WO2024090455A1 - 多発性硬化症の診断方法及び診断用バイオマーカー - Google Patents

多発性硬化症の診断方法及び診断用バイオマーカー Download PDF

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multiple sclerosis
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隆 山村
和貴郎 佐藤
大貴 竹脇
亙 須田
伶奈 高安
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国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター
国立研究開発法人理化学研究所
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    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing multiple sclerosis and a diagnostic biomarker.
  • MS Multiple sclerosis
  • SPMS secondary progressive MS
  • MS is diagnosed by combining clinical findings with test results such as brain and spinal MRI and cerebrospinal fluid tests, but in early-stage cases where there are few abnormal findings, diagnosis is often difficult, and it takes an average of about three years to make a diagnosis.
  • many disease-modifying drugs for MS have become available for clinical use, but many clinical studies have shown that early diagnosis and initiation of treatment significantly improves prognosis, which has led to great interest in the development of biomarkers that will enable early diagnosis of MS.
  • Non-Patent Documents 3-6 The present inventors were the first in the world to report the characteristics of the intestinal microbiota of MS patients based on 16S ribosomal RNA (16S rRNA) gene analysis and metagenomic analysis, and have provided diagnostic methods and biomarkers for autoimmune diseases such as MS using fecal samples (Patent Documents 1-2, Non-Patent Documents 7-8).
  • 16S rRNA 16S ribosomal RNA
  • the present invention aims to provide a method for diagnosing multiple sclerosis using saliva samples from multiple sclerosis patients and a diagnostic biomarker.
  • the present inventors used 16S rRNA gene data from saliva samples to comparatively analyze salivary microbiota from multiple sclerosis patients and healthy individuals. As a result, they showed an altered salivary microbiota in multiple sclerosis patients compared to healthy individuals, and identified various microbial taxa that showed significant changes in abundance between multiple sclerosis patients and healthy individuals. In addition, based on the salivary microbiota, they developed a predictive model using a random forest algorithm (a machine learning predictive model) and evaluated its predictive accuracy as a microbiota-based non-invasive diagnostic marker for multiple sclerosis. The present invention is based on these findings.
  • the present invention relates to the following inventions [1] to [11], for example.
  • a method for diagnosing multiple sclerosis comprising the steps of measuring the relative abundance of bacteria in a saliva sample collected from a subject before and after treatment, and performing either (1) or (2) of the following: (1) When the relative abundance of bacteria having a base sequence of a 16S ribosomal RNA gene that has 97% or more homology with the base sequence of a 16S ribosomal RNA gene of any of bacteria belonging to the bacterial genus of group A-1 or the bacterial species of group B-1 is higher than the relative abundance in healthy individuals, the subject is judged to be suffering from multiple sclerosis or to be at high risk of suffering from multiple sclerosis.
  • Group A-1 Actinomyces, Selenomonas, Streptococcus, Lactobacillus, Corynebacterium, Rothia, Schaalia, Atopobium, Citrobacter Group A-2: Haemophilus, Porphyromonas, Alloprevotella, Gemella, Fusobacterium Group B-1: Actinomyces gravenitzii, Selenomonas infelix, Actinomyces viscosus, Streptococcus salivarius, Rothia mucilaginosa, Corynebacterium matruchotii, Streptococcus parasanguinis, Actinomyces naeslundii, Prevotella histicola, Streptococcus anginosus, Schaalia odontolitica, Prevotella denticola, Streptococcus lactius, Atopobium parvulum Group B-2: Porphyromonas pasteri, Haemophilus
  • Group A-1 Actinomyces, Selenomonas, Streptococcus, Lactobacillus, Corynebacterium, Rothia, Schaalia, Atopobium, Citrobacter Group A-2: Haemophilus, Porphyromonas, Alloprevotella, Gemella, Fusobacterium Group B-1: Actinomyces gravenitzii, Selenomonas infelix, Actinomyces viscosus, Streptococcus salivarius, Rothia mucilaginosa, Corynebacterium matruchotii, Streptococcus parasanguinis, Actinomyces naeslundii, Prevotella histicola, Streptococcus anginosus, Schaalia odontolitica, Prevotella denticola, Streptococcus lactius, Atopobium parvulum Group B-2: Porphyromonas pasteri, Haemophilus
  • a diagnostic biomarker for multiple sclerosis comprising salivary bacteria whose 16S ribosomal RNA gene base sequence has 97% or more homology with the 16S ribosomal RNA gene base sequence of any of bacteria belonging to bacterial genera of groups A-1 and A-2 and bacterial species of groups B-1 and B-2.
  • Group A-1 Actinomyces, Selenomonas, Streptococcus, Lactobacillus, Corynebacterium, Rothia, Schaalia, Atopobium, Citrobacter Group A-2: Haemophilus, Porphyromonas, Alloprevotella, Gemella, Fusobacterium Group B-1: Actinomyces gravenitzii, Selenomonas infelix, Actinomyces viscosus, Streptococcus salivarius, Rothia mucilaginosa, Corynebacterium matruchotii, Streptococcus parasanguinis, Actinomyces naeslundii, Prevotella histicola, Streptococcus anginosus, Schaalia odontolitica, Prevotella denticola, Streptococcus lactius, Atopobium parvulum Group B-2: Porphyromonas pasteri, Haemophilus
  • Group A-1 Actinomyces, Selenomonas, Streptococcus, Lactobacillus, Corynebacterium, Rothia, Schaalia, Atopobium, Citrobacter Group A-2: Haemophilus, Porphyromonas, Alloprevotella, Gemella, Fusobacterium Group B-1: Actinomyces gravenitzii, Selenomonas infelix, Actinomyces viscosus, Streptococcus salivarius, Rothia mucilaginosa, Corynebacterium matruchotii, Streptococcus parasanguinis, Actinomyces naeslundii, Prevotella histicola, Streptococcus anginosus, Schaalia odontolitica, Prevotella denticola, Streptococcus lactius, Atopobium parvulum Group B-2: Porphyromonas pasteri, Haemophilus
  • a preventive or therapeutic agent for multiple sclerosis comprising as an active ingredient at least one selected from the group consisting of bacteria whose 16S ribosomal RNA gene base sequence has 97% or more homology with the 16S ribosomal RNA gene base sequence of any one of bacteria belonging to group A-2 bacterial genus or group B-2 bacterial species, and physiologically active substances derived from the above bacteria.
  • A-1 Actinomyces, Selenomonas, Streptococcus, Lactobacillus, Corynebacterium, Rothia, Schaalia, Atopobium, Citrobacter Group B-1: Actinomyces gravenitzii, Selenomonas infelix, Actinomyces viscosus, Streptococcus salivarius, Rothia mucilaginosa, Corynebacterium matruchotii, Streptococcus parasanguinis, Actinomyces naeslundii, Prevotella histicola, Streptococcus anginosus, Schaalia odontolitica, Prevotella denticola, Streptococcus lactius, Atopobium parvulum [11] A preventive or therapeutic agent for multiple sclerosis, comprising as an active ingredient at least one selected from the group consisting of a bacterium whose 16S ribosomal RNA gene base sequence has
  • a method for preventing or treating multiple sclerosis comprising administering to a subject in need thereof at least one kind selected from the group consisting of bacteria whose 16S ribosomal RNA gene base sequence has 97% or more homology with the 16S ribosomal RNA gene base sequence of any one of bacteria belonging to group A-2 bacterial genus or group B-2 bacterial species, and physiologically active substances derived from said bacteria.
  • Group A-1 Actinomyces, Selenomonas, Streptococcus, Lactobacillus, Corynebacterium, Rothia, Schaalia, Atopobium, Citrobacter Group B-1: Actinomyces gravenitzii, Selenomonas infelix, Actinomyces viscosus, Streptococcus salivarius, Rothia mucilaginosa, Corynebacterium matruchotii, Streptococcus parasanguinis, Actinomyces naeslundii, Prevotella histicola, Streptococcus anginosus, Schaalia odontolitica, Prevotella denticola, Streptococcus lactius, Atopobium parvulum [13] A method for preventing or treating multiple sclerosis, comprising administering to a subject in need thereof at least one selected from the group consisting of a bacterium whose 16S ribosomal
  • the present invention also relates to the following [2-1] to [2-7].
  • a non-transitory computer-readable recording medium having recorded thereon a program for causing a computer to execute the following steps: obtaining base sequence data by comprehensively deciphering the base sequences of the 16S ribosomal RNA genes of bacteria contained in a saliva sample collected from a subject; calculating, from the obtained base sequence data based on a 16S ribosomal RNA gene database, the frequency of base sequences that have 97% or more homology with the base sequence of the 16S ribosomal RNA gene of any of the bacteria of the bacterial genera of groups A-1 and A-2, and the bacterial species of groups B-1 and B-2, and calculating the relative abundance of the base sequences; comparing the calculated relative abundance with a pre-input standard value to determine the pathology of multiple sclerosis; and outputting the obtained determination result.
  • Group A-1 Actinomyces, Selenomonas, Streptococcus, Lactobacillus, Corynebacterium, Rothia, Schaalia, Atopobium, Citrobacter Group A-2: Haemophilus, Porphyromonas, Alloprevotella, Gemella, Fusobacterium Group B-1: Actinomyces gravenitzii, Selenomonas infelix, Actinomyces viscosus, Streptococcus salivarius, Rothia mucilaginosa, Corynebacterium matruchotii, Streptococcus parasanguinis, Actinomyces naeslundii, Prevotella histicola, Streptococcus anginosus, Schaalia odontolitica, Prevotella denticola, Streptococcus lactius, Atopobium parvulum Group B-2: Porphyromonas pasteri, Haemophilus
  • a non-transitory recording medium according to any one of [2-1] to [2-4], wherein the base sequence of the 16S ribosomal RNA gene of the bacterial species of group B-1 is the base sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 14, and the base sequence of the 16S ribosomal RNA gene of the bacterial species of group B-2 is the base sequence shown in SEQ ID NOs: 15 to 24.
  • a diagnostic system for multiple sclerosis comprising an input means for acquiring base sequence data obtained by comprehensively deciphering the base sequences of the 16S ribosomal RNA genes of bacteria contained in a fecal sample collected from a subject, a calculation means for determining whether the subject is suffering from multiple sclerosis or is at high risk of suffering from multiple sclerosis based on the acquired base sequence data, and an output means for outputting the determination result obtained by the calculation means.
  • a diagnostic system for relapsing-remitting multiple sclerosis comprising an input means for acquiring base sequence data obtained by comprehensively deciphering the base sequences of the 16S ribosomal RNA genes of bacteria contained in a fecal sample collected from a subject after treatment, a calculation means for determining whether the subject's multiple sclerosis condition has improved by treatment based on the acquired base sequence data, and an output means for outputting the determination result obtained by the calculation means.
  • the present invention makes it possible to provide a method for diagnosing multiple sclerosis based on salivary microbiota. Since collection and storage of saliva samples is easier than collection and storage of fecal samples, the diagnostic method of the present invention is easier than diagnostic methods based on fecal microbiota. Furthermore, the present invention makes it possible to provide a biomarker for diagnosing multiple sclerosis, as well as a therapeutic agent for multiple sclerosis.
  • FIG. 1 shows the results of a comparison of bacterial flora composition at the phylum level among five subject groups.
  • FIG. 1 shows the results of a comparison of bacterial flora composition at the genus level among five subject groups. The results of comparing the mean relative abundance of bacterial species at the genus level among the five subject groups are shown.
  • Species-level taxonomic assignment based on 16S data indicates that statistically significant differences were observed among species-equivalent clusters with mean relative abundance of 0.1% or more in at least one of the five subject groups. Species-level taxonomic assignment based on 16S data indicates that statistically significant differences were observed among species-equivalent clusters with mean relative abundance of 0.1% or more in at least one of the five subject groups.
  • FIG. 1 shows the differences between high and low disease activity groups.
  • FIG. 1 shows the differences between high and low disease activity groups.
  • FIG. 1 shows the differences between high and low disease activity groups.
  • FIG. 1 shows the relative expression levels of five salivary bacteria that were significantly increased or decreased in abundance in patients with high disease activity compared to those with low disease activity in all patients.
  • 1 shows the patient profiles of the RRMS discovery and validation cohorts, respectively.
  • 1 shows the results of random forest algorithm analysis of saliva and gut microbiota from the RRMS group and healthy control group.
  • a list of 14 bacterial genera selected by the random forest algorithm and their abundance-based Z-scores are shown.
  • a list of 24 bacteria selected by the random forest algorithm and their abundance-based Z-scores are shown.
  • the mean AUC of salivary microbiota at genus and species level among RRMS, early onset RRMS, mild RRMS and HC groups is shown.
  • the mean AUC of salivary and fecal microbiota at genus and species level among RRMS, early onset RRMS, mild RRMS and HC groups is shown.
  • Multiple sclerosis is an autoimmune disease caused by the immune system's reaction against normal cells and tissues.
  • Multiple sclerosis can be classified into subtypes, such as relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS), which repeats acute exacerbations and remissions, secondary progressive multiple sclerosis (SPMS), which progresses to a progressive pathology after a certain period of RRMS pathology, and atypical multiple sclerosis (Atypical MS), which has almost no brain lesions specific to MS.
  • RRMS RRMS with a disease duration of 5 years or less is called early RRMS
  • RRMS with an EDSS score of 1 or less is called mild RRMS.
  • NMOSD neuromyelitis optica-related disorders
  • the method for diagnosing multiple sclerosis according to the present embodiment is based on the composition of the salivary bacterial flora of the subject, and can be used to determine the presence or absence of multiple sclerosis or the risk of developing multiple sclerosis, and to determine the effectiveness of treatment for multiple sclerosis.
  • the method for diagnosing multiple sclerosis according to the present embodiment can also be considered as a method for assisting diagnosis.
  • a method for diagnosing multiple sclerosis comprises measuring the relative abundance of bacteria in a saliva sample collected from a subject, and carrying out the following steps (1) or (2).
  • (1) When the relative abundance of bacteria having a base sequence of a 16S ribosomal RNA gene that has 97% or more homology with the base sequence of a 16S ribosomal RNA gene of any of bacteria of the bacterial genus of group A-1 or the bacterial species of group B-1 is higher than the relative abundance in healthy individuals, the subject is judged to have multiple sclerosis or to be at high risk of having multiple sclerosis.
  • Group A-1 Actinomyces, Selenomonas, Streptococcus, Lactobacillus, Corynebacterium, Rothia, Schaalia, Atopobium, Citrobacter Group A-2: Haemophilus, Porphyromonas, Alloprevotella, Gemella, Fusobacterium Group B-1: Actinomyces gravenitzii, Selenomonas infelix, Actinomyces viscosus, Streptococcus salivarius, Rothia mucilaginosa, Corynebacterium matruchotii, Streptococcus parasanguinis, Actinomyces naeslundii, Prevotella histicola, Streptococcus anginosus, Schaalia odontolitica, Prevotella denticola, Streptococcus lactius, Atopobium parvulum Group B-2: Porphyromonas pasteri, Haemophilus
  • a method for diagnosing multiple sclerosis comprises measuring the relative abundance of bacteria in a saliva sample collected from a subject before and after treatment, and performing the following (3) or (4): (3) The relative abundance of bacteria whose 16S ribosomal RNA gene base sequence has 97% or more homology with the base sequence of the 16S ribosomal RNA gene of any of the bacteria of the bacterial genus of group A-1 or the bacterial species of group B-1 is compared before and after the treatment, and if the relative abundance after the treatment is lower than before the treatment, the pathology of multiple sclerosis of the subject is judged to have been improved by the treatment.
  • the bacteria of the above group A-1 bacterial genus and the above group B-1 bacterial species, identified by the base sequence of the V1-V2 region of the 16S rRNA gene were identified as bacteria whose relative abundance was significantly increased in MS patients, particularly in RRMS patients, compared to healthy controls.
  • the bacteria of the above group A-2 bacterial genus and the above group B-2 bacterial species, identified by the base sequence of the V1-V2 region of the 16S rRNA gene were identified as bacteria whose relative abundance was significantly decreased in MS patients compared to healthy controls.
  • the homology is preferably 98% or more, 99% or more, or 99.5% or more, more preferably 99.7% or more, even more preferably 99.9% or more, and even more preferably 100%.
  • homology refers to the percentage of matching bases when two base sequences are aligned (e.g., alignment using the BLAST algorithm).
  • the multiple sclerosis to be diagnosed includes subtypes such as relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS), secondary progressive multiple sclerosis (SPMS), and atypical multiple sclerosis (atypical MS), and is preferably relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS).
  • RRMS relapsing-remitting multiple sclerosis
  • SPMS secondary progressive multiple sclerosis
  • atypical MS atypical multiple sclerosis
  • the base sequence of the V1-V2 region of the 16S rRNA gene is a base sequence that includes the V1 variable region and the V2 variable region.
  • the base sequence of the bacterial 16S ribosomal RNA gene may be the base sequence of the V1-V2 region of the 16S rRNA gene.
  • the base sequence of the V1-V2 region of the 16S rRNA gene of bacteria derived from saliva can be subjected to a similarity search in a known 16S database (e.g., RDP or CORE) and the NCBI genome database, and a taxonomic assignment can be made to identify the genus or species of the bacteria.
  • the threshold of sequence homology may be set to 97%, and from the viewpoint of further increasing the accuracy of the determination, it is preferable that it is 98%, 99% or 99.5%, more preferably 99.7%, even more preferably 99.9%, and even more preferably 100%.
  • Actinomyces bacteria include, but are not limited to, Actinomyces gravenitzii, Actinomyces viscosus, Actinomyces naeslundii, Actinomyces dentalis, Actinomyces haliotis, Actinomyces ihuae, Actinomyces israelii, Actinomyces johnsonii, Actinomyces massiliensis, Actinomyces oris, and Actinomyces timonensis.
  • the base sequences of the 16S ribosomal RNA genes or the V1-V2 regions of the 16S rRNA genes of these bacteria can be obtained from known databases (e.g., the RDP, CORE, or NCBI databases).
  • Selenomonas bacteria are not particularly limited, but examples include Selenomonas infelix, Selenomonas artemidis, Selenomonas dianae, Selenomonas infelix, Selenomonas noxia, and Selenomonas spumblea.
  • the base sequences of the 16S ribosomal RNA genes or the V1-V2 regions of the 16S rRNA genes of these bacteria can be obtained from known databases (e.g., the RDP, CORE, or NCBI databases).
  • the genus Streptococcus is not particularly limited, but examples thereof include Streptococcus salivarius, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus anginosus, Streptococcus lactarius, Streptococcus agalactiae, Streptococcus s alactolyticus, Streptococcus australis, Streptococcus constellatus, Streptococcus cristatus, Streptococcus downei, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus equinus, Streptococcus g ordonii, Streptococcus infantis, Streptococcus intermedius, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus pasteurianus, Streptococcus pneumoniae, Strep Examples of such bacteria include Streptococcus pseudopneumoni
  • the genus Lactobacillus is not particularly limited, but examples thereof include Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus antri, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus s fermentum, Lactobacillus frumenti, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus iners, Lactobacillus intestinalis, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus s kitasatonis, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus murinus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus pontis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rh amnosus, Lactobacillus rogosae, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus sanfrancis
  • Bacteria of the genus Corynebacterium include, but are not limited to, Corynebacterium matruchotii, Corynebacterium argentoratense, Corynebacterium durum, Corynebacterium jeddahense, Corynebacterium kroppenstedtii, Corynebacterium propinquum, Corynebacterium renale, Corynebacterium simulans, and Corynebacterium tuberculostearicum.
  • the base sequences of the 16S ribosomal RNA genes or the V1-V2 regions of the 16S rRNA genes of these bacteria can be obtained from known databases (e.g., the RDP, CORE, or NCBI databases).
  • Bacteria of the genus Rothia include, but are not limited to, Rothia mucilaginosa, Rothia dentocariosa, Rothia endophytica, Rothia kristinae, etc.
  • the base sequences of the 16S ribosomal RNA genes or the V1-V2 regions of the 16S rRNA genes of these bacteria can be obtained from known databases (e.g., the RDP, CORE, or NCBI databases).
  • Schaalia bacteria include, but are not limited to, Schaalia odontolitica, Schaalia cardiffensis, Schaalia georgiae, Schaalia meyeri, and Schaalia vaccimaxillae.
  • the base sequences of the 16S ribosomal RNA genes or the V1-V2 regions of the 16S rRNA genes of these bacteria can be obtained from known databases (e.g., the RDP, CORE, or NCBI databases).
  • Bacteria of the genus Atopobium include, but are not limited to, Atopobium parvulum, Atopobium rimae, etc.
  • the base sequences of the 16S ribosomal RNA genes or the V1-V2 regions of the 16S rRNA genes of these bacteria can be obtained from known databases (e.g., the RDP, CORE, or NCBI databases).
  • Bacteria of the genus Citrobacter include, but are not limited to, Citrobacter rodentium, Citrobacter amalonaticus, Citrobacter farmeri, Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, etc.
  • the base sequences of the 16S ribosomal RNA genes or the V1-V2 regions of the 16S rRNA genes of these bacteria can be obtained from known databases (e.g., the RDP, CORE, or NCBI databases).
  • Bacteria of the genus Haemophilus include, but are not limited to, Haemophilus haemolyticus, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus sputorum, Haemophilus parahaemolyticus, Haemophilus influenzae, Haemophilus parahaemolyticus, and Haemophilus pittmaniae.
  • the base sequences of the 16S ribosomal RNA genes or the V1-V2 regions of the 16S rRNA genes of these bacteria can be obtained from known databases (e.g., the RDP, CORE, or NCBI databases).
  • Porphyromonas Bacteria of the genus Porphyromonas are not particularly limited, but examples thereof include Porphyromonas pasteri, Porphyromonas catoniae, Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas pogonae, and Porphyromonas unonis.
  • the base sequences of the 16S ribosomal RNA genes or the V1-V2 regions of the 16S rRNA genes of these bacteria can be obtained from known databases (e.g., the RDP, CORE, or NCBI databases).
  • Alloprevotella Bacteria of the genus Alloprevotella include, but are not limited to, Alloprevotella rava and Alloprevotella tannerae.
  • the base sequences of the 16S ribosomal RNA genes or the V1-V2 regions of the 16S rRNA genes of these bacteria can be obtained from known databases (e.g., the RDP, CORE, or NCBI databases).
  • Bacteria of the genus Gemella include, but are not limited to, Gemella sanguinis, Gemella haemolysans, and Gemella morbillorum.
  • the base sequences of the 16S ribosomal RNA genes or the V1-V2 regions of the 16S rRNA genes of these bacteria can be obtained from known databases (e.g., the RDP, CORE, or NCBI databases).
  • Bacteria of the genus Fusobacterium are not particularly limited, but examples thereof include Fusobacterium periodonticum, Fusobacterium canifelinum, Fusobacterium mortiferum, Fusobacterium necrophorum, Fusobacterium nucleatum, and Fusobacterium varium.
  • the base sequences of the 16S ribosomal RNA genes or the V1-V2 regions of the 16S rRNA genes of these bacteria can be obtained from known databases (e.g., the RDP, CORE, or NCBI databases).
  • the base sequence of the 16S ribosomal RNA gene of the bacterial species of group B-1 may be the base sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 14, and the base sequence of the 16S ribosomal RNA gene of the bacterial species of group B-2 may be the base sequence shown in SEQ ID NOs: 15 to 24 (Table 1).
  • SEQ ID NOs: 1 to 24 are partial sequences of the 16S ribosomal RNA gene of each bacterial species shown in Table 1, and include the base sequences of the V1 region to V2 region.
  • the subject can be determined to have multiple sclerosis or to have a high risk of developing multiple sclerosis.
  • the subject can be determined to have multiple sclerosis or to have a high risk of developing multiple sclerosis.
  • a determination may be made for at least one of the bacteria whose 16S ribosomal RNA gene base sequence has 97% or more homology with the above 14 genera and the above 24 species of bacteria. From the viewpoint of further increasing the accuracy of the determination, a determination may be made for two or more of the above bacteria, and preferably, a determination may be made for three or more, four or more, five or more, six or more, seven or more, eight or more, nine or more, ten or more, or all of the above bacteria.
  • the relative abundance of the above bacteria in healthy individuals may be measured in advance.
  • the relative abundance of the above bacteria in healthy individuals may be the average value of multiple healthy individuals.
  • the presence or absence of significant differences can be analyzed by statistical analysis (e.g., Welch's t-test) from multiple data on the relative abundance of the above bacteria in healthy individuals and the data on the relative abundance of the subject.
  • the relative abundance of bacteria whose 16S ribosomal RNA gene base sequence has 97% or more homology with the 16S ribosomal RNA gene base sequence of any of the bacteria of the bacterial genus of group A-1 or the bacterial species of group B-1 is compared before and after treatment, and if the relative abundance after treatment is less than before treatment, it can be determined that the condition of multiple sclerosis in the subject has been improved by the treatment.
  • the relative abundance of bacteria whose 16S ribosomal RNA gene base sequence has 97% or more homology with the 16S ribosomal RNA gene base sequence of any of the bacteria of the bacterial genus of group A-2 or the bacterial species of group B-2 is compared before and after treatment, and if the relative abundance after treatment is more than before treatment, it can be determined that the condition of multiple sclerosis in the subject has been improved by the treatment.
  • the relative abundance of the above bacteria in a subject before treatment may be measured in advance, or may be measured approximately simultaneously with the relative abundance of the above bacteria in a subject after treatment.
  • the terms "before treatment” and “after treatment” used here include, for example, before and after a treatment (e.g., a third dose) administered during a period of continuous treatment (e.g., regular medication).
  • the relative abundance of bacteria means the proportion of the (specific) bacteria in the entire bacterial flora.
  • the relative abundance of bacteria can be calculated, for example, from the total number of bacteria that make up the bacterial flora and the number of specific bacteria contained in the bacterial flora. More specifically, for example, genes (e.g., 16S rRNA genes) that have a base sequence common to the bacteria contained in the bacterial flora and a base sequence characteristic of each bacterial species can be comprehensively decoded, and the total number of decoded genes and the total number of genes belonging to a specific bacterial species can be used as the total number of bacteria that make up the bacterial flora and the number of specific bacteria, respectively, to calculate the relative abundance of the specific bacteria.
  • genes e.g., 16S rRNA genes
  • the method for diagnosing multiple sclerosis includes a step of measuring the relative abundance of bacteria contained in a saliva sample collected from a subject, the bacteria being bacteria having 97% or more homology with the base sequence of the 16S ribosomal RNA gene of any of the bacteria of the bacterial genus of group A-1 or the bacterial species of group B-1, or bacteria having 97% or more homology with the base sequence of the 16S ribosomal RNA gene of any of the bacteria of the bacterial genus of group A-2 or the bacterial species of group B-2, and can also be considered as a data collection method for determining the presence or absence of multiple sclerosis or the risk of developing it.
  • the method for diagnosing multiple sclerosis also includes a step of measuring the relative abundance of bacteria contained in a saliva sample collected from a subject, the bacteria being bacteria having 97% or more homology to the base sequence of the 16S ribosomal RNA gene of any of the bacteria of the bacterial genus of group A-1 or the bacterial species of group B-1, or bacteria having 97% or more homology to the base sequence of the 16S ribosomal RNA gene of any of the bacteria of the bacterial genus of group A-2 or the bacterial species of group B-2, and can also be considered as a data collection method for assessing the effectiveness of a treatment for multiple sclerosis.
  • Diagnostic program and diagnostic system The above-described method for diagnosing multiple sclerosis according to the present embodiment can also be provided as a diagnostic program that causes a computer to function as a system for diagnosing multiple sclerosis.
  • the multiple sclerosis diagnostic program causes a computer to execute the steps of: acquiring base sequence data by comprehensively deciphering the base sequences of the 16S ribosomal RNA genes of bacteria contained in a saliva sample collected from a subject; calculating the frequency of base sequences that have 97% or more homology with the base sequences of the 16S ribosomal RNA genes of bacteria of the bacterial genera of groups A-1 and A-2, and the bacterial species of groups B-1 and B-2 from the acquired base sequence data based on a 16S ribosomal RNA gene database, and calculating the relative abundance of the base sequences; comparing the calculated relative abundance with a previously input reference value to determine the pathology of multiple sclerosis; and outputting the obtained determination result.
  • the reference value is the relative abundance of the corresponding base sequence in a healthy individual, and if the relative abundance is the relative abundance of bacteria having 97% or more homology with the base sequence of the 16S ribosomal RNA gene of any of the bacteria of the bacterial genus of group A-1 or the bacterial species of group B-1, and the calculated relative abundance is higher than the relative abundance in a healthy individual, or if the relative abundance is the relative abundance of bacteria having 97% or more homology with the base sequence of the 16S ribosomal RNA gene of any of the bacteria of the bacterial genus of group A-2 or the bacterial species of group B-2, and the calculated relative abundance is lower than the relative abundance in a healthy individual, the subject is determined to have multiple sclerosis or to be at high risk of having multiple sclerosis.
  • the multiple sclerosis diagnostic system includes an input means for acquiring base sequence data obtained by comprehensively deciphering the base sequences of the 16S ribosomal RNA gene of bacteria contained in a saliva sample collected from a subject, a calculation means for determining whether the subject is suffering from multiple sclerosis or is at high risk of suffering from multiple sclerosis based on the acquired base sequence data, and an output means for outputting the determination result obtained by the calculation means.
  • the calculation means (e.g., a CPU) performs the steps of: calculating a relative abundance from the frequency of occurrence of at least one base sequence having 97% or more homology with the base sequence of the 16S ribosomal RNA gene of bacteria of the bacterial genera of group A-1 and group A-2, and the bacterial species of group B-1 and group B-2 from the input base sequence data; comparing the calculated relative abundance with a reference value (the above-mentioned relative abundance in a healthy person) read from a storage device (e.g., ROM, RAM); and (i-1) determining whether the above-mentioned relative abundance is higher than the frequency of occurrence of the 16S ribosomal RNA gene of bacteria of the bacterial genera of group A-1 or the bacterial species of group B-1.
  • a storage device e.g., ROM, RAM
  • the step of determining that the subject is suffering from multiple sclerosis or is at high risk of suffering from multiple sclerosis may also execute a step of determining that the subject is not suffering from multiple sclerosis or is not at high risk of suffering from multiple sclerosis if (i-1) or (i-2) does not apply.
  • the diagnostic program may be recorded on a computer-readable recording medium. That is, the computer-readable recording medium according to this embodiment has the above-described program recorded on it.
  • the recording medium may be a non-transitory recording medium. Examples of computer-readable recording media include the ROM or hard disk of a computer, an external storage device provided on a server computer connected to a network, or a portable recording medium such as a flexible disk, a memory card, or a magneto-optical disk.
  • the input means is used to input the comprehensively decoded base sequence data into the computer, and examples of such means include various interfaces such as a mouse, keyboard, data transmission line, and modem.
  • the determination results are output to an output means such as a display or printer.
  • the determination results may also be output via a data transfer line to another information processing terminal.
  • the diagnostic biomarker for multiple sclerosis comprises salivary bacteria having a 16S ribosomal RNA gene base sequence that is 97% or more homologous to the 16S ribosomal RNA gene base sequence of any of bacteria belonging to the bacterial genera of groups A-1 and A-2 and bacterial species of groups B-1 and B-2.
  • the bacteria belonging to the bacterial genera of groups A-1 and A-2 and groups B-1 and B-2 are as described above.
  • the base sequence of the 16S ribosomal RNA gene may be from a salivary bacterium having 97% or more homology with any of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 24.
  • the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 24 are partial base sequences of the 16S ribosomal RNA genes of bacterial species in groups B-1 and B-2.
  • the relative abundance of bacteria in group A-1 bacterial genus or group B-1 bacterial species identified based on the base sequence of the V1-V2 region of the 16S rRNA gene is significantly increased in MS patients compared to healthy controls.
  • the relative abundance of bacteria in group A-2 bacterial genus or group B-2 bacterial species identified based on the base sequence of the V1-V2 region of the 16S rRNA gene is significantly decreased in MS patients compared to healthy controls.
  • the salivary bacteria can be used as a biomarker.
  • the biomarker of this embodiment can be used to diagnose multiple sclerosis, for example, by determining the presence or absence of multiple sclerosis or the risk of developing multiple sclerosis, and by determining the effectiveness of treatment for multiple sclerosis.
  • the use of salivary bacteria as a diagnostic biomarker for multiple sclerosis is the use of salivary bacteria whose 16S ribosomal RNA gene base sequence has 97% or more homology with the 16S ribosomal RNA gene base sequence of any of the bacteria of the bacterial genera of groups A-1 and A-2, and the bacterial species of groups B-1 and B-2, as a diagnostic biomarker for multiple sclerosis.
  • One embodiment of the use may be the use of salivary bacteria whose 16S ribosomal RNA gene base sequence has 97% or more homology with any of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 24, as a diagnostic biomarker for multiple sclerosis.
  • the preventive or therapeutic agent for multiple sclerosis contains, as an active ingredient, at least one selected from the group consisting of bacteria whose 16S ribosomal RNA gene base sequence has 97% or more homology with the 16S ribosomal RNA gene base sequence of any of bacteria belonging to group A-2 bacterial genus or group B-2 bacterial species, and physiologically active substances derived from the above bacteria.
  • the preventive or therapeutic agent for multiple sclerosis contains as an active ingredient at least one selected from the group consisting of bacteria whose 16S ribosomal RNA gene base sequence has 97% or more homology with any of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 15 to 24, and physiologically active substances derived from the bacteria.
  • the preventive or therapeutic agent contains the bacteria or a physiologically active substance derived from the bacteria, and is therefore suitable for preventing or treating multiple sclerosis (ameliorating, alleviating, or remitigating the condition).
  • the bacteria that are the active ingredients can be obtained, for example, by isolating and culturing salivary bacteria that constitute the human salivary flora, analyzing the base sequence of the V1-V2 region of the 16S rRNA gene of the isolated salivary bacteria, and identifying the salivary bacteria that have the desired base sequence.
  • the bacterial species in question may be purchased from a cell bank such as ATCC.
  • Physiologically active substances derived from salivary bacteria can be obtained by culturing the salivary bacteria in question and purifying or isolating the physiologically active substances secreted into the medium. They can also be obtained by purifying or isolating them from the oral contents of an animal, such as a mouse, inoculated with and colonized by the salivary bacteria in question (in vivo method).
  • the preventive or therapeutic agent may consist of only the active ingredient, or may further contain a pharma- ceutically acceptable carrier (excipient, binder, disintegrant, filler, emulsifier, flow additive regulator, etc.) or additive (isotonicity agent, lubricant, flavoring agent, solubilizer, suspending agent, diluent, surfactant, stabilizer, absorption promoter, bulking agent, pH adjuster, moisturizer, adsorbent, disintegration inhibitor, coating agent, colorant, preservative, antioxidant, fragrance, flavoring, sweetener, buffer, soothing agent, etc.).
  • a pharma- ceutically acceptable carrier excipient, binder, disintegrant, filler, emulsifier, flow additive regulator, etc.
  • additive isotonicity agent, lubricant, flavoring agent, solubilizer, suspending agent, diluent, surfactant, stabilizer, absorption promoter, bulking agent, pH adjuster, moisturizer, adsorb
  • the dosage form of the preventive or therapeutic agent may be appropriately selected depending on the administration method and prescription conditions.
  • dosage forms include tablets, pills, granules, powders, capsules, drops, sublingual tablets, troches, and liquids.
  • the preparation may be provided with an enteric coating. Any known enteric coating may be used without any particular restrictions.
  • the method of administration of the preventive or therapeutic agent may be either oral or parenteral.
  • the dosage of the preventive or therapeutic agent, in terms of the amount of active ingredient, when administered to, for example, an adult male human (body weight 60 kg) is usually 0.001 mg to 5000 mg/day/person, and preferably 0.01 mg to 500 mg/day/person. It may be administered in multiple divided doses.
  • the method for preventing or treating multiple sclerosis comprises administering to a subject in need thereof at least one selected from the group consisting of bacteria whose 16S ribosomal RNA gene base sequence has 97% or more homology with the 16S ribosomal RNA gene base sequence of any one of bacteria belonging to group A-2 bacterial genus or group B-2 bacterial species, and physiologically active substances derived from the above bacteria.
  • a method for preventing or treating multiple sclerosis includes administering to a subject in need thereof at least one selected from the group consisting of bacteria whose 16S ribosomal RNA gene base sequence has 97% or more homology with any of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 15 to 24, and physiologically active substances derived from the bacteria.
  • 16S RNA was obtained from saliva samples and 30 fecal samples of 60 healthy subjects adjusted for age, sex, and BMI. 16S RNA was also obtained from fecal samples of 111 perfectly matched patients from 118 MS and NMOSD patients. A detailed view of the enrolled patients and healthy subjects is shown in Figure 1.
  • fecal samples Collected fecal samples were immediately placed in disposable plastic bags containing oxygen absorbers and carbon dioxide generators (the inside of the plastic bags is an environment in which oxygen-sensitive anaerobic bacteria can survive) and transported to the laboratory while maintaining a temperature of 4°C.
  • the feces were suspended in phosphate-buffered saline containing 20% glycerol, immediately frozen in liquid nitrogen, and stored at -80°C until use.
  • Bacterial DNA was isolated and purified from the fecal samples according to the enzymatic lysis method.
  • V1-V2 regions of the 16S rRNA gene and data processing The V1-V2 regions of the 16S rRNA genes of the bacterial species contained in each sample were comprehensively amplified by PCR using a universal primer set for bacteria (forward primer 27Fmod (containing a barcode sequence, SEQ ID NO: 25: 5'-agrgtttgatymtggctcag-3') and reverse primer 338R (SEQ ID NO: 26: 5'-tgctgcctcccgtaggagt-3') (Kim et al., an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes 20, 241-253 (2013).). The PCR amplified products were fed into a next-generation sequencer MiSeq system (Illumina), and the sequence of each PCR product was determined.
  • a universal primer set for bacteria forward primer 27Fmod (containing a barcode sequence, SEQ ID NO: 25: 5'-agrgtttgatymtggctcag-3
  • the 96 sequences obtained above were submitted to an analysis pipeline constructed by the RIKEN IMS Microbiome Research Team to analyze the relative proportions of bacterial species.
  • this pipeline paired sequences assigned to each sample were joined using the Fast1-join program, and reads with an average quality score below 25 that were inexact matches with both universal primers and reads with potential chimeras (a total of 43-44% of all reads) were removed. From the remaining high-quality sequences (average quality score > 25), 10,000 reads per sample were randomly selected and used for the analysis performed in this study.
  • the selected reads were sorted by the highest average quality score and grouped into operational taxonomic units (OTUs) by classification using the UCLUST algorithm based on 96% pairwise identity (Said et al., DNA research: an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes 21, 15-25 (2014)). Taxonomic assignments for each OTU were made using the GLSEARCH program by performing a similarity search against known 16S (RDP and CORE) and NCBI genome databases. Sequence similarity thresholds of 70%, 90%, 94% and 96% were applied for classification at the phylum, family, genus and species levels, respectively.
  • Figure 2 shows the results of the ⁇ diversity index.
  • the box plots show the median, interquartile range, minimum and maximum values. *: p ⁇ 0.05, **: p ⁇ 0.01 and ***: p ⁇ 0.001 were based on Wilcoxon rank sum test using the Benjamini-Hochberg method for multiple group comparison.
  • PERMANOVA showed significant differences in ⁇ -diversity of the whole salivary microbiota for weighted and unweighted UniFrac distances between all MS subtype groups and the HC group ( Figure 2E). As mentioned above, the differences in ⁇ and ⁇ diversity observed between the RRMS and HC groups were not significantly affected by the differences in immunotherapy administered to the patients.
  • Figure 3 shows the results of comparing the bacterial biota composition at the phylum level among the five subject groups, with the top six phyla shown.
  • the plots in each box plot show the median, interquartile range, minimum and maximum values.
  • *: p ⁇ 0.05, **: p ⁇ 0.01, ***: p ⁇ 0.001, ***: p ⁇ 10-4 , ***: p ⁇ 10-5 , ***: p ⁇ 10-6 , ***: p ⁇ 10-7 , ***: p ⁇ 10-8 and ***: p ⁇ 10-9 were based on Wilcoxon rank sum test using the Benjamini-Hochberg method for multiple group comparison.
  • Phylum-level taxonomic assignment based on 16S data identified six major phyla with mean relative abundances of 0.1% or greater in at least one of the five subject groups.
  • Five phyla: Firmicutes (A), Bacteroidetes (B), Proteobacteria (C), Actinobacteria (D), and Fusobacteria (E) showed significant changes in abundance between the two subject groups (Figure 3).
  • Figure 4 shows the results of comparing the bacterial biota composition at the genus level among the five subject groups, showing the results for the top 12 genera.
  • the plots in each box plot show the median, interquartile range, minimum and maximum values.
  • *: p ⁇ 0.05, **: p ⁇ 0.01, ***: p ⁇ 0.001, ***: p ⁇ 10-4 , ***: p ⁇ 10-5 , ***: p ⁇ 10-6 , ***: p ⁇ 10-7 , ***: p ⁇ 10-8 , and ***: p ⁇ 10-9 were based on Wilcoxon rank sum test using the Benjamini-Hochberg method for multiple group comparison.
  • Figure 5 shows the results of comparing the average relative abundance of bacterial species at the genus level among the five subject groups.
  • Genera with an average relative abundance of 0.1% or more in at least one of the five groups are represented. Data are expressed as mean ⁇ SEM. *p ⁇ 0.05 based on Wilcoxon rank sum test using Benjamin-Hochberg method, indicating a significant change in relative abundance between the patient and HC groups.
  • Genus-level taxonomic assignment based on 16S data identified 38 genera with an average relative abundance of 0.1% or more in at least one of the five subject groups, with the average relative abundance of 24 genera showing significant changes between the two groups (* in Figure 5).
  • Figures 6 and 7 show a comparison of the abundance of species-equivalent clusters with a mean relative abundance of 0.1% or more in at least one of the five subject groups by species-level taxonomic assignment based on 16S data.
  • Figures 6 and 7 show a list of bacterial species showing significant changes in abundance between any two subject groups, and bacterial species with fold changes (log10) between the two groups.
  • Statistics were based on Wilcoxon rank sum tests using the Benjamin-Hochberg method. Comparisons between all pairs of the five subject groups identified a total of 35 distinct species with significant changes in abundance between any two subject groups (Wilcoxon test, p ⁇ 0.05; Figures 6 and 7).
  • Figures 8 to 10 show the differences between the group with high disease activity (recent activity patients) and the group with low disease activity (non-recent activity patients) in the four ⁇ diversity indices and the abundance of 6 phyla, 38 genera, and 84 species with a relative abundance of 0.1% or more in at least one of the five subject groups.
  • Bold text marked with an * indicates data of bacteria that were significantly changed in the group with high disease activity compared to the group with low disease activity.
  • the statistical method was based on the Wilcoxon rank sum test.
  • Figure 11 shows the relative expression of five salivary bacteria that were significantly increased or decreased in abundance in the high disease activity group compared to the low disease activity group in all patients. Differences between the high and low disease activity groups were assessed in four alpha diversity indices and the relative abundance of six phyla, 39 genera, and 84 species with a relative abundance >0.1% in at least one of the five subject groups. Each boxplot shows the median, interquartile range, minimum, and maximum. *p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, **p ⁇ 0.001, **p ⁇ 0.0001, ******p ⁇ 0.00001, ******p ⁇ 0.000001.
  • Figure 13 shows the results of random forest algorithm (machine learning prediction model) analysis of saliva and gut microbiota of the RRMS group and healthy control group.
  • Random forest was performed at the genus level (A) and species level (B) using saliva samples.
  • the best RF model with the highest area under the receiver operating characteristic curve (AUC) is indicated by an arrow in each window.
  • the horizontal axis indicates the number of genera or species, and the bacteria used were the 39 genera and 84 species mentioned above.
  • Figures 14 and 15 show the bacterial genera and 24 species selected by the RF algorithm, respectively, and the Z-scores based on the abundance of each genus or species are plotted from lowest (Color Key: -1) to highest (Color Key: 1) on the scale shown above. *: p ⁇ 0.05 based on the Wilcoxon rank sum test in the comparison between the patient group and the HC group.
  • Table 2 and Figures 16 and 17 show the average AUCs of salivary and fecal microbiota at the genus and species levels among the RRMS group, the early-onset RRMS group, the mild RRMS group, and the HC group.
  • the prediction models based on the salivary microbiota from the discovery cohorts of RRMS and HC had areas under the receiver operating characteristic curves (AUCs) of 0.94 (genus level) and 0.93 (species level), respectively (Figs. 13-15, Fig. 16A, Table 2), and consisted of 14 genera and 24 species (relative abundance ⁇ 0.1%) that contributed significantly to the discrimination of the two cohorts (Figs. 13-15).
  • the above prediction models from the discovery cohorts were validated by applying them to the validation cohorts of RRMS and HC.
  • the AUCs were 0.79 (genus level) and 0.83 (species level), respectively (Figs. 16A and B, Fig. 17B, Table 2).
  • the AUCs of the prediction models based on fecal samples were 0.82 (genus level) and 0.68 (species level), and those based on saliva samples were 0.94 (genus level) and 0.93 (species level), respectively, indicating that the salivary microbiota model had a higher predictive accuracy for RRMS than the fecal microbiota (Table 2, Figure 17E).
  • the prediction models based on fecal and saliva samples had AUCs of 0.96 (genus level) and 0.93 (species level), which were almost equivalent to those based on saliva samples alone (Table 2, Figure 17F). These data suggested that the prediction models based on salivary microbiota had a higher predictive accuracy than those based on fecal microbiota.
  • the AUCs for the early RRMS cohort were 0.84 (genus level) and 0.84 (species level), and for the mild RRMS cohort (EDSS score 1 or less), the AUCs were 0.88 (genus level) and 0.81 (species level), respectively (Table 2, Figure 16C, Figure 17D). These data suggest that the salivary microbiota may be an early and highly sensitive diagnostic marker for MS.
  • the two groups could be distinguished with approximately 83% accuracy (area under the curve (AUC); 0.83). Furthermore, when comparing the early-onset RRMS patient group, within 5 years of onset, with the HC group, and when comparing the validation RRMS patient group with a neuropathy severity score (EDSS score) of 1 or less with the HC group, the two groups could be distinguished with 84% and 88% accuracy, respectively.
  • AUC area under the curve

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Abstract

本発明の多発性硬化症の診断方法は、被験者から採取された唾液試料に含まれる細菌の相対存在量を測定するステップと、以下の（１）又は（２）を実施するステップとを備える。 （１）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、所定の細菌のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９７％以上の相同性を有する細菌の相対存在量が、健常人における当該相対存在量に比較して多い場合、被験者は多発性硬化症に罹患している、又は罹患する危険性が高いと判定する （２）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、所定の細菌のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のいずれかと９７％以上の相同性を有する細菌の相対存在量が、健常人における当該相対存在量に比較して少ない場合、被験者は多発性硬化症に罹患している、又は罹患する危険性が高いと判定する

Description

多発性硬化症の診断方法及び診断用バイオマーカー
　本発明は、多発性硬化症の診断方法及び診断用バイオマーカーに関する。
　多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＭＳ）は、視力低下や運動麻痺、感覚障害、高次脳機能障害など多様な症状を呈する、中枢神経系の自己免疫性脱髄疾患であり、若年成人期に発症する主要な神経疾患である。ほとんどの患者は再発の徴候を経験し、寛解の間隔は初期の臨床病期に数カ月から数年持続する。この病期にとどまる患者は再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）と呼ばれる。これらの患者の一部は、ＭＳの発症から数年後に二次進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ）と呼ばれる進行性疾患形態に移行する可能性がある。ＳＰＭＳへの移行が確立されると、神経学的障害が徐々にかつ不可逆的に蓄積する（非特許文献１）。
　ＭＳの診断は、臨床所見と脳・脊髄ＭＲＩ、髄液検査などの検査所見を組み合わせて行われるが、異常所見が乏しい病初期の症例においては、診断が難しい場合も少なくなく、診断までに平均して約３年を要する。近年、数多くのＭＳの疾患修飾薬が臨床で使用可能となったが、早期に診断して治療を開始することが有意に予後を改善するという事実が多くの臨床研究により示されたことで、ＭＳの早期診断を可能にするバイオマーカーの開発に大きな関心が寄せられるようになった。
　一方で近年、腸内細菌叢がＭＳ等の自己免疫性疾患の病因に重要な役割を果たしていることが明らかとなってきた（非特許文献３～６）。本発明者らは、１６Ｓ　リボソーマルＲＮＡ（１６Ｓ　ｒＲＮＡ）遺伝子解析及びメタゲノム解析に基づいたＭＳ患者の腸内細菌叢の特徴を世界に先駆けて報告し、そして糞便サンプルを用いたＭＳ等の自己免疫性疾患の診断方法及び診断のためのバイオマーカーを提供してきた（特許文献１～２、非特許文献７～８）。
ＷＯ２０１７／０３４０３１ ＷＯ２０２１／０３９９３２
Compston et al., Multiple sclerosis. Lancet 372, 1502-1517 (2008) Yasmine Belkaid et al., Cell, 2014, 157(1):121-141 K. Berer et al., Gut microbiota from multiple sclerosis patients enables spontaneous autoimmune encephalomyelitis in mice. Proc Natl Acad Sci U S A 114,10719-10724 (2017). E. Cekanaviciute et al., Gut bacteria from multiple sclerosis patients modulate human T cells and exacerbate symptoms in mouse models. Proc Natl Acad Sci U S A114, 10713-10718 (2017). J. Chenet al., Multiple sclerosis patients have a distinct gut microbiota compared to healthy controls. Scientific reports 6, 28484 (2016). S. Jangi et al., Alterations of the human gut microbiome in multiple sclerosis. Nat Commun 7, 12015 (2016). S. Miyake et al., Dysbiosis in the Gut Microbiota of Patients with Multiple Sclerosis, with a Striking Depletion of Species Belonging to Clostridia XIVa and IV Clusters. PLoS One 10, e0137429 (2015). D. Takewaki et al., Alterations of the gut ecological and functional microenvironment in different stages of multiple sclerosis. under review. PNAS, 117, (36) 22402-22412
　本発明は、多発性硬化症患者の唾液サンプルを用いた多発性硬化症の診断方法及び診断用バイオマーカーを提供することを目的とする。
　本発明者らは、唾液試料からの１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子データを用いて、多発性硬化症患者及び健常者からの唾液細菌叢を比較分析した。その結果、健常者と比較して多発性硬化症患者における変化した唾液細菌叢を示し、多発性硬化症患者と健常者との間で存在量に有意な変化を示す種々の微生物分類群を同定した。また、唾液細菌叢に基づいて、ランダムフォレストアルゴリズム（機械学習予測モデル）を用いた予測モデルを開発し、多発性硬化症に対する細菌叢ベースの非侵襲的診断マーカーとして予測精度を評価した。本発明は、これらの知見に基づくものである。
　すなわち、本発明は、例えば、下記［１］～［１１］に係る発明に関する。
［１］
　多発性硬化症の診断方法であって、治療前及び治療後に被験者から採取された唾液試料に含まれる細菌の相対存在量を測定するステップと、以下の（１）又は（２）を実施するステップとを備える、方法。
　（１）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、群Ａ－１の細菌属の細菌又は群Ｂ－１の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９７％以上の相同性を有する細菌の相対存在量が、健常人における当該相対存在量に比較して多い場合、上記被験者は多発性硬化症に罹患している、又は罹患する危険性が高いと判定する
　（２）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、群Ａ－２の細菌属の細菌又は群Ｂ－２の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のいずれかと９７％以上の相同性を有する細菌の相対存在量が、健常人における当該相対存在量に比較して少ない場合、上記被験者は多発性硬化症に罹患している、又は罹患する危険性が高いと判定する
群Ａ－１：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｏｔｈｉａ、Ｓｃｈａａｌｉａ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ
群Ａ－２：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ａｌｌｏｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｇｅｍｅｌｌａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
群Ｂ－１：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｇｒａｅｖｅｎｉｔｚｉｉ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ　ｉｎｆｅｌｉｘ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｒｏｔｈｉａ　ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｈｉｓｔｉｃｏｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓｃｈａａｌｉａ　ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔａｒｉｕｓ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ　ｐａｒｖｕｌｕｍ
群Ｂ－２：Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｐａｓｔｅｒｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｎａｎｃｅｉｅｎｓｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｓｐｕｔｏｒｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｏｏｒｅｉ、Ａｌｌｏｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｒａｖａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ
［２］
　多発性硬化症の診断方法であって、治療前及び治療後に被験者から採取された唾液試料に含まれる細菌の相対存在量を測定するステップと、以下の（３）又は（４）を実施するステップとを備える、方法。
　（３）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、群Ａ－１の細菌属の細菌又は群Ｂ－１の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９７％以上の相同性を有する細菌の相対存在量を治療前後で比較して、治療後の当該相対存在量が治療前に比較して少ない場合、上記被験者の多発性硬化症の病態は治療により改善されたと判定する
　（４）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、群Ａ－２の細菌属の細菌又は群Ｂ－２の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のいずれかと９７％以上の相同性を有する細菌の相対存在量を治療前後で比較して、治療後の当該相対存在量が治療前に比較して多い場合、上記被験者の多発性硬化症の病態は治療により改善されたと判定する
群Ａ－１：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｏｔｈｉａ、Ｓｃｈａａｌｉａ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ
群Ａ－２：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ａｌｌｏｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｇｅｍｅｌｌａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
群Ｂ－１：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｇｒａｅｖｅｎｉｔｚｉｉ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ　ｉｎｆｅｌｉｘ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｒｏｔｈｉａ　ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｈｉｓｔｉｃｏｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓｃｈａａｌｉａ　ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔａｒｉｕｓ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ　ｐａｒｖｕｌｕｍ
群Ｂ－２：Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｐａｓｔｅｒｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｎａｎｃｅｉｅｎｓｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｓｐｕｔｏｒｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｏｏｒｅｉ、Ａｌｌｏｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｒａｖａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ
［３］
　上記多発性硬化症が、再発寛解型多発性硬化症である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
　上記細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域－Ｖ２領域の塩基配列である、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
　上記群Ｂ－１の細菌種の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号１～１４で示される塩基配列であり、上記群Ｂ－２の細菌種の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号１５～２４に示される塩基配列である、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
　１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、群Ａ－１及び群Ａ－２の細菌属の細菌並びに群Ｂ－１及び群Ｂ－２の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９７％以上の相同性を有する唾液細菌からなる、多発性硬化症の診断用バイオマーカー。
群Ａ－１：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｏｔｈｉａ、Ｓｃｈａａｌｉａ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ
群Ａ－２：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ａｌｌｏｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｇｅｍｅｌｌａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
群Ｂ－１：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｇｒａｅｖｅｎｉｔｚｉｉ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ　ｉｎｆｅｌｉｘ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｒｏｔｈｉａ　ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｈｉｓｔｉｃｏｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓｃｈａａｌｉａ　ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔａｒｉｕｓ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ　ｐａｒｖｕｌｕｍ
群Ｂ－２：Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｐａｓｔｅｒｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｎａｎｃｅｉｅｎｓｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｓｐｕｔｏｒｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｏｏｒｅｉ、Ａｌｌｏｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｒａｖａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ
［７］
　１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号１～２４で示される塩基配列のいずれかと９７％以上の相同性を有する唾液細菌からなる、多発性硬化症の診断用バイオマーカー。
［８］
　１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、群Ａ－１及び群Ａ－２の細菌属の細菌、並びにＢ－１及び群Ｂ－２の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９７％以上の相同性を有する唾液細菌の、多発性硬化症の診断用バイオマーカーとしての使用。
群Ａ－１：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｏｔｈｉａ、Ｓｃｈａａｌｉａ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ
群Ａ－２：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ａｌｌｏｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｇｅｍｅｌｌａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
群Ｂ－１：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｇｒａｅｖｅｎｉｔｚｉｉ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ　ｉｎｆｅｌｉｘ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｒｏｔｈｉａ　ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｈｉｓｔｉｃｏｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓｃｈａａｌｉａ　ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔａｒｉｕｓ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ　ｐａｒｖｕｌｕｍ
群Ｂ－２：Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｐａｓｔｅｒｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｎａｎｃｅｉｅｎｓｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｓｐｕｔｏｒｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｏｏｒｅｉ、Ａｌｌｏｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｒａｖａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ
［９］
　１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号１～２４で示される塩基配列のいずれかと９７％以上の相同性を有する唾液細菌の、多発性硬化症の診断用バイオマーカーとしての使用。
［１０］
　１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、群Ａ－２の細菌属の細菌又は群Ｂ－２の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９７％以上の相同性を有する細菌、及び上記細菌に由来する生理活性物質からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、多発性硬化症の予防剤又は治療剤。
群Ａ－１：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｏｔｈｉａ、Ｓｃｈａａｌｉａ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ
群Ｂ－１：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｇｒａｅｖｅｎｉｔｚｉｉ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ　ｉｎｆｅｌｉｘ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｒｏｔｈｉａ　ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｈｉｓｔｉｃｏｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓｃｈａａｌｉａ　ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔａｒｉｕｓ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ　ｐａｒｖｕｌｕｍ
［１１］
　１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号１５～２４で示される塩基配列のいずれかと９７％以上の相同性を有する細菌、及び上記細菌に由来する生理活性物質からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、多発性硬化症の予防剤又は治療剤。
［１２］
　１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、群Ａ－２の細菌属の細菌又は群Ｂ－２の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９７％以上の相同性を有する細菌、及び上記細菌に由来する生理活性物質からなる群より選択される少なくとも１種を、それを必要とする対象に投与することを含む、多発性硬化症の予防方法又は治療方法。
群Ａ－１：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｏｔｈｉａ、Ｓｃｈａａｌｉａ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ
群Ｂ－１：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｇｒａｅｖｅｎｉｔｚｉｉ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ　ｉｎｆｅｌｉｘ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｒｏｔｈｉａ　ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｈｉｓｔｉｃｏｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓｃｈａａｌｉａ　ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔａｒｉｕｓ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ　ｐａｒｖｕｌｕｍ
［１３］
　１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号１５～２４で示される塩基配列のいずれかと９７％以上の相同性を有する細菌、及び上記細菌に由来する生理活性物質からなる群より選択される少なくとも１種を、それを必要とする対象に投与することを含む、多発性硬化症の予防方法又は治療方法。
　本発明はまた、下記［２－１］～［２－７］にも関する。
［２－１］
　被験者から採取された唾液試料に含まれる細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を網羅的に解読した塩基配列データを取得するステップ、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子データベースに基づき、取得した塩基配列データから、群Ａ－１及び群Ａ－２の細菌属の細菌、並びに群Ｂ－１及び群Ｂ－２の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９７％以上の相同性を有する塩基配列の頻度を計算し、当該塩基配列の相対存在量を算出するステップ、算出した相対存在量を予め入力された基準値と比較して多発性硬化症の病態を判定するステップ、及び得られた判定結果を出力するステップをコンピュータに実行させるプログラムが記録されたコンピュータ読み取り可能な非一時的記録媒体。
群Ａ－１：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｏｔｈｉａ、Ｓｃｈａａｌｉａ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ
群Ａ－２：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ａｌｌｏｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｇｅｍｅｌｌａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
群Ｂ－１：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｇｒａｅｖｅｎｉｔｚｉｉ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ　ｉｎｆｅｌｉｘ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｒｏｔｈｉａ　ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｈｉｓｔｉｃｏｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓｃｈａａｌｉａ　ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔａｒｉｕｓ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ　ｐａｒｖｕｌｕｍ
群Ｂ－２：Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｐａｓｔｅｒｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｎａｎｃｅｉｅｎｓｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｓｐｕｔｏｒｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｏｏｒｅｉ、Ａｌｌｏｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｒａｖａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ
［２－２］
　上記判定するステップは、上記相対存在量が、群Ａ－１の細菌属の細菌又は群Ｂ－１の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９７％以上の相同性を有する細菌の相対存在量であり、かつ算出した相対存在量が健常人における当該相対存在量に比較して多い場合、又は、上記相対存在量が、群Ａ－２の細菌属の細菌又は群Ｂ－２の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のいずれかと９７％以上の相同性を有する細菌の相対存在量であり、かつ算出した相対存在量が健常人における当該相対存在量に比較して少ない場合、当該被験者は、多発性硬化症に罹患している、又は罹患する危険性が高いと判定する、［２－１］に記載の非一時的記録媒体。
［２－３］
　上記多発性硬化症が、再発寛解型多発性硬化症である、［２－１］又は［２－１］に記載の非一時的記録媒体。
［２－４］
　上記細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域－Ｖ２領域の塩基配列である、［２－１］～［２－３］のいずれかに記載の非一時的記録媒体。
［２－５］
　上記群Ｂ－１の細菌種の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号１～１４で示される塩基配列であり、上記Ｂ－２の細菌種の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号１５～２４に示される塩基配列である、［２－１］～［２－４］のいずれかに記載の非一時的記録媒体。
［２－６］
　被験者から採取された糞便試料に含まれる細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を網羅的に解読した塩基配列データを取得する入力手段と、取得した塩基配列データに基づいて、被験者が多発性硬化症へ罹患している、又は罹患する危険性が高いことを判定する演算手段と、上記演算手段で得られた判定結果を出力する出力手段を備える、多発性硬化症の診断システム。
［２－７］
　治療後に被験者から採取された糞便試料に含まれる細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を網羅的に解読した塩基配列データを取得する入力手段と、取得した塩基配列データに基づいて、被験者の多発性硬化症の病態は治療により改善されたかを判定する演算手段と、上記演算手段で得られた判定結果を出力する出力手段を備える、再発寛解型多発性硬化症の診断システム。
　本発明によれば、唾液細菌叢に基づいた多発性硬化症の診断方法の提供が可能となる。唾液サンプルの採取及び保管は糞便サンプルの採集及び保管よりも簡便であることから、本発明の診断方法は糞便細菌叢に基づく診断方法よりも簡便である。また、本発明によれば、多発性硬化症の診断用バイオマーカー、並びに、多発性硬化症の治療剤の提供が可能となる。
被験者の背景プロファイルを示す。 患者群と健常者群との間の唾液細菌叢におけるα及びβ多様性の比較の結果を示し、Ａ～Ｄは、ＯＴＵ数、Ｃｈａｏ－１、ＡＣＥ及びＳｈａｎｎｏｎ指数の、非典型ＭＳ群とＨＣ群の比較結果（α多様性）、ＥはＵｎｉＦｒａｃ距離解析に基づいてβ多様性を評価した結果（β多様性）を示す。 ５つの対象群間で、細菌叢組成を門レベルで比較した結果を示す図である。 ５つの対象群間で、細菌叢組成を属レベルで比較した結果を示す図である。 ５つの対象群間で、属レベルでの細菌種の平均相対的存在量を比較した結果を示す。 １６Ｓデータに基づく種レベルの分類帰属により、５つの対象群のうち少なくとも１つの対象群で平均相対存在量が０．１％以上の種等価クラスターの中で統計的に有意差を認めたものを示す。 １６Ｓデータに基づく種レベルの分類帰属により、５つの対象群のうち少なくとも１つの対象群で平均相対存在量が０．１％以上の種等価クラスターの中で統計的に有意差を認めたものを示す。 疾患活動性が高い群と疾患活動性が低い群の間の差異を示す図である。 疾患活動性が高い群と疾患活動性が低い群の間の差異を示す図である。 疾患活動性が高い群と疾患活動性が低い群の間の差異を示す図である。 全患者において、疾患活動性が低い患者群と比較して、疾患活動性が高い患者群で存在量が有意に増加又は減少した５つの唾液細菌の相対発現量を示す図である。 ＲＲＭＳの探索コホートグループ及び検証コホートグループのそれぞれの患者のプロフィールを示す。 ＲＲＭＳ群と健常対照群の唾液及び腸内細菌叢のランダムフォレストアルゴリズム解析の結果を示す。 ランダムフォレストアルゴリズムにより選択された１４属の細菌リスト及びその存在量に基づくＺスコアを示す。 ランダムフォレストアルゴリズムにより選択された２４種の細菌リスト及びその存在量に基づくＺスコアを示す。 ＲＲＭＳ群、早期発症ＲＲＭＳ群、軽症ＲＲＭＳ群及びＨＣ群の間の属及び種レベルでの唾液細菌叢の平均ＡＵＣを示す。 ＲＲＭＳ群、早期発症ＲＲＭＳ群、軽症ＲＲＭＳ群及びＨＣ群の間の属及び種レベルでの唾液及び糞便細菌叢の平均ＡＵＣを示す。
　以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
　多発性硬化症は、自己の免疫系が自己の正常な細胞及び組織に対して反応することにより引き起こされる疾患である自己免疫疾患の１つである。多発性硬化症には、急性増悪と寛解を繰り返す再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）、ＲＲＭＳ病態が一定期間続いた後に進行性の病態へと移行する二次進行型多発性硬化症（ＳＰＭＳ）、ＭＳ特有の脳病変がほとんどない非典型多発性硬化症（Ａｔｙｐｉｃａｌ　ＭＳ）等のサブタイプに分類できることが知られている。また、ＲＲＭＳのうち、罹病期間５年以下のＲＲＭＳを早期ＲＲＭＳといい、神経障害度スコア（ＥＤＳＳスコア）が１以下のＲＲＭＳを軽症ＲＲＭＳという。また、多発性硬化症に罹患する患者の中では、視神経炎及び脊髄炎を主な症候とする患者が含まれており、視神経脊髄炎類縁疾患（ＮＭＯＳＤ）として、多発性硬化症とは独立した疾患として分類されることがある。ＮＭＯＳＤは、抗アクアポリン４（ＡＱＰ４）抗体及び脊髄長大病変の存在を特徴とする。
〔診断方法〕
　本実施形態に係る多発性硬化症の診断方法は、被験者の唾液細菌叢の構成に基づく判定を行うものであるため、多発性硬化症への罹患の有無又は罹患の危険性を判定すること、及び多発性硬化症の治療効果を判定することに用いることができる。本実施形態に係る多発性硬化症の診断方法は、診断を補助するための方法と捉えることもできる。
　一実施形態の多発性硬化症の診断方法は、被験者から採取された唾液試料に含まれる細菌の相対存在量を測定するステップと、以下の（１）又は（２）を実施するステップと、を備える。
（１）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、群Ａ－１の細菌属の細菌又は群Ｂ－１の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９７％以上の相同性を有する細菌の相対存在量が、健常人における当該相対存在量に比較して多い場合、上記被験者は多発性硬化症に罹患している、又は罹患する危険性が高いと判定する
（２）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、群Ａ－２の細菌属の細菌又は群Ｂ－２の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のいずれかと９７％以上の相同性を有する細菌の相対存在量が、健常人における当該相対存在量に比較して少ない場合、上記被験者は多発性硬化症に罹患している、又は罹患する危険性が高いと判定する
群Ａ－１：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｏｔｈｉａ、Ｓｃｈａａｌｉａ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ
群Ａ－２：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ａｌｌｏｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｇｅｍｅｌｌａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
群Ｂ－１：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｇｒａｅｖｅｎｉｔｚｉｉ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ　ｉｎｆｅｌｉｘ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｒｏｔｈｉａ　ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｈｉｓｔｉｃｏｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓｃｈａａｌｉａ　ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔａｒｉｕｓ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ　ｐａｒｖｕｌｕｍ
群Ｂ－２：Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｐａｓｔｅｒｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｎａｎｃｅｉｅｎｓｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｓｐｕｔｏｒｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｏｏｒｅｉ、Ａｌｌｏｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｒａｖａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ
　別の実施形態の多発性硬化症の診断方法は、治療前及び治療後に被験者から採取された唾液試料に含まれる細菌の相対存在量を測定するステップと、以下の（３）又は（４）を実施するステップと、を備える。
（３）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、群Ａ－１の細菌属の細菌又は群Ｂ－１の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９７％以上の相同性を有する細菌の相対存在量を治療前後で比較して、治療後の当該相対存在量が治療前に比較して少ない場合、上記被験者の多発性硬化症の病態は治療により改善されたと判定する
（４）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、群Ａ－２の細菌属の細菌又は群Ｂ－２の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のいずれかと９７％以上の相同性を有する細菌の相対存在量を治療前後で比較して、治療後の当該相対存在量が治療前に比較して多い場合、上記被験者の多発性硬化症の病態は治療により改善されたと判定する
　後述の実施例で詳述するとおり、健常対照と比較してＭＳ患者、特にＲＲＭＳ患者で有意に相対存在量が増加する細菌として、１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域－Ｖ２領域の塩基配列によって特定された上記群Ａ－１の細菌属の細菌、及び上記群Ｂ－１の細菌種が同定された。同様に、健常対照と比較してＭＳ患者で有意に相対存在量が減少する細菌として、１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域－Ｖ２領域の塩基配列によって特定された上記群Ａ－２の細菌属の細菌、及び上記群Ｂ－２の細菌種が同定された。
　したがって、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、群Ａ－１及び群Ａ－２の細菌属の細菌並びに群Ｂ－１及び群Ｂ－２の細菌種と９７％以上の相同性を有する細菌の相対存在量を指標とすることにより、多発性硬化症への罹患の有無又は罹患の危険性を判定すること、及び多発性硬化症の治療効果を判定することが可能になる。判定精度をより高める観点から、上記相同性は、９８％以上、９９％以上又は９９．５％以上であることが好ましく、９９．７％以上であることがより好ましく、９９．９％以上であることが更に好ましく、１００％であることが更により好ましい。
　なお、本明細書において、「相同性」とは、２つの塩基配列のアラインメント（例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用したアラインメント）を行ったとき、一致する塩基の割合を意味する。
　診断の対象である多発性硬化症は、再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）、二次進行型多発性硬化症（ＳＰＭＳ）、非典型多発性硬化症（Ａｔｙｐｉｃａｌ　ＭＳ）等のサブタイプを含み、再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）であることが好ましい。
　細菌の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子には、多くの生物種で塩基配列の保存度が高い領域（保存領域）の他に、特定の細菌種及びその近縁種に固有の塩基配列の領域（可変領域）が存在する。１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子には、Ｖ１～Ｖ９と呼ばれる９つの可変領域が知られている。可変領域の塩基配列を同定することにより、細菌種を特定することができる。１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域－Ｖ２領域の塩基配列とは、Ｖ１可変領域及びＶ２可変領域を含む塩基配列である。
　一実施形態において、細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域－Ｖ２領域の塩基配列であってよい。唾液由来の細菌の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域－Ｖ２領域の塩基配列を、既知の１６Ｓデータベース（例えば、ＲＤＰ又はＣＯＲＥ）及びＮＣＢＩゲノムデータベースにて類似検索を行い、分類学上の割り当てを行うことにより、細菌の属又は種を同定することができる。類似検索において、配列相同性の閾値（配列類似度閾値）を９７％にすればよく、また、判定精度をより高める観点から、９８％、９９％又は９９．５％であることが好ましく、９９．７％であることがより好ましく、９９．９％であることが更に好ましく、１００％であることが更により好ましい。
　Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属細菌としては、特に限定されないが、例えば、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｇｒａｅｖｅｎｉｔｚｉｉ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｄｅｎｔａｌｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｈａｌｉｏｔｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｉｈｕａｅ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｉｓｒａｅｌｉｉ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓなどが挙げられる。これらの細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列又は１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域－Ｖ２領域の塩基配列は、既知のデータベース（例えば、ＲＤＰ、ＣＯＲＥ又はＮＣＢＩデータベース）から入手することができる。
　Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ属細菌としては、特に限定されないが、例えば、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ　ｉｎｆｅｌｉｘ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ　ａｒｔｅｍｉｄｉｓ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ　ｄｉａｎａｅ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ　ｉｎｆｅｌｉｘ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ　ｎｏｘｉａ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ　ｓｐｕｔｉｇｅｎａなどが挙げられる。これらの細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列又は１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域－Ｖ２領域の塩基配列は、既知のデータベース（例えば、ＲＤＰ、ＣＯＲＥ又はＮＣＢＩデータベース）から入手することができる。
　Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌としては、特に限定されないが、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｒｉｓｔａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｄｏｗｎｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｑｕｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｏｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｓｅｕｄｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｕｂｎｅｒｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｏｂｒｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒｉｓなどが挙げられる。これらの細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列又は１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域－Ｖ２領域の塩基配列は、既知のデータベース（例えば、ＲＤＰ、ＣＯＲＥ又はＮＣＢＩデータベース）から入手することができる。
　Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌としては、特に限定されないが、例えばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｎｔｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｍｅｎｔｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｉｎｅｒｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｋｉｔａｓａｔｏｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｕｃｏｓａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｕｒｉｎｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｅｎｔｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｏｎｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｏｇｏｓａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｕｍｉｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｕｌｔｕｎｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｖａｇｉｎａｌｉｓなどが挙げられる。これらの細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列又は１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域－Ｖ２領域の塩基配列は、既知のデータベース（例えば、ＲＤＰ、ＣＯＲＥ又はＮＣＢＩデータベース）から入手することができる。
　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌としては、特に限定されないが、例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｒｇｅｎｔｏｒａｔｅｎｓｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｕｒｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｊｅｄｄａｈｅｎｓｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｋｒｏｐｐｅｎｓｔｅｄｔｉｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｒｏｐｉｎｑｕｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｅｎａｌｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｔｅａｒｉｃｕｍなどが挙げられる。これらの細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列又は１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域－Ｖ２領域の塩基配列は、既知のデータベース（例えば、ＲＤＰ、ＣＯＲＥ又はＮＣＢＩデータベース）から入手することができる。
　Ｒｏｔｈｉａ属細菌としては、特に限定されないが、例えば、Ｒｏｔｈｉａ　ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ、Ｒｏｔｈｉａ　ｄｅｎｔｏｃａｒｉｏｓａ、Ｒｏｔｈｉａ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃａ、Ｒｏｔｈｉａ　ｋｒｉｓｔｉｎａｅなどが挙げられる。これらの細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列又は１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域－Ｖ２領域の塩基配列は、既知のデータベース（例えば、ＲＤＰ、ＣＯＲＥ又はＮＣＢＩデータベース）から入手することができる。
　Ｓｃｈａａｌｉａ属細菌としては、特に限定されないが、例えば、Ｓｃｈａａｌｉａ　ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｓｃｈａａｌｉａ　ｃａｒｄｉｆｆｅｎｓｉｓ、Ｓｃｈａａｌｉａ　ｇｅｏｒｇｉａｅ、Ｓｃｈａａｌｉａ　ｍｅｙｅｒｉ、Ｓｃｈａａｌｉａ　ｖａｃｃｉｍａｘｉｌｌａｅなどが挙げられる。これらの細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列又は１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域－Ｖ２領域の塩基配列は、既知のデータベース（例えば、ＲＤＰ、ＣＯＲＥ又はＮＣＢＩデータベース）から入手することができる。
　Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ属細菌としては、特に限定されないが、例えば、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ　ｐａｒｖｕｌｕｍ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ　ｒｉｍａｅなどが挙げられる。これらの細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列又は１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域－Ｖ２領域の塩基配列は、既知のデータベース（例えば、ＲＤＰ、ＣＯＲＥ又はＮＣＢＩデータベース）から入手することができる。
　Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌としては、特に限定されないが、例えば、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｒｏｄｅｎｎｔｉｕｍ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆａｒｍｅｒｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｋｏｓｅｒｉなどが挙げられる。これらの細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列又は１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域－Ｖ２領域の塩基配列は、既知のデータベース（例えば、ＲＤＰ、ＣＯＲＥ又はＮＣＢＩデータベース）から入手することができる。
　Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属細菌としては、特に限定されないが、例えば、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｓｐｕｔｏｒｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐｉｔｔｍａｎｉａｅなどが挙げられる。これらの細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列又は１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域－Ｖ２領域の塩基配列は、既知のデータベース（例えば、ＲＤＰ、ＣＯＲＥ又はＮＣＢＩデータベース）から入手することができる。
　Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属細菌としては、特に限定されないが、例えば、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｐａｓｔｅｒｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｃａｔｏｎｉａｅ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｅｎｄｏｄｏｎｔａｌｉｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｐｏｇｏｎａｅ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｕｅｎｏｎｉｓなどが挙げられる。これらの細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列又は１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域－Ｖ２領域の塩基配列は、既知のデータベース（例えば、ＲＤＰ、ＣＯＲＥ又はＮＣＢＩデータベース）から入手することができる。
　Ａｌｌｏｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属細菌としては、特に限定されないが、例えば、Ａｌｌｏｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｒａｖａ、Ａｌｌｏｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｔａｎｎｅｒａｅなどが挙げられる。これらの細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列又は１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域－Ｖ２領域の塩基配列は、既知のデータベース（例えば、ＲＤＰ、ＣＯＲＥ又はＮＣＢＩデータベース）から入手することができる。
　Ｇｅｍｅｌｌａ属細菌としては、特に限定されないが、例えば、Ｇｅｍｅｌｌａ　ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｇｅｍｅｌｌａ　ｈａｅｍｏｌｙｓａｎｓ、Ｇｅｍｅｌｌａ　ｍｏｒｂｉｌｌｏｒｕｍなどが挙げられる。これらの細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列又は１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域－Ｖ２領域の塩基配列は、既知のデータベース（例えば、ＲＤＰ、ＣＯＲＥ又はＮＣＢＩデータベース）から入手することができる。
　Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌としては、特に限定されないが、例えば、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｕｍＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｃａｎｉｆｅｌｉｎｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｏｒｔｉｆｅｒｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｖａｒｉｕｍなどが挙げられる。これらの細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列又は１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域－Ｖ２領域の塩基配列は、既知のデータベース（例えば、ＲＤＰ、ＣＯＲＥ又はＮＣＢＩデータベース）から入手することができる。
　一実施形態において、群Ｂ－１の細菌種の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号１～１４で示される塩基配列であってよく、群Ｂ－２の細菌種の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号１５～２４に示される塩基配列であってよい（表１）。配列番号１～２４は、表１に示すそれぞれの細菌種の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の部分配列であり、Ｖ１領域－Ｖ２領域の塩基配列を含む。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　一実施形態に係る多発性硬化症の診断方法は、（１）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、群Ａ－１の細菌属の細菌又は群Ｂ－１の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９７％以上の相同性を有する細菌の相対存在量が、健常人における当該相対存在量に比較して多い場合、前記被験者は多発性硬化症に罹患している、又は罹患する危険性が高いと判定することができる。同様に、（２）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、群Ａ－２の細菌属の細菌又は群Ｂ－２の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のいずれかと９７％以上の相同性を有する細菌の相対存在量が、健常人における当該相対存在量に比較して少ない場合、前記被験者は多発性硬化症に罹患している、又は罹患する危険性が高いと判定することができる。
　多発性硬化症への罹患の有無又は罹患の危険性の判定にあたっては、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、上記１４属の細菌及び上記２４種の細菌と９７％以上の相同性を有する細菌の少なくとも１種について、判定を行ってもよい。判定精度をより高める観点から、上記細菌の２種以上について判定を行ってもよく、好ましくは、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上について判定を行ってもよく、上記細菌の全てについて判定を行ってもよい。
　本明細書において、健常人における上記細菌の相対存在量は、予め測定しておいてもよい。健常人における上記細菌の相対存在量は、複数の健常人の平均値であってもよい。また、健常人における上記細菌の相対存在量の複数のデータと被験者の当該相対存在量のデータとから、統計解析（例えば、Ｗｅｌｃｈのｔ検定）により有意差の有無を解析することもできる。
　一実施形態に係る多発性硬化症の診断方法は、（３）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、群Ａ－１の細菌属の細菌又は群Ｂ－１の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９７％以上の相同性を有する細菌の相対存在量を治療前後で比較して、治療後の当該相対存在量が治療前に比較して少ない場合、上記被験者の多発性硬化症の病態は治療により改善されたと判定することができる。同様に、（４）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、群Ａ－２の細菌属の細菌又は群Ｂ－２の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のいずれかと９７％以上の相同性を有する細菌の相対存在量を治療前後で比較して、治療後の当該相対存在量が治療前に比較して多い場合、上記被験者の多発性硬化症の病態は治療により改善されたと判定することができる。
　本明細書において、治療前の被験者における上記細菌の相対存在量は、予め測定しておいてもよく、また治療後の被験者における上記細菌の相対存在量と略同時に測定してもよい。ここでいう「治療前」及び「治療後」とは、例えば、継続的な治療（例えば、定期的な投薬）を行っている期間の途中で施された治療（例えば、３回目の投薬）の前後を含む概念である。
　本明細書において、細菌の相対存在量とは、細菌叢全体に対し当該（特定の）細菌が占める割合を意味する。細菌の相対存在量は、例えば、細菌叢を構成する全細菌数と、細菌叢に含まれる特定の細菌の数から求めることができる。より具体的には、例えば、細菌叢に含まれる細菌に共通する塩基配列と各細菌種に特徴的な塩基配列とを有する遺伝子（例えば、１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子）を網羅的に解読し、解読した遺伝子の総数、及び特定の細菌種に帰属される遺伝子の総数を、それぞれ細菌叢を構成する全細菌数、及び特定の細菌の数として、特定の細菌の相対存在量を求めることができる。
　本実施形態に係る多発性硬化症の診断方法は、被験者から採取された唾液試料に含まれる細菌の相対存在量を測定するステップを含み、当該細菌は、群Ａ－１の細菌属の細菌又は群Ｂ－１の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９７％以上の相同性を有する細菌、或いは、群Ａ－２の細菌属の細菌又は群Ｂ－２の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のいずれかと９７％以上の相同性を有する細菌である、多発性硬化症への罹患の有無又は罹患の危険性を判定するためのデータ収集方法と捉えることもできる。
　本実施形態に係る多発性硬化症の診断方法はまた、被験者から採取された唾液試料に含まれる細菌の相対存在量を測定するステップを含み、当該細菌は、群Ａ－１の細菌属の細菌又は群Ｂ－１の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９７％以上の相同性を有する細菌、或いは、群Ａ－２の細菌属の細菌又は群Ｂ－２の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のいずれかと９７％以上の相同性を有する細菌である、多発性硬化症の治療効果を判定するためのデータ収集方法と捉えることもできる。
〔診断プログラム及び診断システム〕
　上述した本実施形態に係る多発性硬化症の診断方法は、コンピュータを多発性硬化症の診断システムとして機能させる診断プログラムとして提供することもできる。
　一実施形態において、多発性硬化症の診断プログラムは、被験者から採取された唾液試料に含まれる細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を網羅的に解読した塩基配列データを取得するステップ、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子データベースに基づき、取得した塩基配列データから、群Ａ－１及び群Ａ－２の細菌属の細菌、並びに群Ｂ－１及び群Ｂ－２の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９７％以上の相同性を有する塩基配列の頻度を計算し、当該塩基配列の相対存在量を算出するステップ、算出した相対存在量を予め入力された基準値と比較して多発性硬化症の病態を判定するステップ、及び得られた判定結果を出力するステップをコンピュータに実行させる。
　一実施形態において、基準値は、健常人における対応する塩基配列の相対存在量であり、上記相対存在量が、群Ａ－１の細菌属の細菌又は群Ｂ－１の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９７％以上の相同性を有する細菌の相対存在量であり、かつ算出した相対存在量が健常人における当該相対存在量に比較して多い場合、又は、上記相対存在量が、群Ａ－２の細菌属の細菌又は群Ｂ－２の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のいずれかと９７％以上の相同性を有する細菌の相対存在量であり、かつ算出した相対存在量が健常人における当該相対存在量に比較して少ない場合、当該被験者は、多発性硬化症に罹患している、又は罹患する危険性が高いと判定する。
　一実施形態に係る多発性硬化症の診断システムは、被験者から採取された唾液試料に含まれる細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を網羅的に解読した塩基配列データを取得する入力手段と、取得した塩基配列データに基づいて、被験者が多発性硬化症へ罹患している、又は罹患する危険性が高いことを判定する演算手段と、上記演算手段で得られた判定結果を出力する出力手段を備える。
　演算手段（例えば、ＣＰＵ）は、入力した塩基配列データから群Ａ－１及び群Ａ－２の細菌属の細菌、並びに群Ｂ－１及び群Ｂ－２の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９７％以上の相同性を有する塩基配列の少なくとも１つについて、当該塩基配列の出現頻度から相対存在量を算出するステップ、算出した相対存在量を、記憶装置（例えば、ＲＯＭ、ＲＡＭ）から読み出した基準値（健常人における上記相対存在量）と比較し、（ｉ－１）上記相対存在量が、群Ａ－１の細菌属の細菌又は群Ｂ－１の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９７％以上の相同性を有する細菌の相対存在量であり、かつ上記被験者における上記相対存在量が健常人における当該相対存在量に比較して多い場合、又は、（ｉ－２）上記相対存在量が、群Ａ－２の細菌属の細菌又は群Ｂ－２の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のいずれかと９７％以上の相同性を有する細菌の相対存在量であり、かつ上記被験者における上記相対存在量が健常人における当該相対存在量に比較して少ない場合、被験者は、多発性硬化症に罹患している、又は罹患する危険性が高いと判定するステップを実行するものである。演算手段はまた、（ｉ－１）又は（ｉ－２）に該当しない場合、被験者は多発性硬化症に罹患していない、又は罹患する危険性が高くないと判定するステップを実行してもよい。
　上述した診断プログラム及び診断システムの実施形態において、診断プログラムは、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録されていてもよい。すなわち、本実施形態に係るコンピュータ読み取り可能な記録媒体は、上述したプログラムが記録されている。記録媒体は、非一時的記録媒体であってもよい。コンピュータ読み取り可能な記録媒体としては、例えば、コンピュータのＲＯＭ若しくはハードディスク、ネットワークに接続されたサーバ・コンピュータ等に設けられた外部記憶装置、又はフレキシブルディスク、メモリーカード、光磁気ディスク等の可搬記録媒体が挙げられる。
　入力手段は、網羅的に解読した塩基配列データをコンピュータに入力するためのものであって、例えば、マウス、キーボード、データ伝送回線、モデム等の各種インターフェースが挙げられる。判定結果は、例えば、ディスプレイ、プリンタ等の出力手段に出力される。判定結果はまた、他の情報処理端末へのデータ転送回線等を介して出力されてもよい。
〔診断用バイオマーカー及びその使用〕
　本実施形態に係る多発性硬化症の診断用バイオマーカーは、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、群Ａ－１及び群Ａ－２の細菌属の細菌並びに群Ｂ－１及び群Ｂ－２の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９７％以上の相同性を有する唾液細菌からなる。群Ａ－１及び群Ａ－２の細菌属の細菌並びに群Ｂ－１及び群Ｂ－２は上述のとおりである。
　一実施形態の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号１～２４で示される塩基配列のいずれかと９７％以上の相同性を有する唾液細菌からなってもよい。配列番号１～２４で示される塩基配列は、群Ｂ－１及び群Ｂ－２の細菌種の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列である。
　上述のとおり、１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域－Ｖ２領域の塩基配列に基づき同定された群Ａ－１の細菌属の細菌又は群Ｂ－１の細菌種は、健常対照と比較してＭＳ患者で有意に相対存在量が増加する。また、１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域－Ｖ２領域の塩基配列に基づき同定された群Ａ－２の細菌属の細菌又は群Ｂ－２の細菌種は、健常対照と比較してＭＳ患者で有意に相対存在量が減少する。
　したがって、上記相対存在量の多寡に基づき、上記唾液細菌をバイオマーカーとして使用することができる。本実施形態のバイオマーカーによれば、例えば、多発性硬化症への罹患の有無又は罹患の危険性を判定すること、及び多発性硬化症の治療効果を判定することなど、多発性硬化症を診断することができる。
　本実施形態に係る多発性硬化症の診断用バイオマーカーとしての使用は、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、群Ａ－１及び群Ａ－２の細菌属の細菌、並びにＢ－１及び群Ｂ－２の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９７％以上の相同性を有する唾液細菌の、多発性硬化症の診断用バイオマーカーとしての使用である。一実施形態の使用は、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号１～２４で示される塩基配列のいずれかと９７％以上の相同性を有する唾液細菌の、多発性硬化症の診断用バイオマーカーとしての使用であってよい。
〔予防剤又は治療剤〕
　本実施形態に係る多発性硬化症の予防剤又は治療剤は、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、群Ａ－２の細菌属の細菌又は群Ｂ－２の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９７％以上の相同性を有する細菌、及び上記細菌に由来する生理活性物質からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有する。
　一実施形態に係る多発性硬化症の予防剤又は治療剤は、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号１５～２４で示される塩基配列のいずれかと９７％以上の相同性を有する細菌、及び上記細菌に由来する生理活性物質からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有する。
　上述のとおり、１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域－Ｖ２領域の塩基配列に基づき同定された群Ａ－２の細菌属の細菌又は群Ｂ－２の細菌種は、健常対照と比較してＭＳ患者で有意に相対存在量が減少する。本実施形態に係る予防剤又は治療剤は、当該細菌又はこれら由来の生理活性物質を含有することから、多発性硬化症の予防又は治療（病態の改善、緩和、寛解）に適する。
　有効成分である細菌は、例えば、ヒトの唾液細菌叢を構成する唾液細菌を単離培養し、単離された唾液細菌の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域－Ｖ２領域の塩基配列を解析し、所望の塩基配列を有する唾液細菌を特定することにより得ることができる。また、既知菌種と９７％以上の類似度を有する唾液細菌は、当該菌種と同一種であるため、当該菌種をＡＴＣＣ等の細胞バンクから購入してもよい。唾液細菌由来の生理活性物質は、当該唾液細菌を培養し、培地中に分泌された生理活性物質を精製又は単離することで得ることができる。また、当該唾液細菌を接種及び定着させたマウス等の動物の口腔内容物から精製又は単離することで得ることもできる（Ｉｎ　ｖｉｖｏ方法）。
　予防剤又は治療剤は、有効成分のみで構成してもよく、また薬学的に許容される担体（賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤等）又は添加剤（等張化剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、可溶化剤、懸濁剤、希釈剤、界面活性剤、安定剤、吸収促進剤、増量剤、ｐＨ調整剤、保湿剤、吸着剤、崩壊抑制剤、コーティング剤、着色剤、保存剤、抗酸化剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤、無痛化剤等）を更に含有していてもよい。
　予防剤又は治療剤の剤形は、投与方法、処方条件に応じて適宜選択してよい。剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、ドロップ剤、舌下剤、トローチ剤、液剤等を挙げることができる。また、有効成分を大腸に効率良く送達するという観点から、製剤には腸溶性コーティングを施してもよい。腸溶性コーティングとしては、公知のものを特に制限なく使用することができる。
　予防剤又は治療剤の投与方法としては、経口投与、非経口投与のいずれであってもよい。予防剤又は治療剤の投与量は、例えば、ヒト成人男子（体重６０ｋｇ）に投与する場合、有効成分量換算で、通常０．００１ｍｇ～５０００ｍｇ／日／人であり、好ましくは０．０１ｍｇ～５００ｍｇ／日／人である。複数回に分割して投与してもよい。
〔予防方法又は治療方法〕
　本実施形態に係る多発性硬化症の予防方法又は治療方法は、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、群Ａ－２の細菌属の細菌又は群Ｂ－２の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９７％以上の相同性を有する細菌、及び上記細菌に由来する生理活性物質からなる群より選択される少なくとも１種を、それを必要とする対象に投与することを含む。
　一実施形態に係る多発性硬化症の予防方法又は治療方法は、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号１５～２４で示される塩基配列のいずれかと９７％以上の相同性を有する細菌、及び上記細菌に由来する生理活性物質からなる群より選択される少なくとも１種を、それを必要とする対象に投与することを含む。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
１．試験方法
［１．患者、臨床データ及び健常対照］
　２０～８０歳のＭＳ患者９１例とＮＭＯＳＤ患者２０例を対象とした。ＭＳ患者９１名全員がＭｃＤｏｎａｌｄの診断基準を満たしていた。この研究では、最初に９１名の患者を臨床及びＭＲＩに基づく方法によって２つのグループに分類した。ＭＳ特異的脳ＭＲＩ病変を有する７１名の患者を典型的なＭＳ群とし、ＭＳ特異的脳ＭＲＩ病変を有さない２０名の患者を非典型ＭＳ群とした。典型的なＭＳを有する７１名の患者はさらに、患者の臨床経過に基づく神経科医の診断により、５９名のＲＲＭＳ患者及び１２名のＳＰＭＳ患者に分類された。すべてのＮＭＯＳＤ患者は血清抗ＡＱＰ４抗体陽性であり、ＮＭＯＳＤの国際的な総意に基づく診断基準を満たしていた。また、罹病期間が５年以下の２０例を早期ＲＲＭＳ、ＥＤＳＳスコアが１以下の２４例を軽症ＲＲＭＳと診断した。ＥＤＳＳスコアは、ＭＳの臨床評価に基づく神経障害の尺度である（Ｋｕｒｔｚｋｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９８３）。試験登録時に再発が認められた患者はいなかった。年間再発率（ＡＲＲ）は、サンプル採取に先立つ１年間の再発回数と定義した。本研究において、「寛解状態」とは、３０日以上臨床的に安定な状態として定義され、「再発状態」は、２４時間以上継続する神経症候が示された神経の増悪の開始後３０日以内の期間として定義された。感染症に罹患し、糞便サンプルの回収中に抗生物質で治療された患者は、本研究から除外された。ＲＲＭＳ患者１１名、ＳＰＭＳ患者２名及び非典型ＭＳ患者２名は、サンプリング前２ヶ月以内に免疫療法を受けていなかった。年齢、性別及びＢＭＩが調整された健常者６０名の唾液サンプル及び３０名の糞便サンプルから１６Ｓ　ＲＮＡを得た。また、ＭＳ患者及びＮＭＯＳＤ患者１１８名から、完全に一致した患者１１１名の糞便サンプルから１６Ｓ　ＲＮＡを得た。登録患者及び健常者の詳細な図１に示す。
　本研究は国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター臨床研究審査委員会（Ａ２０１６－１３２）及び理化学研究所生命医科学研究センター臨床研究審査委員会（Ｈ３０－４（６））によって承認された。サンプルを提供したすべての被験者から署名されたインフォームド・コンセントが得られた。
［２．ＤＮＡの準備］
　採取した唾液サンプルは、４℃の温度を維持しながら、実験室に輸送した。実験室では液体窒素を用いて試料を直ちに凍結し、使用時まで－８０℃で保存した。
　採取した糞便サンプルは直ちに使い捨ての酸素吸収剤及び二酸化炭素発生剤を含有するプラスチックバッグ（プラスチックバッグ内は、酸素感受性嫌気性細菌が生存可能な環境である。）に入れて、４℃の温度を維持しながら、実験室へ運搬した。実験室において、２０％グリセロールを含有するリン酸緩衝生理食塩水に糞便を懸濁させ、直ちに液体窒素で凍結させ、使用するまで－８０℃で保管した。細菌のＤＮＡは、酵素溶解法に従って、糞便サンプルから単離され、精製された。
［３．１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域－Ｖ２領域の配列決定及びデータ処理］
　細菌に普遍的なプライマーセット（フォワードプライマー２７Ｆｍｏｄ（バーコード配列を含む、配列番号２５：５’－ａｇｒｇｔｔｔｇａｔｙｍｔｇｇｃｔｃａｇ－３’）及びリバースプライマー３３８Ｒ（配列番号２６：５’－ｔｇｃｔｇｃｃｔｃｃｃｇｔａｇｇａｇｔ－３’）を用いたＰＣＲにより、各サンプル中に含まれる細菌種の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子Ｖ１領域－Ｖ２領域を網羅的に増幅した(Kim et al., an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes 20, 241-253 (2013).）。ＰＣＲ増幅産物を次世代シークエンサーＭｉＳｅｑ　システム（ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）に供与し、各ＰＣＲ産物の配列を決定した。
　上記で得られた９６の配列は、理化学研究所ＩＭＳマイクロバイオーム研究チームで構築した解析パイプラインに供与することで、細菌種の相対比率の解析を行った。本パイプラインでは、各サンプルに割り当てられたペア配列を、Ｆａｓｔ１－ｊｏｉｎプログラムによって結合した後、平均クオリティ値が２５未満で両方のユニバーサルプライマーと不正確な一致であるリード及びキメラの可能性であるリード（全リードに対して全部で４３－４４％）が除外された。残った高品質の配列（平均クオリティ値＞２５）から、サンプル当たり１０，０００のリードがランダムに選択され、本研究で実施された分析に使用された。
　選択されたリードを平均クオリティ値の高い順序にソートし、９６％のペアワイズ相同性を指標に、ＵＣＬＵＳＴアルゴリズムを用いて分類することにより、操作上の分類単位（Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ　Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　Ｕｎｉｔ、ＯＴＵ）にグループ化した（Said et al., DNA research : an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes 21, 15-25 (2014)）。ＧＬＳＥＡＲＣＨプログラムを用いて、既知の１６Ｓ（ＲＤＰ及びＣＯＲＥ）及びＮＣＢＩゲノムデータベースに対して類似検索を行い、各ＯＴＵに対する分類学上の割り当てを行った。門レベル、科レベル、属レベル及び種レベルでの分類には、それぞれ７０％、９０％、９４％及び９６％の配列類似度閾値を適用した。
［４．統計解析］
　全ての統計解析には、Ｒ（ｖｅｒｓｉｏｎ３．３．３）又はＰｒｉｓｍ（グラフパッドソフトウェア社製）を使用した。ウィルコクソン順位和検定はＢｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法により対象群間の細菌叢データを比較するために用いられた。スピアマンの相関係数解析は、相関関係を評価するために用いられた。クラスカルウォリス検定及びカイ二乗検定は、患者背景データの比較に用いられた。ノンパラメトリック多変量分散解析（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎａｌ　ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｖａｒｉａｎｃｅ、ＰＥＲＭＡＮＯＶＡ）は、細菌叢全体の組成の比較に用いられた。有意水準は、ｐ値０．０５未満に設定した。
２．結果
［１．患者と健常対照の背景プロファイル］
　被験者の背景プロファイルを図１に示す。ＲＲＭＳ患者５９名（平均年齢３９．２歳）、ＳＰＭＳ患者１２名（平均年齢４４．３歳）、非典型ＭＳ患者２０名（平均年齢４２．１歳）、ＮＭＯＳＤ患者２０名（平均年齢４３．１歳）、健常対照者６０名（ＨＣ；平均年齢３９．５歳）が組み入れられた。
　全ての対象群間における年齢、性別及びＢＭＩには有意差はなかった。一方、免疫療法を受けた患者の割合は、４つの患者群とＨＣ群の間で実質的な差があった。しかし、ＲＲＭＳ群では免疫療法を受けた患者と受けなかった患者の間にα及びβの多様性に有意差がなかったことから、免疫療法は唾液細菌叢の構造に有意な影響を及ぼさなかった（図示せず）。
［２．患者群と健常者群との間の唾液細菌叢におけるα及びβ多様性の比較］
　Ｍｉｓｅｑを用いた１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子Ｖ１領域－Ｖ２領域のアンプリコンシーケンス解析によって、すべての被験者からの高品質１６Ｓリードから、分析のために１サンプル当たり１０，０００リードを無作為に選択し、１７１サンプルから合計で１７１００００リードを選択した。
　図２のＡ～Ｄはα多様性指数の結果を示す。箱ひげ図におけるプロットは、中央値、四分位範囲、最小値及び最大値を示した。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１及び＊＊＊：ｐ＜０．００１は、多群比較のためのＢｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を用いたウィルコクソンの順位和検定に基づいた。
　（Ａ）ＯＴＵ数、（Ｂ）Ｃｈａｏ－１、（Ｃ）ＡＣＥ（ａｂｕｎｄａｎｃｅ－ｂａｓｅｄ　ｃｏｖｅｒａｇｅ　ｅｓｔｉｍａｔｏｒ）及び（Ｄ）Ｓｈａｎｎｏｎ指数は、非典型ＭＳ群とＨＣ群の比較を除いて、５群間でα多様性の有意差を示さなかった（図２）。
　次に、１６Ｓデータを用いたＵｎｉＦｒａｃ距離解析に基づいて、β多様性を評価した。加重（ｗｅｉｇｈｔｅｄ）ＰＣｏＡプロットの２つの成分は分散の３３．１％及び２０．９％を説明し、非加重（ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ）ＰＣｏＡプロットの２つの成分は分散の８．１％及び６．８％を説明した（プロット図を示さず）。４つの患者群とＨＣ群の間のノンパラメトリック多変量分散解析（ＰＥＲＭＡＮＯＶＡ）におけるＲ２及び調整されたｐ値は図２　Ｅに示す。＊：Ｂｅｎｊａｍｉｎ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法によるウィルコクソン順位和検定に基づくｐ＜０．０５。ＰＥＲＭＡＮＯＶＡは、全てのＭＳサブタイプ群とＨＣ群の間で、加重（ｗｅｉｇｈｔｅｄ）及び非加重（ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ）Ｕｎｉｆｒａｃ距離に対して全唾液細菌叢のβ多様性に有意差を示した（図２　Ｅ）。上述したように、ＲＲＭＳ群とＨＣ群の間で観察されたα及びβの多様性の違いは、患者に投与された免疫療法の違いによる有意な影響を受けなかった。
［３．５つの対象群間の細菌の存在量の比較］
　１６Ｓデータに基づき、様々な分類レベルで細菌存在量を比較した。各サンプルの分類帰属や存在量の定量は、１６Ｓリードを、公開されている利用可能な細菌の１６Ｓ及びゲノムデータベースにマッピングすることにより行った。
　図３は、５つの対象群の間で、細菌叢組成を門レベルで比較した結果を示す図であり、上位６つの門の結果を示す。各箱ひげ図におけるプロットは、中央値、四分位範囲、最小値及び最大値を示した。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：ｐ＜１０－４、＊＊＊＊＊：ｐ＜１０－５、＊＊＊＊＊＊：ｐ＜１０－６、＊＊＊＊＊＊＊：ｐ＜１０－７、＊＊＊＊＊＊＊＊：ｐ＜１０－８、及び＊＊＊＊＊＊＊＊＊：ｐ＜１０－９は、多群比較のためのＢｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を用いたウィルコクソンの順位和検定に基づいた。
　１６Ｓデータに基づく門レベルの分類帰属により、５つの対象群のうち少なくとも１つの対象群で平均相対存在量が０．１％以上である６つの主要な門が同定された。５つの門：Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ（Ａ）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ（Ｂ）、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ（Ｃ）、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ（Ｄ）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ（Ｅ）の存在量には、２つの対象群の間で有意な変化があった（図３）。
　図４は、５つの対象群間で、細菌叢組成を属レベルで比較した結果を示す図であり、上位１２の属の結果を示す。各箱ひげ図におけるプロットは、中央値、四分位範囲、最小値及び最大値を示した。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：ｐ＜１０－４、＊＊＊＊＊：ｐ＜１０－５、＊＊＊＊＊＊：ｐ＜１０－６、＊＊＊＊＊＊＊：ｐ＜１０－７、＊＊＊＊＊＊＊＊：ｐ＜１０－８、及び＊＊＊＊＊＊＊＊＊：ｐ＜１０－９は、多群比較のためのＢｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を用いたウィルコクソンの順位和検定に基づいた。
　ＲＲＭＳ群とＨＣ群の唾液マイクロバイオームと比較して、４つの主要な門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ及びＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、１０つの属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｒｏｔｈｉａ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｃｈａａｌａ、Ｇｅｍｅｌｌａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ及びＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）の存在量はそれらの間で有意に変化していた（図３及び図４）。ＭＳ／ＮＭＯＳＤ群の唾液細菌叢では、ＨＣ群と比較して、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａの存在量が増加していたのに対して、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓの存在量は減少していた（図４）。
　図５は、５つの対象群間の属レベルでの細菌種の平均相対的存在量（Ａｖｅｒａｇｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ａｂｕｎｄａｎｃｅ）を比較した結果を示す。５つのグループのうち少なくとも１つで、平均相対存在量が０．１％以上の属を表す。データは平均±ＳＥＭで表す。＊Ｂｅｎｊａｍｉｎ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を用いたウィルコクソン順位和検定に基づくｐ＜０．０５、患者群とＨＣ群の間の相対的存在量に有意な変化があることを示している。１６Ｓデータに基づく属レベルの分類帰属により、５つの対象群のうち少なくとも１つの対象群で平均相対存在量が０．１％以上の３８属を同定し、２４属の平均相対的存在量は２群間で有意な変化を示した（図５中＊）。
　図６及び図７は、１６Ｓデータに基づく種レベルの分類帰属により、５つの対象群のうち少なくとも１つの対象群で平均相対存在量が０．１％以上の種等価クラスターの存在度を比較した結果を示す。図６及び図７は、任意の２つの対象群間で存在量に有意な変化を示す細菌種のリストで、２つの群間で倍数変化（ｌｏｇ１０）があった細菌種を示す。統計はＢｅｎｊａｍｉｎ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を用いたウィルコクソン順位和検定に基づいた。５つの対象群のすべてのペア間の比較により、任意の２つの対象群間で存在量に有意な変化を有する合計３５の異なる種が同定された（ウィルコクソン検定、ｐ＜０．０５；図６及び図７）。ＲＲＭＳ群とＨＣ群の間、ＳＰＭＳ群とＨＣ群の間、非典型ＭＳ群とＨＣ群の間、ＮＭＯＳＤ群とＨＣ群の間、ＳＰＭＳ群と非典型ＭＳ群の間で存在量に有意差を示す、２９種、５種、２１種、２１種及び２種をそれぞれ同定した（図６及び図７）。
［４．唾液細菌叢の変化は疾患活動性と有意に関連］
　唾液細菌叢データと患者の疾患活動性の程度との関連性を、サンプル採取前の１年以内に少なくとも１回の臨床的再発を経験した患者から得られた疾患活動性が高いサンプルと、サンプル採取前の１年以上臨床的再発を経験していない患者から得られた疾患活動性が低いサンプルとを比較することによって検討した。
　その結果を図８～１０に示す。図８～１０は、４つのα多様性指標、及び、５つの対象群の少なくとも１つにおいて相対存在量が０．１％以上の６門、３８属及び８４種の存在量における疾患活動性が高い群（Ｒｅｃｅｎｔ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｐａｔｉｅｎｔ）と疾患活動性が低い群（Ｎｏｎ－ｒｅｃｅｎｔ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｐａｔｉｅｎｔ）の間の差異を示す。＊を付した太字は、疾患活動性が高い群において、疾患活動性が低い群と比較して有意に変化した細菌のデータを示す。統計的手法はウィルコクソン順位和検定に基づいた。
　図１１は、全患者において、疾患活動性が高い群では疾患活動性が低い群に比べて存在量が有意に増加又は減少した５つの唾液細菌の相対発現量を示す。疾患活動性が高い群と疾患活動性が低い群との間の差異を、４つのα多様性指標及び５つの対象群の少なくとも１つにおいて相対存在量が０．１％を超える６つの門、３９属及び８４種の相対存在量において評価した。各箱ひげ図におけるプロットは、中央値、四分位範囲、最小値及び最大値を示した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊＊＊ｐ＜０．００００１、＊＊＊＊＊＊ｐ＜０．０００００１であった。
　有意に変化した細菌は、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｐａｓｔｅｒｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｓｐｕｔｏｒｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｇｏｒｄｏｎｉｉを含み、疾患活動性が低い群と比較して疾患活動性が高い群における相対存在量が有意に減少した（それぞれｐ＝０．０３、０．０３、０．０３、０．０１及び０．０１；図１１）。
［５．ＲＲＭＳの診断マーカーとしての唾液細菌叢の可能性の評価］
　ランダムフォレスト（ＲＦ）を持つＲＲＭＳの予測モデルをＲＲＭＳ群とＨＣ群の間の差に基づいて開発し、交差検証により評価した。この目的のために、全てのＲＲＭＳ患者を類似した被験者数を有する２つのグループ：ＲＲＭＳの探索コホート（ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　ｃｏｈｏｒｔ；ｎ＝３０）と検証コホート（ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ　ｃｏｈｏｒｔ；ｎ＝２９）に分け、選択バイアスを最小限にするために２つのコホート間のサンプル採取日の差が最小にした（図１２）。
　図１３は、ＲＲＭＳ群と健常対照群の唾液及び腸内細菌叢のランダムフォレストアルゴリズム（機械学習予測モデル）解析の結果を示す。ランダムフォレスト（ＲＦ）は唾液サンプルを用いて属レベル（Ａ）と種レベル（Ｂ）で行われた。最も高い受信者動作特性曲線下面積（ＡＵＣ）を有する最良のＲＦモデルは、各ウィンドウ内の矢印によって示される。横軸は、属又は種の数を示し、使用された細菌は上記の３９属及び８４種であった。
　図１４及び図１５は、それぞれＲＦアルゴリズムにより選択された１４属及び２４種の細菌リストであり、各属又は種の存在量に基づくＺスコアは、上に示すスケール通りの最低（Ｃｏｌｏｒ　Ｋｅｙ：－１）から最高(Ｃｏｌｏｒ　Ｋｅｙ：１)まで描かれている。＊：患者群とＨＣ群の比較におけるウィルコクソン順位和検定に基づくｐ＜０．０５。
　次に、唾液及び糞便細菌叢によるＲＲＭＳ群とＨＣ群とを診断する可能性を検討した。表２、図１６及び図１７は、ＲＲＭＳ群、早期発症ＲＲＭＳ群、軽症ＲＲＭＳ群及びＨＣ群の間の属レベル及び種レベルでの唾液及び糞便細菌叢の平均ＡＵＣを示す。
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　ＲＲＭＳとＨＣの発見コホートからの唾液細菌叢に基づく予測モデルでは、受信者動作特性曲線下面積（ＡＵＣ）は、それぞれ０．９４（属レベル）と０．９３（種レベル）であり（図１３～１５、図１６　Ａ、表２）、１４属、２４種（相対存在量０．１％以上）からなり、２つのコホートの識別に大きく寄与していた（図１３～１５）。発見コホートからの上記の予測モデルは、ＲＲＭＳ及びＨＣの検証コホートに適用することによって検証された。ＡＵＣはそれぞれ０．７９（属レベル）と０．８３（種レベル）であった（図１６　Ａ及びＢ、図１７　Ｂ、表２）。
　ＲＲＭＳ（ｎ＝３０）とＨＣ（ｎ＝３０）の発見コホートで正確に一致した被験者から採取した唾液と糞便サンプルを用いて、ＲＲＭＳの診断マーカーとしての唾液と糞便細菌叢の可能性を評価し、比較した。糞便サンプルに基づく予測モデルのＡＵＣは０．８２（属レベル）と０．６８（種レベル）であり、唾液サンプルに基づくＡＵＣはそれぞれ０．９４（属レベル）と０．９３（種レベル）であり、唾液細菌叢のモデルのＲＲＭＳの予測精度は糞便細菌叢よりも高いことが示された（表２、図１７　Ｅ）。糞便及び唾液サンプルに基づく予測モデルは、ＡＵＣが０．９６（属レベル）及び０．９３（種レベル）であり、これは唾液サンプルのみに基づくものとほぼ同等であった（表２、図１７　Ｆ）。これらのデータは、唾液細菌叢に基づく予測モデルのほうが糞便細菌叢に基づく予測モデルよりも予測精度が高いことが示唆された。
　早期ＲＲＭＳコホート（罹病期間５年以下）のＡＵＣは０．８４（属レベル）及び０．８４（種レベル）、軽症ＲＲＭＳコホート（ＥＤＳＳスコアが１以下）のＡＵＣはそれぞれ０．８８（属レベル）及び０．８１（種レベル）であった（表２、図１６　Ｃ、図１７　Ｄ）。これらのデータは唾液細菌叢がＭＳの早期かつ高感度な診断マーカーである可能性を示唆している。
　これらの細菌のセットを用いて検証コホートのＲＲＭＳ群とＨＣ群の分別能を評価したところ、約８３％の精度（ａｒｅａ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｃｕｒｖｅ（ＡＵＣ）；０．８３）で２群を区別することができた。さらに、発症５年以内の早期発症ＲＲＭＳ患者群とＨＣ群との比較、神経障害度スコア（ＥＤＳＳスコア）が１以下の検証ＲＲＭＳ患者群とＨＣ群との比較においても、それぞれ８４％、８８％の精度で２群を区別することができた。

Claims (13)

  1. 　多発性硬化症の診断方法であって、治療前及び治療後に被験者から採取された唾液試料に含まれる細菌の相対存在量を測定するステップと、以下の（１）又は（２）を実施するステップとを備える、方法。
    　（１）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、群Ａ－１の細菌属の細菌又は群Ｂ－１の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９７％以上の相同性を有する細菌の相対存在量が、健常人における当該相対存在量に比較して多い場合、前記被験者は多発性硬化症に罹患している、又は罹患する危険性が高いと判定する
    　（２）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、群Ａ－２の細菌属の細菌又は群Ｂ－２の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のいずれかと９７％以上の相同性を有する細菌の相対存在量が、健常人における当該相対存在量に比較して少ない場合、前記被験者は多発性硬化症に罹患している、又は罹患する危険性が高いと判定する
    群Ａ－１：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｏｔｈｉａ、Ｓｃｈａａｌｉａ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ
    群Ａ－２：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ａｌｌｏｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｇｅｍｅｌｌａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
    群Ｂ－１：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｇｒａｅｖｅｎｉｔｚｉｉ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ　ｉｎｆｅｌｉｘ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｒｏｔｈｉａ　ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｈｉｓｔｉｃｏｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓｃｈａａｌｉａ　ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔａｒｉｕｓ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ　ｐａｒｖｕｌｕｍ
    群Ｂ－２：Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｐａｓｔｅｒｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｎａｎｃｅｉｅｎｓｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｓｐｕｔｏｒｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｏｏｒｅｉ、Ａｌｌｏｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｒａｖａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ
  2. 　多発性硬化症の診断方法であって、治療前及び治療後に被験者から採取された唾液試料に含まれる細菌の相対存在量を測定するステップと、以下の（３）又は（４）を実施するステップとを備える、方法。
    　（３）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、群Ａ－１の細菌属の細菌又は群Ｂ－１の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９７％以上の相同性を有する細菌の相対存在量を治療前後で比較して、治療後の当該相対存在量が治療前に比較して少ない場合、前記被験者の多発性硬化症の病態は治療により改善されたと判定する
    　（４）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、群Ａ－２の細菌属の細菌又は群Ｂ－２の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のいずれかと９７％以上の相同性を有する細菌の相対存在量を治療前後で比較して、治療後の当該相対存在量が治療前に比較して多い場合、前記被験者の多発性硬化症の病態は治療により改善されたと判定する
    群Ａ－１：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｏｔｈｉａ、Ｓｃｈａａｌｉａ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ
    群Ａ－２：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ａｌｌｏｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｇｅｍｅｌｌａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
    群Ｂ－１：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｇｒａｅｖｅｎｉｔｚｉｉ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ　ｉｎｆｅｌｉｘ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｒｏｔｈｉａ　ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｈｉｓｔｉｃｏｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓｃｈａａｌｉａ　ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔａｒｉｕｓ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ　ｐａｒｖｕｌｕｍ
    群Ｂ－２：Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｐａｓｔｅｒｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｎａｎｃｅｉｅｎｓｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｓｐｕｔｏｒｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｏｏｒｅｉ、Ａｌｌｏｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｒａｖａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ
  3. 　前記多発性硬化症が、再発寛解型多発性硬化症である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域－Ｖ２領域の塩基配列である、請求項１又は２に記載の方法。
  5. 　前記群Ｂ－１の細菌種の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号１～１４で示される塩基配列であり、前記群Ｂ－２の細菌種の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号１５～２４に示される塩基配列である、請求項１又は２に記載の方法。
  6. 　１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、群Ａ－１及び群Ａ－２の細菌属の細菌並びに群Ｂ－１及び群Ｂ－２の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９７％以上の相同性を有する唾液細菌からなる、多発性硬化症の診断用バイオマーカー。
    群Ａ－１：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｏｔｈｉａ、Ｓｃｈａａｌｉａ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ
    群Ａ－２：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ａｌｌｏｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｇｅｍｅｌｌａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、
    群Ｂ－１：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｇｒａｅｖｅｎｉｔｚｉｉ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ　ｉｎｆｅｌｉｘ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｒｏｔｈｉａ　ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｈｉｓｔｉｃｏｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓｃｈａａｌｉａ　ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔａｒｉｕｓ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ　ｐａｒｖｕｌｕｍ
    群Ｂ－２：Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｐａｓｔｅｒｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｎａｎｃｅｉｅｎｓｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｓｐｕｔｏｒｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｏｏｒｅｉ、Ａｌｌｏｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｒａｖａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ
  7. 　１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号１～２４で示される塩基配列のいずれかと９７％以上の相同性を有する唾液細菌からなる、多発性硬化症の診断用バイオマーカー。
  8. 　１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、群Ａ－１及び群Ａ－２の細菌属の細菌、並びに群Ｂ－１及び群Ｂ－２の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９７％以上の相同性を有する唾液細菌の、多発性硬化症の診断用バイオマーカーとしての使用。
    群Ａ－１：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｏｔｈｉａ、Ｓｃｈａａｌｉａ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ
    群Ａ－２：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ａｌｌｏｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｇｅｍｅｌｌａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
    群Ｂ－１：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｇｒａｅｖｅｎｉｔｚｉｉ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ　ｉｎｆｅｌｉｘ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｒｏｔｈｉａ　ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｈｉｓｔｉｃｏｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓｃｈａａｌｉａ　ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔａｒｉｕｓ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ　ｐａｒｖｕｌｕｍ
    群Ｂ－２：Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｐａｓｔｅｒｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｎａｎｃｅｉｅｎｓｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｓｐｕｔｏｒｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｏｏｒｅｉ、Ａｌｌｏｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｒａｖａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ
  9. 　１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号１～２４で示される塩基配列のいずれかと９７％以上の相同性を有する唾液細菌の、多発性硬化症の診断用バイオマーカーとしての使用。
  10. 　１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、群Ａ－２の細菌属の細菌又は群Ｂ－２の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９７％以上の相同性を有する細菌、及び前記細菌に由来する生理活性物質からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、多発性硬化症の予防剤又は治療剤。
    群Ａ－１：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｏｔｈｉａ、Ｓｃｈａａｌｉａ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ
    群Ｂ－１：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｇｒａｅｖｅｎｉｔｚｉｉ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ　ｉｎｆｅｌｉｘ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｒｏｔｈｉａ　ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｈｉｓｔｉｃｏｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓｃｈａａｌｉａ　ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔａｒｉｕｓ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ　ｐａｒｖｕｌｕｍ
  11. 　１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号１５～２４で示される塩基配列のいずれかと９７％以上の相同性を有する細菌、及び前記細菌に由来する生理活性物質からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、多発性硬化症の予防剤又は治療剤。
  12. 　１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、群Ａ－２の細菌属の細菌又は群Ｂ－２の細菌種のいずれかの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９７％以上の相同性を有する細菌、及び前記細菌に由来する生理活性物質からなる群より選択される少なくとも１種を、それを必要とする対象に投与することを含む、多発性硬化症の予防方法又は治療方法。
    群Ａ－１：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｏｔｈｉａ、Ｓｃｈａａｌｉａ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ
    群Ｂ－１：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｇｒａｅｖｅｎｉｔｚｉｉ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ　ｉｎｆｅｌｉｘ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｒｏｔｈｉａ　ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｈｉｓｔｉｃｏｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓｃｈａａｌｉａ　ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔａｒｉｕｓ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ　ｐａｒｖｕｌｕｍ
  13. 　１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号１５～２４で示される塩基配列のいずれかと９７％以上の相同性を有する細菌、及び前記細菌に由来する生理活性物質からなる群より選択される少なくとも１種を、それを必要とする対象に投与することを含む、多発性硬化症の予防方法又は治療方法。

     
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