KR102020253B1 - 산화 환원 지시약의 색조 변화를 측정하는 방법 - Google Patents

산화 환원 지시약의 색조 변화를 측정하는 방법 Download PDF

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Abstract

우식원성균수의 측정 등에 이용할 수 있는 산화 환원 지시약의 색조 변화를 측정하는 수단을 제공한다. 산화 환원 지시약의 색조 변화를 측정하는 방법으로서, 검사 시약과 피검 시료를 반응시켜서 색조의 변화를 측정하는 것을 포함하고, 상기 검사 시약이 산화 환원 지시약, 산화 환원 반응 촉진제, 및 할로겐의 염을 포함하는 방법에 의해 산화 환원 지시약의 색조 변화를 측정한다.

Description

산화 환원 지시약의 색조 변화를 측정하는 방법{METHOD FOR DETERMINING COLOR CHANGE IN OXIDATION-REDUCTION INDICATOR}
본 발명은 우식원성균수의 측정 등에 이용할 수 있는 산화 환원 지시약의 색조 변화를 측정하는 방법, 및 그것을 위해서 사용되는 시험편에 관한 것이다.
구강 내에는 다종의 세균이 존재하지만, 그 중에서도 우식을 야기하는 것을 우식원성균이라고 한다. 예를 들면, 타액 중의 우식원성균수가 높으면 우식 리스크, 즉 구강이 어느 정도 충치로 이환(罹患)하기 쉬운 상태에 있는지를 나타내는 리스크가 높다고 생각된다. 우식원성균의 검출법으로서는 산화 환원 지시약인 레자주린을 사용한 검출법(특허문헌 1, 2)이나, NADH 등의 환원력에 의거하는 화학 발광을 이용한 검출법(특허문헌 3) 등이 이미 알려져 있다.
레자주린은 통상은 산화형의 청색 색소인 레자주린(극대 흡수 파장 605㎚)으로서 존재하지만, 세균의 대사에 의해 발생하는 NADH나 NADPH(이후, 이것들을 총칭해서 「NAD(P)H」라고 기재하는 경우가 있음)에 의해 환원되어 적자색 색소(극대 흡수 파장 573㎚)인 레조루핀으로 변환된다. 또한, 레조루핀은 NAD(P)H에 의해 더욱 환원되어 무색의 하이드로레자주린으로 변환된다. 따라서, 레자주린의 색조 변화에 의거하여 피검 시료 중의 세균, 주로 우식원성균을 포함하는 그램 양성균의 균수를 측정할 수 있다. 레자주린을 이용한 우식원성균수의 측정 시스템으로서는 RD 테스트 「쇼와」(상품명, 쇼와야쿠힌카코 가부시키가이샤 제)나 CAT21 패스트(상품명, 윌덴트사 제)가 알려져 있다.
1-메톡시-5-메틸페나지늄메틸설페이트(1-메톡시 PMS), 페나지늄메틸설페이트(PMS), 페나진에토설페이트(PES) 등의 전자 캐리어는, 예를 들면 테트라졸륨염을 정색 시약으로서 사용하는 반응계에 있어서 테트라졸륨염의 산화 환원 반응의 메디에이터(mediator)로서 이용되고 있다. 또한, PMS는 레자주린을 산화 환원 지시약으로서 이용하는 반응계에 있어서 메디에이터로서 이용할 수 있다고 되어 있지만(특허문헌 4), 메디에이터로서는 PMS보다 디아포라아제가 바람직하다고 되어 있다(특허문헌 4).
그러나, 이러한 산화 환원 지시약이나 메디에이터를 이용하는 반응계에 있어서, 염화나트륨이나 염화칼륨 등의 염을 더 이용하는 것은 알려져 있지 않다.
일본 특허 공개 소 58-225029호 공보 일본 특허 공개 2004-093335호 공보 일본 특허 공개 평 10-210998호 공보 일본 특허 공개 소 62-239999호 공보
상술한 종래의 우식원성균수의 측정 시스템에서는 32℃∼37℃의 온도 조절과 15∼20분의 반응 시간이 필요하고, 치과 의원 등에서의 단시간에서의 우식원성균수의 측정은 불가능했다. 또한, 온도 조절을 행하지 않을 경우 반응 소요 시간이 더욱 증대된다고 하는 문제가 있었다. 즉, 종래의 우식원성균수의 측정법에 있어서는 반응 온도나 소요 시간이라고 하는 점에서 개선의 여지가 있었다. 본 발명은 우식원성균수의 측정 등에 이용할 수 있는 산화 환원 지시약의 색조 변화를 측정하는 신규의 수단을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은 예의 검토한 결과, 레자주린을 정색지시약으로서 포함하는 검사 시약을 사용한 우식원성균수의 측정 방법에 있어서, 검사 시약의 성분으로서 1-메톡시-5-메틸페나지늄메틸설페이트(1-메톡시 PMS)를 첨가함으로써 정색 반응성이 향상되는 것을 발견했다. 본 발명자는 검사 시약의 성분으로서 염화나트륨, 염화칼륨, 브롬화나트륨 또는 브롬화칼륨을 더 첨가함으로써 정색 반응성이 더욱 향상되는 것을 발견하여 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 이하와 같이 예시할 수 있다.
[1]
산화 환원 지시약의 색조 변화를 측정하는 방법으로서,
검사 시약과 피검 시료를 반응시켜서 색조의 변화를 측정하는 것을 포함하고,
상기 검사 시약이 산화 환원 지시약, 산화 환원 반응 촉진제, 및 할로겐의 염을 포함하는 방법.
[2]
피검 시료 중의 우식원성균수를 측정하는 방법인 [1]에 기재된 방법.
[3]
상기 산화 환원 지시약이 레자주린인 [1] 또는 [2]에 기재된 방법.
[4]
상기 산화 환원 반응 촉진제가 1-메톡시-5-메틸페나지늄메틸설페이트, 페나지늄메틸설페이트 또는 페나진에토설페이트인 [1]∼[3] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[5]
상기 할로겐의 염이 염화나트륨, 염화칼륨, 브롬화나트륨 또는 브롬화칼륨인 [1]∼[4] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[6]
지지 담체와, 그 지지 담체에 담지되는 흡수성 담체를 구비하는 시험편으로서, 상기 흡수성 담체가 상기 검사 시약을 유지하는 시험편을 이용하여 측정이 행해지는 [1]∼[5] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[7]
산화 환원 지시약, 산화 환원 반응 촉진제, 및 할로겐의 염을 포함하는 NADH 및 NADPH의 측정 시약.
[8]
상기 산화 환원 지시약이 레자주린인 [7]에 기재된 시약.
[9]
상기 산화 환원 반응 촉진제가 1-메톡시-5-메틸페나지늄메틸설페이트, 페나지늄메틸설페이트 또는 페나진에토설페이트인 [7] 또는 [8]에 기재된 시약.
[10]
상기 할로겐의 염이 염화나트륨, 염화칼륨, 브롬화나트륨 또는 브롬화칼륨인 [7]∼[9] 중 어느 하나에 기재된 시약.
[11]
지지 담체와, 그 지지 담체에 담지되는 흡수성 담체를 구비하는 NADH 및 NADPH의 측정에 사용하기 위한 시험편으로서,
상기 흡수성 담체가 [7]∼[10] 중 어느 하나에 기재된 시약을 유지하는 시험편.
[12]
우식원성균수의 측정에 사용하기 위한 시험편인 [11]에 기재된 시험편.
(발명의 효과)
본 발명에 의해, 산화 환원 지시약의 색조 변화를 명료하게 측정할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의해 실온 하에서 단시간에 우식원성균수를 측정할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의하면 치과 의원 등의 임상 현장에 있어서 항온 장치 등의 설비 없이 다수의 검체를 단시간에 처리할 수 있고, 간편하고 또한 신속한 우식원성균수의 검사가 가능해진다.
도 1(A)는 본 발명의 시험편의 일실시형태를 나타내는 평면도이며, 도 1(B)는 본 발명의 시험편의 일실시형태를 나타내는 정면도이다.
도 2는 각 검토 성분이 반응 개시 1분 후∼5분 후의 반사율 변화(Δ4분 반사율)에 부여하는 효과를 나타내는 도면이다.
도 3은 각 검토 성분이 베이스 반사율에 부여하는 효과를 나타내는 도면이다.
도 4는 각 검토 성분이 Δ4분 반사율에 부여하는 효과를 나타내는 도면이다.
도 5는 1-메톡시 PMS 농도가 0.4mM일 경우의, 염을 첨가했을 경우와 첨가하지 않을 경우에 있어서의 토출액 중 우식원성균수와 Δ4분 반사율의 상관을 나타내는 도면이다.
도 6은 1-메톡시 PMS 농도가 0.5mM일 경우의, 염을 첨가했을 경우와 첨가하지 않을 경우에 있어서의 토출액 중 우식원성균수와 Δ4분 반사율의 상관을 나타내는 도면이다.
도 7은 1-메톡시 PMS 농도가 0.6mM일 경우의, 염을 첨가했을 경우와 첨가하지 않을 경우에 있어서의 토출액 중 우식원성균수와 Δ4분 반사율의 상관을 나타내는 도면이다.
도 8은 각종 염류가 Δ4분 반사율에 부여하는 효과를 나타내는 도면이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 방법은 산화 환원 지시약, 산화 환원 반응 촉진제, 및 할로겐의 염을 이용하는 것을 특징으로 하는 산화 환원 지시약의 정색을 측정하는 방법이다.
즉, 본 발명의 방법은 산화 환원 지시약의 색조 변화를 측정하는 방법으로서, 검사 시약과 피검 시료를 반응시켜서 색조의 변화를 측정하는 것을 포함하고, 상기 검사 시약이 산화 환원 지시약, 산화 환원 반응 촉진제, 및 할로겐의 염을 포함하는 방법이다.
본 발명의 방법에 있어서, 산화 환원 지시약은 NAD(P)H를 전자 공여체로 하는 산화 환원 반응에 의해 정색하는 지시약이다. 따라서, 상기 검사 시약은 NAD(P)H의 측정 시약으로서 이용할 수 있다.
마찬가지로, 본 발명의 방법은 피검 시료에 포함되는 NAD(P)H 및/또는 반응계에 있어서 생성되는 NAD(P)H의 검출에 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해, 예를 들면 피검 시료에 포함되는 세균의 대사에 의해 생성되는 NAD(P)H를 검출할 수 있고, 그것에 의해 피검 시료에 포함되는 세균을 검출할 수 있다. 그러한 세균으로서, 구체적으로는 예를 들면 우식원성균을 들 수 있다.
즉, 본 발명의 방법의 일형태는 피검 시료 중의 우식원성균수를 측정하는 방법으로서, 검사 시약과 피검 시료를 반응시켜서 색조의 변화를 측정하는 것을 포함하고, 상기 검사 시약이 산화 환원 지시약, 산화 환원 반응 촉진제, 및 할로겐의 염을 포함하는 방법이다. 이하, 우식원성균수를 측정하는 방법을 예시하여 본 발명의 방법을 설명한다. 또한, 이하 산화 환원 지시약, 산화 환원 반응 촉진제, 및 할로겐의 염을 총칭해서 「유효 성분」이라고 하는 경우가 있다.
본 발명에 있어서, 우식원성균이란 우식을 야기하는 원인이 될 수 있는 균을 말한다. 우식원성균으로서는, 구체적으로는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 및 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sobrinus) 등을 들 수 있다. 우식원성균수가 많을수록 우식 리스크, 즉 충치로 이환될 리스크가 높아진다고 생각된다.
본 발명에 있어서, 우식원성균수의 측정을 행하는 피검 시료는 특별하게 한정되지 않는다. 예를 들면, 우식원성균수의 측정을 행하는 피검 시료로서는 구강으로부터 얻어지는 피검 시료를 들 수 있다. 구강으로부터 얻어지는 피검 시료로서는, 예를 들면 안정시 타액(비자극 타액), 자극 타액, 구강 세척 토출액을 들 수 있다. 자극 타액으로서는 껌으로 자극해서 채취한 타액을 들 수 있다. 이들 중에서는 구강 세척 토출액이 바람직하다. 구강 세척 토출액은, 예를 들면 정제수를 입에 머금었다가 토해냄으로써 얻어진다. 구체적으로는, 예를 들면 3mL의 정제수를 10초간 입에 머금었다가 용기에 토해내면 된다. 정제수의 용량이나, 입에 머금는 시간은 필요에 의해 적당하게 변경할 수 있다. 얻어진 피검 시료는 특단의 전처리 없이 이후의 조작에 이용할 수 있지만, 필요에 따라서 적당하게 희석 등의 추가 조작을 행해도 좋다. 또한, 우식원성균수의 측정을 행하는 피검 시료로서는 우식원성균의 배양액 등의 우식원성균을 포함하는 시료를 들 수 있다. 우식원성균의 배양액은, 예를 들면 ATCC 등의 생물 자원 뱅크로부터 입수할 수 있는 단리(單離)된 우식원성균주의 배양액이라도 좋다.
본 발명에 있어서, 검사 시약은 산화 환원 지시약을 포함한다. 본 발명에 있어서, 산화 환원 지시약이란 NAD(P)H를 전자 공여체로 하는 산화 환원 반응에 의해 정색하는 지시약이면 특별하게 한정되지 않는다. NAD(P)H는 세균의 대사에 의해 생성된다. 즉, 피검 시료 중의 세균, 주로 우식원성균을 포함하는 그램 양성균의 생균수에 따라서 산화 환원 지시약의 환원이 진행된다. 따라서, 산화 환원 지시약의 환원에 의한 색조의 변화는 우식원성균수를 반영한다. 또한, 「NAD(P)H를 전자 공여체로 한다」란 직접 NAD(P)H에 의해 환원되어도 좋고, NAD(P)H에 의해 환원되는 다른 물질(mediator)을 통해서 간접적으로 환원되어도 좋다. 산화 환원 지시약으로서는, 구체적으로는 예를 들면 레자주린, 테트라졸륨염, 메틸렌 블루, 및 크실렌 블루를 들 수 있다. 이들 중에서는 레자주린이 바람직하다. 이것들은 단독으로 포함되어 있어도 좋고, 임의의 조합으로 포함되어 있어도 좋다.
레자주린은 통상은 산화형의 청색 색소인 레자주린(극대 흡수 파장 605㎚)으로서 존재하지만, NAD(P)H에 의해 환원되어 적자색 색소(극대 흡수 파장 573㎚)인 레조루핀으로 변환된다. 또한, 레조루핀은 NAD(P)H에 의해 더욱 환원되어 무색의 하이드로레자주린으로 변환된다.
테트라졸륨염은 NAD(P)H에 의해 환원되어 포르마잔 색소로 변환된다. 테트라졸륨염으로서 구체적으로는, 예를 들면 MTT(3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브로마이드), XTT(2,3-비스-(2-메톡시-4-니트로-5-술포페닐)-2H-테트라졸륨-5-카르복사닐라이드), MTS(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카복시메톡시페닐)-2-(4-술포페닐)-2H-테트라졸륨), WST-1(2-(4-요오드페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨), 및 WST-8(2-(2-메톡시-4-니트로페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨)을 들 수 있다. 이들 중에서는 WST-1 또는 WST-8이 바람직하다.
또한, 산화 환원 지시약의 흡수 스펙트럼은 지시약마다 다르기 때문에, 정색 반응의 검출 조건은 사용하는 산화 환원 지시약에 따라서 적당하게 설정하면 좋다.
본 발명의 방법에 있어서, 산화 환원 지시약의 농도는 피검 시료 중의 우식원성균수에 따라서 정색 반응이 진행되는 한 특별하게 한정되지 않고, 사용하는 산화 환원 지시약의 종류나 그 밖의 성분 등의 여러 가지 조건에 따라서 적당하게 설정할 수 있다. 예를 들면, 시험편을 이용하여 우식원성균수의 측정을 행할 경우에는 시험편의 제작에 사용하는 시약 함침액 중의 산화 환원 지시약의 농도는 바람직하게는 0.01∼1mM, 보다 바람직하게는 0.05∼0.3mM, 더욱 바람직하게는 0.1∼0.16mM이다.
본 발명에 있어서, 검사 시약은 산화 환원 반응 촉진제를 포함한다. 본 발명에 있어서, 산화 환원 반응 촉진제란 산화 환원 반응에 의한 산화 환원 지시약의 정색 반응을 촉진하는 화합물이면 특별하게 한정되지 않는다. 산화 환원 반응 촉진제로서는, 예를 들면 NAD(P)H에 의해 환원되어서 환원형으로 되고, 다른 물질을 환원하는 기능을 갖는 화합물을 들 수 있다. 환원형의 산화 환원 반응 촉진제에 의해 환원되는 다른 물질로서는 산화 환원 지시약을 들 수 있다. 산화 환원 반응 촉진제로서, 구체적으로는 예를 들면 1-메톡시-5-메틸페나지늄메틸설페이트(1-메톡시 PMS), 페나지늄메틸설페이트(PMS), 페나진에토설페이트(PES)를 들 수 있다. 이들 중에서는 1-메톡시 PMS가 바람직하다. 이들은 단독으로 포함되어 있어도 좋고, 임의의 조합으로 포함되어 있어도 좋다.
본 발명의 방법에 있어서, 산화 환원 반응 촉진제의 농도는 피검 시료 중의 우식원성균수에 따라서 정색 반응이 진행되는 한 특별하게 한정되지 않고, 사용하는 산화 환원 반응 촉진제의 종류나 그 밖의 성분 등의 여러 가지 조건에 따라서 적당하게 설정할 수 있다. 예를 들면, 시약 함침액 중의 산화 환원 반응 촉진제의 농도는 바람직하게는 0.01∼5mM이고, 보다 바람직하게는 0.05∼1mM이며, 더욱 바람직하게는 0.1∼0.6mM이다.
본 발명에 있어서, 검사 시약은 할로겐의 염을 포함한다. 본 발명에 있어서, 할로겐의 염이란 할로겐 이온과 임의의 양이온이 이온 결합한 염을 말한다. 할로겐의 염으로서는, 예를 들면 불화물염, 염화물염, 브롬화물염, 요오드화물염을 들 수 있다. 할로겐의 염으로서는 염화물염 또는 브롬화물염이 바람직하고, 염화물염이 보다 바람직하다. 또한, 할로겐의 염으로서는 할로겐과 알칼리 금속의 염이 바람직하다. 알칼리 금속으로서는 나트륨 또는 칼륨이 바람직하다. 할로겐의 염으로서, 구체적으로는 염화나트륨, 염화칼륨, 브롬화나트륨 또는 브롬화칼륨이 바람직하게 사용된다. 이들은 단독으로 포함되어 있어도 좋고, 임의의 조합으로 포함되어 있어도 좋다.
본 발명의 방법에 있어서, 할로겐의 염의 농도는 피검 시료 중의 우식원성균수에 따라서 정색 반응이 진행되는 한 특별하게 한정되지 않고, 사용하는 할로겐의 염의 종류나 그 밖의 성분 등의 여러 가지 조건에 따라서 적당하게 설정할 수 있다. 예를 들면, 시약 함침액 중의 할로겐의 염의 농도는 바람직하게는 1∼1000mM, 보다 바람직하게는 5∼500mM, 특히 바람직하게는 50∼200mM이다.
할로겐의 염이 포함됨으로써, 예를 들면 정색 반응의 백그라운드의 저하를 기대할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 산화 환원 지시약이 레자주린이며, 산화 환원 반응 촉진제가 1-메톡시 PMS일 경우, 레자주린을 단독으로 사용할 경우와 비교해서 레자주린과 1-메톡시 PMS를 혼합해서 사용할 경우에는 레자주린의 청색이 적색측으로 시프트하지만, 할로겐의 염을 더 첨가함으로써 레자주린의 색조를 청색측으로 되돌릴 수 있다. 상술한 바와 같이, 레자주린(청색)은 NAD(P)H에 의해 레조루핀(적자색)으로 환원되기 때문에 레자주린의 청색이 적색측으로 시프트되는 것은 정색 반응의 백그라운드의 증대를 의미하고, 또한 색조의 변화 가능한 범위가 상기 시프트만큼 제한되는 것을 의미한다. 따라서, 할로겐의 염에 의해 레자주린의 색조가 청색측으로 되돌아오는 것은 정색 반응의 백그라운드의 저하를 의미하고, 또한 색조의 변화 가능한 범위를 확장할 수 있는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 방법에 있어서는 할로겐의 염이 포함됨으로써, 할로겐의 염이 포함되지 않을 경우와 비교해서 색조 변화를 명료하게 측정할 수 있다. 따라서, 할로겐의 염은 색조 변화에 의거하는 우식원성균수의 측정에 효과적이다.
또한, 피검 시료 중의 우식원성균수에 따라서 정색 반응이 진행되는 한 검사 시약은 그 밖의 성분을 포함하고 있어도 좋다.
검사 시약은, 예를 들면 탄소원을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 탄소원은 우식원성균의 대사를 활성화할 수 있도록, 우식원성균이 자화(資化) 가능한 것이 바람직하다. 탄소원으로서는 당류나 유기산을 들 수 있고, 당류가 바람직하다. 당류로서, 구체적으로는 수크로오스나 글루코오스를 들 수 있고, 특히 수크로오스가 바람직하다. 탄소원이 포함될 경우, 시약 함침액에 있어서의 탄소원의 농도는 1∼1000mM, 보다 바람직하게는 5∼500mM, 특히 바람직하게는 20∼250mM이다.
또한, 검사 시약은 예를 들면 pH 완충제를 포함하고 있어도 좋다. pH 완충제로서, 구체적으로는 예를 들면 인산 버퍼, HEPES 버퍼, PIPES 버퍼, MES 버퍼, Tris 버퍼, GTA 광역 버퍼를 들 수 있다. pH 완충제가 포함될 경우, 시약 함침액에 있어서의 pH 완충제의 농도는 바람직하게는 10∼1000mM, 보다 바람직하게는 20∼500mM, 특히 바람직하게는 50∼150mM이다. 반응액의 pH는, 예를 들면 통상 pH 4.0∼9.0이며, 바람직하게는 5.5∼8.0이다.
또한, 검사 시약은 예를 들면 바인더를 포함하고 있어도 좋다. 바인더로서, 구체적으로는 예를 들면 폴리비닐알콜(PVA), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 카복시메틸셀룰로오스를 들 수 있다. 바인더가 포함될 경우, 시약 함침액에 있어서의 바인더의 농도는 바람직하게는 0.01∼5%, 보다 바람직하게는 0.05∼3%, 더욱 바람직하게는 0.1∼1%이다. 또한, 본 발명에 있어서 바인더의 농도의 「%」는 특별히 기재하지 않는 한 w/v%를 의미한다.
또한, 검사 시약은 예를 들면 우식원성균 이외의 대사를 저해하는 약제를 포함하고 있어도 좋다. 그러한 약제로서 구체적으로는, 예를 들면 바시트라신 등의 우식원성균 이외의 세균의 증식 억제에 이용되는 약제나, 아텔루르산 칼륨 등의 그램 음성균의 증식을 억제하는 약제를 들 수 있다.
이들 성분은 모두 각각 단독으로 포함되어 있어도 좋고, 임의의 조합으로 포함되어 있어도 좋다.
본 발명의 방법은 시험편을 이용하여 실시할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 시험편(이하, 본 발명의 시험편이라고도 함)은 산화 환원 지시약, 산화 환원 반응 촉진제, 및 할로겐의 염을 포함하는 검사 시약을 유지하는 시험편이다. 본 발명의 시험편은 NAD(P)H의 측정에 사용하기 위한 시험편이면 좋고, 그 일형태는 우식원성균수의 측정에 사용하기 위한 시험편이다. 이하, 우식원성균수의 측정에 사용하기 위한 시험편을 예시하여 본 발명의 시험편을 설명한다.
본 발명의 시험편은 바람직하게는 지지 담체와, 상기 지지 담체에 담지되는 흡수성 담체를 구비하고, 상기 흡수성 담체가 검사 시약을 유지한다. 검사 시약을 유지하는 흡수성 담체 부분에 피검 시료를 점착함으로써, 피검 시료 중의 우식원성균수에 따라서 정색 반응이 진행된다. 도 1에는 지지 담체(10)와, 지지 담체(10)에 담지되는 흡수성 담체(11)를 구비하는 본 발명의 시험편의 일실시형태인 시험편(1)을 예시한다. 도 1(A)는 시험편(1)의 평면도이며, 도 1(B)는 시험편(1)의 정면도이다.
흡수성 담체로서는 검사 시약을 유지할 수 있고, 또한 산화 환원 지시약의 환원에 의거하는 색조 변화의 측정이 가능한 한에 있어서 어떠한 담체라도 사용할 수 있다. 즉, 흡수성 담체로서는 예를 들면 종이, 셀룰로오스, 다공질 세라믹, 화학 섬유, 합성 수지제 직포, 및 부직포를 들 수 있고, 여과지 또는 유리 섬유 여과지인 것이 바람직하다. 여과지 또는 유리 섬유 여과지로서는, 예를 들면 시판하는 것을 적합하게 사용할 수 있다.
지지 담체로서는 필름, 시트 또는 플레이트 등의 평면 형상 담체를 바람직하게 사용할 수 있다. 지지 담체는 플라스틱제나 종이제라도 좋다. 플라스틱으로서는, 예를 들면 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 및 폴리염화비닐 등 여러 가지 플라스틱을 사용할 수 있다. 지지 담체로서는, 예를 들면 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET)제 담체가 바람직하다. 또한, 지지 담체는 복합재라도 좋고, 폴리에스테르와 폴리에틸렌의 복합재나 폴리에틸렌과 알루미늄을 적층한 복합재, 기타 여러 가지 복합재를 이용할 수 있다. 지지 담체의 두께는 10∼500㎛인 것이 바람직하고, 50∼300㎛인 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 시험편에 있어서, 우식원성균수 측정용 검사 시약을 유지하는 흡수성 담체는 적어도 1개 구비되어 있으면 좋고, 2개 또는 그 이상 구비되어 있어도 좋다.
또한, 본 발명의 시험편은 우식원성균수 측정용 검사 시약을 유지하는 흡수성 담체에 추가해서 우식원성균수 이외의 파라미터 측정용 흡수성 담체를 구비하고 있어도 좋다. 또한, 본 발명의 시험편은 우식원성균 등의 파라미터 측정용 흡수성 담체에 추가해서 임의의 시험지, 예를 들면 파라미터의 측정에는 사용되지 않는 더미의 흡수성 담체를 구비하고 있어도 좋다. 본 발명의 시험편이 복수의 흡수성 담체를 구비할 경우, 각 흡수성 담체는 사용되는 검출 기기의 종류 등에 따라서 적당하게 배열하면 좋다. 검출 기기로서는 여러 가지 반사율 측정 기기를 적합하게 사용할 수 있지만, 예를 들면 검출 기기로서 포켓켐 UA PU-4010(아크레이 가부시키가이샤 제)을 사용할 경우에는 각 흡수성 담체는 지지 담체 상에 직선 형상으로 정렬되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 시험편을 제조하는 방법은 특별하게 한정되지 않고, 본 발명의 시험편은 예를 들면 검사 시약을 미리 유지시킨 흡수성 담체를 지지 담체에 담지시킴으로써 제조할 수 있다. 시약을 흡수성 담체에 유지시키는 방법은 특별하게 한정되지 않고, 예를 들면 흡수성 담체를 시약 용액에 침지해도 좋고, 흡수성 담체에 시약 용액을 점착 또는 도포해도 좋다. 상기 중, 흡수성 담체를 시약 용액에 침지하는 것이 바람직하다. 또한, 시약 용액이란 검사 시약을 함유하는 용액이다. 시약을 흡수성 담체에 유지시키는 공정은 복수회의 침지 내지 점착 또는 도포 등의 공정을 포함하고 있어도 좋다. 시약을 유지시킨 흡수성 담체는 건조시켜서 이후의 공정에 사용할 수 있다. 시약을 유지시킨 흡수성 담체를 필요에 따라서 절단하고, 지지 담체에 담지시킴으로써 본 발명의 시험편을 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 시험편은 예를 들면 지지 담체에 미리 담지시킨 흡수성 담체에 검사 시약을 유지시킴으로써 제조되어도 좋다. 이 경우에는 흡수성 담체에 시약 용액을 점착 또는 도포함으로써 시약을 흡수성 담체에 유지시키고, 그 후 건조시키는 것이 바람직하다. 본 발명의 시험편에 있어서, 흡수성 담체를 지지 담체에 담지시키는 방법은 특별하게 제한되지 않고, 예를 들면 통상 사용되는 접착 방법을 적합하게 사용할 수 있다. 예를 들면, 점착 테이프에 의해 부착해도 좋고, 접착제에 의해 부착해도 좋다.
본 발명의 방법에 의하면, 온도 조절을 행하지 않고 우식원성균수의 측정이 가능하다. 즉, 반응 온도는 실온이면 좋다. 구체적으로는, 예를 들면 반응 온도는 통상 15℃∼37℃이며, 15℃∼30℃라도 좋다. 또한, 본 발명의 방법에 있어서는 적당하게 온도 조절을 행해도 좋다.
본 발명의 방법에 있어서, 반응 시간은 반응 온도나 시약 성분 등의 여러 가지 조건에 따라서 적당하게 설정할 수 있다. 반응 시간은, 예를 들면 통상 1∼10분이다. 예를 들면, 반응 시간은 5분이라도 좋다.
본 발명의 방법에 있어서는 측정된 색조의 변화에 의거하여 우식원성균수를 측정할 수 있다. 또한, 「우식원성균수를 측정한다」란 피검 시료 중의 우식원성균수의 값 자체를 산출하는 것에 한정되지 않고, 피검 시료 중의 우식원성균수의 정도를 적어도 2단계, 바람직하게는 3 또는 그 이상의 단계로 구분해서 판정하는 것이라도 좋다. 구체적으로는, 예를 들면 피검 시료 중의 우식원성균수가 「적음」, 「중간 정도」 또는 「많음」의 3단계 중 어디에 해당하는지를 판정하면 좋다. 복수 단계로 구분할 경우의 구체적인 균수는 임상 데이터나, 사용하는 피검 시료의 형태에 따라서 적당하게 설정하면 좋다. 일례를 들면, 3mL의 정제수로 10초간 구강 세척함으로써 얻어지는 구강 세척 토출액 중의 우식원성균수로서 106CFU/mL 미만인 경우에 「적음」, 106CFU/mL 이상이고 107CFU/mL 미만인 경우에 「중간 정도」, 107CFU/mL 이상인 경우에 「많음」이라고 판정해도 좋다.
본 발명의 방법에 의해 측정된 색조의 변화, 우식원성균수의 값, 또는 우식원성균수의 정도는 피검 시료를 채취한 피검자의 우식 리스크의 판정에 이용해도 좋다. 예를 들면, 색조의 변화, 우식원성균수의 값, 또는 우식원성균수의 정도에 의거하여 피검 시료를 채취한 피검자의 우식 리스크를 적어도 2단계, 바람직하게는 3 또는 그 이상의 단계로 구분해서 판정해도 좋다. 구체적으로는, 예를 들면 피검 시료를 채취한 피검자의 우식 리스크가 「낮음」, 「중간 정도」 또는 「높음」의 3단계 중 어디에 해당하는지를 판정하면 좋다. 본 발명의 방법에 있어서는 그렇게 우식 리스크를 판정하는 것도 「우식원성균수를 측정하는」 것의 일형태인 것으로 한다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 측정된 색조의 변화, 우식원성균수의 값, 또는 우식원성균수의 정도는 단독으로 우식 리스크의 판정에 이용되어도 좋고, 그 밖의 파라미터와 조합시켜서 이용되어도 좋다.
색조의 변화에 의거하는 우식원성균수의 측정은 균수가 기지의 우식원성균 표준 시료를 이용하여 우식원성균수와 색조 변화의 상관 데이터를 취득하고, 상기 상관 데이터를 이용해서 행하면 좋다. 상관 데이터란, 예를 들면 검량선이다. 또한, 우식 리스크의 판정을 행할 경우에는 우식 리스크를 더 포함시킨 상관 데이터를 설정해서 이용하면 좋다.
본 발명의 방법에 있어서, 색조의 변화란 산화 환원 지시약의 환원에 의거하는 특정 파장에 있어서의 흡광도의 증감 및/또는 극대 흡수 파장의 시프트를 말한다. 즉, 본 발명의 방법에 있어서는 산화 환원 지시약의 일부 또는 전부가 환원됨으로써 환원된 산화 환원 지시약의 양 및/또는 비율에 따라서, 특정 파장에 있어서의 흡광도의 증감 및/또는 극대 흡수 파장의 시프트가 발생한다.
본 발명의 방법에 있어서, 색조의 변화는 광학적인 검출 기기에 의해 측정할 수 있다. 색조의 변화는 특정 파장에 있어서의 흡광도의 증감으로서 측정되는 것이 바람직하다.
특정 파장에 있어서의 흡광도의 증감은, 통상 상기 특정 파장의 광을 정색 부위, 즉 피검 시료를 점착한 흡수성 담체 부분에 조사하고, 해당 특정 파장에 있어서의 일정 시간의 경과에 의한 반사율의 변화값을 취득함으로써 측정할 수 있다. 특정 파장에 있어서의 흡광도의 증가는 상기 특정 파장에 있어서의 반사율의 감소로서 측정할 수 있다. 특정 파장에 있어서의 흡광도의 감소는 상기 특정 파장에 있어서의 반사율의 증가로서 측정할 수 있다. 일정 시간이란 피검 시료의 점착 직후로부터 임의의 시간이 경과할 때까지라도 좋고, 피검 시료의 점착 후의 어느 시점으로부터 더욱 임의의 시간이 경과할 때까지라도 좋다. 일정 시간의 길이는 반응 시간 등의 여러 가지 조건에 따라서 적당하게 설정할 수 있지만, 예를 들면 통상 1∼10분이며, 2∼8분이라도 좋다. 피검 시료의 점착 후의 어느 시점이란 반응 시간 등의 여러 가지 조건에 따라서 적당하게 설정할 수 있지만, 예를 들면 피검 시료의 점착의 5초 후∼3분 후인 것이 바람직하고, 10초 후∼2분 후인 것이 보다 바람직하다. 구체적으로는, 예를 들면 반응 시간을 5분으로 하고 반응 개시 후 1분∼5분까지의 4분간에 있어서의 반사율 변화를 측정해도 좋다. 반사율의 변화값은 반사율을 적어도 2회 측정하고, 측정값의 차이로서 산출할 수 있다. 반사율은 3 또는 그 이상의 횟수 측정되어도 좋다. 일정 시간의 경과에 의한 반사율의 변화값은 복수 회 측정된 반사율에 의거하여 반사율의 변화 속도로서 산출되어도 좋다.
또한, 피검 시료의 점착 직후 또는 피검 시료의 점착 후의 어느 시점에서의 반사율을 측정할 필요가 없을 경우에는 반사율의 측정 횟수를 저감시킬 수 있다. 예를 들면, 피검 시료의 점착 직후 또는 피검 시료의 점착 후의 어느 시점에서의 반사율을 피검 시료 중의 우식원성균수에 상관없이 일정한 값이라고 가정했을 경우에는, 그것으로부터 임의의 시간이 경과한 시점에서 1회만 반사율의 측정을 행하여 측정값과 상기 일정한 값의 차로서 반사율의 변화값을 산출하는 것도 가능하다. 상기 일정한 값은 반사율의 변화값을 산출할 때에 결정되어 있으면 좋다. 또한, 피검 시료의 점착 직후 또는 피검 시료의 점착 후의 어느 시점에서의 반사율을 피검 시료 중의 우식원성균수에 상관없이 일정한 값이라고 가정했을 경우에는, 그것으로부터 임의의 시간이 경과한 시점에서의 반사율과 우식원성균수의 상관 데이터를 이용함으로써 반사율의 변화값 자체를 산출하지 않고 우식원성균수를 측정하는 것도 가능하다. 이렇게 반사율의 변화값 자체는 산출되지 않고 우식원성균수가 측정될 경우에는, 반사율을 측정하는 것 자체를 「흡광도의 증감을 측정하는」 것으로 간주해도 좋고, 또한 본 발명의 방법에 있어서의 「색조의 변화를 측정하는」 것으로 간주해도 좋다. 즉, 이렇게 반사율의 변화값 자체는 산출되지 않고 우식원성균수가 측정될 경우도 색조의 변화에 의거하여 우식원성균수를 측정하는 것에 포함된다.
흡광도의 증감은 적어도 1개의 측정용 파장에 의거해서 측정되면 좋지만, 적어도 1개의 측정용 파장을 포함하는 2개 또는 그 이상의 파장에 의거하여 측정되어도 좋다. 예를 들면, 2개 또는 그 이상의 측정용 파장을 이용해도 좋고, 측정용 파장과 백그라운드의 영향을 제외하기 위한 참조용 파장을 개별적으로 설정해서 이용해도 좋다. 흡광도의 증감을 측정하기 위해서 사용하는 광원의 파장은 사용하는 산화 환원 지시약이나 검출 기기에 따라서 적당하게 설정할 수 있다. 측정용 파장은 사용하는 산화 환원 지시약의 산화형에서의 극대 흡수 파장이라도 좋고, 환원형에서의 극대 흡수 파장이라도 좋고, 그 이외의 파장이라도 좋다. 예를 들면, 산화 환원 지시약으로서 레자주린을 사용할 경우에는 측정 파장을 630∼635㎚, 참조 파장을 750∼760㎚로 할 수 있다.
극대 흡수 파장의 시프트는 일정 시간의 경과 전후에 있어서의 극대 흡수 파장을 비교함으로써 측정할 수 있다. 극대 흡수 파장은 복수의 파장의 광을 정색 부위, 즉 피검 시료를 점착한 흡수성 담체 부분에 조사하고, 각 파장에 있어서의 반사율을 측정함으로써 특정할 수 있다. 극대 흡수 파장의 시프트를 측정하기 위한 조건은 복수의 파장의 광을 이용하여 극대 흡수 파장을 특정하는 것 이외에는 특정 파장에 있어서의 흡광도의 증감을 측정할 경우와 마찬가지라도 좋다.
또한, 색조의 변화를 측정하기 위해서 취득되는 상기한 바와 같은 데이터, 즉 특정 파장에 있어서의 반사율이나, 그것으로부터 산출되는 반사율의 변화값, 극대 흡수 파장 등을 총칭해서 이하 「반사율 데이터」라고 하는 경우가 있다.
광학적인 검출 기기로서는 특별하게 한정되지 않지만, 예를 들면 소변 시험지용 또는 혈액 시험지용 반사율 측정 기기를 사용할 수 있다. 소변 시험지용 반사율 측정 기기로서는, 예를 들면 포켓켐 UA PU-4010(아크레이 가부시키가이샤 제)을 사용할 수 있다. 포켓켐 UA PU-4010을 사용할 경우에는 2파장 반사 측광법에 의한 측정을 행할 수 있다. 포켓켐 UA PU-4010에 있어서, 측광부에서는 멀티 LED에 의해 파장이 다른 2종류의 광, 즉 측정 파장의 광, 및 참조 파장의 광을 정색 부위에 조사하고, 그 반사율에 의거해서 색조의 변화를 측정할 수 있다.
구체적으로는, 예를 들면 산화 환원 지시약으로서 레자주린을 사용한 시험편을 사용하고, 검출 기기로서 포켓켐 UA PU-4010(아크레이 가부시키가이샤 제)을 사용할 경우에는 실온, 5분의 반응 시간에서 측정 파장을 635㎚, 참조 파장을 760㎚로 해서 측정을 행할 수 있다. 이 조건에서는 레자주린의 환원 반응의 진행은 635㎚의 흡광도의 감소로서, 즉 635㎚의 광을 조사했을 때의 반사율의 증가로서 검출된다. 반응 시간을 5분으로 했을 경우에는, 예를 들면 반응 개시 후 1분∼5분까지의 4분간에 있어서의 반사율 변화를 측정하면 좋다.
본 발명의 방법은, 또한 예를 들면 측정된 색조의 변화, 산출된 우식원성균수의 값, 판정된 우식원성균수의 정도, 및/또는 판정된 우식 리스크의 정도를 출력하는 공정을 포함하고 있어도 좋고, 또한 이들 측정·판정 결과에 의거해서 코멘트를 출력하는 공정을 포함하고 있어도 좋다. 코멘트란, 예를 들면 측정·판정 결과를 설명하는 것이다. 코멘트의 예로서는 「타액 중의 충치균은 적고, 양호한 상태입니다.」를 들 수 있다. 출력은, 예를 들면 반사율 측정 기기에 설치된 표시부에 표시함으로써 행할 수 있다. 표시부는 문자나 화상 등의 정보를 표시할 수 있는 것인 한 특별하게 한정되지 않고, 예를 들면 LED 백라이트를 구비한 액정 디스플레이가 바람직하게 사용된다. 표시는 문자, 도형, 기호, 색채 또는 이것들의 결합 등의 임의의 형식에 의해 행해진다. 또한, 출력의 형태는 의사, 치과 위생사 또는 피검자 등이 출력된 정보를 인식 가능한 한 특별하게 제한되지 않고, 예를 들면 인쇄해서 출력해도 좋고, 음성에 의해 출력해도 좋다. 또한, 표시부에 있어서의 시각적인 표시, 인쇄에 의한 출력, 및 음성에 의한 출력 등을 임의로 조합하여 정보의 출력을 행해도 좋다.
본 발명의 방법에 있어서, 반사율 데이터의 취득, 우식원성균수의 산출 등의 연산, 및 측정·판정 결과나 코멘트의 출력 등의 각 공정은 단일의 컴퓨터에 의해 실행되어도 좋고, 물리적으로 독립된 복수의 컴퓨터에 의해 실행되어도 좋다. 예를 들면, 취득한 반사율 데이터를 전기 통신 회선 등을 이용해서 다른 장치에 송신하고, 그 다른 장치에서 우식원성균수의 산출 등의 연산을 행해도 좋다. 또한, 측정·판정 결과를 전기 통신 회선 등을 이용해서 다른 장치에 송신하고, 그 다른 장치에서 상기 측정·판정 결과나 그것에 의거하는 코멘트 등의 정보를 표시해도 좋다. 그러한 형태로서는, 예를 들면 웹(WEB) 상에서 반사율 데이터를 입력하여 연산용 서버에 반사율 데이터를 송신하고, 상기 연산용 서버에서 우식원성균수의 산출 등의 연산을 행하고, 또한 측정·판정 결과를 웹 상에서 표시하는 형태를 예시할 수 있다. 또한, 전기 통신 회선 등을 이용한 데이터의 송수신에 의거하는 과금 시스템을 채용해도 좋다. 그러한 과금 시스템으로서는, 예를 들면 이용자가 웹 브라우저 상에서 측정·판정 결과를 표시시킨 시점에서, 또는 측정·판정 결과를 포함하는 파일의 다운로드를 완료한 시점에서 과금하는 시스템을 들 수 있다. 과금은 표시·다운로드 종량제, 및 일(日), 주(週) 또는 월(月) 등 기간에 따라서 과금하는 정액제 등의 임의의 방식으로 실시할 수 있다.
이상, 우식원성균수를 측정하는 방법을 예시하여 본 발명의 방법을 설명했지만, 본 발명의 방법은 우식원성균수의 측정에 한정되지 않고, 피검 시료에 포함되는 NAD(P)H 및/또는 반응계에 있어서 생성되는 NAD(P)H의 검출을 이용하는 임의의 방법에 이용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법은 NAD(P)H를 직접적 또는 간접적으로 생성하는 효소 반응의 검출에 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 NAD(P)H의 측정 자체를 목적으로 해도 좋고, 그렇지 않아도 좋다. 우식원성균수를 측정하는 방법 및 그것에 관련되는 검사 시약이나 시험편 등에 관한 상술의 설명은 본 발명의 방법의 다른 형태에도 준용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법은 그 형태에 따라서 측정된 색조 변화에 의거하여 NAD(P)H의 양 또는 정도를 산출하는 공정을 포함하고 있어도 좋고, 측정된 색조 변화에 의거하여 NAD(P)H량과 관련되는 검출 대상의 양 또는 정도를 산출하는 공정을 포함하고 있어도 좋다.
또한, 본 발명의 방법에 있어서는 측정의 목적 등의 여러 가지 조건에 따라서는 상기와 같은 시험편을 사용하는 형태에 한정되지 않고, 그 밖의 임의의 형태로 정색 반응을 진행시켜도 좋다. 예를 들면, 본 발명의 방법에 있어서는 상기 검사 시약을 포함하는 용기 내에서 정색 반응을 진행시켜도 좋다. 구체적으로는, 예를 들면 피검 시료와 상기 검사 시약을 임의의 용기 내에 넣음으로써 피검 시료에 포함되는 NAD(P)H 및/또는 용기 내에 있어서 생성되는 NAD(P)H의 양에 따라서 정색 반응을 진행시킬 수 있다. 용기로서는 특별하게 제한되지 않지만, 예를 들면 튜브나 시험관을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에 있어서는 측정의 목적 등의 여러 가지 조건에 따라서는 상기와 같은 검출 기기를 사용하는 형태에 한정되지 않고, 그 밖의 임의의 형태로 정색 반응을 검출해도 좋다. 예를 들면, 본 발명의 방법에 있어서는 육안으로 색조의 변화를 측정해도 좋다. 그러나, 통상 할로겐의 염에 의한 정색 반응의 백그라운드의 저하 효과를 유효하게 이용하기 위해서는 광학적인 검출 기기를 이용하여 정량적으로 색조 변화를 측정하는 것이 바람직하고, 또한 색조 변화의 정량적인 측정 결과에 의거하여 정량적으로 우식원성균수의 측정 등을 행하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 방법에 있어서는 측정의 목적 등의 여러 가지 조건에 따라서는 최종적으로 산화 환원 지시약, 산화 환원 반응 촉진제, 및 할로겐의 염이 유효 성분으로서 이용되는 한 반응 개시시부터 피검 시료 및 그들 모두의 유효 성분이 반응계에 포함되어 있어도 좋고, 그렇지 않아도 좋다. 예를 들면, 피검 시료에 있어서 NAD(P)H의 생성이 충분하게 진행된 후 검사 시약을 반응계에 첨가해도 좋다. 또한, 예를 들면 각 유효 성분을 다른 타이밍으로 반응계에 첨가해도 좋다. 또한, 할로겐의 염에 의한 정색 반응의 백그라운드의 저하 효과를 얻기 위해서, 통상 할로겐의 염은 피검 시료, 산화 환원 지시약, 및 산화 환원 반응 촉진제가 반응계에 갖추어질 때까지 반응계에 첨가되는 것이 바람직하고, 미리 산화 환원 지시약이나, 산화 환원 지시약과 산화 환원 반응 촉진제의 혼합물에 첨가해두는 것이 보다 바람직하다.
또한, 본 발명에 있어서 검사 시약은 각 유효 성분을 포함하는 한 임의의 형태로 제공되어도 좋다. 예를 들면, 검사 시약은 상기한 바와 같이 시험편에 유지되어서 제공되어도 좋고, 임의의 용기에 넣어서 제공되어도 좋다. 또한, 검사 시약은 고체 형상, 액체 형상, 겔 형상 등의 임의의 형태로 제제화되어서 제공되어도 좋다. 제제화에 있어서는 제제 담체로서 통상 사용되는 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 안정제, 교미교취제, 희석제, 계면활성제 또는 용제 등의 첨가제를 사용할 수 있다. 검사 시약은 그대로, 또는 물, 생리식염수, 완충액 등을 이용하여 희석, 분산 또는 용해해서 본 발명의 방법에 이용할 수 있다. 이렇게 희석, 분산 또는 용해하거나 했을 경우에도 본 발명의 검사 시약의 범위에 포함되는 것은 말할 필요도 없다. 또한, 각 유효 성분은 혼합되어서 검사 시약에 포함되어 있어도 좋고, 혼합되지 않고 별개로 검사 시약에 포함되어 있어도 좋다. 본 발명의 검사 시약에 있어서의 각 유효 성분의 농도는 측정의 목적 등의 여러 가지 조건에 따라 적당하게 설정하면 좋지만, 예를 들면 반응계에 있어서 피검 시료와 혼합된 액체 상태로, 상술의 시약 함침액에 있어서의 바람직한 농도가 되는 농도이면 좋다.
또한, 본 발명의 검사 시약은 NAD(P)H 측정용, 또는 우식원성균수 측정용 등의 키트로서 제공되어도 좋다. 키트는 본 발명의 검사 시약을 포함하는 한 특별하게 제한되지 않는다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실험예 1] 증감제의 결정
본 실험예에서는 레자주린을 산화 환원 지시약으로서 사용할 때에 증감제로서 이용할 수 있는 화합물의 스크리닝을 행했다.
<시약 함침액 처방>
레자주린나트륨(도쿄 카세이 제) 42㎎, 1M 인산 완충액(pH 6.0) 120mL, 수크로오스(나카라이테스크 제) 12g을 증류수 1100mL에서 용해한 기본 조성에 대하여, 표 1에 나타내는 농도로 되도록 각 검토 성분을 첨가하여 시약 함침액을 조제했다.
Figure 112014030155485-pct00001
<시험편 제작>
상기 시약 함침액에 여과지를 함침한 뒤, 50℃에서 15분간 건조시켜 시험지를 얻었다. 제작한 각 시험지를 5㎜×300㎜ 폭으로 컷팅하고, 이것을 100㎜×280㎜의 점착제를 붙인 PET 필름에 부착했다. 이 시험지 부착 PET 필름을 5㎜ 폭으로 컷팅해서 100㎜×5㎜의 시험편을 얻었다. 또한, 이하 시약을 유지하는 시험지 부분을 「시약 부분」이라고 하는 경우가 있다.
<측정 방법>
상기 시험편의 시약 부분에 농도가 109CFU/mL가 되도록 증류수로 현탁한 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans, ATCC25175)의 균액을 10μL 적하해서 실온에 두었다. 각 시험지의 측정 파장 635㎚/참조 파장 760㎚에 있어서의 1분 후∼5분 후의 반사율 변화(Δ4분 반사율이라고도 함)를 반사율 측정 기기를 이용하여 측정했다.
<결과>
결과를 도 2에 나타낸다. 검토의 결과, 기본 조성에 1-메톡시 PMS를 첨가함으로써 Δ4분 반사율이 현저하게 상승하는 것이 명확해졌다.
[실험예 2] 베이스 반사율 저하제의 결정
본 실험예에서는 레자주린을 산화 환원 지시약으로서 사용하고, 1-메톡시 PMS를 증감제로서 사용할 때에 베이스 반사율(즉, 반사율의 백그라운드 값)을 저하시킬 수 있는 화합물의 스크리닝을 행했다.
<처방>
레자주린나트륨(도쿄 카세이 제) 42㎎, 1M 인산 완충액(pH 6.0) 120mL, 수크로오스(나카라이테스크 제) 12g, 1-메톡시 PMS(도진 카가쿠 제) 242㎎을 증류수 1100mL에서 용해한 기본 조성에 대하여, 표 2에 나타내는 농도로 되도록 각 검토 성분을 첨가하여 시약 함침액을 조제했다.
Figure 112014030155485-pct00002
<시험편 제작>
상기 시약 함침액에 여과지를 함침한 뒤, 50℃에서 15분간 건조시켜 시험지를 얻었다. 제작한 각 시험지를 5㎜×300㎜ 폭으로 컷팅하고, 이것을 100㎜×280㎜의 점착제를 붙인 PET 필름에 부착했다. 이 시험지 부착 PET 필름을 5㎜ 폭으로 컷팅해서 100㎜×5㎜의 시험편을 얻었다.
<측정 방법>
우선, 각 시험편의 베이스 반사율의 측정을 행했다. 상기 시험편의 시약 부분에 증류수를 10μL 적하하여 실온에 두었다. 각 시험지의 측정 파장 635㎚/참조 파장 760㎚에 있어서의 1분 후의 반사율을 반사율 측정 기기를 이용해서 측정하여 베이스 반사율로 했다.
또한, 별도 각 시험편의 우식원성균에 대한 반응성의 평가를 행했다. 상기 시험편의 시약 부분에 농도가 109CFU/mL가 되도록 증류수로 현탁한 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans, ATCC25175)의 균액을 10μL 적하하여 실온에 두었다. 각 시험지의 측정 파장 635㎚/참조 파장 760㎚에 있어서의 1분 후∼5분 후의 반사율 변화(Δ4분 반사율)를 반사율 측정 기기를 이용하여 측정했다.
<결과>
베이스 반사율의 측정 결과를 도 3에 나타낸다. 검토의 결과, 기본 조성에 KCl 또는 NaCl을 첨가함으로써 현저하게 베이스 반사율이 저하되는 것이 명확해졌다.
또한, 반응성의 평가를 행한 결과를 도 4에 나타낸다. 증감제인 1-메톡시 PMS만을 첨가했을 경우와 비교해서, KCl 또는 NaCl을 병용함으로써 Δ4분 반사율이 더욱 상승하고, 반응성이 현격히 향상되는 것이 명확해졌다.
[실험예 3] 토출액을 사용한 검토
본 실험예에서는 구강 세척 토출액을 피검 시료로서 사용하여 KCl 또는 NaCl의 첨가 효과를 검토했다.
<처방>
레자주린나트륨(도쿄 카세이 제) 42㎎, 1M 인산 완충액(pH 6.0) 120mL, 수크로오스(나카라이테스크 제) 12g을 증류수 1100mL에서 용해한 기본 조성에 대하여, 표 3에 나타내는 농도로 되도록 1-메톡시 PMS와 KCl 또는 NaCl을 첨가하여 시약 함침액을 조제했다.
Figure 112014030155485-pct00003
<시험편 제작>
상기 시약 함침액에 여과지를 함침한 뒤, 50℃에서 15분간 건조시켜 시험지를 얻었다. 제작한 각 시험지를 5㎜×300㎜ 폭으로 컷팅하고, 이것을 100㎜×280㎜의 점착제를 붙인 PET 필름에 부착했다. 이 시험지 부착 PET 필름을 5㎜ 폭으로 컷팅해서 100㎜×5㎜의 시험편을 얻었다.
<측정 방법>
12명의 볼런티어의 협력을 얻어서, 3mL의 정제수로 10초간 구강 세척하고 용기에 토해냄으로써 얻어진 토출액을 피검 시료로 했다. 상기 시험편의 시약 부분에 각 피검 시료를 10μL 적하하고, 각 시험지의 측정 파장 635㎚/참조 파장 760㎚에 있어서의 1분 후∼5분 후의 반사율 변화(Δ4분 반사율)를 반사율 측정 기기를 이용하여 측정했다. 또한, 피검 시료 중의 우식원성균수의 측정을 플레이트 배양법(MSB 배지)에 의해 행했다.
결과를 도 5, 도 6, 도 7에 나타낸다. 기본 조성에 1-메톡시 PMS만을 첨가한 대조군과 비교해서, KCl 또는 NaCl을 더 첨가함으로써 Δ4분 반사율의 향상이 확인되었다. 따라서, 스트렙토코커스 뮤탄스의 균액을 사용한 검토와 마찬가지로, 토출액을 사용한 검토에 있어서도 KCl 또는 NaCl의 유효성이 나타내어졌다. 또한, KCl 또는 NaCl의 첨가군에서는 1-메톡시 PMS의 농도가 0.4mM∼0.6mM의 어느 경우에 있어서나 같은 정도의 높은 Δ4분 반사율을 나타내는 것이 명확해졌다. 이러한 높은 Δ4분 반사율에 의해, 예를 들면 토출액 중의 우식원성균수의 대소를 3단계로 구분해서 판정할 수 있다.
[실험예 4] 각종 염류의 첨가 효과의 검토
본 실험예에서는 구강 세척 토출액을 피검 시료로서 사용하여 각종 염류의 첨가 효과를 검토했다.
<처방>
레자주린나트륨(도쿄 카세이 제) 42㎎, 1M 인산 완충액(pH 6.0) 120mL, 수크로오스(나카라이테스크 제) 12g을 증류수 1100mL로 용해한 기본 조성에 대하여, 표 4에 나타내는 농도로 되도록 1-메톡시 PMS와 각종 염류를 첨가하여 시약 함침액을 조제했다.
Figure 112014030155485-pct00004
<시험편 제작>
상기 시약 함침액에 여과지를 함침한 뒤, 50℃에서 15분간 건조시켜 시험지를 얻었다. 제작한 각 시험지를 5㎜×300㎜ 폭으로 컷팅하고, 이것을 100㎜×280㎜의 점착제를 붙인 PET 필름에 부착했다. 이 시험지 부착 PET 필름을 5㎜ 폭으로 컷팅해서 100㎜×5㎜의 시험편을 얻었다.
<측정 방법>
12명의 볼런티어의 협력을 얻어서, 3mL의 정제수로 10초간 구강 세척하고 용기에 토해냄으로써 얻어진 토출액을 피검 시료로 했다. 상기 시험편의 시약 부분에 각 피검 시료를 10μL 적하하고, 각 시험지의 측정 파장 635㎚/참조 파장 760㎚에 있어서의 1분 후∼5분 후의 반사율 변화(Δ4분 반사율)를 반사율 측정 기기를 이용하여 측정했다.
결과를 표 5 및 도 8에 나타낸다. 기본 조성에 1-메톡시 PMS만을 첨가한 대조군과 비교해서, KBr 또는 NaBr을 더 첨가함으로써 Δ4분 반사율의 향상이 확인되었다.
Figure 112014030155485-pct00005
(산업상의 이용 가능성)
본 발명에 의해, 산화 환원 지시약의 색조 변화를 명료하게 측정할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의해 실온 하에서 단시간에 우식원성균수를 측정할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의하면 치과 의원 등의 임상 현장에 있어서 항온 장치 등의 설비 없이 다수의 검체를 단시간에 처리할 수 있어, 간편하고 또한 신속한 우식원성균수의 측정이 가능해진다. 측정 결과는, 예를 들면 피검자의 우식 리스크의 판정에 적합하게 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 우식의 예방 등에 유용하다.
1 : 시험편 10 : 지지 담체
11 : 흡수성 담체

Claims (12)

  1. 산화 환원 지시약의 색조 변화를 측정하는 방법으로서,
    검사 시약과 피검 시료를 반응시켜서 색조의 변화를 측정하는 것을 포함하고,
    상기 검사 시약은 산화 환원 지시약, 산화 환원 반응 촉진제, 및 할로겐의 염을 포함하고,
    상기 산화 환원 지시약은 레자주린이고,
    상기 산화 환원 반응 촉진제는 1-메톡시-5-메틸페나지늄메틸설페이트, 페나지늄메틸설페이트 또는 페나진에토설페이트이고,
    상기 할로겐의 염은 염화나트륨, 염화칼륨, 브롬화나트륨 또는 브롬화칼륨이고,
    피검 시료 중의 우식원성균수를 측정하는 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    지지 담체와, 그 지지 담체에 담지되는 흡수성 담체를 구비하는 시험편으로서, 상기 흡수성 담체는 상기 검사 시약을 유지하는 시험편을 이용하여 측정이 행해지는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 산화 환원 지시약, 산화 환원 반응 촉진제, 및 할로겐의 염을 포함하는 NADH 및 NADPH의 측정 시약으로서,
    상기 산화 환원 지시약은 레자주린이고,
    상기 산화 환원 반응 촉진제는 1-메톡시-5-메틸페나지늄메틸설페이트, 페나지늄메틸설페이트 또는 페나진에토설페이트이고,
    상기 할로겐의 염은 염화나트륨, 염화칼륨, 브롬화나트륨 또는 브롬화칼륨이고,
    우식원성균수의 측정에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 시약.
  5. 지지 담체와, 그 지지 담체에 담지되는 흡수성 담체를 구비하는 NADH 및 NADPH의 측정에 사용하기 위한 시험편으로서,
    상기 흡수성 담체는 제 4 항에 기재된 시약을 유지하고,
    우식원성균수의 측정에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 시험편.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
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