JPS61234795A - 芳香族アミノ酸の定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、血液または一般食品中の遊離の３種の芳香族
アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファ
ン）を定量測定する方法に関するものである。

〔従来の方法〕

遊離アミノ酸の定量は現在ではもっばら自動アミノ酸分
析機によって行なわれている。　　しかし、臨床検査や
食品製造工場の品質管理におけるその定量は、短時間に
低コストで多数の試料を分析しなければならない。　　
したがって、酵素法、化学法、バイオアッセイ法による
アミノ酸個別定量法が、今だに採用されている。　酵素
法は２種に大別され、その第１はグルタミン酸の定量方
法に代表されるもので、この方法は、ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤと略称する。）又
はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下
、ＮＡＤＰと略称する。）の存在下で、グルタミン酸デ
ヒドロデナーゼを試料に作用させると、グルタミン酸か
らα−ケトグルタル酸への反応と共にＮＡＤまたはＮＡ
ＤＰが各々還元型のＮＡＤ（すなわちＮＡｔ））（）ま
たは還元型のＮＡＤＰ（すなわちＮＡＤＰＨ）に変化す
るので、このＮＡＤＨまたはＮＡＤＰ）Ｉの増加量をそ
の吸光度増加量として測定するものである。

グルタミン酸 上記第１の方法は、脱水素酵素法に分Ｈされている。　
しかし、この種の方法で芳香族アミノ酸を測定したとい
う報告はない。　残る第２の方法は、酸化酵素法とよば
れるもので、Ｌ−アミノ酸オキシグーゼ、トリプトファ
ンオキシグーゼ、フェニルアラニンオキシグーゼを用い
て、各々Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、トリプトファン
、フェニルアラニンを定量することができる。　この第
２の方法は、酸化酵素がその基質アミノ酸を酸化すると
き、同時に化学量論的に過酸化水素を発生するので、こ
の過酸化水素をパーオキシダーゼで分解し、この反応で
の発生酸素によって適当な色原体を酸化発色させ、その
発色量を測定することによって、上記アミノ酸を定量す
るものである。　しかし、この第２の方法によっても、
遊離の芳香族アミノ酸を定量したことはない。　ただし
−またはＤ−７ミノ酸オキシダーゼをアミノ酸分析機の
検出器として使用した報告（（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　
ｃｈｃａｍ、、　Ｖｏｌ、３５．　Ｎｏ、１＋　１４（
１９６３）〕があるだけである。　また、遊離芳香族ア
ミノ酸を化学法で測定する方法は、古（から種々知られ
ている。　例えば、血中のフェニルアラニン定量法とし
て広く利用されるニンヒドリン−ペプチド法は、血液試
料をトリクロル酢酸で除蛋白した後、ニンヒドリンとＬ
−ロイシル化−アラニンの共存下で６０℃２時間反応さ
せ、水冷後、硫酸銅試薬を加え、次いで、室温に１０〜
１５分間放置して励起波長３６５ｎｍ、蛍光波長５８０
ｎｍで蛍光光度測定を行う。　その他に、カベラーアド
ラー法（Ｋａｐｅｌ　１ａｒ−Ａｄｌｅｒ法）がある。

　チロシンノ化学的定量方法としては試料に１−ニトロ
ソ−２−す７トールと硫酸を加えて加熱する方法があり
、トリプトファンの定量測定方法としては、ハロゲン化
法、Ｎ−ニトロソ法などがある。　バイオアッセイ法と
しては、枯草菌を用いたフェニルアラニン定量法があり
、キットとして市販（第一化学薬品（株）製）されてい
る。

〔発明が解決しようとする問題点〕

脱水素酵素法は、定量されるべきアミノ酸を酵素で酸化
するとき、ＮＡＤ主た（土ＮＡＤＰが各々ＮＡＤＨ主た
；土ＮＡＤＰＨに共役反応することを利用しているもの
であるが、血中においては、その中に存在するＮＡＤま
たはＮＡＤＰ、更には、これに関連する酵素が反応に干
渉するという問題点があった。　また、経済的観点から
は、脱水素酵素法では高価なＮ−ＡＤよたはＮＡＤＰを
必要とし、他方、酸化酵素法では、Ｎ−ＡＤまたはＮＡ
ＤＰ以外にパーオキシダーゼ、色原体などをも必要とし
ているので、定量の実施に多額の経費を要する。

化学法は、いずれも複雑な試薬の調製が必要であり、反
応時間も長く、特異性が広いなどの問題点がある。　例
えば、前記ニンヒドリン−ペプチド法では、種々のアミ
ノ酸の発色、蛋白質の混在などにより測定誤差が大きい
。　カベラーアドラー法では、フェニルアラニンについ
てのみ再現性があり、他には不安定である。　ハロゲン
化法、Ｎ−ニトロソ法は、特異性が広く、蛋白質の影響
を受けやすい、　バイオアッセイ法は、半定量法であり
、精度が悪く、所要時間も１６〜１８時間を要し、更に
高度の技術も必要であるなどの問題点を有している。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、上述の如き従来技術の問題点を解消するため
に次のような構成をとるものである。　すなわち、本発
明は、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼを、芳香族ア
ミノ酸を含有する試料に作用させ、生成するアミン類を
有機溶媒に転溶させ、次いで該アミン類の光吸収度、蛍
光強度、または化学発色による発色度を測定することに
よって試料中の芳香族アミノ酸を定量することを特徴と
する芳香族アミノ酸の定量法であり、また上記方法にお
いて、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼをろ紙、けい
藻土等の担体に吸着させ、該担体の表面部または内部に
おいて酵素反応を行わせるものであり、あるいはまた、
上記方法において、生成するアミン類を転溶させる有機
溶媒として、塩基性物質を含む有機溶媒を使用する芳香
族アミノ酸の定量法である。

本発明における芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼとし
ては、フェニルアラニンデカルボキシラーゼ、トリプト
ファンデカルボキシラーゼ、チロシンデカルボキシラー
ゼ等のアミノ酸デカルボキシラーゼを用いる。　これら
の酵素は、第４図に示す如く脱炭酸反応を触媒し、前記
従来技術に示したいずれのカテゴリーにも入らない。　
　したがって、上記酵素を用いた本発明における定量法
は、いずれのカテゴリーにも入らないものである。

本発明においては、第４図に示す反応によって生成する
β−７ｘ　ニルエチルアミン（β−ｐｈｅｎｙｌｅｔｈ
ｙｌａｍｉｎｅ）、トリプタミン（ｔｒｙｐｔａｍｉｎ
ｅ）、チラミン（ｔｙｒａｍｉｎｅ）を定量することに
よって、上記酵素反応の基質である各芳香族アミノ酸を
定量するものである。　アミノ酸デカルボキシラーゼは
、動・植物界に広く分布しているが、芳香族アミノ酸の
うち、いずれか１つに特異性が高い酵素が本発明の定量
法には好ましい。　芳香族アミノ酸以外のアミノ酸の特
異性については、光吸収および蛍光をもたないからそれ
らについての特異性を問題にする必要はない。　例えば
、本発明に用いるフェニルアラニンデカルボキシラーゼ
（例えば特願昭５９−２６７７４３号）は、ロイシン、
メチオニン、イソロイシンに対してフェニルアラニンよ
りも強い活性を示す。　　しかし、トリプトファンやチ
ロシンに対しては、はとんど作用しない。　　したがっ
て、トリプタミンやチラミンは生成されず、有機溶媒相
に転溶して光吸収乃至蛍光を有する物質は、フェニルア
ラニンから生成されるβ−フェニルエチルアミンのみで
あるので、その光吸収乃至蛍光を測ればよい。　なお、
β−フェニルエチルアミンの場合は、吸光係数が低いの
で、蛍光を測定するほうが好ましい。

また、トリプト７７ンデカルボキシラーゼ（本出願人に
より、本願と同時出願の「芳香族アミノ酸デカルボキシ
ラーゼの製造方法」）は、はとんど芳香族アミノ酸のみ
に作用し、中でもトリプトファンに強く作用する。　　
したがって、トリプトファンの定量に使用できる。　な
お、この場合は、トリプトファンの紫外線吸光係数が大
きいので２８０ｎｍ付近の光吸収を測定することができ
る。　チロシンについても同様である。

本願に係る酵素（芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ）
と試料の反応方法については、いろいろな方法を使用で
きる。

例えば、■単純に試験管内で試料と酵素を混合して反応
させる方法■酵素を予めろ紙、けい藻土、セルロースパ
ウダーなどの不溶性担体や反応に用いる試験管壁に浸透
または吸着させておき、それに試料を接触させて反応さ
せる方法などである。　■の方法は、酵素の安定化、ピ
ペットで酵素を試験管に入れる操作を省くことができる
などの利点がある。　反応時間については、使用する酵
素の比活性が高ければ、それだけ１．定量に要する時間
は短くてよいが、精製コストが高くなる。　また吸着さ
せる担体の表面積が広ければそれだけ有機溶媒相への転
溶時間も短くなるが、反応試験管の大きさ、有機溶媒の
量（分光光度計や蛍光光度計の感度に合わせる）によっ
て調節する必要がある。　反応液をアルカリ性とする手
段は単にカセイソーダ、カセイカリ、アンモニア、ジエ
チルアミンなどの一般強塩基性水溶液を酵素反応後に添
加する方法や有機溶媒に予め塩基性物質を溶解させてお
く方法が実施できる。　後者の場合は、塩基性溶液を反
応液に別途に加える必要はなく操作が簡単になる。　有
機溶媒は、それ自身が被測定アミンと同ヒ光吸収乃至蛍
光をもっていなければよい。

ヘプタン、シクロヘキサンなどのアルカン類、クロロホ
ルム、ベンゼン、トルエン、キシレンなどが使用できる
。　塩基性物質を有機溶媒に予め混合しておく場合には
、塩基性物質が有機溶媒に溶解し、かつ反応液にも即座
に溶解するものでなければならない。　塩基性物質とし
ては、例えばジエチルアミンやジヘキシルアミンが使用
できる。

また、試料を添加し、酵素の反応開始と同時に即座に有
機溶媒を加えれば、有機溶媒が熱伝導の役目を果たし、
恒温を保つのに都合がよい。　そして反応終了後ジエチ
ルアミンやジヘキシルアミンがなどの塩基性物質のみを
添加すればよい。

このように手段としてはいろいろな組合わせが適宜設定
できる。

有機溶媒相の光吸収あるいは蛍光の測定波長は、それぞ
れのアミンによって異なる。　フェニルアラニンの定量
ではもっばら励起波長（Ｅｘ）が２５５ｎｍで蛍光波長
（Ｅｍ）が２７５ｎｍの蛍光測定が微量定量として好ま
しい。　　トリプタミンの場合は、吸光係数が大きいた
め光吸収でも微量定量が可能でその波長は２８０ｎｍ付
近がよい。　蛍光測定も可能でその時はＥｘは２７５ｎ
石でＥｍが３０５ｒｏ＋＋である。　チロシンの場合は
、光吸収波長は２７Ｏｎｍ付近で蛍光測定の場合はＥｘ
が２３５ｎｍ″？Ｅｍは３０５ｎｍである。

酵素によって特異性に若干の相違があるので、酵素の特
異性に合わせて光吸収波長、蛍光波長を適宜選択、ある
いは適当な光波長選択フィルターを用いればよい、　例
えばフェニルアラニンの定量の場合、トリプトファンの
反応生成物であるトリプタミンが有機溶媒相に混入する
とトリプタミンの蛍光強度がβ−フェニルエチルアミン
のそれに比較して約１０倍であるため、β−フェニルエ
チルアミンの値に影響する。

したがって、この場合にはＥＩ１１側に２７５ｎｍの干
渉フィルターを取り付けるとよい。

〔作用および発明の効果〕

本発明は、第４図に示す如ぎ各芳香族アミノ酸デカルボ
キシラーゼによる脱炭酸反応を経由して、生成するβ−
７エ二ルエチルアミン、トリプタミン、チラミンを各々
定量し、これによって基質の各芳香族アミノ酸を定量す
るものである。

一般のアミノ酸デカルボキシラーゼは共役性のＮＡＤま
たはＮＡＤＰ等を必要とせず、反応も不可逆反応である
ので、基質のアミノ酸は、はぼ完全にアミンに変化し、
定量には都合がよい。　生成アミンは各々特有の光吸収
、蛍光を有しているが、それらは基質アミノ酸の光吸収
、蛍光とほぼ同じ波長でおるので、測定に際しては、基
質アミノ酸と生成アミンとの分離が必要となってくる。

　本発明方法においては、この分離を有機溶媒で行う。

　すなわち、アミノ酸は両性電解質であるので、それを
塩基性または酸性にしても有機溶媒に溶解するようには
ならないが、アミンは酸性で水溶性であり、塩基性にす
ると有機溶媒に溶解するようになる。　本発明方法にお
いては、上記の如き作用に基づき、芳香族アミノ酸を芳
香族アミノ酸デカルボキシラーゼで各々のアミンに変化
させた後、反応液を塩基性とし、そこに有機溶媒を加え
てアミンを有機溶媒に転溶せしめ、この有機溶媒相の光
吸収または蛍光の強さを測定することによって、生成ア
ミンの量を測定し、これによって基質の芳香族アミノ酸
の定量を実施することができる。　生成アミンの測定に
おいては、上記有機溶媒相のβ−フェニルエチルアミン
、トリプタミン、チラミンを化学発色させ、その吸光度
を測定し、定量することもできる。

本発明方法によれば、血中に存在する妨害物質、すなわ
ち上記生成アミンと同波長の光吸収主たは同波長の蛍光
を有する両性物質、水溶性物質が有機溶媒相に転溶する
ことかないので、測定誤差を生ヒないという大きな利点
を有する。　また、本発明方法においてはパーオキシダ
ーゼ、ＮＡＤ＊たはＮＡＤＰ、色原体を必要としないの
で、従来方法に比較し、より経済的である。　また、測
定所要時間において、従来の化学法で２時間以上、バイ
オアッセイ法で１６〜１８時間を要したのに対し、本発
明方法によれば、酵素反応時間３０分、転溶時間約１０
秒〜３０分で計１時間以内を要するだけであり、測定時
間の短縮化、効率化を実現できる。

更にまた、本発明方法によれば、試料の除蛋白処理の必
要がなく、使用する試薬も少なくてすむので測定処理操
作が従来化学法に比較して極めて簡略化できる。

〔実施例〕

実施例１゜ 塩基性溶液および有機溶媒を別々に添加するフェニルア
ラニンの定量方法。

試料０．１ａ１１１．：４Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０
）０．０’ｂＩＩＪｌとフェニルアラニンデカルボキシ
ラーゼ（１０ＬＩｎｉｔ／ａｌ）０．０５ＪＩを加え３
５℃で３０分間反応させた後、５Ｎ　ＮａＯＨＯ，０５
−とｎ−へブタンｌｌ１１１を添加し、約１０秒間軽（
振とう、遠心後、有機溶媒相の蛍光（Ｅｘ２５５ｎｍ、
　Ｅｍ２〕５ｎｍ）を測定した。　使用した蛍光光度計
は日立源２０４−３で蛍光セルはミクロセル（１ｄ容）
を用いた。　なお、蛍光光度計のＥｍ側に干渉フィルタ
ーＮ０゜６００１−１７６６（８本真空光学（株）製、
２７５ｎｍ選択）を取り付けた。

上記方法におけるβ−フェニルエチルアミン濃度と有機
溶媒相の蛍光強度との関係、種々濃度のβ−フェニルエ
チルアミンを試料とし、上記フェニルアラニンの定量法
で蛍光強度を測定した。　その結果を第１図に示す。　
第１図からβ・フェニルエチルアミンと蛍光強度の関係
は直線でβ−フェニルエチルアミンは定量的にヘプタン
層に転溶していることが明白である。

実施例２゜ 担体に予め酵素を吸着、乾燥させておき反応後塩基性有
機溶媒を添加するフェニルアラニンの定量法。

正方形に切ったろ紙（２０Ｘ２０ｍｍ）巾Ｓａ＋ｍに折
りたたんだものをｎ−へブタンで洗浄し、それにフェニ
ルアラニンデカルボキシラーゼ水溶液（ＩＬＩｎｉｔ／
枚）を浸透、吸収させ４．５℃で通風乾燥した。　この
ろ紙を試験管に投入し、それに試料０．ＩＪを添加し、
３５℃で３０分間インキュベーション、次いで０．１％
ジエチルアミンを含有するｎ−へブタン１＋Ｉ１１を加
えて室温に３０分間放置後、ｎ−へブタン層の蛍光を測
定した。

使用した機器は実施例１と同じであった。　この方法に
ついて前記実施例１と同様、試料中のβ−フェニルエチ
ルアミンと有機溶媒相の蛍光強度との関係を見た。　そ
の結果を第２図に示した。　この場合もβ−フェニルエ
チルアミンは、はぼ定量的にｎ−へブタン層に転溶して
いることが明白である。

実施例３ トリプトファンデカルボキシラーゼを用いて光吸収法で
トリプトファンを定量する方法。

すなわち試料０．ＩＪにトリプトファンデカルボキシラ
ーゼ（本出願人による本願と同時提出の特許出願「芳香
族アミノ酸デカルボキシラーゼの製造方法」記載の酵素
標品［活性１０ｔｌｎｉｔ／ａ［１］）０．１＋Ｊを加
え３５℃で３０分間反応させる。　次いで、５Ｎ　Ｎａ
０ｔｌ　Ｏ，１−で反応を止めた後、ｎ−へブタン３ｄ
を加え１０秒間軽く振どう後、遠心上澄みの２７５ｎｍ
の光吸収を測定した。　測定は、分光光度計（日立製１
２４型）を使用した。　種々の既知濃度のトリプトファ
ンを含む試料について、光吸収を測定し、標準直線を作
成した。　それを第３図に示した。

実施例４゜ アミノ酸混合液（フェニルアラニンを含む１７種のアミ
ノ酸を各々０．１μｍｏｌｅ／＋Ｊ）を試料として実施
例１の方法でフェニルアラこンを定量した結果、測定値
は０．１００μｍｏｌｅ／Ｔｎｌで理論値と一致した。

実施例５ 正常者の血清に７エニルアラニンを添加し、種々濃度の
７エニルアラニンを含む血清を調製し、それについて実
施例２の方法でフェニルアラニンを測定した。　その結
果を第１表に示す。　理論値と測定値は、はぼ一致した
。

第１表 実施例６ 市販しょう油にトリプトファンを添加し、種々濃度のト
リプトファンを含むしょう油を調製し、それについて実
施例３の方法でトリプトファンを測定した。　　その結
果を第２表に示す。この場合も理論値と測定値はほぼ一
致した。

第２表

【図面の簡単な説明】

第１図は、塩基性溶液および有機溶媒を別々に添加する
方法において試料のβ−フェニルエチルアミン濃度と有
機溶媒相の蛍光強度との関係をあられしたものである。 第２図は、ろ紙に酵素を吸着、乾燥させたものを使用酵
素とし、反応後塩基性有機溶媒を添加する方法において
試料のβ−フェニルエチルアミン濃度と有機溶媒相の蛍
光強度との関係をあられしたものである。 第３図は、塩基性溶液および有機溶媒を別々に添加する
方法において試料トリプタミン濃度と有機溶媒相の光吸
収との関係をあられしたものである。 第４図は、本発明方法における芳香族アミノ酸デカルボ
キシラーゼの脱炭酸反応３種（１）〜（３）を示す。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼを、芳香族ア
   ミノ酸を含有する試料に作用させ、生成するアミン類を
   有機溶媒に転溶させ、次いで、該アミン類の光吸収度、
   蛍光強度、または化学発色による発色度を測定すること
   によって試料中の芳香族アミノ酸を定量することを特徴
   とする芳香族アミノ酸の定量法。
2. （２）芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼをろ紙、けい
   藻土等の担体に吸着させ、該担体の表面部または内部に
   おいて酵素反応を行なわせる特許請求の範囲第１項記載
   の芳香族アミノ酸の定量法。
3. （３）生成するアミン類を転溶させる有機溶媒が、塩基
   性物質を含む有機溶媒である特許請求の範囲第１項記載
   の芳香族アミノ酸の定量法。