JPS62239999A - Ｎａｄ（ｐ）ｈの半定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の目的〕 発明の利用分野 本発明は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリ
ン酸（以下これらをｒＮＡＤ　（Ｐ）Ｈ」という）の半
定量法に関し、さらに詳しくは触媒の存在下ＮＡＤ　（
Ｐ）Ｈを含む試料とレサズリンを反応せしめて、生じた
色の変化を肉眼判定することを特徴とするＮＡＤ　（Ｐ
）Ｈの半定量法に関する。

従来の技術 従来ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈを定量する方法は、（１）それ自
身の有する紫外部の吸収または螢光を測定する方法、（
２）ジアホラーゼの存在下ＮＡＤ（Ｐ）Ｈとテトラゾリ
ウム化合物などの色原体を反応せしめてホルマザン色素
に導き、その可視部の吸収を測定する方法および（３）
触媒の存在下ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈとレサズリンの反応によ
って生成したレゾルフィンの螢光を測定する方法〔メソ
ソズ　イン　エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ、）第４１巻、５３〜５６頁、　１９７５年〕が
知られている。

上記紫外部の吸収を測定する方法は、血清などの生体体
液を試料とする場合は共存する紫外部に吸収を有する妨
害物質による影響を受けること、および感度が低いとい
う欠点があり、また螢光を測定する方法は測定感度が高
いにもかかわらず、螢光光度計が高価で一般的に普及し
ていないため繁用されていない。また、上記ホルマザン
色素を測定する方法は該色素が難溶性であるため光度計
のセルやチューブに付着することおよび測定感度が低い
という欠点がある。

ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈは脱水素酵素および還元酵素の補酵素
であり、これらの酵素の反応によって生じたＮＡＤ　（
Ｐ）Ｈの変化を測定するこ、とによって生体体液中に存
在する酵素またはそれら酵素の基質となる生体体液中の
成分が測定される。現在、生体体液中の成分の定量には
酸化酵素を用いる方法がもっばら利用されているが、こ
の方法は試料中に共存するアスコルビン酸、ビリルビン
などの還元性物質による妨害を受は易いという欠点があ
る。脱水素酵素または還元酵素を用いる方法はこのよう
な還元性物質による影響を受けにくい有利な方法である
が、前記した理由によりあまり利用されていないのが実
状である。

発明が解決しようとする問題点 本発明は前記した従来のＮＡＤ　（Ｐ）Ｈの定量におけ
る欠点を改良し、かつ分光光度針、螢光光度計などの測
定機器を必要としない簡便な半定量法を提供することを
目的とする。

〔発明の構成〕

問題点を解決するための手段 本発明者らはＮＡＤ　（Ｐ）Ｈを定量する方法について
、実用性に優れた発色色素を利用する手段を鋭意研究し
た結果、触媒の存在下ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈとレサズリンか
らレゾルフィンを生成せしめる反応において、レサズリ
ンおよびレゾルフィンが可視部の特定の波長に吸収極大
を有するという性質を利用してＮＡＤ　（Ｐ）Ｈを定量
する方法を見いだした。即ち、レサズリンは微アルカリ
性側で６００ｎｍ付近に吸収極大を有する青色物質であ
り、一方レゾルフィンは５７Ｏｎｍ付近に吸収極大を有
する赤色物質であるから、それぞれの吸収極大付近の波
長における吸光度を測定することによりＮＡＤ　（Ｐ）
Ｈが定量される。ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈとレサズリンの反応
式を次に示す。

（以下余白） レサズリンおよびレゾルフィンの濃度は前記の波長にお
ける吸収を光度針を用いて測定することによって正確に
定量することができるが、本発明者らは用いる試薬の濃
度を適正な範囲に選べば肉眼判定により半定量できるこ
とを知った。

本発明によれば、あらかじめ種々濃度のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
とレサズリンを反応せしめて得られた反応液の色を対照
として、これと試料反応液の色を肉眼で対比することに
より試料中のＮＡＤ　（Ｐ）Ｈを半定量することができ
る。測定可能なＮＡＤ　（Ｐ）Ｈの濃度の範囲は使用す
るレサズリンの濃度によって決定される。色の対比は、
反応液どうしでもよいが、反応液をろ紙にスポットし、
ろ紙上の色で比較することもできる。そのほかにろ紙テ
ープ中に反応液を浸み込ませて、試料と接触させて現わ
れる色でみる簡便なチップ（テープ）法も可能である。

本発明においてＮＡＤ　（Ｐ）Ｈとレサズリンからレゾ
ルフィンを生成する反応の触媒として使用されるのは、
例えばジアホラーゼ、フェナジンメトサルフェートであ
り、特に好ましくはジアホラーゼが用いられる。

本発明によるＮＡＤ　（Ｐ）Ｈの定量は、ＮＡＤ（Ｐ）
Ｈを補酵素とする酸化還元酵素の活性の測定または該酵
素を用いた基質の測定に利用することができる。このよ
うな酸化還元酵素の例としては、乳酸脱水素酵素、アル
コール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グルタミン酸
脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、α−
グリ七コロリン酸脱水素酵素グリセロール脱水素酵素、
コレステロール脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、ピ
ロリン−５−カルボン酸還元酵素などが挙げられる。ま
た、上記の酵素とリンクさせることのできる酵素または
基質の測定に本発明を用いることもできる。例えば、ピ
ロリン−５−カルボン酸還元酵素に対しては、オルニチ
ン−ケト酸アミノトランスフェラーゼとアルギナーゼ、
アルギニノコハク酸リアーゼ、アルギニノコノｈり酸シ
ンテターゼ、オルニチンカルバモイルトランスフェラー
ゼ、カルバモイルリン酸シンテターゼなどから選ばれる
酵素をリンクさせることにより、これら酵素活性または
これら酵素が触媒する基質を測定することができる。

実施例Ｉ　　ＮＡＤＨの半定量 マイクロプレート（タック社製、ディスポーザルＵ型、
９６穴）の各ウェルに終濃度Ｏ〜４２８μＭのＮＡＤＨ
，同１４２μＭのレサズリン、同０．ＯＩＭ−トリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８，５）およびジアホラーゼ２００ｍ　
Ｕを含む反応混合物７０ｐｓ１を入れ、室温で５分間イ
ンキヱベートした。ＮＡＤＨの濃度と反応液の色は第１
表に示すとおりであった。

（以下余白） 第１表 実施例２ 実施例１において、レサズリンの濃度を２００μＭとし
た以外は同様に操作した。ＮＡＤＨの濃度と反応液の色
は第２表に示すとおりであった。

第２表 実施例３ 実施例１において、レサズリンの濃度を２８５μＭとし
た以外は同様に操作した。ＮＡＤＨの濃度と反応液の色
は第３表に示すとおりであった。

第３表 実施例４　オルニチン−ケト酸アミノトランスフェラー
ゼ活性測定への応用 マイクロプレートの各ウェルにオルニチン２０ｎｍｏｌ
、）リス塩酸（ｐＨ８，０）　　５　Ｉ！　ｍｏｌ　、
α−ケトグルタル酸０．２５μｍｏｌ　、ジチオスレイ
トール０．５ｎｍｏｌ、ピロリン−５−カルボン酸還元
酵素３．７ｍＵ、および終濃度４０〜３６０　μＭのＮ
　Ａ　Ｄ　Ｈを含む反応混合物５Ｍを入れ、試料として
新生児の血液を固定化したガスリー氏ろ紙ディスク（径
３　ｍｍ）を加えて３７℃で１６時間インキュベートし
た。次いで１ｍＭレサズリン１０ｉおよび２００ｍ　Ｕ
シアホラ−４１０ｇを加えて室温において５分間反応し
た。

反応液をワットマンｌｌ＆１３ＭＭろ紙にスポットし、
風乾したのち色を観察した。その結果、ＮＡＤＨの濃度
が１１０〜１４０μＭの範囲にある場合、オルニチン−
ケト酸アミントランスフェラーゼ活性は正常値、その１
／２．１１５、およびＯ（欠損症）の鑑別ができ、それ
ぞれ色は青、青紫、紫、および紫桃であった。またＮＡ
ＤＨが２１０μＭではそれぞれ青、紫、桃、桃色となっ
た。ＮＡＤＨの濃度が上記以外の範囲では酵素活性の有
無が鑑別できた。

実施例５　アルギナーゼ活性測定への応用マイクロプレ
ートの各ウェルにアルギニン２０ｎｍｏｌ、トリス塩酸
（ｐＨ８，０）　　５　ｐ　ｍｏｌ　、α−ケトグルタ
ル酸０．２５μｍ１０１、ジチオスレイトール０．５ｎ
ｍｏ＋、オルニチン−ケト酸アミノトランスフエラーゼ
３．７ｍＵ、ピロリン−５−カルボン酸還元酵素３．７
ｍＵ、および終濃度１００〜２００μＭのＮＡＤＨを含
む反応混合物５０度を入れ、試料として新生児の血液を
固定化したガ入り−氏ろ紙ディスク（径３開）を加えて
３７℃で１６時間インキュベートした。次いで１ｍＭレ
サズリン１ｔＷおよび２００ｍｔＪジアホラーゼ１０ｇ
を加えて室温において５分間反応した。反応液をワット
マンＮ１５ＭＭろ紙にスポットし、風乾したのち色を観
察した。その結果、アルギナーゼ活性は正常値、その約
１／２、約１１５、およびＯ（欠損症）の鑑別ができ、
それぞれ色はＮＡＤＨが１６０μＭでは青、青紫、紫桃
および桃であった。またＮＡＤＨが１１５〜１４０μＭ
ではそれぞれ青、青紫、紫および紫桃色であった。

実施例６　アルギニノコハク酸リアーゼ活性測定への応
用 実施例５において、アルギニンの代わりにアルギニノコ
ハク酸２Ｑｎｍｏｌを用い、精製アルギナーゼ（肝）４
ｍＵとＮＡＤＨの濃度を１４０〜２１０μＭとした以外
は同様に操作した。一般的には血中のアルギナーゼが強
いためとくに肝のアルギナーゼは省略できる。正常な酵
素活性、その１／２．１１５．０の欠損症を有する試料
の反応液の色はＮＡＤＨ１４０〜１７０μＭでは青、青
紫、紫、紫桃色であった。２１０〜２９０μＭではそれ
ぞれ青、紫乃至紫桃、そして桃色であった。

実施例７　アルギニノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ
、オルニチン−ケト酸アミノトランスフェラーゼ、ピロ
リン−５−カルボン酸還元酵素欠損症の同時マス・スク
リーニング法 実施例６において、オルニチン−ケト酸アミノトランス
フェラーゼとピロリン−５−カルボン酸還元酵素を除去
し、ＮＡＤＨを１４０〜１７０μＭとした以外は同様に
操作した。１個の乾燥血液ろ紙ディスクで四つ酵素活性
の有無やヘテロ保因者をスクリーニングできる。どれか
１つでも酵素が欠損している欠損症ならば紫乃至紫桃色
となり、ヘテロならば青紫色になる。

〔発明の効果〕

本発明法により、試料中に共存する還元性物質による妨
害をうけにくい酸化還元酵素の半定量および該酵素を用
いる生体体液成分の半定量が可能となった。本発明法は
、従来の測定で用いられてきた分光光度計若しくは螢光
光度計などの測定機器を必要としないため、新生児のマ
ススクリーニングなどの大量の試料を迅速に測定する必
要がある場合に効果的である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまた
   は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
   を含む試料とレサズリンを触媒の存在下反応せしめて生
   じた色の変化を肉眼判定することを特徴とする還元型ニ
   コチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型ニコ
   チンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の半定量法。 ２　触媒がジアホラーゼである特許請求の範囲第１項記
   載の方法。