ES2304792T3 - Gen d-sorbitol dehidrogenasa. - Google Patents
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Abstract
SE EXPONE UN DNA QUE COMPRENDE UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICA UNA PROTEINA, TAL COMO SE DEFINE POR (A) O (B) Y QUE TIENE ACTIVIDAD DE DESHIDROGENASA DEL SORBITOL: (A) UNA PROTEINA QUE TIENE LA SECUENCIA DE AMINOACIDOS DE LA POSICION 1 A LA 716 DE LA SECUENCIA DESCRITA EN SEQ ID NO: 2, O (B) UNA PROTEINA DERIVADA DE LA PROTEINA DEL ANTERIOR PARRAFO (A) POR SUSTITUCION, SUPRESION, INSERCION O ADICION DE UNO O MAS AMINOACIDOS EN LA SECUENCIA DE AMINOACIDOS DEFINIDA EN (A), VECTORES, QUE COMPRENDE TALES DNAS, HUESPEDES TRANSFORMADOS POR DICHOS VECTORES, Y UN PROCESO PARA LA PREPARACION DE DICHAS PROTEINAS Y PARA SU USO.
Description
Gen D-sorbitol
deshidrogenasa.
La presente invención se refiere a un nuevo
código de ADN para sorbitol deshidrogenasa de un microorganismo
perteneciente a las bacterias de ácido acético incluyendo el género
Gluconobacter y el género Acetobacter, un vector de
expresión conteniendo dicho ADN, y organismos recombinantes
conteniendo dicho vector de expresión. Además la presente invención
se refiere al proceso para producir D-sorbitol
deshidrogenasa recombinante y el proceso para producir
L-sorbosa utilizando dichas enzimas recombinantes u
organismos recombinantes conteniendo dicho vector de expresión.
L-Sorbosa es un intermediario
importante en el proceso actual industrial de producción de la
vitamina C, el cual es principalmente practicado por el método de
Reichstein (Helvetica chimica Acta, 17: 311, 1934). En el proceso,
la única transformación microbiana es la producción de
L-sorbosa a partir de D-sorbitol por
cepas de Gluconobacter o Acetobacter. La
transformación se considera que es llevada a cabo por la
D-sorbitol deshidrogenasa (SLDH) independiente de
NAD/NADP. L-Sorbosa es también un sustrato bien
conocido en el arte para producir microbiológicamente el ácido
2-ceto-L-gulónico,
el cual es un intermediario útil en la producción de vitamina
C.
Es conocido que existen
D-sorbitol deshidrogenasa independiente de NAD/NADP,
las cuales catalizan la oxidación de D-sorbitol a
L-sorbosa. Dicha D-sorbitol
deshidrogenasa fue aislada y caracterizada a partir de
Gluconobacter suboxydans var \alpha IFO 3254 (E. Shinagawa
y otros, Agric Biol. Chem., 46: 135-141, 1982), y se
encontró que está compuesta de tres subunidades con pesos
moleculares de 63 kDa, 51 kDa y 17 kDa; la mayor subunidad es la
deshidrogenasa conteniendo a FAD como un cofactor, la segunda de
ellas es citocromo c AB/vs/26.6.98 y la más pequeña es una proteína
con función desconocida; y muestra su pH óptimo a 4.5. Tal SLDH
también fue purificada y caracterizada a partir de G.
suboxydans ATCC 621 (KCTC 2111) (E-S Choi y
otros, FEMS Microbiol. Lett. 125; 45-50, 1995) y se
encontró que está compuesta de tres subunidades con pesos
moleculares de 75 kDa, 50 kDa y 14 kDa; la mayor subunidad es la
deshidrogenasa conteniendo a la pirroloquinolina quinona (PQQ) como
un cofactor, la segunda de ellas es citocromo c y la más pequeña es
una proteína con función desconocida. Los inventores también
purificaron y caracterizaron la SLDH
NAD/NADP-independiente a partir de G.
suboxydans IFO 3255(T. Hoshino y otros, EP 728840; la
SLDH está compuesta de un tipo de subunidad con peso molecular de
79.0 +/- 0.5 kDa y muestra su pH óptimo de 6 a 7 y muestra actividad
deshidrogenasa en manitol y glicerol así como en
D-sorbitol.
D-sorbitol.
Aunque diversas SLDHs han sido purificadas, sus
genes no han sido clonados aún. Es útil clonar el gen de SLDH para
una producción eficiente de la enzima SLDH y para construir
organismos recombinantes que tengan una actividad SLDH
intensificada para mejorar el rendimiento productivo de
L-sorbosa. Es útil también introducir el llamado
gen SLDH dentro de organismos deseados, por ejemplo
Gluconobacter transformando L-sorbosa en
ácido 2-ceto-L gulónico para
construir microorganismos recombinantes los cuales producen
directamente el ácido 2-ceto-L
gulónico a partir del D-sorbitol.
La presente invención proporciona el código de
secuencia nucleótida (gen) para D-sorbitol
deshidrogenasa (SLDH) originando a partir de un microorganismo
perteneciente a las bacterias de ácido acético incluyendo el género
Gluconobacter y el género Acetobacter; una molécula de
ADN que comprende la secuencia nucleótida así como la llamada
combinación de dicho ADN con un ADN que comprende la secuencia
nucleótida de una proteína funcional activando in vivo la
llamada SLDH, vectores de expresión que portan el ADN que comprende
la secuencia nucleótida SLDH o dicha combinación de ADNs;
organismos recombinantes que portan los vectores de expresión; un
proceso para producir el SLDH recombinante; y un proceso para
producir L-sorbosa utilizando el SLDH recombinante
y una proteína la cual es funcional activando in vivo
SLDH.
Además la presente invención está dirigida a
secuencias de ADN que codifican los polipéptidos con actividad SLDH
y polipéptidos funcionales activando in vivo dicha SLDH, como
es divulgado por ejemplo en la lista de secuencia como SEQ ID NO:2
y NO:3 así como sus cadenas complementarias, o aquellas en las
cuales incluye estas secuencias, secuencias de ADN las cuales se
hibridan bajo condiciones rigurosas con tales secuencias.
Un hombre especializado en el arte está
familiarizado con la hibridación rigurosa y las condiciones
rigurosas de lavado, las cuales se describen, por ejemplo en
Sambrook y otros, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, New York, USA, second edition, 1989.
Seguidamente una breve descripción de los
dibujos se presenta.
La Figura 1 ilustra las secuencias parciales de
aminoácidos de polipéptidos SLDH y oligonucleótidos. Las secuencias
de aminoácidos en negritas en la figura fueron usadas para
sintetizar dos secuencias de oligonucleótidos (S7 y S6R) por PCR.
Las flechas muestran la dirección de síntesis de ADN. Todos los
cebadores fueron mezclas de ADN degenerado que tienen errores para
el codón de uso de Gluconobacter.
La Figura 2 ilustra un mapa de restricción del
gen SLDH clonado en la presente invención y la estructura génica de
la región de ADN que codifica para SLDH y ORF2.
La Figura 3 ilustra la secuencia nucleótida que
codifica para SLDH y ORF2 con secuencias aguas arriba y aguas abajo
e ilustra la secuencia de aminoácidos inferida de SLDH y ORF2. La
Figura 3 ilustra también los supuestos sitios de enlace ribosomal
(secuencias SD) de los genes SLDH y ORF2 y las posibles secuencias
terminales de la transcripción.
La Figura 4 ilustra los pasos para la
construcción de los plásmidos pTNB114, pTNB115, y pTNB116 para la
expresión de los genes de SLDH y/o ORF2 en E. coli bajo el
control del promotor lac.
La Figura 5 ilustra los pasos para la
construcción del plásmido pTNB110 el cual porta los genes de SLDH
y/o ORF2 bajo el control de un promotor común pA (descrito abajo en
el ejemplo 6) y pTNB143 el cual porta el gen de ORF2 bajo el
control de pA localizado contiguo al gen en la secuencia aguas
arriba y el gen SLDH bajo el control de otro promotor pA localizado
contiguo al gen SLDH en su secuencia aguas arriba.
Los inventores han aislado el gen de SLDH junto
con el gen funcional que desarrolla in vivo la actividad de
SLDH por técnicas de ADN recombinante y determinaron la secuencia
nucleótida.
La presente invención proporciona las secuencias
de ADN que codifican para SLDH de Gluconobacter y un gen
funcional que desarrolla in vivo actividad de SLDH después
indicada aquí como gen ORF2, los vectores de expresión conteniendo
dicho ADN para SLDH y las células huésped portando dichos vectores
de expresión.
Brevemente, el(los) gen(es) de
SLDH y/o ORF2, la molécula de ADN conteniendo dicho(s)
gen(es), el vector de expresión recombinante y el organismo
recombinante utilizado en la presente invención pueden obtenerse por
los siguientes pasos:
(1) Aislamiento del ADN cromosómico a partir de
los microorganismos los cuales pueden proporcionar actividad de
SLDH que transforma D-sorbitol en
L-sorbosa y construcción de la biblioteca genómica
con el ADN cromosómico en una célula huésped apropiada, por ejemplo
E. coli.
(2) Clonación del(de los) gen(es)
SLDH y/o ORF2 a partir del ADN cromosómico por hibridación de
colonias, placas, o Southern-blot, clonación por PCR
(Reacción en cadena de la polimerasa), análisis
Western-blot y similares.
(3) Determinación de la secuencia nucleótida del
(de los) gen(es) SLDH y/o ORF2 obtenidos anteriormente por
métodos convencionales para seleccionar la molécula de ADN
conteniendo dicho(s) gen(es) SLDH y/o ORF2 y
construcción del vector de expresión recombinante en el cual
el(los) gen(es) SLDH y/o ORF2 pueden expresarse
eficientemente.
(4) Construcción de organismos recombinantes que
portan el(los) gen(es) SLDH y/o ORF2 por un método
apropiado para introducir el ADN dentro de la célula huésped, por
ejemplo, transformación, transducción, transconjugación y/o
electroporación.
Los materiales y técnicas empleadas en el
aspecto anterior de la presente invención son ejemplificados en
detalle como sigue:
El ADN cromosómico total puede ser purificado
por un procedimiento bien conocido en el arte. El gen objetivo
puede ser clonado en cualquiera de los vectores plásmidos o fagos a
partir del ADN cromosómico total típicamente por cualquiera de los
siguientes métodos ilustrados:
(i) La secuencia parcial de aminoácidos es
determinada a partir de las proteínas purificadas o fragmentos de
péptidos de las mismas. Tal proteína entera o fragmentos de péptidos
pueden ser preparados por el aislamiento de tal proteína entera o
por tratamiento con peptidasas a partir del gel después de la
electroforesis en gel SDS-poliacrilamida. De este
modo la proteína obtenida o los fragmentos de ella son aplicados al
secuenciador de proteína como el Applied Biosystems secuenciador
automático de fase gaseosa 470A. La secuencia de aminoácidos puede
ser utilizada para diseñar y preparar sondas de oligonucleótidos y/o
cebadores con el sintetizador de ADN como el Applied Biosystems
secuenciador automático de ADN 381A. Dichas sondas pueden ser
empleadas para el aislamiento de clones que portan el gen objetivo
a partir de la biblioteca genómica de la cepa que porta el gen
objetivo con la ayuda de la hibridación de placas, colonias, o
Southern-blot.
(ii) Alternativamente, para el propósito de
selección de clones que expresan la proteína objetivo a partir de
la biblioteca genómica, métodos inmunológicos con anticuerpos
preparados contra la proteína objetivo pueden ser aplicados.
(iii) El fragmento de ADN del gen objetivo
puede ser amplificado a partir del ADN cromosómico por el método
PCR con un conjunto de cebadores, es decir dos oligonucleótidos
sintetizados de acuerdo con la secuencia de aminoácidos determinada
como anteriormente. Luego el clon que porta el gen objetivo entero
puede ser aislado a partir de la biblioteca genómica construida,
por ejemplo en E. coli por hibridación de placas, colonias,
o Southern-blot con el producto PCR obtenido
anteriormente como la sonda.
\newpage
(iv) El camino adicional alternativo a la
clonación es el tamizaje de clones complementando cepas deficientes
de SLDH construidas por mutación convencional con mutagénesis
química o por técnicas de ADN recombinante, por ejemplo con
transposon Tn5 para afectar el gen objetivo.
Secuencias de ADN las cuales pueden ser logradas
por la reacción en cadena de la polimerasa empleando cebadores
diseñados sobre la base de las secuencias de ADN divulgadas allí por
métodos conocidos en el arte también son un propósito de la
presente invención. Está implícito que la secuencia de ADN de la
presente invención también puede ser lograda sintéticamente como es
descrito, por ejemplo en EP 747 483.
El anticuerpo mencionado anteriormente puede ser
preparado con proteína SLDH purificada o sus fragmentos de péptidos
como antígeno por tal método descrito en Methods in Enzymology, vol.
73, p 46, 1981.
Una vez que el clon que porta el gen deseado es
obtenido, la secuencia nucleótida del gen objetivo puede ser
determinada por el método bien conocido tal como el método
terminador de cadena dideoxi con fago M13 (Sanger F. y otros, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467, 1977).
El gen deseado que expresa actividad de
D-sorbitol deshidrogenasa de la presente invención
es ilustrado en la Figura 2 y la Figura 3. Este gen específico
codifica la enzima SLDH que tiene 716 residuos de aminoácidos junto
con un péptido señal de 24 residuos de aminoácidos. Los inventores
encontraron un marco de lectura abierta justo en la secuencia aguas
arriba de la anterior estructura génica del SLDH y designada ésta
como ORF2. Este gen ORF2 codifica una proteína que tiene 126
residuos de aminoácidos y fue sugerido ser funcional en proporción
a la actividad enzimática deseada para el SLDH recombinante de la
presente invención, en particular cuando dicho SLDH es expresado en
células huésped de diferentes géneros a partir de bacterias de ácido
acético.
Para expresar el gen deseado/secuencia
nucleótida aislada a partir de bacterias de ácido acético incluyendo
el género Gluconobacter y el género Acetobacter
eficientemente, varios promotores pueden ser empleados; por
ejemplo, el promotor original del gen, promotores de genes de
resistencia a antibióticos tales como el gen resistente a la
kanamicina de Tn5 (D.E. Berg, and C.M. Berg. 1983. Bio/Technology
1:417-435), gen resistente a la ampicilina de
pBR322, y \beta-galactosidasa de E. coli
(lac), promotor trp-, tac-, trc-, promotores de fago lambda y
cualquiera de los promotores que puedan ser funcionales en el
organismo huésped. Para este propósito, el organismo huésped puede
ser seleccionado a partir de de microorganismos que incluyen
bacterias tales como Escherichia coli, Pseudomonas
putida, Acetobacter xylinum, Acetobacter
pateurianus, Acetobacter aceti, Acetobacter
hansenii, y Gluconobacter albidus, Gluconobacter
capsulatus, Gluconobacter cerinus, Gluconobacter
dioxyacetonicus, Gluconobacter gluconicus,
Gluconobacter industrius, Gluconobacter melanogenus,
Gluconobacter nonoxygluconicus, Gluconobacter oxydans,
por ejemplo, Gluconobacter oxydans DSM 4025, el cual ha
sido depositado como DSM 4025 en Marzo 17, 1987 bajo las
condiciones del Tratado de Budapest para Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellculturen GMBH, Braunschweig, BRD,
Gluconobacter oxydans subespecie sphaericus, Gluconobacter roseus,
Gluconobacter rubiginosus, Gluconobacter suboxydans, células
mamíferas y células vegetales.
Para la expresión, otros elementos reguladores,
tales como la secuencia Shine-Dalgarno (SD) (por
ejemplo, AGGAGG etc. incluyendo secuencias factibles naturales y
sintéticas en la célula huésped) y un terminador transcripcional
(estructura repetitiva invertida que incluye cualquier secuencia
factible natural y sintética en la célula huésped) los cuales son
factibles en la célula huésped dentro de la cual la secuencia que
codifican será introducida pueden ser empleados con los promotores
descritos anteriormente.
Para la expresión de polipéptidos unidos a la
membrana, similar a la proteína SLDH de la presente invención, un
péptido señal, conteniendo usualmente de 15 a 50 residuos de
aminoácidos y totalmente hidrofóbico, es de preferencia asociado.
Un ADN que codifica un péptido señal puede ser seleccionado a partir
de cualquier secuencia factible natural y sintética en la célula
huésped deseada.
Una amplia variedad de combinaciones
huésped/vectores de clonación pueden ser usadas en la clonación de
la doble cadena de ADN. El vector de clonación es generalmente un
plásmido o fago que contiene el origen de replicación, elementos
reguladores, un sitio de clonación incluyendo un sitio de
multi-clonación y marcadores selectivos tales como
genes de resistencia a antibióticos incluyendo genes de resistencia
para ampicilina, tetraciclina, kanamicina, estreptomicina,
gentamicina, espectinomicina, etc.
De preferencia el vector para la expresión del
gen de la presente invención en E. coli es seleccionado a
partir de algunos vectores empleados en E. coli, tales como
pBR322 o sus derivados incluyendo pUC18 y pBluescript II
(Stratagene Cloning Systems, CA, USA), pACYC177 y pACYC184 (J.
Bacteriol., 134:1141-1156, 1978) y sus derivados, y
un vector derivado a partir una amplia gama de plásmidos huéspedes
tales como RK2 (C.M. Thomas, Plasmid 5: 10, 1981) y RSF1010 (P.
Guerry y otros, J. Bacteriol. 117: 619-630, 1974).
El vector preferido para la expresión de la secuencia nucleótida de
la presente invención en bacterias incluyendo Gluconobacter,
Acetobacter y P. putida es seleccionado a partir de
algunos vectores los cuales pueden replicarse en
Gluconobacter, Acetobacter y/o P. putida, así
como en el organismo de clonación preferido tal como E.
coli. El vector preferido es un vector de amplia gama huésped
como el vector cósmido similar a pVK100 (V.C. Knauf y otros,
Plasmid. 8: 45-54, 1982) y sus derivados y RSF1010.
El número de copias y la estabilidad del vector deberían ser
cuidadosamente considerados para una estable y eficiente expresión
del gen clonado y también para un eficiente cultivo de la célula
huésped que porta el gen clonado. Moléculas de ADN conteniendo
elementos transponibles tales como el Tn5 que también pueden ser
empleadas como vector para introducir el gen deseado dentro del
huésped preferido, especialmente en un cromosoma. Moléculas de ADN
conteniendo algunos ADNs aislados a partir del huésped preferido
junto con el gen de la presente invención también es útil para
introducir este gen dentro del huésped preferido aplicando alguno de
los métodos convencionales, por ejemplo, transformación,
transducción, transconjugación o electroporación, los cuales son
bien conocidos para aquellos especializados en el arte,
considerando la naturaleza del huésped y la molécula de ADN.
Huéspedes útiles pueden incluir microorganismos,
células de mamíferos, células vegetales y similares. Dentro de los
microorganismos preferidos, aquí pueden ser mencionadas las
bacterias tales como E. coli, P. putida, A.
xylinum, A. pateurianus, A. aceti, A.
hansenii, Gluconobacter albidus, Gluconobacter
capsulatus, Gluconobacter cerinus, Gluconobacter
dioxyacetonicus, Gluconobacter gluconicus,
Gluconobacter industrius, Gluconobacter melanogenus,
Gluconobacter nonoxygluconicus, Gluconobacter oxydans
y Gluconobacter oxydans subespecie sphaericus,
Gluconobacter roseus, Gluconobacter rubiginosus, Gluconobacter
suboxydans y algunas bacterias capaces de expresar SLDH
recombinante y/o gen(es) ORF2. Equivalentes funcionales,
subcultivos, mutantes y variantes de dichos microorganismos también
pueden ser empleados en la presente invención. La cepa preferida es
la E. coli K12 o sus derivadas, P. putida,
Gluconobacter o cepas Acetobacter.
Los genes y secuencias nucleótidas de SLDH y/o
ORF2 proporcionados en esta invención están ligados dentro de un
vector adecuado conteniendo regiones reguladoras tales como un
promotor, un sitio de enlace ribosomal y un terminador
transcripcional factible en las células huéspedes descritas
anteriormente con métodos bien conocidos en el arte para producir
un vector de expresión. Cuando los genes de SLDH y ORF2 son clonados
en combinación, cualquiera de los dos genes puede ser clonado en
serie o separadamente en el mismo plásmido también en el ADN
cromosómico. Las Figuras 4 y 5 ejemplifican la forma de la clonación
combinada de los genes SLDH y ORF2 en el plásmido. También se puede
clonar un gen en el plásmido y el otro en el ADN cromosómico.
Para construir un microorganismo recombinante
que porte un vector de expresión recombinante, varios métodos de
transferencia de genes incluyendo transformación, transducción,
apareamiento conyugal (Capítulos 14 y 15, Methods for general and
molecular bacteriology, Philipp Gerhardt et al. ed., American
Society for Microbiology, 1994) y electroporación pueden ser
empleados. Los métodos para construir el organismo recombinante
pueden ser seleccionados a partir de métodos bien conocidos en el
campo de la biología molecular. Sistemas de transformación usuales
pueden ser empleados para E. coli. Pseudomonas,
Gluconobacter y Acetobacter. El sistema de
transducción puede ser empleado para E. coli. El sistema de
apareamiento conyugal puede ser ampliamente empleado en bacterias
Gram positivas y Gram negativas incluyendo E. coli. P.
putida, y Gluconobacter. El apareamiento conyugal
preferido es divulgado en WO89/06688. La conjugación puede ocurrir
en medio líquido o en una superficie sólida. El receptor preferido
para la producción de SLDH y/o ORF2 se selecciona a partir de E.
coli. P. putida, Gluconobacter y
Acetobacter. Al receptor para el apareamiento conyugal, un
marcador selectivo es usualmente adicionado; por ejemplo, la
resistencia contra el ácido nalidíxico o la rifampicina es
usualmente seleccionada. La resistencia natural también puede ser
empleada; por ejemplo resistencia contra polimixina B es útil para
muchas Gluconobacters.
La presente invención proporciona un proceso
para producir SLDH recombinante. Se puede aumentar el rendimiento
productivo de la enzima SLDH introduciendo el gen de SLDH
proporcionado en la presente invención dentro de organismos
incluyendo bacterias de ácido acético del género
Gluconobacter y el género Acetobacter. También se
puede producir SLDH activa en microorganismos además de
Gluconobacter empleando el gen de la SLDH de la presente
invención en combinación con el gen de ORF2 de la presente
invención. El recombinante de SLDH puede ser inmovilizado en un
portador sólido para una reacción enzimática en fase sólida. La
presente invención también proporciona organismos recombinantes. Se
puede producir L-sorbosa a partir de
D-sorbitol con los organismos recombinantes.
También se puede producir L-sorbosa a partir de
D-sorbitol incluso en un organismo huésped además
de las bacterias de ácido acético introduciendo el gen SLDH en
combinación con el gen ORF2 de la presente invención.
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Ejemplo
1
Secuencias parciales de aminoácidos de los
péptidos No.1, 3 y 8 preparadas a partir de la proteína SLDH fueron
determinadas (Fig. 1; SEQ ID NO:4 a 6).SLDH purificada de G.
suboxydans IFO 3255 (T. Hoshino y otros, EP
728840)fue digerida con lisilendopeptidasa; la mezcla de
reacción (25 ml) contenía 1.2 mM de lisilendopeptidasa y 3 nmol de
la proteína SLDH en buffer Tris-HCl 100 mM, pH 9.0,
y la reacción fue llevada a cabo a 37ºC durante 15 horas. Los
fragmentos de péptido resultantes fueron separados por HPLC
(columna: protein C-4, VYDAC, California, USA) con
gradiente de acetonitrilo/isopropanol en TFA 0.1% a un velocidad de
flujo de 1.0 ml/min. La elusión de los péptidos fue monitoreada por
absorbancia UV a 214 nm, y las fracciones de los picos fueron
colectadas manualmente y sometidas a análisis de secuencia de
aminoácidos N- terminal con un secuenciador de aminoácidos (Applied
Biosystems model 470A, The Perkin Elmer Corp., Conn., USA).
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Ejemplo
2
La PCR fue conducida con el ADN cromosómico de
G. suboxydans IFO 3255 y cebadores de oligonucleótidos de
ADN degenerados, s7 y s6R cuyas secuencias son mostradas en la Fig.
1. La amplificación por PCR fue llevada a cabo con Amplitaq
polimerasa termoestable (Perkin-Elmer, Roche
Molecular Systems Inc., NJ, USA), empleando un termociclador
(ZYMOREACTOR II AB-1820, ATTO, Tokio, Japan).
Seguidamente la mezcla de reacción (50 \mul) fue empleada para
PCR: 200 \muM de dNTPs, 10-20 pmol de cada cebador
(degeneración 54-288), 6 ng de ADN cromosómico de
G. suboxydans IFO 3255 y 0.5 unidades de ADN polimerasa en el
buffer proporcionado por el proveedor. La reacción constó de 30
ciclos de 1) paso de desnaturalización a 94ºC durante 1 minuto; 2)
paso de templado a 48ºC durante 1 minuto; 3) paso de síntesis a 72ºC
durante 2 minutos. Por consiguiente un ADN de 1.6 kb fue
amplificado y clonado en un vector de E. coli, pUC57/T (MBI
Fermentas, Vilnius, Lithuania), el cual tiene un extremo terminal
3'-ddT para ligamento directo de un fragmento de ADN
amplificado y obtener el plásmido recombinante pMT20. El ADN
clonado fue sometido a la secuenciación de nucleótidos por el método
de terminador de cadena dideoxi (F. Sanger y otros, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 74:5463-5467, 1977); el fragmento
de 1.6 kb que codifica los péptidos No.3 y No.8.
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Ejemplo
3
El ADN cromosómico de G. suboxydans IFO
3255 fue preparado a partir de células cultivadas en placas de agar
MB durante 2 días. El ADN cromosómico (160 \mug) fue parcialmente
digerido con 20 unidades de Eco RI en 500 \mul de mezcla
de reacción. Porciones de muestras fueron retiradas a los 5, 10, 15,
30 y 60 minutos y el grado de digestión fue detectado por
electroforesis en gel de agarosa. Las primeras cuatro porciones que
contenían fragmentos de ADN parcialmente digeridos fueron combinadas
y sometidas a una electroforesis en gel preparativo (agarosa:
0.6%). Fragmentos de 15-35 kb fueron recortados y
electroeluídos a partir del gel. El eluato fue filtrado y
precipitado con acetato de sodio y etanol a -80ºC. Los fragmentos de
ADN fueron colectados por centrifugación y suspendidos en 200
\mul de buffer Tris-HCl 10 mM, pH 8.0, conteniendo
EDTA 1 mM.
En paralelo, 1.8 \mug de vector cósmido pVK100
fue completamente digerido con Eco RI y tratado con fosfatasa
alcalina de intestino de ternero. El pVK100 linealizado y
defosforilado fue ligado con fragmentos Eco RI de
15-35 kb del ADN cromosómico de de G.
suboxydans IFO 3255 (5 \mug) con el kit de ligamento (Takara
Shuzo, Kyoto, Japan) en 20 tubos separados bajo las condiciones
recomendadas por el proveedor para la obtención del ADN altamente
polimerizado. El ADN ligado fue entonces empleado para el
empaquetamiento in vitro de acuerdo con el método descrito
por el proveedor (Amersham Japan). Las partículas de fago
resultantes fueron empleadas para infectar E. coli ED8767,
el huésped para la biblioteca genómica. Por consiguiente, 4,271
colonias fueron obtenidas y de todas las colonias probadas (20
colonias) poseían los insertos de ADNs con la talla promedio de
aproximadamente
25 kb.
25 kb.
La biblioteca de cósmidos descrita anteriormente
fue tamizada para aislar el clon portando el gen SLDH completo por
el método de hibridación de colonias con ADN de pMT20 de 1.6 kb
marcados con P^{32}. Un clon fue aislado y designado como pSLII,
el cual porta un inserto de aproximadamente 25 kb en el vector
pVK100. A partir de pSLII, el fragmento Pst I de 6.2 kb fue
aislado y clonado dentro de pUC18 para obtener el plásmido pUSLIIP.
El fragmento Pst I de 6.2 kb conteniendo los genes SLDH y
ORF2 fue aislado a partir de pUSLIIP y subclonado dentro del vector
pCRII (Invitrogen Corporation, CA, USA) para producir pCRSLIIP. A
partir del plásmido resultante, el fragmento de ADN conteniendo el
fragmento Pst I de 6.2 kb fue aislado como fragmento
Hind III-Xho I y clonado entre los sitios Hind
III y Xho I de pVK100 para obtener pVKSLIIP.
Para confirmar si el fragmento Pst I de
6.2 kb codifica el SLDH objetivo, células de E. coli JM109
portando pUSLIIP fueron sometidas a análisis por
Western-blot con anticuerpos
anti-SLDH como descrito anteriormente. Proteínas
inmuno-positivas con peso molecular de
aproximadamente 80 kDa fueron observadas en el transformante,
indicando que el fragmento Pst I codifica los polipéptidos
con el peso molecular del SLDH intacto (79 kDa +/- 0.5 kDa).
La mutagénesis del transposon Tn5 fue realizada
con G. melanogenus IFO 3293 como la madre. Tn5, un elemento
transponible y codifica para Kmr, causa mutaciones nulas al azar en
el ADN de su organismo huésped y ampliamente empleado como mutágeno
en bacterias Gram-negativas. La IFO 3293 fue
seleccionada como madre por las razones siguientes: (i) produjo
L-sorbosa a partir de D-sorbitol,
(ii) mostró polipéptidos inmuno-positivos con peso
molecular de aproximadamente 80 kDa en análisis por
Western-blot con los anticuerpos preparados contra
SLDH purificada a partir de G. suboxydans IFO 3255 y (iii)
su frecuencia para generar mutantes Tn5 fue mucho mayor que la de
G. suboxydans IFO 3255.
G. melanogenus IFO 3293 fue cultivada en
tubos de prueba conteniendo 5 ml de medio MB, conteniendo 25 g/l
de manitol, 5 g/l de extracto de levadura (Difco Laboratorios), 3
g/l de Bactopeptona (Difco) a 30ºC toda la noche. E. coli
HB101 (pRK2013) [D.H. Figurski, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 76:
1648-1652, 1979] y E. coli HB101 (pSUP2021)
[R. Simon, y otros, BIO/TECHNOL. 1: 784-791, 1983]
fueron cultivadas en tubos de prueba conteniendo 5 ml de medio LB
con 50 \mug/ml de kanamicina a 37ºC toda la noche. Las células
fueron colectadas separadamente por centrifugación y suspendidas en
la mitad del volumen del medio MB. Cada suspensión celular fue
mezclada en la proporción 1:1:1 y la mezcla fue colocada en filtro
de nitrocelulosa sobre la superficie de la placa de agar MB. Las
placas fueron incubadas a 27ºC toda la noche y las células
resultantes en el filtro fueron raspadas, suspendidas en un volumen
adecuado de medio MB y extendidas en la placa elegida (placa MPK),
MB conteniendo 10 \mug/ml de polimixina B y 50 \mug/ml de
kanamicina. La placa MPK fue incubada a 27ºC de 3 a 4 días.
Los 3,436 mutantes Tn5 resultantes fueron
sometidos al tamizaje por inmuno-dot blot con el
anticuerpo anti-SLDH. Las células de cada cepa
fueron suspendidas independientemente en 50 \mul de buffer Laemmli
compuesto de Tris-HCl 62.5 mM (pH6.5), glicerol
10%, SDS 2% y \beta- mercaptoetanol 5% en placas de
microtitulación de 96- pocillos e incubada a 60ºC durante 2 horas.
Los Extractos Libres de Células (CFEs) fueron estampados en filtros
de nitrocelulosa y las muestras inmuno-positivas en
los CFEs fueron tamizadas con el kit de sustrato conjugado AP
(Bio-RAD Laboratorios, Richmond, Calif., USA). Como
resultado, solo una cepa 26A11 sin señal positiva en el tamizaje
por inmuno-dot blot fue obtenida.
La deficiencia de SLDH en la cepa 26A11 fue
confirmada por análisis de Western-blot; este
expresó al menos la cantidad de 1/500 de SLDH comparado con su cepa
madre. 26A11 no fue una cepa deficiente del SLDH completo, sino la
cepa con el gen SLDH reprimido por la inserción de Tn5; el sitio de
inserción fue encontrado siendo próximo del C- terminal por
determinación de la secuencia nucleótida alrededor del punto de
inserción Tn5. A continuación, la reacción celular restante fue
conducida para examinar la actividad SLDH total en 26A11 y de las
cepas Gluconobacter salvajes. En el buffer fosfato de potasio
100 mM (pH7.0) conteniendo D-sorbitol 2%, 26A11
convirtió ligeramente D-sorbitol a
L-sorbosa, mientras las cepas salvajes IFO 3293 y
IFO 3255 lo hicieron completamente en 39.5 horas a 30ºC.
Para confirmar la actividad SLDH de los clones
SLDH obtenidos, la prueba de complementación fue conducida. Los
plásmidos pSLII y pVKSLIIP fueron introducidos dentro de 26A11 por
el apareamiento conyugal. El transconjugante portando pSLII o
pVKSLIIP regeneró la actividad SLDH en la reacción celular
mini-restante y mostró polipéptidos
inmuno-reactivos de aproximadamente 80 kDa en el
análisis por Western-blot.
El plásmido pUSLIIP fue empleado para la
secuenciación de nucleótidos de los genes de SLDH y ORF2. La
secuencia nucleótida determinada (SEQ ID NO: 1; 3,481 pb) reveló
que el ORF del gen SLDH (2,223 pb, nucleótido No.572 a 2794 en SEQ
ID NO: 1) que codifica el polipéptido de 740 residuos de aminoácidos
(SEQ ID NO: 2), en la cual estuvieron tres secuencias de
aminoácidos (Péptidos No.1, 3 y 8 mostrados en SEQ ID NO: 4 al 6)
determinadas a partir del polipéptido SLDH purificado.
Adicionalmente al ORF SLDH, uno más ORF, ORF2, fue encontrado justo
aguas arriba del ORF SLDH como es ilustrado en las Figuras 2 y 3. El
ORF y ORF2 (381 pb, nucleótido No.192 a 572 en SEQ ID NO: 1)
codifican el polipéptido de 126 residuos de aminoácidos (SEQ ID NO:
3).
La 4^{ta} secuencia de aminoácidos del
polipéptido No.1 fue determinada como Glu por el secuenciador de
aminoácidos, pero esta fue Ala de acuerdo con la secuencia de ADN.
La 11^{na} secuencia de aminoácidos del polipéptido No.3 fue
determinada como Gln por el secuenciador de aminoácidos, pero esta
fue Pro de acuerdo con la secuencia de ADN. La región similar al
péptido señal (SEQ ID NO: 8) está posiblemente incluida en la
secuencia de aminoácidos deducida: esta contiene (i) muchos residuos
hidrofóbicos, (ii) residuos positivamente cargados cerca del
N-terminal, y (iii) el sitio
Ala-Xaa-Ala como una señal clave. La
verdadera secuencia señal fue determinada como es descrito en el
ejemplo 3 (7). El supuesto sitio del enlace ribosomal
(Shine-Dalgarno, SD, secuencia) para el gen SLDH
fue localizado a 8 pb aguas arriba del codón de iniciación (AGAGGAG
en nucleótido No.558-564 de Seq ID NO: 1). La
supuesta secuencia SD para el gen ORF2 fue localizada a 10 pb aguas
arriba del codón de iniciación (GGGAGG en el nucleótido
No.177-182 de Seq ID NO: 1). Estuvieron algunas
secuencias repetitivas invertidas inmediatamente aguas abajo de la
estructura génica de SLDH (secuencia nucleótida del
No.2803-2833 y del No.2838-2892)
como es ilustrado en la Figura 3; las mismas funcionan como lazos
terminadores de la transcripción para el gen SLDH. Para el gen
ORF2, la secuencia repetitiva invertida fue encontrada en el
No.684-704.
Búsquedas homólogas para SLDH y ORF2 fueron
realizadas con los programas mpBlast (NCBI, Bethesda, Md. USA) y
Motifs in GCG (Genetics Computer Group, University Research Park,
Md. USA). El polipéptido SLDH tuvo una secuencia comúnmente
conservada en quinoproteína en la región cerca del
C-terminal (dentro de los residuos de aminoácidos
No.632 al 692 de la SEQ ID No.2) y otra secuencia identificada como
una quinoproteína motivo (Prosite No. PS00363:
[DN]W.{3}G[RK].{6}[FY]S.{4}[LIVM]N.{2}NV.{2}L[RK];
residuo de aminoácido No.79 al 107 de la SEQ ID No.2).
ORF2 mostró homología con la región
N-terminal de la D-glucosa
deshidrogenasa (GDH) dependiente del PQQ unida a la membrana de
G. oxydans, E. coli, A. calcoaceticus, la cual
es conocida como una región extendida de membrana para la unión del
GDH a la membrana. Las identidades de ORF2 para la región N-
terminal de las GDHs de G. oxydans, E. coli, A.
calcoaceticus fueron 30%, 32%, y 37%, respectivamente. La
proteína ORF2 funciona como una proteína áncora para lograr unión
tipo del SLDH a la membrana.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
La secuenciación directa del
N-terminal no dio resultado, indicando que el
N-terminal está bloqueado. Luego, el polipéptido
SLDH fue tratado con la endoproteinasa Lys-C (Wako,
Osaka Japan) en Tris-HCl 0.1 M a 37ºC por 20 horas
con una proporción sustrato para enzima de 20:1 (p/p). El total
digerido fue analizado por HPLC fase reversa (RP300, 1 mm x 25 cm,
Applied Biosystems, Foster City, CA) y cada pico fue sometido a
espectrometría de masa (instrumento de triple cuádruplo TSQ700,
Finningan-MAT, San Jose, California) para determinar
el peso molecular. Uno de los digeridos descrito como SEQ ID No.7
fue asignado como la secuencia N-terminal por
análisis de espectrometría de masa y análisis de la composición de
aminoácidos junto con la composición de aminoácidos pronosticada a
partir de la secuencia nucleótida determinada que se muestra como
SEQ ID NO:1. Análisis adicional con la disociación inducida
colisional (CID) fue llevado a cabo para confirmar la identidad del
péptido con secuencia N-terminal. El
N-terminal fue determinado siendo un residuo
piroglutamil.
Desde que el N-terminal de SLDH
fue determinado siendo
Gln-Phe-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Glu-Pro-Ser-Ser-Ser-Val-Pro-Gly-Pro-Gly-Asn-Ala-Ser-Glu-Pro-Thr-Glu-Asn-Ser-Pro-Lys
como se muestra en SEQ ID NO.7, la secuencia señal fue confirmada
siendo largos residuos de 24 aminoácidos con la secuencia de
Met-Arg-Arg-Pro-Tyr-Leu-Leu-Ala-Thr-Ala-Ala-Gly-Leu-Ala-Leu-Ala-Cys-Ser-Pro-Leu-Ile-Ala-His-Ala
listada como SEQ ID NO:8. La secuencia C-terminal
también fue determinada empleando los péptidos recuperados a partir
de la digestión con proteasa V8 siendo
Pro-Asp-Ala-Ile-Lys-Gln
(SEQ ID NO:9).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
A partir del pCRSLIIP descrito en el ejemplo 3
(2), los plásmidos que portan el gen SLDH con y sin el gen ORF2
bajo el control del promotor lac fueron construidos como es
ilustrado en la Figura 4. Los tres plásmidos resultantes son
pTNB114 portando los genes de SLDH y ORF2, pTNB115 portando el gen
SLDH y el gen ORF2 truncadosen su N-terminal
conteniendo el sitio de enlace ribosomal y el codón de iniciación
(ATG) y pTNB116 portando el gen ORF2 truncado en su mayoría y el
gen SLDH intacto. Estos tres plásmidos fueron introducidos dentro de
E. coli por transformación convencional. La producción del
polipéptido SLDH fue detectada por análisis
Western-blot con extractos libres de células de los
transformantes resultantes y la actividad de SLDH fue ensayada con
las células restantes. La reacción celular restante fue llevada a
cabo en la mezcla de reacción compuesta de NaCl 0.3%, CaCO_{3}
1%, D-sorbitol 4% y PMS 1 mM con y sin 1 \mug/ml
de PQQ a temperatura ambiente por 17 horas. La actividad de SLDH
para producir L-sorbosa fue analizada por ensayo TLC
con gel de sílice 60 F_{254}, 0.25 mm, Merk con el solvente
revelador compuesto de
n-propanol-H_{2}O-H_{3}PO_{4}-HCOOH
1% (400:100:10:1) y reactivo en aerosol de naftoresorcinol. Por
consiguiente, el polipéptido SLDH fue detectado en todos los
transformantes, incluso sin expresión génica de ORF2, en análisis
por Western-blot, pero la actividad de SLDH para
producir L-sorbosa fue detectada solo en el
transformante portando pTNB114 conteniendo el gen ORF2 intacto bajo
condiciones de reacción celular restante en presencia de PQQ.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
La Figura 5 ilustra los pasos para la
construcción de pTNB110 y pTNB143. El plásmido pTNB110 portando los
genes ORF2 y SLDH bajo el control del promotor del gen de la enzima
A (pA) de DSM4025 (T. Hoshino y otros, European Patent Application
No.9611500.8) fue construido por la inserción del fragmento
Hind III-Kpn I conteniendo pA, fragmentos Kpn
I-Xho I a partir de pTNB114 entre los fragmentos de
Hind III-Xho I de pUC18. El plásmido pTNB143 portando
los genes ORF2 y SLDH como unidades de expresión independiente, gen
ORF2 con pA y gen SLDH con pA, fue construido por inserción del
fragmento Sal I de 0.9 kb a partir de pTNB141 y el fragmento
Hind III-Xho I de 3.2 kb a partir de pTNB135 dentro
del vector híbrido pUC57/pCRII (fragmento Sca I-Hind
III con plac a partir de pUC57 y el fragmento Xho I a
Sca I sin plac a partir de pCRII) como se muestra en la
Figura 5. Los plásmidos, pTNB110 y pTNB143, fueron introducidos
dentro de E. coli por transformación convencional. Los
transformantes resultantes fueron sometidos a análisis por
Western-blot y a la reacción celular restante como
descrito en el ejemplo 5. Por consiguiente, ambos transformantes
portando pTNB110 y pTNB143 produjeron proteína SLDH y mostraron
actividad SLDH para producir L-sorbosa a partir de
D-sorbitol en presencia de PQQ.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
El plásmido pTNB136 para la expresión del gen
SLDH en G. oxydans DSM 4025 tiene intensas actividades
L-sorbosa y L-sorbosona
deshidrogenasa junto con débil actividad D-sorbitol
deshidrogenasa para producir L-sorbosa, fue
construido por la inserción del fragmento Hind III-Xho
I a partir de pTNB135 (Figura 5) entre los sitios de Hind
III y Xho I de pVK100. El plásmido pTNB136 y su vector pVK100
fueron introducidos por apareamiento conyugal dentro de la cepa
GOB\DeltaK, la cual es un mutante de G. oxydans DSM 4025
cuyo gen de la enzima B (EP 832 974) tiene
D-sorbitol deshidrogenasa para producir
L-sorbosa es eliminado por sustitución de dos
fragmentos Eco RI conteniendo gen de la Enzima B con el
casete génico de resistencia a kanamicina (fragmento Eco RI
1.28 kb de pUC4K; Pharmacia Uppsala, Sweden). La afectación génica
fue conducida por técnicas de ADN recombinante bien conocidas en el
arte. El transconjugante resultante, GOB\DeltaK portando pTNB136
o pVK100, produjo 5 g/L o por debajo de 2 g/l de 2KGA en
D-sorbitol 10%, respectivamente, por fermentación
en frasco conducida a 30ºC durante 4 días (medio:
D-sorbitol 10%, urea 1.6%, glicerol 0.05%,
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O 0.25%, licor de maíz en remojo 3%,
células húmedas de levadura panadera 6.25% y CaCO_{3} 1.5%).
Análisis por Western-blot con anticuerpos
anti-SLDH revelaron que los transconjugantes
portando pTNB136 expresaron los polipéptidos SLDH
inmuno-reactivos.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE
\vskip0.800000\baselineskip
- NOMBRE: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG
\vskip0.800000\baselineskip
- CALLE: Grezacherstrasse 124
\vskip0.800000\baselineskip
- CIUDAD: Basle
\vskip0.800000\baselineskip
- PAÍS: Suiza
\vskip0.800000\baselineskip
- CÓDIGO POSTAL: CH-4002
\vskip0.800000\baselineskip
- TELÉFONO: 061-688 25 11
\vskip0.800000\baselineskip
- FAX: 061-688 13 95
\vskip0.800000\baselineskip
- TELEX: 962292/965542 hlr c
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- Gen de la D-Sorbitol deshidrogenasa
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 9
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: Macintosh
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: MS word ver 5.1a
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DATOS DE LA APLICACIÓN EN CURSO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE LA APLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- DATOS CLASIFICADOS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3481 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MÓLECULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- ORGANISMO: Gluconobacter suboxydans
\vskip0.800000\baselineskip
- CEPA: IFO 3255
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- RASGOS:
\vskip0.800000\baselineskip
- RASGOS CLAVES: CDS
\vskip0.800000\baselineskip
- POSICIÓN: 192..572
\vskip0.800000\baselineskip
- MÉTODO DE SECUENCIACIÓN: E
\vskip0.800000\baselineskip
- RASGOS CLAVES: CDS
\vskip0.800000\baselineskip
- POSICIÓN: 572..2794
\vskip0.800000\baselineskip
- MÉTODO DE SECUENCIACIÓN: E
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 740 residuos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal (ii)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MÓLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- ORGANISMO: Gluconobacter suboxydans
\vskip0.800000\baselineskip
- CEPA: IFO 3255
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- RASGOS:
\vskip0.800000\baselineskip
- RASGOS CLAVES: péptido sig
\vskip0.800000\baselineskip
- POSICIÓN: -24..-1
\vskip0.800000\baselineskip
- MÉTODO DE SECUENCIACIÓN: E
\vskip0.800000\baselineskip
- RASGOS CLAVES: péptido mat
\vskip0.800000\baselineskip
- POSICIÓN: 1..716
\vskip0.800000\baselineskip
- MÉTODO DE SECUENCIACIÓN: E
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 126 residuos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal (ii)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MÓLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- TIPO DE FRAGMENTO: fragmento interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- ORGANISMO: Gluconobacter suboxydans
\vskip0.800000\baselineskip
- CEPA: IFO 3255
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- RASGOS:
\vskip0.800000\baselineskip
- RASGOS CLAVES: péptido mat
\vskip0.800000\baselineskip
- POSICIÓN: 1..126
\vskip0.800000\baselineskip
- MÉTODO DE SECUENCIACIÓN: E
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 residuos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MÓLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- TIPO DE FRAGMENTO: fragmento interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- ORGANISMO: Gluconobacter suboxydans
\vskip0.800000\baselineskip
- CEPA: IFO 3255
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- RASGOS:
\vskip0.800000\baselineskip
- MÉTODO DE SECUENCIACIÓN: E
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 residuos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MÓLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- TIPO DE FRAGMENTO: fragmento interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- ORGANISMO: Gluconobacter suboxydans
\vskip0.800000\baselineskip
- CEPA: IFO 3255
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- RASGOS:
\vskip0.800000\baselineskip
- MÉTODO DE SECUENCIACIÓN: E
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 residuos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MÓLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- TIPO DE FRAGMENTO: fragmento interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- ORGANISMO: Gluconobacter suboxydans
\vskip0.800000\baselineskip
- CEPA: IFO 3255
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- RASGOS:
\vskip0.800000\baselineskip
- MÉTODO DE SECUENCIACIÓN: E
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 residuos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MÓLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- TIPO DE FRAGMENTO: fragmento N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- ORGANISMO: Gluconobacter suboxydans
\vskip0.800000\baselineskip
- CEPA: IFO 3255
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- RASGOS:
\vskip0.800000\baselineskip
- MÉTODO DE SECUENCIACIÓN: E
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 residuos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MÓLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- ORGANISMO: Gluconobacter suboxydans
\vskip0.800000\baselineskip
- CEPA: IFO 3255
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- RASGOS:
\vskip0.800000\baselineskip
- RASGOS CLAVES: péptido sig
\vskip0.800000\baselineskip
- POSICIÓN: 1..24
\vskip0.800000\baselineskip
- MÉTODO DE SECUENCIACIÓN: E
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 residuos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MÓLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- TIPO DE FRAGMENTO: fragmento C-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- ORGANISMO: Gluconobacter suboxydans
\vskip0.800000\baselineskip
- CEPA: IFO 3255
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- RASGOS:
\vskip0.800000\baselineskip
- MÉTODO DE SECUENCIACIÓN: E
Claims (8)
1. ADN que codifica una proteína que tiene
actividad D-sorbitol deshidrogenasa cuando es
clonado dentro de una bacteria de ácido acético, hibridable bajo
condiciones rigurosas, con un ADN de acuerdo con la SEQ ID NO:1.
2. ADN que codifica una proteína funcional
activando in vivo D-sorbitol deshidrogenasa,
hibridable bajo condiciones rigurosas, con un ADN de acuerdo con la
SEQ ID NO:1.
3. Un vector de expresión comprendiendo un ADN
de acuerdo con las reivindicaciones 1 y/o 2.
4. Célula huésped transformada con un ADN de
acuerdo con las reivindicaciones 1 y/o 2 o un vector de acuerdo a
la reivindicación 3.
5. Célula huésped de acuerdo con la
reivindicación 4 seleccionada a partir de un grupo compuesto por
bacterias de ácido acético incluyendo el género Gluconobacter
y el género Acetobacter.
6. Un proceso para producir
D-sorbitol deshidrogenasa recombinante que comprende
los pasos de cultivar la célula huésped que comprende el ADN de
acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2 en un medio apropiado, y
recobrar una proteína con actividad de D-sorbitol
deshidrogenasa a partir del cultivo.
7. Un proceso el cual comprende la conversión de
D-sorbitol en L-sorbosa con la ayuda
de una proteína codificada por un ADN de acuerdo con las
reivindicaciones 1 y 2 o con la célula huésped comprendiendo un ADN
de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2.
8. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 7
en el que dicha L-sorbosa es además convertida en
2-KGA y/o vitamina C.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP97114432 | 1997-08-21 | ||
| EP97114432 | 1997-08-21 | ||
| EP98115231A EP0897984B1 (en) | 1997-08-21 | 1998-08-13 | D-Sorbitol dehydrogenase gene |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2304792T3 true ES2304792T3 (es) | 2008-10-16 |
Family
ID=26145734
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES98115231T Expired - Lifetime ES2304792T3 (es) | 1997-08-21 | 1998-08-13 | Gen d-sorbitol dehidrogenasa. |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0897984B1 (es) |
| ES (1) | ES2304792T3 (es) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000055329A1 (en) * | 1999-03-17 | 2000-09-21 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Sorbitol dehydrogenase, gene encoding the same and use thereof |
| US6204040B1 (en) | 1999-04-22 | 2001-03-20 | Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology | Gluconobacter suboxydans sorbitol dehydrogenase, genes and methods of use thereof |
| DE19963126A1 (de) | 1999-12-24 | 2001-07-12 | Suedzucker Ag | Verfahren zur Herstellung von 6-O-alpha-D-Glucopyranosyl-D-sorbit |
-
1998
- 1998-08-13 ES ES98115231T patent/ES2304792T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-13 EP EP98115231A patent/EP0897984B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0897984A2 (en) | 1999-02-24 |
| EP0897984A3 (en) | 2002-07-10 |
| EP0897984B1 (en) | 2008-04-23 |
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