변색범위를 가지며 산성조건에서는 붉은 자주색을 띄다가 염기성으로 갈수록 오렌지색으로 변한다.

본 발명에서 채택하고 있는 제1성분, 제2성분 및 제3성분의 조성은 많은 pH 지식약 중에서 본 발명의 목적에 적합하도록 최적의 조합으로 선별된 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 제3성분은 메틸오렌지 또는 나프틸레드이다.

본 발명의 조성물은 비교적 넓은 pH 범위에 걸쳐 색상 변화를 나타낸다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 pH 3.0 - 7.0의 범위에 서 뚜렷한 색상 변화를 나타낸다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 치아 우식 활성에 따른 pH에 변화에 따라 뚜렷한 색상 변화를 나타내기 때문에, 다른 보조적인 장치 또는 기기의 도움 없이 육안(naked eye)으로 관찰될 수 있는 색상 변화를 나타낸다. 본 명세서에서의 용어“육안으로 관찰”은 현미경 및 확대경 등의 광학기기를 이용하지 않는 관찰을 의미하지만, 안경 등의 통상적인 시력보완기구를 착용한 관찰은 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 치아우식증 활성 측정용 조성물은 중성 pH를 갖는다. 본 명세서에서 용어“중성 pH”란 6.0-8.0의 pH 범위, 바람직하게는 pH 6.5-7.5, 보다 바람직하게는 pH 6.8-7.2를 의미한다. 즉, 본 발명의 치아우식증 활성 측정용 조성물은 중성의 pH를 나타내므로, 치아우식 활성을 측정하기 위한 환자의 치태 미생물 배양액에 첨가하는 경우에는, 중성 pH로부터 시작하여 점차 낮은 pH로 변화되는 양상을 관찰하게 된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 제1성분으로서의 브로모크레졸그린, 제2성분으로서의 브로모크레졸퍼플 및 제3성분으로서의 메틸오렌지를 포함하고, 브로모크레졸그린 : 브로모크레졸퍼플 : 메틸오렌지의 조성비는 1:2:1.5 중량비이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 치아우식증 활성 측정용 조성물은 제1성분으로서의 브로모크레졸그린, 제2성분으로서의 브로모크레졸퍼플 및 제3성분으로서의 레자주린을 포함하고, 상기 브로모크레졸그린 : 브로모크레졸퍼플 : 레자주린의 조성비는 1:1.5:0.5 중량비이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 치아우식증 활성 측정용 조성물은 제1성분으로서의 브로모크레졸그린, 제2성분으로서의 브로모크레졸퍼플 및 제3성분으로서의 나프틸레드를 포함하고, 상기 브로모크레졸그린 : 브로모크레졸퍼플 : 나프틸레드의 조성비는 1:2:1.5 중량비이다.

상기 각 지시약 성분들의 조성비는 하기 실시예에 기재된 바와 같이, pH 변화에 따라 가장 뚜렷한 색 변화를 나타낸다.

본 명세서에서 용어 “조성비”는 혼합 지시약 용액 내에 포함된 각각의 지시약 간의 중량비를 의미한다.

본 발명의 조성물에서, pH 지시약의 농도가 너무 낮으면 색 변화의 감지가 어렵고, 농도가 너무 높으면 색 변화에 시간이 소요될 뿐만 아니라, 색이 너무 어두워 구별하기 어려워지는 문제점이 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 치아우식증 활성 측정용 조성물은 측정 대상의 치아로부터 채취한 치태에 존재하는 미생물의 배양액에 적용된다. 종래의 치아우식증 활성 측정용 조성물은 치아 표면에 직접 적용되는 방식이지만, 본 발명의 치아우식증 활성 측정용 조성물은 치태를 구강에서 채취한 뒤 구강 밖의 배양기에서 배양하고 이 배양액과 반응시켜 치아우식증 활성을 측정하게 된다.

본 발명의 조성물은 보조 착색제를 추가적으로 함유할 수 있다. 보조 착색제는 조성물의 pH 변화시 색을 변화시키지 않으면서 지시제의 색 변화 검출을 개선 시키는데, 예를 들어 보조 착색제는 색 변화의 출현을 증강시키는 배경색을 제공할 수 있다. 패턴트 블루(Patent Blue) V, 패턴트 블루 E 131, 에리오글라우신(Erioglaucine), 네오자폰 블루(NEOZAPON blue) 807 (BASF로부터 구매 가능), 메틸렌 블루 (Hoechst로부터 구매 가능), 인디고 카민, 인디고 카르틴(E 132), 안토시안(E 163) 등의 블루 착색제; 쿠르쿠민(E 100), 락토플라빈 (E 101), 리보플라빈-5-포스페이트 (E 101a), 타트라진(E 102), 치놀린 옐로우(E 104), 옐로우 오렌지S (E 110)등의 옐로우 착색제; 및 코헤닐(e 120), 아조루빈 (E 122), 아마란트 (E 123), 에리트로신 (E 127), 알루라 레드(E 129) 및 루비 안료 (E 180) 등의 레드 착색제가 조성물에 유용한 보조 착색제로 이용될 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 치아우식증 활성 측정용 조성물은 비교적 넓은 pH 범위, 예컨대 pH 3-7 범위에 걸쳐 뚜렷한 색상 변화를 나타내며 환자로부터 분리된 치태에 존재하는 미생물의 배양액에 적용되며, 이 미생물들의 유기산 생산 능력을 검출함으로써 치아우식증 활성에 대한 정보를 제공하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 치아우식증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 환자의 치태에 존재하는 미생물을 검출하는 방법을 제공한다:

(a) 환자로부터 채취한 치태에 있는 미생물을 배양하는 단계;

(b) 상기 미생물의 배양액을 상술한 본 발명의 치아우식증 활성 측정용 조성 물과 반응시키는 단계; 및

(c) 상기 배양액 및 치아우식증 활성 측정용 조성물의 혼합액의 색상을 관찰하는 단계.

본 발명의 방법을 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:

단계 (a): 환자로부터 채취한 치태 내의 미생물 배양

본 발명의 방법에 따르면, 우선 환자로부터 시료인 치태를 채취한다. 치태는 다양한 방식으로 채취할 수 있으며, 바람직하게는 치태는 흡착재료를 이용하여 치아 표면을 문질러 채취한다. 본 발명의 흡착재료는 치아 표면으로부터 직접적으로 치태를 채취할 수 있는 재료로써 당업계에 공지된 모든 재료를 포함하며, 바람직하게는 살균된 면봉이다.

채취한 치태에 있는 미생물을 배양한다. 본 발명의 방법에서 배양되는 미생물은, 바람직하게는 치아우식증 원인균이고, 보다 바람직하게는 스트랩토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 및 락토바실리(Lactobacilli)이다.

치태 내 미생물의 배양은 적합한 배양액을 이용하여 당업계의 통상적인 방법에 따라 실시할 수 있다. 상기 배양액은 바람직하게는 탄소원, 질소원 및 삼투압조절제를 포함한다.

본 발명의 미생물 배양액에 이용되는 탄소원은 다양한 탄수화물이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 수크로스, 글루코스, 프럭토스, 갈락토스, 아라비노스 및 락토스이며, 보다 바람직하게는 수크로스, 글루코스 및 프럭토스이며, 가장 바람직하게는 수크로스이다. 탄소원의 함량은 바람직하게는 5-50 중량%, 보다 바람직하게 는 5-40 중량%, 보다 더 바람직하게는 10-30 중량%, 가장 바람직하게는 대략 20 중량% 이다.

본 발명의 미생물 배양액에 이용되는 질소원은 유기 질소원이 이용되며, 바람직하게는 트립토스, 이스트 추출물, 프로테오스 펩톤 No.3 및 펩톤이며, 보다 바람직하게는 트립토스 또는 이스트 추출물이다. 질소원의 함량은 바람직하게는 0.5-10 중량%, 보다 바람직하게는 0.5-5 중량%, 보다 더 바람직하게는 1-3 중량%, 가장 바람직하게는 대략 2-2.5 중량% 이다.

삼투압조절제로서 다양한 무기 염화물이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 CaCl₂ 또는 NaCl이며, 가장 바람직하게는 NaCl이다. 삼투압조절제으로서 NaCl가 이용되는 경우, 그 함량은 바람직하게는 0.5-2 중량%이며, 보다 바람직하게는 0.5-1.5 중량% 이고, 가장 바람직하게는 대략 0.5 중량% 이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 미생물 배양액은 NaN₃를 포함한다. NaN₃는 본 발명에서 검출하고자 하는 치아우식증 유발 미생물, 예컨대 스트랩토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)나 락토바실리(Lactobacilli)를 선택적으로 배양할 수 있는 조건을 만든다.

본 발명의 방법에서의 미생물을 배양하는 방법은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 본 발명의 미생물을 배양하는 단계에 있어서, 배양 온도는 바람직하게는 20-37℃이고, 보다 바람직하게는 23-37℃이며, 가장 바람직하게는 대략 37℃이다.

단계 (b): 미생물 배양액과 치아우식증 활성 측정용 조성물의 반응

상술한 과정에서 얻은 미생물 배양액과 상술한 본 발명의 치아우식증 활성 측정용 조성물을 반응시킨다.

본 발명의 방법에서 미생물의 배양액을 치아우식증 활성 측정용 조성물과 반응시키는 단계는 미생물 배양액에 치아우식증 활성 측정용 조성물을 첨가하는 방법 및 반대로 치아우식증 활성 측정용 조성물에 미생물 배양액을 첨가하는 방법 모두를 포함한다.

단계 (c): 치아우식증 활성 측정용 조성물의 색상 관찰

치태의 미생물 배양액과 본 발명의 치아우식증 활성 측정용 조성물을 반응시킨 혼합액으로부터 나오는 색상을 관찰한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 관찰은 상기 배양액에 상기 치아우식증 활성 측정용 조성물을 첨가한 후 즉시 육안으로 관찰하여 실시된다. 본 발명의 방법에 의한 색상 변화는 즉시 이루어지기 때문에 색상 변화의 관찰도 즉시할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 관찰된 치아우식증 활성 측정용 조성물의 혼합액의 색상을 pH에 따른 기준(reference) 색상과 비교하는 단계를 추가적으로 포함한다. 즉, 일정한 pH를 갖는 완충액과 반응시킨 본 발 명의 치아우식증 활성 측정용 조성물의 색상과 비교하여, 본 발명의 방법에 의해서 최종적으로 나오는 색상의 pH 값을 파악하게 된다.

최근 들어 일반 국민들도 구강건강에 대한 관심이 증가하고, 사회적으로도 웰빙의 개념이 대두되면서 구강 질환의 예방에 대한 관심이 증가하고 있다. 구강 질환의 특성 상 질병이 이미 발생한 뒤에 치료할 경우 큰 비용이 필요하지만, 질병 발생 전에 환자의 위험을 미리 파악하고 적극적으로 예방조치를 취할 경우 효과적인 예방이 가능하다. 본 발명은 대표적인 구강질환인 치아우식증의 활성을 평가하고 예측할 수 있는 기술로써 다양한 인구계층에 활용이 가능하다. 특히 최근 한국 사회의 이슈인 저출산 고령화로 인한 인구 구조의 변화는 유아 및 어린이와 노령층의 증가를 의미하고 이들 계층은 치아우식증 발생에 특히 취약한 집단이다. 그러므로 이들 집단을 대상으로 치아우식증의 발생을 지속적으로 모니터링하고 그 위험을 평가할 수 있는 본 발명은 앞으로도 큰 시장이 형성될 것으로 판단된다.

앞으로 21세기 치과의 방향은 구강질환이 이미 발생한 뒤 치아를 뽑거나 충전하는 외과적 접근법에서부터 질병 발생을 미리 예측 평가하고 적극적으로 예방하는 비외과적 접근법이 부각될 것이다. 따라서 대표적인 구강질환인 치아우식증의 활성을 평가하고 이를 이용해서 미래의 질병 발생을 예측하여, 개인의 우식발생 위험도에 적합한 맞춤형 관리 프로그램을 구축하는 데 있어서 본 발명은 첫 근간이 될 수 있다. 본 발명은 기존의 검사법이 갖고 있는 시료 채취의 불편함을 극복함으로써 기존 방법으로는 검사가 용이하지 않은 영유아나 장애인 및 노인까지 그 대 상을 확대할 수 있다. 또한 전문 지식이 없이도 색의 변화만으로도 위험성을 알 수 있기 때문에 일반 대상자들도 쉽게 자각할 수 있어서 구강관리교육에 도 효과적으로 활용이 가능하리라 판단된다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 비교적 넓은 pH 범위, 예컨대 pH 3-7 범위에 걸쳐 뚜렷한 색상 변화를 나타내어 넓은 범위의 치아우식활성을 분석할 수 있다.

(b) 본 발명은 환자로부터 분리된 치태에 존재하는 미생물의 배양액에 적용되어 실시되기 때문에, 환자의 치아에 직접 적용되는 종래기술과 비교하여 환자의 순응도(compliance)가 높다.

(c) 본 발명은 치태에 존재하는 수많은 미생물종들의 유기산 생산 능력을 종합적으로 검출함으로써 치아우식증 활성에 대한 정보를 제공할 수 있다.

(d) 본 발명은 육안으로 관찰된 색상 관찰을 통하여 간편한 방식으로 치아우식활성을 분석할 수 있다.

(e) 본 발명은 기존의 검사법이 갖고 있는 시료 채취의 불편함을 극복함으로써 기존 방법으로는 검사가 용이하지 않은 영유아나 장애인 및 노인까지 그 대상을 확대할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법 및 재료

미생물 배양액의 조성

미생물 생장을 위한 성분으로 수크로스(Sucrose, Duksan), 트립토스(Tryptose, Difco), 효모추출물(Yeast extract, Pronadisa-Conda), 염화나트륨(NaCl, Junsei), 아지드화 나트륨(NaN₃ _,Sigma-Aldrich)을 하기 표 1의 비율로 혼합하여 구강내 미생물이 생장할 수 있는 배양액을 만들었으며, 배양성분 중 탄소원, 질소원 및 미량성분은 다른 종류도 가능하다.

미생물 배양을 위한 조성액은 500 ㎖ 의 탈이온수, 200 g 의 수크로스, 20 g의 트립토스, 0.5 g 의 염화나트륨, 1 g 의 효모 추출물, 0.2 g 의 아지드화 나트륨(NaN₃)을 첨가하여 혼합하였다. 충분히 녹인 후 탈이온수를 이용하여 전체 부피가 1000 ㎖ 가 되도록 하였다. 이렇게 만들어진 조성액은 간헐살균법(100 ℃ 오븐에 30분간 정치한 후 실온에서 식히는 과정을 3회 반복)을 통해 살균하였다. 살균이 완료된 조성액은 8 ㎖ 바이알에 각 2 ㎖ 씩 분주하여 준비하였다.

미생물 배양액의 조성

성분	백분율	양
수크로스	20 %	200 g/L
트립토스	2 %	20 g/L
효모 추출물	0.1 %	1 g/L
염화나트륨	0.5 %	5 g/L
아지드화니트륨(NaN₃)	0.02 %	0.2 g/L

pH 7 - pH 3을 구분할 수 있는 pH 지시약 조성 탐색

1. pH 지시약의 조성

본 발명에서는 먼저 pH 7부터 pH 3 사이의 환경을 잘 구별할 수 있는 지시약 및 지시약 조성을 탐색하고자 하였다. 진단 조성액의 구성 성분이 될 pH 지시약으로는 브로모크레졸퍼플(Bromocresol Purple)(BCP), 브로모크레졸그린(Bromocresol green)(BCG), 메틸레드(Methyl red)(MR), 메틸오렌지(Methyl orange)(MO), 레자주린(Resazurin)(R), 나프틸레드(Naphthyl red)(NR)를 사용하였다. 상기 6가지 pH 지시약은 Sigma-Aldrich 에서 구입하였다. 상기 6가지 각각의 pH 지시약을 이용하여 다양한 조성을 만든 후 이들 지시약 혼합물을 각각 pH 7.0, 6.0, 5.0, 4.0 및 3.0을 유지할 수 있는 하기 표 6의 조성을 가지는 완충 용액에 첨가하여 pH 환경에 따른 용액의 색을 관찰하였다. 여러 조건 중 pH에 따른 분리능이 가장 좋은 조건을 그 색깔 변화의 뚜렷함을 기준으로 선정하였다.

변색범위 pH 5.2 - 6.8 을 가지는 브로모크레졸퍼플과 변색범위 pH 3.8 - 5.4 를 가지는 브로모크레졸그린을 기본으로 조합하여 pH 3.8 - 6.8 사이의 범위를 탐지할 수 있도록 한 후, 추가적인 시약을 첨가하여 탐지범위와 민감도가 최대가 되도록 하는 조성을 탐색하였다.

지시약 혼합물은 탈이온수 9 ㎖에 브로모크레졸퍼플, 브로모크레졸그린 및 추가적인 각 지시약을 하기 표 2, 표 3, 표 4 및 표 5에서 제시한 함량의 10배 농도가 되도록 첨가하여 충분히 녹인 후 추가적인 탈이온수를 이용하여 최종 부피를 10 ㎖로 맞추었다.

브로모크레졸퍼플, 브로모크레졸그린 및 메틸레드의 조합

번호	브로모크레졸 퍼플 (μg/ml)	브로모크레졸 그린 (μg/ml)	메틸 레드 (μg/ml)
1	30	15	-
2	20	10	5
3	-	5	2
4	10	5	20
5	20	-	20
6	20	10	1
7	30	15	5
8	15	10	5

브로모크레졸퍼플, 브로모크레졸그린, 메틸오렌지의 조합

번호	브로모크레졸 퍼플 (μg/ml)	브로모크레졸 그린 (μg/ml)	메틸 오렌지 (μg/ml)
1	-	-	10
2	20	10	5
3	-	5	20
4	10	5	20
5	20	10	10
6	20	10	15

브로모크레졸퍼플, 브로모크레졸그린, 레자주린(Resazurin)의 조합

번호	브로모크레졸 퍼플 (μg/ml)	브로모크레졸 그린 (μg/ml)	레자주린 (μg/ml)
1	-	-	10
2	20	20	20
3	15	10	5

브로모크레졸퍼플, 브로모크레졸그린, 나프틸레드(Naphtyl red)의 조합

번호	브로모크레졸 퍼플(μg/ml)	브로모크레졸 그린 (μg/ml)	나프틸 레드 (μg/ml)
1	-	-	5
2	15	10	5
3	15	10	10
4	20	10	15
5	30	15	20

2. 완충용액의 조성

pH 7.0 - 3.0 의 완충 용액은 탈이온수 및 0.2M Na₂HPO₄ 용액과 0.1 M 시트르산 용액을 이용하여 하기 표 6에서 제시한 함량비 대로 제조하였다. 0.2 M Na₂HPO₄ 저장액은 1000 ㎖ 탈이온수에 무수 Na₂HPO₄(분자량:141.96, Duksan)를 28.392 g 첨가한 후 충분히 교반하여 준비한다. 0.1M 시트르산저장액은 1000 ㎖ 탈이온수에 무수 시트르산 (분자량:192.12, Jungbunzlauer)를 19.212 g 첨가한 후 충분히 교반하여 준비하였다.

완충용액의 조성0.2M Na₂HPO₄(ml)

pH	증류수(ml)	0.2M Na₂HPO₄(ml)	0.1M 시트르산(ml)
7.0	49.9	43.6	6.5
6.0	50	32.1	17.9
5.0	50	25.7	24.3
4.0	50	19.3	30.7
3.0	50	10.2	39.8

준비된 완충 용액(pH 7.0, 6.0, 5.0, 4.0 및 3.0)을 8 ㎖ 바이알에 1.8 ㎖ 씩 각각 분주하고 여기에 지시약 혼합물들을 0.2 ㎖ 첨가하여 색의 변화를 관찰하여 그 결과를 표 7 내지 표 10에 나타내었다.

사람 치태에 의한 지시약 조성물의 색깔 변화 관찰

앞선 실험을 통해 탐색된 조건을 이용하여 실제 사람 치태를 배양한 용액에 첨가 하여 색 변화를 관찰하였다. 먼저 사람으로부터 치태를 채취하기 위해 멸균된 재료를 준비하였고, 이를 이용하여 대상자 치아 표면에 존재하는 치태를 충분히 채취하였다. 치아는 특정 치아만을 선별하지 않고 모든 치아에 골고루 재료를 문질러 치태를 얻었다. 채취된 치태는 바로 배양액에 넣었다. 치태가 함유된 배양액은 37℃ 배양기에서 48시간 배양하였다. 배양이 끝난 배양액에 각 지시약 혼합물을 첨가하고 변화된 색을 관찰하였다.

사람의 치태를 얻기 위해 사용된 흡착재료(면봉)는 121℃에서 20분간 습윤살균 장치(Autoclave)를 이용하여 살균하였고, 이 후 60℃ 오븐에서 24시간 건조하였다. 검사는 다음과 같이 진행하였다. 먼저, 준비된 흡착재료를 이용하여 사람의 상악 및 하악의 치아 표면을 문질러 치아에 존재하는 치태를 채취하였다. 이 후 치태가 채취된 흡착물질을 준비된 미생물 배양액에 넣고 37℃ 배양기에서 48시간동안 배양하였다. 배양이 완료된 조성액에 pH 지시약을 0.2 ㎖ 첨가하여 색을 관찰하였다. 이 때 완충액을 이용한 결과와 대조하여 지시약 첨가 후 나타난 색을 토대로 대상자의 구강 내 미생물 군총의 산 생산 능력을 추론하고 우식발생을 예측하였다.

완충용액과의 반응결과를 통해 브로모크레졸퍼플, 브로모크레졸그린 및 메틸오렌지의 최적 조합물(pH 11.7)로 결정된 진단 시약을 과거 치아치료 개수가 0-4개인 교정치료환자의 치태와 반응시켰다. 브로모크레졸퍼플, 브로모크레졸그린 및 레자주린의 최적 조합물(pH 12.2)의 진단 시약을 과거 치아치료 개수가 0-10개인 교정치료환자의 치태와 반응시켰다. 또한 브로모크레졸퍼플, 브로모크레졸그린 및 나프틸레드의 최적 조합물(pH 13.8)의 진단 시약을 과거 치아치료 개수가 6-10개인 교정치료환자의 치태와 반응시켰다. 대체적으로 교정환자의 구강은 복잡한 장치로 구성되어 구강위생관리가 불리하다.

실험결과

1. 브로모크레졸퍼플, 브로모크레졸그린, 메틸레드의 조합

브로모크레졸퍼플, 브로모크레졸 그린 및 메틸레드가 다양한 비율로 조합된 8가지 조합 지시약에 의한 pH 3.0 - 7.0 환경에서의 색깔변화를 표 7에 나타내었다.

표 7에서 보는 바와 같이 조합시료 1번이 전 범위에 걸쳐 가장 뚜렷한 색깔변화를 보였으나 이는 브로모크레졸퍼플과 브로모크레졸그린과의 조합만으로 이루어진 시료이며, 이 밖의 시료들은 pH 3.0과 pH 4.0 사이의 색변화가 뚜렷하지 않아 모든 산성 pH 범위를 측정하기 위한 조합시료로써 브로모크레졸퍼플, 브로모크레졸그린, 메틸레드는 부적합한 조합임이 밝혀졌다.

2. 브로모크레졸 퍼플, 브로모크레졸 그린, 메틸 오렌지의 조합

브로모크레졸 퍼플, 브로모크레졸그린 및 메틸오렌지가 다양한 비율로 조합된 6가지 혼합 지시약에 의한 pH 3.0 - 7.0 환경에서의 색깔변화를 표 8에 나타내었다.

표 8에서 보는 바와 같이 BP : BG : MO 의 비율이 2:1:1.5 인 조합시료 6번이 전 범위에 걸쳐 가장 뚜렷한 색깔변화를 보였다.

3. 브로모크레졸퍼플, 브로모크레졸그린, 레자주린의 조합

브로모크레졸퍼플, 브로모크레졸그린 및 레자주린이 다양한 비율로 조합된 3가지 혼합지시약에 의한 pH 3.0 - 7.0 환경에서의 색깔변화를 표 9에 나타내었다.

표 9에서 보는 바와 같이 BP : BG : R 의 비율이 1.5 : 1 : 0.5 인 조합시료 3번이 전 범위에 걸쳐 가장 뚜렷한 색깔변화를 보였다.

4. 브로모크레졸퍼플, 브로모크레졸그린, 나프틸레드의 조합

브로모크레졸퍼플, 브로모크레졸그린 및 나프틸레드가 다양한 비율로 조합된 5가지 혼합지시약에 의한 pH 3.0 - 7.0 환경에서의 색깔변화를 표 10에 나타내었다.

표 10에서 보는 바와 같이 BP : BG : NR의 비율이 2 : 1 : 1.5 인 조합시료 4번이 전 범위에 걸쳐 가장 뚜렷한 색깔변화를 보였다.

이상의 결과를 종합하여 각 조합에서 산성조건의 pH 분해능이 가장 우수한 성분비율을 아래 표 11에 표시하였다.

지시약 혼합물에 따른 최적 조건

번호	BCP (ug/ml)	BCG (ug/ml)	MO (ug/ml)	R (ug/ml)	NR (ug/ml)
1	20	10	15	-	-
2	15	10	-	5	-
3	20	10	-	-	15

사람 치태에 의한 지시약 조성물의 색깔 변화 관찰

교정치료환자를 대상으로 한 실험 결과는 하기 표 12-14에 나타나 있다.

과거 치아치료 개수가 0-4개인 5명의 교정치료환자의 치태와 반응시킨 결과, 대상자 1, 3 및 5의 경우에는 pH가 약 4, 대상자 2 및 4의 경우에는 pH가 약 5 정도로 측정되었고, 이에 우식활성이 높다는 결론을 얻을 수 있었다.

과거 치아치료 개수가 0-10개인 5명의 교정치료환자의 치태와 반응시킨 결과, 대상자 a 및 e의 경우에는 pH가 약 4.5, 대상자 b 및 d의 경우에는 pH가 약 4, 대상자 c의 경우에는 pH가 약 3.5 정도로 측정되었고, 이에 우식활성이 표 12보다 높다는 결론을 얻을 수 있었다.

과거 치아치료 개수가 6-10개인 3명의 교정치료환자의 치태와 반응시킨 결과, 대상자 i의 경우에는 pH가 약 6.0, 대상자 ii는 pH가 약 4.0, 대상자 iii의 경우에는 pH가 약 3.5 정도로 측정되었고, 이에 우식활성이 매우 높다는 결론을 얻을 수 있었다.

상기 실험결과는 본 발명의 치아우식증 활성 진단 시약은 실제적으로 사람의 치태에 적용되어 치아우식의 정도를 간편하면서도 비교적 높은 정확도로 측정할 수 있음을 명확히 보여 준다.

Claims

(a) 제1성분으로서의 브로모크레졸 그린, (b) 제2성분으로서의 브로모크레졸 퍼플 및 (c) 제3성분으로서의 메틸오렌지, 레자주린 또는 나프틸레드를 포함하는 치아우식증 활성 측정용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 pH 3.0 - 7.0의 범위에서 색상 변화를 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 색상 변화는 육안(naked eye)으로 관찰될 수 있는 색상 변화인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 제3성분은 메틸오렌지 또는 나프틸레드인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 중성 pH를 가지는 것을 특징으로 하는 조 성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 제1성분으로서의 브로모크레졸그린, 제2성분으로서의 브로모크레졸퍼플 및 제3성분으로서의 메틸오렌지를 포함하고, 상기 브로모크레졸그린 : 브로모크레졸퍼플 : 메틸오렌지의 조성비는 1:2:1.5 중량비인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 제1성분으로서의 브로모크레졸그린, 제2성분으로서의 브로모크레졸퍼플 및 제3성분으로서의 레자주린을 포함하고, 상기 브로모크레졸그린 : 브로모크레졸퍼플 : 레자주린의 조성비는 1:1.5:0.5 중량비인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 제1성분으로서의 브로모크레졸그린, 제2성분으로서의 브로모크레졸퍼플 및 제3성분으로서의 나프틸레드를 포함하고, 상기 브로모크레졸그린 : 브로모크레졸퍼플 : 나프틸레드의 조성비는 1:2:1.5 중량비인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 측정 대상의 치아로부터 채취한 치태에 존재하는 미생물의 배양액에 적용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
다음의 단계를 포함하는 치아우식증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 환자의 치태에 존재하는 미생물을 검출하는 방법:

(a) 환자로부터 채취한 치태에 있는 미생물을 배양하는 단계;

(b) 상기 미생물의 배양액을 상기 제1 항 내지 제9항 중 어느 한 항의 치아우식증 활성 측정용 조성물과 반응시키는 단계; 및

(c) 상기 배양액 및 치아우식증 활성 측정용 조성물의 혼합액의 색상을 관찰하는 단계.
제 10 항에 있어서, 상기 치태에 있는 미생물은 치아우식증 원인균인 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 치태는 흡착재료를 이용하여 치아 표면을 문질러 채취된 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 단계 (c)는 상기 배양액에 상기 치아우식증 활성 측정용 조성물을 첨가한 후 즉시 육안으로 관찰하는 것을 특징으로 하는 방법.