JPH01128797A - 酵素活性の定量法 - Google Patents

酵素活性の定量法

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JPH01128797A JP62286559A JP28655987A JPH01128797A JP H01128797 A JPH01128797 A JP H01128797A JP 62286559 A JP62286559 A JP 62286559A JP 28655987 A JP28655987 A JP 28655987A JP H01128797 A JPH01128797 A JP H01128797A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は酸素の存在下色源体に酸化酵素を作用させて色
素を生成する反応の反応速度を増強させる化合物（以下
エンハンサ−という）の定量法に関する。
腎障害の指標となるＴ−グルタミルトランスベ１−ｆ−
’ｆ−ゼ（γ−ＧＴＰ）　、ロイシンアミノペプチダー
ゼ（ＬＡＰ＞あるいはアラニンアミノペプチダーゼ（Ａ
ＡＰ）等の定量において特定の基質をこれらを分解する
酵素の作用によって分解しエンハンサ−を生成するよう
に基質を選択することによって微量の酵素を定量できる
。
従来の技術 γ−ＧＴＰ、ＬＡＰあるいはＡＡＰの定量は例えばこれ
らの酵素を含有する試料にその基質を加え、必要に応じ
て分析可能な物質に誘導するのに必要な酵素を加えて生
成する測定可能な化合物の生成速度を測定することによ
って行われている。
例えばｒ−ＧＴＰＳＬＡＰによってこれらの酵素の適当
な基質を分解させてアニＩＪン誘導体を生成させ、これ
と色源体とを反応させて色素を生成させこの色素の生成
速度を定量することによって行われている。酵素量が少
ないときはできるだけ分子吸収係数の大きい色素を生成
する色源体が用いられるがこれには限界がある。
問題点を解決するための手段 本発明によれば酸素の存在下に色源体を酸化する酵素の
作用によって色源体を酸化する反応の反応速度を増強さ
せる化合物即ちエンハンサ−の存在下に該反応を行わせ
て生成する色素を定量することによってエンハンサ−の
童を定量できる。
本発明の原理はエンハンサ−の量と色素の生成速度が比
例していることに基づいている。すなわち、酸化酵素の
作用によって色源体が酸化され時間に比例して色素が生
成し、エンハンサ−が存在すると色素の生成速度が増幅
される。又エンハンサ−の量を変えたときの一定時間後
の色素の生成量はエンハンサ−の量に比例していること
に基づいている。
本発明を実施するに際してはエンハンサ−を生成するあ
るいは含有する試料に色源体及び酸化酵素を加え要すれ
ば緩衝液中で反応させる。反応は用いられる酵素の至適
条件通常２０〜４０℃、ｐＨ５〜９で行われる。
本発明で用いられる緩衝剤としてはグツドバッファー、
リン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、トリス塩酸塩等が例示さ
れる。
反応に際し各試薬は緩衝剤１０ｍ）Ｊ−ＬＭ、酸化酵素
０．００１〜１００００／ｍ！、色源体０．　Ｏ１〜１
０ｍｇ／　ｊｉ！の濃度で用いられる。
生成した色素の定量は公知のいずれの手法も適用できる
が簡便には色素の極大吸収波長の光による反応液の吸収
を測定することによって行われる。
本発明によって定量できるエンハンサ−は色源体を酸化
する反応の反応速度を増加させる化合物であればいずれ
も測定できる。
かかる化合物の具体例として一般式（＋）〔式中Ｒ１〜
Ｒ４は同一もしくは異なってよく水素、ハロゲン、アル
キル、スルホン又はヒドロキシルを示しＲ３はヒドロキ
シル、アミノ又は置換アミノを示し、該置換基はアルキ
ル、スルホアルキル、ヒドロキシアルキルを示す〕で表
されるアニリン誘導体があげられる。
具体的化合物として３．５−ジブロモ−４−ヒドロキシ
アニリン（ＤＢＨＡ）　、３．５−ジクロロ−４−ヒド
ロキシアニリン（ＤＣＨＡ）、ｐ−Ｎ、Ｎ−ジスルフォ
ブロピルアミノアニリン（ＳＰＡ）、３．５−ショート
−４−ヒドロキシアニリン（ＤＩＨＡ）、３．３−ジア
ミノスチルベン−４，４′−ジスルフォン酸（ＤＳＤＡ
）　、ｐ−７二二レンジアミン（ＰＰＤ）　、４−アミ
ノアニリン−３−スルフォン酸（ＤＡＳ＞　、２−メチ
ル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリン（ＤＭ
ＢＨＡ）　、２．６−シメチルー３．５−ジクロロ−４
−ヒドロキシアニリン（ＤＭＤＢＨＡ）　、４−Ｎ、Ｎ
−ジスルフォプロピルアミノ−３，５−ジブロモアニリ
ン（ＳＤＢＡ）　、４−　（Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキ
シエチルアミノ）−３，５−ジブロモアニリン（ＥＨＤ
ＢＡ）　、ｌ−Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノ−３，４−ジヒ
ドロキシアニリン（ＤＥＤＨＡ）　、Ｎ、Ｎ−ジスルフ
ォプロピルアニリン（ＤＳＰＡ）などがあげられる。
采発明で用いられる酸化酵素としては酸素の存在下電源
体を酸化して色素を生成させる酵素はいずれも使用でき
、ビリルビンオキシダーゼ（ＢＬＯＤ、ＥＣＩ、３．３
．５）、モノフェノール・オキシゲナーゼ（ＭＰＯｌＥ
ＣＩ、１４．１８、■）、アスコルビン酸オキシダーゼ
（ＡＯＤ、ＥＣＩ、１０．３．３、）、カテコールオキ
シダーゼ（ＥＣＩ、１０．３．１）、ラッカーゼ（ＥＣ
Ｉ、１０．３．２）、０−アミノフェノールオキシダー
ゼ（ＥＣＩ、１０．３．４）、：３−ヒドロキシアンス
ラニレイトオキシダーゼ（ＥＣ１１１０，３，５）、フ
ェノールモノオキシゲナーゼ（ＥＣＩ、１４．１３．７
）などがあげられる。
色源体としては、酸化されて発色するものは何れも使用
できる。高感度を目視す目的に使用するには、分子吸光
係数の高いものが好ましい。しかしエンハンサ−の非存
在下の反応において発色（試薬盲検に相当）は少ないが
、エンハンサ−の存在により著しく強い発色を示す化合
物が好ましく、例えば次の化合物があげられる。
Ｐ−Ｉ　　　　　　　　　　　　　　Ｐ−２Ｐ−３ ［：Ｉｌ、　　　　　　　　ＣＨ。
ＣＨ３ＣＨ５ □ Ｎｌｌ　　　　　　　　Ｐ−７ ＣＭ。
Ｃ＝０ 曜 ＮＨＰ　−８ ＣＨ２−Ｃ００Ｉ（ ｌ１ ＣＨ２−Ｃ００ＩＩ Ｃ二〇 曙 Ｐ１２Ｐ−１３ これらの化合物の吸収極大値が表に示される。
本発明のエンハンサ−の定量法は微量の酵素の定量に適
用することによって優れた効果を奏する。
即ち、微量の酵素を含有する試料にその酵素の基質を加
え反応させてエンハンサ−を生成させ、このエンハンサ
−を本発明方法によって定量すれば酵素活性を定量でき
る。
試料中の酵素が微量でエンハンサ−の生成速度は小さく
ても徐々にエンハンサ−が蓄積し、エンハンサ−の増加
に伴って色素の生成速度が徐々に加速されエンハンサ−
の量に対応して色素が生成する。この色素の生成速度を
測定すればエンハンサ−の生成速度が定量できるので試
料中の酵素活性も定量できる。
酵素活性と色素による反応液の吸光度は比例関係にある
ので検量線は酵素活性と吸光度の関係を求めておけば便
利である。
この方法で酵素活性を定量するに際しては酵素反応を行
わせたときにエンハンサ−を定量的に生成する基質が用
いられる。酵素の基質としてエンハンサ−を生成するよ
うな基質が知られていないときには公知の酵素の基質に
エンハンサ−を結合した基質を調製し、これを用いれば
よい。例えばＤＢＨＡ、ＤＣＨＡ等のエンハンサ−はヒ
ドロキシル基を有するので適当なアミノ酸あるいはベプ
タイドを介してエンハンサ−と公知の基質を結合させた
化合物を当業者は容易に製造できる。
酵素と基質の組合せが例示される。
酵素活性の定量を実施するに際して、緩衝剤。
酸化酵素１色源体は前述の濃度で用いられ基質は０、１
〜１００ｍｇ／ｍｌ　、界面活性剤は１〜１０　ｍｇ／
ｍｌの濃度で用いられる。
本発明によれば酸化酵素及び化合物（［）からなるエン
ハンサ一定量用組成物が提供される。この組成物に緩衝
剤、測定すべき酵素の基質、界面活性剤等が加えられる
ことができる。これらの組成物における各成分は前述の
濃度の比が適用される。
本発明によれば測定に必要な試薬液をろ紙ポリマー等適
当な試薬液吸収材料に含ませ乾燥させたシート、フィル
ム、ステック等は診断に便利で有用である。吸収材料に
は測定に必要な成分を前述の濃度比で含ませ乾燥し、使
用に際して試料を加えて反応させ発色の強さを試薬ブラ
ンクと比較すればよい。
以下に本発明の態様を実施例によって説明する。
実施例Ｉ ＤＩＰＳ○（グツド緩衝液＞（ｐＨ７，５）　０．１Ｍ
ディスパノールＭ　−３２Ａ　　　　　５　ｍｇ／ｍｌ
化合物Ｐ　−１０，２ｍｇ／ｍ１ ＢＬＯＤ　　　　　　　　　　　　　Ｏ，０２Ｕ／ｍｌ
Ｇ　ｌ　ｙ　−Ｇ　！　ｙ　　　　　　　　　　３　　
ｍｇ／ｍ１ＭｇＣｊＬ　　　　　　　　　　　　　１　
　ｍｇ／ｍ１Ｔ−グルタミル−Ｄ　Ｂ　ＨＡ　（Ｇ−Ｄ
ＢＨＡ）　　２　　ｍｇ／ｍｌ上記試薬液３．０ｍｌに
２．５．　５．７．５及び１０ｍＬＩ／ｍｌのｒ−ＧＴ
Ｐ液を０．０２ｍ１を加えて３７℃で３０分反応させ生
成する色素による６　３’　Ｏｎｍにおける吸光度の変
化を測定した。
この反応は下記で示される。
って色素の生成速度は増加する。色素の生成を測定する
ことにより反応液中のｒ−ＧＴＰの活性を知ることがで
きる。
一方比較としてｐ−ｔの代わりに色源体としてＮ−エチ
ル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ′−サクシニル・
エチレンジアミン（ＥＭＳＥ）　を１．５ｍｇ／ｍｌ　
、　ＢＬＯＤを０．４Ｕ／ｍｌ用いる他は上記試薬と同
一組成の試薬を用いて同様の実験を行い反応液の７１０
ｎｍにおける吸光度を測定した。
この反応は下記で示される。
　−ＧＴＰ Ｇ−ロ叶Ａ＋Ｇｌｙ−Ｇｌｙ　　　　　　　　　　　　
　Ｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ＋ＤＢｔ（ＡＬＯＤ Ｈ”　＋ＤＢＨ八十ＥへＳＢ　　　　　　　色素この反
応では、反応速度は増加しないので色素の生成が非常に
遅い。
ｒ−ＧＴＰの濃度と吸光度の関係は上記実験結果から比
例関係にあることが下記に示される。
実施例２ 試薬液Ａ ＤＩＰＳＯ緩衝液（ｐＨ７，５）　　　　　０．１　Ｍ
ディスパノールＭ−３２Ａ　　　　　５　　ｍｇ／ｍｌ
化合物Ｐ　−２０，２ｍｇ／ｍ１ ＡＯＤ　　　　　　　　　　　　　　５０　　Ｕ／ｍ１
Ｍｇ（１！、　　　　　　　　　　　　　１　　ｍｇ／
ｍ１ＬＬ−ＤＳＰＡ　　　　　　　　　　２　　ｍｇ／
ｍ１３．０ｍｌの試薬液Ａに２０ｍ１／ｍｌのＬＡＰ含
有液０．０２ｍ１を加えて３０分間反応させ、反応液の
吸光度を６３０ｎｍで測定した。又同様にＰ−２の代わ
りにＥＭＳＥを使用し同様に操作し７４５ｎｍの吸光度
を測定した系と比較して５．２倍の感度が得られた。
実施例３ 試薬液Ａ リン酸緩衝液（ｐＨ７，２）　　　　　　　０．１　Ｍ
ト　リ　ト　ンＸ　−１００５ｍｇ／ｍｌ化合物Ｐ−１
１ｍｇ／ｍ１ ＡＯＤ　　　　　　　　　　　　　　２００　　Ｕ／ｍ
１Ｇ−ＤＢＨＡ　　　　　　　　　　　１０　　ｍｇ／
ｍｌＧ　ｌ　ｙ　−Ｇ　ｌ　ｙ　　　　　　　　　　２
０　　ｍｇ／ｍｌ試薬液Ａに厚さ０．２１ｍｍのワット
マンに４１のろ紙を浸した後真空乾燥器中で乾燥して試
験紙を作成した。
試薬液Ｂ 化合物Ｐ−１の代わりにＥＭＳＥ　（４ｍｇ／ｍｌ）及
びＡＯＤの量を５００　Ｕ／ｍｌにする以外は試薬液Ａ
と同じ組成である。これを上記と同様にして試験紙を作
成した。
ｒ−ＧＴＰを０．０．１．０．２．０．５．１．０゜２
．０．５．０．　１０．　２０．　５０ｍ［Ｊ／ｍ＋含
有する水溶液を用意し、この液ｔｏｏｙをそれぞれ試験
紙Δ、Ｂの上に滴下してどの濃度のｒ−ＧＴＰまで検出
が可能なのかを調べた。反応時間が２０分では已につい
ては５．０　ｍｌ／ｍｌまでであったが八についてはＯ
，１ｍＵ／ｍｌまで可能であり、３分間の反応ではＢが
５０ｍ１／ｍｌまで、Ａは１　　ｍｌｌ／ｍｌまで調べ
ることができた。また、健常人の尿および腎疾患患者の
尿を滴下したところ、試験紙Ｂでは２０分でその違いが
認められたが、試験紙Ａでは５分で判断できた。
実施例４ 実施例３のＡＯＤの代わりに表に示す酸化酵素を用いる
他は実施例３の方法を繰り返して表に示す結果を得た。
実施例５ 下記物質測定のためにＧ−ＤＢＨＡの代わりに下表の基
質を用いる他は実施例１の方法を繰り返して行った。
実施例６ ＬＳＰＡの代わりに表に示す基質を用いる他は実施例２
を繰り返して表に示す酵素活性を測定した。
実施例７ 実施例２のＤＳＰＡの代わりに、ＤＩＨＡ。
ＤＳＤＡ、ＰＰＤ、ＤＡＳ、ＭＤＢＨＡ。
ＤＭＤＢＨＡ、５ＤＢＡ、ＥＨＤＢＡ。
ＤＥＤＨＡをそれぞれ使用して実施例２の実験を行った
。ＢとＡの感度比はそれぞれ４６．１，３．４゜６．８
．４．４．　１６．６．　２０．８．　５．０．　１１
．４゜８．９となった。
発明の効果 本発明によれば、試料中に微量ふくまれるＴ−ＧＴＰ、
ＬＡＰなどの酵素を容易に短時間に測定することができ
る。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）酸素の存在下に酸化酵素によって色源体の酸化反
    応の反応速度を増加させる化合物（以下エンハンサーと
    いう）の存在下に該反応を行わせて生成する色素を定量
    することを特徴とするエンハンサーの定量法。
  2. （２）該エンハンサーが酵素反応の生成物である特許請
    求の範囲第１項記載の定量法。
JP62286559A 1987-11-13 1987-11-13 酵素活性の定量法 Expired - Lifetime JPH07114709B2 (ja)

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