WO2019004400A1 - 齲蝕の有無又はその発症リスクの判定方法及びバイオマーカー - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a method and biomarker for determining the presence of caries or the risk of caries.
- the cause of dental caries is oral bacteria.
- the mutans microbe is known as a representative pathogen of oral bacteria that causes dental caries.
- mutans bacteria alone can not explain the pathogenesis of caries, and it is necessary to consider caries as a multi-microbial infection involving oral bacteria other than mutans bacteria.
- caries In general, caries is often noticed by subjective symptoms such as tooth pain and tooth sore. However, at the time of occurrence of subjective symptoms, caries have progressed, and it may be necessary to cut the carious part greatly or it may be necessary to extract the worst. Therefore, it is important to detect caries early and treat it appropriately before the onset of symptoms. However, finding caries in the absence of symptoms is difficult for a dental professional. Therefore, a method that can easily evaluate the presence or absence of caries is desired.
- Patent Document 1 is a method for assisting in the diagnosis of the tendency of caries. That is, it has not been described that it can be used again to determine whether or not a patient has a caries tooth for a person who has been treated for caries even once.
- An object of the present invention is to provide a method of easily determining the presence or absence of caries or the risk of caries regardless of the experience of caries.
- the amount of the Neisseria bacteria, the Moraxella bacteria, or the Granulikella bacteria is less than the abundance ratio or amount of the marker bacteria to the total bacteria in the biological sample collected from a healthy person, or the Campylobacter genus
- There is a high risk of caries when there are many bacteria said Bayonella spp., Said Treponema spp. Bacteria, said Alloprebella spp.
- the marker bacterium is a group consisting of the Bayonella bacteria, the Neisseria bacteria, the Moraxella bacteria, the Granulicatera bacteria, the Tannera bacteria, the Lacnoanaelobacrum bacteria, and the Megasphaella bacteria.
- the marker bacteria is a combination of the Campylobacter bacteria and the Bayyonera bacteria, a combination of the Bayyonera bacteria and the Treponema bacteria, a combination of the Alloprevella bacteria and the Dialister bacteria, the Bayyonella bacteria
- the method according to any one of the above [1] to [4] which determines that the caries risk is high when the following condition (1) is satisfied.
- At least one of the genus bacteria is at least 0.03%.
- Setting (1) A combination of bacteria selected from the group consisting of Campylobacter bacteria, Bayonella bacteria, and Treponema bacteria, and the number of marker bacteria satisfying the abundance ratio defined in the condition (1) is one or more. .
- Setting (2) Campylobacter bacteria, Bayyonera bacteria, Treponema bacteria, Neisseria bacteria, Moraxella bacteria, Granulicatella bacteria, Alloprebotella bacteria, Dialister bacteria, Tannera bacteria, Lacnoanaelobacram bacteria, and A combination of bacteria selected from the group consisting of Megasphaella bacteria, wherein the number of marker bacteria satisfying the abundance ratio defined in the condition (1) is 6 or more.
- Setting (3) A combination of bacteria selected from the group consisting of Moraxella spp., Granulicella spp. Bacteria, and Allopterella spp. Bacteria, and the number of marker bacteria satisfying the abundance ratio defined in the above condition (1) is 2 or more .
- Setting (4) A combination of bacteria selected from the group consisting of Moraxella spp., Granulicella spp. Bacteria, Alloprotella spp. Bacteria, Dialister spp. Bacteria, and Tannera spp. Bacteria, and the abundance ratio defined in the condition (1) The number of marker bacteria that meet 3 or more.
- Setting (5) A combination of bacteria selected from the group consisting of Moraxella bacteria, Granulicola ella bacteria, Alloprotella bacteria, Dialister bacteria, Tannera bacteria, Lacnoanaelobacrum bacteria, and Megasphaella bacteria, The number of marker bacteria satisfying the abundance ratio defined in the condition (1) is 4 or more.
- a combination of bacteria selected from the group consisting of Bayonella bacteria, Treponema bacteria, Neisseria bacteria, Moraxella bacteria, and Granulicola tera bacteria, and satisfying the abundance ratio defined in the condition (1).
- the number of marker bacteria is 2 or more.
- [7] A method for measuring the proportion or amount of marker bacteria to total bacteria in a biological sample collected from a subject, in order to determine the presence or absence of untreated carious teeth in the subject, wherein the marker bacteria is Gateibacterium, Actinobacillus, Orybacterium, Atopobacterium, Aikenobia, Eikenera, Paraprebotella, Capnosite Ferga, Arthrobacter, Synergystes, Actinomyces A method which is at least one selected from the group consisting of genus bacteria, mycoplasma genus bacteria, and Squardvia genus bacteria.
- the marker bacterium is selected from the group consisting of Orybacterium bacteria, Arthrobacter bacteria, Paraprebotella bacteria, Actinobacillus bacteria, Agrigibacter bacteria, and Capnocytophaga bacteria.
- the method according to the above [7] or [8], which is at least one of [10] The method according to any one of the above [7] to [9], wherein it is determined that there is an untreated carious tooth when the following condition (2) is satisfied.
- the abundance ratio of the agglutiobacter bacteria is 0.3% or less, the abundance ratio of the actinobacterium bacteria is 0.05% or less, the abundance ratio of the orybacterium bacteria is 0.07 % Or less, the abundance ratio of the atopovium bacteria is 0.5% or less, the abundance ratio of the Eikenella bacteria is 0.05% or less, the abundance ratio of the paraprevotera bacteria is 0.03% or less, the capnocyte fur
- the abundance ratio of bacillus bacteria is 0.6% or less
- the abundance ratio of the Arthrobacter bacteria is 0.03% or less
- the abundance ratio of the synergistes bacteria is 0.03% or less
- the actinomyces bacteria The presence ratio is at least one of 2% or less, the presence ratio of Mycoplasma bacteria is 0.03% or less, and the presence ratio of Scardia bacteria is 0.03% or less.
- Agglutibacter bacteria Atopobium bacteria, Eikenera bacteria, Capnocytophaga bacteria, Synergistes bacteria, Actinomyces bacteria, Mycoplasma bacteria, and Scardia bacteria It is a combination of bacteria to be selected, and the number of marker bacteria satisfying the abundance ratio defined in the condition (2) is 6 or more.
- the biological sample is a sample collected from the oral cavity.
- the sample is saliva, plaque, tartar, tongue or gum exudate.
- a biomarker for determining the risk of dental caries in a subject comprising Campylobacter bacteria, Bayyonella bacteria, Treponema bacteria, Neisseria bacteria, Moraxella bacteria, Granulicatella bacteria, Alloprebotella bacteria, Diarister bacteria, A biomarker comprising at least one marker bacterium selected from the group consisting of Tannera bacteria, Lactoanaerobacum bacteria, and Megasphaella bacteria, or a component derived from the marker bacterium.
- a biomarker for the determination of the presence or absence of untreated caries of a subject the bacteria being aggregative bacteria, actinobacillus, oribacillus, atopobium, aikenella, paraprevotera, , At least one marker bacteria selected from the group consisting of Capnocytophaga bacteria, Arthrobacter bacteria, Synergistes bacteria, Actinomyces bacteria, Mycoplasma bacteria, and Scardobia bacteria, or the marker bacteria Biomarkers containing components derived from bacteria.
- the biomarkers for judging the risk of dental caries of the subject Campylobacter bacteria, Bayyonella bacteria, Treponema bacteria, Neisseria bacteria, Moraxella bacteria, Granulicatella bacteria, Alloprebotella bacteria, Diarister bacteria, Tannera From the primer pair, the probe, and the microarray on which the probe is immobilized, which is capable of detecting the 16S rRNA gene of at least one marker bacterium selected from the group consisting of genus bacteria, lactobacilli and megasphaella bacteria
- a detection kit comprising one or more selected from the group consisting of [17] Aggregatibacter bacteria, Actinobacillus bacteria, Orybacterium bacteria, Atopobacterium bacteria, Aikenera bacteria, Paraprevotera bacteria, Capnobacterium, Capnobacteria, which are biomarkers for determination of untreated caries of a subject
- the "sensitivity” refers to a ratio in which a subject is determined to have a high risk of caries or a ratio in which a subject having an untreated dental caries by dental diagnosis is determined to have an untreated dental caries.
- the “specificity” refers to the percentage that determines that the subject has a low risk of caries, or the percentage that determines that a subject who does not have an untreated dental caries by dental diagnosis has no untreated dental caries.
- the “bacterial abundance ratio” refers to the abundance ratio of the bacteria to be evaluated to the total number of bacteria contained in the biological sample (number ratio number / number).
- untreated refers to a state in which the treatment is not completely cured, and is a concept encompassing both in-treatment and before-treatment states.
- “Caries risk” is an index of the subject's susceptibility to caries, and is an index considered to have a caries risk or likely to become caries in the future, and it is not necessary to treat untreated caries. It is not limited to the indicator of the presence or absence of
- the method of determining the caries risk of the present invention is a method of measuring the proportion or amount of marker bacteria in a biological sample collected from a subject in order to determine the caries risk of the subject. Also, the method of the present invention measures the abundance ratio or amount of marker bacteria in a biological sample collected from a subject and compares it with the abundance ratio or amount of marker bacteria to total bacteria in a biological sample collected from a healthy subject. It is also a way to determine the caries risk.
- the method of the present invention can be used as a method of judging caries risk which is performed prior to examination by a dentist or dental hygienist.
- the time required for screening of patients who are at risk of caries in mass screening etc. by conducting examinations by a dentist and a dental hygienist on subjects who are judged to have a high risk of caries by the method of the present invention Can be shortened. They can also teach oral care according to the caries risk.
- the biological sample is preferably a sample collected from the oral cavity, more preferably saliva, plaque, tartar, tongue or gum exudate, and even more preferably saliva.
- the saliva includes non-stimulatory saliva and stimulating saliva, either of which may be used. However, non-stimulating saliva is preferred in view of performing a mass examination.
- non-stimulated saliva for example, there is a method of collecting saliva as it is, a method of containing distilled water or the like in the mouth, lightly rinsing, and collecting it as a discharge liquid containing saliva.
- a method of collecting stimulated saliva for example, there is a method of promoting secretion of saliva by collecting paraffin gum or the like to collect it. After taking a biological sample, if it is not used immediately for analysis, it needs to be stored at low temperature (eg, ice temperature). If left at room temperature, bacteria grow and it becomes impossible to analyze the proportion and amount of bacteria correctly.
- the abundance ratio or amount of marker bacteria to total bacteria in a biological sample can be relatively determined using the abundance ratio or amount of components specific to each bacterium.
- the specific component is not particularly limited, and examples thereof include genes, proteins and peptides, with genes being preferred.
- Examples of the gene include DNA, RNA and the like, DNA is preferable, and ribosomal RNA (rRNA) gene is more preferable.
- rRNA ribosomal RNA
- rRNA 16SrRNA, 5SrRNA, 26SrRNA etc. are mentioned.
- rRNA is a small subunit of ribosome, this ribosome is a vital organ for protein synthesis, so it is resistant to evolutionary mutation and has a common gene sequence in all bacteria.
- rRNA also contains a sequence more specific to bacteria, not only total bacterial count, but also bacterial specific quantification and identification of bacterial species can be performed by using 16S rRNA gene. Sequence information of the 16S rRNA gene of each marker bacterium can be obtained from public databases such as DDBJ, NCBI, and Ribosomal Database Project.
- the number of marker bacteria in the biological sample and the number of total bacteria is more specific than the 16S rRNA gene Measurement by quantitative PCR of a region (target region) including a dynamic region (V1 to V9 region, preferably V1 or V2 region), or using a gene amplification product of the target region (preferably V1 or V2 region),
- a region including a dynamic region (V1 to V9 region, preferably V1 or V2 region)
- V1 to V9 region preferably V1 or V2 region
- a gene amplification product of the target region preferably V1 or V2 region
- any primer designed from a conserved region of 16S rRNA for example, a primer set comprising a combination of a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 1 and a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 2
- a method of analyzing and measuring a gene amplification product of a region including a target region (for example, V1, V2 region) with a next-generation sequencer is preferable.
- the method of extracting DNA is not particularly limited, and may be a chemical or biochemical lysis method or a method of physically disrupting the cell wall, or a combination thereof.
- saliva is collected as a spouted liquid which has been rinsed for about 10 seconds with 3 mL of distilled water.
- the collected saliva is immediately ice-cooled.
- bacteria contained in saliva are centrifuged at 10000 G for 10 minutes and collected as a centrifugal sedimentation.
- Bacterial DNA is extracted from the collected bacteria using a DNA extraction kit (next tec 1- Step DNA Isolation Kit for Bacteria, manufactured by Toho).
- the collected DNA is stored at -80.degree. C. as required.
- the sequence of the amplified gene was analyzed targeting the V1 to V2 region of the 16S ribosomal DNA of the extracted bacterial DNA, and the sequence of 3000 bacterial DNAs was analyzed. Can be analyzed to identify the type of bacteria, and the abundance ratio can be determined.
- Marker bacteria that can be used as biomarkers for determining the risk of dental caries in subjects include Campylobacter bacteria, Bayonella bacteria, Treponema bacteria, Neisseria bacteria, Moraxella bacteria, Granulicatella bacteria, Alloprebotella bacteria, Diarister bacteria, At least 1 sort (s) selected from the group which consists of Tannera bacteria, Lachnoanaerobaclam bacteria, and Megasphaella bacteria is mentioned.
- the method of the present invention measures the abundance ratio or amount of marker bacteria to total bacteria in a biological sample collected from a subject, and compares it to the abundance ratio or amount of marker bacteria to total bacteria in a biological sample collected from a healthy subject.
- Aspect (1) At least one selected from the group consisting of Bayonella spp., Neisseria spp. Bacteria, Moraxella spp. Bacteria, Granulicatella spp. Bacteria, Tannera spp. Bacteria, Lacnoanaelobacrum spp., And Megasphaella spp.
- the above marker bacteria are used as a biomarker for determining the risk of caries of a subject, for example, it can be determined as "high in the risk of caries" as follows. First, the abundance ratio of marker bacteria to all bacteria (individuals / individual, the same applies hereinafter) is measured. Next, the threshold value set for each marker bacterium is compared with the measured ratio of marker bacteria. Then, when the measured presence ratio of marker bacteria satisfies the condition below or above the threshold value set for each marker bacteria, it is determined as “positive”. Finally, depending on the number of marker bacteria that became positive, it can be determined that "the risk of caries is high”. In addition, the number of marker bacteria which corresponded to positive can be arbitrarily changed according to sensitivity or specificity.
- the threshold value of the abundance ratio of marker bacteria set for each marker bacterium is, for example, the abundance ratio of marker bacteria of a healthy person who has been measured in advance (for example, a person who is confirmed beforehand to have no caries experienced teeth) Alternatively, it can be specified by amount (normal control). More specifically, examples of the range of the threshold include the following condition (1A).
- the threshold value of the abundance ratio is set in the following range; the abundance ratio of Campylobacter bacteria is 0.35 to 0.55%, the abundance ratio of Bayionella bacteria is 2.5 to 3%, Treponema bacteria The abundance ratio of 0.01 to 0.1%, the abundance ratio of Neisseria bacteria is 16 to 20%, the abundance ratio of Moraxella bacteria is 0.01 to 0.1%, and the abundance ratio of Granuricella bacteria is 2.
- the abundance ratio of Aloprevolate bacteria is 0.3 to 0.5%
- the abundance ratio of Diarister bacteria is 0.01 to 0.08%
- the abundance ratio of Tannera bacteria is 0.03 0.1%
- the abundance ratio of Lactoanaerobacrum bacteria is 0.03 to 0.1%
- the abundance ratio of Megasphaella bacteria is 0.01 to 0.1%.
- the range of the threshold is outside the range of the condition (1A)
- the sensitivity and specificity may be lowered, which may affect the reliability of the test.
- the marker bacteria for Neisseria bacteria, Moraxella bacteria, Granulicatera bacteria, the case where the abundance ratio is below the threshold is determined as “positive”, and for the other bacteria, the presence ratio is greater than the threshold. Determined as "positive”.
- the control may be a carious person instead of a healthy person (carious person control). In that case, positive and negative criteria will be exchanged.
- the abundance ratio of Campylobacter bacteria is 0.43% or more
- the abundance ratio of Bayonella bacteria is 2.7% or more
- the abundance ratio of Treponema bacteria Is 0.03% or more
- the abundance ratio of Neisseria bacteria is 18% or less
- the abundance ratio of Moraxella bacteria is 0.03% or less
- the abundance ratio of Granulithera bacteria is 2.5% or less
- the abundance ratio of Alloprevotera bacteria Is 0.35% or more
- the abundance ratio of Dialister bacteria is 0.05% or more
- the abundance ratio of Tannera bacteria is 0.05% or more
- the abundance ratio of Lachnoanaerobaclam bacteria is 0.05% or more
- the abundance ratio of Megasphaella bacteria is 0.03% or more.
- the number of marker bacteria corresponding to positive may be at least one, and may be set to determine that "the caries risk is high" when two or more, three or more, four or more, and the like.
- the method of the present invention can be used as a method for determining the caries risk, it is preferable to reduce the oversight of subjects having a high risk of caries. Therefore, it is preferable to set the number of marker bacteria corresponding to positive so that the sensitivity value can be increased. From the results of the examples described later, when raising the numerical values of sensitivity and specificity, for example, there is a setting of determining that “the caries risk is high” if the following settings (1) to (6) are satisfied.
- Setting (1) A combination of bacteria selected from the group consisting of Campylobacter bacteria, Bayonella bacteria, and Treponema bacteria, and the number of marker bacteria corresponding to positive is one or more.
- Setting (2) Campylobacter bacteria, Bayyonera bacteria, Treponema bacteria, Neisseria bacteria, Moraxella bacteria, Granulicatella bacteria, Alloprebotella bacteria, Dialister bacteria, Tannera bacteria, Lacnoanaelobacram bacteria, and A combination of bacteria selected from the group consisting of Megasphaella bacteria, wherein the number of positively marking marker bacteria is 6 or more.
- Setting (3) A combination of bacteria selected from the group consisting of Moraxella bacteria, Granulicola ella bacteria, and Allopterella bacteria, and the number of marker bacteria that are positive is two or more.
- Setting (4) A combination of bacteria selected from the group consisting of Moraxella spp., Granulicella spp. Bacteria, Alloprotella spp. Bacteria, Dialister spp. Bacteria, and Tannera spp. Bacteria, and the number of marker bacteria corresponding to positive is three. that's all.
- Setting (5) A combination of bacteria selected from the group consisting of Moraxella bacteria, Granulicola ella bacteria, Alloprotella bacteria, Dialister bacteria, Tannera bacteria, Lacnoanaelobacrum bacteria, and Megasphaella bacteria, The number of marker bacteria corresponding to positive is 4 or more.
- Setting (6) A combination of bacteria selected from the group consisting of Bayonella bacteria, Treponema bacteria, Neisseria bacteria, Moraxella bacteria, and Granulicarella bacteria, and the number of positively marking marker bacteria is two or more. .
- the method for determining an untreated carious tooth of the present invention is a method of measuring the abundance ratio or amount of marker bacteria in a biological sample collected from a subject in order to determine the presence or absence of an untreated carious tooth of the subject.
- the method of the present invention also measures the abundance ratio or amount of marker bacteria in a biological sample collected from a subject and compares it with the abundance ratio or amount of marker bacteria in a biological sample collected from a healthy individual. It is also a method to determine the presence or absence of carious teeth for treatment.
- the method of the present invention can be used as a method for determining the presence or absence of an untreated carious tooth, which is performed prior to examination by a dentist or dental hygienist.
- a dentist or dental hygienist examines a subject who is judged to have an untreated caries tooth after the fact, and the subject feels a subjective symptom when actually having a carious tooth
- the carious tooth may be treated at a previous stage.
- the contents are the same as the contents described in “1. Caries risk test method” except that the type and presence ratio or amount of marker bacteria are different.
- Marker bacteria that can be used as biomarkers for determining the presence or absence of untreated dental caries of a subject include Agglytobacter bacteria, Actinobacillus bacteria, Orybacterium bacteria, Atopobium bacteria, Aikenera bacteria, Paraprevotera bacteria It is at least one selected from the group consisting of bacteria, Capnocytophaga bacteria, Arthrobacter bacteria, Synergystes bacteria, Actinomyces bacteria, Mycoplasma bacteria, and Scardobia bacteria.
- the method of the present invention measures the abundance ratio or amount of marker bacteria to total bacteria in a biological sample collected from a subject, and compares it to the abundance ratio or amount of marker bacteria to total bacteria in a biological sample collected from a healthy subject.
- marker bacteria are found to have high sensitivity values in the examples described later, Orybacterium bacteria, Arthrobacter bacteria, Paraprebotella bacteria, Actinobacillus bacteria, Agrigibacter bacteria, and It is preferable that it is at least 1 sort (s) selected from the group which consists of Capnocytophaga genus bacteria.
- the above marker bacteria are used as a biomarker for the determination of the presence or absence of untreated dental caries of a subject, for example, it can be determined as "presence of untreated dental caries" as follows. First, the abundance ratio of marker bacteria to all bacteria (individuals / individual, the same applies hereinafter) is measured. Next, the threshold value set for each marker bacterium is compared with the measured ratio of marker bacteria. Then, when the measured presence ratio of marker bacteria satisfies the condition below or above the threshold value set for each marker bacteria, it is determined as “positive”. Finally, depending on the number of marker bacteria that were found to be positive, it may be determined as "presence of untreated caries".
- the threshold value of the abundance ratio of marker bacteria set for each marker bacterium is, for example, the presence of marker bacteria of a healthy person who has been measured in advance (for example, a person who is previously confirmed to have no untreated dental caries). It can be specified by ratio or amount (normal control). More specifically, the range of the threshold includes, for example, the following condition (2A). Condition (2A): The threshold value of the abundance ratio is set in the following range; the abundance ratio of aggregative bacteria is 0.2 to 0.35%, the abundance ratio of actinobacillus bacteria is 0.03 to 0. 1%, the abundance ratio of A.
- oryzae bacteria is 0.03 to 0.1%
- the abundance ratio of Atopobium bacteria is 0.3 to 0.7%
- the abundance ratio of E. coli bacteria is 0.03 to 0. 06%
- the abundance ratio of Paraprevotella bacteria is 0.01 to 0.06%
- the abundance ratio of Capnocytophaga bacteria is 0.4 to 0.7%
- the abundance ratio of Arthrobacter bacteria is 0. 01 to 0.8%
- the abundance ratio of synergistes bacteria is 0.01 to 0.06%
- the abundance ratio of Actinomyces bacteria is 1.5 to 3%
- the abundance ratio of Mycoplasma bacteria is 0.01 to 0.05% or less
- the presence of Scardbia bacteria The present ratio is 0.01 to 0.05%.
- the sensitivity and specificity may be low, which may affect the reliability of the test.
- the control may be a carious person instead of a healthy person (carious person control). In that case, positive and negative criteria will be exchanged.
- the abundance ratio of aggregative bacteria is 0.3% or less, the abundance ratio of actinobacillus bacteria is 0.05% or less, Oliobacterium Of Aumobacterium is 0.07% or less, 0.5% or less of Atopovium bacteria, 0.05% or less of Aikenera bacteria, 0.03% of Paraprebotella bacteria
- the abundance ratio of Capnocytophaga bacteria is 0.6% or less
- the abundance ratio of Arthrobacter bacteria is 0.03% or less
- the abundance ratio of Synergistes bacteria is 0.03% or less
- Actinomyces The presence ratio of genus bacteria is 2% or less, the presence ratio of mycoplasma bacteria is 0.03% or less, and the ratio of presence of Scardia bacteria is 0.03% or less.
- the number of marker bacteria corresponding to the positive should be at least one, and it may be set to determine that there is an untreated dental caries when there are three or more, four or more, five or more, etc. Good.
- the method of the present invention can be used as a method for determining the presence or absence of an untreated carious tooth, it is preferable to reduce the oversight of a subject having an untreated carious tooth. Therefore, it is preferable to set the number of marker bacteria corresponding to positive so that the sensitivity value can be increased. From the results of the examples described later, when raising the numerical values of sensitivity and specificity, for example, a setting that determines “presence of untreated dental caries” may be mentioned if the following settings (1) to (3) are satisfied. .
- Setting (1) A combination of bacteria selected from the group consisting of Agrigytobacter bacteria, Actinobacillus bacteria, Eikenera bacteria, Paraprebotella bacteria, and Synergystes bacteria, and all marker bacteria that are positive are all positive.
- Setting (2) Agglutiobacter bacteria, Actinobacillus bacteria, Orybacterium bacteria, Eikenera bacteria, Paraprebotella bacteria, Capnocytophaga bacteria, Arthrobacter bacteria, and Synergistes bacteria
- Agglutibacter bacteria Atopobium bacteria, Eikenera bacteria, Capnocytophaga bacteria, Synergistes bacteria, Actinomyces bacteria, Mycoplasma bacteria, and Scardia bacteria It is a combination of bacteria to be selected, and the number of marker bacteria corresponding to positive is six or more.
- the biomarker of the present invention is at least one marker bacterium or a component derived therefrom, which is used to determine the presence or absence of an untreated caries tooth or the risk of caries of a subject.
- By measuring the abundance ratio or amount of the biomarker of the present invention in a biological sample collected from a subject it is possible to determine the presence or absence of untreated carious teeth in the subject or the caries risk.
- Determination method of caries risk or [2. It is preferable to use the method described in the above]. For example, DNA specific to each bacterium is extracted, and an artificial operation such as analysis of rRNA gene is performed to measure the identification of bacteria and the abundance ratio or amount in a biological sample.
- the biomarker of the present invention has been found to be applicable as an indicator for determining the presence or absence of an untreated caries tooth or the caries risk using measurement results.
- Biomarkers for the determination of caries risk include Campylobacter bacteria, Bayyonera bacteria, Treponema bacteria, Neisseria bacteria, Moraxella bacteria, Granulicatera bacteria, Allopebotella bacteria, Dialister bacteria, Tannera bacteria, Lacnoanaelobaclam And at least one marker bacteria selected from the group consisting of genus bacteria, and bacteria belonging to the genus Megasphaella, or components derived therefrom.
- Biomarkers for the determination of untreated dental caries include aggregative bacteria, Actinobacillus bacteria, Orybacterium bacteria, Atopobium bacteria, Eikenella bacteria, Paraprebotella bacteria, Capnocytophaga bacteria, At least one marker bacterium selected from the group consisting of Arthrobacter bacteria, Synergystes bacteria, Actinomyces bacteria, Mycoplasma bacteria, and Scardia bacteria, or a component derived therefrom. The details of each bacterium are described below.
- Campylobacter bacteria examples include Campylobacter Lectus, Campylobacter gracillas, Campylobacter consiss, Campylobacter shoae, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Campylobacter fetus, and the like.
- bayonella bacteria examples include bayonera aticica, bayonera parvula, bayonera alcareces, and bayonella dispers and the like.
- Treponema bacteria Treponema bacteria, such as Treponema denticola, Treponema sokranski, Treponema pecchi novolam etc. may be mentioned.
- Neisseria bacteria Bacterial species of Neisseria bacteria include Neisseria subflava, Neisseria shicca, Neisseria mucosa and the like.
- Moraxella bacteria As species of Moraxella genus bacteria, Moraxella catarrhalis, Moraxella lactata and the like can be mentioned.
- Granulica terra bacteria Bacterial species of Granulica terra bacteria include granulica terra adiasense and the like.
- Alloprevotella bacteria The species of Alloprevella spp. Bacteria include Alloprevella teraneae, Alloprevella teraba etc.
- Dialister bacteria The species of the bacteria of the genus Dialyster include Dialyster invisus, Dialyster pneumocinsus, and the like.
- Tanerella bacteria Bacterial species of the genus Tanerella bacteria include, but are not limited to, Tanerella Forsythia, Tanerella Forsytensis, and the like.
- Lactoanaerobacum bacteria Bacterial species of the Lactoanaerobacum genus bacteria include Lactoanaerobacum umeaens, Lactoanaelobacram oleares, Lactoanaerobacram subleum and the like.
- Megasphaella bacteria Bacterial species of the genus Megasphaella bacteria include Megasphaera cerevisae, Megasphaera elsdenii, Megasfaera micronusiformis, Megasfaera suesiensis, Megasfaera pavis boranus and the like.
- agglutibacter bacteria examples include agglutibacter actinomycetemcomitans and the like.
- Actinobacillus genus bacteria Actinobacillus genus bacteria species include Actinobacillus minar, Actinobacillus succinogenes, Actinobacillus actinomycetem comitans and the like.
- Orybacterium bacteria examples of bacteria of the genus Orybacterium include Orybacterium sinus and the like.
- Atopobium bacteria Bacterial species of Atopobium bacteria include Atopobium parvum, Atopobium limae, Atopobium vaginae and the like.
- Eikenella bacteria examples of species of Eikenera bacteria include Eikenella collodes.
- Paraprevotella bacteria Bacterial species of the Paraprebotella genus include Paraprevotera clara, Paraprevotera xylaniphila, and the like.
- Capnocytophaga bacteria examples of the species of Capnocytophaga bacteria include Capnocytophaga spitiga, Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga ochracea, and the like.
- Arthrobacter bacteria Bacterial species of the Arthrobacter bacteria include Arthrobacter davidanieri, Arthrobacter spy, Arthrobacter ureafaciens, Arthrobacter citreus and the like.
- Synergistes bacteria examples include Synergistes oral taxon 363 and Synergistes oral taxon 361.
- Actinomyces bacteria examples include Actinomyces naeslandi, Actinomyces viscosus, Actinomyces odontriticus, Actinomyces oris, and the like.
- mycoplasma bacteria examples include Mycoplasma salicylarum, Mycoplasma lipophilium, Mycoplasma genitalium and the like.
- Sukadbia genus bacteria examples include Sukadbia wigsiae and Sukadbia Inopinata.
- the component derived from the marker bacterium is a component specific to each marker bacterium, and may be a component capable of measuring the type and the abundance ratio of the marker bacterium from the amount thereof, for example, a nucleic acid (eg, DNA or RNA) And proteins, peptides and the like, DNA is preferable, and ribosomal RNA (rRNA) gene is more preferable.
- a nucleic acid eg, DNA or RNA
- rRNA ribosomal RNA
- rRNA ribosomal RNA
- rRNA ribosomal RNA
- 16SrRNA gene is preferable, at least one of the V1 to V9 regions of the 16S rRNA gene is more preferable, and either or both of the V1 and V2 regions are more preferable because analysis is easy.
- the detection kit is a primer pair, a probe, which can detect 16S rRNA of each marker bacteria which is a biomarker for judging the risk of caries teeth of a subject or a judgment of untreated caries teeth of the subject, and the probe
- a kit or means comprising one or more selected from the group consisting of a microarray on which is immobilized.
- the primer pair may be at least one and is preferably designed from a conserved region of 16S rRNA of bacteria.
- the base length and the sequence may be appropriately determined according to the gene amplification method such as PCR used for detection.
- the probe may be an oligonucleotide complementary to the base sequence of at least a part of the specific region (V1 to V9) of the 16S rRNA of each marker bacterium, and may be modified with a fluorescent substance or the like as necessary. .
- the probes may be immobilized on a substrate (the material is not limited).
- the detection kit may contain other reagents for use in detection of marker bacteria. For example, reagents (eg, DNA polymerase, enzymes such as restriction enzymes, fluorescent reagents, substrates such as dNTPs, coenzymes such as ATP), positive / negative control (eg, housekeeping gene) used according to amplification methods are mentioned.
- reagents eg, DNA polymerase, enzymes such as restriction enzymes, fluorescent reagents, substrates such as dNTPs, coenzymes such as ATP
- positive / negative control eg, housekeeping gene
- composition ratio The measurement of the abundance ratio of bacteria (hereinafter also referred to as “composition ratio”) was performed using “GS Junior bench top system” (manufactured by Roche Life Science). According to the manual of the instrument, the amplified gene sequence is analyzed targeting the V1 to V2 region of 16S ribosomal DNA of the extracted bacterial DNA, and the sequence of 3,000 bacterial DNAs is analyzed to identify the bacterial type, and the bacterial composition ratio ( We asked for%).
- CCATCTCCATCCCTGCGTGTTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNNNANNGT TYGTGGTCTCAG (SEQ ID NO: 1) as a forward primer (wherein N means A, C, G or T, M means A or C) , R means G or A, Y means T or C), and CCTATCCCCTGTGTCCTTGGCAGTCTCAGTGCTGCCTCCCGTAGGAGT (SEQ ID NO: 2) was used as a reverse primer.
- public databases CORE and RDP
- the difference in the average value of the composition ratio between two groups of subjects with 0 caries experienced teeth and 10 or more caries experienced teeth was compared and analyzed (Welch's t-test). The results are shown in Table 2.
- Campylobacter bacteria bacteria of the genus Filifactor, bacteria of the genus Neisseria, bacteria of the genus Veillonella, bacteria of the genus Scardovia, which are different in bacterial composition ratio in subjects with high dental caries and high numbers of dental caries who have high dental caries and subjects without dental caries.
- Extracted Treponema bacteria Alloprevotella bacteria, Tannerella bacteria, Lachnoanaerobaculum bacteria, Moraxella bacteria, Arthrobacter bacteria, Bifidobacterium bacteria, Synergistes bacteria, Granulicatella bacteria, Dialister bacteria, Megasphaera bacteria (Table 2 in the table) , P value less than 0.1 bacteria), marker candidate for caries risk It was selected in.
- bacteria with a composition ratio of bacteria less than 0.01% were judged to be unreliable in data, and were not included in the analysis.
- the threshold value of the bacterial composition ratio of each bacterium is set to the value shown in Table 3, and for Neisseria bacteria, Moraxella bacteria, and Granulicatella bacteria, when the composition ratio is larger than the threshold, it is determined as "low in caries risk”. And the case below the threshold was judged as "high caries risk”. For other bacteria, when the composition ratio was above the threshold, it was judged as “high in caries risk”, and when it was below the threshold, it was judged as "low in caries risk”.
- carious teeth in Table 3 also include completely cured caries.
- Veillonella bacteria Neisseria bacteria, Moraxella bacteria, Granulicatella bacteria, Tannerella bacteria, Tannerella bacteria, Lachnoanaerobaculum bacteria, Megasphaera bacteria are preferable, and Neisseria bacteria, Moraxella bacteria, Granulicatella bacteria, Megasphaera bacteria Bacteria may be more preferred.
- the threshold value of the bacterial composition ratio of each bacterium is 0.43% for Campylobacter bacteria, 2.7% for Bayonella bacteria, 0.03% for Treponema bacteria, 18% for Neisseria bacteria, and Moraxella bacteria. 0.03%, Granulicathera bacteria 2.5%, Alloprebotella bacteria 0.35%, Dialisterial bacteria 0.05%, Tannera bacteria 0.05%, Lachnoanaelobacrum bacteria 0 It was set at .05% and 0.03% for Megasphaella bacteria.
- composition ratio of bacteria Neisseria bacteria, Moraxella bacteria, and Granulicatella bacteria were judged as “negative” when the composition ratio was higher than the threshold, and “positive” when the composition ratio was below the threshold.
- the threshold value of the bacterial abundance ratio of each marker bacteria group is set, and the number of marker bacteria corresponding to positive is at least the minimum number shown in Table 5 and Table 6 It can be seen that sensitivity and specificity improve if it is judged that the risk is high.
- selection of markers 2 In order to select marker candidates that can detect the presence or absence of untreated caries teeth, grouping is performed as shown in Table 7 for 4 people who have untreated caries and 16 people who do not have untreated caries. did. In addition, in order to exclude the influence of the age, the number of caries experienced teeth, and the condition of the gum, it is an analysis between the groups with no significant difference in the age and the maximum probing pocket depth and the bleeding by probing. Also, the presence or absence of untreated caries of the subject is the result of examination by a dentist.
- the bacterial composition ratio in saliva was measured by the method described in (Selection of Markers 1) to determine the presence or absence of untreated carious teeth.
- Table 9 shows the results of diagnosis by each dentist of the presence or absence of untreated dental caries by the dentist and the determination results from the threshold value of the bacterial composition ratio of each bacterium.
- the threshold value of the bacterial composition ratio of each bacterium is set to a value shown in Table 9, and the case where the composition ratio is equal to or less than the threshold value is referred to as "presence of untreated dental caries (hereinafter may be referred to as" positive "). It was judged that the value was larger than the threshold value as "No treatment of untreated dental caries (hereinafter sometimes referred to as” negative ").
- Oribacterium bacteria, Arthrobacter bacteria, Paraprevotella bacteria, Actinobacillus bacteria, Aggregatibacter bacteria, Capnocytophaga bacteria can detect an untreated carious tooth with high sensitivity.
- the examination results are shown in Table 10.
- the threshold value of the bacterial composition ratio of each bacterium is 0.07% for Oribacterium bacteria, 0.03% for Arthrobacter bacteria, 0.03% for Paraprevotella bacteria, 0.05% for Actinobacillus bacteria, and Eikenella bacteria.
- the threshold value of each bacterial abundance ratio is set in each marker bacterial group, and when the number of bacteria positively determined is more than the minimum number shown in Table 10, it is determined as "presence of untreated dental caries". Then, it can be seen that the sensitivity and specificity are high.
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Abstract
齲蝕経験の有無にかかわらず、齲蝕の有無又は齲蝕リスクを簡易に判定する方法を提供することを課題とし、被験者の齲蝕リスクを判定するために、被験者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量を測定する方法であって、マーカー細菌が、カンピロバクター属細菌、ベイヨネラ属細菌、トレポネーマ属細菌、ナイセリア属細菌、モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、アロプレボテラ属細菌、ジアリスター属細菌、タンネラ属細菌、ラクノアナエロバクラム属細菌、及びメガスファエラ属細菌からなる群から選択される少なくとも１種等である方法。
Description
本発明は、齲蝕の有無又は齲蝕リスクの判定方法及びバイオマーカーに関する。
齲蝕の原因は、口腔細菌である。齲蝕の原因となる口腔細菌の代表的な病原菌として、ミュータンス菌が知られている。しかしながら、ミュータンス菌だけでは齲蝕の病因を説明することは出来ず、ミュータンス菌以外の口腔細菌が関与する複数菌感染症として齲蝕を考える必要がある。
齲蝕は、一般に歯の痛みや歯がしみる等の自覚症状で気付くことが多い。しかしながら、自覚症状が生じる時点では、齲蝕が進行してしまっており、齲蝕部位を大きく削る必要が生じる場合や、最悪抜歯する必要が生じる場合がある。そのため、自覚症状が生じる前の段階で、早期に齲蝕を発見し、適切に治療することが重要である。
しかしながら、自覚症状がない段階で齲蝕を発見することは、歯科専門家でなければ困難である。そこで、簡易に齲蝕の有無を評価できる方法が望まれている。
しかしながら、自覚症状がない段階で齲蝕を発見することは、歯科専門家でなければ困難である。そこで、簡易に齲蝕の有無を評価できる方法が望まれている。
齲蝕の予防には自身の齲蝕リスクを知り、定期的に歯科検診を受けることや歯磨等の口腔衛生を毎日適切に行うことが重要である。齲蝕リスクを評価する方法として、原因菌であるミュータンス菌を指標とした製品が市販されている。しかしながら、ミュータンス菌以外の菌については評価していないので、さらに検討の余地がある。
ミュータンス菌以外の菌として、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属等の菌を指標とした齲蝕のなりにくさの診断を補助する方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。
ミュータンス菌以外の菌として、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属等の菌を指標とした齲蝕のなりにくさの診断を補助する方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。
特許文献１に記載の方法は、齲蝕のなりにくさの診断を補助する方法である。すなわち、一度でも齲蝕の治療を行った人について、再度、齲蝕歯を有するかの判定に利用し得ることは記載されていない。
本発明の課題は、齲蝕経験の有無にかかわらず、齲蝕の有無又は齲蝕リスクを簡易に判定する方法を提供することである。
本発明者らは、上記課題について鋭意検討した結果、生体試料中に含まれる所定の細菌の存在比率又は量を測定することにより、上記の課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明者らは、下記の〔１〕～〔１７〕を提供する。
〔１〕被験者の齲蝕リスクを判定するために、被験者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量を測定する方法であって、前記マーカー細菌が、カンピロバクター属細菌、ベイヨネラ属細菌、トレポネーマ属細菌、ナイセリア属細菌、モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、アロプレボテラ属細菌、ジアリスター属細菌、タンネラ属細菌、ラクノアナエロバクラム属細菌、及びメガスファエラ属細菌からなる群から選択される少なくとも１種である方法。
〔２〕健常者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量と比較して、前記ナイセリア属細菌、前記モラクセラ属細菌、又は前記グラヌリカテラ属細菌が少ないか、或いは前記カンピロバクター属細菌、前記ベイヨネラ属細菌、前記トレポネーマ属細菌、前記アロプレボテラ属細菌、前記ジアリスター属細菌、前記タンネラ属細菌、前記ラクノアナエロバクラム属細菌、又は前記メガスファエラ属細菌が多いときに、齲蝕リスクが高いと判定する上記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記マーカー細菌が、前記ベイヨネラ属細菌、前記ナイセリア属細菌、前記モラクセラ属細菌、前記グラヌリカテラ属細菌、前記タンネラ属細菌、前記ラクノアナエロバクラム属細菌、及び前記メガスファエラ属細菌からなる群から選択される少なくとも１種である上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕前記マーカー細菌が、前記カンピロバクター属細菌と前記ベイヨネラ属細菌の組み合わせ、前記ベイヨネラ属細菌と前記トレポネーマ属細菌の組み合わせ、前記アロプレボテラ属細菌と前記ジアリスター属細菌の組み合わせ、前記ベイヨネラ属細菌と前記タンネラ属細菌の組み合わせ、前記タンネラ属細菌と前記ナイセリア属細菌の組み合わせ、又は前記トレポネーマ属細菌と前記ナイセリア属細菌の組み合わせである上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕下記条件（１）を満たすときに、齲蝕リスクが高いと判定する上記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の方法。
条件（１）：前記カンピロバクター属細菌の存在比率が０．４３％以上、前記ベイヨネラ属細菌の存在比率が２．７％以上、前記トレポネーマ属細菌の存在比率が０．０３％以上、前記ナイセリア属細菌の存在比率が１８％以下、前記モラクセラ属細菌の存在比率が０．０３％以下、前記グラヌリカテラ属細菌の存在比率が２．５％以下、前記アロプレボテラ属細菌の存在比率が０．３５％以上、前記ジアリスター属細菌の存在比率が０．０５％以上、前記タンネラ属細菌の存在比率が０．０５％以上、前記ラクノアナエロバクラム属細菌の存在比率が０．０５％以上、及び前記メガスファエラ属細菌の存在比率が０．０３％以上の少なくとも１つ。
〔６〕下記設定（１）～（６）のいずれかを満たすときに、齲蝕リスクが高いと判定する上記〔５〕に記載の方法。
設定（１）：カンピロバクター属細菌、ベイヨネラ属細菌、及びトレポネーマ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、前記条件（１）で規定する存在比率を満たすマーカー細菌の数が１つ以上。
設定（２）：カンピロバクター属細菌、ベイヨネラ属細菌、トレポネーマ属細菌、ナイセリア属細菌、モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、アロプレボテラ属細菌、ジアリスター属細菌、タンネラ属細菌、ラクノアナエロバクラム属細菌、及びメガスファエラ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、前記条件（１）で規定する存在比率を満たすマーカー細菌の数が６つ以上。
設定（３）：モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、及びアロプレボテラ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、前記条件（１）で規定する存在比率を満たすマーカー細菌の数が２つ以上。
設定（４）：モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、アロプレボテラ属細菌、ジアリスター属細菌、及びタンネラ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、前記条件（１）で規定する存在比率を満たすマーカー細菌の数が３つ以上。
設定（５）：モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、アロプレボテラ属細菌、ジアリスター属細菌、タンネラ属細菌、ラクノアナエロバクラム属細菌、及びメガスファエラ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、前記条件（１）で規定する存在比率を満たすマーカー細菌の数が４つ以上。
設定（６）：ベイヨネラ属細菌、トレポネーマ属細菌、ナイセリア属細菌、モラクセラ属細菌、及びグラヌリカテラ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、前記条件（１）で規定する存在比率を満たすマーカー細菌の数が２つ以上。
〔７〕被験者の未治療の齲蝕歯の有無を判定するために、被験者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量を測定する方法であって、前記マーカー細菌が、アグリゲイティバクター属細菌、アクチノバチルス属細菌、オリバクテリウム属細菌、アトポビウム属細菌、エイケネラ属細菌、パラプレボテラ属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、アルスロバクター属細菌、シネルギステス属細菌、アクチノマイセス属細菌、マイコプラズマ属細菌、及びスカードビア属細菌からなる群から選択される少なくとも１種である方法。
〔８〕健常者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量と比較して、前記マーカー細菌のいずれかが少ないときに、未治療の齲蝕歯が有ると判定する上記〔７〕に記載の方法。
〔９〕前記マーカー細菌が、オリバクテリウム属細菌、アルスロバクター属細菌、パラプレボテラ属細菌、アクチノバチルス属細菌、アグリゲイティバクター属細菌、及びカプノサイトファーガ属細菌からなる群から選択される少なくとも１種である上記〔７〕又は〔８〕に記載の方法。
〔１０〕下記条件（２）を満たすときに、未治療の齲蝕歯が有ると判定する上記〔７〕～〔９〕のいずれかに記載の方法。
条件（２）：前記アグリゲイティバクター属細菌の存在比率が０．３％以下、前記アクチノバチルス属細菌の存在比率が０．０５％以下、前記オリバクテリウム属細菌の存在比率が０．０７％以下、前記アトポビウム属細菌の存在比率が０．５％以下、前記エイケネラ属細菌の存在比率が０．０５％以下、前記パラプレボテラ属細菌の存在比率が０．０３％以下、前記カプノサイトファーガ属細菌の存在比率が０．６％以下、前記アルスロバクター属細菌の存在比率が０．０３％以下、前記シネルギステス属細菌の存在比率が０．０３％以下、前記アクチノマイセス属細菌の存在比率が２％以下、前記マイコプラズマ属細菌の存在比率が０．０３％以下、及び前記スカードビア属細菌の存在比率が０．０３％以下の少なくとも１つ。
〔１１〕下記設定（１）～（３）のいずれかを満たすときに、未治療の齲蝕歯が有ると判定する上記〔１０〕に記載の方法。
設定（１）：アグリゲイティバクター属細菌、アクチノバチルス属細菌、エイケネラ属細菌、パラプレボテラ属細菌、及びシネルギステス属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、前記条件（２）で規定する存在比率を満たすマーカー細菌が全て。
設定（２）：アグリゲイティバクター属細菌、アクチノバチルス属細菌、オリバクテリウム属細菌、エイケネラ属細菌、パラプレボテラ属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、アルスロバクター属細菌、及びシネルギステス属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、前記条件（２）で規定する存在比率を満たすマーカー細菌の数が７つ以上。
設定（３）：アグリゲイティバクター属細菌、アトポビウム属細菌、エイケネラ属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、シネルギステス属細菌、アクチノマイセス属細菌、マイコプラズマ属細菌、及びスカードビア属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、前記条件（２）で規定する存在比率を満たすマーカー細菌の数が６つ以上。
〔１２〕前記生体試料が、口腔内から採取した試料である上記〔１〕～〔１１〕のいずれかに記載の方法。
〔１３〕前記試料が、唾液、歯垢、歯石、舌苔又は歯肉滲出液である上記〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕被験者の齲蝕歯のリスク判定用バイオマーカーであって、カンピロバクター属細菌、ベイヨネラ属細菌、トレポネーマ属細菌、ナイセリア属細菌、モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、アロプレボテラ属細菌、ジアリスター属細菌、タンネラ属細菌、ラクノアナエロバクラム属細菌、及びメガスファエラ属細菌からなる群から選択される少なくとも１種のマーカー細菌、又は該マーカー細菌の由来成分を含むバイオマーカー。
〔１５〕被験者の未治療の齲蝕歯の有無の判定用バイオマーカーであって、アグリゲイティバクター属細菌、アクチノバチルス属細菌、オリバクテリウム属細菌、アトポビウム属細菌、エイケネラ属細菌、パラプレボテラ属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、アルスロバクター属細菌、シネルギステス属細菌、アクチノマイセス属細菌、マイコプラズマ属細菌、及びスカードビア属細菌からなる群から選択される少なくとも１種のマーカー細菌、又は該マーカー細菌の由来成分を含むバイオマーカー。
〔１６〕被験者の齲蝕歯のリスク判定用バイオマーカーである、カンピロバクター属細菌、ベイヨネラ属細菌、トレポネーマ属細菌、ナイセリア属細菌、モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、アロプレボテラ属細菌、ジアリスター属細菌、タンネラ属細菌、ラクノアナエロバクラム属細菌、及びメガスファエラ属細菌からなる群から選択される少なくとも１種のマーカー細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出し得る、プライマーペア、プローブ、及び前記プローブが固定されているマイクロアレイからなる群より選ばれる１以上を含む、検出キット。
〔１７〕被験者の未治療の齲蝕歯の判定用バイオマーカーである、アグリゲイティバクター属細菌、アクチノバチルス属細菌、オリバクテリウム属細菌、アトポビウム属細菌、エイケネラ属細菌、パラプレボテラ属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、アルスロバクター属細菌、シネルギステス属細菌、アクチノマイセス属細菌、マイコプラズマ属細菌、及びスカードビア属細菌からなる群から選択される少なくとも１種のマーカー細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出し得る、２以上のプライマーペア、プローブ、及び前記プローブが固定されているマイクロアレイからなる群より選ばれる１以上を含む、検出キット。
即ち、本発明者らは、下記の〔１〕～〔１７〕を提供する。
〔１〕被験者の齲蝕リスクを判定するために、被験者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量を測定する方法であって、前記マーカー細菌が、カンピロバクター属細菌、ベイヨネラ属細菌、トレポネーマ属細菌、ナイセリア属細菌、モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、アロプレボテラ属細菌、ジアリスター属細菌、タンネラ属細菌、ラクノアナエロバクラム属細菌、及びメガスファエラ属細菌からなる群から選択される少なくとも１種である方法。
〔２〕健常者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量と比較して、前記ナイセリア属細菌、前記モラクセラ属細菌、又は前記グラヌリカテラ属細菌が少ないか、或いは前記カンピロバクター属細菌、前記ベイヨネラ属細菌、前記トレポネーマ属細菌、前記アロプレボテラ属細菌、前記ジアリスター属細菌、前記タンネラ属細菌、前記ラクノアナエロバクラム属細菌、又は前記メガスファエラ属細菌が多いときに、齲蝕リスクが高いと判定する上記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記マーカー細菌が、前記ベイヨネラ属細菌、前記ナイセリア属細菌、前記モラクセラ属細菌、前記グラヌリカテラ属細菌、前記タンネラ属細菌、前記ラクノアナエロバクラム属細菌、及び前記メガスファエラ属細菌からなる群から選択される少なくとも１種である上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕前記マーカー細菌が、前記カンピロバクター属細菌と前記ベイヨネラ属細菌の組み合わせ、前記ベイヨネラ属細菌と前記トレポネーマ属細菌の組み合わせ、前記アロプレボテラ属細菌と前記ジアリスター属細菌の組み合わせ、前記ベイヨネラ属細菌と前記タンネラ属細菌の組み合わせ、前記タンネラ属細菌と前記ナイセリア属細菌の組み合わせ、又は前記トレポネーマ属細菌と前記ナイセリア属細菌の組み合わせである上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕下記条件（１）を満たすときに、齲蝕リスクが高いと判定する上記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の方法。
条件（１）：前記カンピロバクター属細菌の存在比率が０．４３％以上、前記ベイヨネラ属細菌の存在比率が２．７％以上、前記トレポネーマ属細菌の存在比率が０．０３％以上、前記ナイセリア属細菌の存在比率が１８％以下、前記モラクセラ属細菌の存在比率が０．０３％以下、前記グラヌリカテラ属細菌の存在比率が２．５％以下、前記アロプレボテラ属細菌の存在比率が０．３５％以上、前記ジアリスター属細菌の存在比率が０．０５％以上、前記タンネラ属細菌の存在比率が０．０５％以上、前記ラクノアナエロバクラム属細菌の存在比率が０．０５％以上、及び前記メガスファエラ属細菌の存在比率が０．０３％以上の少なくとも１つ。
〔６〕下記設定（１）～（６）のいずれかを満たすときに、齲蝕リスクが高いと判定する上記〔５〕に記載の方法。
設定（１）：カンピロバクター属細菌、ベイヨネラ属細菌、及びトレポネーマ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、前記条件（１）で規定する存在比率を満たすマーカー細菌の数が１つ以上。
設定（２）：カンピロバクター属細菌、ベイヨネラ属細菌、トレポネーマ属細菌、ナイセリア属細菌、モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、アロプレボテラ属細菌、ジアリスター属細菌、タンネラ属細菌、ラクノアナエロバクラム属細菌、及びメガスファエラ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、前記条件（１）で規定する存在比率を満たすマーカー細菌の数が６つ以上。
設定（３）：モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、及びアロプレボテラ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、前記条件（１）で規定する存在比率を満たすマーカー細菌の数が２つ以上。
設定（４）：モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、アロプレボテラ属細菌、ジアリスター属細菌、及びタンネラ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、前記条件（１）で規定する存在比率を満たすマーカー細菌の数が３つ以上。
設定（５）：モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、アロプレボテラ属細菌、ジアリスター属細菌、タンネラ属細菌、ラクノアナエロバクラム属細菌、及びメガスファエラ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、前記条件（１）で規定する存在比率を満たすマーカー細菌の数が４つ以上。
設定（６）：ベイヨネラ属細菌、トレポネーマ属細菌、ナイセリア属細菌、モラクセラ属細菌、及びグラヌリカテラ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、前記条件（１）で規定する存在比率を満たすマーカー細菌の数が２つ以上。
〔７〕被験者の未治療の齲蝕歯の有無を判定するために、被験者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量を測定する方法であって、前記マーカー細菌が、アグリゲイティバクター属細菌、アクチノバチルス属細菌、オリバクテリウム属細菌、アトポビウム属細菌、エイケネラ属細菌、パラプレボテラ属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、アルスロバクター属細菌、シネルギステス属細菌、アクチノマイセス属細菌、マイコプラズマ属細菌、及びスカードビア属細菌からなる群から選択される少なくとも１種である方法。
〔８〕健常者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量と比較して、前記マーカー細菌のいずれかが少ないときに、未治療の齲蝕歯が有ると判定する上記〔７〕に記載の方法。
〔９〕前記マーカー細菌が、オリバクテリウム属細菌、アルスロバクター属細菌、パラプレボテラ属細菌、アクチノバチルス属細菌、アグリゲイティバクター属細菌、及びカプノサイトファーガ属細菌からなる群から選択される少なくとも１種である上記〔７〕又は〔８〕に記載の方法。
〔１０〕下記条件（２）を満たすときに、未治療の齲蝕歯が有ると判定する上記〔７〕～〔９〕のいずれかに記載の方法。
条件（２）：前記アグリゲイティバクター属細菌の存在比率が０．３％以下、前記アクチノバチルス属細菌の存在比率が０．０５％以下、前記オリバクテリウム属細菌の存在比率が０．０７％以下、前記アトポビウム属細菌の存在比率が０．５％以下、前記エイケネラ属細菌の存在比率が０．０５％以下、前記パラプレボテラ属細菌の存在比率が０．０３％以下、前記カプノサイトファーガ属細菌の存在比率が０．６％以下、前記アルスロバクター属細菌の存在比率が０．０３％以下、前記シネルギステス属細菌の存在比率が０．０３％以下、前記アクチノマイセス属細菌の存在比率が２％以下、前記マイコプラズマ属細菌の存在比率が０．０３％以下、及び前記スカードビア属細菌の存在比率が０．０３％以下の少なくとも１つ。
〔１１〕下記設定（１）～（３）のいずれかを満たすときに、未治療の齲蝕歯が有ると判定する上記〔１０〕に記載の方法。
設定（１）：アグリゲイティバクター属細菌、アクチノバチルス属細菌、エイケネラ属細菌、パラプレボテラ属細菌、及びシネルギステス属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、前記条件（２）で規定する存在比率を満たすマーカー細菌が全て。
設定（２）：アグリゲイティバクター属細菌、アクチノバチルス属細菌、オリバクテリウム属細菌、エイケネラ属細菌、パラプレボテラ属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、アルスロバクター属細菌、及びシネルギステス属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、前記条件（２）で規定する存在比率を満たすマーカー細菌の数が７つ以上。
設定（３）：アグリゲイティバクター属細菌、アトポビウム属細菌、エイケネラ属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、シネルギステス属細菌、アクチノマイセス属細菌、マイコプラズマ属細菌、及びスカードビア属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、前記条件（２）で規定する存在比率を満たすマーカー細菌の数が６つ以上。
〔１２〕前記生体試料が、口腔内から採取した試料である上記〔１〕～〔１１〕のいずれかに記載の方法。
〔１３〕前記試料が、唾液、歯垢、歯石、舌苔又は歯肉滲出液である上記〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕被験者の齲蝕歯のリスク判定用バイオマーカーであって、カンピロバクター属細菌、ベイヨネラ属細菌、トレポネーマ属細菌、ナイセリア属細菌、モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、アロプレボテラ属細菌、ジアリスター属細菌、タンネラ属細菌、ラクノアナエロバクラム属細菌、及びメガスファエラ属細菌からなる群から選択される少なくとも１種のマーカー細菌、又は該マーカー細菌の由来成分を含むバイオマーカー。
〔１５〕被験者の未治療の齲蝕歯の有無の判定用バイオマーカーであって、アグリゲイティバクター属細菌、アクチノバチルス属細菌、オリバクテリウム属細菌、アトポビウム属細菌、エイケネラ属細菌、パラプレボテラ属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、アルスロバクター属細菌、シネルギステス属細菌、アクチノマイセス属細菌、マイコプラズマ属細菌、及びスカードビア属細菌からなる群から選択される少なくとも１種のマーカー細菌、又は該マーカー細菌の由来成分を含むバイオマーカー。
〔１６〕被験者の齲蝕歯のリスク判定用バイオマーカーである、カンピロバクター属細菌、ベイヨネラ属細菌、トレポネーマ属細菌、ナイセリア属細菌、モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、アロプレボテラ属細菌、ジアリスター属細菌、タンネラ属細菌、ラクノアナエロバクラム属細菌、及びメガスファエラ属細菌からなる群から選択される少なくとも１種のマーカー細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出し得る、プライマーペア、プローブ、及び前記プローブが固定されているマイクロアレイからなる群より選ばれる１以上を含む、検出キット。
〔１７〕被験者の未治療の齲蝕歯の判定用バイオマーカーである、アグリゲイティバクター属細菌、アクチノバチルス属細菌、オリバクテリウム属細菌、アトポビウム属細菌、エイケネラ属細菌、パラプレボテラ属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、アルスロバクター属細菌、シネルギステス属細菌、アクチノマイセス属細菌、マイコプラズマ属細菌、及びスカードビア属細菌からなる群から選択される少なくとも１種のマーカー細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出し得る、２以上のプライマーペア、プローブ、及び前記プローブが固定されているマイクロアレイからなる群より選ばれる１以上を含む、検出キット。
本発明によれば、齲蝕経験の有無にかかわらず、齲蝕の有無又は齲蝕リスクを簡易に判定する方法を提供することができる。
以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。
本明細書中、「感度」とは、被験者を齲蝕リスクが高いと判定する割合、又は歯科医師診断による未治療の齲蝕歯を有する被験者を未治療の齲蝕歯があると判定する割合をいう。「特異度」とは、被験者を齲蝕リスクが低いと判定する割合、又は歯科医師診断による未治療の齲蝕歯を有しない被験者を未治療の齲蝕歯がないと判定する割合をいう。「細菌の存在比率」とは、生体試料中に含まれる全細菌に対する評価対象の細菌の存在比率（個数比率 個／個）をいう。「未治療」とは、治療が完治していない状態をいい、治療中と治療前の両状態を包含する概念である。「齲蝕リスク」とは、被験者の齲蝕のなりやすさの指標となるものであり、齲蝕になったことがある又は今後齲蝕になる可能性が高いと考えられる指標であり、必ずしも未治療の齲蝕の有無の指標に限定されない。
本明細書中、「感度」とは、被験者を齲蝕リスクが高いと判定する割合、又は歯科医師診断による未治療の齲蝕歯を有する被験者を未治療の齲蝕歯があると判定する割合をいう。「特異度」とは、被験者を齲蝕リスクが低いと判定する割合、又は歯科医師診断による未治療の齲蝕歯を有しない被験者を未治療の齲蝕歯がないと判定する割合をいう。「細菌の存在比率」とは、生体試料中に含まれる全細菌に対する評価対象の細菌の存在比率（個数比率 個／個）をいう。「未治療」とは、治療が完治していない状態をいい、治療中と治療前の両状態を包含する概念である。「齲蝕リスク」とは、被験者の齲蝕のなりやすさの指標となるものであり、齲蝕になったことがある又は今後齲蝕になる可能性が高いと考えられる指標であり、必ずしも未治療の齲蝕の有無の指標に限定されない。
［１．齲蝕リスクの判定方法］
本発明の齲蝕リスクの判定方法は、被験者の齲蝕リスクを判定するために、被験者から採取した生体試料中のマーカー細菌の存在比率又は量を測定する方法である。また、本発明の方法は、被験者から採取した生体試料中のマーカー細菌の存在比率又は量を測定して、健常者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量と比較して、齲蝕リスクを判定する方法でもある。本発明の方法は、歯科医師や歯科衛生士による検査に先だって行う、齲蝕リスクの判定方法として利用し得る。本発明の方法により、齲蝕リスクが高いと判定された被験者を対象として、歯科医師や歯科衛生士が事後的に検査を行うことで、集団検診等での齲蝕リスクを有する患者のスクリーニングに要する時間を短くし得る。また、齲蝕リスクに応じた口腔ケアを指導し得る。
本発明の齲蝕リスクの判定方法は、被験者の齲蝕リスクを判定するために、被験者から採取した生体試料中のマーカー細菌の存在比率又は量を測定する方法である。また、本発明の方法は、被験者から採取した生体試料中のマーカー細菌の存在比率又は量を測定して、健常者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量と比較して、齲蝕リスクを判定する方法でもある。本発明の方法は、歯科医師や歯科衛生士による検査に先だって行う、齲蝕リスクの判定方法として利用し得る。本発明の方法により、齲蝕リスクが高いと判定された被験者を対象として、歯科医師や歯科衛生士が事後的に検査を行うことで、集団検診等での齲蝕リスクを有する患者のスクリーニングに要する時間を短くし得る。また、齲蝕リスクに応じた口腔ケアを指導し得る。
被験者は、性別や齲蝕経験の有無の区別はなく、未成年者と成年者のいずれであってもよい。
生体試料は、口腔内から採取した試料であることが好ましく、唾液、歯垢、歯石、舌苔又は歯肉滲出液であることがより好ましく、唾液であることがさらに好ましい。唾液は、非刺激唾液と刺激唾液とがあり、どちらを用いてもよい。但し、集団検診を行うことを鑑みると、非刺激唾液が好ましい。
非刺激唾液の採取方法としては、例えば、唾液をそのまま採取する方法や蒸留水等を口に含み、軽く濯いだ後、唾液を含む吐出液として採取する方法がある。刺激唾液の採取方法としては、例えば、パラフィンガムなどを咀嚼することで唾液の分泌を促進させて採取する方法がある。
生体試料を採取した後、すぐに解析に利用しない場合、低温（例えば、氷温）で保存する必要がある。常温で放置すると、細菌が増殖して正確な細菌の存在比率や量を解析できなくなるからである。
生体試料を採取した後、すぐに解析に利用しない場合、低温（例えば、氷温）で保存する必要がある。常温で放置すると、細菌が増殖して正確な細菌の存在比率や量を解析できなくなるからである。
生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量は、各細菌に特異的な成分の存在比率又は量を利用して相対的に決定することができる。特異的な成分は特に限定されず、例えば、遺伝子、タンパク質、ペプチドが挙げられるが、遺伝子が好ましい。遺伝子としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ等が挙げられ、ＤＮＡが好ましく、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子がより好ましい。ｒＲＮＡとしては、１６ＳｒＲＮＡ、５ＳｒＲＮＡ、２６ＳｒＲＮＡ等が挙げられる。ｒＲＮＡはリボソームの小サブユニットであるが、このリボソームはタンパク質合成という生命維持に不可欠な器官であるため、進化による変異が生じにくく、全ての細菌で共通の遺伝子配列を有する。また、ｒＲＮＡは、細菌により特異的な配列も含むため、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を用いることで、全細菌数だけでなく、菌特異的な定量や、菌種の同定等も行うことが出来る。各マーカー細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列情報は、ＤＤＢＪ、ＮＣＢＩ，Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ等の公開データベースから取得可能である。
生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量の測定を、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を利用して行う方法として、例えば、生体試料中のマーカー細菌及び全細菌の細菌数を１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のうち細菌により特異的な領域（Ｖ１～Ｖ９領域、好ましくはＶ１、Ｖ２領域）を含む領域（ターゲット領域）の定量ＰＣＲにより測定する方法や、ターゲット領域（好ましくは、Ｖ１、Ｖ２領域）の遺伝子増幅産物を用い、マイクロアレーや次世代シークエンサーにより解析、測定する方法、各マーカー細菌に特異的な１６ＳｒＲＮＡにプローブをハイブリダイズさせ、その量を測定する方法等がある。ＰＣＲ等の遺伝子増幅法においては、１６ＳｒＲＮＡのうち保存的領域から設計される任意のプライマー（例えば、配列番号１の塩基配列を有するプライマー及び配列番号２の塩基配列を有するプライマーの組み合わせを含むプライマーセット）を用いることが好ましい。これらの中でも、ターゲット領域（例えば、Ｖ１、Ｖ２領域）を含む領域の遺伝子増幅産物を次世代シークエンサーで解析、測定する方法が好ましい。
ＤＮＡの抽出方法は、特に限定されず、化学的、生化学的な溶菌による方法や物理的に細胞壁を破砕する方法のいずれでもよく、これらを組合せてもよい。
ＤＮＡの抽出方法は、特に限定されず、化学的、生化学的な溶菌による方法や物理的に細胞壁を破砕する方法のいずれでもよく、これらを組合せてもよい。
本発明の方法を、後述する実施例の方法に即してより詳細に説明する。
まず、３ｍＬの蒸留水で約１０秒間濯いだ吐出液として唾液を採取する。採取した唾液は、直ぐに氷冷する。採取当日に、唾液中に含まれる細菌を１００００Ｇで１０分間遠心分離し、遠心沈査として回収する。回収した細菌からＤＮＡ抽出キット（ｎｅｘｔｔｅｃ １－Ｓｔｅｐ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉａ、トーホー社製）を用いて、細菌ＤＮＡを抽出する。採取したＤＮＡは、必要に応じて－８０℃にて保存する。
まず、３ｍＬの蒸留水で約１０秒間濯いだ吐出液として唾液を採取する。採取した唾液は、直ぐに氷冷する。採取当日に、唾液中に含まれる細菌を１００００Ｇで１０分間遠心分離し、遠心沈査として回収する。回収した細菌からＤＮＡ抽出キット（ｎｅｘｔｔｅｃ １－Ｓｔｅｐ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉａ、トーホー社製）を用いて、細菌ＤＮＡを抽出する。採取したＤＮＡは、必要に応じて－８０℃にて保存する。
ＧＳジュニアベンチトップシステム（ロッシュ・ライフサイエンス社製）を用いて、抽出した細菌ＤＮＡの１６ＳリボソームＤＮＡのＶ１～Ｖ２領域をターゲットに増幅した遺伝子の配列の解析を行い、３０００個の細菌ＤＮＡの配列を解析して細菌の種類を特定し、その存在比率を求めることができる。
被験者の齲蝕のリスク判定用バイオマーカーとして利用し得るマーカー細菌は、カンピロバクター属細菌、ベイヨネラ属細菌、トレポネーマ属細菌、ナイセリア属細菌、モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、アロプレボテラ属細菌、ジアリスター属細菌、タンネラ属細菌、ラクノアナエロバクラム属細菌、及びメガスファエラ属細菌からなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。本発明の方法は、被験者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量を測定し、健常者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量と比較して、ナイセリア属細菌、モラクセラ属細菌、又はグラヌリカテラ属細菌が少ないか、或いはカンピロバクター属細菌、ベイヨネラ属細菌、トレポネーマ属細菌、アロプレボテラ属細菌、ジアリスター属細菌、タンネラ属細菌、ラクノアナエロバクラム属細菌、又はメガスファエラ属細菌が多いときに、齲蝕リスクが高いと判定し得る。
なお、これらのマーカー細菌は、後述する実施例の方法により、「齲蝕リスク 高」と認識された被験者と、「齲蝕リスク 低」と認識された被験者の間で、その存在比率に有意差が認められたものである。
なお、これらのマーカー細菌は、後述する実施例の方法により、「齲蝕リスク 高」と認識された被験者と、「齲蝕リスク 低」と認識された被験者の間で、その存在比率に有意差が認められたものである。
本発明の方法は、齲蝕リスクの判定方法として利用し得ることを考慮すると、齲蝕リスクが高い被験者の見落としを少なくすることが好ましい。そのため、マーカー細菌としては、後述の実施例で感度の数値が高いことが認められる次の態様が好ましい。
態様（１）：ベイヨネラ属細菌、ナイセリア属細菌、モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、タンネラ属細菌、ラクノアナエロバクラム属細菌、及びメガスファエラ属細菌からなる群から選択される少なくとも１種。
態様（２）：カンピロバクター属細菌とベイヨネラ属細菌の組み合わせ、ベイヨネラ属細菌とトレポネーマ属細菌の組み合わせ、アロプレボテラ属細菌とジアリスター属細菌の組み合わせ、前記ベイヨネラ属細菌と前記タンネラ属細菌の組み合わせ、前記タンネラ属細菌と前記ナイセリア属細菌の組み合わせ、又はトレポネーマ属細菌とナイセリア属細菌の組み合わせ。
態様（１）：ベイヨネラ属細菌、ナイセリア属細菌、モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、タンネラ属細菌、ラクノアナエロバクラム属細菌、及びメガスファエラ属細菌からなる群から選択される少なくとも１種。
態様（２）：カンピロバクター属細菌とベイヨネラ属細菌の組み合わせ、ベイヨネラ属細菌とトレポネーマ属細菌の組み合わせ、アロプレボテラ属細菌とジアリスター属細菌の組み合わせ、前記ベイヨネラ属細菌と前記タンネラ属細菌の組み合わせ、前記タンネラ属細菌と前記ナイセリア属細菌の組み合わせ、又はトレポネーマ属細菌とナイセリア属細菌の組み合わせ。
被験者の齲蝕のリスク判定用バイオマーカーとして上記マーカー細菌を用いるとき、例えば、次のようにして「齲蝕リスクが高い」と判定し得る。まず、全細菌に対するマーカー細菌の存在比率（個／個、以下同）を測定する。次に、マーカー細菌毎に設定した閾値と、測定したマーカー細菌の存在比率を比較する。そして、測定したマーカー細菌の存在比率が、マーカー細菌毎に設定した閾値以下或いは以上の条件を満たすときに「陽性」と判定する。最後に、陽性に該当したマーカー細菌の数に応じて「齲蝕リスクが高い」と判定し得る。なお、陽性に該当したマーカー細菌の数は、感度や特異度に応じて任意に変更し得る。ここで、マーカー細菌毎に設定するマーカー細菌の存在比率の閾値は、例えば、予め測定済みの健常者（例、齲蝕経験歯を有しないことが予め確認されている者）のマーカー細菌の存在比率又は量（健常者対照）で特定し得る。より詳細には、閾値の範囲としては、例えば、下記条件（１Ａ）が挙げられる。
条件（１Ａ）：存在比率の閾値は以下の範囲で設定する；カンピロバクター属細菌の存在比率が０．３５～０．５５％、ベイヨネラ属細菌の存在比率が２．５～３％、トレポネーマ属細菌の存在比率が０．０1～０．１％、ナイセリア属細菌の存在比率が１６～２０％、モラクセラ属細菌の存在比率が０．０１～０．１％、グラヌリカテラ属細菌の存在比率が２．２～２．６％、アロプレボテラ属細菌の存在比率が０．３～０．５％、ジアリスター属細菌の存在比率が０．０１～０．０８％、タンネラ属細菌の存在比率が０．０３～０．１％、ラクノアナエロバクラム属細菌の存在比率が０．０３～０．１％、及びメガスファエラ属細菌の存在比率が０．０１～０．１％。
閾値の範囲を条件（１Ａ）の範囲外とすると、感度や特異度が低くなり、検査の信頼性に影響する場合がある。
前記マーカー細菌のうち、ナイセリア属細菌、モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌については、存在比率が閾値以下の場合を「陽性」と判定し、それ以外の細菌については、存在比率が閾値以上の場合を「陽性」と判定する。
なお、比較対照を健常者の代わりに齲蝕者としてもよい（齲蝕者対照）。その場合、陽性と陰性の判定基準が入れ替わることになる。
条件（１Ａ）：存在比率の閾値は以下の範囲で設定する；カンピロバクター属細菌の存在比率が０．３５～０．５５％、ベイヨネラ属細菌の存在比率が２．５～３％、トレポネーマ属細菌の存在比率が０．０1～０．１％、ナイセリア属細菌の存在比率が１６～２０％、モラクセラ属細菌の存在比率が０．０１～０．１％、グラヌリカテラ属細菌の存在比率が２．２～２．６％、アロプレボテラ属細菌の存在比率が０．３～０．５％、ジアリスター属細菌の存在比率が０．０１～０．０８％、タンネラ属細菌の存在比率が０．０３～０．１％、ラクノアナエロバクラム属細菌の存在比率が０．０３～０．１％、及びメガスファエラ属細菌の存在比率が０．０１～０．１％。
閾値の範囲を条件（１Ａ）の範囲外とすると、感度や特異度が低くなり、検査の信頼性に影響する場合がある。
前記マーカー細菌のうち、ナイセリア属細菌、モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌については、存在比率が閾値以下の場合を「陽性」と判定し、それ以外の細菌については、存在比率が閾値以上の場合を「陽性」と判定する。
なお、比較対照を健常者の代わりに齲蝕者としてもよい（齲蝕者対照）。その場合、陽性と陰性の判定基準が入れ替わることになる。
マーカー細菌毎に設定した陽性判定のための閾値の好適例としては、カンピロバクター属細菌の存在比率が０．４３％以上、ベイヨネラ属細菌の存在比率が２．７％以上、トレポネーマ属細菌の存在比率が０．０３％以上、ナイセリア属細菌の存在比率が１８％以下、モラクセラ属細菌の存在比率が０．０３％以下、グラヌリカテラ属細菌の存在比率が２．５％以下、アロプレボテラ属細菌の存在比率が０．３５％以上、ジアリスター属細菌の存在比率が０．０５％以上、タンネラ属細菌の存在比率が０．０５％以上、ラクノアナエロバクラム属細菌の存在比率が０．０５％以上、メガスファエラ属細菌の存在比率が０．０３％以上、が挙げられる。
陽性に該当するマーカー細菌の数は少なくとも１つであればよく、２つ以上、３つ以上、４つ以上等のときに、「齲蝕リスクが高い」と判定するように設定してもよい。但し、本発明の方法が、齲蝕リスクの判定方法として利用し得ることを考慮すると、「齲蝕リスクが高い」被験者の見落としを少なくすることが好ましい。そのため、感度の数値を高くできるように、陽性に該当するマーカー細菌の数を設定することが好ましい。
後述する実施例の結果から、感度及び特異度の数値を高くする場合、例えば、下記の設定（１）～（６）を満たす場合に「齲蝕リスクが高い」と判定する設定が挙げられる。
設定（１）：カンピロバクター属細菌、ベイヨネラ属細菌、及びトレポネーマ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、陽性に該当するマーカー細菌の数が１つ以上。
設定（２）：カンピロバクター属細菌、ベイヨネラ属細菌、トレポネーマ属細菌、ナイセリア属細菌、モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、アロプレボテラ属細菌、ジアリスター属細菌、タンネラ属細菌、ラクノアナエロバクラム属細菌、及びメガスファエラ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、陽性に該当するマーカー細菌の数が６つ以上。
設定（３）：モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、及びアロプレボテラ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、陽性に該当するマーカー細菌の数が２つ以上。
設定（４）：モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、アロプレボテラ属細菌、ジアリスター属細菌、及びタンネラ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、陽性に該当するマーカー細菌の数が３つ以上。
設定（５）：モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、アロプレボテラ属細菌、ジアリスター属細菌、タンネラ属細菌、ラクノアナエロバクラム属細菌、及びメガスファエラ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、陽性に該当するマーカー細菌の数が４つ以上。
設定（６）：ベイヨネラ属細菌、トレポネーマ属細菌、ナイセリア属細菌、モラクセラ属細菌、及びグラヌリカテラ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、陽性に該当するマーカー細菌の数が２つ以上。
後述する実施例の結果から、感度及び特異度の数値を高くする場合、例えば、下記の設定（１）～（６）を満たす場合に「齲蝕リスクが高い」と判定する設定が挙げられる。
設定（１）：カンピロバクター属細菌、ベイヨネラ属細菌、及びトレポネーマ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、陽性に該当するマーカー細菌の数が１つ以上。
設定（２）：カンピロバクター属細菌、ベイヨネラ属細菌、トレポネーマ属細菌、ナイセリア属細菌、モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、アロプレボテラ属細菌、ジアリスター属細菌、タンネラ属細菌、ラクノアナエロバクラム属細菌、及びメガスファエラ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、陽性に該当するマーカー細菌の数が６つ以上。
設定（３）：モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、及びアロプレボテラ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、陽性に該当するマーカー細菌の数が２つ以上。
設定（４）：モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、アロプレボテラ属細菌、ジアリスター属細菌、及びタンネラ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、陽性に該当するマーカー細菌の数が３つ以上。
設定（５）：モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、アロプレボテラ属細菌、ジアリスター属細菌、タンネラ属細菌、ラクノアナエロバクラム属細菌、及びメガスファエラ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、陽性に該当するマーカー細菌の数が４つ以上。
設定（６）：ベイヨネラ属細菌、トレポネーマ属細菌、ナイセリア属細菌、モラクセラ属細菌、及びグラヌリカテラ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、陽性に該当するマーカー細菌の数が２つ以上。
［２．未治療の齲蝕歯の判定方法］
本発明の未治療の齲蝕歯の判定方法は、被験者の未治療の齲蝕歯の有無を判定するために、被験者から採取した生体試料中のマーカー細菌の存在比率又は量を測定する方法である。また、本発明の方法は、被験者から採取した生体試料中のマーカー細菌の存在比率又は量を測定して、健常者から採取した生体試料中のマーカー細菌の存在比率又は量と比較して、未治療の齲蝕歯の有無を判定する方法でもある。本発明の方法は、歯科医師や歯科衛生士による検査に先だって行う、未治療の齲蝕歯の有無の判定方法として利用し得る。本発明の方法により、未治療の齲蝕歯が有ると判定された被験者を対象として、歯科医師や歯科衛生士が事後的に検査をし、実際に齲蝕歯を有する場合、被験者が自覚症状を感じる前の段階で齲蝕歯を治療し得る。
マーカー細菌の種類と存在比率又は量が異なること以外は、「１．齲蝕リスクの検査方法」に記載した内容と同様である。
本発明の未治療の齲蝕歯の判定方法は、被験者の未治療の齲蝕歯の有無を判定するために、被験者から採取した生体試料中のマーカー細菌の存在比率又は量を測定する方法である。また、本発明の方法は、被験者から採取した生体試料中のマーカー細菌の存在比率又は量を測定して、健常者から採取した生体試料中のマーカー細菌の存在比率又は量と比較して、未治療の齲蝕歯の有無を判定する方法でもある。本発明の方法は、歯科医師や歯科衛生士による検査に先だって行う、未治療の齲蝕歯の有無の判定方法として利用し得る。本発明の方法により、未治療の齲蝕歯が有ると判定された被験者を対象として、歯科医師や歯科衛生士が事後的に検査をし、実際に齲蝕歯を有する場合、被験者が自覚症状を感じる前の段階で齲蝕歯を治療し得る。
マーカー細菌の種類と存在比率又は量が異なること以外は、「１．齲蝕リスクの検査方法」に記載した内容と同様である。
被験者の未治療の齲蝕歯の有無の判定用バイオマーカーとして利用し得るマーカー細菌は、アグリゲイティバクター属細菌、アクチノバチルス属細菌、オリバクテリウム属細菌、アトポビウム属細菌、エイケネラ属細菌、パラプレボテラ属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、アルスロバクター属細菌、シネルギステス属細菌、アクチノマイセス属細菌、マイコプラズマ属細菌、及びスカードビア属細菌からなる群から選択される少なくとも１種である。本発明の方法は、被験者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量を測定し、健常者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量と比較して、マーカー細菌のいずれかが少ないときに、未治療の齲蝕歯が有ると判定し得る。
本発明の方法は、未治療の齲蝕歯の有無の判定方法として利用し得ることを考慮すると、未治療の齲蝕歯が有る被験者の見落としを少なくすることが好ましい。そのため、マーカー細菌は、後述の実施例で感度の数値が高いことが認められる、オリバクテリウム属細菌、アルスロバクター属細菌、パラプレボテラ属細菌、アクチノバチルス属細菌、アグリゲイティバクター属細菌、及びカプノサイトファーガ属細菌からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。
本発明の方法は、未治療の齲蝕歯の有無の判定方法として利用し得ることを考慮すると、未治療の齲蝕歯が有る被験者の見落としを少なくすることが好ましい。そのため、マーカー細菌は、後述の実施例で感度の数値が高いことが認められる、オリバクテリウム属細菌、アルスロバクター属細菌、パラプレボテラ属細菌、アクチノバチルス属細菌、アグリゲイティバクター属細菌、及びカプノサイトファーガ属細菌からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。
被験者の未治療の齲蝕歯の有無の判定用バイオマーカーとして上記マーカー細菌を用いるとき、例えば、次のようにして「未治療の齲蝕歯 有り」と判定し得る。まず、全細菌に対するマーカー細菌の存在比率（個／個、以下同）を測定する。次に、マーカー細菌毎に設定した閾値と、測定したマーカー細菌の存在比率を比較する。そして、測定したマーカー細菌の存在比率が、マーカー細菌毎に設定した閾値以下或いは以上の条件を満たすときに「陽性」と判定する。最後に、陽性に該当したマーカー細菌の数に応じて「未治療の齲蝕歯 有り」と判定し得る。なお、陽性に該当したマーカー細菌の数は、感度や特異度に応じて任意に変更し得る。ここで、マーカー細菌毎に設定するマーカー細菌の存在比率の閾値は、例えば、予め測定済みの健常者（例、未治療の齲蝕歯がないことが予め確認されている者）のマーカー細菌の存在比率又は量（健常者対照）で特定し得る。より詳細には、閾値の範囲としては、例えば、下記条件（２Ａ）が挙げられる。
条件（２Ａ）：存在比率の閾値は以下の範囲で設定する；アグリゲイティバクター属細菌の存在比率が０．２～０．３５％、アクチノバチルス属細菌の存在比率が０．０３～０．１％、オリバクテリウム属細菌の存在比率が０．０３～０．1％、アトポビウム属細菌の存在比率が０．３～０．７％、エイケネラ属細菌の存在比率が０．０３～０．０６％、パラプレボテラ属細菌の存在比率が０．０１～０．０６％、カプノサイトファーガ属細菌の存在比率が０．４～０．７％、アルスロバクター属細菌の存在比率が０．０１～０．８％、シネルギステス属細菌の存在比率が０．０１～０．０６％、アクチノマイセス属細菌の存在比率が１．５～３％、マイコプラズマ属細菌の存在比率が０．０１～０．０５％以下、及びスカードビア属細菌の存在比率が０．０１～０．０５％。
閾値の範囲を条件（２Ａ）の範囲外とすると、感度や特異度が低くなり、検査の信頼性に影響する場合がある。
前記マーカー細菌について、存在比率が、閾値以下の場合を「陽性」と判定する。
なお、比較対照を健常者の代わりに齲蝕者としてもよい（齲蝕者対照）。その場合、陽性と陰性の判定基準が入れ替わることになる。
条件（２Ａ）：存在比率の閾値は以下の範囲で設定する；アグリゲイティバクター属細菌の存在比率が０．２～０．３５％、アクチノバチルス属細菌の存在比率が０．０３～０．１％、オリバクテリウム属細菌の存在比率が０．０３～０．1％、アトポビウム属細菌の存在比率が０．３～０．７％、エイケネラ属細菌の存在比率が０．０３～０．０６％、パラプレボテラ属細菌の存在比率が０．０１～０．０６％、カプノサイトファーガ属細菌の存在比率が０．４～０．７％、アルスロバクター属細菌の存在比率が０．０１～０．８％、シネルギステス属細菌の存在比率が０．０１～０．０６％、アクチノマイセス属細菌の存在比率が１．５～３％、マイコプラズマ属細菌の存在比率が０．０１～０．０５％以下、及びスカードビア属細菌の存在比率が０．０１～０．０５％。
閾値の範囲を条件（２Ａ）の範囲外とすると、感度や特異度が低くなり、検査の信頼性に影響する場合がある。
前記マーカー細菌について、存在比率が、閾値以下の場合を「陽性」と判定する。
なお、比較対照を健常者の代わりに齲蝕者としてもよい（齲蝕者対照）。その場合、陽性と陰性の判定基準が入れ替わることになる。
マーカー細菌毎に設定した陽性判定のための閾値の好適例としては、アグリゲイティバクター属細菌の存在比率が０．３％以下、アクチノバチルス属細菌の存在比率が０．０５％以下、オリバクテリウム属細菌の存在比率が０．０７％以下、アトポビウム属細菌の存在比率が０．５％以下、エイケネラ属細菌の存在比率が０．０５％以下、パラプレボテラ属細菌の存在比率が０．０３％以下、カプノサイトファーガ属細菌の存在比率が０．６％以下、アルスロバクター属細菌の存在比率が０．０３％以下、シネルギステス属細菌の存在比率が０．０３％以下、アクチノマイセス属細菌の存在比率が２％以下、マイコプラズマ属細菌の存在比率が０．０３％以下、及びスカードビア属細菌の存在比率が０．０３％以下、が挙げられる。
陽性に該当するマーカー細菌の数は少なくとも１つであればよく、３つ以上、４つ以上、５つ以上等のときに、「未治療の齲蝕歯 有り」と判定するように設定してもよい。但し、本発明の方法が、未治療の齲蝕歯の有無の判定方法として利用し得ることを考慮すると、未治療の齲蝕歯が有る被験者の見落としを少なくすることが好ましい。そのため、感度の数値を高くできるよう、陽性に該当するマーカー細菌の数を設定することが好ましい。
後述する実施例の結果から、感度及び特異度の数値を高くする場合、例えば、下記の設定（１）～（３）を満たす場合に「未治療の齲蝕歯 有り」と判定する設定が挙げられる。
設定（１）：アグリゲイティバクター属細菌、アクチノバチルス属細菌、エイケネラ属細菌、パラプレボテラ属細菌、及びシネルギステス属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、陽性に該当するマーカー細菌が全て。
設定（２）：アグリゲイティバクター属細菌、アクチノバチルス属細菌、オリバクテリウム属細菌、エイケネラ属細菌、パラプレボテラ属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、アルスロバクター属細菌、及びシネルギステス属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、陽性に該当するマーカー細菌の数が７つ以上。
設定（３）：アグリゲイティバクター属細菌、アトポビウム属細菌、エイケネラ属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、シネルギステス属細菌、アクチノマイセス属細菌、マイコプラズマ属細菌、及びスカードビア属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、陽性に該当するマーカー細菌の数が６つ以上。
後述する実施例の結果から、感度及び特異度の数値を高くする場合、例えば、下記の設定（１）～（３）を満たす場合に「未治療の齲蝕歯 有り」と判定する設定が挙げられる。
設定（１）：アグリゲイティバクター属細菌、アクチノバチルス属細菌、エイケネラ属細菌、パラプレボテラ属細菌、及びシネルギステス属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、陽性に該当するマーカー細菌が全て。
設定（２）：アグリゲイティバクター属細菌、アクチノバチルス属細菌、オリバクテリウム属細菌、エイケネラ属細菌、パラプレボテラ属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、アルスロバクター属細菌、及びシネルギステス属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、陽性に該当するマーカー細菌の数が７つ以上。
設定（３）：アグリゲイティバクター属細菌、アトポビウム属細菌、エイケネラ属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、シネルギステス属細菌、アクチノマイセス属細菌、マイコプラズマ属細菌、及びスカードビア属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、陽性に該当するマーカー細菌の数が６つ以上。
［３．バイオマーカー］
本発明のバイオマーカーは、被験者の未治療の齲蝕歯の有無又は齲蝕リスクの判定のために利用される、少なくとも１種の、マーカー細菌又はその由来成分である。被験者から採取した生体試料中の本発明のバイオマーカーの存在比率又は量を測定することにより、被験者の未治療の齲蝕歯の有無、又は、齲蝕リスクを判定できる。判定の際には、［１．齲蝕リスクの判定方法］又は［２．未治療の齲蝕歯の判定方法］に記載された方法を用いることが好ましい。例えば、各細菌に特異的なＤＮＡを抽出し、ｒＲＮＡ遺伝子を解析する等、人為的な操作を加えることで、細菌の特定と生体試料における存在比率又は量を測定する。本発明のバイオマーカーは、測定結果を利用して、未治療の齲蝕歯の有無又は齲蝕リスクを判定する指標としての利用可能性が見出されたものである。
本発明のバイオマーカーは、被験者の未治療の齲蝕歯の有無又は齲蝕リスクの判定のために利用される、少なくとも１種の、マーカー細菌又はその由来成分である。被験者から採取した生体試料中の本発明のバイオマーカーの存在比率又は量を測定することにより、被験者の未治療の齲蝕歯の有無、又は、齲蝕リスクを判定できる。判定の際には、［１．齲蝕リスクの判定方法］又は［２．未治療の齲蝕歯の判定方法］に記載された方法を用いることが好ましい。例えば、各細菌に特異的なＤＮＡを抽出し、ｒＲＮＡ遺伝子を解析する等、人為的な操作を加えることで、細菌の特定と生体試料における存在比率又は量を測定する。本発明のバイオマーカーは、測定結果を利用して、未治療の齲蝕歯の有無又は齲蝕リスクを判定する指標としての利用可能性が見出されたものである。
齲蝕リスクの判定用バイオマーカーは、カンピロバクター属細菌、ベイヨネラ属細菌、トレポネーマ属細菌、ナイセリア属細菌、モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、アロプレボテラ属細菌、ジアリスター属細菌、タンネラ属細菌、ラクノアナエロバクラム属細菌、及びメガスファエラ属細菌からなる群から選択される少なくとも１種のマーカー細菌又はその由来成分を含む。
未治療の齲蝕歯の判定用バイオマーカーは、アグリゲイティバクター属細菌、アクチノバチルス属細菌、オリバクテリウム属細菌、アトポビウム属細菌、エイケネラ属細菌、パラプレボテラ属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、アルスロバクター属細菌、シネルギステス属細菌、アクチノマイセス属細菌、マイコプラズマ属細菌、及びスカードビア属細菌からなる群から選択される少なくとも１種のマーカー細菌、又はその由来成分を含む。
以下、各細菌の詳細を記す。
未治療の齲蝕歯の判定用バイオマーカーは、アグリゲイティバクター属細菌、アクチノバチルス属細菌、オリバクテリウム属細菌、アトポビウム属細菌、エイケネラ属細菌、パラプレボテラ属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、アルスロバクター属細菌、シネルギステス属細菌、アクチノマイセス属細菌、マイコプラズマ属細菌、及びスカードビア属細菌からなる群から選択される少なくとも１種のマーカー細菌、又はその由来成分を含む。
以下、各細菌の詳細を記す。
（カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属細菌）
カンピロバクター属細菌の菌種は、カンピロバクター レクタス、カンピロバクター グラシラス、カンピロバクター コンシサス、カンピロバクター ショウアエ、カンピロバクター ジェジュニ、カンピロバクター コリ、カンピロバクター フィータス等が挙げられる。
カンピロバクター属細菌の菌種は、カンピロバクター レクタス、カンピロバクター グラシラス、カンピロバクター コンシサス、カンピロバクター ショウアエ、カンピロバクター ジェジュニ、カンピロバクター コリ、カンピロバクター フィータス等が挙げられる。
（ベイヨネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）属細菌）
ベイヨネラ属細菌の菌種は、ベイヨネラ アティピカ、ベイヨネラ パルビュラ、ベイヨネラ アルカレセンス、ベイヨネラ ディスパー等が挙げられる。
ベイヨネラ属細菌の菌種は、ベイヨネラ アティピカ、ベイヨネラ パルビュラ、ベイヨネラ アルカレセンス、ベイヨネラ ディスパー等が挙げられる。
（トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）属細菌）
トレポネーマ属細菌の菌種は、トレポネーマ デンティコラ、トレポネーマ ソクランスキ、トレポネーマ ペクチノボラム等が挙げられる。
トレポネーマ属細菌の菌種は、トレポネーマ デンティコラ、トレポネーマ ソクランスキ、トレポネーマ ペクチノボラム等が挙げられる。
（ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属細菌）
ナイセリア属細菌の菌種は、ナイセリア サブフラバ、ナイセリア シッカ、ナイセリア ムコサ等が挙げられる。
ナイセリア属細菌の菌種は、ナイセリア サブフラバ、ナイセリア シッカ、ナイセリア ムコサ等が挙げられる。
（モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）属細菌）
モラクセラ属細菌の菌種は、モラクセラ カタラーリス、モラクセラ ラクナタ等が挙げられる。
モラクセラ属細菌の菌種は、モラクセラ カタラーリス、モラクセラ ラクナタ等が挙げられる。
（グラヌリカテラ（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ）属細菌）
グラヌリカテラ属細菌の菌種は、グラヌリカテラ アディアセンス等が挙げられる。
グラヌリカテラ属細菌の菌種は、グラヌリカテラ アディアセンス等が挙げられる。
（アロプレボテラ（Ａｌｌｏｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属細菌）
アロプレボテラ属細菌の菌種は、アロプレボテラ タネラエ、アロプレボテラ ラバ等が挙げられる。
アロプレボテラ属細菌の菌種は、アロプレボテラ タネラエ、アロプレボテラ ラバ等が挙げられる。
（ジアリスター（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ）属細菌）
ジアリスター属細菌の菌種は、ジアリスター インビサス、ジアリスター ニューモシンサス等が挙げられる。
ジアリスター属細菌の菌種は、ジアリスター インビサス、ジアリスター ニューモシンサス等が挙げられる。
（タネレラ（Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ）属細菌）
タネレラ属細菌の菌種は、タネレラ フォーサイシア、タネレラ フォルシテンシス等が挙げられる。
タネレラ属細菌の菌種は、タネレラ フォーサイシア、タネレラ フォルシテンシス等が挙げられる。
（ラクノアナエロバクラム（Ｌａｃｈｎｏａｎａｅｒｏ ｂａｃｕｌｕｍ）属細菌）
ラクノアナエロバクラム属細菌の菌種は、ラクノアナエロバクラム ウメアエンス、ラクノアナエロバクラム オラレ、ラクノアナエロバクラム サブレウム等が挙げられる。
ラクノアナエロバクラム属細菌の菌種は、ラクノアナエロバクラム ウメアエンス、ラクノアナエロバクラム オラレ、ラクノアナエロバクラム サブレウム等が挙げられる。
（メガスファエラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）属細菌）
メガスファエラ属細菌の菌種は、メガスファエラ セレビシエ、メガスファエラ エルスデニー、メガスファエラ ミクロヌシフォルミス、メガスファエラ スエシエンシス、メガスファエラ パウシボランス等が挙げられる。
メガスファエラ属細菌の菌種は、メガスファエラ セレビシエ、メガスファエラ エルスデニー、メガスファエラ ミクロヌシフォルミス、メガスファエラ スエシエンシス、メガスファエラ パウシボランス等が挙げられる。
（アグリゲイティバクター（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ）属細菌）
アグリゲイティバクター属細菌の菌種は、アグリゲイティバクター アクチノミセテムコミタンス等が挙げられる。
アグリゲイティバクター属細菌の菌種は、アグリゲイティバクター アクチノミセテムコミタンス等が挙げられる。
（アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌）
アクチノバチルス属細菌の菌種は、アクチノバチルス ミナー、アクチノバチルス サクシノジェネス、アクチノバチルス アクチノマイセテムコミタンス等が挙げられる。
アクチノバチルス属細菌の菌種は、アクチノバチルス ミナー、アクチノバチルス サクシノジェネス、アクチノバチルス アクチノマイセテムコミタンス等が挙げられる。
（オリバクテリウム（Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌）
オリバクテリウム属細菌の菌種は、オリバクテリウム シナス等が挙げられる。
オリバクテリウム属細菌の菌種は、オリバクテリウム シナス等が挙げられる。
（アトポビウム（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ）属細菌）
アトポビウム属細菌の菌種は、アトポビウム パルブラム、アトポビウム リマエ、アトポビウム バギナエ等が挙げられる。
アトポビウム属細菌の菌種は、アトポビウム パルブラム、アトポビウム リマエ、アトポビウム バギナエ等が挙げられる。
（エイケネラ（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ）属細菌）
エイケネラ属細菌の菌種は、エイケネラ コローデンス等が挙げられる。
エイケネラ属細菌の菌種は、エイケネラ コローデンス等が挙げられる。
（パラプレボテラ（Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属細菌）
パラプレボテラ属細菌の菌種は、パラプレボテラ クララ、パラプレボテラ キシラニフィラ等が挙げられる。
パラプレボテラ属細菌の菌種は、パラプレボテラ クララ、パラプレボテラ キシラニフィラ等が挙げられる。
（カプノサイトファーガ（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）属細菌）
カプノサイトファーガ属細菌の菌種は、カプノサイトファーガ スプティーガ、カプノサイトファーガ ギンギバリス、カプノサイトファーガ オクラセア等が挙げられる。
カプノサイトファーガ属細菌の菌種は、カプノサイトファーガ スプティーガ、カプノサイトファーガ ギンギバリス、カプノサイトファーガ オクラセア等が挙げられる。
（アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌）
アルスロバクター属細菌の菌種は、アルスロバクター ダビダニエリ、アルスロバクター エスピー、アルスロバクター ウレアファシエンス、アルスロバクター シトレウス等が挙げられる。
アルスロバクター属細菌の菌種は、アルスロバクター ダビダニエリ、アルスロバクター エスピー、アルスロバクター ウレアファシエンス、アルスロバクター シトレウス等が挙げられる。
（シネルギステス（Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ）属細菌）
シネルギステス属細菌の菌種は、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ３６３、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ３６１等が挙げられる。
シネルギステス属細菌の菌種は、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ３６３、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ３６１等が挙げられる。
（アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属細菌）
アクチノマイセス属細菌の菌種は、アクチノマイセス ナエスランディ、アクチノマイセス ビスコーサス、アクチノマイセス オドントリティカス、アクチノマイセス オリス等が挙げられる。
アクチノマイセス属細菌の菌種は、アクチノマイセス ナエスランディ、アクチノマイセス ビスコーサス、アクチノマイセス オドントリティカス、アクチノマイセス オリス等が挙げられる。
（マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属細菌）
マイコプラズマ属細菌の菌種は、マイコプラズマ サリバリウム、マイコプラズマ リポフィリウム、マイコプラズマ ジェニタリウム等が挙げられる。
マイコプラズマ属細菌の菌種は、マイコプラズマ サリバリウム、マイコプラズマ リポフィリウム、マイコプラズマ ジェニタリウム等が挙げられる。
（スカードビア（Ｓｃａｒｄｏｖｉａ）属細菌）
スカードビア属細菌の菌種は、スカードビア ウィッグシアエ、スカードビア イノピナタ等が挙げられる。
スカードビア属細菌の菌種は、スカードビア ウィッグシアエ、スカードビア イノピナタ等が挙げられる。
（由来成分）
マーカー細菌の由来成分とは、各マーカー細菌に特異的な成分であり、かつその量からマーカー細菌の種類や存在比率を測定可能な成分であればよく、例えば、核酸（例、ＤＮＡやＲＮＡ）、タンパク質、ペプチド等が挙げられ、ＤＮＡが好ましく、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子がより好ましい。ｒＲＮＡとしては、例えば、１６ＳｒＲＮＡ、５ＳｒＲＮＡ、２６ＳｒＲＮＡ等が挙げられる。中でも、解析が容易であるため、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が好ましく、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＶ１～Ｖ９領域の少なくとも１つがより好ましく、Ｖ１及びＶ２領域のいずれか又は両方が更に好ましい。
マーカー細菌の由来成分とは、各マーカー細菌に特異的な成分であり、かつその量からマーカー細菌の種類や存在比率を測定可能な成分であればよく、例えば、核酸（例、ＤＮＡやＲＮＡ）、タンパク質、ペプチド等が挙げられ、ＤＮＡが好ましく、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子がより好ましい。ｒＲＮＡとしては、例えば、１６ＳｒＲＮＡ、５ＳｒＲＮＡ、２６ＳｒＲＮＡ等が挙げられる。中でも、解析が容易であるため、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が好ましく、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＶ１～Ｖ９領域の少なくとも１つがより好ましく、Ｖ１及びＶ２領域のいずれか又は両方が更に好ましい。
（検出キット（検出手段））
検出キット（検出手段）とは、被験者の齲蝕歯のリスク判定用又は被験者の未治療の齲蝕歯の判定用バイオマーカーである各マーカー細菌の１６ＳｒＲＮＡを検出し得る、プライマーペア、プローブ、及び前記プローブが固定されているマイクロアレイからなる群より選ばれる１以上を含む、キット又は手段である。プライマーペアは、少なくとも１つでよく、細菌の１６ＳｒＲＮＡのうち保存的領域から設計されることが好ましい。塩基長、配列は、検出に用いるＰＣＲ等の遺伝子増幅法などに応じて適宜定めればよい。プローブは、各マーカー細菌の１６ＳｒＲＮＡの特異的な領域（Ｖ１～Ｖ９）の少なくとも一部の塩基配列と相補的なオリゴヌクレオチドであればよく、必要に応じて蛍光物質等で修飾されていてもよい。マイクロアレイは、基板（材質は限定されない）にプローブが固定されていればよい。検出キットは、マーカー細菌の検出に用いるための他の試薬を含んでいてもよい。例えば、増幅法に応じて用いられる試薬（例、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素等の酵素、蛍光試薬、ｄＮＴＰｓ等の基質、ＡＴＰ等の補酵素）、ポジティブ／ネガティブコントロール（例、ハウスキーピング遺伝子）が挙げられる。検出キットは、容器に収められていてもよい。
検出キット（検出手段）とは、被験者の齲蝕歯のリスク判定用又は被験者の未治療の齲蝕歯の判定用バイオマーカーである各マーカー細菌の１６ＳｒＲＮＡを検出し得る、プライマーペア、プローブ、及び前記プローブが固定されているマイクロアレイからなる群より選ばれる１以上を含む、キット又は手段である。プライマーペアは、少なくとも１つでよく、細菌の１６ＳｒＲＮＡのうち保存的領域から設計されることが好ましい。塩基長、配列は、検出に用いるＰＣＲ等の遺伝子増幅法などに応じて適宜定めればよい。プローブは、各マーカー細菌の１６ＳｒＲＮＡの特異的な領域（Ｖ１～Ｖ９）の少なくとも一部の塩基配列と相補的なオリゴヌクレオチドであればよく、必要に応じて蛍光物質等で修飾されていてもよい。マイクロアレイは、基板（材質は限定されない）にプローブが固定されていればよい。検出キットは、マーカー細菌の検出に用いるための他の試薬を含んでいてもよい。例えば、増幅法に応じて用いられる試薬（例、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素等の酵素、蛍光試薬、ｄＮＴＰｓ等の基質、ＡＴＰ等の補酵素）、ポジティブ／ネガティブコントロール（例、ハウスキーピング遺伝子）が挙げられる。検出キットは、容器に収められていてもよい。
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。以下の実施例は、本発明を好適に説明するためのものであって、本発明を限定するものではない。
（マーカーの選定１）
歯科医師診断により齲蝕経験歯が０本の被験者１７名（年齢１０歳から３９歳）と、齲蝕経験歯を１０本以上有する被験者２０名（年齢３０歳から６０歳）について、表１に示すように群分けした。なお、齲蝕経験歯数は、未治療の齲蝕歯の数、治療済みの齲蝕歯の数を歯科医師が診査し、未治療の齲蝕歯の数と治療済みの歯の数の合計を齲蝕経験歯数とした。
歯科医師診断により齲蝕経験歯が０本の被験者１７名（年齢１０歳から３９歳）と、齲蝕経験歯を１０本以上有する被験者２０名（年齢３０歳から６０歳）について、表１に示すように群分けした。なお、齲蝕経験歯数は、未治療の齲蝕歯の数、治療済みの齲蝕歯の数を歯科医師が診査し、未治療の齲蝕歯の数と治療済みの歯の数の合計を齲蝕経験歯数とした。
３ｍＬの蒸留水で約１０秒間洗口した後、吐出液として唾液を採取した。採取した唾液は直ぐに氷冷した。採取当日に、唾液を１００００Ｇで１０分間遠心分離し、唾液中に含まれる細菌を遠心沈査として回収した。回収した細菌から細菌ＤＮＡを抽出した。なお、細菌ＤＮＡの抽出は、ＤＮＡ抽出キットである「ｎｅｘｔｔｅｃ １－Ｓｔｅｐ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉａ」（トーホー社製）を用い、キットのプロトコルに従って行った。
細菌の存在比率（以下、「構成比率」ともいう）の測定は、「ＧＳジュニアベンチトップシステム」（ロッシュ・ライフサイエンス社製）を用いて行った。機器のマニュアルに従い、抽出した細菌ＤＮＡの１６ＳリボソームＤＮＡのＶ１～Ｖ２領域をターゲットに増幅した遺伝子配列の解析を行い、３０００個の細菌ＤＮＡの配列を解析して細菌種類を特定、細菌構成比率（％）を求めた。
１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のＶ１～Ｖ２領域の増幅には、フォワードプライマーとして、ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＡＣＴＣＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＲＧＴＴＴＧＡＴＹＭＴＧＧＣＴＣＡＧ（配列番号１）（但し、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴを意味し、Ｍは、Ａ又はＣを意味し、Ｒは、Ｇ又はＡを意味し、Ｙは、Ｔ又はＣを意味する）を、リバースプライマーとして、ＣＣＴＡＴＣＣＣＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＴＧＧＣＡＧＴＣＴＣＡＧＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＧＴＡＧＧＡＧＴ（配列番号２）を用いた。また、得られた配列からの細菌種類の特定には公表データベース（ＣＯＲＥ及びＲＤＰ）を用いた。
また、齲蝕経験歯が０本の被験者と、齲蝕経験歯が１０本以上の被験者の２群間の構成比率の平均値の差を比較解析（ウェルチのｔ検定）した。結果を表２に示す。
１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のＶ１～Ｖ２領域の増幅には、フォワードプライマーとして、ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＡＣＴＣＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＲＧＴＴＴＧＡＴＹＭＴＧＧＣＴＣＡＧ（配列番号１）（但し、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴを意味し、Ｍは、Ａ又はＣを意味し、Ｒは、Ｇ又はＡを意味し、Ｙは、Ｔ又はＣを意味する）を、リバースプライマーとして、ＣＣＴＡＴＣＣＣＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＴＧＧＣＡＧＴＣＴＣＡＧＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＧＴＡＧＧＡＧＴ（配列番号２）を用いた。また、得られた配列からの細菌種類の特定には公表データベース（ＣＯＲＥ及びＲＤＰ）を用いた。
また、齲蝕経験歯が０本の被験者と、齲蝕経験歯が１０本以上の被験者の２群間の構成比率の平均値の差を比較解析（ウェルチのｔ検定）した。結果を表２に示す。
齲蝕リスクの高い齲蝕経験歯数が多い被験者と、齲蝕経験歯のない被験者と、で細菌構成比率の異なる菌として、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ属細菌、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属細菌、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属細菌、Ｓｃａｒｄｏｖｉａ属細菌、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属細菌、Ａｌｌｏｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属細菌、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ属細菌、Ｌａｃｈｎｏａｎａｅｒｏｂａｃｕｌｕｍ属細菌、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属細菌、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ属細菌、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ属細菌、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ属細菌、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ属細菌を抽出し（表２中、ｐ値が０．１未満の細菌）、齲蝕リスクのマーカー候補として選定した。
なお、細菌の構成比率が０．０１％未満の細菌は、データの信頼性が低いと判断し、解析の対象外とした。
なお、細菌の構成比率が０．０１％未満の細菌は、データの信頼性が低いと判断し、解析の対象外とした。
（バイオマーカーによる齲蝕リスクの検査）
歯科医師の診断により齲蝕経験歯が５本以上と診査された３５名を齲蝕リスクが高い被験者群とし、齲蝕経験歯がない２６名を齲蝕リスクが低い被験者群とした。前記被験者は、５歳から６４歳であった。前記被験者６１名に対して（マーカーの選定１）に記載した方法で、唾液を採取して唾液中の口腔細菌の細菌構成比率を測定した。各細菌の細菌構成比率の閾値から、齲蝕リスクが高いと判定される場合には「齲蝕リスク 高（以降、「陽性」と称す場合がある）」、低いと判定される場合には「齲蝕リスク 低（以降、「陰性」と称す場合がある）」として、本発明の検査による各被験者の齲蝕リスクを評価した。各被験者の、歯科医師の齲蝕歯数の診断に基づく齲蝕リスク結果と各細菌の細菌構成比率の閾値からの判定結果を表３に記す。
なお、各細菌の細菌構成比率の閾値は、表３に示す値に設定し、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属細菌、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属細菌、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ属細菌については、構成比率が閾値より大きい場合を「齲蝕リスク 低」と判定し、閾値以下の場合を「齲蝕リスク 高」と判定した。それ以外の細菌については、構成比率が閾値以上の場合を「齲蝕リスク 高」と判定し、閾値より小さい場合を「齲蝕リスク 低」と判定した。
ただし、表３中の齲蝕歯には、完治済みの齲蝕歯も含める。
歯科医師の診断により齲蝕経験歯が５本以上と診査された３５名を齲蝕リスクが高い被験者群とし、齲蝕経験歯がない２６名を齲蝕リスクが低い被験者群とした。前記被験者は、５歳から６４歳であった。前記被験者６１名に対して（マーカーの選定１）に記載した方法で、唾液を採取して唾液中の口腔細菌の細菌構成比率を測定した。各細菌の細菌構成比率の閾値から、齲蝕リスクが高いと判定される場合には「齲蝕リスク 高（以降、「陽性」と称す場合がある）」、低いと判定される場合には「齲蝕リスク 低（以降、「陰性」と称す場合がある）」として、本発明の検査による各被験者の齲蝕リスクを評価した。各被験者の、歯科医師の齲蝕歯数の診断に基づく齲蝕リスク結果と各細菌の細菌構成比率の閾値からの判定結果を表３に記す。
なお、各細菌の細菌構成比率の閾値は、表３に示す値に設定し、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属細菌、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属細菌、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ属細菌については、構成比率が閾値より大きい場合を「齲蝕リスク 低」と判定し、閾値以下の場合を「齲蝕リスク 高」と判定した。それ以外の細菌については、構成比率が閾値以上の場合を「齲蝕リスク 高」と判定し、閾値より小さい場合を「齲蝕リスク 低」と判定した。
ただし、表３中の齲蝕歯には、完治済みの齲蝕歯も含める。
表３から、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属細菌、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属細菌、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属細菌、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属細菌、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ属細菌、Ａｌｌｏｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属細菌、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ属細菌、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ属細菌、Ｌａｃｈｎｏａｎａｅｒｏｂａｃｕｌｕｍ属細菌、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ属細菌は、齲蝕リスクのマーカーとして有用であり、齲蝕リスクを評価できることを確認した。
なお、齲蝕リスクの評価は、リスクの高い者を見出し、適切な予防処置を行うことにあるので、感度は高いマーカーが好ましい。そのため、マーカーとしては、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属細菌、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属細菌、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属細菌、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ属細菌、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ属細菌、Ｌａｃｈｎｏａｎａｅｒｏｂａｃｕｌｕｍ属細菌、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ属細菌が好ましく、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属細菌、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属細菌、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ属細菌、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ属細菌がさらに好ましいといえる。
なお、齲蝕リスクの評価は、リスクの高い者を見出し、適切な予防処置を行うことにあるので、感度は高いマーカーが好ましい。そのため、マーカーとしては、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属細菌、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属細菌、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属細菌、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ属細菌、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ属細菌、Ｌａｃｈｎｏａｎａｅｒｏｂａｃｕｌｕｍ属細菌、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ属細菌が好ましく、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属細菌、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属細菌、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ属細菌、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ属細菌がさらに好ましいといえる。
感度、特異度の向上を目的として、上記の被験者６１名の分析データを用いて、バイオマーカーの対象とする細菌を組み合せて判定することを検討した。検討結果を表４に記す。
なお、表４中、組合せて評価する細菌の１つでも「陽性」と判定される場合、「齲蝕リスク 高」と判定した。
なお、表４中、組合せて評価する細菌の１つでも「陽性」と判定される場合、「齲蝕リスク 高」と判定した。
表４から、バイオマーカーを組み合わせた場合、上記の判定手法を採用することで、感度が向上し、齲蝕リスクを診断する方法として優れることがわかる。
感度、特異度の向上を目的として、バイオマーカーの対象とする細菌を３種以上組み合せるとともに、陽性に該当するマーカー細菌の最小数を検討した。検討結果を表５及び表６に記す。
なお、各細菌の細菌構成比率の閾値は、カンピロバクター属細菌は０．４３％、ベイヨネラ属細菌は２．７％、トレポネーマ属細菌は０．０３％、ナイセリア属細菌は１８％、モラクセラ属細菌は０．０３％、グラヌリカテラ属細菌は２．５％、アロプレボテラ属細菌は０．３５％、ジアリスター属細菌は０．０５％、タンネラ属細菌は０．０５％、ラクノアナエロバクラム属細菌は０．０５％、メガスファエラ属細菌は０．０３％と設定した。細菌の構成比率について、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属細菌、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属細菌、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ属細菌は、構成比率が閾値より大きい場合を「陰性」と判定し、閾値以下の場合を「陽性」と判定した。それ以外の細菌は、構成比率が閾値以上の場合を「陽性」と判定し、閾値より小さい場合を「陰性」と判定した。
なお、各細菌の細菌構成比率の閾値は、カンピロバクター属細菌は０．４３％、ベイヨネラ属細菌は２．７％、トレポネーマ属細菌は０．０３％、ナイセリア属細菌は１８％、モラクセラ属細菌は０．０３％、グラヌリカテラ属細菌は２．５％、アロプレボテラ属細菌は０．３５％、ジアリスター属細菌は０．０５％、タンネラ属細菌は０．０５％、ラクノアナエロバクラム属細菌は０．０５％、メガスファエラ属細菌は０．０３％と設定した。細菌の構成比率について、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属細菌、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属細菌、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ属細菌は、構成比率が閾値より大きい場合を「陰性」と判定し、閾値以下の場合を「陽性」と判定した。それ以外の細菌は、構成比率が閾値以上の場合を「陽性」と判定し、閾値より小さい場合を「陰性」と判定した。
表５及び表６からわかるように、各マーカー細菌群において各々の細菌存在比率の閾値を設定し、陽性に該当するマーカー細菌の数を表５及び表６に示す最小数以上の場合に「齲蝕リスク 高」と判定すると、感度、特異度が向上することがわかる。
（マーカーの選定２）
未治療の齲蝕歯の有無を検出できるマーカー候補を選定するため、未治療の齲蝕歯を有する者４名と、未治療の齲蝕歯を有しない者１６名について、表７に示すように群分けした。
なお、年齢や齲蝕経験歯数、歯肉の状態の影響を排除するため、年齢及び最大プロービングポケット深さ、プロービングによる出血に有意な差のない群間での解析である。また、被験者の未治療の齲蝕の有無は、歯科医師により診査した結果である。
未治療の齲蝕歯の有無を検出できるマーカー候補を選定するため、未治療の齲蝕歯を有する者４名と、未治療の齲蝕歯を有しない者１６名について、表７に示すように群分けした。
なお、年齢や齲蝕経験歯数、歯肉の状態の影響を排除するため、年齢及び最大プロービングポケット深さ、プロービングによる出血に有意な差のない群間での解析である。また、被験者の未治療の齲蝕の有無は、歯科医師により診査した結果である。
上記の被験者２０名について、（マーカーの選定１）に記載した方法で、唾液を採取して唾液中の口腔細菌の細菌構成比率を測定した。未治療の齲蝕歯を有する者４名と、未治療の齲蝕歯を有しない者１６名の２群間で細菌構成比率を比較解析した（ウェルチのｔ検定）。結果を表８に記す。
表８から、マーカーとしてＡｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ属細菌、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ属細菌、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ属細菌、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属細菌、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属細菌、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ属細菌、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属細菌、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属細菌、Ｓｃａｒｄｏｖｉａ属細菌を抽出し（ｐ値が０．１より小さい菌を抽出）、齲蝕の有無のマーカー候補として選定した。
なお、細菌の構成比率が０．０１％未満の細菌は、データの信頼性が低いと判断し、解析の対象外とした。
なお、細菌の構成比率が０．０１％未満の細菌は、データの信頼性が低いと判断し、解析の対象外とした。
（バイオマーカーによる未治療の齲蝕歯有無の検査）
５歳から６４歳の被験者８６名について、（マーカーの選定１）に記載した方法で、唾液中の細菌構成比率を測定し、未治療の齲蝕歯の有無を判定した。各被験者の、歯科医師の未治療の齲蝕歯の有無の診断結果と各細菌の細菌構成比率の閾値からの判定結果を表９に記す。
なお、各細菌の細菌構成比率の閾値は、表９に示す値に設定し、構成比率が閾値以下の場合を「未治療の齲蝕歯 有り（以降、「陽性」と称す場合がある）」と判定し、閾値より大きい場合を「未治療の齲蝕歯 無し（以降、「陰性」と称す場合がある）」と判定した。
５歳から６４歳の被験者８６名について、（マーカーの選定１）に記載した方法で、唾液中の細菌構成比率を測定し、未治療の齲蝕歯の有無を判定した。各被験者の、歯科医師の未治療の齲蝕歯の有無の診断結果と各細菌の細菌構成比率の閾値からの判定結果を表９に記す。
なお、各細菌の細菌構成比率の閾値は、表９に示す値に設定し、構成比率が閾値以下の場合を「未治療の齲蝕歯 有り（以降、「陽性」と称す場合がある）」と判定し、閾値より大きい場合を「未治療の齲蝕歯 無し（以降、「陰性」と称す場合がある）」と判定した。
表９から、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属細菌、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属細菌により、感度よく未治療の齲蝕歯が有ると診断できることを確認した。
感度、特異度の向上を目的として、上記の被験者８６名の分析データを用いて、複数のマーカーの組合せとともに、「未治療の齲蝕歯 有り」と判定するときの、陽性に該当するマーカー細菌の最小数を検討した。検討結果を表１０に記す。
なお、各細菌の細菌構成比率の閾値は、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌が０．０７％、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌が０．０３％、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属細菌が０．０３％、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌が０．０５％、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ属細菌が０．０５％、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ属細菌が０．０３％、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ属細菌が０．３％、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属細菌が０．６％、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属細菌が２％、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属細菌が０．０３％、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ属細菌が０．５％、Ｓｃａｒｄｏｖｉａ属細菌が０．０３％と設定した。細菌の構成比率について、構成比率が閾値以下の場合を「陽性」と判定し、閾値より大きい場合を「陰性」と判定した。
なお、各細菌の細菌構成比率の閾値は、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌が０．０７％、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌が０．０３％、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属細菌が０．０３％、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌が０．０５％、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ属細菌が０．０５％、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ属細菌が０．０３％、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ属細菌が０．３％、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属細菌が０．６％、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属細菌が２％、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属細菌が０．０３％、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ属細菌が０．５％、Ｓｃａｒｄｏｖｉａ属細菌が０．０３％と設定した。細菌の構成比率について、構成比率が閾値以下の場合を「陽性」と判定し、閾値より大きい場合を「陰性」と判定した。
表１０から、各マーカー細菌群おいて各々の細菌存在比率の閾値を設定し、陽性判定される細菌の数が表１０に示す最小数以上である場合に「未治療の齲蝕歯 有り」と判定すると、感度、特異度が高いことがわかる。
Claims (17)
- 被験者の齲蝕リスクを判定するために、被験者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量を測定する方法であって、
前記マーカー細菌が、カンピロバクター属細菌、ベイヨネラ属細菌、トレポネーマ属細菌、ナイセリア属細菌、モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、アロプレボテラ属細菌、ジアリスター属細菌、タンネラ属細菌、ラクノアナエロバクラム属細菌、及びメガスファエラ属細菌からなる群から選択される少なくとも１種である方法。 - 健常者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量と比較して、
前記ナイセリア属細菌、前記モラクセラ属細菌、又は前記グラヌリカテラ属細菌が少ないか、或いは前記カンピロバクター属細菌、前記ベイヨネラ属細菌、前記トレポネーマ属細菌、前記アロプレボテラ属細菌、前記ジアリスター属細菌、前記タンネラ属細菌、前記ラクノアナエロバクラム属細菌、又は前記メガスファエラ属細菌が多いときに、齲蝕リスクが高いと判定する請求項１に記載の方法。 - 前記マーカー細菌が、前記ベイヨネラ属細菌、前記ナイセリア属細菌、前記モラクセラ属細菌、前記グラヌリカテラ属細菌、前記タンネラ属細菌、前記ラクノアナエロバクラム属細菌、及び前記メガスファエラ属細菌からなる群から選択される少なくとも１種である請求項１又は２に記載の方法。
- 前記マーカー細菌が、前記カンピロバクター属細菌と前記ベイヨネラ属細菌の組み合わせ、前記ベイヨネラ属細菌と前記トレポネーマ属細菌の組み合わせ、前記アロプレボテラ属細菌と前記ジアリスター属細菌の組み合わせ、前記ベイヨネラ属細菌と前記タンネラ属細菌の組み合わせ、前記タンネラ属細菌と前記ナイセリア属細菌の組み合わせ、又は前記トレポネーマ属細菌と前記ナイセリア属細菌の組み合わせである請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
- 下記条件（１）を満たすときに、齲蝕リスクが高いと判定する請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
条件（１）：前記カンピロバクター属細菌の存在比率が０．４３％以上、前記ベイヨネラ属細菌の存在比率が２．７％以上、前記トレポネーマ属細菌の存在比率が０．０３％以上、前記ナイセリア属細菌の存在比率が１８％以下、前記モラクセラ属細菌の存在比率が０．０３％以下、前記グラヌリカテラ属細菌の存在比率が２．５％以下、前記アロプレボテラ属細菌の存在比率が０．３５％以上、前記ジアリスター属細菌の存在比率が０．０５％以上、前記タンネラ属細菌の存在比率が０．０５％以上、前記ラクノアナエロバクラム属細菌の存在比率が０．０５％以上、及び前記メガスファエラ属細菌の存在比率が０．０３％以上の少なくとも１つ。 - 下記設定（１）～（６）のいずれかを満たすときに、齲蝕リスクが高いと判定する請求項５に記載の方法。
設定（１）：カンピロバクター属細菌、ベイヨネラ属細菌、及びトレポネーマ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、前記条件（１）で規定する存在比率を満たすマーカー細菌の数が１つ以上。
設定（２）：カンピロバクター属細菌、ベイヨネラ属細菌、トレポネーマ属細菌、ナイセリア属細菌、モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、アロプレボテラ属細菌、ジアリスター属細菌、タンネラ属細菌、ラクノアナエロバクラム属細菌、及びメガスファエラ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、前記条件（１）で規定する存在比率を満たすマーカー細菌の数が６つ以上。
設定（３）：モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、及びアロプレボテラ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、前記条件（１）で規定する存在比率を満たすマーカー細菌の数が２つ以上。
設定（４）：モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、アロプレボテラ属細菌、ジアリスター属細菌、及びタンネラ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、前記条件（１）で規定する存在比率を満たすマーカー細菌の数が３つ以上。
設定（５）：モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、アロプレボテラ属細菌、ジアリスター属細菌、タンネラ属細菌、ラクノアナエロバクラム属細菌、及びメガスファエラ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、前記条件（１）で規定する存在比率を満たすマーカー細菌の数が４つ以上。
設定（６）：ベイヨネラ属細菌、トレポネーマ属細菌、ナイセリア属細菌、モラクセラ属細菌、及びグラヌリカテラ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、前記条件（１）で規定する存在比率を満たすマーカー細菌の数が２つ以上。 - 被験者の未治療の齲蝕歯の有無を判定するために、被験者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量を測定する方法であって、
前記マーカー細菌が、アグリゲイティバクター属細菌、アクチノバチルス属細菌、オリバクテリウム属細菌、アトポビウム属細菌、エイケネラ属細菌、パラプレボテラ属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、アルスロバクター属細菌、シネルギステス属細菌、アクチノマイセス属細菌、マイコプラズマ属細菌、及びスカードビア属細菌からなる群から選択される少なくとも１種である方法。 - 健常者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量と比較して、前記マーカー細菌のいずれかが少ないときに、未治療の齲蝕歯が有ると判定する請求項７に記載の方法。
- 前記マーカー細菌が、オリバクテリウム属細菌、アルスロバクター属細菌、パラプレボテラ属細菌、アクチノバチルス属細菌、アグリゲイティバクター属細菌、及びカプノサイトファーガ属細菌からなる群から選択される少なくとも１種である請求項７又は８に記載の方法。
- 下記条件（２）を満たすときに、未治療の齲蝕歯が有ると判定する請求項７～９のいずれか１項に記載の方法。
条件（２）：前記アグリゲイティバクター属細菌の存在比率が０．３％以下、前記アクチノバチルス属細菌の存在比率が０．０５％以下、前記オリバクテリウム属細菌の存在比率が０．０７％以下、前記アトポビウム属細菌の存在比率が０．５％以下、前記エイケネラ属細菌の存在比率が０．０５％以下、前記パラプレボテラ属細菌の存在比率が０．０３％以下、前記カプノサイトファーガ属細菌の存在比率が０．６％以下、前記アルスロバクター属細菌の存在比率が０．０３％以下、前記シネルギステス属細菌の存在比率が０．０３％以下、前記アクチノマイセス属細菌の存在比率が２％以下、前記マイコプラズマ属細菌の存在比率が０．０３％以下、及び前記スカードビア属細菌の存在比率が０．０３％以下の少なくとも１つ。 - 下記設定（１）～（３）のいずれかを満たすときに、未治療の齲蝕歯が有ると判定する請求項１０に記載の方法。
設定（１）：アグリゲイティバクター属細菌、アクチノバチルス属細菌、エイケネラ属細菌、パラプレボテラ属細菌、及びシネルギステス属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、前記条件（２）で規定する存在比率を満たすマーカー細菌が全て。
設定（２）：アグリゲイティバクター属細菌、アクチノバチルス属細菌、オリバクテリウム属細菌、エイケネラ属細菌、パラプレボテラ属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、アルスロバクター属細菌、及びシネルギステス属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、前記条件（２）で規定する存在比率を満たすマーカー細菌の数が７つ以上。
設定（３）：アグリゲイティバクター属細菌、アトポビウム属細菌、エイケネラ属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、シネルギステス属細菌、アクチノマイセス属細菌、マイコプラズマ属細菌、及びスカードビア属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、前記条件（２）で規定する存在比率を満たすマーカー細菌の数が６つ以上。 - 前記生体試料が、口腔内から採取した試料である請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記試料が、唾液、歯垢、歯石、舌苔又は歯肉滲出液である請求項１２に記載の方法。
- 被験者の齲蝕歯のリスク判定用バイオマーカーであって、
カンピロバクター属細菌、ベイヨネラ属細菌、トレポネーマ属細菌、ナイセリア属細菌、モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、アロプレボテラ属細菌、ジアリスター属細菌、タンネラ属細菌、ラクノアナエロバクラム属細菌、及びメガスファエラ属細菌からなる群から選択される少なくとも１種のマーカー細菌、又は該マーカー細菌の由来成分を含むバイオマーカー。 - 被験者の未治療の齲蝕歯の有無の判定用バイオマーカーであって、
アグリゲイティバクター属細菌、アクチノバチルス属細菌、オリバクテリウム属細菌、アトポビウム属細菌、エイケネラ属細菌、パラプレボテラ属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、アルスロバクター属細菌、シネルギステス属細菌、アクチノマイセス属細菌、マイコプラズマ属細菌、及びスカードビア属細菌からなる群から選択される少なくとも１種のマーカー細菌、又は該マーカー細菌の由来成分を含むバイオマーカー。 - 被験者の齲蝕歯のリスク判定用バイオマーカーである、カンピロバクター属細菌、ベイヨネラ属細菌、トレポネーマ属細菌、ナイセリア属細菌、モラクセラ属細菌、グラヌリカテラ属細菌、アロプレボテラ属細菌、ジアリスター属細菌、タンネラ属細菌、ラクノアナエロバクラム属細菌、及びメガスファエラ属細菌からなる群から選択される少なくとも１種のマーカー細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出し得る、プライマーペア、プローブ、及び前記プローブが固定されているマイクロアレイからなる群より選ばれる１以上を含む、検出キット。
- 被験者の未治療の齲蝕歯の判定用バイオマーカーである、アグリゲイティバクター属細菌、アクチノバチルス属細菌、オリバクテリウム属細菌、アトポビウム属細菌、エイケネラ属細菌、パラプレボテラ属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、アルスロバクター属細菌、シネルギステス属細菌、アクチノマイセス属細菌、マイコプラズマ属細菌、及びスカードビア属細菌からなる群から選択される少なくとも１種のマーカー細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出し得る、２以上のプライマーペア、プローブ、及び前記プローブが固定されているマイクロアレイからなる群より選ばれる１以上を含む、検出キット。
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