MXPA98002646A - Citocromo c y su gen - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una secuencia de ADN que comprende una secuencia ADN que codifica tras la expresión en una célula hospedadora procariota o eucariota, polipéptidos que poseen al menos una parte de la estructura primaria y una de la propiedades biológicas del citocromo c551, a un polipéptido codificado por dicha secuencia de ADN, a un vector de expresión que incluye dicha secuencia ADN, a una célula hospedadora transformada por dicho vector, a un proceso para la producción empleando dicha célula hospedadora y al uso de dicho citocromo c para la producción de vitamina C.

Description

CITOCROMO C Y SU GEN Cam o de la Invención La invención se refiere a un nuevo citocromo c y a un procedimiento para su preparación.

Antecedentes de la Invención Es conocido que el citocromo c es uno de los componentes esenciales que median en la transferencia de electrones entre las deshidrogenasas primarias y la oxidasa terminal para que pueda tener lugar la oxidación del substrato con la reducción del oxígeno molecular a H20. Esta reacción de transferencia de electrones se basa en una oxidación-reducción del hierro hemo . Se han realizado intentos recientes para aplicar la reacción de transferencia de electrones del citocromo c en forma de nuevos materiales que limitan los materiales o elementos biológicos, principalmente biochips; por ejemplo, empleando el citocromo c552 de Hydrogenobacter thermophilus (Kodama y cois., Patente Estadounidense No. 5459046) . Las bacterias del ácido acético incluyendo Gluconobacter y Acetobacter poseen una capacidad muy eficiente para la oxidación de azúcar y alcoholes de azúcares, siendo empleadas industrial ente para la producción de vinagre y L-sorbosa, la cual se utiliza REF: 27133 como intermediario en la producción de Vitamina C. Para la fermentación ox dativa, el citocromo c juega un papel importante a la hora de completar la oxidación. Las proteínas del citocromo c han sido purificadas y caracterizadas a partir de numerosos organismos, incluyendo Gluconobacter, por ejemplo Matsushita y cois., informaron de la purificación del citocromo c553 con unión a CO (CO) (peso molecular de 48 kDa) de Gl uconobacter suboxydans (FEMS Microbiol. Lett . , 10: 267-270, 1981), y posteriormente al citocromo c553 (CO) demostró ser idéntico a la segunda subunidad de la alcohol deshidrogenasa de Gluconobacte . La amplificación del citocromo c553 (CO) en un Gluconobacter deficiente para la segunda subunidad de la alcohol deshidrogenasa mejoró ligeramente la producción de L-sorbosa a partir de D-sorbitol a nivel de velocidad específica (g de producto por g de células hora) , tal y como se descubre en J. Ferment . Bioeng., l , 209-213, 1992 (Y. Takeda y cois.). Además del citocromo c553, el citocromo c551 (AL) (peso molecular de 55kDa) y el citocromo c551 (CO) (peso molecular de 72 kDa) [Ameyama y cois., Agri . Biol. Chem., 51. 2943-2950 (1987)] también fueron aislados de Gluconobacter .

Breve Descripción de la Invención Es un objetivo de la presente invención el proporcionar un nuevo citocromo c que pertenece a una familia de proteínas con función de aceptores de electrones. Más particularmente, el nuevo citocromo c de la presente invención es útil como un aceptor de electrones de deshidrogenasas tales como la alcohol y la aldehido deshidrogenasa.

La presente invención se dirige asimismo a derivados funcionales de los polipéptidos del presente caso. Tales derivados funcionales se definen en base a las secuencias de aminoácidos de la presente invención por adición, inserción, deleción y/o substitución de uno o más residuos aminoacídicos de tales secuencias, en los casos en que tales derivados poseen todavía actividad citocromo c medida mediante un ensayo conocido en el campo o descrito específicamente aquí. Tales derivados funcionales pueden realizar bien por síntesis química peptídica conocida en el campo o mediante medios recombinantes en base a las secuencias de ADN tal y como se descubren aquí mediante métodos conocidos en campo y descubiertos por ejemplo por Sambrook y cois. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, EE.UU., segunda edición de 1989) . Los cambios aminoacídicos en proteínas y péptidos que no alteran en general la actividad de tales moléculas son conocidos en el campo y están descritos, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill en "The Proteins" (Academic Press, New York, 1979, véase específicamente la Figura 6, página 14). Los cambios que se producen más normalmente son: Ala/Ser, Val/lie, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lie, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly, así como la forma inversa de los mismos.

Adicionalmente, la presente invención se refiere a secuencias de ADN que comprenden una secuencia de ADN que codifica tras su expresión en una célula hospedadora procariota o eucariota polipéptidos que poseen al menos una parte de la estructura primaria y una de las propiedades biológicas del citocromo c551 tal y como se descubre, por ejemplo, en el listado de secuencias, así como sus cadenas complementarias, o bien aquellas que incluyen dichas secuencias, secuencias de ADN que hibridan preferentemente en condiciones normales con tales secuencias o fragmentos de las mismas y secuencias de ADN que debido a la degeneración del código genético no hibridan bajo condiciones estándar con tales secuencias, pero que codifican para polipéptidos que poseen exactamente la misma secuencia aminoacídica.

Las "condiciones normales" de hibridación significan en este contexto las condiciones que son empleadas generalmente por expertos en el campo para detectar señales de hibridación específicas y que están descritas, por ejemplo, por Sambrook y cois., (Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, EE.UU., segunda edición de 1989) , o preferentemente las denominadas condiciones restrictivas de hibridación y condiciones no restrictivas de lavado o más preferentemente las denominadas condiciones de restrictividad moderada o incluso más preferentemente las denominadas condiciones restrictivas de hibridación y condiciones restrictivas de lavado, con las cuales un experto en el campo está familiarizado y están descritas, por ejemplo, en Sambrook y cois. (op. cit.).

Es adicionalmente un objeto de la presente invención el proporcionar una secuencia de ADN tal y como se ha especificado anteriormente que comprende adicionalmente una secuencia de ADN que codifica un polipéptido que posee una actividad alcohol/aldehido deshidrogenasa. Tales construcciones pueden prepararse por ejemplo tal y como se describe en el Ejemplo 6.

Es adicionalmente un objeto de la presente invención el proporcionar un polipéptido que posea una actividad citocromo c y que esté codificado por una secuencia de ADN definida anteriormente o un polipéptido que posea actividad citocromo c obtenible u obtenido a partir de un microorganismo que pertenece al género Gluconobacter seleccionado del grupo consistente en los citocromos c551 I y II, los cuales muestran respectivamente las siguientes propiedades físico-químicas: (a) citocromo c551 I: (a) Peso molecular: aproximadamente 19 ± 1 kDa por gel filtración, y aproximadamente 18,0 ± 1,0 kDa por análisis por SDS-PAGE; (b) Espectro de absorción: la forma reducida muestra un máximo de absorción a 551 nm, 522 nm y 417 nm, en forma de picos alfa, beta y gamma, respectivamente; (c) Contenido en hemo : aproximadamente 1 mol de hemo/mol de proteína; (d) Punto isoeléctrico: aproximadamente 3,95; y (b) citocromo c551 II: (a) Peso molecular: aproximadamente 19 ± 1 kDa por gel filtración, y aproximadamente 16,8 kDa ± 1,0 kDa por análisis por SDS-PAGE; (b) Espectro de absorción: la forma reducida muestra un máximo de absorción a 551 nm, 522 nm y 417 nm, en forma de picos alfa, beta y gamma, respectivamente; (c) Contenido en hemo : aproximadamente 1 mol de hemo/mol de proteína; (d) Punto isoeléctrico: aproximadamente 3,75.

Es adicionalmente un objeto de la presente invención el proporcionar una secuencia de ADN tal y como se especifica anteriormente que comprende adicionalmente una secuencia de ADN que codifica un polipéptido que posee actividad alcohol/aldehido deshidrogenasa.

Es adicionalmente un objeto de la presente invención el proporcionar un vector adecuado para la expresión en una célula hospedadora procariota o eucariota que comprende una secuencia de ADN tal y como se define anteriormente y una célula hospedadora que ha sido transformada por dicho vector, más específicamente una célula hospedadora tal que en la cual una secuencia de ADN como se ha definido anteriormente ha sido integrada en su genoma, adicionalmente tales células hospedadoras que son de origen eucariota y preferentemente una célula de mamífero o de planta o aquellas células hospedadoras que son de origen procariota, especialmente cuando se seleccionan del grupo formado por bacterias, tal como Escherichia coli , Pseudomonas putida, Acetobacter xylinum, Acetobacter pasteurianus, Acetobacter aceti , Acetobacter hansenii , y Gluconobacter oxydans , por ejemplo Gl uconobacter oxydans DSM núm. 4025.

Adicionalmente, es un objeto de la presente invención el proporcionar un proceso para la producción del citocromo c551, que comprende el cultivo de una célula hospedadora como se ha definido anteriormente en un medio de cultivo adecuado y la recuperación del citocromo c551 del cultivo.

El citocromo c de la presente invención es asimismo aplicable para mejorar la producción de 2KGA a partir de L-sorbosa o D-sorbitol, y adicionalmente la producción de aldehidos, ácidos carboxílicos y cetonas a partir de los substratos correspondientes en presencia de alcohol y aldehido deshidrogenasa in vi vo e in vi tro .

El compuesto 2KGA es un intermediario importante para la producción de ácido ascórbico (Vitamina C) , en el cual puede convertirse según el bien conocido método de Reichstein. La producción de 2KGA a partir de L-sorbosa o a partir de D-sorbitol por fermentación es conocida. Las cepas de Gluconobacter se sabe que producen 2KGA vía la reacción catalizada por las deshidrogenasas de sorbosa y sorbosona, tal y como se descubre en Agrie. Biol. Chem., 54(5), 1211-1218, 1990 (T. Hoshino y cois.) y en la Publicación de Patente Europea núm. 606621.

Por consiguiente, el uso del citocromo c en la presente invención para la producción de Vitamina C constituye asimismo un objeto de la presente invención.

Se proporciona a continuación una breve descripción de las figuras antes de pasar a la descripción de la presente invención en mayor detalle: La Figura 1 muestra un espectro de absorción del citocromo c551 I y II. La concentración de proteína en la muestra fue en cada caso de 0,4 mg/ml. Las curvas sólida y discontinua son espectros de la forma reducida y oxidada, respectivamente.

La Figura 2 muestra secuencias de péptidos aislados del citocromo c551 II natural y de los oligonucleótidos sintetizados; donde: [A] Secuencias peptídicas determinadas a partir del citocromo c551 II natural; cl, c5 y c6 : las secuencias subrayadas se utilizaron para preparar oligonucleótidos; *: Se halló posteriormente que el Péptido III era la secuencia inmediatamente anterior al Péptido I. [B] Oligonucleótidos sintetizados como sondas y como cebadores .

La Figura 3 nuestra un análisis por transferencia Western de GOS2R portador del plásmido con el gen del citocromo c551. Se muestra 5 µg de extracto libre de células/carril.

La Figura 4 muestra la preparación del plásmido empleado en la expresión del conjugado alcohol/aldehido deshidrogenasa (AADH) -citocromo c551 que fue construido a imitación de la alcohol deshidrogenasa (ADH) de A . aceti y que posee una secuencia similar a la del citocromo c en su extremo C-terminal. La secuencia entre el dominio deshidrogenasa y el dominio citocromo c de ADH (PALNNRGFLPVKPP correspondiente a los aminoácidos 582 a 595 de la ADH madura) fue empleada como enlazador para conectar el dominio AADH con el dominio citocromo c551. Los sitios de restricción Nhel y BamHI fueron introducidos para unir las tres partes (AADH, enlazador y citocromo c551) .

Se construyó el conjugado AADH-citocromo c551 a imitación de la alcohol deshidrogenasa (ADH) de A. aceti que posee una secuencia similar a citocromo c en su extremo C-terminal. *1: La secuencia entre el dominio deshidrogenasa y el dominio citocromo c de ADH (PALNNRGFLPVKPP correspondiente a los aminoácidos 582 a 595 de la ADH madura) fue empleada como enlazador para conectar el dominio AADH con el dominio citocromo c551. *2 : Se introdujeron los sitios de restricción Nhel y BamHI para ligar las tres partes (AADH, enlazador y citocromo c551) .

Antes de dar paso a la descripción de la presente invención en mayor detalle se presentan a continuación las propiedades físico-químicas del citocromo c551 purificado, consistente en las isoformas I y II tal como se obtienen de Gluconobacter oxydans . !l) Peso molecular.

En la filtración en gel de la etapa de purificación, los citocromos c551 I y II mostraron un peso molecular aparente de 19 ± 1 kDa. Adicionalmente, el análisis por SDS-PAGE mostró pesos moleculares de 18,0 ± 1,0 y 16,8 ± 1,0 kDa para los citocromos c551 I y II, respectivamente. Por consiguiente, existen dos preparaciones de citocromos c551 que muestran pesos moleculares muy próximos, siendo ambos citocromos c551 I y II proteínas monoméricas. (2) Espectro de absorción y contenido en hemo El espectro de absorción de los citocromos c551 I y II que resultaron totalmente reducidos mediante la adición de ditionito de sodio se muestran en la Figura 1.

Los espectros de ambos citocromos c551 I y II fueron indistinguibles uno del otro. Los citocromos reducidos mostraron máximos de absorción a 551 nm, 522 nm y 417 nm, en forma de picos alfa, beta y gamma, respectivamente.

Adicionalmente, los citocromos oxidados mostraron un máximo de absorción a 411 nm en forma de un pico gama. Los contenidos en hemo de los citocromos c551 I y II se determinaron como de aproximadamente 1 mol/mol de proteína, mono-hemo, mediante el método de piridina hemocromo de Drabkin (J. Biol. Chem., 146: 605, 1942). (3) Punto isoeléctrico Los puntos isoeléctricos (pl) se determinaron como de 3,95 y 3,75 para los citocromo c551 I y II mediante el sistema de electroforesis isoeléctrica LKB (Estocolmo, Suecia) . (4) Comparación del mapa peptídico de los citocromos C551 I y II Los citocromos c551 I y II se digirieron con proteasa V8 o con termolisina en las mismas condiciones, y se compararon los patrones de fragmentación peptídica mediante análisis de HPLC en fase reversa. Los patrones de fragmentación peptídica principales (aproximadamente 30 picos de fragmentos peptídicos) de los citocromos c551 I y II fueron idénticos, a excepción de que se observaron adicionalmente algunos picos menores de fragmentos peptídicos en los citocromos c551 I y II, respectivamente. El resultado indicó una elevada homología de secuencia aminoacídica entre los citocromos c551 I y II. (5) Secuencias de aminoácidos del citocromo c551 II Los aminoácidos N-terminales de los citocromos c551 I y II se hallaban bloqueados mediante modificación desconocida. Por consiguiente se determinaron las secuencias aminoacídicas internas a partir de los fragmentos peptídicos. Además de los fragmentos digeridos con la proteasa V( y con termosilina, el citocromo c551 II (sin el hemo y S-carboximetilado) se digirió con lisil-endopeptidasa para obtener fragmentos peptídicos adicionales. Se determinaron las siguientes secuencias aminoacídicas internas a partir de diversos fragmentos peptídicos obtenidos: Núm. 1 (listado de secuencias SEQ ID Núm. 3) : AlaAspThrAlaAlaThrGluGluAlaProAlaAlaAlaAlaGlyAlaAla- ThrSerlleTyrAspGlyValTyrThrAlaAlaGlnAlaGluAlaGlyGlnAlaAlaTrp MetThrSerXaaAlaSerXaaHisGlyProThrAlaArgGlySer, Núm. 2 (listado de secuencias SEQ ID nÚM. 4) : GlyProArgValIleGlyProValIleAsnAsnLysTyrAlaAspLysProLeu LeuAspTyrPheAsnTyrArgAspAsnMetProMetGlyAlaProHisSerLeuSerAsp AspThrTyrValGlu Núm. 3 (listado de secuencias SEQ ID Núm. 5) : IleLeuGlnSerHisGlyAlaGluProGlyGluThrGlu.

Descripción Detallada de la Invención El citocromo c proporcionado por la presente invención puede prepararse cultivando un microorganismo adecuado, disgregando las células y aislando y purificando el citocromo c a partir del extracto libre de células obtenido a partir de las células disgregadas, preferentemente a partir de la fracción soluble del microorganismo .

Los microorganismos utilizados en la presente invención para el aislamiento del citocromo c de la presente invención pertenecen preferentemente al género Gluconobacter y son capaces de producir citocromo c. Los equivalentes funcionales, subcultivos, mutantes y variantes de dicho microorganismo pueden ser también utilizados en la presente invención. Una cepa preferida es Gl uconobacter cxydans . Una cepa específica y preferida de Gluconobacter oxydans ha sido depositada en el Deutsche Sammlung von Mikroorganis en en Góttingen (Alemania) bajo el DSM Núm. 4025 el 17 de Marzo de 1987. Adicionalmente, un subcultivo de la cepa ha sido también depositado en la Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, Instituto de Investigación en Fermentación, Japón, bajo las estipulación del tratado de Budapest con el número de depósito: Gluconobacter oxydans DSM Núm. 4025 FERM BP-3812 (fecha de depósito: 30 de Marzo de 1992). Adicionalmente, la Publicación de Patente Europea 0278 477 descubre las características de esta cepa.

Los microorganismos pueden ser cultivados en un medio acuoso suplementado con los nutrientes adecuados en condiciones aeróbicas. El cultivo puede realizarse a un pH entre aproximadamente 4,0 y 9,0 preferentemente entre aproximadamente 6,0 y 8,0. Si bien el período de cultivo varía dependiendo del pH, temperatura y medio nutritivo utilizado, se obtendrán resultados favorables normalmente con de 2 a 6 días. Un intervalo preferido de la temperatura para llevar a cabo el cultivo es de aproximadamente 13 °C a 36°C, preferentemente de aproximadamente 18°C a 33°C.

Se requiere normalmente que el medio de cultivo contenga nutrientes tales como fuentes de carbono asimilables, fuentes de nitrógeno asimilables y substancias inorgánicas, vitaminas, elementos traza y el resto de factores promotores del crecimiento. Pueden utilizarse como fuentes de carbono asimilables glicerol, D-glucosa, D-manitol, D-fructosa, D-arabitol, L-sorbosa, D-sorbitol y similares.

Pueden utilizarse diversas substancias orgánicas o inorgánicas como fuentes de nitrógeno, tales como el extracto de levadura, extracto de carne, peptona, caseína, licor de infusión de maíz, urea, aminoácidos, nitratos, sales de amonio y similares. Pueden utilizarse como substancias inorgánicas sulfato de magnesio, fosfato de potasio, cloruros ferroso y férrico, carbonato de calcico y similares.

A continuación, se describen las formas para el aislamiento y purificación del citocromo c a partir de los microorganismos tras el cultivo y para la clonación del gen/secuencia de ADN. (1) Las células se recuperan del cultivo de fermentación por centrifugación o filtración. (2) Las células se resuspenden en la solución tamponadora y se disgregan mediante un homogeneizador, sonicador o mediante tratamiento con lisozima y similares para rendir una solución disgregada de células. (3) El citocromo c se aisla y purifica a partir de un extracto libre de células obtenido a partir de las células disgregadas, preferentemente a partir de la fracción soluble de los microorganismos mediante métodos normales de purificación de proteínas tales como precipitación con sulfato amónico, diálisis, cromatografías de intercambio iónico, cromatografías de gel de filtración y cromatografías de afinidad.

El citocromo c proporcionado por la presente invención es útil como un aceptor de electrones procedentes de un enzima perteneciente a las deshidrogenasa para la producción de aldehidos, ácidos carboxílicos y cetonas a partir de alcoholes y aldehidos, especialmente para la producción de 2KGA a partir de L-sorbosa o D-sorbitol vía L-sorbosona.

De forma resumida, el gen del citocromo c, la secuencia de ADN, el vector de expresión recombinante y el organismo recombinante, denominado también célula hospedadora transformada, utilizados en la presente invención, pueden obtenerse siguiendo las etapas que se describen a continuación: (1) Aislamiento del ADN cromosómico de los microorganismos que pueden proporcionar citocromo c que acepta electrones de las hidrogenasas y construcción de la biblioteca génica con el ADN cromosómico en Escherichia coli . (2) Clonación del gen del citocromo c a partir de ADN cromosómico mediante hibridación de colonias, de calvas o de tipo Southern, clonación por PCR (reacción en cadena de la pclimerasa) , análisis por transferencia Western y similares. (3) Determinación de la secuencia de nucleótidos del gen del citocromo c obtenida como se ha descrito anteriormente mediante los métodos habituales para seleccionar la molécula de ADN que contiene dicho gen del citocromo c y construcción del vector de expresión recombinante a partir del cual el citocromo c puede expresarse de forma eficiente. (4) Construcción de los organismos recombinantes portadores del gen del citocromo c mediante transformación, transducción, transconjugación y electroporación, Los materiales y las técnicas empleados en el aspecto anterior de la presente invención se ejemplifican en detalle del modo siguiente: Puede purificarse un ADN cromosómico total mediante un procedimiento bien conocido en el campo. El gen que codifica el citocromo c se clona bien en vectores plasmídicos o en vectores fágicos a partir de un ADN cromosómico total mediante los siguientes métodos: (i) determinando las secuencias parciales de aminoácidos a partir del citocromo c purificado aislando la proteína completa o bien los fragmentos peptídicos obtenidos mediante el tratamiento con peptidasa del gel tras la electroforesis en gel de poliacrilamida y SDS y aplicándolos a un secuenciador de proteínas tal como un secuenciador automático de fase gas Applied Biosystems 470A (Perkin Elmer Corp., Norwalk, Conn. , EE.UU.), sintetizando sondas de oligonucleótidos con un sintetizador de ADN tal como un sintetizador de ADN automático Applied Biosystems 381A (Perkin Elmer) de conformidad con las secuencias de aminoácidos obtenidas como se ha descrito anteriormente, aislando los clones portadores del gen objetivo a partir de una biblioteca de genes de la cepa portadora del gen objetivo con las sondas de oligonucleótidos mediante hibridación de tipo Southern, en colonia o en calva; (ii) seleccionando clones que expresen el citocromo c a partir de la biblioteca de genes mediante métodos inmunológicos empleando un anticuerpo anti-citocromo c; o (iii) amplificando el ADN a partir del ADN cromosómico total mediante un método de PCR con dos oligonucleótidos sintetizados de conformidad con las secuencias aminoacídicas determinadas según lo descrito anteriormente y aislando un clon portador del gen del citocromo c completo a partir de la biblioteca de genes construida en E . coli mediante hibridación de tipo Southern, en colonia o en calva empleando el producto de PCR obtenido anteriormente como sonda. Los anticuerpos descritos anteriormente que reaccionan contra dicho citocromo c pueden prepararse a partir de proteína citocromo c purificada o su fragmento peptídico mediante un método descrito en Methods in Enzymology, vol. 73, pág. 46, 1981.

La secuencia nucleotídica del gen del citocromo c puede determinarse mediante un método bien conocido en el campo tal como el método de terminación de la cadena con dideoxis utilizando el fango M13 (Sanger F. y cois., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467, 1977).

Pueden utilizarse diversos promotores para la expresión de forma eficiente del gen del citocromo c, o hablando en general para expresar la secuencia de ADN que codifica para la actividad citocromo c; por ejemplo, el promotor original que existe corriente arriba de dicho gen del citocromo c, promotores de genes de resistencia a antibiótico tales como el gen de resistencia a kanamicina de Tyn5 (Berg, D.E., y C.M. Berg, 1983, Bio/Technology 1: 417-435), gen de resistencia a ampicilina del pBR322, y promotores de la b-galactosidad de E. coli (lac) , de trp, tac, tre, promotores del fago lambda y cualquier promotor que pueda ser funcional en los hospedadores consistentes en microorganismos incluyendo bacterias como Escherichia coli , Pseudomonas putida, Acetobacter xylinum, Acetobacter pasteurianus, Acetobacter aceti , Acetobacter hansenii y Glucobacter oxydans, células de mamífero y células de planta.

Para el objeto descrito, son necesarios otros elementos reguladores tales como una secuencia Shine- Dalgarno (SD) (por ejemplo AGGAGG, etc., incluyendo secuencias naturales y sintéticas operativas en la célula hospedadora) y un terminador de la transcripción (estructura en repetición invertida que incluye cualquier secuencia natural y sintética operativa en la célula hospedadora) que son operativos en la célula hospedadora en la que la secuencia codificante será introducida y utilizada con el promotor descrito anteriormente.

Para la expresión de los polipéptidos periplásmicos, proteína citocromo c, es indispensable un péptido señal que contiene normalmente de 15 a 50 residuos aminoacídicos y es totalmente hidrofóbico. Un ADN que codifica un péptido señal puede seleccionarse de cualquier secuencia natural y sintética operativa en la célula hospedadora deseada.

Puede emplearse una variedad de combinaciones de hospedadores/vectcres de clonación en la clonación del ADN de doble cadena. El vector de clonación es generalmente un plásmido o un fago que contiene un origen de replicación, elementos reguladores, un sitio de clonación incluyendo un sitio de clonación múltiple y marcadores de selección tales como genes de resistencia a antibióticos incluyendo genes de resistencia a ampicilina, tetracilina, kanamicina, estreptomicina, gentamicina, espectinomicina, etc.

Los vectores preferidos para la expresión del gen objeto en E. coli se selecciona de cualquier vector utilizado normalmente en E. coli , tal como pBR322 o sus derivados incluyendo pUC18 y pBluescriptII, pACYC177 y PACYC184 (J. Bacteriol, 134: 1141-1156, 1978) y sus derivados, y un vector derivado de un plásmido de amplio rango de hospedador tal como RK2 y RSF1010. Un vector preferido para la expresión del gen objeto en GluconoJbacter incluyendo G. oxydans DSM Núm. 4025 y P. putida se selecciona de cualquier vector que pueda replicar en Gluconobacter y/o P. putida, así como en un organismo de clonación preferido como E . coli . El vector preferido es un vector de amplio rango de hospedador tal como un vector cósmido como pVK102 y sus derivados y RSF1010 y sus derivados, y un vector que contiene un origen de replicación funcional en GluconoJbacter y otro origen funcional en E. coli . El número de copias y la estabilidad del vector deben ser tenidas en cuanta cuidadosamente para la expresión estable y eficiente del gen clonado, así como para el cultivo eficiente de la célula hospedadora portadora del gen clonado. Las secuencias de ADN que contienen elementos transponibles tales como Tn5 pueden ser empleadas asimismo como un vector para introducir el gen objetivo en el hospedador preferido, especialmente en un cromosoma. Las secuencias de ADN que contienen cualquier ADN aislado del hospedador preferido junto con el gen objetivo son asimismo útiles para introducir la secuencia de ADN deseada en el hospedador preferido, especialmente en un cromosoma. Tales secuencias de ADN pueden ser transferibles al hospedador preferido por transformación, transducción, transconjugación o electroporación.

Los hospedadores útiles son de origen procariota o eucariota, y pueden incluir microorganismos, células de mamífero y células de planta. Como microorganismos preferidos pueden mencionarse bacterias tales como E. coli , P . putida, A. xylinu , A. pasteurianus , A. aceti , A, hansenii , G . oxydans , y cualquier bacteria Gram-negativa que sea capaz de producir citocromo c recombinante. Pueden utilizarse asimismo en la presente invención equivalentes funcionales, sub-cultivos, mutantes y variantes de dicho microorganismo. Una cepa preferida es E. coli K12 y sus derivados, P . pu tida o G. oxydans DMS Núm. 4025 La secuencia de ADN que codifica el citocromo c de la presente invención se liga en un vector adecuado que contiene una región reguladora tal como el promotor y un sitio de unión a ribosoma y un terminador de transcripción operativo en la célula hospedadora descrita anteriormente mediante métodos bien conocidos en el campo para producir un vector de expresión.

Para construir una célula hospedadora portadora de un vector de expresión, puede utilizarse diversos métodos de transferencia de ADN, incluyendo transformación, transducción, apareamiento por conjugación (Capítulos 14 y 15, Methods for General and Molecular Bacteriology, Philipp Gerhardt y cois., eds., American Society for Microbioligy, 1994) , y electroporación. El método para construir una célula hospedadora transformante puede seleccionarse de los métodos bien conocidos en el campo de la biología molecular. Puede utilizarse un sistema de transformación habitual para E. coli , Pseudomonas y Acetobacter. El sistema de transducción puede utilizarse asimismo para E. coli . El sistema de apareamiento por conjugación puede utilizarse en numerosos casos de bacterias Gra -positivas y Gra -negativas, incluyendo E. coli , P . pu tida y G . oxydans . Un método de apareamiento por conjugación preferido ha sido descubierto básicamente por el inventor en la Publicación PCT Núm. WO89/06688. la conjugación puede tener lugar en medio líquido o sobre una superficie sólida. El receptor preferido para la producción de citocromo c se selecciona de E. coli , P . pu tida y G. oxydans . El receptor preferido para la producción de 2KGA se selecciona de E. coli , P . putida y G. oxydans , los cuales pueden producir AADHs activas con un vector de expresión recombinante. El receptor preferido para la producción de 2KGA es G. oxydans DSM Núm. 4025. Se añade normalmente un marcador de selección al receptor del apareamiento por conjugación, por ejemplo resistencia contra el ácido nalidíxico o rifampicina.

El citocromo c551 de la presente invención puede utilizarse como una fuente para la construcción de conjugados proteína-proteína tales como los conjugados AADH-citocromo c551 construidos con secuencias de ADN que codifican AADH para mejorar la eficiencia total de la transferencia de electrones tal y como se ejemplifica más adelante .

Ejemplo 1: Preparación de los citocromos c551 I y TT.

Todos los procesos se llevaron a cabo a 4°C a menos que se especifique lo contrario. (1) Cultivo de G. oxydans DMS Núm. 4025 Se distribuyó medio de cultivo de inoculo conteniendo L-sorbosa al 8% (esterilizada por separado) , glicerol al 0,05%, MgS04.7H20 al 0,25%, licor de infusión de maíz al 1,75%, levadura de panadero al 5,0%, CaC03 al 0,5% y urea al 0,5% (esterilizada por separado), pH 7,0, en tubos de ensayo (5ml cada uno) . Se inoculó en el medio de cultivo de inoculo en el tubo de ensayo una porción recogida en asa de células de G. oxydans DMS Núm. 4025 crecidas en medio NS2 en placa de agar conteniendo D-manitol al 5,0% MgS04'7H20 al 0,25%, licor de infusión de maíz al 1,75%, levadura de panadero (Oriental Yeast Co., Tokyo, Japón) al 5,0%, CaC03 al 0,5%, urea al 0,5% (esterilizada por separado) y agar al 2,0%, pH 7,0 (antes de la esterilización) a 27°C durante cuatro días, cultivándose el cultivo a 30°C durante 24 horas con agitación. El cultivo de inoculo resultante se transfirió a 100 mi del mismo medio de cultivo de inoculo tal como se ha descrito anteriormente en un frasco erlenmeyer de 500 mi y se cultivo a 30°C durante 24 horas con una rotación de 280 rpm. Se transfirieron 25 mi del cultivo de inoculo preparado anteriormente a 500 mi de medio de producción conteniendo L-sorbosa al 10% (esterilizada por separado), glicerol al 0,05%, urea al 1,6% (esterilizada por separado), MgS04'7H20 al 0,25%, células de levadura de panadero al 6,25%, CaC03 al 1,5% (grado de producción, Naccaraitesque, Kyoto, Japón) , y licor de infusión de maíz al 3,0% pH 7,5 (antes de la esterilización), en un frasco erlenmeyer de 2000 mi, cultivándose a 30°C durante 35 a 40 horas con una rotación de 180 rpm. Tras el cultivo, se eliminaron los materiales sólidos como las células de levadura de panadero y el CaC03 mediante centrifugación a baja velocidad (500 x g, 15 min) , dos veces. Las células se resuspendieron en Tris-HCl 25mM, NaCl 0,9%, Kcl 0,09%, CaCl2 10 mM, MgCl2 5 mM, sacarosa al 5% y fluoruro de fenilmetilsulfañilo (PMSF) lmM, pH 8,0 centrifugándose la suspención celular a 500 x g durante 15 min. para eliminar materiales sólidos, recogiéndose a continuación las células por centrifugación a 10000 x g durante 15 minutos y conservándose a -20°C hasta su uso. (2) Preparación de la fracción soluble Las células obtenidas a partir del cultivo de 10 litros (peso húmedc de 40 g) se suspendieron con 60 mi de Tris-HCl 25mM, CaCl2 5mM, pH 8,0 y se disgregaron haciéndolas pasar a través de una prensa francesa (1500 kg/cm2) dos veces. Se añadieron a la solución DNasa y MgCl2 a una concentración final de 0,01 mg/ml y lmM, respectivamente, eliminándose los restos celulares por centrifugación a 6000 x g durante 10 minutos. A partir del extracto libre de células (8800 mg de proteína total) preparado como se ha descrito anteriormente, se separó la fracción soluble conteniendo los citocromos mediante ultracentrifugación a 100000 x g durante 90 minutos, dializándose a continuación contra Tris-HCl 25 mM, CaCl2 5mM, pH 8,0. (3) Cromatografía en columna DEAE-Toyopearl 650M Se sometió la fracción soluble a una columna de DEAE-Toyopearl 650M (TOSOH Corp., Tokyo, Japón; 2,5 ID x 45 cm) que había sido equilibrada con Tris-HCl 25mM, CaCl2 5mM, pH 8,0. tras lavar la columna con 400 mi del mismo tampón, se realizó la elución con 2000 mi de un gradiente lineal de 0 a 0 , 5 M de NaCl en el tampón. Se recogió la banda rojo oscuro que mostraba un pico de absorción de la diferencia de 412 nm menos 480 nm a aproximadamente 0,13M de la concentración de NaCl como la fracción principal de citocromo. [4) Cromatografía en columna en Butyl-Toyapearl 650S Se diluyó la fracción principal de citocromo con el mismo volumen de Tris-HCl 25 mM, 80% de (NH4)2S04 saturado, pH 8,0 con agitación suave, se centrifugó a 10000 x g durante 15 minutos para eliminar los materiales insolubles y se aplicó a una columna de Butyl-Toyopearl 650S (TOSOH; 2,5 ID x 20 cm) que había sido equilibrada con Tris-HCl 25 mM, 40% de (NH4)2S04 saturado, pH 8,0. tras lavar con 200 mi del mismo tampón, la elución se llevó a cabo con 1000 mi de un gradiente lineal de 40% a 0% de (NH4)2S04 saturado en el tampón. Se recogió una banda de citocromo que eluía a aproximadamente un 20% de concentración de (NH4)2S04 saturado, concentrándose hasta 2,5 mi empleando ultrafiltración a través de PM-10 bajo presión de N2 gas. (5) Gel filtración en Sephacryl S-100HR La fracción de citocromo se cargó con una columna de Sephacryl S-100HR (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia,-2,5 ID x 90 cm) que había sido equilibrada con fosfato sódico a 25mM, NaCl 0,2 M, pH 7,2. la columna se desarrolló con el mismo tampón, recogiéndose una banda de citocromo que mostraba un peso molecular de aproximadamente 19kDa. (6) Cromatografía en columna de hidroxilapatito Se dializó extensivamente la fracción principal de citocromo contra 0,2 mM de fosfato sódico a pH 6,8 y se aplicó sobre una columna de hidroxilapatito: HCA-100S (3,3 x 20 cm; Mitsui Toatsu Chemicals Inc., Tokyo, Japón), que había sido equilibrada con fosfato sódico 0,2 mM (pH 6,8) . Tras lavar la columna con 200 mi del mismo tampón, se llevó a cabo la elución con 2000 mi de un gradiente lineal de fosfato sódico 0,2 - 18 mM (pH 6,8). Durante la realización del gradiente, los citocromos se separaron en dos bandas rojas y se eluyeron. En consecuencia, las bandas más rápida y más lenta se denominaron como citocromos c551 I y II respectivamente. Cada citocromo se dializó contra MOPS 25 mM, NaCl 0,2 M, pH - 7 , 5 y se concentraron hasta 2,0 mi empleando ultrafiltración a través de PM-10 (Millipore Corp., Bedford, Mass., EE.UU.), bajo atmósfera de N2 gas, y se conservaron a -80°C. Finalmente, 37,4 mg de citocromo c551 I y 42,6 mg de citocromo c551 II se obtuvieron a partir de 8800 mg de proteína celular total. (7) Pureza de los citocromos c551 I y II Tras la cromatografía en la columna de hidroxilapatito (etapa final de la purificación) , cada citocromo se eluyó en forma de un pico único con una relación constante de absorción 280/410 nm. En los análisis de PAGE en SDS y nativa, cada citocromo mostró una banda de proteína única cuando se teñía, o una banda roja visible cuando no era teñido. Los pesos moleculares de los citocromos c551 I y II se determinó que eran 18,0 ± 1,0 y 16,8 ± 1,0 kDa, respectivamente, mediante análisis en SDS-PAGE. (8) Capacidad de los citocromos c551 I y II purificados de aceptación de electrones procedentes de la AADH de G. oxydans DMS Núm. 4025 Se reconstituyó el sistema de producción de 2-KGA conteniendo las siguientes proteínas definidas y purificadas. El sistema consistía en AADH 12 µM (purificada a partir de G. oxydans DMS Núm. 4025 mediante el método descrito por A. Asakura y T. Hoshino en la Publicación de Patente Europea Núm. 606621) , citocromos c551 I y II 14,4 µM (mezcla 1:1), citocromo c de corazón de caballo de tipo VI 250 µM (suministrado por Sigma, St . Louis, Mo., EE.UU.), 12,5 unidades/ml .de citocromo c oxidasa de corazón de bovino tipo aa3 (adquirida a Sigma) y tampón MOPS 50mM pH 7,5, conteniendo 50 mg/ml de L-sorbosa, 5 mg/ml de albúmina sérica bovina (fracción V, adquirida a Sigma), y NaCl 0,2 M. En el sistema de producción de 2-KGA, el citocromo c de corazón de caballo de tipo VI y la citocromo c oxidasa de corazón de bovino tipo aa3 catalizan la reoxidación del citocromo c bacteriano, los citocromos c551 I y II, con reducción de oxígeno. Tras la reacción con incubación aeróbica a 25°C durante 15 horas, se acumularon aproximadamente 8 mM de 2-KGA. En contraste, en ausencia de citocromos c551 I y II, la acumulación de 2-KGA fue de menos de 0,2 mM. La producción de 2-KGA dependiente de los citocromos c551 I y II indicó que los citocromos c551 I y II eran aceptores de electrones efectivos para el ciclo catalítico de la AADH productor de 2-KGA.

Eiemolo 2: Clonación dpi gen del citocrnmo r-?qi (1) Amplificación parcial del gen del citocromo c551 mediante el método de PCR Se realizó una PCR empleando los cebadores cl, c5, c6 y sus secuencias antisentido (clR, c5R, c6R) , las cuales se sintetizaron de acuerdo con las secuencias aminoacídicas de la proteína de citocromo c551 purificada mediante un sintetizador de ADN Applied Biosystems 581A (EE.UU.) tal y como se muestra en la Figura 2. La reacción de PCR se realizó empleando el GeneAmp™ DNA Amplification Reagent Kit (Takara Shuzo, Kyoto, Japón) , mediante un termociclador de Perkin Elmer Instruments según las recomendaciones del proveedor. La reacción consistió en 30 ciclos de: 1) etapa de desnaturalización a 94°C durante 1 min; 2) etapa de hibridación a 48 ó 42°C durante 2 min; y 3) etapa de síntesis a 72°C durante 3 min. La mezcla de reacción (50 µl) contenía 200 µM de dNTPs, 6,4 µM de cada cebador (degeneración 32), 250 ng de ADN cromosómico de G. oxydans DSM Núm. 4025, y 2,5 unidades de polimerasa Taq en el tampón proporcionado. Cuando el producto de PCR se marcaba con P, se añadían 0,74 Mbeq de [a-32P]dCTP y 40 µM de dCTP a la mezcla de reacción en lugar de 200 µM de dCTP . La PCR con los cebadores c5 y clR producía un ADN de 50 pb, mientras que las PCR con las otras combinaciones de cebadores no producían bandas de ADN o bien producían numerosas bandas . (2) Clonación y secuenciación de nucleótidos del fragmento de 50 pb amplificado por PCR El fragmento de 50 pb amplificado por PCR se clonó en el sitio Smal del pUC18 y se secuenció mediante el método de terminación de cadena con dideoxis (Proc. Nati.

Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467, 1977). La secuencia de nucleótidos determinada para este fragmento de 50 pb fue: ' -ATCAACAACAAGTATGCTGACAAGCCGCTGCTGGACTACTTCAACTAC?C-3' (listado de secuencias SEQ ID Núm. 6) .

La secuencia aminoacídica deducida de esta secuencia de nucleótidos en el primer marco de lectura (IleAsnAsnLysTyrAlaAspLysProLeuLeuAspTyrPheAsnTyrThr) incluye las secuencias aminoacídicas IleAsnAsnLysTyrAla y AspTyrPheAsnTyrThr empleadas para preparar los cebadores. (3) Análisis por hibridación Southern del ADN cromosómico de G. oxydans DSN Núm. 4025 empleando un oligonucleótido de 50 bases como sonda.

Se hibridaron transferencias Southern preparadas a partir del ADN cromosómico de G. oxydans DSM Núm. 4025 digerido con varios enzimas de restricción incluyendo EcoRI con el oligonucleótido de 50 mer sintetizado mediante un sintetizador de ADN y marcado con 32P en base a la información de la secuencia de 50 bases indicada anteriormente. La sonda híbrido únicamente con un fragmento EcoRI de 2,5 kb. Este resultado indica que el citocromo c551 se produce a partir de un único gen en el ADN cromosómico. (4) Clonación del fragmento EcoRI de 2,5 kb que contiene el gen completo del citocromo c551 El ADN cromosómico de G. oxydans DSM Núm. 4025 se digirió completamente con EcoRI, y los fragmentos resultantes se sometieron a electroforesis en gel de agarosa. Los fragmentos de ADN de alrededor de 2,5 kb (2-3,5 kb) de longitud se cortaron y se eluyeron del gel. Los fragmentos de ADN recuperados se ligaron con en un vector pUC18 digerido con EcoRI y se utilizaron para transformar E. coli JM109. Se obtuvieron aproximadamente 1000 transformantes y se escrutaron por hibridación en colonia empleando el oligonucleótido de 50 mer marcado con P como sonda. Como consecuencia, se obtuvo una colonia que mostraba una señal intensa, se extrajo el ADN plasmídico de la colonia y se digirió con EcoRI : el fragmento EcoRI de 2,5 kb que contenía mostró una señal muy intensa. El plásmido se denominó pGOC201. El fragmento EcoRI de 2,5 kb se clonó asimismo en el vector pVKlOO (Knauf, V.C. y cois., Plasmid, 8: 45-54, 1982), para generar los plásmidos pGOClOl y pGOClOÍR, los cuales poseen el fragmento EcoRI de 2,5 kb en direcciones opuestas. (5) Secuenciación de nucleótidos del gen completo del citocromo c551 La secuencia de nucleótidos del gen del citocromo c551 se determinó mediante el método de terminación de cadena con dideoxis. Se secuenció un fragmento de 1,7 kb EcoRI-Smal, hallándose un marco abierto de lectura (ORF de 507 pb presente en la secuencia mostrada en el listado de secuencias como SEQ ID Núm. 1) en este fragmento. Este ORF codifica una proteína de 168 aminoácidos (listado de secuencias SEQ ID Núm. 2) que contiene los tres tramos consistentes con las secuencias aminoacídicas de los fragmentos peptídicos derivados de las digestiones del citocromo c551 (listado de secuencias SEQ ID Núm. 3-5) . El ORF contenía asimismo una secuencia señal típica; la secuencia señal se escinde posiblemente tras los residuos Ala para generar los 25 residuos de MetLysAnsLysThrThrLeuGlyGlyAlaLeuAlaLeuAlaAlaLeuLeuAlaGly ThrThrGlyAlaLeuAl y los 143 residuos de la secuencia madura. El peso molecular del citocromo c551 maduro calculado a partir de la secuencia fue de 14836. este valor es algo más pequeño que los pesos moleculares aparentes de los citocromos c551 I y II (18000 y 16800) estimados por SDS-PAGE. Se halló en el medio de la proteína madura (residuos núm. 51 a 55) un CysAlaSerCysHis como secuencia consenso de unión a hemo, CysXaaXaaCysHis . (6) Subclonación del gen del citocromo c551 mediante un método de PCR El fragmento de 744 pb conteniendo las secuencias flanqueantes de 117 pb 5 ' y 120 en 3* del ORF (507 pb) se amplificó por PCR mediante cebadores conteniendo el sitio EcoRI . La clonación de los fragmentos amplificados en los vectores pVKlOO generó los plásmidos pGOC102 y pGOC102R, el cual posee el fragmento de 744 pb en dirección opuesta. La clonación del fragmento de 744 pb en pMMB22 (Bagdasarian, M., y cois., Gene, 26: 273-282, 1983 generó el plásmido pGOC402.

Ejemplo 3; Expresión del gPn del citnr-ro.m^ c551 e E . Cn l i . P- cu t ida y G . Ox?dans DSM Núm. 402 (1) Expresión del citocromo c551 en E. Coli Se sometió un extracto de células de E. Coli JM109 portadoras de pGOC402 o pMMB22 a un análisis por trasferencia Western. Las células de E. Coli se hicieron crecer en LB con 50 µg/ml de ampicilina durante toda la noche, y seguidamente se inocularon alícuotas del 1% en 5 mi de medio frasco. Tras 4 horas de cultivo, el cultivo se continuó durante una hora más con o sin adición de isopropil-ß-D-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de lmM. Las células se recuperaron y se resuspendieron en agua. Tras determinar la concentración de proteínas, la suspensión celular se diluyó a una concentración de 2 mg de proteína/ml en tampón de Laemmli consistente en Tris-HCL 62,5 mM (pH 6,5), glicerol 10%, SDS 2% y ß-mercaptoetanol al 5%, hirviéndose durante 3 minutos. Se sometieron treinta µg de los extractos exentos de células a una electroforesis en gel de poliacrilamina-SDS (15%) . Las bandas de proteína resultantes en el gel se transfirieron a un filtro de nitrocelulosa mediante un aparato de electro -transferencia en semi-seco (Trans-blot Sd, Bio-Rad, Hercules, Calif., EE.UU.) ajustando a 25 V durante 1 hora en tampón Tris-HCl 2 , 5 mM y glicina 19,2 mM, pH 8,6, conteniendo metanol al 20%. La proteína citocromo c551 se visualizó mediante tratamiento con antisuero anti-citocromo c551, conjugado de IgG de cabra anticonejo y peroxidasa de rábano, peróxido de hidrógeno y reactivos de revelado de color tal y como lo recomienda el proveedor (KONICA Co . , Tokyo, Japón). Las células portadoras de pGOC402 preparadas con o sin inducción con IPTG expresaron dos bandas positivas (de aproximadamente 30 ng ó 10 ng de citocromo c551 en total por 30 µg de extracto exento de células, respectivamente) , mientras que las células portadoras de pMMB22 no las expresaron. Los valores de Rf de dichas bandas fueron idénticos a los de los citocromos c551 I y II purificados, lo que indica que los citocromos c551 I y II se expresan a partir de un solo gen y se modifican post-traduccionalmente o post-transcripcionalmente . (2) Expresión del gen del citocromo c551 en P. Putida En primer lugar, se introdujeron pGOC402 y pMMB22 en P . Putida resistente a ácido nalidíxico (Nalr) ATCC 21812 mediante un método de apareamiento por conjugación triparental llevado a cabo del modo siguiente, Se cultivaron células de P. putida Nalr ATTCC 21812 a 30°C en 5 mi de medio MB consistente en manitol al 2.5%, extracto de levadura al 0.5% (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) y Bactotriptona (Difco) al 0,3%. Las cepas donadoras, E. coli JM109 portadora pGOC402 (resistencia a estreptomicina: Smr) o pMMB (Smr) , y una cepa ayudante, E. Coli HB101 portadora de pRK2013 (Kmr, Figurski, D:H., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 76: 1648-1652,1976), se hicieron crecer en medio LB conteniendo los antibióticos adecuados durante toda la noche a 37°C. Estos cultivos de toda la noche (2 mi cada uno) se centrifugaron independientemente, y los sedimentos celulares se resuspendieron independientemente en 2 mi de medio MB. Se mezclaron 100 µl de cada una de las suspensiones celulares y 50 µl de la suspensión celular mezclada se aplicaron sobre un filtro de nitrocelulosa colocado sobre la superficie de medio FB en agar consistente en fructosa al 5%, extracto de levadura al 1% (Difco) , Polypepton al 1% (Wako Puré Chemical Industries Ltd. , Osaka, Japón) y agar al 1% se incubó a 27°C durante toda la noche. Las células resultantes se sembraron en medio MB en agar conteniendo 50 µg/ml de ácido nalidíxico y 50 µg/ml de estreptomicida (placa de agar MNS) . Los transconjugantes obtenidos de este modo se purificaron por estría en placas de agar MNS para eliminar las células de E. col i y de P. putida exenta de plásmido .

Se preparó un extracto libre de células de P. putida transconjugante portadora de pGOC402 o pMMB22 a partir de las células hechas crecer durante toda la noche en medio MB conteniendo 50 µg/ml de estreptomicina con o sin adición de IPTG 10 mM, sometiéndose a un análisis por transferencia Western tal y como se describe en el ejemplo 3-1. Las células portadoras de pGOC402 preparado con o sin inducción con IPTG expresaron dos bandas positivas (aproximadamente 30 y 10 ng de citocromo c551 en total por 20 µg de extracto celular, respectivamente) , mientras que las células portadoras de pMMB22 no se expresaron. (3) Expresión del gen de citocromo c551 en GOS2R y en GORS6-35 Los plásmidos portadores del gen del citocromo c551 en pVKlOO en ambas direcciones (pGOClOl y pGOClOÍR) se introdujeron en un derivado de G. Oxydans DMS Núm. 4025, GOS2R, resistente a rifampicina, (T. Hoshino y cois., Solicitud de Patente Europea Núm. 9611500.8), mediante un método de apareamiento por conjugación triparental. Se cultivaron las células de GOS2R a 30°C en 10 mi de medio T consistente en Caldo de Soja Tripticasa al 3% (Becton Dickinson, Cockeysville, Md., EE.UU.) y extracto de levadura al 0,3% (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) con 100 µg/ml de rifampicina. Las cepas donadoras E. coli HB101 portadora de pGOClOl (Tcr) , o pGOClOÍR (Tcr) o pVK102 (Kmr) , y la cepa ayudante E. coli HB101 portadora de pRK2013 (Kmr) se hicieron crecer en medio de LB conteniendo los antibióticos adecuados durante toda la noche a 37°C. Estos cultivos de toda la noche (10 mi de cultivo de G02R y 2 mi de cultivo de E. coli ) se centrifugaron independientemente y los sedimentos celulares se suspendieron independientemente en 2 mi de medio T. Se mezclaron 100 µl de las suspensiones celulares y 50 µl de la suspensión celular mezclada se aplicaron sobre un filtro de nitrocelulosa colocando sobre la superficie de medio agar NS2 descrito en el Ejemplo 1-(1) . La placa se incubó a 27°C durante toda la noche. Las células resultantes se sembraron sobre medio agar T conteniendo 100 µg/ml de rifampicina y 3 µg/ml de tetraciclina (placa de agar TRT) . Los transconjugantes obtenidos de este modo se purificaron por estría en placa de agar TRT para eliminar las células de E. coli y de GOS2R exentas de plásmido. Las células de los transconjugantes crecidos en placas de agar NS2 se sometieron a análisis por transferencia Western tal y como se describe en el ejemplo 3-(l) . La Figura 3 muestra que GOS2R portadoras de pGOClOl o pGOClOÍR produjeron más proteínas inmunológicamente positivas que G0S2R portadoras de pVK102; la tasa de amplificación aparenta ser del doble.

Se introdujeron los plásmidos pGOClOl y pGOC102 en un derivado resistente de G. Oxydans DSM Núm. 4025 (con elevada tasa de producción de 2KGA a partir de L-sorbosa, T. Hoshino y cois., Solicitud de Patente Europea Núm. 9611500.8) mediante una- conjugación triparental como se ha descrito anteriormente. Se introdujo el plásmido pGOClOl a una frecuencia baja (<10"8 transconjugantes por receptor) , mientras que el plásmido pGOC102 se introdujo a una frecuencia mayor (aproximadamente 10"4 transconjugantes por receptor) . Uno de los transconjugantes típicos portador pGOClOl, GORS6-35 (pGOClOl) -1 mostró un crecimiento muy pobre y una estabilidad plasmídica baja (50%) tal y como se muestra en la Tabla 1, lo que sugiere que la presencia o expresión del gen del citocromo c posee un efecto inhibidor sobre el crecimiento del hospedador, lo que tiene como resultado la amplificación de las células libres de plásmido durante el crecimiento. Otro transconjugante, GORS6-35 (pGOClOl) -2 pasó a mostrar un buen crecimiento y una elevada estabilidad plasmídica (>99%) tras varias transferencias en medio agar NS2 conteniendo 30 µg/ml de tetraciclina. Esta alteración espontánea del crecimiento parece haber sido resultado de la adaptación del hospedador del estrés producido por la sobreexpansión del citocromo c551. Por el contrario, el transconjugante portador del pGOC102 mostró un buen crecimiento y una elevada estabilidad plasmídica (88%) .

El contenido en citocromo c551 de las cepas crecidas en medio de producción conteniendo L-sorbosa al 10% se determinó cuantitativamente por la diferencia en el espectro de reducido menos oxidado. El análisis cuantitativo del citocromo c551 se realizó mediante un espectrofotómetro Shimadzu UV-200 (Kyoto, Japón) del modo siguiente. Se cultivaron las cepas derivadas de GORS6-35 en el medio de producción conteniendo células de levadura de panadero descrito en el Ejemplo 1 durante 4 días. Tras eliminar el CaC03 y las células de levadura de panadero por centrifugación a 1000 rpm durante 10 minutos dos veces, las células se recogieron por centrifugación a 8000 rpm durante 10 min. Las células recogidas se lavaron con Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) conteniendo MGC12 5 M, y se resuspendieron en 5 mi del mismo tampón. La suspensión celular se pasó a través de un disruptor por presión de prensa francesa (1500 kg/cm ) dos veces, y los restos celulares se eliminaron por centrifugación a 5000 rpm durante 10 minutos. El extracto celular crudo resultante se ultracentrifugó a 4500 rpm durante 1 hora. El sobrenadante se utilizó para determinar el contenido en citocromo c551 mediante la diferencia en el espectro de reducido menos oxidado. Para la oxidación del citocromo, la muestra se trató con ferricianuro potástico 2 mM en tampón fosfato sódico 100 mM (pH 7,0) mientras que para la reducción se trató con borohidruro sódico al 0,1% en lugar de ferricianuro. La concentración de citocromo c551 (C) en el sobrenadante viene dada por la siguiente ecuación: C-E (A551-A541) red- (AS51-A541 OX' ' donde E (coeficiente de extinción molar) =19,1 mM"xcm -1 El nivel de expresión de citocromo c551 en GORS6-35 (pGOClOl)-l, GORS6-35 (pGOC101)-2, GOR6-35 (pG-OC102) ó GOR6-35 (pVK102) se muestra en la Tabla 1. GORS6-35 (pGOC101)-2 Y GORS6-35 (pGOC102) expresaron de 1,6 A 1,3 veces más citocromo c551 que GORS6-35 (pVK102) .

Tabla 1 Cepas Estabilidad Contenido en citocromo plasmídica (%) c551* (nmol/mg proteína soluble) GORS6-35 (pVK102) 91 0,807 GORS6-35 (pGOClOl) -1 50 0,733 GORS6-35 (pGOClOl) -2 >99 1,297 GORS6-35 (pGOC102) 88 1, 070 *E1 contenido incluye ambos citocromos c551 I yll.

El aumento en el contenido de citocromo c551 en GORS6-35 portadora de pGOC102 surgió que el promotor del gen del citocromo c probablemente estaba presente en los 117 pb corriente arriba del gen estructural.

Ejemplo 4. Producción de 2KGA a partir de L-aorhoaa por GQRS6-35 amplificada con citocromo cf.51 Se inoculó B . mega terium DSM Núm. 4026 Publicación de Patente Europea 0278477) a partir de una estría en agar SCM (Tabla 2) en 150 mi de SCM. En el mismo medio de inoculo SCM se inocularon células GORS6-35 (pGOClOl) -2 o GORS6-35 (pVK102) procedentes de un cultivo en agar en medio NS2 conteniendo 30µg/ml de tetraciclina, o células GOR6-35 o G. Oxydans DSM Núm. 4025 procedentes de un cultivo en agar en medio NS2. El cultivo de inoculo se prolongó hasta que el pH del caldo de cultivo fue de 6,5 a 6,0 a 30°C, lo cual tardaba normalmente de 15 a 24 horas . Una porción (7,5 mi) del caldo de inoculo en 50 mi de medio de producción (Tabla 3) en una matriz erlenmeyer de 500 mi. Estas fermentaciones principales se realizaron a 30 °C, 180 rpm en un agitador rotatorio durante 5 días. Tal y como se muestra en la Tabla 4, una fermentación mixta empleando GORS6-35 (pGOClOl) -2 resultó en una porción mejor de 2KGA que la derivada de G.

Oxydans DSM Núm. 4025, GORS6-35 y G0RS6 (pVK102) : una producción más rápida de 2 KGA a partir de L-sorbosa 11% y una producción más rápida y un rendimiento superior a partir de L-sorbosa al 14%. La cepa recombinante produjo 105,1 g/1 de 2KGA de L-sorbosa al 11% en 3 días, y 130,8 y 133 g/1 a partir de L-sorbosa al 14% en 4 y 5 días, respectivamente, mientras que el vector control GORS6-35 (pVKlOO) produjo 96,3 g/1 de 2KGA a partir de L-sorbosa 11% en 3 días, y 99,9 y 112,6 g/1 a partir de L-sorbosa al 14% en 4 y 5 días, respectivamente.

Tabla 2. Medio de cultivo de inoculo (SCM) Ingrediente Concentración (%) Extracto de levadura 0,3 Extracto de carne 0,3 Licor de infusión de maíz 0,3 Peptona 1 , 0 Urea 0,1 KH2P04 0,1 MgS04 .7H20 0,02 CaC03 0,1 L-sorbosa 2,0 _____ *E1 CaC03 se añade tras ajustar el pH 150 mi de medio en matraz erlenmeyer de 500 mi Para la estría en agar SCM se añadió agar al 2% al medio SCM Tabla 3. Medio de producción L-sorbosa* 11% 14% Urea* 2,4 3,1 CSL 1,6 2,0 MgS04. /H20 0, 016 0,02 KH2. P04 0, 16 0,2 CaC03** 0,8 1,0 PH 6,7 La L-sorbosa y la urea se autoclavan por separado ** El CaC03 se añade tras ajustar el pH 100 mi de medio en matraz Erlenmeyer de 500 mi Tabla 4 Cepa Concentración de Producción 2KGA (g/1) sorbosa (%p/v) 3 días 4 días 5 días GORS6-35 11 105,1 106,2 (pGOClOl) -2 14 103,1 130,8 133,3 GORS6-35 11 96,3 106, 9 (pVK102) 14 84,1 99,9 112,6 GORS6-35 11 95,5 104,7 14 90,6 104,7 104,8 DMS Núm. 4025 11 102,2 106,4 14 81,8 95,6 107,7 Ejemplo 5_ Producci n _e 2_O? par. si transconJugante d__ J gutidfl portador del gen del ci ocromo c551 junto con senes de AADH de G . Oxydans DSM Núm. 4Q25 Se construyeron, mediante apareamiento por el método de conjugación triparental como se describe en el Ejemplo 3- (2), cuatro transconjugantes de P. putida Nalr ATCC 21812, P. putida portada de pSSA102R (vector pVKlOO portador de un fragmento de ADN de 2,7 kb que incluye el gen del enzima A clonado de G. Oxydans DSM Núm. 4025; el gen codifica la AADH que convierte L-sorbosa a 2KGA; T. Hoshino y colis., Solicitud de Patente Europea Núm. 9611500.8) y pGOC402, P. putida portadora de pVK102 y pGOC402, P. putida portadora de pSSA102 y pMMB22, y P. pu tida portador de PVK102 y pMMB22. Se inocularon células de estos cuatro transconjugantes mantenidas en medio agar MB conteniendo 10 µg/ml de tetraciclina 50 µg/ml de estreptomicina en 10 mi de medio MB suplementando con 10 µg/ml de tetraciclina, 50 µg/ml de estreptomicida y 10 mM de IPTG, incubándose a 30°C durante 18 horas. Las células resultantes se centrifugaron y se lavaron con NaCl 0,9%. La mezcla de reacción de células en latencia consistente en 20 OD600 unidades de células, L-sorbosa al 4%, NaCl 0,3% CaC03 1%, 1 µg/ml de pirroloquinolina quinona (PQQ) se incubó a 30° C durante 48 horas con agitación. La cantidad de 2KGA producida por P. pu tida portadora de pSSA102R y pGOC402 fue de 63,4 g/1, mientras que la de las otras tres cepas estuvo por debajo de 0,5 g/1. La expresión del citocromo c551 proporcionó un enlace fisiológico entre la AADH de G. Oxydans DSM Núm. 4025 y la cadena de transporte de electrones de P. pu tida .

Ejemplo 6. Conjugando citocromo C551-AADH Los plásmidoe que codifican genes conjugados de citocromo C551-AADH se construyeron tal y como se ilustra en la Figura 4. En este caso, los genes del enzima A/B3 y del enzima B (T. Hoshino y cois., Solicitud de Patente Europea Núm. 9611500.8) se emplearon como genes AADH. El enlazador entre AADH y el citocromo c551 se construyó a imitación de la ADH de A . aceti (Inoue T. Cois., J. Bacteriol, 171: 3115-3122, 1989). Los plásmidos se introdujeron en P. putida Nalr ATCC 21812 y el transconjugante resultante se sometió a análisis por transferencia Western con el anticuerpo preparado contra AADH o citocromo c551. El análisis mostró que las construcciones tanto AADH como polipéptido de citocromo en una molécula. Los trasnconjugantes portadores del gen conjugado del enzima A/B3 -citocromo c551 se emplearon en la reacción de células en latencia como se describe en el Ejemplo 5. Como resultado, los primeros transconjugantes produjeron 7,8 g/1 de 2KGA a partir de g/1 L-sorbosa, y los últimos produjeron 9,0 g/1 de L-sorbosa, a partir de g/1 de D-sorbitol en 40 horas.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: NOMBRE : F. HOFFMANN-LA ROCHE A.G. CALLE : Grenzacherstrasse 124 CIUDAD: Basilea PAÍS: Suiza CÓDIGO POSTAL: CH-4070 TELEFONO : 061-688 25 05 FAX: 061-688 13 95 TELEX: 962292/9965542 hlr c (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Nuevo Citocromo c (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 6 (iv) FORMA LEGIBLE POR COMPUTADOR: (A) TIPO DE SOPORTE : disquete flexible (B) COMPUTADOR: Macintosh (C) SISTEMA OPERATIVO: Macintosh (D) SOFTWARE: Microsoft Word 5.1a INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 744 pares de bases (B)TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 1 CAAGGCGGAG TTGTCCGGCA AAGACTGAC? TTTCTGTTTG CGGCCGTTAT ATAGGGGCTG 60 CTCGCAGATG TCGGCACCTT GTCCGGCCTG CGACGCAGCA AGCTAAAGCA AGCtAAAATG 120 AAAAACAAAA CCACTCtGGG CGGCGCGCTT GCACTTGCAG CACTGCTGGC CGGAACGACC 180 GGGGCACTGG CGTTCAGCAA CATCGAACGt CCCGCACCGG CCGCTGATAC TGCAGCTACC 240 GAAGAAGCAC CTGCTGCCGC TGCTGGCGCC GCCACTTCGA TCTACGACGG CGTTTACACT 300 GCAGCCCAGG CCGAAGCTGG CCAGGCTGCA TGGATGACCA GCTGCGCAAG CTGCCACGGC 360 CCGACCGCTC GCGGCTCGTC GGGTGGTCCG CGCGT TATCG GCCCTGTCAT CAACAACAAG 420 T?TCCTG?C? ?GCCGCTGCT CGACTACTTC A?CT?C?CCC GCG?C??C?T GCCC?TGCGC 400 CCCC 'L'C?CT CGTTG?GCG? CG?T?CC ?T G7TG???TCG TTGCGTTC?T TCTGC??TCG 540 C?CGGCGC?G ?GCCGGGCG? G?CGGAACTG ACCTCGGACG ??GCGCTGCT CGGC?GCCTG 600 ATC?TGGGCC GT??CCCCA? CT???CGC?G GGTCGCC??C CGCTTC?CGG T??GC??CCT 660 ?CC?G?TTGG CCGGCT?CGG TCGGCC??TC CTCCTTT?CC ??CCCTCCAT CCCA??CA?G 720 GTAAAACCTG ATGAAGACGT CGTC 744 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 2 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 168 residuos (B)TIPO: aminoácido (C) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 2 : M' t Lys Asn Lys Thr Thr Leu Gly Gly ?la L u ? a Lr-u ?l.-. ?la Lo Leu Ala Gly Thr Thr Gly Ala Leu ?la Phe Ser ?sn lie Glu -10 -5 1 5 ?rg Pro Ala Pro ?la ?ia ?sp Thr ?la ?la Thr Glu Glu ?la Pro LO Ib 20 Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ser He Tyr Asp Gly Val Tyr 25 30 35 Thr ?la ?la Gln ?la Glu ?la Gly Gln ?la ?la Trp Met Thr Ser 40 45 50 Cys Ala Ser Cys F.is Gly Pro Thr Ala Arg Gly Ser Ser Gly Gly 55 60 65 Pro Arg Val lie Gly Pro Val lie Asn Asn Lys Tyr Ala ?sp Lys 70 75 80 Pro Leu Leu Asp Tyr Phe Asn Tyr Thr Arg Asp Asn Met Pro Met 85 90 95 Gly ?la Pro His Ser Leu Ser ?sp ?sp Thr Tyr Val Glu lio Val 100 105 no Ala Phe He Leu Gln Ser His Gly Ala Glu Pro Gly Glu Thr Glu 115 120 125 Leu Thr Ser Asp Glu Ala Leu Leu Gly Ser Leu Met Met Gly Arg 130 135 1 0 Asn Pro Asn 143 (3) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 52 residuos (B)TIPO: aminoácido (C) TIPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 3 Ala Asp Thr Ala Ala Thr Glu Glu Ala Pro Ala Ala Ala ?la Gly 1 5 10 15 Ala Ala Thr Ser He Tyr Asp Gly Val Tyr Thr Ala Ala Gln Ala 20 25 30 Glu Ala Gly Gln Ala Ala Trp Met Thr Ser Xaa Ala Ser Xaa His 35 40 45 Gly Pro Thr Ala Arg Gly Ser (4) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 4 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 44 residuos (B)TIPO: aminoácido (C) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 4 Gly Pro Arg Val He Gly Pro Val He Asn Asn Lys Tyr Ala Asp 1 5 ?o 15 Lys Pro Leu Leu Asp Tyr Phe Asn Tyr Thr Arg Asp Asn Met Pro 20 25 30 Met Gly Ala Pro His Ser Leu Ser Asp Asp Thr Tyr Val Glu 35 40 44 (5) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 5 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 13 residuos (B)TIPO: aminoácido (C) TOPOLOGÍA: 1ineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 5 : He L u Gln S His Gly ?la Glu Pro Gly Glu Thr Glu 1 5 • 10 13 (6) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 5 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 50 pares de base (B)TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 6 : ATCAACAACA AGTATGCTGA C??GCCGCTG CTGGACTACT TCAACTACAC 50 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.

Claims (14)

R E I V I N D I C A C I O N E S

1. Una secuencia ADN caracterizada porque comprende una 5 secuencia de ADN que codifica tras la expresión en una célula hospedadora procariota o eucariota, polipéptidos que poseen al menos una parte de la estructura primaria y una de las propiedades biológicas del citocromo c551, seleccionándose dicha secuencia de ADN de entre: -JQ 9a) la secuencia ADN identificada como SEQ ID No. 1 o su cadena complementaria; (b) secuencias de ADN que hibridan con las secuencias de ADN definidas en (a) o fragmentos de las mismas; y (c) secuencias de ADN que, teniendo en consideración la degeneración del código genético, hibridarían con las 15 secuencias ADN definidas en (a) o en (b), codificando dichas secuencias un polipéptido que posee la misma secuencia aminoacídica. 0

2. La secuencia de ADN como se especifica en la reivindicación 1, caracterizada porque comprende adicionalmente una secuencia de ADN que codifica un 25 polipéptido que posee actividad alcohol/aldehido deshidrogenasa .

3. Un polipéptido que posee actividad citrocromo c caracterizado porque es codificado por una secuencia ADN como se reivindica en la reivindicación 1 ó 2.

4. Un polipéptido que posee actividad de citocromo c caracterizado porque es obtenible u obtenido a partir de un microorganismo que pertenece al género Glucopobacter, seleccionado del grupo consistente en citocromos c551 I y II, los cuales muestran respectivamente las siguientes propiedades físico-químicas: (a) citocromo C551-I: (a) peso molecular: aproximadamente 19 ± 1 kDa por gel filtración, y aproximadamente 18,0 ± 1,0 kDa por análisis por SDS-PAGE; (b) espectro de absorción: la forma reducida muestra un máximo de absorción a 551 nm, 522 nm y 417 nm, en forma de picos alfa, beta y gamma, respectivamente; (c) contenido en hemo: aproximadamente 1 mol de hemo /mol de proteína; (d) unto isoeléctrico: aproximadamente 3,95; y (b) citocromo c551 II: (a) peso molecular: aproximadamente 19 ± 1 kDa por gel filtración, y aproximadamente 16,8 kDa ± 1,0 kDa por análisis por SDS-PAGE, (b) espectro de absorción: la forma reducida muestra un máximo de absorción a 551 nm, 522 nm y 417 nm, en forma de picos alfa, beta y gamma, respectivamente; (c) contenido de hemo: aproximadamente 1 mol de hemo/mol de proteína; (d) punto isoeléctrico: aproximadamente 3,75.

5. El vector adecuado para la expresión en una célula hospedadora procariota o eucariota caracterizado porque comprende una secuencia de ADN como se reivindica en la reivindicación 1 ó 2.

6. La célula hospedadora caracterizada porque ha sido transformada con un vector como se reivindica en la reivindicación 5.

7. La célula hospedadora como se reivindica en la reivindicación 6, caracterizada porque la célula hospedadora y la secuencia de ADN como se reivindica en la reivindicación 1 ó 2 ha sido integrada en su genoma.

8. La célula hospedadora como se reivindica en la reivindicación 6 ó 7 caracterizada porque es de origen eucariota, y preferentemente una célula de mamífero o de planta.

9. La célula hospedadora como se reivindica en la reivindicación 6 ó 7 caracterizada porque es de origen procariota.

10. La célula hospedadora como se reivindica en la reivindicación 9, caracterizada porque es seleccionada del grupo consistente en bacterias tales como Escherichia coli , Pseudomonas putida, Acetobacter xylinum, Acetobacter pasteurianus, Acetobacter hanseii , y GluconoJbacter oxydans .

11. La célula hospedadora como se reivindica en la reivindicación 10, caracterizada porque es Gluconobacter oxydans DSM Núm. 4025.

12. Un proceso para la producción del citocromo c551, caracterizado porque comprende el cultivo de una célula hospedadora tal y como se define en cualesquiera de las reivindicaciones de 4 a 9 en un medio de cultivo adecuado y la recuperación del citocromo c551 del cultivo.

13. El uso del citocromo c551 tal y como se reivindica en la reivindicación 1,3 ó 4 para la producción de vitamina C.

14. La reivindicación tal y como ha sido descrita,