CN102066911B - 用于生物传感的基于萤光素-荧光素酶的微装置 - Google Patents

Abstract

提供了用于测定样品中的一种或多种微生物的浓度的方法和装置。该方法包括将样品过滤通过在样品管内部的过滤器以将该一种或多种微生物保留在该过滤器上。所得到的包含或生成三磷酸腺苷的滤出液通过该样品管并进入该报道分子区域。在该报道分子区域中，该滤出液中的该三磷酸腺苷与包括萤光素-荧光素酶络合物的透明多孔基质接触。该三磷酸腺苷与该萤光素-荧光素酶络合物相互作用以提供用检测器测定的光响应。将该光响应与校准曲线相比较以测定样品中一种或多种微生物的总浓度。

Description

用于生物传感的基于萤光素-荧光素酶的微装置

背景技术

生物发光是天然发生的现象，其已经用于多种应用，特别是在分子生物学中，在分子生物学中与其相关的酶已经用作遗传报道分子。生物发光对于用作遗传标记几乎是理想的。典型地，在哺乳动物细胞中没有内生性发光活性，而实验引入的生物发光几乎是瞬间的、灵敏的且可定量的。尽管多种物种都显示出生物发光，但仅有相对很少的已经表征和克隆。其中，仅萤火虫（Photinus pyralis）荧光素酶、海肾（Renilla）荧光素酶和水母发光蛋白已经有了很多实用。在产生生物发光的萤火虫荧光素酶的机制中对分子组分的研究显示该酶的基质是萤火虫荧光素，也即多杂环有机酸，D-(-)-2-(6’-羟基-2’-苯并噻唑基)-δ²-噻唑啉-4-羧酸（下文称作“荧光素”）。

萤火虫荧光素酶是单体61 kD酶，其对两步工艺中的荧光素的氧化起催化作用，其在560nm发光。第一步包括通过用三磷酸腺苷（ATP）的α-磷酸盐在镁的存在下的酰化使荧光素的羧酸酯基团活化以生成luciferyl adenylate并除去无机焦磷酸盐。在第二步中，用分子氧氧化该luciferyl adenylate以生成AMP、二氧化碳和氧化荧光素。该氧化荧光素是以电子激发态生成的。一旦转变为基态，该氧化荧光素发光。该下面称作荧光素-荧光素酶的反应的反应机理如下：

荧光素+ATP+O₂+Mg²⁺+荧光素酶→氧化荧光素+光子 （1）。

由于所有活细胞都包含三磷酸腺苷，因此在562纳米处检测到光表明存在活细胞。记录该发射的光并将其分析以测定该样品中该微生物的浓度。该方法具有很多优点，包括例如约10^-18微生物/克样品流体的低检测限、约1分钟的短响应时间、以及低试剂和仪器成本。

发明内容

需要的是用于测定样品中一种或多种微生物的浓度的简单的基于荧光素-荧光素酶的方法和设备。

附图说明

通过参照以下描述和图解该实施方案的附图可以更好地理解本发明的实施方案，在附图中：

图1描绘了用于生物传感的示例性基于荧光素-荧光素酶的微装置的横截面。

具体实施方式

本发明提供了用于测定样品中一种或多种微生物的浓度的方法和设备。该方法包括将样品过滤通过样品管内部的过滤器以将该一种或多种微生物保留在该过滤器上。可以将所得到的包含或生成三磷酸腺苷的滤出液通过该样品管并进入该报道分子区域。在该报道分子区域中，该滤出液中的三磷酸腺苷与包括萤光素-荧光素酶络合物的透明多孔基质接触。三磷酸腺苷与该萤光素-荧光素酶络合物相互作用以提供可以用检测器测定的光响应。该检测器典型地可以是电荷耦合设备（charge-coupled device）。可以将该光响应与校准曲线相比较以确定样品中微生物的总浓度。如果需要微生物的特定浓度，可以通过用缓冲或清洗试剂冲洗来清洁该样品管。然后，可以将第二样品引入该样品管中。可以将该样品与对于评价所需微生物可以具有特异性的试剂相结合。该试剂可以是例如刺激物、抑制剂、终止剂、抗生素、营养剂或其组合。例如，如果该试剂是特定微生物的抑制剂，该微生物将停止或降低其生成三磷酸腺苷的能力。随着该第二样品通过该过滤器，滤出液将具有降低的三磷酸腺苷的浓度。该降低的三磷酸腺苷的浓度将产生可能比原始响应低的第二光响应。因此，如果从该第一光响应中减去该第二光响应，能够测定该特定微生物的浓度。类似地，使用对其他微生物而言特异性的其他试剂可以重复该工艺。因此，可以测定数种微生物的浓度。

此处所用的一些术语具有以下含义。在本说明书中所用的所有其他术语和短语具有如本领域技术人员会理解的其普通含义。该普通含义可以通过参照技术词典而得到，例如Hawley’s Condensed Chemical Dictionary, 11^th Edition, Sax和Lewis, Van Nostrand Reinhold, New York, N.Y., 1987和The Merck Index, 11^th Edition, Merck & Co., Rahway N.J., 1989。

此处所用的术语“和/或”表示该术语相关的指代物中的任一种、指代物的任意组合或所有指代物。

除上下文有明确的另外表示之外，此处所用的单数形式“a”、“an”和“the（该，所述）”可以包括复数指代。因此，例如，提及“配方”可以包括多个这种配方，使得化合物X的配方可以包括化合物X的多个配方。

此处所用的术语“约”表示所指定数值的10％的变化，例如约50％意味着从45％到55％的变化。对于整数范围，该术语约能够包括比所列整数大1或2个整数和小1或2个整数。

此处所用的术语“抗生素”表示抑制或消除微生物（例如细菌、真菌或原生动物）的生长的化学治疗剂。

此处所用的术语“缓冲剂”表示抵制pH变化的溶液。

此处所用的术语“电荷耦合设备”表示用于电子形成图像的设备，其使用在被入射光撞击时释放电子的硅层。

此处所用的术语“抑制剂”表示抑制微生物生长的试剂。

此处所用的短语“在一种实施方案中”表示特殊的特征、结构或特点。然而，每个实施方案可能不必需包括该特殊的特征、结构或特点。此外，在与实施方案结合描述特殊的特点、结构或特征时，认为与其他实施方案相结合实施该特点、结构或特征（无论是否公开描述）是在本领域技术人员的知识范围内的。

此处所用的术语“荧光素”表示一旦用适当选择的荧光素酶氧化就会产生生物发光的任意底物。荧光素可以是天然或合成化合物。从不同生物物种中分离出来的荧光素在结构上可能变化非常大，尽管在很多情况中在广泛多种种类中已经发现了同样的结构。

此处所用的术语“荧光素酶”表示酶，其对荧光素氧化为氧化荧光素起催化作用，伴随着在生物发光反应中产生光，以使得该氧化荧光素从该荧光素-荧光素酶络合物中释放到该反应介质中。这些荧光素发光的反应需要一种或多种辅助因素（例如三磷酸腺苷、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯或黄素单核苷酸）的存在。这种荧光素酶的实例是萤火虫、细菌和真菌的那些。

此处所用的术语“荧光素-荧光素酶络合物”表示除了此处所限定的引发化合物之外，在引发生物发光反应所需的所有其他特定辅助因素的存在下荧光素酶与其适合的荧光素的任意组合。有很多种荧光素-荧光素酶络合物；每种荧光素酶使用特定的荧光素和辅助因素。荧光素酶-荧光素酶络合物能够是任意这种组合，前提是一旦引入活性形式的引发化合物，生物荧光反应就开始并发光。引发化合物是用于在添加到荧光素-荧光素酶络合物时引发荧光素酶介导的生物发光反应（不同于二价阳离子）所需要的辅助因素。这种引发化合物的实例是三磷酸腺苷、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯或黄素单核苷酸。选择引发化合物以能够在适当选择的其他组分（其可以包括多价阳离子）的存在下与该荧光素-荧光素酶络合物相互作用以引发生物发光反应。

此处所用的术语“微生物”表示过小以不能被人的肉眼看到的生物体。此处所用的术语“微生物”表示细菌、真菌、古细菌（archaea）或原生生物。

此处所用的术语“报道分子区域”表示在该装置上用该荧光素-荧光素酶络合物固定的区域。一旦ATP分子通过，其将被荧光素-荧光素酶消耗并将发光。

此处所用的术语“样品”表示怀疑包含分析物的材料。该样品能够作为从该来源得到而直接使用或经过预处理以改性该样品的特征以后使用。该样品能够来自任意生物来源，例如生理流体，包括血液、唾液、目镜液、脑脊髓液、汗液、尿液、乳液、腹水液、raucous、滑液、腹腔液、或羊膜液等。能够在使用之前对该样品进行预处理，例如由血液制备血浆、和稀释粘性液体等。处理方法能够包括过滤、蒸馏、浓缩、干扰组分的失活和试剂的添加。除了生理流体之外，也能够使用其他液体样品，例如水、和食品等，用于环境或食品制备化验的性能。此外，能够使用怀疑包含分析物的固体材料作为样品，例如土壤、和食品等。在一些情况中，改性固体试验样品以形成液体介质或释放该分析物可能是有利的。

此处所用的术语“刺激物”表示加速微生物生长的试剂。

此处所用的术语“终止剂”表示停止、抑制或减速微生物的生长的试剂。

此处所用的术语“透明多孔基质”表示该多孔基质传送由该滤出液与该荧光素-荧光素酶络合物的相互作用提供的光响应产生的电磁辐射的一个或多个波长的能力。

该新方法和设备能够用于测定酶活性、微生物活性、微生物对特定试剂的敏感性、微生物毒性、和疾病检测等。此外，该新方法和设备可以在环境保护、食品安全、水质量控制和医疗和生物研究中找到应用。

在一种实施方案中，提供了用于测定一种或多种微生物在样品中的浓度的方法。该方法提供：（a）将包括一种或多种微生物的第一样品通过样品管内的过滤器过滤以将该一种或多种微生物保留在该过滤器上并提供第一滤出液；（b）将该第一滤出液通过该样品管内的报道分子区域，其中该报道分子区域包括包括荧光素-荧光素酶络合物的透明多孔基质；（c）检测来自该报道分子区域的第一光响应，其中该光响应是由该滤出液与该荧光素-荧光素酶络合物的相互作用提供的；（d）将该第一光响应与校准曲线比较以测定该一种或多种微生物在该样品中的浓度；（e）任选地，将包括试剂和一种或多种微生物的第二样品过滤通过该样品管内的过滤器以将该一种或多种微生物保留在该过滤器上并提供第二滤出液，其中该试剂对于第一微生物具有特异性且包括刺激物、抑制剂、终止剂、抗生素、营养剂或其组合；（f）任选地，将该第二滤出液通过该样品管内的该报道分子区域；（g）任选地，检测来自该报道分子区域的第二光响应，其中该第二光响应是由该第二滤出液与该荧光素-荧光素酶络合物的相互作用提供的；（h）任选地，将该第一光响应减去该第二光响应以提供第一微生物特异性光响应；和（i）任选地，将该第一微生物特异性光响应与校准曲线比较以测定该第一微生物在该样品中的浓度，其中该一种或多种微生物包括一种或多种细菌、一种或多种真菌、一种或多种古细菌、一种或多种原生生物或其组合。

在一种实施方案中，用检测器进行该第一和第二光响应的检测。在一种实施方案中，该检测器包括照相机、视频照相机、硅光电池或光电倍增管或其组合。

在一种实施方案中，将该荧光素-荧光素酶络合物固定在该透明多孔基质上或封装在其内。在一种实施方案中，包括该荧光素-荧光素酶络合物的该透明多孔基质包括透明无机凝胶基质、透明有机聚合物凝胶基质、透明混杂无机-有机凝胶基质或其组合。在一种实施方案中，透明无机凝胶基质包括硅胶、硼酸盐、TiO₂、Al₂O₃、ZrO₂或其组合。在一种实施方案中，该透明有机聚合物凝胶基质包括聚乙烯醇、聚酯、聚酰亚胺、聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚烯烃、聚碳酸酯或其组合。

在一种实施方案中，该透明混杂无机-有机凝胶基质包括硅胶、硼酸盐、TiO₂、Al₂O₃、ZrO₂、聚乙烯醇、聚酯、聚酰亚胺、聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚烯烃、聚碳酸酯或其组合。

在一种实施方案中，该样品管包括有机聚合材料、无机材料或其组合。在一种实施方案中，该聚合材料包括包括聚乙二醇、聚环氧乙烷的聚甲基丙烯酸甲酯；聚丙烯酰胺或其组合。

在一种实施方案中，该无机材料包括玻璃、陶瓷材料、金属、金属合金、金属氧化物、复合金属氧化物或其组合。

在一种实施方案中，提供了设备。该设备包括：（a）样品管，包括：样品入口、在该样品管内的过滤器，其中该样品管包括在该样品入口和该过滤器之间的任选的试剂入口或连接到在该过滤器和该报道分子区域之间的任选阀门的任选的清洗性缓冲液入口；和在该过滤器和出口之间的报道分子区域，其中该报道分子区域包括包括荧光素-荧光素酶络合物的透明多孔基质；（b）与该检测器连接的检测器以检测来自该报道分子区域的一个或多个光响应，其中该一个或多个光响应是由一种或多种滤出液与该荧光素-荧光素酶络合物的相互作用提供的；和（c）与该报道分子区域连接的分析仪以测定该一种或多种微生物在该样品中的浓度，其中该一种或多种微生物包括一种或多种细菌、一种或多种真菌、一种或多种古细菌、一种或多种原生生物或其组合。

在一种实施方案中，提供了设备。该设备包括：（a）样品管，包括：样品入口、在该样品管内的过滤器和在该过滤器和出口之间的报道分子区域，其中该报道分子区域包括包括荧光素-荧光素酶络合物的透明多孔基质；（b）与该报道分子区域连接的检测器以检测来自该报道分子区域的一个或多个光响应，其中该一个或多个光响应是由一种或多种滤出液与该荧光素-荧光素酶络合物的相互作用提供的；和（c）与该检测器连接的分析仪以测定该一种或多种微生物在该样品中的浓度。

图1是用于生物传感的示例性基于荧光素-荧光素酶的微装置（1）的横截面视图。

在一种实施方案中，该微装置（1）包括样品管（10）、样品储存器（11）、试剂储存器（12）、混合区域（13）、过滤器（14）、阀（15）、清洁性缓冲液入口储存器（16）、报道分子区域（17）、透明多孔基质（18）、检测器（19）、分析仪（20）和出口储存器（21）。操作者打开该阀（15）以将该样品储存器（11）与该出口储存器（21）连接。将该样品和试剂泵送到该混合区域（13）中并结合，将该混合的样品泵送通过该过滤器（14）。该过滤器（14）将保留该微生物和其他大的碎片，并允许溶解在该样品流体中的小分子（例如三磷酸腺苷）通过该过滤器（14）。该流体将通过该阀（15）并进入该报道分子区域（17）。一旦在该报道分子区域（17）中，该流体将进入包含该荧光素-荧光素酶络合物的透明多孔基质（18）中。该荧光素-荧光素酶络合物可以固定在该透明多孔基质上，或者可以封装在其内。

如上讨论，在氧和镁离子（Mg⁺²）存在下该三磷酸腺苷与荧光素-荧光素酶络合物依照方程（1）反应以产生波长为562纳米的可见光。该562纳米的可见光可以被检测器（19）接收，转化为可以送往分析仪（20）的信号。该分析仪（20）将该信号与校准曲线比较以测定该微生物在该样品中的浓度。在完成数据分析时，操作者可以打开该阀（15），将清洁性缓冲液从该清洁性缓冲液储存器（16）泵送通过该多孔基质（18）并使固定在该透明多孔基质（18）上或封装在其内的该荧光素-荧光素酶络合物再生。然后，该操作者可以用废物储存器（未示出）代替该样品储存器（11）和试剂储存器（12），打开该阀（15），并将清洁性缓冲液从该清洁性缓冲液储存器（16）泵送到该废物储存器，由此从该过滤器中清洗掉任意残留的微生物和其他大碎片。将该微装置（1）准备好用于下一个样品。尽管图中未显示，可以为该微装置（1）提供温度调节机构以将该流体保持在预设温度并为其提供混合机构以搅拌该混合区域（13）中的混合物。

可以使用任意含微生物的液体作为该样品。能够使用通过例如在介质中培养细菌得到的培养溶液或临床样品（例如含细菌的尿液和血液）等作为该样品。

在一些实施方案中，该试剂储存器（12）、混合区域（13）、阀（15）和清洁性缓冲液储存器（16）是任选的。

适合的微生物可以包括例如一种或多种细菌、一种或多种真菌、一种或多种古细菌、一种或多种原生生物或其组合。

检测装置

在另一实施方案中，可以用电荷耦合装置进行该第一和第二光响应的检测。其他适合的装置可以包括例如照相机、视频照相机、硅光电池、和光电倍增管（PMT）等或其组合。

适合的电荷耦合装置包括例如可获自Photometrics, Pleasanton, CA, USA的CoolSNAP EZ。

经固定的荧光素-荧光素酶络合物

在一种实施方案中，该荧光素-荧光素酶络合物可以固定在该透明多孔基质上。可以使用几种方法，包括例如：通过重氮化将荧光素酶固定在多孔基质（具有经胺处理的表面）上；通过席夫碱反应将荧光素酶直接固定在多孔基质（具有经胺处理的表面）上；或通过席夫碱反应将荧光素酶直接固定在多孔基质（具有羧基、醛基）上。对于该荧光素而言，可以使用两种方法，包括例如：将荧光素添加到溶液中并允许该溶液流过具有ATP的报道分子区域；和使用例如荧光素酚基将荧光素固定到多孔基质上。

在另一实施方案中，可以将该荧光素-荧光素酶络合物封装在该透明多孔基质上。为了将该荧光素-荧光素酶络合物封装在该基质内，可以使用例如两种方法。在第一种方法中，使用例如溶胶-凝胶或其他技术使表达荧光素-荧光素酶的细胞或微生物生长并封装在多孔基质中。在第二种方法中，可以将荧光素酶加入到孔尺寸小于荧光素酶尺寸的多孔基质中。在上述各种方法中，可以通过例如以下添加荧光素：（1）将荧光素添加到溶液中并允许该包含荧光素的溶液流动通过具有ATP的报道分子区域；（2）使用荧光素的酚基将该荧光素固定在多孔基质上；和（3）用封装在该基质内的细胞或微生物制备荧光素。

在另一实施方案中，包括荧光素-荧光素酶络合物的该透明多孔基质包括透明无机凝胶基质、透明有机聚合物凝胶基质、透明混杂无机-有机凝胶基质或其组合。

在一种实施方案中，该透明无机凝胶基质包括硅胶、硼酸盐、TiO₂、Al₂O₃、ZrO₂或其组合。

在一种实施方案中，该透明有机聚合物凝胶基质包括聚乙烯醇、聚酯、聚酰亚胺、聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚烯烃、聚碳酸酯或其组合。

在一种实施方案中，该复合凝胶基质包括上述其无机和有机聚合物凝胶基质的组合。

Schubert等, Synthesis of Inorganic Materials, 2^nd Edition, Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2005中公开了适合的透明无机凝胶基质和透明混杂无机-有机凝胶基质。

适合的透明有机聚合物凝胶基质可以包括例如水不溶性材料，例如乙酸纤维素、丙酸纤维素、丁酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、硝酸纤维素、聚丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯醇缩醛、聚酰亚胺、聚硅氧烷、聚氨酯、聚糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、其共聚物或其组合。

样品管

在一种实施方案中，该样品管包括聚合材料或无机材料，或其他生物相容或生物惰性材料。该样品管可以是例如全部由一种材料制成或由不同部分制成，每一部分可以由不同材料构成。

在一种实施方案中，该样品管可以由一种材料制成。在另一实施方案中，该样品管可以在不同部分由两种或更多种材料制成。

在一种实施方案中，该样品管可以全部由玻璃或聚合物制成。在另一实施方案中，该样品管可以由金属制成，其具有由透明材料（例如玻璃或聚合物）制成的透明报道分子区域。在其中该样品管可能由多于一种材料（例如玻璃和金属）制成的某些实施方案中，可以使用密封剂以连接这些材料。在一种实施方案中，可以使用硅密封剂，例如Room Temperature Vulcanizing（RTV）硅橡胶密封剂。

该样品管可以经选择以提供适合的光透射特征。例如，该样品管可以是官能化的或非官能化的玻璃或多种聚合物中的任一种。一旦阅读了本公开内容，其他底物材料对于本领域技术人员而言将是容易显而易见的。

适用于该样品管的聚合材料可以包括例如是均聚物或共聚物的透明有机聚合物，其是天然形成的或合成的，交联的或未交联的。感兴趣的特定聚合物包括但不局限于：聚烯烃，例如聚丙烯；聚酰亚胺；聚碳酸酯；聚酯；聚酰胺；聚醚；聚氨酯；聚氟烃；聚苯乙烯；聚（丙烯腈-丁二烯-苯乙烯）（ABS）；丙烯酸酯和丙烯酸聚合物，例如聚甲基丙烯酸甲酯；和其他取代和未取代的聚烯烃；及其共聚物。

该样品管也可以由“复合材料”（即由不同材料构成的组合物）制成。该复合材料可以是嵌段复合材料，例如A-B-A嵌段复合材料、或A-B-C嵌段复合材料等。该样品管的内表面可以化学改性以提供所需的化学或物理性质，例如降低分子部分到该样品管的内壁上的吸附性和降低电渗流。例如，该样品管的内表面可以涂覆有或官能化以包含电中性分子物种、两性离子基团、亲水或疏水低聚物或聚合物等。当用聚酰亚胺、聚酰胺和具有反应活性位置或官能团（例如羧基、羟基、氨基和卤代烷基）的聚烯烃（例如聚乙烯醇、聚羟基苯乙烯、聚丙烯酸、聚丙烯腈等），或者用能够经改性以包含这种反应活性位置或官能团的聚合物时，可能可以将能够提供各种所需表面性质的基团化学键合到该表面上。也可以使用表面活性剂（例如聚环氧乙烷三嵌段共聚物，例如可以商标“Pluronic”得到的那些、聚氧乙烯山梨糖醇酐或“TWEEN”）、天然聚合物（例如牛血清清蛋白）或提供所需表面特征（特别是降低生物分子（例如核酸或蛋白质）的吸附性）的其他部分，对该样品管的内表面进行有利地改性。

优选地，该样品管中的聚合材料可以包括例如：包括聚乙二醇、聚环氧乙烷的聚甲基丙烯酸甲基酯；聚丙烯酰胺等，或其组合。在一种实施方案中，可以对该包括聚乙二醇、聚环氧乙烷的聚甲基丙烯酸甲基酯；聚丙烯酰胺等，或其组合进行例如表面改性。

适用于该样品管的无机材料可以包括例如玻璃、陶瓷材料、金属、金属合金、金属氧化物、复合金属氧化物或其组合。

适合的陶瓷材料可以包括例如SiO₂、ZrO₂、TiO₂、Al₂O₃、ZnO等或其组合。

适合的金属可以包括例如Al、Mg、Zn、Pd、Pt、Ni、Co、Rh、Ir、Fe、Ru、Au、Ag、Cu等或其组合。

适合的合金可以包括例如不锈钢、硬铝、硅铝合金、青铜、黄铜等或其组合。

用于该样品管的其他可能解决方案可以是使用上述材料的任意组合。

操作条件

该用于测定样品中一种或多种微生物的浓度的设备可以以例如可能适用于所需微生物的任意所需温度、压力和流速操作。

在示例性实施方案中，该设备可以以约0℃～约100℃的温度，典型地为约室温～约60℃，更典型地约35℃～约40℃的温度操作。然而，在其中所需的微生物是适于高温环境的微生物的某些实施方案中，可以使用更高的温度。

在该样品管内的样品的流速可以是任意所需的速率。在示例性实施方案中，该流速可以为约0.000005标准立方厘米/分钟（sccm）～约10sccm，优选约0.00005sccm～约0.1sccm，更优选约0.0005sccm～约0.01sccm。

该样品管内的压力可以是任意所需的压力。

此处参考或引用的所有专利和公开文件表示本发明所述领域技术人员的技术水平，每一这些提及的专利或公开文件由此通过引用结合进来，就像其已经整体单独通过引用结合进来或者整体在此处给出一样。申请人保留将来自任意这种引用的专利或公开文件的任何和所有材料和信息物理引入本说明书中的权力。

此处公开的具体方法和组合物表示优选的实施方案且是示例性的且并不意于限制本发明的范围。一旦考虑了本说明书，其他目的、方面和实施方案将是本领域技术人员容易想到的，且包括在由权利要求的范围限定的本发明的精神之内。本领域技术人员将容易显而易见得出可以在不脱离本发明的范围和精神的情况下对此处公开的本发明进行各种取代和改变。此处示例性描述的本发明适宜地可以在没有如下的任何一种要素或多种要素、或者一种限制或多种限制的情况下实施：所述要素和限制没有在本文中特别公开为必需的。此处示例性描述的该方法和工艺适宜地可以以不同的步骤顺序实施，且其并不必限制到此处或权利要求中指出的步骤顺序。

Claims (15)

1.用于测定样品中一种或多种微生物的浓度的方法，包括以下步骤：

（a）将包括一种或多种微生物的第一样品过滤通过样品管内的过滤器以将该一种或多种微生物保留在该过滤器上并提供第一滤出液；

（b）将该第一滤出液通过该样品管内的报道分子区域，其中该报道分子区域包括包含荧光素-荧光素酶络合物的透明多孔基质；

（c）检测来自该报道分子区域的第一光响应，其中该光响应是由该滤出液与该荧光素-荧光素酶络合物的相互作用提供的；

（d）将该第一光响应与校准曲线比较以测定该一种或多种微生物在该样品中的浓度；

（e）任选地，将包括试剂和一种或多种微生物的第二样品过滤通过该样品管内的该过滤器以将该一种或多种微生物保留在该过滤器上并提供第二滤出液，其中该试剂对于第一微生物而言是特异性的且包括刺激物、抑制剂、终止剂、抗生素、营养剂或其组合；

（f）任选地，将该第二滤出液通过该样品管内的该报道分子区域；

（g）任选地，检测来自该报道分子区域的第二光响应，其中该第二光响应是由该第二滤出液与该荧光素-荧光素酶络合物的相互作用提供的；

（h）任选地，将该第一光响应减去该第二光响应以提供第一微生物特异性光响应；和

（i）任选地，将该第一微生物特异性光响应与校准曲线比较以测定该第一微生物在该样品中的浓度，

其中该一种或多种微生物包括一种或多种细菌、一种或多种真菌、一种或多种古细菌、一种或多种原生生物或其组合；和

其中该样品管包括有机聚合材料、无机材料或其组合。

2.权利要求1的方法，其中用包括照相机、硅光电池或光电倍增管或其组合的检测器进行该第一和第二光响应的检测。

3.权利要求1的方法，其中将该荧光素-荧光素酶络合物固定在该透明多孔基质上或封装在其内，该透明多孔基质包括透明无机凝胶基质、透明有机聚合物凝胶基质、透明混杂无机-有机凝胶基质或其组合。

4.权利要求3的方法，其中该透明无机凝胶基质包括硅胶、硼酸盐、TiO₂、Al₂O₃、ZrO₂或其组合。

5.权利要求3的方法，其中该透明有机聚合物凝胶基质包括聚乙烯醇、聚酯、聚酰亚胺、聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚烯烃、聚碳酸酯或其组合。

6.权利要求3的方法，其中该透明混杂无机-有机凝胶基质包括硅胶、硼酸盐、TiO₂、Al₂O₃、ZrO₂、聚乙烯醇、聚酯、聚酰亚胺、聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚烯烃、聚碳酸酯或其组合。

7.权利要求1的方法，其中该样品管包括有机聚合材料，该有机聚合材料包括包含聚乙二醇、聚环氧乙烷的聚甲基丙烯酸甲酯；聚丙烯酰胺、或其组合。

8.权利要求1的方法，其中该样品管包括无机材料，该无机材料包括玻璃、陶瓷材料、金属、金属合金、金属氧化物、复合金属氧化物或其组合。

9.用于测定样品中一种或多种微生物的浓度的设备，包括：

（a）由有机聚合材料、无机材料或其组合制成的样品管，其中该样品管还包括：

样品入口；

在该样品管内的过滤器，其中该样品管包括在该样品入口和该过滤器之间的任选的试剂入口或连接到在该过滤器和报道分子区域之间的任选的阀的任选的清洁性缓冲液入口；和

在该过滤器和出口之间的报道分子区域，其中该报道分子区域包括包含荧光素-荧光素酶络合物的透明多孔基质；

（b）与该报道分子区域连接以检测来自该报道分子区域的一个或多个光响应的检测器，其中该一个或多个光响应是由一种或多种滤出液与该荧光素-荧光素酶络合物的相互作用提供的；和

（c）与该检测器连接以测定该一种或多种微生物在该样品中的浓度的分析仪，其中该一种或多种微生物包括一种或多种细菌、一种或多种真菌、一种或多种古细菌、一种或多种原生生物或其组合。

10.权利要求9的设备，其中该检测器包括照相机、硅光电池或光电倍增管或其组合。

11.权利要求9的设备，其中将该荧光素-荧光素酶络合物固定在包含荧光素-荧光素酶络合物的该透明多孔基质上或封装在其内，该透明多孔基质包括透明无机凝胶基质、透明有机聚合物凝胶基质、透明混杂无机-有机凝胶基质或其组合。

12.权利要求11的设备，其中该透明无机凝胶基质包括硅胶、硼酸盐、TiO₂、Al₂O₃、ZrO₂或其组合。

13.权利要求11的设备，其中该透明有机聚合物凝胶基质包括聚乙烯醇、聚酯、聚酰亚胺、聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚烯烃、聚碳酸酯或其组合。

14.权利要求11的设备，其中该透明混杂无机-有机凝胶基质包括硅胶、硼酸盐、TiO₂、Al₂O₃、ZrO₂、聚乙烯醇、聚酯、聚酰亚胺、聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚烯烃、聚碳酸酯或其组合。

15.用于测定样品中一种或多种微生物的浓度的设备，包括：

（a）样品管，包括：

样品入口；

在该样品管内的过滤器；和

在该过滤器和出口之间的报道分子区域，其中该报道分子区域包括包含荧光素-荧光素酶络合物的透明多孔基质；

（b）与该报道分子区域连接以检测来自该报道分子区域的一个或多个光响应的检测器，其中该一个或多个光响应是由一种或多种滤出液与该荧光素-荧光素酶络合物的相互作用提供的；和

（c）与该检测器连接以测定该一种或多种微生物在该样品中的浓度的分析仪。